JP7170367B2 - 赤外域の円二色性測定装置 - Google Patents

Description

本発明は赤外域ＣＤ（いわゆる振動円二色性）の測定装置に関する。

振動遷移に関わる振動円二色性の測定装置は、測定で得られるスペクトルと分子構造から計算で予測されるスペクトルの比較性が良いことから、医薬や生理活性物質の構造解析に応用されてきた。

特許文献１にはフーリエ変換型のＣＤ分光光度計を用いた振動円二色性の測定方法が示されている。フーリエ変換型（ＦＴ型）では、回折格子を用いず、光路差可変の干渉計を用いて赤外光の干渉波を作り出し、これを測定光として用いる。ＦＴ型ＣＤ分光光度計の構成の一例は、赤外光源→干渉計→偏光変調子（ＰＥＭ）→セル部（試料）→ＭＣＴ検出器→信号処理部（ロックインアンプ等）→フーリエ変換部（コンピュータ等）となる。

赤外光の干渉波は、ＰＥＭによって交互に生じる右周りと左周りの円偏光からなる干渉波となって、試料を照射し、ＭＣＴ検出器で検出される。干渉波の検出信号（インターフェログラムと呼ばれる）には、左右の円偏光の吸光度の差（ΔＡ）が信号強度の周期的な変化として表れる。つまり、干渉波の検出信号は、ＰＥＭの偏光変調に同期する交流成分（ＡＣ）および直流成分（ＤＣ）を含むため、これらをロックインアンプ等で抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）を算出する。ただし、検出信号は干渉波の信号であるから、最後にコンピュータ上でフーリエ変換して赤外域のＣＤスペクトルを得る。

特開２０１３－２０５２７５号公報

吸光度の差ΔＡを測定するのであれば、できるだけ吸光度Ａが高い状態の試料を測定した方が、理論的には測定精度がよくなる。しかし、試料の吸光度Ａが高いほど、検出される光量が減って検出信号が弱くなってしまうので、ノイズの影響が大きくなり、吸光度の差の測定ができなくなる、という実情がある。

特許文献１のフーリエ変換型のＣＤ分光光度計では、試料の吸光度Ａが高くても１．５～２、通常は１前後になるようにする、という制約がある。ここで、吸光度Ａは、次式で定義される。
Ａ＝εｃＬ＝－ｌｏｇ_１０（Ｉ／Ｉ０） ・・・（１）
式中のＬは光路長、ｃはモル濃度、εはモル吸光係数、Ｉ_０は入射光の強度、Ｉは出射光の強度を示す。例えば、溶液試料の場合、モル濃度ｃまたはセルの光路長Ｌを変更して、試料の吸光度Ａを高くても１．５～２未満に調整する。これに対し、水を溶媒とするタンパク質等の試料測定では、吸光度が２を超えることが多く、赤外域のＣＤ信号を得ることが困難な状況である。

本発明の目的は、試料の吸光度が２以上（例えば、２～５の範囲）であって、従来の測定装置では光量を十分に検出できないことから測定条件が不利になるような試料に対しても、適正なＳＮ比の赤外域ＣＤを測定することができる赤外域の円二色性測定装置を提供することにある。

発明者らは、赤外域レーザーでありながら、高輝度・高出力・広帯域での波数可変機能を持つ量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）に着目し、この赤外域レーザー光を測定光として、赤外域ＣＤ測定に適用する研究を進め、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明に係る赤外域の円二色性測定装置は、試料の少なくとも１つの吸収ピークを含む赤外波数域内でレーザー光の波数を掃引可能なレーザー光源と、
試料が配置される試料室と、
掃引された特定波数の前記レーザー光が試料を透過する前後のいずれかにおいて当該レーザー光の偏光状態を変調させる偏光変調子と、
前記試料を透過して偏光状態を変調されたレーザー光の強度変化を検出する検出器と、
前記検出器の検出信号から変調周波数と同期する交流成分（ＡＣ）と直流成分（ＤＣ）とを抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）に基づいて試料の赤外域円二色性の値を算出する信号処理部と、
レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたゲイン切替用光学素子と、
前記ゲイン切替用光学素子をレーザー光の掃引波数に応じて切り替えて、前記検出器に入る光量を調整する切替手段と、を備えることを特徴とする。

ここで、前記レーザー光源が量子カスケードレーザ（ＱＣＬ）であることが好ましい。また、前記レーザー光源からレーザー光を最大パワーの連続モードで出力した際の平均出力が、１ｍＷ以上であり、当該レーザー光の発振線幅が、０．０５～４．０ｃｍ^－１であることが好ましい。

また、前記信号処理部が、掃引される特定波数毎に前記赤外域円二色性の値を算出して、試料の赤外域ＣＤスペクトルを取得することが好ましい。

また、前記信号処理部は、レーザー光の掃引波数に応じてアナログ信号の強度を電気的に切り替えて、ＡＤ変換時の量子化誤差を低減させるゲイン切替用電気素子を備えることが好ましい。

さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたチョッパーを備え、当該チョッパーの通過率が７０％以上であることが好ましい。

また、前記信号処理部は、
水または水蒸気の吸収ピーク波数を保有する記憶部と、
レーザー光の掃引波数が前記水または水蒸気の吸収ピーク波数に一致するかを判断する判断部と、
一致した場合に当該吸収ピークの影響を回避する処理を実行する回避部と、を有し、
前記回避部は、前記水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光による赤外域ＣＤ値に基づいて、水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値を算出するように構成されていることが好ましい。

