JP7224645B2 - 異なる複数の目的遺伝子の評価方法 - Google Patents

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Description

本発明は、異なる複数の目的遺伝子の評価方法、該評価方法によって同定されたがん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、及び薬剤感受性又は耐性マーカー等に関する。
進行性肺がんに対する抗がん剤ゲフィチニブ、エルロチニブ、又はアファチニブの第一治療の承認には、現在のところ、エキソン19における欠失変異又は点突然変異（L858R）等の古典的／感受性EGFR遺伝子の変異の存在を必要とする（非特許文献1）。さらに、エキソン18における挿入欠失、E790変異（非特許文献2）、G719変異（非特許文献3）、エキソン19における挿入（非特許文献4）、A763-764のFQEA挿入（非特許文献5）、S768I変異（非特許文献6）及びL861Q等の低頻度の感受性変異を有する患者に対して、EGFRチロシンキナーゼインヒビター（TKI）を臨床的に使用することが一般的である。しかしながら、前臨床及び臨床試験のデータは、ゲフィチニブ及びエルロチニブ等の第一世代のEGFR チロシンキナーゼインヒビター（TKI）が上記低頻度のEGFR変異に対してあまり有効でないことを示唆している（非特許文献7）。ゲフィチニブ及びエルロチニブに対する耐性に関わる主なメカニズムはEGFR遺伝子のT790M変異に起因するとされており、これはオシメルチニブ処置によって克服され得る（非特許文献8）。しかしながら、オシメルチニブ処置も、C797複合変異に対しては有効でないことが知られている（非特許文献9）。また、エキソン20における挿入も、EGFR TKI非感受性変異に関与することが知られている。以上の様に、EGFR遺伝子内の多くの変異が抗がん剤の感受性に強く影響を与えることが知られている。
上記の主要な遺伝子変異に加えて、がん患者のゲノム上の遺伝子には、アミノ酸置換をもたらす非常に多くの非同義変異が存在する。例えば、体細胞突然変異のCOSMICデータベース（v78, http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/）では、EGFR遺伝子について合計770種の非同義変異が存在することが報告されている。同様に、肺がんに関与するALK遺伝子については442種の非同義変異が報告されている。しかしながら、そのような変異の大部分については、臨床的意義が明らかにされていない。
患者ごとに適切な薬剤を選択するために、多数の非同義又は同義変異の臨床的意義を明らかにする方法、複数の機能未知の遺伝子やその変異のがん化能を評価する方法、及び被験者の薬剤感受性を迅速かつ正確に評価する方法、及び既存薬又は新薬に対する非同義又は同義変異の耐性又は感受性を評価する方法の開発は臨床学的に極めて重要である。しかし、個々の変異について正確かつ網羅的に分析し評価できる技術は現在までのところ知られていない。
Nature Medicine, 2015, 21, 2, p. 99 Ackerman A. et al., J. Thorac. Oncol. 2012, 7, e 19-20 Han, S.W. et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, pp. 2493-2501 He, M. et al., Clin. Cancer Res., 2012, 18, pp. 1790-1797 Yasuda, H. et al., Sci. Transl. Med., 2013, 5, 216ra177 Kancha, R.K. et al, Clin. Cancer Res., 2009, 15, pp. 460-467 Watanabe, S. et al. J. Thorac. Oncol., 2014, 9, pp. 189-194 Cross, D.A. et al., Cancer Discov., 2014, 4, pp. 1046-1061 Thress, K.S. et al., Nat. Med., 2015, 21, pp. 560-562
本発明は、異なる複数の目的遺伝子の機能、例えばがん化能の評価方法、及び各目的遺伝子を有する被験者の薬剤に対する感受性等を評価可能な方法を提供することを課題とする。また、本発明は、上記方法によって同定されるがん検出用マーカー、薬剤感受性又は薬剤耐性マーカー、及びこれらのマーカーを検出するための手段等を提供することを課題とする。
本発明者らは、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子等を含むポリヌクレオチドをゲノムDNAに挿入した複数の宿主細胞を混合して培養し、培養後の宿主細胞由来の前記ポリヌクレオチドをタグ配列に基づいて定量することで、培養後の各宿主細胞の相対的な細胞数を決定し、それに基づいて異なる複数の目的遺伝子を個別に、かつ網羅的に評価できることを見出した。また、本発明者らはこの方法に基づき、新規がん検出用マーカー及び薬剤感受性マーカー等を見出し、本願発明を完成させた。
したがって、本発明は以下の態様を包含する。
（１）タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、
異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、
混合した宿主細胞を培養する工程、
培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、
抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、
前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程、
を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法。
（２）前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子はがん化能を有すると評価する工程をさらに含む、（２）に記載の方法。
（４）培養工程を、分化誘導条件下で行い、
前記培養後の相対的な細胞数が基準値に比べて高い場合に、その目的遺伝子は分化抑制遺伝子であると評価する工程をさらに含む、（２）に記載の方法。
（５）培養工程を、被験環境下で行う、（１）又は（２）に記載の方法。
（６）前記被験環境が、被験物質の存在下である、（５）に記載の方法。
（７）前記目的遺伝子ががん遺伝子であり、培養工程を抗がん剤の存在下で行い、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん遺伝子の抗がん剤に対する感受性を評価する工程を含む、（６）に記載の方法。
（８）抗がん剤が、低分子化合物及び／又は抗体薬剤である、（７）に記載の方法。
（９）（７）又は（８）に記載の方法を、複数の抗がん剤について一度に又は独立して複数回行い、得られた抗がん剤感受性の結果に基づいて各がん遺伝子に対して有効な抗がん剤を決定する工程を含む、抗がん剤決定方法。
