JP7155270B2 - 抗ｃｔｌａ４抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本開示は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＣＴＬＡ４又はＣＴＬＡ－４）抗体及びその用途に関する。

現在、がんはヒトの死亡率が最も高い疾患の１つである。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計データによると、２０１２年の世界的ながんの発生数と死亡例はそれぞれ１４００万ヒトと８２０万ヒトに達する。中国では、新たに診断された癌症例は３０７万ヒトであり、死亡者数は２２０万ヒトである。

抗癌抗体の最近の臨床的および商業的成功は、抗体による治療法に大きな注目を引き起こしている。抗体による治療薬に用いられる抗癌抗体を開発する必要がある。

本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その抗原結合フラグメント、及びその用途に関する。

一つの側面では、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）１、２及び３（ここで、ＶＨ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＨ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＣＤＲｓ １、２及び３（ここで、ＶＬ ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つＶＬ ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）に結合した抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、
ここで、選択されたＶＨ ＣＤＲｓ １、２及び３のアミノ酸配列、並びに選択されたＶＬ ＣＤＲｓ １、２及び３アミノ酸の配列は、以下のいずれの１つである、抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
（１）選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、３に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５、６に示されること、
（２）選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、８、９に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１１、１２に示されること、
（３）選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４６、４７に示され、且つ、選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８、４９、５０に示されること、
（４）選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１、５２、５３に示され、且つ選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４、５５、５６に示されること。

幾つかの実施態様において、ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ １、２、３を含み、且つＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ １、２、３を含む。

幾つかの実施態様において、ＶＨは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、８及び９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ １、２、３を含み、且つＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ １、２、３を含む。

幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合している。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。

一つの側面では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸に関し、前記ポリペプチドは、
（１）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、且つ前記ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、１９、２０又は７０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（２）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３、１４、１５、１６、１７又は６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（３）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、８及び９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、２６、２７、２８又は７２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；又は
（４）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、２２、２３、２４又は７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（５）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４６及び４７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（６）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８、４９及び５０に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；
（７）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントにおいて、前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１、５２及び５３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント；
（８）ＶＬを含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントにおいて、前記ＶＬは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４、５５及び５６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含み、且つ前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨとペアリングする際にＣＴＬＡ４に結合する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；を含む。

幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、前記ポリペプチドは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２及び３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含むＶＨを含有する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含む。

幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５及び６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含むＶＬを含有する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含む。

幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、８及び９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含むＶＨを含有する免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含む。

幾つかの実施態様において、前記核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、１１及び１２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ １、２及び３を含むＶＬを含有する免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントを含む。

幾つかの実施態様において、前記ＶＨは、ＶＬとペアリングする際に、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合している。幾つかの実施態様において、前記ＶＬは、ＶＨとペアリングする際に、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合している。

幾つかの実施態様において、前記免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントであり、且つ前記免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントは、ヒト化免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメントである。

幾つかの実施態様において、前記核酸は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする。幾つかの実施態様において、前記核酸は、ｃＤＮＡである。

他の側面では、本開示は、さらに、本明細書に記載するような核酸の１種又は複数種を含むベクターを提供する。幾つかの実施態様において、前記ベクターは、ＣＴＬＡ４に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする。

一つの側面では、本開示は、各ベクターが本明細書に記載の核酸の１種を含むベクターのペアにおいて、前記ベクターは、ＣＴＬＡ４に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードするベクターのペアに関する。

一つの側面では、本開示は、本明細書に記載のベクター又はベクターのペアを含む細胞を提供する。幾つかの実施態様において、前記細胞は、ＣＨＯ細胞である。

他の側面では、本開示は、本明細書に記載の核酸の１種又は複数種を含む細胞を提供する。

一つの側面では、本開示は、本明細書に記載の核酸の２種を含む細胞を提供する。幾つかの実施態様において、前記２種の核酸は、ＣＴＬＡ４に一緒に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする。

一つの側面では、本開示は、さらに、抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の細胞に抗体又は抗原結合フラグメントを産生させるために十分な条件下で細胞培養するステップと、細胞によって産生された抗体又は抗原結合フラグメントを収集するステップと、を含む。

一つの側面では、本開示は、選択されたＶＨ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び選択されたＶＬ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ＣＴＬＡ４に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、選択されたＶＨ配列及び選択されたＶＬ配列は、以下のいずれの１つである、ＣＴＬＡ４に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
（１）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３、１４、１５、１６、１７又は６９であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、１９、２０又は７０であり；
（２）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、２２、２３、２４又は７１であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、２６、２７、２８又は７２であり；
（３）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４であり；
（４）選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５であり、且つ選択されたＶＬ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６である。

幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９の配列を含む。幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９の配列を含む。

幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５の配列を含む。幾つかの実施態様において、ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２の配列を含み、且つＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５の配列を含む。

幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合している。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。幾つかの実施態様において、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。

一つの側面では、本開示は、治療剤に共有結合または非共有結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む抗体－薬物複合体も提供する。幾つかの実施態様において、治療剤は、細胞傷害性薬又は細胞増殖抑制薬（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、マイタンシノイド類（例えば、ＤＭ－１ 及びＤＭ－４）、ジオン、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ、１－ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、シクロホスファミドおよび類似体）。

一つの側面では、本開示は、癌を有する対象を治療する方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、或いは本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を対象に治療有効量で投与するステップを含む。

幾つかの実施態様において、前記癌は、黒色腫である。幾つかの実施態様において、前記癌は、切除不能な黒色腫または転移性黒色腫である。

幾つかの実施態様において、前記癌は、非小細胞肺がん（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ、ＳＣＬＣ）、膀胱がん又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。

一つの側面では、本開示は、さらに、腫瘍増殖速度を低下させる方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を有効量で腫瘍細胞に接触させるステップを含む。

他の側面では、本開示は、腫瘍細胞を死滅させる方法において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは本明細書に記載の抗体－薬物複合体を含む組成物を有効量で腫瘍細胞に接触させるステップを含む方法に関する。

一つの側面では、本開示は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

他の側面では、本開示は、本明細書に記載の抗体薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本明細書で使用されるように、「癌」という用語とは、自律的増殖能力を有する細胞である。そのような細胞の実例には、急激な細胞増殖によって特徴づけられる異常な状態又は状況を含む。その用語は、腫瘍などの癌性増殖、発癌プロセス、転移組織、および悪性に形質転換された細胞、組織、または臓器を、組織病理学的タイプまたは浸潤期間に関係なく含むことを意味する。また、呼吸器系、心臓血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系及び内分泌系のような様々な臓器系の悪性腫瘍；ほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、及び小腸がんのような悪性腫瘍を含む腺癌も含まれる。「自然発生」のがんは、対象へのがん細胞の移植によって実験的に誘発されないいずれのがんも含まれ、例えば、自然発生がん、発がん物質への患者の曝露によるがん、癌遺伝子の挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトによるがん、並びに感染（例えば、ウイルス感染）による癌を含む。「カルシノーマ（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」という用語は、当分野で認められており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。この用語は、癌腫と肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。「腺癌」とは、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。「肉腫」という用語は、当分野で認められており、間葉由来の悪性腫瘍を指す。「造血性新生物障害（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、造血起源の過形成／腫瘍細胞が関与する疾患が含まれる。造血性腫瘍性障害は、骨髄系、リンパ系、または赤血球系、またはその前駆細胞に引き起こされることができる。

本明細書で使用される「抗体」という用語とは、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖からの３つのＣＤＲのいずれか又は免疫グロブリン重鎖からの３つのＣＤＲのいずれか）を含み、且つエピトープに特異的に結合できる抗原結合分子のいずれかを指す。抗体の非限定的な例は：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体が含まれる。幾つかの実施態様において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ区領域を含むことができる。抗体という用語は、誘導体、例えば、抗体フラグメントからなる二重特異性抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体及び多重特異性抗体も含む。

本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語とは、全長抗体の一部を指し、前記抗体の一部が抗原に特異的に結合できるものである。幾つかの実施態様において、抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖の可変ドメイン又は軽鎖の可変ドメイン）を含む。抗体フラグメントの非限定的な実例は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖフラグメントを含む。

本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語とは、ヒトに存在する内因性核酸（例えば、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子座）によってコードされる抗体を指す。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、ヒトから収集されるか、ヒト細胞培養（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞）で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は非ヒト細胞（例えば、マウスまたはハムスター細胞株）で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、細菌または酵母細胞で産生される。幾つかの実施態様において、ヒト抗体は、未再構成または再構成されたヒト免疫グロブリン遺伝子座（例えば、重鎖または軽鎖ヒト免疫グロブリン遺伝子座）を含むトランスジェニック非ヒト動物（例えば、ウシ）で産生される。

本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語とは、少なくとも２つの異なる抗体（例えば、ヒトおよびマウス抗体などの２つの異なる哺乳動物種由来の抗体）に存在する配列を含む抗体を指す。キメラ抗体の非限定的な実例は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び/又は重鎖可変ドメイン配列の全部又は一部）およびヒト抗体の定常領域を含む抗体である。キメラ抗体の他の実例は、本明細書に記載され、当分野で知られている。

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語とは、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する最小配列を含み、ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含む非ヒト抗体を指す。幾つかの非限定的な例では、ヒト化抗体は、受容体抗体の超可変（CDR）領域残基が、所望の特異性、親和性、および性能を有する非ヒト抗体（例えば、ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ抗体）の超可変（CDR）領域残基で置き換えられたヒト抗体（受容体抗体）である。 幾つかの実施態様において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン残基で置き換えられている。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、受容体抗体又はドナー抗体に存在しない残基を含むことができる。抗体の性能をさらに改善するために、これらの修飾を行うことができる。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、全部又はほとんど全部の超可変ループ（ＣＤＲ）は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンの可変ドメインに対応し、且つ全部又はほとんど全部のフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体とは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）であることを指す。ヒト化抗体は、当該分野で公知の分子生物学的方法を使用して産生され得る。ヒト化抗体を産生する方法の非限定的な例は、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される「一本鎖抗体」という用語とは、抗原に特異的に結合することができる少なくとも2つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、哺乳類免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変ドメイン）を含む単一のポリペプチドを指す。一本鎖抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されている。