以上の構成の赤外域のＣＤ測定装置によれば、赤外域のレーザー光を所定波数域で掃引可能なレーザー光源を備えることで、高輝度、高出力、広帯域から選択された波数の赤外レーザー光を測定光として用いることができる。その結果、吸光度が２以上である試料に対しても適正なＳＮ比での赤外域ＣＤが測定可能になり、測定精度が向上する。

赤外域のＣＤ測定装置を構成するＣＤ測定光学系を示す図である。 フーリエ変換型の光源系の構成を示す図である。 レーザー光源系の構成を示す図である。 ＱＣＬの半導体チップ毎の波数チューニングカーブを重ねて示した図。 １７５０ｃｍ^－１から１５００ｃｍ^－１まで波数掃引した場合のレーザー光の強度の変化を示す図である。 ＱＣＬの１６７５．５ｃｍ^－１のレーザー光の発振線幅を示す図。 レーザー光を用いた赤外域ＣＤ測定装置の全体構成を示す図である。 Ｎ_２パージの有効性を示すスペクトル図である。 パージ開始から９０分経過までのレーザー光の強度変化を示す図である。 パージなし、で測定したスペクトルを透過率１００％ラインで示した図。 パージあり、で測定したスペクトルを透過率１００％ラインで示した図。 Ｎ_２パージの有効性を個別評価するための実験装置を示す図である。 図１２の実験装置を用いてパージ開始から１２０分経過までのレーザー光の強度変化を測定した結果を示す図である。 本実施形態の測定例としての赤外域ＣＤスペクトル図である。 比較のための赤外域ＣＤスペクトル図である。 測定例として高い吸光度の試料を測定した赤外域ＣＤスペクトル図。 測定例として試料を積算時間２０分で測定した赤外域ＣＤスペクトル図。 チョッピング試験に用いた通過率８３％の回転式チョッパーを示す図。 図１８の回転式チョッパーを使った試験結果を示す図。 （Ａ）～（Ｄ）は本実施形態の水蒸気の吸収回避処理による効果を示すための１００％ラインの図である。 （Ａ）～（Ｄ）は本実施形態の水蒸気の吸収回避処理による効果を示すためのＡＣ／ＤＣ信号の図である。

＜赤外域のＣＤ測定装置＞
本発明の各実施形態について図面を用いて説明する。まず、図１に赤外域のＣＤ測定装置を構成するＣＤ測定光学系１０を示す。ＣＤ測定光学系１０は、測定光の光軸に沿って、可動ブロック１１上の光学素子、光学フィルター１２、偏光子１３、ＰＥＭ１４、試料室１５、集光レンズ１６、ＭＣＴ検出器１７の順に配置されている。測定光として、「赤外干渉波の光」および「赤外レーザー光」から選択可能に構成されている。

赤外干渉波の光は、フーリエ変換型の光源系２０（図２参照）から供給される。レーザー光は、レーザー光源系３０（図３参照）から供給される。可動ブロック１１には２種類の光学素子（赤外干渉波用の楕円鏡１１ａ、レーザー用の平面鏡１１ｂ）が搭載され、可動ブロック１１をスライドさせて一方の光学素子をＣＤ測定光学系の光軸に配置するで、ＣＤ測定光学系１０への測定光が切り替わる。

図１のＣＤ測定光学系において、選択された測定光は、光学フィルター１２によって所望の波数域の光のみとされ、偏光子１３によって直線偏光成分のみが取り出されてＰＥＭ１４に送られる。

偏光子１３の光学的な光軸方向とＰＥＭ１４の主軸方向とは、光軸方向から見て４５度で交わる関係になっているとよい。偏光子１３からの直線偏光は、ＰＥＭ１４により偏光状態の変調を受ける。具体的には、直線偏光の互いに直交する２つの偏光成分間の位相差δが変調する。位相差δの変調は、通常、サインカーブで行われ、これに伴って左回りと右回りの円偏光がＰＥＭ１４から交互に試料室１５に向けて出射される。

ＰＥＭ１４および試料室１５の位置関係は図１に限られず、ＰＥＭ１４を試料室１５よりも検出器側に配置することもできる。

例えば、溶液試料をセル内に入れて、試料室１５に配置する。セル内の試料はＰＥＭからの左右の円偏光の照射を交互に受け、その透過光は集光レンズ１６で集光されてＭＣＴ検出器１７で光強度が検出される。

測定光が赤外干渉波の場合、偏光子１３で直線偏光の干渉波になって、ＰＥＭ１４で位相変調されるので、試料は左右の円偏光成分からなる干渉波を受ける。一方、測定光が赤外レーザー光の場合、偏光子１３で直線偏光のレーザー光になって、ＰＥＭ１４で位相変調されるので、試料は左右の円偏光成分からなるレーザー光を受ける。なお、赤外レーザー光の指向性が高い場合は集光レンズ１６を省略してもよい。

検出器１７としては、ＭＣＴ検出器に限られず、Ｓｉフォトダイオード、ＩｎＳｂ検出器、ＩｎＧａＡｓ検出器などの量子型検出素子を用いた検出器や、ＴＧＳ、ＤＬａＴＧＳなどの焦電素子を用いた検出器を、適宜選択してもよい。