（１０）前記目的遺伝子ががん抑制遺伝子であり、宿主細胞が前記癌抑制遺伝子を欠失させた細胞であり、培養工程を前記がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置下で行う、（６）に記載の方法。
（１１）薬剤がPARP阻害剤である、（１０）に記載の方法。
（１２）異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞が、同一の細胞株に由来する、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記目的遺伝子が、１つのがん遺伝子の複数の変異体を含む、（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記目的遺伝子が、野生型遺伝子に対して複数の変異を含む複合変異型遺伝子を含む、（１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）定量工程が、次世代シーケンスによるリード数に基づいて行われる、（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）培養工程を、非ヒト動物を用いてin vivoで行う、（１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）がん検出用マーカーであって、H304Y、P741L、S752-I759del、H773Y、A767V、V786M、L838P、E865K、A871G、G874S、V802I、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質からなる、前記マーカー。
（１８）がん検出用マーカーであって、L62R及びG719S（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、I744M及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される複合変異を有するEGFRタンパク質からなる前記マーカー。
（１９）（１７）又は（１８）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
（２０）COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質。
（２１）配列番号7で示されるアミノ酸配列、配列番号7で示されるアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号7で示されるアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換したアミノ酸配列を含む、（２０）に記載の融合タンパク質。
（２２）（２０）又は（２１）に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（２３）（２０）又は（２１）に記載の融合タンパク質、又は（２２）に記載のポリヌクレオチドからなる分化抑制変異検出用マーカー。
（２４）L62R、L62R及びL858R（cis）、R108K、R108K及びL858R（cis）、A216T、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、H304Y、S306L、P596L、G598V、R669Q、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709K、E709V、K714R、L718Q、S720F、L747V、P753S、A767V、V769L、V769M、H773L、V774M、R776H、C797S、L833V、V843I、R776C、並びにR831Lからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ感受性マーカー。
（２５）L62R及びG719S（trans）、L62R及びL858R（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、R669Q及びL858R（cis）、R669Q及びL858R（trans）、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、K739N、K739N及びL858R（cis）、K739N及びL858R（trans）、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-S752>V、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、L747V及びL858R（cis）、L747V及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、I759M、I759M及びL858R（cis）、I759M及びL858R（trans）、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773Y、V774-C775insHV、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、V851I、T854A、L858R、A859T、L861Q、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、E865K及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、セツキシマブ耐性マーカー。
（２６）A839T変異を有するEGFRタンパク質からなる、EGFRチロシンキナーゼインヒビター耐性マーカー。
（２７）R108K及びL858R（cis）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R831L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、L62R、R108K、R108K及びL858R（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（trans）、K714R、G719A、G719S、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、E865K、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ゲフィチニブ感受性マーカー。
（２８）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、A864T、A871T、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ゲフィチニブ耐性マーカー。