本明細書で使用される「多量体化抗体」という用語とは、４つ又はそれ以上（例えば、６つ、８つ又は１０つ）の免疫グロブリン可変ドメインを含む抗体を指す。幾つかの実施態様において、多量体化抗体は、１つの標的分子（例えば、ＣＴＬＡ４）を哺乳動物細胞（例えば、ヒトＴ細胞）の表面上での少なくとも１つの第２の標的分子（例えば、ＰＤ１）に架橋させることができる。

本明細書で使用される「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体で交換可能に使用され、本発明の方法による治療が与えるヒト又は非ヒト動物を説明する。本発明は、獣医学的および非獣医学的用途を考慮している。ヒト患者は、成人または若年の人間（例、18歳未満のヒト）であってもよい。患者には、ヒトに加えて、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、及び霊長類も含まれる。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ類、ブタ類（例えば、ブタ、ミニチュアブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、その他の家畜、農場、動物園の動物を含む。

本明細書で使用するように、抗体に言及する場合には、「～に特異的に結合する」及び「～を特異的に結合する」という語句は、相互作用が標的分子での特定の構造（即ち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存するため、他の分子抗体に対して優位にその標的分子（例えば、ＣＴＬＡ４）と相互作用することであり、言い換えれば、該試薬は、一般にすべての分子ではなく、特定の構造を含む分子を認識して結合する。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異的抗体と呼ばれることができる。例えば、ＣＴＬＡ４分子に特異的に結合する抗体は、ＣＴＬＡ４特異的抗体又は抗ＣＴＬＡ４抗体と呼ばれことができる。

本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用されることができ、少なくとも2つのアミノ酸の任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」及び「核酸配列」という用語は、本明細書に互換的に使用されることができ、少なくとも2ヌクレオチドの任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びその修飾物を含むが、これらに限定されない。

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、本発明で使用される方法および材料を説明するが、当技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法及び実例は、例として説明されるものであり、これらに限定されない。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）を基準とする。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

図１は、抗ＣＴＬＡ４抗体を作製する例示的な態様の第１の部分のフローチャートを示す。 図２は、抗ＣＴＬＡ４抗体を作製する例示的な態様の第２の部分のフローチャートを示す。 図３は、抗ＣＴＬＡ４抗体がＣＴＬＡ４とＣＤ８０の間の結合を遮断することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図４は、抗ＣＴＬＡ４抗体がＣＴＬＡ４とＣＤ８６の間の結合を遮断することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図５は、サルＣＴＬＡ４（ｒｍＣＴＬＡ４）、マウスＣＴＬＡ４（ｍＣＴＬＡ４）及びヒト－マウスキメラＣＴＬＡ４（ｃｈｉＣＴＬＡ４）に対する抗ＣＴＬＡ４抗体の交差反応性のフローサイトメトリーの結果を示す一連の図である。 図６は、抗ＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４及び４Ｇ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重を示すグラフである。 図７は、抗ＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４及び４Ｇ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重のパーセント変化を示すグラフである。 図８は、抗ＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４及び４Ｇ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図９は、Ｙｅｒｖｏｙ及び１３Ａ４で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重を示すグラフである。 図１０は、Ｙｅｒｖｏｙ及び１３Ａ４で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重のパーセント変化を示すグラフである。 図１１は、Ｙｅｒｖｏｙ及び１３Ａ４で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１２は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重を示すグラフである。 図１３は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重のパーセント変化を示すグラフである。 図１４は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウス中の経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１５は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４及び１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａで処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重を示すグラフである。 図１６は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４及び１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａで処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重のパーセント変化を示すグラフである。 図１７は、Ｙｅｒｖｏｙ、ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４及び１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａで処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図１８は、抗ＣＴＬＡ４抗体がＣＴＬＡ４とヒトＣＤ８６の間の結合を遮断することを示す一連のフローサイトメトリーグラフである。 図１９は、サル、マウス及びヒト－マウスキメラＣＴＬＡ４に対する抗ＣＴＬＡ４抗の交差反応性のフローサイトメトリーの結果を示す一連の図である。 図２０は、ＣＴ４－０４－１３Ａ４、ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重を示すグラフである。 図２１は、ＣＴ４－０４－１３Ａ４、ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な体重のパーセント変化を示すグラフである。 図２２は、ＣＴ４－０４－１３Ａ４、ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２で処置されたＭＣ－３８腫瘍を移植したＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスの経時的な腫瘍体積を示すグラフである。 図２３は、Ｋａｂａｔ番号により定義される抗ＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４、４Ｇ１２、６Ｄ２、７Ｅ１２、及びそのヒト化抗体のＣＤＲ配列を示す。 図２４は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号により定義される抗ＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４、４Ｇ１２、６Ｄ２、７Ｅ１２、及びそのヒト化抗体のＣＤＲ配列を示す。 図２５は、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 図２５は、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。 図２６は、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、サルＣＴＬＡ４及びキメラＣＴＬＡ４のアミノ酸配列を示す。 図２７は、複数種のマウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。

本開示は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）に結合する抗体、その抗原結合フラグメントの実例を提供する。

ＣＴＬＡ４は、活性化Ｔ細胞によって発現され、Ｔ細胞に抑制シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。これは、免疫チェックポイントであり、ＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして機能し、免疫応答をダウンレギュレートする。

本開示は、さらに、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の配列及び調製、並びに前記抗体を使用する方法を提供する。

ＣＴＬＡ４及び癌
免疫系は、ｉｎ ｖｉｖｏの正常な細胞と「外来」とみなされる細胞とを区別することができる。これにより、免疫系は、正常な細胞に影響を与えずに、外来細胞を攻撃できる。このメカニズムには、免疫チェックポイントと呼ばれるタンパク質が関与する場合がある。免疫チェックポイントは、免疫システムの内、シグナルを増幅したり（共刺激分子）、シグナルを抑制する分子である。

チェックポイント阻害剤は、正常な組織への免疫系の攻撃を防止できるので、自己免疫疾患を防止する。多くの腫瘍細胞は、チェックポイント阻害剤も発現する。これらの腫瘍細胞は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞において、特定の免疫チェックポイント経路を選択することにより免疫監視を回避する。（Ｃｒｅｅｌａｎ、 Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃ． 「Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２１．１ （２０１４）： ８０－８９）。多くの免疫チェックポイントは、リガンドと受容体の相互作用によって引き起こされるため、リガンド及び／又はその受容体に対する抗体によって容易にブロックされる。

免疫チェックポイント経路は、一連の複雑な細胞相互作用が関与し、正常の条件下でエフェクターＴ細胞の過剰な活性化を防止する。該経路の一部は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２）と呼ばれる細胞表面受容体である。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞にのみ発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の活性化を阻害する作用を奏するとともに、ヘルパーＴ細胞の活性を阻害しながら制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を高めると報告されている。従って、ＣＴＬＡ－４は、「オフ」スイッチとして機能し、免疫応答をダウンレギュレートする。細胞傷害性Ｔ細胞は活性化すると、その細胞表面にＣＴＬＡ－４を発現し、ＡＰＣ上で互に共有するリガンドであるＢ７－１（ＣＤ８０）又はＢ７－２（ＣＤ８６）について共刺激分子ＣＤ２８と競合する。このような「陰－陽」のバランスは、細胞傷害活性を抑制しながら、Ｔ細胞機能を自己制限的に進める可能である（Ｃｒｅｅｌａｎ、 Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃ． “Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２１．１ （２０１４）： ８０－８９）。

多くの癌細胞は、Ｔ細胞中ＣＴＬＡ－４の異常な発現を刺激することができ、これらのＣＴＬＡ－４異常Ｔ細胞は、アネルギー表現型を示す。従って、癌細胞は、パトロール中のＴ細胞をを回避するためにＣＴＬＡ－４経路を選択する可能性ある。ＣＴＬＡ－４を阻害するモノクローナル抗体の取り込みにより、複数の癌（例えば、黒色腫）で一貫した永続的な抗腫瘍反応を達成できる。これらの抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）及びイピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（Ｙｅｒｖｏｙ））は、ＣＴＬＡ４に結合することにより、抑制シグナルを遮断することで、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞が癌細胞を破壊する。従って、抗ＣＴＬＡ４抗体は、癌の治療に用いられることができる。

本開示は、幾つかの抗ＣＴＬＡ４抗体、その抗原結合フラグメント、並びにこれらの抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗原結合フラグメントによる癌の治療方法を提供する。

抗体及び抗原結合フラグメント
本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体及その抗原結合フラグメントを提供する。一般的に、抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）は、軽鎖及び重鎖の両方のポリペプチド鎖からなる。本開示に係る非限定的な抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完璧な４本鎖免疫グロブリンである。抗体の重鎖は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤを含む任意のアイソタイプ、或いはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含むサブアイソタイプであってもよい。軽鎖可以是κ軽鎖又はλ軽鎖。抗体は、軽鎖の2つの同一コピー及び重鎖のの2つの同一コピーを含んでもよい。それらは、それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域、Ｖ_Ｈ）及び複数の定常ドメイン（又は定常領域）を含む重鎖は、その定常領域内のジスルフィド結合を介して互いに結合し、抗体の「幹」を形成する。それらは、それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域、Ｖ_Ｌ）及び１つの定常ドメイン（又は定常領域）を含む軽鎖は、それぞれジスルフィド結合を介して１本の重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域は、それに結合する重鎖の可変領域とペアリングしている。軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、いずれもより保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）の間に位置する３つの超可変領域を含む。

これらの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、抗体の主要な抗原結合表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域は、主にβ－シート構造を採用し、且つ、ＣＤＲはループ接続を形成し、前記ループ接続はβ－シート構造と連結しながらある場合にはβ－シート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって近接して保持され、且つ、他の鎖に由来するＣＤＲとともに抗原結合領域の形成に寄与する。