図２にフーリエ変換型の光源系（ＩＲ光源２１→楕円鏡２２→アパーチャー２３→マイケルソン干渉計２４→出射側の放物面鏡２５→アパーチャー２６）の構成を示す。マイケルソン干渉計２４は、入射側の放物面鏡２４ａ、ビームスプリッター（ＢＳ）、固定鏡２４ｂ、移動鏡２４ｃによって構成される。ＢＳで分割された一方の平行光束は固定鏡２４ｂを反射してＢＳに戻り、分割された他方の平行光束は移動鏡２４ｃを反射して同様にＢＳに戻る。２つの平行光束はＢＳで合成され干渉波として放物面鏡２５に向けて出射する。このようにして、移動鏡２４ｃによって可変な光路差Ｄに応じた干渉波（インターフェログラム）が生じる。赤外干渉波の光は、出射側の放物面鏡２５を反射して、ＣＤ測定光学系１０の可動ブロック１１の楕円鏡１１ａに進み、測定光として利用される。

図３に本実施形態において特徴的なレーザー光源系３０の構成を示す。レーザー光源系３０は、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）を赤外光源とすることで、高輝度・高出力・広帯域から選択された特定波数の赤外レーザー光を供給する。

ＱＣＬには、多層半導体構造の活性領域を有する半導体チップが１ないし複数個設けられている。注入された電子が活性領域のレイヤを滝のように通過して多数のフォトンが放出されるので、レーザー利得が高く、波数域が広い。例えば、４個の半導体チップ（ＱＣＬ－１～ＱＣＬ－４）を使って、波数域を指紋領域（１８５０～８９０ｃｍ^－１）まで広げた場合について、図４に半導体チップ毎の波数チューニングカーブを重ねて示す。ＱＣＬ－１の波数域を約１８５０～１５００ｃｍ^－１、ＱＣＬ－２の波数域を約１７５０～１４００ｃｍ^－１、ＱＣＬ－３の波数域を約１５００～１１００ｃｍ^－１、ＱＣＬ－４の波数域を約１３００～８９０ｃｍ^－１としてもよい。波長域に換算すると、５．４～１１．２μｍになる。

ＱＣＬでは内蔵された駆動部３１によって出力レーザー光の波数が変化する。例えば、駆動部としての共振器（キャビティ）が出力波数を掃引する。

ＱＣＬ－２のみを使って、波数を１７５０ｃｍ^－１から１５００ｃｍ^－１まで掃引した場合のレーザー光の強度の変化を図５に示す。比較のため、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴＩＲ）の標準的な赤外光源のスペクトル形状を同条件で測定したものを並べた。波数１６００ｃｍ^－１（最大パワー）でレーザー光を連続モード出力した際の平均出力が約３００ｍＷになっている。

試用するレーザーの平均出力としては、少なくとも１ｍＷ以上であれば、従来の測定装置による検出信号よりも質の良い検出信号が得られる。好ましくは１０ｍＷ以上、より好ましくは１００ｍＷ以上である。１ｍＷ～数百ｍＷ程度の平均出力のレーザーを用いれば、概ね出力に比例して検出信号の質が改善される。平均出力が大きいレーザーを用いると、試料の焼損や検出器感度の飽和といった制約が生じるので、大きくとも１Ｗ～１０Ｗ程度の平均出力のレーザーがよい。試料によって、焼損する出力は異なり、また、検出光量も変わるため、試料に応じて最も本発明の効果を発揮できるレーザーの平均出力を選定するとよい。なお、測定装置にゲイン切替手段（減光器など）を設ける場合は、レーザー光の減光率を調整できるので、実際にはさらに大きな平均出力のレーザーを搭載することも可能である。

図５の例で、両者のスペクトル形状を同じ波数（例えば１６００ｃｍ^－１）で比較すると、ＦＴＩＲ標準光源の出力値が４．４を示すのに対し、ＱＣＬの出力は、２４２３倍の１０６６４．７を示し、出力強度の差が非常に大きいことが分かる。

次に、ＱＣＬの１６７５．５ｃｍ^－１のレーザー光の発振線幅を図６に拡大して示す。レーザー光の発振線幅（半値全幅）が狭い程、レーザー光の波数分解能が高い。図６のレーザー光の半値全幅は０．１３ｃｍ^－１である。レーザー光の発振線幅（半値全幅）としては、約０．０５～４．０ｃｍ^－１であることが好ましい。

ＱＣＬのレーザー光の特徴は、（１）掃引可能な波数域が広く、（２）出力が驚くほど強く、（３）発振線幅（半値全幅）が非常に狭いことである。なお、ＱＣＬは、特定波数のレーザー光を連続モード（ＣＷモード）で出力する。パルスモードを選択できるＱＣＬでもよいが、ＣＷモードの方が検出信号が大きく、測定精度がよい。

図３に戻って、ＱＣＬからの赤外レーザー光の進路には、回転式チョッパー３２、可動ブロック３３上の２つの平面鏡３３ａ，３３ｂ、減光器入側の固定平面鏡３４、減光器セット３５、減光器出側の固定平面鏡３６が順に配置されている。可動ブロック３３には、２つの平面鏡の他に、アパーチャーを通過する光路を形成するための光学素子（入側の楕円面鏡３３ｃ、アパーチャー３３ｄ、出側の楕円面鏡３３ｅ）が搭載されている。可動ブロック３３がスライドすることで、アパーチャーを通過しない光路と、アパーチャーを通過する光路とが切り替わる。後者の光路ではレーザー光の光束断面が、アパーチャー前後の楕円面鏡３３ｃ，３３ｅによって拡張され、アパーチャー３３ｄの開口部の大きさになる。