（２９）R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、S768I及びL858R（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709V、K714R、G719A、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、A864T、E865K、A871G、A871T、G874S、S1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、エルロチニブ感受性マーカー。
（３０）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、N771-P772insN、N771-P772insN、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、エルロチニブ耐性マーカー。
（３１）L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G、E709G及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、L747-P753>Q、L747S、T751-I759>N、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、A864T、E865K、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A871T、G874S、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、S1153I、T751I、S768I、V769L、H773L、V774M、G779S、T854A、A859T、並びにG873Eからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、アファチニブ感受性マーカー。
（３２）L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769-D770insASV、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、V774-C775insHV、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、C797S、V851I、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、アファチニブ耐性マーカー。
（３３）L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びL858R（cis）、V769-D770insASV、V769L、V769M、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、G779S、V786M、T790M、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、V851I、T854A、L858R、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、A864T、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、G874S、E746-S752>V、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、S1153I、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709G、E709K、E709V、K714R、G719A、I744M、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、T790M及びE746-A750del（trans）、L838V、L861Q及びG719A（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、並びにL861R及びG719A（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、オシメルチニブ感受性マーカー。
（３４）S306L、L703I、E709A及びG719S（cis）、E709A及びL858R（cis）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S768I及びG719A（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びG719A（cis）、C797S、L861Q及びG719A（cis）、E865K、A871T、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、オシメルチニブ耐性マーカー。
（３５）E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、H835L、L858R、A871T、A1118T、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、H304Y、P596L、L62R、G719A、G719C、G719S、G735S、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、D761-E762insEAFQ、V765M、H773L、V774-C775insHV、V774M、V786M、T790M、P798H、R831H、L833F、V851I、K860I、L861Q、G873E、G874S、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ロシレチニブ感受性マーカー。
（３６）A289V、S492R、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、S720F、P741L、P753S、A763-Y764insFQEA、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773Y、R776C、R776H、G779S、C797S、V802I、R831L、L833V、V834L、V834M、V843I、P848L、T854A、A859T、A864T、E865K、及びA871Gからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、ロシレチニブ耐性マーカー。
（３７）
R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、P2329L、D2913H、P2639L、S3291C、D23V、I2664M、K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、及びW2970*からなる群から選択される変異を有するBRCA2タンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、がん検出用マーカー。
（３８）（１７）～（１９）及び（２３）～（３７）のいずれかに記載のマーカーを検出するための、プライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキット。