抗体のアミノ酸配列を分析することにより抗体のＣＤＲ領域を同定する方法は周知であり、且つＣＤＲの多くの定義は一般的に使用されているものである。Ｋａｂａｔの定義は、抗体配列の可変性に基づくものであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づくものである。これらの方法及び定義は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ、 “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、” Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、 ２００１． ４２２－４３９；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ、 ｅｔ ａｌ． “Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｏｒｒｅｃｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ、” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５．１４ （２００８）： ３８３２－３８３９；Ｗｕ、 Ｔ．Ｔ． ａｎｄ Ｋａｂａｔ、 Ｅ．Ａ． （１９７０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １３２： ２１１－２５０；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３：１２１－５３ （１９９１）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ． ６８（１－３）：９－１６ （Ｏｃｔ． １９９７）；Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２７５（２）：２６９－９４ （Ｊａｎ ．１９９８）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７－８３ （Ｄｅｃ． １９８９）；Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ、 ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：６４ （２００７）に記載されるように、それぞれ本明細書に援引により組み込まれる。

ＣＤＲは、抗原エピトープを認識するために重要である。本明細書で使用される「エピトープ」とは、抗原結合部位に特異的に結合することができる、標的分子の最小部分である。エピトープの最小サイズは、約３、４、５、６又は７個のアミノ酸であってもよいが、これらのアミノ酸は必ずしも抗原の一次構造の連続的な線状配列にある必要がない。これは、エピトープが抗原の二次および三次構造に基づく抗原の３次元構造に依存するためである。

幾つかの実施態様において、抗体は、無傷の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）である。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、高度に保存されたものであり、相違点としては、その定常領域、特にそのヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインにある。ＩｇＧサブクラスの配列及び相違は、当技術分野で知られているものであり、しかも、例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ、 Ｇｅｓｔｕｒ、 Ｇｉｌｌｉａｎ Ｄｅｋｋｅｒｓ、 ａｎｄ Ｔｈｅｏ Ｒｉｓｐｅｎｓ． “ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５ （２０１４）；Ｉｒａｎｉ、 Ｖａｓｈｔｉ、 ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７．２ （２０１５）： １７１－１８２；Ｓｈａｋｉｂ、 Ｆａｒｏｕｋ、 ｅｄ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、 ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 ２０１６に記載されており、それぞれ本明細書に援引により組み込まれる。

抗体は、また、任意の種（例えば、ヒト、げっ歯類動物、マウス、ラクダ科）に由来する免疫グロブリン分子であってもよい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、及び別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体も含まれるが、これらに限定されない。「抗原結合部位」又は「抗原結合フラグメント」という用語は、インタクトな抗体の特異的結合活性を保持する抗体の一部、即ち、抗体のうち、インタクトな抗体の標的分子でのエピトープに特異的に結合できる任意の部分である。それは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びこれらのフラグメントの変異体を含む。よって、幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、抗体フラグメントからなるｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、多重特異性抗体、及び抗体結合ドメインであるまたは抗体結合ドメインと相同性を有する結合ドメインを含む任意のポリペプチドであってもよい。抗原結合部位の非限定的な例は、例えば、インタクトな抗体的重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ、インタクトな抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、インタクトな抗体の全長重鎖又は軽鎖、又はインタクトな抗体の重鎖又は軽鎖に由来する単一のＣＤＲを含む。

幾つかの実施態様において、抗原結合フラグメントは、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）の一部を形成することができる。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３－ゼータ膜貫通及び細胞内ドメインに融合する本明細書に記載の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合体である。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、複数種の共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインも含む。幾つかの実施態様において、キメラ抗原受容体は、効力を増強するために、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０を含む。従って、一つの側面では、本開示は、さらに、発現本明細書に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。

幾つかの実施態様において、ｓｃＦＶは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインを持つ。

抗ＣＴＬＡ４抗体和抗原結合フラグメント
本開示は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗体及その抗原結合フラグメントを提供する。本明細書に記載の抗体及び抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４に結合でき、抑制ＣＴＬＡ４抑制経路を阻害できることにより、免疫応答を増強させる。本開示は、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体ＣＴ４－０４－１３Ａ４（「１３Ａ４」）、ＣＴ４－０３－４Ｇ１２（「４Ｇ１２」）、ＣＴ４－２０－６Ｄ２（「６Ｄ２」）、ＣＴ４－２０－７Ｅ１２（「７Ｅ１２」）、及びそのヒト化抗体を提供する。

Ｋａｂａｔ番号によって定義される、１３Ａ４及び１３Ａ４に由来する抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～３、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４～６を含む。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによっても定義されてもよい。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９～３１に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２～３４に示される。

類似しては、Ｋａｂａｔ番号によって定義される、４Ｇ１２及び４Ｇ１２に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７～９、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０～１２を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５～３７にしめされ、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８～４０に示される。

Ｋａｂａｔによって定義される、６Ｄ２及び６Ｄ２に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５～４７、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８～５０を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７～５９に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０～６２に示される。

Ｋａｂａｔによって定義される、、７Ｅ１２及び７Ｅ１２に由来する抗体のＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１～５３、及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４～５６を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号では、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３～６５に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６～６８に示される。

さらに、ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を提供する。マウス抗体をヒト化するには様々な方法があるので（例えば、配列が異なるアミノ酸によって置き換えることができる）、抗体の重鎖及び軽鎖は、１つ以上の態様のヒト化抗体配列を有することができる。ヒト化１３Ａ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３～１７に示される。ヒト化１３Ａ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８～２０に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３～１７）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８～２０）のいずれか１つとペアリングすることができる。

類似しては、ヒト化４Ｇ１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１～２４に示される。ヒト化４Ｇ１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５～２８に示される。これらの重鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１～２４）のいずれか１つは、これらの軽鎖可変領域配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５～２８）のいずれか１つとペアリングすることができる。

図２５に示すように、ヒト化率とは、国際免疫遺伝情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＩＭＧＴ）データベース中のヒト抗体配列と比較する重鎖又は軽鎖可変領域配列の同一性の割合を意味する。トップヒット（ｔｏｐ ｈｉｔ）とは、重鎖又は軽鎖可変領域配列が他の種よりも特定の種に近いことを意味する。例えば、ヒトへのトップヒットとは、配列が他の種よりもヒトに近いことを意味する。ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）へのトップヒットとは、その配列がヒト配列及びカニクイザル配列と同じ割合の同一性を有し、且つこの割合の同一性が他の種の配列と比較して最高であることを意味する。幾つかの実施態様において、ヒト化率は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％を超える。ヒト化率の決定方法及びトップヒットの決定への詳細な説明は、当技術分野で知られており、Ｊｏｎｅｓ、 Ｔｉｍ Ｄ．、 ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ＩＮＮｓ ａｎｄ ｏｕｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｎａｍｅｓ．” ＭＡｂｓ． Ｖｏｌ． ８． Ｎｏ． １． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ、 ２０１６に記載され、本明細書に援引により組み込まれている。

さらに、幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７～９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９～３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５～３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５～４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１～５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７～５９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３～６５から選ばれる１つ、２つ又は３つの重鎖可変領域ＣＤＲ、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４～６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０～１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２～３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８～４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８～５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４～５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０～６２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６～６８から選ばれる１つ、２つ又は３つの軽鎖可変領域ＣＤＲを含む。

幾つかの実施態様において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）（ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、且つＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる）と、ＣＤＲ １、２、３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）（ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、且つＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる）とを持つ。選択されたＶＨ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列及び選択されたＶＬ ＣＤＲ １、２、３のアミノ酸配列は、図２３（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）及び図２４（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）に示される。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４７というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５１；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６３；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６４；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６５というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６２というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントは、０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６６；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６７；０、１又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６８というＣＤＲの１つ、２つ又は３つを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

挿入、欠失及び置換は、ＣＤＲ配列内、又はＣＤＲ配列の片方や両方の末端で行うことができる。

本開示は、さらに、ＣＴＬＡ４と結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、選択されたＶＨ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）と、選択されたＶＬ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３、１４、１５、１６、１７又は６９であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８、１９、２０又は７０である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１、２２、２３、２４又は７１であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、２６、２７、２８又は７２である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７３であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７４である。幾つかの実施態様において、選択されたＶＨ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７５であり、且つ選択されたＶＬ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７６である。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適比較目的のために整列される（例えば、最適整列のために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は２つにギャップを導入し、比較目的のために、非相同性配列が無視されることができる）。比較目的のために整列されている参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、幾つかの実施態様において、少なくとも９０％、９５％又は１００％である。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置及び第２の配列中の対応する位置は、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められると、分子がその位置で同一である。２つの配列の間でのパーセント同一性は、２つの配列の最適整列のために導入されるギャップ数及び各ギャップの長さを考慮する場合には、配列が共有する同一位置の数の関数である。本開示の目的のために、配列の比較及び２つの配列の間での同一性パーセントの決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスにより達成し、ここで、ギャップペナルティを１２とし、ギャップ伸長ペナルティを４とし、フレームシフト・ギャップ・ペナルティを５とする。

本開示は、さらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供し、前記ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン重鎖を含む。免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖は、図２３又は図２４に示されるＣＤＲを含むか、又は図２５又は図２７に示される配列を有する。ポリペプチドが対応するポリペプチド（例えば、対応する重鎖可変領域又は対応する軽鎖可変領域）とペアリングする場合には、ペアリングしたポリペプチドは、ＣＴＬＡ４と結合する。

抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗原結合フラグメントは、抗体又は抗体フラグメントの抗体変異体（包括誘導体及び複合体を含む）、及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗体フラグメントであってもよい。本明細書で提供される他の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（多量体化抗体、例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ体）、一本鎖抗体、細胞内で産生する抗体（即ち、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ））、及その抗原結合フラグメントであってもよい。抗体又はその抗原結合フラグメントは、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、タイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントである。