ＱＣＬからの赤外域レーザー光は、回転式チョッパー３２の通過率に応じた断続的なレーザー光になる。そのレーザー光は、可動ブロック上の光路を通り、さらに減光器セット３５を通過し、ＣＤ測定光学系１０の可動ブロック１１上の平面鏡１１ｂに進んで測定光として利用される。

試料の円二色性ＣＤは、式（２）で定義される。

円二色性ＣＤは、左円偏光に対する試料の吸光度Ａ_Ｌと右円偏光に対する試料の吸光度Ａ_Ｒとの差（ΔＡ）であり、式（２）のように、試料を透過した左円偏光の光強度Ｉ_Ｌと右円偏光の光強度Ｉ_Ｒとの比の常用対数で示される。光強度Ｉ_０は、試料への入射光の強度である。吸光度の差ΔＡは無次元数であるため、通常は次式（３）のように楕円率（ＣＤ［mdeg］）に変換される。

ここで、ＰＥＭを用いた偏光変調法に基づいて、式（２）の左円偏光強度Ｉ_Ｌと右円偏光強度Ｉ_Ｒを測定する場合、これらの平均値（（Ｉ_Ｌ＋Ｉ_Ｒ）／２）が偏光変調法での光強度の波形中の「ＤＣ信号」に対応し、また、これらの差の半分（（Ｉ_Ｌ－Ｉ_Ｒ）／２）が偏光変調法での光強度の波形中の「ＡＣ信号の最大振幅」に対応している。１次のベッセル関数J₁(2πδ_０)のモデルを適用すると、偏光変調法での光強度Ｉの波形は、ＤＣ信号の項とＡＣ信号の項の和として示される。従って、式（３）は次の近似式のように表現できる。

つまり、光強度の検出波形データから、ＡＣ信号とＤＣ信号を抽出できれば、ＣＤ値の測定が可能になる。

図７に、赤外域レーザー光を用いる赤外域ＣＤ測定装置の全体構成を示す。同図には、信号処理手段４０の構成（プリアンプ４１、ＤＣ信号用のロックインアンプ４２、ＡＣ信号用のロックインアンプ４３、ＰＥＭコントローラー４４、Ａ／Ｄ変換器４５、データロガー４６、コンピュータ等の演算処理装置４７）を併せて示す。検出器１７からの光強度信号はプリアンプ４１で増幅され、プリアンプ４１から直流成分と交流成分の各信号がそれぞれのロックインアンプ４２，４３に送られる。

ＤＣ信号用のロックインアンプ４２は、チョッピング周波数に同期する基準信号を使って、プリアンプの直流成分の信号からＤＣ信号を抽出する。つまり、回転式チョッパー３２の遮光期間における直流成分の信号値と、回転式チョッパー３２の通過期間における直流成分の信号値とを抽出し、データロガー４６に記録する。遮光期間および通過期間の信号値の差分をＤＣ信号として扱う。

ＡＣ信号用のロックインアンプ４３は、ＰＥＭ１４の駆動周波数と同期する基準信号を使って、ＰＥＭ１４と同じ周波数成分であるＡＣ信号を、プリアンプ４１の交流成分の信号から抽出してデータロガー４６に記録する。

データロガー４６に記録する際、ＤＣ信号およびＡＣ信号はＡ／Ｄ変換器４５で数値化される。演算処理装置４７は、データロガー４６からＡＣ信号とＤＣ信号を読み出して、両信号の比（ＡＣ／ＤＣ）を得て、式（４）に基づいて赤外域ＣＤ値を算出する。

測定光が赤外レーザー光であるから、ＱＣＬにおいて選択された波数毎に、演算処理装置４７が赤外域ＣＤ値を算出することで、赤外域のＣＤスペクトルデータが得られる。

なお、測定光として図２の赤外干渉波の光を選択した場合は、光強度信号はインターフェログラムであるから、光強度信号に基づく算出結果はＣＤ値そのものではない。そのため、演算処理装置は、データロガー４６からＡＣ信号とＤＣ信号を読み出して、両信号の比（ＡＣ／ＤＣ）の値をフーリエ変換処理することで、赤外域のＣＤスペクトルデータを得る。上述の式（４）における「ＡＣ／ＤＣ」を「Ｆ［ＡＣ／ＤＣ］」に置き換えた数式が、フーリエ変換を利用したＣＤ値の近似式になる。式中のＦ［ ］はフーリエ変換を表す。

＜Ｎ_２パージの有効性の評価＞
図７に基づく実験装置を使って、窒素ガス置換（Ｎ_２パージ）にかかる時間と、その有効性について評価した。実験装置では、ＱＣＬの出力波数域を１７５０－１５００ｃｍ^－１とし、チョッパーのチョッピング周波数を５００Ｈｚとし、減光器（例えばＮＤフィルター）の透過率を２％とした。試料室にはサンプルを置かず、ＰＥＭは駆動させないで、レーザー光をＭＣＴ検出器で検出した。