（３９）被験者から得られたサンプルにおいて、（１７）～（１９）及び（３７）のいずれかに記載のマーカーを検出する工程を含む、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
（４０）被験者から得られたサンプルにおいて、（２３）に記載のマーカーを検出する工程を含む、分化抑制変異の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法。
（４１）被験者から得られたサンプルにおいて、（２４）又は（２５）に記載のマーカーを検出する工程を含む、セツキシマブ感受性の判別を補助する方法。
（４２）被験者から得られたサンプルにおいて、（２６）～（３６）のいずれかに記載のマーカーを少なくとも1つ検出する工程を含む、薬剤感受性の判別を補助する方法。
（４３）（１７）又は（１８）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４４）（２０）又は（２１）に規定される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４５）（２４）～（３６）に規定される変異を有するEGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
（４６）（３７）に規定される変異を有するBRCA2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ含む細胞集団。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-069085号の開示内容を包含する。
本発明により、異なる複数の目的遺伝子のがん化能等の機能、及び各目的遺伝子を有する細胞の薬剤に対する感受性又は耐性を迅速かつ正確に、また網羅的に評価することができる。さらに、本発明の方法により同定された各種マーカーに基づいて、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性、及び薬剤感受性等を評価することが可能となる。
図1は、本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法の一実施形態を示す概念図である。 図2は、フォーカス形成アッセイにおけるギムザ染色領域（%）と、本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法の一実施形態による倍率変化（day 8/day 0）が正の相関を有することを示すグラフである（r=0.63）。 図3は、活性型EGFR変異体（11種）又は他のがん化タンパク質（5種）を発現する16種のBa/F3細胞のプールに対して、様々なチロシンキナーゼインヒビター（以下、TKIとする）を試験した結果を示す図である。遺伝子導入細胞ごとの異なる倍化時間を考慮するため、TKI処理したBa/F3細胞のそれぞれをビヒクル処理対象と比較して、各細胞クローンの増殖阻害を計算した。用いた薬剤はゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、クリゾチニブ、アレクチニブ、及びピューロマイシンである。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞（1：EGFR：L858R、2：EGFR：746-750del、3：EGFR：G719S、4：EGFR：L861Q、5：EGFR：S768I、6：EGFR：E709K、7：EGFR：E709A、8：EGFR：A289V、9：EGFR：G598V、10：EGFR：T790M、11：EGFR：T790M及びC797S、12：KRAS：G12V、13：EML4-ALK、14：CD74-ROS1、15：KIFB-RET、及び16：ERBB2：V777L）を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図4は、A839T、L858R、並びにT790M及びC797Sを有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブに対する感受性を示す。横軸は薬剤濃度（nM）、縦軸は細胞生存率（%）を示す。 図5-1は、野生型EGFR（WT）、又は各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。最上段の濃淡は、各変異の種類（ミスセンス変異、欠失変異、及び挿入変異）を表し、それ以外の部分の濃淡は、相対的な生存率を表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図5-1の続葉である。 図6-1は、各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.0001μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図6-1の続葉である。 図7は、3T3フォーカス形成アッセイで単一変異及び複合変異を含むEGFRタンパク質を発現する細胞を評価した結果を示す。溶液の色が濃い程細胞が増殖し、変異ががん化能を有することを示唆している。GFPは緑色蛍光タンパク質、Wtは野生型EGFRを有するタンパク質を発現する細胞を評価したことを示す。Singleは表の左欄に示した変異を含むタンパク質を、Cisは表の左欄に示した変異に加えてL858Rを（シス位置で）含むタンパク質を、Transは表の左欄に示した変異に加えてL858Rを（トランス位置で）含むタンパク質を発現する細胞を評価したことを示す。 図8-1は、各変異を有するEGFRタンパク質を発現する細胞の、セツキシマブに対する感受性を示す。図中、縦軸は薬剤濃度（上の行から順に、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL）を示し、横軸は各変異を有する細胞を用いたことを示す。相対的な生存率を濃淡で表し、色が濃い程生存率が低いことを示す。 図8-1の続葉である。 図9は、Clinvarにおいて登録されたVUS又はconfricting interpretationsの変異を、MANO-B法により評価した結果に示す。
＜複数の目的遺伝子の評価方法＞
（本発明の評価方法）
一態様において、本発明は、異なる複数の目的遺伝子の評価方法（以下、単に「本発明の評価方法」とも記載する）に関する。本明細書において、「複数」の範囲の下限は特に限定しないが、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、20以上、30以上、50以上、100以上であってよい。同様に、「複数」の範囲の上限は特に限定しないが、例えば1000以下、500以下、又は300以下であってよい。