抗体のフラグメントは、提供される方法に適合し、全長抗体の望ましい親和性及び特異性を保持すればよい。従って、ＣＴＬＡ－４に結合する抗体のフラグメントは、ＣＴＬＡ－４に結合する能力を保持する。Ｆｖフラグメントは、インタクトな抗原認識及び結合部位を含む抗体フラグメントである。該領域は、強固に結合している１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなり、前記結合は、本質的に共有結合であり、例えば、ｓｃＦｖである。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面での抗原結合部位を限定する。６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、一緒に抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又はＦｖのうち、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含む半分）でも、抗原を認識・結合する能力を持つが、通常、結合部位全体よりも低い親和性である。

単鎖Ｆｖ又は（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメイン（又は領域）を含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にもポリペプチドリンカーを含むため、ｓｃＦｖは抗原結合に望ましい構造を形成できる。

Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の可変及び定常領域と、重鎖の可変ドメイン及び第１の定常領域（ＣＨ１）とを含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、一対のＦａｂフラグメントを含み、それらは、通常に、そのカルボキシ末端付近にヒンジシステインを介して共有結合される。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも当技術分野で知られている。

ダイアボディは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントであり、そのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖でのＶＬに連結されるＶＨ（ＶＨ及びＶＬ）を含む。同一の鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、他の鎖の相補ドメインとペアリングされ、２つの抗原結合部位を発生する。

線状抗体は、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含み、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する。線状抗体は、二重特異性であってもよく又は単特異性であってもよい。

本開示に係る抗体及び抗体フラグメントは、Ｆｃ領域で修飾して所望のエフェクター機能又は血清半減期を提供することができる。

抗体の多量体化は、抗体の自然凝集、又は当技術分野で知られている化学的や組換え連結技術により達成されることができる。例えば、ある程度の割合の精製された抗体製剤（例えば、精製されたＩｇＧ１分子）は、抗体ホモ二量体及び他の高次抗体多量体を含むタンパク質凝集体を自発的に形成する。

また、抗体ホモ二量体は、当技術分野で知られている化学的な連結技術により形成することができる。例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して抗体多量体を形成でき、前記架橋剤は、ＳＭＣＣ（４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－スクシンイミジル）及びＳＡＴＡ（Ｓ－アセチルチオ酢酸スクシンイミジル）を含むが、これらに限定されない。Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４： ７５０９－７５１４、 １９９７）には、抗体ホモ二量体を形成するための例示的な態様が記載されている。ペプシンの消化により抗体ホモ二量体をＦａｂ’_２ホモ二量体に変換することができる。抗体ホモ二量体の他の形成方法は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：３９６－４０４、 ２００２）に記載の自己好性（ａｕｔｏｐｈｉｌｉｃ）Ｔ１５ペプチドの使用によるものである。

幾つかの実施態様において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するために、一対の抗体分子間の界面を設計することにより作成することができる。例えば、界面は、抗体定常領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含むことができる。該方法では、第１抗体分子の界面に由来する１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）に置き換えられる。大きな側鎖と同一又は類似するサイズの代償的な「空洞」は、第２抗体分子の界面で大きなアミノ酸側鎖を、小さな側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）に置換することにより発生する。これは、他の望ましくない最終生成物（例えば、ホモ二量体）よりもヘテロ二量体の収率を高めるメカニズムを提供する。例えば、ＷＯ９６／２７０１１には該方法が記載され、その全体が援引により組み込まれている。

二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つは、アビジンにカップリングし、また、もう１つはビオチンにカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法により作製されることができる。適合な架橋剤及び架橋法は、当分野で周知されているものであり、米国特許Ｎｏ．４，６７６，９８０に開示されており、その全体が援引により本明細書に組み込まれている。

抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生させる技術も当技術分野で知られている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用し調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１、 １９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解により開裂してＦ（ａｂ’）_２フラグメントを発生させる方法を記載している。これらのフラグメントは、ジチオール複合化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元して隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’－チオールに再転換し、等モル量の他のＦａｂ’ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。

本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかは、安定化分子（例えば、対象のｉｎ ｖｉｖｏ又は溶液中の抗体又はその抗原結合フラグメントの半減期を増加させる分子）に結合されることができる。安定化分子の非限定的な例は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）又はタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン）が含まれる。安定化分子の複合化は、抗体又は抗原結合フラグメント在ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養物中又は医薬組成物として保管される場合）又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、ヒト中）での半減期を延長したり、生物学的活性を高めることができる。

抗体特性
本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０の結合及び／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８６の結合を遮断することができる。ＣＴＬＡ４とＣＤ８０の結合及び／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８６の結合を遮断することにより、抗ＣＴＬＡ４抗体はＣＴＬＡ４抑制経路を破壊し、免疫応答をアップレギュレートする。

幾つかの実施態様において、抗体（又はその抗原結合フラグメント）は、１ ｘ １０^－６ Ｍ未満、１ ｘ １０^－７ Ｍ未満、１ ｘ １０^－８ Ｍ未満、１ ｘ １０^－９ Ｍ未満、又は１ ｘ １０^－１０ Ｍ未満という解離定数（Ｋｄ）でＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４、サルＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４及び／又はキメラＣＴＬＡ４）と特異的に結合する。幾つかの実施態様において、Ｋｄは、２０ ｎＭ、１５ ｎＭ、１０ ｎＭ、９ ｎＭ、８ ｎＭ、７ ｎＭ、６ ｎＭ、５ ｎＭ、４ ｎＭ、３ ｎＭ、２ ｎＭ又は１ ｎＭ未満である。

幾つかの実施態様において、Ｋｄは、１ ｘ １０^－７ Ｍ、１ ｘ １０^－８ Ｍ、１ ｘ １０^－９ Ｍ、１ ｘ １０^－１０ Ｍ、１ ｘ １０^－１１ Ｍ又は１ ｘ １０^－１２ Ｍを超える。

抗原に対する抗体の親和性を測定する一般的な手法は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）、サルＣＴＬＡ４（例えば、アカゲザルＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、キメラＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）及び／又はマウスＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）に結合する。幾つかの実施態様において、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）、サルＣＴＬＡ４（例えば、アカゲザルＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、キメラＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）及び／又はマウスＣＴＬＡ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）に結合しない。

幾つかの実施態様において、抗体の腫瘍成長阻害率（ＴＧＩ％）は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％を超える。幾つかの実施態様において、抗体の腫瘍成長阻害率は、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％未満である。ＴＧＩ％は、例えば、治療開始後３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日又は治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２か月で特定されることができる。本明細書で使用されるように、腫瘍成長阻害率（ＴＧＩ％）は、次の式を使用して計算する。

Ｔｉは、ｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群の平均腫瘍体積である。

抗ＣＴＬＡ４抗体の作製方法
ヒトＣＴＬＡ４の単離フラグメントは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製のための標準的技術を使用して抗体を生成する免疫原として用いられる。ポリクローナルは、抗原ペプチド又はタンパク質の複数回の注射（例えば、皮下又は腹腔内注射）により動物内で発生されることができる。幾つかの実施態様において、抗原ペプチド又はタンパク質は、少なくとも１つのアジュバントとともに注射される。幾つかの実施態様において、抗原ペプチド又はタンパク質は、予防接種を受ける種において免疫原性である試薬と複合化されることができる。動物には抗原ペプチド又はタンパク質を１回超え（例えば、２回、３回又は４回）注射することができる。

全長ポリペプチド又はタンパク質を使用することができるか、又はその抗原ペプチド断片を免疫原として使用することができる。タンパク質の抗原ペプチドは、ペプチドに対して産生された抗体がタンパク質と特異性免疫複合体を形成するようにＣＴＬＡ４のアミノ酸配列の少なくとも８個（例えば、少なくとも１０、１５、２０又は３０個）のアミノ酸残基を含み、且つタンパク質のエピトープを含む。上記のように、ヒトＣＴＬＡ４の全長配列は当技術分野で知られている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）。

免疫原は、通常、適合な対象（例えば、ヒト、又は少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニック動物）を予防接種することにより抗体を調製する。適当な免疫原性製剤は、例えば、組換え発現又は化学合成されたポリペプチド（例えば、ヒトＣＴＬＡ４のフラグメント）を含むことができる。該製剤は、さらに、アジュバント、例えば、フロインド完全又は不完全アジュバント、又は類似する免疫増強薬を含む。

ポリクローナル抗体は、上記のように、ＣＴＬＡ４ポリペプチド又はその抗原ペプチド（例えば、ＣＴＬＡ４の一部）を免疫原として適当な対象を予防接種することにより調製される。予防接種された対象の抗体力価は、例えば、固定化ＣＴＬＡ４ポリペプチド又はペプチドを使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な手法により経時的に監視することができる。必要に応じて、抗体分子を哺乳動物（例えば、血液）から単離し、周知の技術、例えば、プロテインＡ/Ｇクロマトグラフィーによりさらに精製してＩｇＧ画分を得る。予防接種後の適切な時間、例えば、特異性抗体力価が最も高い場合、抗体産生細胞を対象から取得し、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７、 １９７５）初回に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ４：７２、 １９８３）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、 Ｉｎｃ．、 ｐｐ． ７７－９６、 １９８５）又はトリオーマ技術などの標準的技術によりモノクローナル抗体を調製する。ハイブリドーマを産生する技術は、よく知られている（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 １９９４、 Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｓ．）、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｉｎｃ．、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹを参照）。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用し、目的のポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体についてハイブリドーマ培養物上清液をスクリーニングすることにより検出される。

本明細書に記載のヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により、本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントの変異体を調製する。このような変異体は、例えば、抗体又は抗原結合部位を構成する抗原結合部位のアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入又は置換を含む。このような変異体の集団では、一部の抗体又は抗原結合フラグメントは、標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４）に対する親和性が増加する。欠失、挿入及び／又はそれらの任意の組み合わせにより標的に対する結合親和性が増加した抗体又はその抗原結合フラグメントを取得することができる。抗体又は抗原結合フラグメントに導入されたアミノ酸の変化は、抗体又は抗原結合フラグメントを変化させ、或いは、それらに新たな翻訳後修飾を導入し、例えば、グリコシル化部位の数量を変更（例えば、増加又は減少）し、グリコシル化部位のタイプを変更し（例えば、細胞中に存在する酵素によって異なる糖が結合するようにアミノ酸配列を変更し）、又は新たなグリコシル化部位を導入する。