信号処理手段４０のプリアンプ４１は、４００ＨｚフィルタリングしたＤＣ成分の信号をロックインアンプに送る。

まず、「パージなし」の状態で、レーザー光の波数を１７５０－１５００ｃｍ^－１の範囲で掃引し、１ｃｍ^－１ステップで光強度をＭＣＴ検出器で検出した。ステップ速度は５００ｍｓｅｃ／ｃｍ^－１である。結果を図８のスペクトルＡに示す。パージなしでは、各筐体内の水蒸気等による吸収の影響が波数全域に渡って大きいことが分かる。

次に、レーザー光の波数を１６３５ｃｍ^－１に固定して、ＣＤ測定光学系１０およびレーザー光源系３０をそれぞれ収納している筐体内を毎分６Ｌのガス供給量でＮ_２パージする。各筐体には、独立制御可能なパージ装置が設けられている。波数１６３５ｃｍ^－１のレーザー光は、装置内部の水蒸気にほとんどが吸収されるため、Ｎ_２パージの有効性の評価に適する。図９は、パージ開始から９０分経過までの波数１６３５ｃｍ^－１のレーザー光の強度変化を示す。約１時間という比較的短時間のパージによって、窒素への置換が大きく進み、２時間のパージをすれば十分であることが分かる。

図８のスペクトルＡと同様に、「９０分間のパージ後」の状態でスペクトルＢを測定した。水蒸気などによる吸収ピークが大幅に減少し、比較的短いパージ時間で水蒸気などの吸収の影響が大きく低減されることが分かった。

次に、「パージなし」の状態で、図８のスペクトルＡと同様にスペクトルを測定し、レーザー光の透過率Ｔ（＝Ｉ／Ｉ_０×１００）が１００％である透過率１００％ラインを描いたものを図１０に示す。パージなしの状態でのスペクトル測定を３回繰り返し、３つの結果を重ねて表示した。これに対して、「１２０分間のパージ後」の状態でスペクトルを測定し、同様に透過率１００％ラインを描いたものを図１１に示す。

図１０には水蒸気等の吸収の影響が波数域の全体にわたってノイズのように生じていることが分かる。同じ波数のレーザー光であっても、透過率１００％ラインを押し上げる場合と押し下げる場合の両方がある。これに対して図１１のパージ後の透過率１００％ラインでは、水蒸気等の吸収の影響が波数域の全体にわたって大幅に減少していることが分かる。

＜Ｎ_２パージの有効性の個別評価＞
次に、レーザー光源系３０へのＮ_２パージの有効性の評価を個別に行った。図１２に示す実験装置を用いた。レーザー光の波数を１６３５ｃｍ^－１に固定して、レーザー光源系３０の筐体内をＮ_２パージする。筐体内部の光路上に、４倍エキスパンド用の一対の反射鏡を設置して、ビーム径を４倍に拡張させる。レーザー光の強度を、レーザー光源系３０の出口に置かれたパワーメーター（サーモパイル型検出器）で検出する。

図１３は、パージ開始から１２０分経過までの波数１６３５ｃｍ^－１のレーザー光の強度変化を示す。パージ開始時に約２８ｍＷであった強度は、最初の３０分位で急上昇し、６０分後には１２０ｍＷ前後まで達している。このパージ効果を詳細に評価するため、次の表１の予備測定を行った。

表１に、ＱＣＬの直下にパワーメーターを置いて、前記の波数１６３５ｃｍ^－１と、水蒸気の吸収の影響を受けにくい波数１６００ｃｍ^－１の２種類のレーザー光の強度をそれぞれ測定した結果を示す。また、図１２の実験装置を用いて、レーザー光源系３０の出口（「連結部」）での強度も測定した。いずれも「パージなし」の状態で測定した。

表中のカッコ内の数値は、４倍エキスパンド時の測定値である。参考に、試料室での強度値も示す。

光源直下では水蒸気の影響を受けないと仮定して、ＱＣＬを出た直後のレーザー光強度の比率Ｐ_{ｒａｔｉｏ}（＝Ｐ_１６３５／Ｐ_１６００＝１９０／２９５）を計算すると０．６４４になる。１６００ｃｍ^－１のレーザー光は水蒸気の影響をほとんど受けないため、連結部での１６００ｃｍ^－１の光強度（１９２．６ｍＷ）に基づいて連結部での１６３５ｃｍ^－１の光強度を求めると、Ｐ_１６３５（＝１９２．６＊０．６４４）は、１２３．７ｍＷになる。この値は、１６３５ｃｍ^－１のレーザー光が水蒸気の影響を受けない場合の数値に相当する。図１３によれば、パージ後６０分の連結部での光強度が１２０ｍＷ前後（上記の１２３．７ｍＷの計算値に近い値）にまで回復していることから、１時間程度のＮ_２パージで置換が十分に行われたと評価できる。

これらの評価結果から、本実施形態の赤外域ＣＤ測定装置が、それぞれの筐体にＮ_２パージ装置を設けることでのパージ効果が短時間で発揮し得ることが分かる。

＜赤外域ＣＤ測定結果１＞
図７の構成の赤外域ＣＤ測定装置を使って、クロロホルム溶媒にビ－２－ナフトール（Ｂｉ-２-ｎａｐｈｔｏｌ）を溶かした溶液試料の赤外域ＣＤスペクトルを測定した。この装置では、ＱＣＬのレーザー光の波数域を１６５０－１５００ｃｍ^－１とし、チョッパーのチョッピング周波数を５００Ｈｚとし、減光器（例えばＮＤフィルター）の透過率を２％（９８％減光）とした。ＰＥＭの変調周波数を５０ｋＨｚとして、試料の透過光をＭＣＴ検出器で検出した。