本明細書において、「目的遺伝子」の種類は特に限定しない。本発明の方法では細胞の増殖率及び／又は生存率を評価し得るため、目的遺伝子は、細胞の増殖率及び／又は生存率に影響を与える遺伝子であってよい。細胞の増殖率及び／又は生存率に影響を与える遺伝子の例として、例えばがん遺伝子、がん抑制遺伝子、アポトーシスに関与する遺伝子、細胞老化に関与する遺伝子、（分化誘導条件下での）分化抑制遺伝子、幹細胞性の維持に関わる遺伝子、（薬剤存在下での）薬剤感受性又は耐性遺伝子、（ストレス環境下での）ストレス感受性又は耐性遺伝子等が挙げられる。がん遺伝子の例として、EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor、上皮成長因子受容体）遺伝子、ALK（anaplastic lymphoma kinase）遺伝子、RAS遺伝子（KRAS遺伝子、NRAS遺伝子、HRAS遺伝子）、及びRET（REarranged during Transfection）遺伝子等が挙げられる。がん抑制遺伝子の例としてBRCA1、BRCA2、TP53、MSH2、MSH6、MLH1、APC、NF1、INK4A、PTEN、及びRB1が挙げられる。
目的遺伝子の野生型及び変異型遺伝子の双方が、評価される機能を有していてもよいし、目的遺伝子の野生型及び変異型のいずれかが、評価される機能を有していてもよい。本明細書において、「変異」という用語は、集団の大多数（野生型）と異なる形質をもつことを意味し、「変異型」という用語は、そのような形質を有する核酸及びタンパク質等の物質を意味する。一般に、変異は、被験者における遺伝子の塩基配列又はタンパク質のアミノ酸配列を、野生型である健常体におけるそれらの配列と比較することにより同定される。
変異の種類は限定しないが、例えば、遺伝子レベルでの変異、すなわち塩基配列上の変異の例として、アミノ酸のコドンが終止コドンに変わるナンセンス変異、コドン内の塩基の置換によりアミノ酸の置換が生じるミスセンス変異、コドン内の塩基の付加及び／又は欠失によりアミノ酸の付加及び／又は欠失が生じる付加欠失型変異、及び塩基の挿入又は欠失等によりコドンの読み枠がずれるフレームシフト変異等の非同義変異が挙げられる。塩基配列に変異が生じるが、アミノ酸に変化が生じないサイレント変異（同義変異）もまた、本明細書の変異に含まれる。また、一の遺伝子と他の遺伝子の融合によって形成される融合変異、及びエキソンの一部が除かれた転写産物が生ずるエキソンスキッピングもまた、本発明の変異に含まれる。目的遺伝子の変異は、意義が知られた変異であってもよいし、VUS（Variant of uncertain significance、意義不明の変異）であってもよい。
目的遺伝子は、がん遺伝子等の1つの遺伝子の複数の変異体を含み得る。
また、目的遺伝子は1つの野生型遺伝子に対して複数の変異を含む複合型変異を含んでよい。複合型変異に含まれる複数の変異の数は、限定しないが、例えば、2、3、又は4であってよい。
本発明の目的遺伝子の評価方法は、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程（挿入工程）、異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程（混合工程）、混合した宿主細胞を培養する工程（培養工程）、培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程（抽出工程）、抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程（定量工程）、及び前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程（決定工程）を必須の工程として含む。
また、本発明の評価方法は、任意の工程として、前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する工程（比較工程）を、前記決定工程後に含み得る。本発明の評価方法は、任意に、比較工程に加えて、比較工程で得られた基準値との比較により、又は他の目的遺伝子との比較により、目的遺伝子を評価する工程（評価工程）を前記決定工程後又は前記比較工程後にさらに含む。
本発明の評価方法の一実施形態を、図1を用いて説明する。図1では、まずタグ配列を付した目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムDNAに挿入し、それらの細胞を混合した後、任意に細胞の一部を取り出して、Day0のサンプルとする。続いて、混合した細胞を任意の条件（例えば、通常の培養条件又は薬剤処理条件）で適当な期間培養し、その後細胞からゲノムDNAを抽出してタグ配列を含む核酸領域を増幅して定量し、その定量値に基づいて目的遺伝子を有する細胞の相対的な数を決定する。細胞の相対的な数を決定する際、任意にDay 0（培養前）の値により標準化してもよい。本発明の異なる複数の目的遺伝子の評価方法は、例えば、がん化能の有無の評価、分化抑制遺伝子の有無の評価、及びがん遺伝子の抗がん剤に対する感受性の評価等に用いることができる。
本発明の方法を構成する各工程について、以下詳細に記載する。
（挿入工程）
挿入工程では、タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する。
本明細書において、「タグ配列」又は「バーコード配列」とは、各目的遺伝子又はその断片に付される固有の識別配列を意味する。タグ配列は、目的遺伝子に直接連結されてもよいし、スペーサー配列等の他の配列を介して間接的に連結されてもよい。
タグ配列を連結した目的遺伝子を含むポリヌクレオチドをゲノムDNAに挿入することによって、後述する定量工程において、ゲノムDNA中のポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量することが可能となる。タグ配列の長さは限定しないが、各目的遺伝子の識別が可能な程度長いことが好ましい。タグ配列のヌクレオチド長は、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、8以上であってよく、50以下、40以下、30以下、20以下、又は10以下であってよい。理論上は、タグ配列のヌクレオチド長をnとすれば、4n種の目的遺伝子のそれぞれに固有のタグ配列を付すことができる。
目的遺伝子を、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する方法は限定せず、当業者に公知の方法、を用いて行うことができる。そのような方法の例として、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを用いる方法、Cre-Lox等のリコンビナーゼを用いる方法、Piggy Bac Transposon Vector System 等のトランスポザーゼを用いて遺伝子を導入する方法、TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）（例えば、WO2011/072246号を参照）、CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat / CRISPR associated protein 9）（例えば、Hendel A. et al., Nature Biotechnology, 2015, 33, pp. 985-989を参照されたい）、及びZFN（zinc finger nuclease）（例えば、M. Bibikova et al., Genetics, 2002, 161, pp. 1169-1175を参照）等のゲノム編集タンパク質を用いる方法が挙げられる。