本明細書に開示される抗体は、哺乳動物を含む動物のあらゆる種に由来し得る。天然抗体の非限定的な例は、ヒト、霊長類（例えば、サル及び猿）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ及びげっ歯類動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター及びウサギ）に由来する抗体を含み、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類動物を含む。

ヒト及びヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する（又はそれと同じアミノ酸配列を有するものに由来する）可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。ヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ内の、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムや部位特異的突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含む。

ヒト化抗体は、通常、非ヒトＣＤＲが移植されたヒトフレームワーク（ＦＲ）を持つ。従って、ヒト化抗体は、ヒト以外の由来源から導入された１つ以上のアミノ酸残基をもつ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれることが多く、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、例えば、げっ歯類動物ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより行うことができる。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３２１：５２２－５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３３２：３２３－３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２３９：１５３４－１５３６ （１９８８）に記載されており、それぞれ援引により本明細書に組み込まれる。従って、「ヒト化」抗体は、インタクトなヒトＶドメインよりも少ないものが非ヒト生物種由来の対応配列によって実質的に置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、通常、一部のＣＤＲ残基及び一部のＦＲ残基がヒト抗体中の類似する部位に由来する残基によって置換されるマウス抗体である。

ヒト化抗体を作製するためのヒトＶＨ及びＶＬドメインの選択は、免疫原性の低減に非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」という方法によれば、既知のヒトドメイン配列のライブラリ全体に対してマウス抗体のＶドメインの配列をスクリーニングする。そして、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトＦＲとして組み込まれる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 １５１：２２９６ （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、 １９６：９０１ （１９８７））。

さらには、抗体をヒト化するとともに、抗原に対する高特異性、親和性及び他の有利な生物学的特性を保持することは重要である。この目標を達成するために、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図示し表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性がある役割を分析し、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、レシピエント配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加を取得することができる。

通常、ヒト、ヒト化又はキメラ抗ＣＴＬＡ４抗体のアミノ酸配列変異体は、元の抗体の軽鎖又は重鎖に存在する配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有るアミノ酸配列を含む。

元の配列に対する同一性又は相同性は、通常、配列を整列させて必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の最大パーセントを達成しながら配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない場合には、候補配列中で存在する、ヒト、ヒト化又はキメラ抗ＣＴＬＡ４抗体又はフラグメントに存在する配列と同じアミノ酸残基の百分率である。抗体配列のＮ端、Ｃ端又は内部の伸長、欠失又は挿入は、いずれも配列の同一性又は相同性に影響を与えると解釈されない。

抗ＣＴＬＡ４抗体又は抗原結合フラグメントには、追加の修飾を加えることができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、該領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。これにより産生するホモ二量体抗体は、任意に延長される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を有する。また、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することにより、延長されるｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を持つホモ二量体抗体を調製することができ、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２５６０－２５６５、 １９９３）に記載されている。また、２つのＦｃ領域を持つ抗体を改造することができる（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０、 １９８９を参照）。

幾つかの実施態様において、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合フラグメントに共有結合修飾を行うことができる。これらの共有結合修飾は、化学的や酵素的合成、又は酵素的や化学的切断により行うことができる。抗体又は抗体フラグメントの他のタイプの共有結合修飾は、抗体又はフラグメントの標的とするアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることにより分子に導入される。

組換えベクター
本開示は、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）、それに組換えベクターが導入される宿主細胞（即ち、宿主細胞はポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド含有ベクターを含む）、及び組換え技術による組換え抗体ポリペプチド又はそのフラグメントの生産を提供する。

本明細書で使用される「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入される場合に、１種又は複数種の目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達できる任意の構築物である。「発現ベクター」は、１種又は複数種の目的のポリヌクレオチドを送達しながら、発現ベクターが導入された宿主細胞に１種又は複数種の目的ポリヌクレオチドをコードされるポリペプチドとして発現することができる。従って、発現ベクターにおいて、ベクター又は宿主細胞ゲノム中の調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はポリＡ尾部と作動可能に連結することにより、目的のポリヌクレオチドをベクター中に発現し、前記調節エレメントは、目的のポリヌクレオチドが発現ベクターが導入された宿主細胞内で翻訳されるように、目的のポリヌクレオチドの統合部位又はその付近又は脇側にある。

ベクターは、当該分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーション、化学的トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスによる）によって宿主細胞に導入される。従って、ベクターの非限定的な例は、ウイルスベクター（組換えウイルスを生成するために使用できる）、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、黏粒、ファージベクター及びカチオン性凝集剤に結び付けるＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターを含む。

幾つかの実施態様において、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、使用ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され、ここで、非病原性（欠陥）複製コンピテントウイルス、又は複製欠陥ウイルスの使用に関する。後者の場合には、ウイルスの増殖は、一般にウイルスパッケージング細胞を補完する場合にのみ発生する。適当な系は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ－Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：３１７－３２１；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ５６９：８６－１０３；Ｆｌｅｘｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９０、 Ｖａｃｃｉｎｅ、 ８：１７－２１；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４、６０３、１１２、４、７６９、３３０、及び、５、０１７、４８７； ＷＯ ８９／０１９７３；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４、７７７、１２７；ＧＢ ２、２００、６５１；ＥＰ ０、３４５、２４２；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 ６：６１６－６２７、 １９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．、 １９９１、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５２：４３１－４３４；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、 １９９４、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ９１：２１５－２１９；Ｋａｓｓ－Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ９０：１１４９８－１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、 ８８：２８３８－２８４８；及び Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｃｉｒ． Ｒｅｓ．、 ７３：１２０２－１２０７に開示されている。そのような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡは、「裸」であってもよく、例えば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、 １９９３、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５９：１７４５－１７４９及びＣｏｈｅｎ、 １９９３、 Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５９：１６９１－１６９２に記載されるようになる。ＤＮＡを、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にコーティングして裸のＤＮＡの取り込みを向上させることができる。

発現のために、本明細書に開示される抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡインサートは、適当なプロモーター（例えば、異種プロモーター）、例えば、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどに有効的に連結する。他の適切なプロモーターは、当業者に知られている。発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位、及び転写領域で翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことができる。構築物により発現される成熟転写物のコーディング領域は、開始位置にある翻訳開始点、及び翻訳されるポリペプチド末端に適当に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むことができる。

上記のように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことができる。このようなマーカーは、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌での培養用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表例は、例えば、大腸菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫及びＨＫ ２９３細胞などの動物細胞；植物細胞を含むが、これらに限定されない。本明細書に記載の宿主細胞に適切な培地および条件は、当技術分野で知られている。

細菌で用いられる非限定的なベクターは、Ｑｉａｇｅｎから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ－９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。非限定的な真核ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを含む。他の適当なベクターは、当業者にとって容易に明らかになる。

適当に使用される非限定的な細菌プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ及びＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーターを含む。適当な真核プロモーターは、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）のようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターを含む。

醸造用酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、構成的または誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨ）含む大きくのベクターを使用できる。レビューについては、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎ．Ｙ、 及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、 １５３： ５１６－５４４ （１９９７）を参照する。

宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の方法により実現できる。多くの標準的な実験室マニュアルには、例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．、 ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （１９８６）という方法が記載される。

エンハンサー配列をベクターに挿入することにより、高等真核生物による本開示に係る抗体をコードするＤＮＡの転写を増加することができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシスエレメントであり、通常、約１０～３００ｂｐであり、特定の宿主細胞タイプのプロモーターの転写活性を高める働きを奏する。エンハンサーの実例としては、塩基対１００～２７０で複製出発点の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製出発点の後側に位置するポリオーマウィルスエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。

翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、周辺腔または細胞外環境に分泌するために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。シグナルはポリペプチドに内因性であっても、異種シグナルであってもよい。

ポリペプチド（例えば、抗体）は、修飾された態様、例えば、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ－融合タンパク質）又はヒスチジンタグを備える態様、で発現でき、分泌シグナルだけでなく、他の異種機能領域も含む場合がある。例えば、ポリペプチドのＮ末端に別のアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域を追加し、宿主細胞において、精製中又はその後の取り扱い及び保管期間の安定性及び持続性を改善することができる。また、精製しやすいために、ペプチド部分をポリペプチドに加えることができる。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去されることができる。ポリペプチドへのペプチド部分の付加により分泌または排泄を引き起こすることで、安定性を改善し、精製しやすくすることは、当技術分野でよく知られた通常の技術である。

治療方法
本開示に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、多くの治療目的に用いられる。一方、本開示は、対象の癌を治療するための方法、対象中腫瘍体積の経時的増大の速率を低減させる方法、転移のリスクを低下させる方法、又は対象中に別の転移が発生するリスクを低下させる方法を提供する。幾つかの実施態様において、癌の進行を停止、退縮、遅延、または阻害する可能性がある。幾つかの実施態様において、治療は、対象中の癌の１種又は複数種の症状の数、重症度及び／又は持続期間の減少をもたらす。

一つの側面では、本開示は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合フラグメントを治療有効量でそれを必要とする対象（例えば、癌を有する、または癌を有すると同定または診断された対象）に投与することを含む方法を特徴とする。癌としては、例えば、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、カルチノイドがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、 腎がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿道がん、または血液悪性腫瘍が挙げられる。幾つかの実施態様において、癌は、切除不能な黒色腫または転移性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。

幾つかの実施態様において、本明細書に開示される組成物および方法は、癌のリスクがある患者の治療に使用することができる。癌患者は、当技術分野で知られているさまざまな方法で特定できる。

本明細書で使用される「有効量」とは、有益または望ましい結果（疾患、例えば癌の進行を停止、退縮、遅延、または阻害することを含む）をもたらすのに十分な量又は用量を意味する。有効量は、例えば、抗体、抗原結合断片、抗体をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、および/またはそれらの組成物が投与される個体の年齢および体重、重症度、投与経路に応じて異なり、したがって、各々患者の状況に応じて投与する。