測定前に、ＣＤ測定光学系１０およびレーザー光源系３０をそれぞれ収納している筐体内を、毎分６Ｌのガス供給量で１２０分間Ｎ_２パージした状態にした。赤外域ＣＤ測定では、レーザー光の波数を１６５０－１５００ｃｍ^－１の範囲で３回掃引し、１ｃｍ^－１ステップで光強度をＭＣＴ検出器で検出し、平均値を算出した。その赤外域ＣＤスペクトルを図１４に示す。比較のため、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計での測定結果を図１５に示す。

本実施形態に係る赤外域ＣＤ測定装置で測定した赤外域ＣＤスペクトルには、以下の注目すべき点がある。まず、波数分解能が非常に高いことが、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計で測定した赤外域ＣＤスペクトルとの比較から歴然としている。

本書では、試料が本来有している２つのＣＤピークが隣り合っていて、一方のピーク波数νに対し、他方のピーク波数をν＋Δνで表す場合に、測定装置が区別できる２つのＣＤピーク間のΔνの最小値を波数分解能（ｃｍ^－１）として示す。

図１１に示した通り、１２０分間のＮ_２パージで１６５０－１５００ｃｍ^－１の波数域での水蒸気等の吸収の影響は大幅に減少している。そうすると、図１４の赤外域ＣＤスペクトルにおいても、水蒸気などの影響は小さくなっていると言え、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計が測定できなかった微小なＣＤピークまで測定できていると言える。

波数分解能が高い理由の１つに、フーリエ変換型ＣＤ分光光度計での赤外域ＣＤスペクトルの測定範囲（縦軸）が約－０．０００１から＋０．０００１までであるのに対して、本実施形態の装置では、約－０．０８から＋０．０８までと１０００倍程度広い測定範囲になっていることが挙がる。つまり、図６のような非常に強い出力のレーザー光によって、検出器からの検出信号が大きくなり、吸光度Ａの検出感度が挙がった。それに伴って、従来は非常に弱いものしか測定できなかった赤外域ＣＤ信号が、非常に大きな値で取得できるようになった。

２つ目の理由として、図６のような理想的な単波数光に近いプロファイル（半値全幅０．１３ｃｍ^－１）のレーザー光を使ったことが挙がる。

本実施形態の装置の長所は、従来型の分散型ＣＤ分光光度計における課題を挙げることで理解が深まる。例えば、ＵＶ－可視光域のＣＤ分光光度計では、回折格子を使った分散型のＣＤ分光光度計が主流である。

分散型ＣＤ分光光度計において、波長分解能を高めるには、分散型分光器から取り出された光のバンド幅（半値全幅）を、試料の吸収ピークの半値幅の概ね１／１０以下に設定できるとよい、とされている。例えば、半値幅１５ｎｍの吸収ピークをバンド幅２ｎｍの擬似単色光で測定すれば、測定値の誤差を小さく抑えられる。

バンド幅は、分光器に組み込まれたスリットの幅で決まる。そのため、単純にバンド幅を小さく設定すれば良いとは言えない。バンド幅を小さくすると、試料を照射する光が弱くなってノイズが増加するからである。

本実施形態の装置が優れているのは、掃引された特定波数のレーザー光の半値全幅が理想的な単色光と言えるレベルの狭さであり、かつ、レーザー光の出力を高い状態に維持できることである。それによって、検出器から強い検出信号が得られ、赤外ＣＤ値の測定感度が向上することである。フーリエ変換型や分散型のＣＤ分光光度計では、干渉波の光束をアパーチャーで絞ったり、単色光のバンド幅をスリットで狭くしたりすることで、検出信号が弱くなる傾向があり、ＳＮ比が悪化しない程度に、試料の吸光度を高くても１．５～２未満に調整しなければならなかった。本実施形態の装置では、そのような試料の吸光度についての制約がなくなる点で非常に優れている。

＜赤外域ＣＤ測定結果２＞
本実施形態の装置を使って、吸光度４に調整したアミノ酸の溶液試料（Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕｃｉｎｅ）を０．０００１ΔＡの分解能で赤外域ＣＤスペクトル測定した結果を図１６に示す。

＜赤外域ＣＤ測定結果３＞
図１７（Ａ），（Ｂ）に、本実施形態の装置を使って、ピネンの溶液試料（（－）－α－ｐｉｎｅｎｅ）を積算時間２０分で赤外域ＣＤスペクトル測定した結果を示す。ＭＣＴ検出器の素子サイズを２種類（直径１ｍｍ、直径０．２ｍｍ）用いたが、どちらの測定も、短い積算時間で感度のよい赤外域ＣＤスペクトルが得られた。

以下、本実施形態の赤外域ＣＤ測定装置にオプションとして装備可能な構成について説明する。

＜光学的ゲイン切替手段＞
本実施形態において特徴的な図３の減光器セット３５の切替手段３７について説明する。減光器セット３５は、１ないし複数の減光素子３５ａ，３５ｂから構成され、かつ、個々の減光器３５ａ，３５ｂをオンライン／オフラインに独立して切り替え可能な切替手段３７が設けられている。例えば、透過率２％の２枚の減光素子３５ａ，３５ｂを用いる。２枚同時にオンラインにした場合の合計透過率が０．０４％になるため、切替手段３７は、減光器セット３５による合計透過率を１００％、２％、０．０４％の３通りに切り替え可能である。なお、減光器セット３５は、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されていればよい。