挿入工程では、ポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現可能な状態で宿主細胞のゲノムDNAに挿入する。「目的遺伝子が発現可能な状態」とは、目的遺伝子がその発現に必要な調節配列と共に存在し、目的遺伝子が発現される状態を意味する。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D（シャインダルガルノ）配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。これらの調節配列は、宿主細胞のゲノムDNAに内在性（内因性）のものであってもよいし、目的遺伝子と共に挿入工程において宿主細胞のゲノムに人為的に挿入された外因性のものであってもよい。また、目的遺伝子は薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカーと共に宿主細胞のゲノムに挿入してもよく、挿入後にこの選択マーカーを用いて目的遺伝子が導入された細胞を選抜してもよい。
宿主細胞の種類は限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトの細胞である。本発明の評価方法に用い得る細胞の例として、HEK293細胞、3T3細胞、Ba/F3細胞、CHO細胞等の株化細胞、及び初代培養細胞が挙げられる。用いる細胞は、評価する目的遺伝子に応じて、疾患の有無、変異の有無、及び／又は由来組織等を考慮して、適宜選択することができる。
培養細胞は、野生型の細胞であってもよいし、特定の遺伝子、例えばがん遺伝子、がん抑制遺伝子、アポトーシスに関与する遺伝子、細胞老化に関与する遺伝子、分化抑制遺伝子、幹細胞性の維持に関わる遺伝子、薬剤感受性又は耐性遺伝子、ストレス感受性又は耐性遺伝子等をノックアウト又は欠失させた変異細胞であってもよい。
本発明の評価方法は、2種以上の異なる細胞を用いて行い、複数の細胞に対する目的遺伝子の機能を評価してもよいが、後述する培養工程における細胞株間の増殖率等の差異による影響を除くため、同一の細胞株について挿入工程を行い、後の混合工程に用いることが好ましい。
（混合工程）
混合工程では、前記挿入工程において異なる目的遺伝子を含むポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する。本工程では、複数の宿主細胞を概ね同率で混合することが好ましいが、異なる割合で細胞を混合してもよい。後述する定量値を標準化するために、混合直後の細胞を標準化細胞として一部採取してもよい。後述する培養工程後の宿主細胞の結果を標準化細胞の結果で標準化することによって、混合工程における細胞数の混合割合の差を補正することができる。
（培養工程）
培養工程では、前記混合工程で混合した宿主細胞を適当な条件下で培養する。培養工程は、培地成分、温度、pH、湿度、CO2濃度等の培養条件を当業者に知られる通常の条件に設定して行ってもよいし、特定の被験環境下で行ってもよい。「被験環境」とは、本発明の目的の遺伝子を試験する特定の条件を意味し、その例として、被験物質、例えば抗がん剤等の薬剤の存在下、分化抑制又は促進条件下、飢餓ストレス及び温度ストレス等のストレス条件下が挙げられる。
培養工程の期間は特に限定しない。培養工程は、例えば、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、1週間以上、2週間以上であってよく、また3ヶ月以下、2ヶ月以下、1ヶ月以下、又は2週間以下、例えば3日以上2週間以下であってよい。
培養工程は、in vitro及びin vivoのいずれにおいても行うことができるが、試験の簡便性の点からin vitroで行うことがより好ましい。培養工程をin vivoで行う場合、前記混合工程で混合した宿主細胞を、非ヒト動物、例えばラット及びマウス等の実験動物に移植し、一定の期間経過後、後述する抽出工程に供すればよい。
（抽出工程）
抽出工程では、前記培養工程で培養した後の宿主細胞（及び任意に、混合工程後、培養工程前の宿主細胞）から常法によりゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAの抽出方法は当業者に公知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参考にすればよい。具体的には、一般的なフェノールクロロフォルム抽出法や、市販のキット、例えばPureLink（登録商標） Genomic DNA（Thermo Fisher Scientific）、及びMag ExtractorTM-Genome-（TOYOBO）等の市販のキットを用いてゲノムDNAの抽出を行うことができる。抽出したDNAはそのまま、又は精製した後、PCRに用いることができる。なお、培養工程をin vivoで行った場合、宿主細胞を移植した非ヒト動物から適当な組織又は器官を採取し、それから上記方法でゲノムDNAを抽出すればよい。
（定量工程）
定量工程では、前記抽出工程で抽出したゲノムDNA中に含まれる前記ポリヌクレオチドの量を、タグ配列に基づいて定量し、定量値を得る。「定量値」とは、定量方法によって得られる測定値である。定量値は、容量及び重量等の絶対値であってもよいし、基準となる値に対する相対値であってもよい。
定量工程は当業者に公知の定量方法、例えばプローブを用いる定量法、又は特異的なプライマーを用いる半定量PCR又はReal-time PCRにより行うことができ、特に限定しないが、操作の迅速性及び正確性の点から、次世代シーケンスによるリード数に基づいて行うこと好ましい。次世代シーケンスは、次世代シーケンサーを用いた配列情報の取得法であり、Sanger法に比べて膨大な数のシーケンシング反応を同時並行して実行できることを特徴とする（例えば、Rick Kamps et al., Int. J. Mol. Sci., 2017, 18(2), p. 308及びInt. Neurourol. J., 2016, 20(Suppl. 2), S76-83を参照されたい）。
次世代シーケンスの一般的な工程を以下に示す。まず初めに、サンプル調製（工程（1））を行う。サンプル調製では、解析対象となる核酸を、次世代シーケンサーのリード長に合わせて酵素的又は機械的に断片化する。続いて、多くの場合、後のシーケンス工程に必要なアダプター配列を付加する。また、特定の遺伝子領域を解析するために、PCR等により特定の遺伝子領域を富化してもよい。遺伝子領域の富化は、例えば4～12サイクルの増幅ステップにより行う。
続いて、シーケンシング（工程（2））が行われる。シーケンシング工程の詳細は、次世代シーケンサーの種類により異なるが、典型的にはアダプター配列を介して基板に連結させ、またアダプター配列をプライミング部位としてシーケンシング反応が行われる。シーケンス反応の詳細については、例えばRick Kamps et al（上掲）を参照されたい。
最後に、データ出力（工程（3））が行われる。この工程では、シーケンシング反応により得られた配列情報を集めたものが得られる。出力されたデータをさらに解析して、より意味のある結果を導くことができる。