有効量は、１回又はそれ以上の投与で投与できる。例としては、抗体又は抗原結合フラグメントの有効量は、患者の癌の進行を改善、停止、安定化、逆転、阻害、退縮および/または遅延させるのに十分な量、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載の癌細胞のいずれか、又は細胞株（例えば、癌細胞株））の増殖を改善、停止、安定化、逆転、阻害、退縮および/または遅延させるのに十分な量である。当技術分野で理解されているように、抗体又は抗原結合フラグメントの有効量は、変化してもよく、これは、特に、患者の病歴及び他の因素、例えば、使用される抗体のタイプ（及び／又は用量）によるものである。

本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド及び／又は組成物の有効量及びスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の範囲内である。当業者は、投与する必要がある用量が、例えば、本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド及び／又は組成物を投与する哺乳動物、投与経路、用いられる本明細書に開示されている抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗原結合フラグメント及び／又は組成物の具体的なタイプ、及び哺乳動物が投与される他の薬物に応じて変化する。抗体又は抗原結合フラグメントの適当な用量の指針は、抗体及び抗原結合フラグメントの治療用途に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、 ｅｄｓ．、 Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ、 Ｎ．Ｊ．、 １９８５、 ｃｈ． ２２ ａｎｄ ｐｐ． ３０３－３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．、 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、 ｅｄｓ．、 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９７７、 ｐｐ． ３６５－３８９に見つけられる。

抗体の有効量の典型的な１日投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施態様において、用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であることできる。幾つかの実施態様において、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ又は０．０１ｍｇ／ｋｇを超えることできる。幾つかの実施態様において、用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇである。

本明細書に記載の任意の方法において、少なくとも１種の抗体、その抗原結合フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合フラグメント又は医薬組成物）、及び選択してもよい少なくとも１種の追加の治療剤は、対象に少なくとも週１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回又は１日３回）投与される。幾つかの実施態様において、同じ組成物（例えば、液体組成物）では少なくとも２種の異なる抗体及び／又は抗原結合フラグメントが投与される。幾つかの実施態様において、同じ組成物（例えば、液体組成物）では、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント及び少なくとも１種の追加の治療剤が投与される。幾つかの実施態様において、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント及び少なくとも１つの追加の治療剤は、２種の異なる組成物（例えば、少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメントを含む液体組成物、及び少なくとも１つの追加の治療剤を含む経口固体組成物）で投与される。幾つかの実施態様において、前記少なくとも１種の追加の治療剤は、丸剤、錠剤又はカプセルとして投与される。幾つかの実施態様において、前記少なくとも１つの追加の治療剤は、徐放性経口製剤として投与される。

幾つかの実施態様において、少なくとも１種の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を投与する前又は後に、１種又は複数種の追加の治療剤を対象に投与する。幾つかの実施態様において、１種又は複数種の追加の治療剤及び少なくとも１種の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を対象に投与することができ、対象において１種又は複数種の追加の治療剤及び少なくとも１種の抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメント）の生物活性期間が重なり合うことになる。

幾つかの実施態様において、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載の任意の抗体、抗原結合抗体フラグメント又は医薬組成物）を対象に長期間（例えば、在少なくとも１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１年、２年、３年、４年又は５年の期間内）投与する。熟練した医療専門家は、本明細書に記載される、治療の有効性を診断または追跡するための任意の方法（例えば、癌の少なくとも1つの症状の観察）により治療期間の長さを決定することができる。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家は、治療の有効性の評価（例えば、本明細書に記載及び当技術分野で知られている任意の方法）に基づいて、対象に投与する抗体又は抗原結合抗体フラグメント（及び／又は１種又は複数種の追加の治療剤）の種類及び数量（例えば、増加又は減少）を変更してもよく、さらに、対象に投与する少なくとも１種の抗体又は抗原結合抗体フラグメント（及び／又は１種又は複数種の追加の治療剤）の用量又は頻度を調整（例えば、向上又は低減）してもよい。

医薬組成物及び投与経路
本明細書には、さらに、少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種又は４種）の本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれかの２種又はそれ以上（例えば、２種、３種又は４種）は、任意に組み合わせて医薬組成物に存在することができる。医薬組成物は、当技術分野で知られている任意の方法で製剤化することができる。

医薬組成物は、意図された投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内）に適合するように調製される。組成物は、滅菌希釈剤（例えば、滅菌水又は生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン、チメロサールなどの抗菌剤又は抗真菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液；及び糖（例えば、デキストロース）、多価アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）又は塩（例えば、塩化ナトリウム）などの等張化剤；又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容される担体としても使用できる（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号を参照）。組成物の製剤を調製し、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入することができる。必要とする場合には（例えば、注射用製剤など）、例えば、コーティング（例えば、レシチン）又は界面活性剤を使用することにより適切な流動性を維持することができる。吸収を遅延させる試薬（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことにより抗体又はその抗原結合フラグメントの吸収を延長させることができる。また、制御放出は、生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を含むインプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムによって実現できる。

本明細書に記載の抗体又は抗原結合フラグメントのいずれか１種又は複数種を含む組成物は、投与単位形態（即ち、投与を容易にし、投与量を均一にするための、予定量の活性化合物を含む物理的分散ユニット）で非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内）投与する。

組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物（例えば、サル）において標準的な薬学的操作によって決定できる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を特定できる。治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤が望ましくない副作用を示すと、潜在的なリスクを最小限に抑える（即ち、望ましくない副作用を減らす）ように注意する必要がある。毒性及び治療効果は、他の標準的な薬学的操作によって決定できる。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、適当な用量で任意の所与の薬剤を調製して対象（例えば、ヒト）に投与するのに使用できる。１種又は複数種の（例えば、１種、２種、３種又は４種）抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、本明細書に記載の任意の抗体又は抗体フラグメント）の治療有効量は、対象（例えば、癌を有すると判定されたヒト対象）、又は疾患を発症するリスクがあると判定された対象（例えば、以前に癌を発症したが現在に治癒された対象）において対象の疾患を治療し（例えば、癌細胞を殺す）、対象（例えば、ヒト）の疾患の１種又は複数種の症状の重症度、頻度及び／又は持続期間を低減させる量である。本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメントの有効性及び用量は、医療専門家または獣医専門家が当該分野で公知の方法を使用し、対象（例えば、ヒト）における疾患の１種又は複数種の症状を観察することにより決定することができる。特定の要因は、対象を効果的に治療するために必要な用量及びタイミングに影響を与える可能性がある（例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康および/または年齢、および他の疾患の存在）。

例示的な用量は、対象の体重１キログラム当たり本明細書に記載の任意の抗体又は抗原結合フラグメントのミリグラムまたはマイクログラム（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ；約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ；又は約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ）を含む。これらの用量は広い範囲をカバーするが、当業者は、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む治療剤の効力が異なり、有効量は当技術分野で既知の方法により決定できることを理解すべきでる。通常、最初は比較的低用量を投与し、担当の医療専門家または獣医専門家（治療的応用の場合）または研究者（まだ開発段階で作業している場合）は、適切な応答が得られるまで徐々に用量を増やすことができる。さらに、特定の対象の具体的用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、および抗体または抗体フラグメントのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期などのさまざまな要因に依存することが理解される。

医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。

以下、以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１． マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体の産生
ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１）に対するマウス抗体を産生するために、６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトＣＴＬＡ４で予防接種した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、以下に記載の方法により収集された（図１及び図２）。

マウスの予防接種
６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを１００μｇ／ｍｌの濃度で２０μｇ／マウスのｈｉｓタグ付きヒトＣＴＬＡ４タンパク質で予防接種した。ｈｉｓタグ付きヒトＣＴＬＡ４タンパク質をアジュバントで乳化し、マウスの背中の4つの位置に注射した。１回目の皮下（ｓ．ｃ．）注射では、希釈された抗原を同体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した。次の皮下注射では、タンパク質を同体積の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化した。３回目の注射又は追加予防接種の３日後に、血液（血清）を収集し、ＥＬＩＳＡを使用して抗体価を分析した。

別の実験では、ヒトＣＴＬＡ４をコードする発現プラスミドをマウスに注入することにより６～８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを予防接種した。抗原をコードするプラスミドを、１０００μｇ／μｌの濃度で各マウスあたり６０μｇにて遺伝子銃を使用することにより、マウスの前脛骨筋に注射した（筋肉内注射；ｉ．ｍ．注射）。各注射の間に少なくとも１４日間、少なくとも４回の注射が行われた。最後の予防接種から７日後に血液（血清）を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価について血清を検査した。

前の予防接種の少なくとも１４日後に、さらに、予防接種を強化する手順も実行された（プラスミドの注射又はタンパク質の注射）。表面にＣＴＬＡ４抗原を発現するＣＨＯ細胞を尾静脈からマウスに静脈内注射した。そして、注射の４日後に脾臓を採取した。

ＳＰ２／０細胞と脾臓細胞の融合
脾臓組織を粉砕した。まず、ＣＤ３εマイクロビーズ及び抗マウスＩｇＭマイクロビーズにより脾臓細胞を選択し、次に、ＳＰ２／０細胞と融合させた。その後、細胞をヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地を含む９６ウェルプレートに播種した。

ハイブリドーマの１次スクリーニング
標準的プロトコルに従って、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）を使用し、９６ウェルプレート内のハイブリドーマ上清に１次スクリーニングを行った。スクリーニングの前に、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞を９６ウェルプレートに加えた（ウェルあたり２×１０^４細胞）。上清５０μｌを使用した。実験で使用された抗体は、

（１）フルオレセイン（ＦＩＴＣ）複合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的；及び

（２）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７複合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的である。
サブクローン
ＣｌｏｎｅＰｉｘ２を使用してサブクローン化を施した。簡単的には、１次スクリーニング中に特定された陽性ウェルを半固体培地に移し、ＩｇＧ陽性クローンを同定してテストした。ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を使用した。