本実施形態では、減光器セット３５の切替手段３７を使って、測定ゲインを光学的に切り替える。まず、事前測定として、減光素子３５ａを１枚だけオンライン状態にして、レーザー光の波数掃引を行ってバックグラウンド測定を実行する。得られた出力が基準値以下になる波数に対し、個別にゲインを設定する。例えば、検出器１７への光が暗い場合は、減光素子３５ａ，３５ｂを２枚ともオフライン状態にするとよい。逆に、事前測定での出力が強過ぎる波数に対しては、減光素子３５ａ，３５ｂを２枚ともオンライン状態にするとよい。測定条件は記憶部４９に保存される。試料のスペクトル測定を実行する際、記憶した設定値に従って、波数掃引ごとに測定ゲインを光学的に切り替える。この結果、レーザー光の掃引波数に応じた検出器１７への光量変動が小さく抑えられる。

また、予め試料なしの状態で減光量が最適化された光学系に試料を入れると、試料の吸光度が大きいなどの理由で、出力が低下する波数が生じる場合がある。このような波数に対しても、減光素子３５ａ，３５ｂをオフラインにする等の測定条件を設定して、減光量を調整することができる。

以上の光学的ゲインの切替手段３７によって、高い吸光度の試料の赤外域ＣＤスペクトル測定が容易になる。なお、減光素子３５ａ，３５ｂなどで光学的にゲインを変更すると、スペクトルのベースラインにずれが生じるが、ゲインの変更前後の掃引波数域を一部オーバーラップさせたスペクトル測定を実行する手段を設けることで、その測定結果を使えば演算処理手段４７によるベースラインの接続が容易になる。

＜電気的ゲイン切替手段＞
光学的なゲイン切り替えと同様に、電気的なゲインの切り替えを採用することもできる。例えば、図７の信号処理手段４０に設けられたゲイン切替用電気素子４８が、低出力になる波数に対して、アナログ信号の強度を電気的に増幅させて、Ａ／Ｄ変換器４５での量子化誤差を低減させるようにしてもよい。

＜チョッパーの通過率＞
次に、チョッパー３２の通過率の設定について説明する。チョッパー３２は、赤外吸収信号（ＤＣ信号）を取得するために設けられており、図７の位置に限られず、レーザー光の光路上のいずれかの位置にあればよい。

赤外域ＣＤ信号の信号強度は、赤外吸収信号と比べて１０００分の１以下と非常に弱い。チョッピングは、赤外域ＣＤ信号の更なる強度低下を招き、そのＳＮ比も同時に低下させてしまう。本実施形態では、３通りの通過率（５０％、７５％、８３％）の回転式チョッパーを使った試験結果に基づいて、チョッパー３２の通過率を７０％以上に設定することにした。

図１８にチョッピング試験に用いた通過率（Ｄｕｔｙとも呼ぶ）が８３％の回転式チョッパーの一例を示す。中心部から５方向に伸びたリブ部が遮光部として機能する。

通過率８３％の回転式チョッパーを使ってチョッピングして、ＰＥＭ１４で偏光変調したレーザー光を検出器１７で検出した。その検出信号から抽出したＤＣ信号とＡＣ信号の強度変化を図１９に示す。３通りの掃引波数（１５９５ｃｍ^－１，１６００ｃｍ^－１，１６０５ｃｍ^－１）での信号強度の変動は、いずれも許容範囲内であり、適正なＤＣ信号（同図（Ａ））とＡＣ信号（同図（Ｂ））を取得することができた。

＜水または水蒸気の吸収ピークの影響回避＞
本実施形態において特徴的な水等の吸収ピークの影響回避手段について説明する。図７の信号処理手段４０は、さらに、水または水蒸気の既知の吸収ピーク波数を保有する記憶部４９と、レーザー光の掃引波数がこれらの吸収ピーク波数に一致するかどうかを判断する判断部５１と、一致した場合に吸収ピークの影響を回避させる回避部５２とを有する。判断部５１および回避部５２は、演算処理手段４７に組み込まれている。

図８に示したように、本実施形態の赤外域ＣＤ測定への水または水蒸気の吸収ピークの影響は大きい。特に「パージなし」の状態では、個々の吸収ピークが鋭く、非常に感度良く検出されてしまう。

そこで、回避部５２は、水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光によって得られた赤外域ＣＤ値を使って、その平均値などを水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値として算出する。その結果、ＱＣＬのレーザー光による検出感度の鋭さに起因する水または水蒸気ノイズの軽減を図ることができる。

水または水蒸気の吸収ピークの影響回避の具体的な手法を説明する。

まず、本実施形態の装置を用いて、シングルビーム（ＳＢ）を例えば１０本測定し、２本ずつの５組とする。各組の２本を除算して、１００％ラインを５本得る。

０．５ｃｍ^－１ステップで波数掃引して取得したラインを図２０（Ａ）に示す。図２０（Ｂ）～（Ｄ）のラインは、図２０（Ａ）から１．０ｃｍ^－１ステップ分の強度情報だけ抜き出して得たラインである。図２０（Ｂ）のラインは回避処理前のものである。

記憶部４９には、表２に示す回避処理対象の波数セットが２セット（除去１、除去２）分、予め記憶されている。これらの波数セットは、経験的に特に大きい水蒸気ピークを生じ得る波数情報を含んでいる。除去１の波数における水蒸気ピークの方が、除去２の波数における水蒸気ピークよりも大きい。