定量工程において利用され得る「リード数」とは、特定の配列を有する増幅産物の増幅量を指す。本発明の定量工程では、次世代シーケンスによる特定のタグ配列を含む領域のリード数を、ゲノムDNA中のタグ配列が連結された目的遺伝子の相対的な量とみなすことができる。
本発明の定量工程では、特にタグ配列を含む核酸領域をPCRに供したものを次世代シーケンスに供することが好ましい。PCR工程によって、次世代シーケンスに必要なアダプター配列を付加するだけでなく、タグ配列を含む領域を富化し、検出感度を高めることができるからである。また、宿主の内在性の同一のPCRプライミング部位を利用して、及び／又は宿主細胞のゲノムに挿入した同一のPCRプライミング部位を利用して、同一のプライマーを用いてPCR反応を行うことが好ましい。これにより、異なるプライマーを用いる場合の増幅効率の差の影響を受けることなく、増幅前の割合を保ったまま、PCR反応を行うことができる。
（決定工程）
決定工程では、前記定量工程で決定したポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する。
定量工程ではゲノムDNA中の各ポリヌクレオチドが定量されるため、mRNA又はタンパク質を定量する場合とは異なり、発現量の相違の影響を受けることがない。したがって、ポリヌクレオチドのそれぞれの定量値は、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の細胞数を反映している。
混合工程における混合直後の細胞を一部標準化細胞として採取し、決定工程で得られる宿主細胞の培養後の細胞数を、混合直後の宿主細胞の細胞数で標準化することによって、混合工程における細胞数の混合割合の差を補正することができる。
（比較工程）
比較工程は、本発明の評価方法において、前記決定工程後に含まれ得る任意の工程である。比較工程が含まれる場合、目的遺伝子が基準遺伝子を含むことを前提とする。本明細書において、「基準遺伝子」とは、目的遺伝子の機能を評価するための基準となる遺伝子を意味し、その種類は限定しないが、例えば細胞増殖に影響を与えない、すなわちがん化能のないことが知られている陰性対照遺伝子（例えばがん化能を有さない野生型遺伝子）、及び細胞増殖に正又は負の影響を与えることが知られている陽性対照遺伝子（例えばがん遺伝子、薬剤感受性遺伝子又は薬剤耐性遺伝子）が挙げられる。
比較工程では、その基準遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を基準値として、前記決定工程で決定された宿主細胞の培養後の相対的な細胞数と比較する。基準遺伝子が含まれなくても、例えば他の目的遺伝子との比較により目的遺伝子を評価できるが、基準遺伝子との比較により、より正確に目的遺伝子を評価することが可能となる。
（評価工程）
評価工程は、本発明の評価方法において、前記決定工程後又は前記比較工程後に含まれ得る任意の工程である。評価工程では、比較工程で得られた基準値との比較により、又は他の目的遺伝子との比較により、目的遺伝子を評価する。
例えば、基準遺伝子が前記陰性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数が基準値よりも高いときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。同様に、基準遺伝子が前記陽性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数が基準値と同程度であるときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。これらの実施形態では、本発明の評価方法を、がん（候補）遺伝子の同定法として用いることができる。
さらに、例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて目的遺伝子の増殖能を評価する場合、以下の計算式によりされる増殖スコアに基づいてがん（候補）遺伝子を同定することができる。
目的遺伝子Aの増殖能スコア = (AX×T0) / (A0×TX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
T0 = Day 0で回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
A0 = Day 0で回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（増殖能スコアは、その値が高い程目的遺伝子の増殖能（がん化能）が高いことを示す。ここで、Day0は培養前の結果を、Day Xは、X日培養した後の結果を示す。（以下も同様とする））
通常、分化誘導条件で細胞を培養すれば分化が誘導され、細胞の増殖が停止する。したがって、前記培養工程を分化誘導条件下で行い、分化誘導条件下においても増殖が認められる変異については、分化抑制変異、例えばがん化能を有する分化抑制変異であると評価し得る。
したがって、例えば、基準遺伝子が分化に影響を与えないことが知られている陰性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の分化誘導条件下での培養後の相対的な細胞数が基準値よりも高いときには、目的遺伝子が分化抑制能を有すると評価することができる。同様に、基準遺伝子が分化に影響を与えることが知られている陽性対照遺伝子である場合、目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを有する宿主細胞の分化誘導条件下での培養後の相対的な細胞数が基準値と同程度であるときには、目的遺伝子ががん化能を有すると評価することができる。これらの実施形態では、本発明の評価方法を、分化抑制（候補）遺伝子の同定法として用いることができる。
さらに、例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて目的遺伝子の増殖能を評価する場合、以下の計算式により算出される分化抑制能スコアに基づいて分化抑制（候補）遺伝子を同定することができる。
目的遺伝子Aの分化抑制能スコア = (AIX×TX) / (AX×TIX)
［AIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
AX= Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TIX= 分化誘導後Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（分化抑制能スコアは、その値が高い程目的遺伝子の分化抑制能が高いことを示す。）
また、本発明の評価方法は、薬剤に対する感受性又は耐性を評価するために用いることができる。例えば、次世代シーケンスによるリード数に基づいて薬剤感受性を評価する場合、以下の計算式により薬剤感受性スコアを算出することができる。
目的遺伝子Aの薬剤感受性スコア = (ADX×TX) / (AX×TDX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TX= Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数、