腹水抗体
１×１０^６個の陽性ハイブリドーマ細胞をＢ－ＮＤＧ（登録商標）マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ、北京、中国）に腹腔内注射した。マウスの腹腔内でハイブリドーマ細胞を増殖させることによりモノクローナル抗体を産生した。ハイブリドーマ細胞は、マウスの腹部に増殖し腹水を産生した。腹水は、高濃度の抗体を含み、それを採取して用意した。

抗体精製
腹水中の抗体は、ＧＥ ＡＫＴＡタンパク質液体クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、 Ｃｈｉｃａｇｏ、 Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）により精製された。ＣＴ４－０４－１３Ａ４（「１３Ａ４」）、ＣＴ４－０３－４Ｇ１２（「４Ｇ１２」）、ＣＴ４－２０－６Ｄ２（「６Ｄ２」）及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２（「７Ｅ１２」）は、上記の方法により産生したマウス抗体に存在した。これらの抗体の重鎖・軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、図２７に示した。

実施例２． マウス抗体のヒト化
ヒト化の出発点は、マウス抗体（例えば、１３Ａ４及び４Ｇ１２）である。これらのマウス抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を特定した。異なる置換の配列を含む（図２５を参照）、１３Ａ４の５つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３～１７）及び３つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８～２０）を構築した。ヒト化１３Ａ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～６（Ｋａｂａｔ番号）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９～３４（Ｃｈｏｔｈｉａ番号）に示した。

異なる置換の配列を含む（図２５を参照）、４Ｇ１２の４つのヒト化重鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２４）及び４つのヒト化軽鎖可変領域変異体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２８）を構築した）。ヒト化４Ｇ１２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～１２（Ｋａｂａｔ番号）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５～４０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号）に示した。

これらのヒト化抗体は、標準的プロトコルで発生し、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ １．０（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、中国上海）を使用した。

実施例３． マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験：ＣＤ８０及びＣＤ８６のＣＴＬＡ４結合の遮断
抗ＣＴＬＡ４抗体がＣＴＬＡ４とＣＤ８０の結合及びＣＴＬＡ４とＣＤ８６の結合を遮断できるかどうかを判定するために、ブロッキングアッセイを実施した。

抗ＣＴＬＡ４抗体は、マウス腹水から採取され、クロマトグラフィーで精製された。ヒトＣＴＬＡ４で一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞２５μｌをプレートの各ウェルに加えた。精製抗体は、最終濃度が５０、５、０．５、０．０５、０．００５ μｇ／ｍｌになるまで滴下された。滴下された抗体を、各ウェルに４℃でウェルあたり２５ μｌ添加し、３０分間インキュベートした。

ビオチン－ｈＣＤ８０又はビオチン－ｈＣＤ８６を０．４μｇ／ｍｌに滴下した。リガンド溶液５０μｌを各ウェルに加え、ビオチン－ｈＣＤ８０又はビオチン－ｈＣＤ８６の最終濃度を０．２μｇ／ｍｌにした。ビオチン－ｈＣＤ８０又はビオチン－ｈＣＤ８６を含む細胞を４℃で１５分間インキュベートした。

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、４℃で５０μｌの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）及びストレプトアビジン－フィコエリトリン（ストレプトアビジン－ＰＥ）を１：１００の希釈倍率で各ウェルに添加し、１５分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ及びＰＥのシグナルは、フローサイトメトリーにより特定された。

図３に示すように、マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体（ＣＴ４－０４－１３Ａ４及びＣＴ４－０３－４Ｇ１２）の濃度が向上すると、ＰＥのシグナルが低下し、ＣＴ４－０４－１３Ａ４及びＣＴ４－０３－４Ｇ１２抗体はヒトＣＴＬＡ４とビオチン－ｈＣＤ８０の結合を阻害することが分かった。

類似して、図４では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体（ＣＴ４－０４－１３Ａ４及びＣＴ４－０３－４Ｇ１２）の濃度が向上すると、ＰＥのシグナルが低下し、ＣＴ４－０４－１３Ａ４及びＣＴ４－０３－４Ｇ１２抗体がヒトＣＴＬＡ４とビオチン－ｈＣＤ８６の結合を阻害することが分かった。

実施例４． サル、マウス及びヒト－マウスキメラＣＴＬＡ４に対するキメラ抗ｈＣＴＬＡ抗体の交差反応性
ＣＨＯ細胞にアカゲザルＣＴＬＡ４（ｒｍＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、マウスＣＴＬＡ４（ｍＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）及びキメラ（マウス及びヒト）ＣＴＬＡ４（ｃｈｉＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）をトランスフェクトした。

ＣＨＯ細胞２５μｌを各ウェルに添加した。精製キメラ抗ｈＣＴＬＡ抗体（１ μｇ／ｍｌ）（ＣＴ４－０３－４Ｇ１２－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１及びＣＴ４－０４－１３Ａ４－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１）を各ウェルに２５μｌ加え、４℃で３０分間インキュベートした。ＣＴ４－０３－４Ｇ１２－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１及びＣＴ４－０４－１３Ａ４－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、キメラ抗ｈＣＴＬＡ抗体である。ＣＴ４－０３－４Ｇ１２－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、マウス抗体４Ｇ１２に由来する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン、及びヒトＩｇＧ１抗体定常領域（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有した。類似して、ＣＴ４－０４－１３Ａ４－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、マウス抗体１３Ａ４に由来する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン、及びヒトＩｇＧ１抗体定常領域（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を有した。

ＰＢＳ（１２００ ｒｍｐ，５分間）で２回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）５０μｌを以１：１００の希釈倍率で各ウェルに加え、４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣのシグナルは、フローサイトメトリーにより特定された。

図５に示すように、ＣＴ４－０４－１３Ａ４－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、マウスＣＴＬＡ４と交差反応せず、ｒｍＣＴＬＡ４及びキメラＣＴＬＡ４と強い交差反応性を有した。類似して、ＣＴ４－０３－４Ｇ１２－ｍＨｖＫｖ－ＩｇＧ１は、マウスＣＴＬＡ４と交差反応せず、ｒｍＣＴＬＡ４及びキメラＣＴＬＡ４と強い交差反応性を有した。図５では、ＮＣは、陰性対照を示し、ＰＣは、陽性対照を示した。

実施例５． マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏ検出
ｉｎ ｖｉｖｏで抗ｈＣＴＬＡ４抗体をテストし、人体中でこれらの抗体の作用を予測するために、ＣＴＬＡ－４ヒト化マウスモデルを作成した。ＣＴＬＡ４ヒト化マウスモデルは、マウスＣＴＬＡ４タンパク質の細胞外領域の一部がヒトＣＴＬＡ４細胞外領域で置換されたキメラＣＴＬＡ４タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）を発現するように設計された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４の４１～１４３番目のアミノ酸残基は、ヒトＣＴＬＡ４に由来する。ヒト化マウスモデル（Ｂ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウス）は、ヒトとマウスＣＴＬＡ４を発現する通常のマウスの臨床結果の差を大幅に減らすことにより、臨床設定で新しい治療法をテストするための新しいツールを提供できる。

結腸癌モデルにおいて、抗ｈＣＴＬＡ４抗体をアッセイしてｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長に対する作用を示した。ＭＣ－３８癌腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）をＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスに皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ｍｍ^３の体積に達する場合には、腫瘍の体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた。次いで、マウスにＰＢＳ及び抗ｈＣＴＬＡ４抗体を静脈内注射した。抗体は３日ごとに合計１５日間投与された（合計６回の注射）。注射量は、１０μｌ／ｇでマウスの体重に基づいて計算された。腫瘍の長軸及び短軸の長さは、毎週2回測定され、腫瘍の体積を０．５×（長軸）×（短軸）^２として計算された。マウスの体重は、さらに、注射前、マウスを異なる群に分ける際に（１回目の抗体注射の前）、抗体注射期間中に週２回、安楽死前に測定された。

腫瘍成長阻害率（ＴＧＩ％）は、次の式：ＴＧＩ （％） ＝ ［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００を使用して計算された。Ｔｉは、ｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群の平均腫瘍体積である。

統計分析のためにＴ検定を実施した。ＴＧＩ％が６０％を超えると、腫瘍の成長が著しく抑制された。ｐ ＜０．０５は、有意差を示す閾値である。

マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体１３Ａ４及び４Ｇ１２のｉｎ ｖｉｖｏ結果
マウスの体重は、治療期間全体にわたて監視されモニタリングされた。異なる群のマウスの体重は、すべて増加した（図６及び図７）。対照群と抗ｈＣＴＬＡ４治療群の間に体重の有意差は観察されなかった。結果としては、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。

しかしながら、腫瘍サイズは、抗体１３Ａ４及び４Ｇ１２で処置された群で有意差を示した（図８を参照）。図８に示すように、１３Ａ４及び４Ｇ１２は、用量依存的に腫瘍成長を抑制した。興味深いことには、用量が１ ｍｇ／ｋｇの４Ｇ１２と比較して、用量が０．３ ｍｇ／ｋｇの４Ｇ１２は、より良い結果を示し、比較的低い用量（例えば、０．５ ｍｇ／ｋｇ未満、又は０．１ ｍｇ／ｋｇ～０．５ ｍｇ／ｋｇ）の４Ｇ１２は、最高の結果を達成できる。

次の表に示すように、各治療群の２２日目のＴＧＩ％も計算された。

１３Ａ４及びＹｅｒｖｏｙのｉｎ ｖｉｖｏ結果
ＣＴＬＡ４抗体の效力を比較するために、Ｙｅｒｖｏｙを１３Ａ４と同一の実験で使用した。異なる群のマウスは、投与中に、体重がすべて増加した（図９及び図１０を参照）。毒性効果は観察されなかった。

１３Ａ４及びＹｅｒｖｏｙ治療は、いずれも腫瘍サイズの有意な減少をもたらした（図１１を参照）。特に、Ｙｅｒｖｏｙと比較しては、１３Ａ４治療は、少なくともＹｅｒｖｏｙと比較可能な結果をもたらした。両方の治療群の２８日目のＴＧＩ％を以下に示した。