判断部５１は、図２０（Ｂ）のラインから、除去１のピーク波数に該当する波数ポイントの強度情報を抽出する。回避部５２は、抽出された強度情報ごとに、そのピーク波数の両隣りの波数ポイントの強度情報の平均値を計算する。そして、抽出された強度情報をその平均値に置き換える。図２０（Ｃ）に除去１の波数セットについて回避処理後のラインを示す。

判断部５１は、さらに、除去２のピーク波数に該当する波数ポイントの強度情報を抽出する。回避部５２は、抽出された強度情報ごとに、そのピーク波数の両隣りの波数ポイントの強度情報の平均値を計算し、抽出された強度情報をその平均値に置き換える。図２０（Ｄ）に除去２の波数セットについても回避処理済みのラインを示す。

このような回避処理を実行すれば、Ｎ_２パージなしの状態でも赤外域ＣＤスペクトルの測定結果に与える水蒸気の影響を大幅に低減させることができる。

図２０（Ａ）～（Ｄ）のラインは、本実施形態でのＤＣ信号を測定したものに該当する。そこで、ＡＣ／ＤＣ信号の変化についても、同様の条件で図２１（Ａ）～（Ｄ）に示す。図２１（Ａ）は０．５ｃｍ^－１ステップの波数掃引で取得したＡＣ／ＤＣ信号を示す。図２１（Ｂ）は、図２１（Ａ）から１．０ｃｍ^－１ステップ分のＡＣ／ＤＣ信号を抜き出したものを示す。図２１（Ｃ）は除去１の波数セットについて回避処理済みのＡＣ／ＤＣ信号を示す。図２１（Ｄ）は、さらに除去２の波数セットについても回避処理したＡＣ／ＤＣ信号を示す。

このようにＡＣ／ＤＣ信号の波形は、回避処理の実行によって、おおむね改善されている。なお、図２１（Ｄ）の１５３１ｃｍ^－１のピークは、水蒸気の吸収が余り大きく出ない波数ポイントにあるので、ＱＣＬ側のゆらぎに起因するものと考えられる。

１０ ＣＤ測定光学系
１４ 偏光変調子（ＰＥＭ）
１５ 試料室
１７ ＭＣＴ検出器
２０ フーリエ変換型の光源系
３０ レーザー光源系
３２ チョッパー
３５ 減光器セット（ゲイン切替用光学素子）
３５ａ，３５ｂ 減光素子
３７ 切替手段
４０ 信号処理手段（信号処理部）
４８ ゲイン切替用電気素子
４９ 記憶部
５１ 判断部
５２ 回避部
ＱＣＬ 量子カスケードレーザー（レーザー光源）

Claims (7)

1. 試料の少なくとも１つの吸収ピークを含む赤外波数域内でレーザー光の波数を掃引可能なレーザー光源と、
   試料が配置される試料室と、
   掃引された特定波数の前記レーザー光が試料を透過する前後のいずれかにおいて当該レーザー光の偏光状態を変調させる偏光変調子と、
   前記試料を透過して偏光状態を変調されたレーザー光の強度変化を検出する検出器と、
   前記検出器の検出信号から変調周波数と同期する交流成分（ＡＣ）と直流成分（ＤＣ）とを抽出し、両者の比（ＡＣ／ＤＣ）に基づいて試料の赤外域円二色性の値を算出する信号処理部と、
   レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたゲイン切替用光学素子と、
   前記ゲイン切替用光学素子をレーザー光の掃引波数に応じて切り替えて、前記検出器に入る光量を調整する切替手段と、を備える
   ことを特徴とする赤外域の円二色性測定装置。
2. 前記信号処理部は、
   水または水蒸気の吸収ピーク波数を保有する記憶部と、
   レーザー光の掃引波数が前記水または水蒸気の吸収ピーク波数に一致するかを判断する判断部と、
   一致した場合に当該吸収ピークの影響を回避する処理を実行する回避部と、を有し、
   前記回避部は、前記水または水蒸気の吸収ピーク波数の前後の掃引波数のレーザー光による赤外域ＣＤ値に基づいて、水または水蒸気の吸収ピーク波数における赤外域ＣＤ値を算出する、
   ことを特徴とする請求項１記載の赤外域の円二色性測定装置。
3. さらに、レーザー光の光路上のいずれかの位置に配置されたチョッパーを備え、当該チョッパーの通過率が７０％以上である、
   ことを特徴とする請求項１記載の赤外域の円二色性測定装置。
4. 前記レーザー光源が、量子カスケードレーザー（ＱＣＬ）であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の赤外領域の円二色性測定装置。
5. 前記レーザー光源からレーザー光を最大パワーの連続モードで出力した際の平均出力が、１ｍＷ以上であり、
   当該レーザー光の発振線幅が、０．０５～４．０ｃｍ^－１である、
   ことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の赤外領域の円二色性測定装置。
6. 前記信号処理部が、掃引される特定波数毎に前記赤外域円二色性の値を算出して、試料の赤外域ＣＤスペクトルを取得する、
   ことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。
7. 前記信号処理部は、レーザー光の掃引波数に応じてアナログ信号の強度を電気的に切り替えて、ＡＤ変換時の量子化誤差を低減させるゲイン切替用電気素子を備える、
   ことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の赤外域の円二色性測定装置。

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