実施例６． ヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏ結果
ヒト化抗体は、実施例２に記載の方法により産生した。ヒト化抗体の治療効果を確認するために、６つのヒト化抗ｈＣＴＬＡ４抗体（４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１；４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１；１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１；１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１；１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４；１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａ）をＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスでテストし、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長に対する効果を示した（図１２～１７）。さらに、グリカン不均一性を低減させるために、ヒト化抗体１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１的Ｆｃ領域をさらに改良し、２９７位のアスパラギンをアラニンで置換した（図１７を参照）。抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を下表に示した。

実施例５に記載と同様の手順が使用された。ＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）をＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスに皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ｍｍ^３の体積に達する場合には、マウスは、腫瘍の体積に基づいて異なる群に分けられた。次いで、ＰＢＳ及び抗ｈＣＴＬＡ４抗体をマウスに静脈内注射した。抗体は、週２回（毎週の１、４日目）に３週間（合計６回の注射）投与された。用量は、マウスの体重に基づいて１０ ｍｇ／ｋｇにて計算された。腫瘍の長軸と短軸の長さを毎週２回測定し、腫瘍の体積を０．５×（長軸）×（短軸）^２と計算した。マウスの体重も、注射前、及びマウスを異なる群に分ける時（１日目の抗体注射前）に測定された。体重は、抗体注射期間中に週２回、および安楽死の直前の時点に測定された。

腫瘍成長阻害率（ＴＧＩ％）は、次の式：ＴＧＩ （％） ＝ ［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００により計算された。Ｔｉは、ｉ日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群の平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群の平均腫瘍体積である。

統計分析のためにｔ検定を実施した。ＴＧＩ％が６０％を超えると、腫瘍成長が著しく抑制された。ｐ ＜０．０５は有意差を示すと見なされた。

４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１のｉｎ ｖｉｖｏ結果
マウスを以下の４群に分けた。１）Ｇ１では、ヒトＩｇＧを対照として使用し；２）Ｇ４では、Ｙｅｒｖｏｙを比較目的でマウスに投与し；３）Ｇ１０では、４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１をマウスに投与し；及び４）Ｇ１１では、４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１をマウスに投与した。

４つの群のマウスの体重は、投与期間全体にわたってモニタリングした（図１２及び図１３を参照）。各群中のマウスは、ほとんど健康であり、結果としては、抗ＣＴＬＡ４抗体は忍容性が高く、マウスに対して毒性がないことを示した。

しかしながら、Ｙｅｒｖｏｙ、４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１で処置された群では、腫瘍サイズが有意に小さくなった（図１４を参照）。図１４に示すように、４Ｇ１２－Ｈ１Ｋ１－ＩｇＧ１（Ｐ ＝ ０．００２）及び４Ｇ１２－Ｈ２Ｋ１－ＩｇＧ１（Ｐ ＝ ０．００２）は、対照群よりも腫瘍の成長を抑制し、Ｙｅｒｖｏｙ（Ｐ ＝ ０．００７）よりもより良い結果を有した。各治療群の２１日目のＴＧＩ％を以下に示した。

１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４及び１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａのｉｎ ｖｉｖｏ結果
マウスを６群に分けた。１）Ｇ１では、ヒトＩｇＧを対照群として使用され；２）Ｇ４では、Ｙｅｒｖｏｙを比較目的でマウスに投与し；３）Ｇ６では、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１をマウスに投与し；４）Ｇ７では、１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１をマウスに投し；５）Ｇ８では、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ４をマウスに投与し；及び６）Ｇ９では、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１－Ｎ２９７Ａをマウスに投与した。

６つの群のマウスの体重は、投与期間全体にわたってモニタリングした（図１５及び図１６を参照）。結果としては、各群マウスは、いずれも健康であり、抗ＣＴＬＡ４抗体マウスに対して毒性がないことを示した。

しかしながら、各群の腫瘍体積は異なる。図１７に示すように、対照群と比較して、すべての抗ＣＴＬＡ４抗体は、腫瘍成長を抑制することができる。特に、Ｙｅｒｖｏｙよりも、１３Ａ４－Ｈ１Ｋ２－ＩｇＧ１及び１３Ａ４－Ｈ２Ｋ２－ＩｇＧ１は、より良い結果を有する。

各治療群の２１日目のＴＧＩ％を以下に示した。

実施例７． マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出：ＣＴ４－２０－６Ｄ２（「６Ｄ２」）及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２（「７Ｅ１２」）
抗ＣＴＬＡ４抗体は、マウス腹水から採取され、クロマトグラフィーで精製された。ヒトＣＴＬＡ４で一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞２５μｌをプレートの各ウェルに加えた。精製抗体は、最終濃度が５０、５、０．５、０．０５、０．００５ μｇ／ｍｌになるまで滴下された。滴下された抗体を各ウェルに４℃で各ウェルあたり２５μｌ添加し、３０分間インキュベートした。ビオチン－ｈＣＤ８６を０．４μｇ／ｍｌに滴下した。リガンド溶液５０μｌを各ウェルに加え、ビオチン－ｈＣＤ８６の最終濃度を０．２ μｇ／ｍｌにした。ビオチン－ｈＣＤ８６を含む細胞を４℃で１５分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、４℃で５０μｌの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）及びストレプトアビジン－フィコエリトリン（ストレプトアビジン－ＰＥ）を１：１００の希釈倍率で各ウェル中に添加し、１５分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ及びＰＥのシグナルは、フローサイトメトリーにより確認した。

図１８に示すように、抗ｈＣＴＬＡ４抗体（ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２）の濃度が向上すると、ＰＥのシグナルが低下し、ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２抗体はヒトＣＴＬＡ４とビオチン－ｈＣＤ８６の結合を阻害することが分かった。

実施例８． サル、マウス及びヒト－マウスキメラＣＴＬＡ４に対する抗ｈＣＴＬＡ抗体の交差反応性
アカゲザルＣＴＬＡ４（ｒｍＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３）、マウスＣＴＬＡ４（ｍＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２）及びキメラ（マウス及びヒト）ＣＴＬＡ４（ｃｈｉＣＴＬＡ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４）をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。

ＣＨＯ細胞２５μｌを各ウェルに添加した。精製マウス抗ｈＣＴＬＡ抗体（１ μｇ／ｍｌ）（ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２）を各ウェルに２５μｌ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。

ＰＢＳ（１２００ｒｍｐ，５分間）で２回洗浄した後に、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体フルオレセインイソチオシアネート（ＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ）５０μｌを１：１００の希釈倍率で各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣのシグナルは、フローサイトメトリーにより特定された。

図１９に示すように、ＣＴ４－２０－６Ｄ２及びＣＴ４－２０－７Ｅ１２は、マウスＣＴＬＡ４と交差反応せず、キメラＣＴＬＡ４に弱い交差反応性を有し、ｒｍＣＴＬＡ４に比較的強い交差反応性を有した。

実施例９． マウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏ検出
結腸癌モデルにおいて、抗ｈＣＴＬＡ４抗体をアッセイしてｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長に対する作用を示した。ＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺癌細胞）をＢ－ｈＣＴＬＡ－４ヒト化マウスに皮下注射した。マウスの腫瘍が１５０±５０ｍｍ^３の体積に達する場合には、腫瘍の体積に基づいてマウスをランダムに異なる群に分けた。次いで、ＰＢＳ及び抗ｈＣＴＬＡ４抗体をマウスに静脈内注射した。抗体は週２回投与された（合計６回の注射）。対照群では、マウスに生理食塩水を投与した。注射量は、マウスの体重に基づいて１０μｌ／ｇにて計算された。腫瘍の長軸及び短軸の長さは毎週２回測定され、腫瘍の体積を０．５×（長軸）×（短軸）^２として計算した。マウスの体重も、注射前、マウスを異なる群に分ける時（１回目の抗体注射前）、抗体注射期間中に週２回、安楽死前に測定された。

統計分析のためにＴ検定を実施した。ＴＧＩ％が６０％を超えると、腫瘍成長が有意に抑制されることを示した。ｐ＜０．０５は有意差を示すと見なされた。

マウスの体重は、投与期間全体にわたてモニタリングした。異なる群のマウスの体重は、いずれも増加した（図２０及び図２１を参照）。対照群と抗ｈＣＴＬＡ４治療群の間に体重の有意差は観察されなかった。結果としては、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、マウスに毒性がないことを示した。

しかしながら、腫瘍サイズは、抗体１３Ａ４、６Ｄ２及び７Ｅ１２で処置された群で有意差を示した（図２２を参照）。図２２に示すように、１３Ａ４、６Ｄ２及び７Ｅ１２は、いずれもマウスの腫瘍成長を阻害した。

各治療群の２１日目のＴＧＩ％は、以下に示した。

その他の実施態様
本発明に係る具体的な実施形態と組み合わせて本発明を説明したが、上記の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのではなく例示することを意図していることを理解すべきである。他の側面、利点及び修正案も添付の特許請求の範囲内にある。

Claims (13)

1. 重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   （１）前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３もしくは１４に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるアミノ酸配列を含む；又は、
   （２）前記ＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１もしくは２２に示されるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるアミノ酸配列を含む、
   抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. 前記ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３であり、且つ前記ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９であり、又は
   前記ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４であり、且つ前記ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９である、
   請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 前記ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１であり、且つ前記ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５であり、又は
   前記ＶＨのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２であり、且つ前記ＶＬのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５である、
   請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメント、又は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 前記抗体がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域に由来する重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、前記ポリペプチドは、
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３もしくは１４に示される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント；あるいは
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１もしくは２２に示される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメント、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示される軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む免疫グロブリン軽鎖又はそのフラグメント、
   を含む、核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含むベクター。
8. 請求項６に記載の核酸を含む細胞。
9. 治療剤と共有結合する請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、抗体－薬物複合体。
10. 前記治療剤は、細胞傷害性薬又は細胞増殖抑制薬である、請求項９に記載の抗体－薬物複合体。
11. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、癌を予防または治療するための組成物。
12. 癌が、乳がん、カルチノイドがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿道がん、または血液悪性腫瘍である、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記癌は、肝臓がん又は小細胞肺がんである、請求項１２に記載の組成物。

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