ADX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたタグ配列のリード数、
TDX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における全タグ配列の総リード数。］
（薬剤感受性スコアは、その濃度での目的遺伝子導入細胞の生存率を示し、その値が高い程目的遺伝子の薬剤感受性が低い（薬剤耐性が高い）ことを示す。）
目的遺伝子の薬剤感受性又は耐性を評価する場合、薬剤の種類は限定しない。好適な薬剤として、抗がん剤、例えば低分子化合物及び／又は抗体が含まれる。抗がん剤として作用する低分子化合物の例としてEGFRチロシンキナーゼインヒビター（TKI）、例えばgefitinib（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）、アファチニブ（afatinib）、オシメルチニブ（osimertinib）、ロシレチニブ（ロシレチニブ）、クリゾチニブ（crizotinib）、及びアレクチニブ（alectinib）が挙げられ、抗がん剤として作用する抗体の例としてEGFR抗体であるセツキシマブ（cetuximab）が挙げられる。
本発明の一実施形態において、目的遺伝子はがん遺伝子である。この実施形態において、本発明の評価方法は、培養工程を抗がん剤の存在下で行い、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん遺伝子の抗がん剤に対する感受性（又は耐性）を評価する工程を含み得る。
抗がん剤に対する感受性又は耐性は、基準遺伝子（例えば野生型遺伝子）又は他の目的遺伝子と比較して定めることができる。基準遺伝子には、例えば薬剤感受性遺伝子又は薬剤耐性遺伝子のいずれも使用することができる。また、基準遺伝子を含めず、特定の薬剤濃度における細胞生存率を基に薬剤感受性又は耐性を評価することもできる。
また、薬剤感受性又は耐性は、薬剤の種類及び生体内の薬剤濃度等を考慮して薬剤濃度を適宜定め、その薬剤濃度における生存率に基づいて決定することもできる。抗がん剤が上記低分子化合物である場合、例えば、薬剤濃度0.0001μM～10μM、0.0005μM～5μM、0.001μM～1μM、0.005μM～0.5μM、又は0.01μM～0.1μMの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができ、抗がん剤が抗体である場合、0.001μg/mL～100μg/mL、例えば、0.01μg/mL～10μg/mL、又は、0.1μg/mL～1μg/mLの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができる。
これらの薬剤濃度において細胞生存性が高い場合、例えば細胞生存率が50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は100%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤耐性があると判断することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が低い場合、例えば細胞生存率が50%以上、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、又は0%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤感受性があると判断することができる。
本明細書において、感受性は、さらに薬剤が奏功する蓋然性が高い「狭義感受性」と、薬剤が奏功する蓋然性が狭義感受性に比べて劣る「一部感受性」に区別され得る。各薬剤の狭義感受性、一部感受性、及び耐性は、例えばIC90（細胞の増殖が90%阻害される薬剤濃度）に基づいて、以下の様に定めることができる。
例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びオシメルチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性、0.1μM ≦ IC90 ≦ 0.5μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 0.5μMとなる場合を耐性とすることができる。また、アファチニブであれば、IC90 < 0.005μMとなる場合を狭義感受性、0.005μM ≦ IC90 ≦ 0.01μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 0.01μMとなる場合を耐性とすることができる。ロシレチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性、0.1μM ≦ IC90 ≦ 1μMとなる場合を一部感受性、IC90 > 1μMとなる場合を体制とすることができる。セツキシマブであれば、IC90 < 1μg/mLとなる場合を狭義感受性、1μg/mL ≦ IC90 ≦100μg/mLとなる場合を一部感受性、IC90 > 100μg/mLとなる場合を耐性とすることができる。
本発明の一実施形態において、目的遺伝子はBRCA1遺伝子又はBRCA2遺伝子等のがん抑制遺伝子である。この実施形態において、宿主細胞は、目的遺伝子、例えば癌抑制遺伝子を欠失させた細胞であってもよい。また、この実施形態において、培養工程を、前記がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置下で行うことができる。がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置の例として、PARP（ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ）阻害剤等及び細胞障害性の抗がん剤(例えば白金性抗がん剤のシスプラチン、カルボプラチン等）等の薬剤、並びに放射線処置が挙げられる。PARP阻害剤の例として、オラパリブ（olaparib）、ニラパリブ（niraparib）、ベリパリブ（veliparib）、及びタラゾパリブ（Talazoparib）が挙げられる。この実施形態において、本発明の評価方法は、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん抑制遺伝子を評価する工程を含み得る。例えば、機能を有するがん抑制遺伝子が導入された細胞は修復能を有するため、PARP等の薬剤を加えても細胞数が低下しない。一方で機能欠失型のがん抑制遺伝子が導入された細胞は修復能を有さない為、PARP等の薬剤を加えると相対細胞数が低下する。このような基準にしたがって、培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん抑制遺伝子を評価することができる。
＜抗がん剤決定方法＞
一態様において、本発明は抗がん剤決定方法に関する。本発明の抗がん剤決定方法は、複数の抗がん剤について上記薬剤の感受性の評価方法を行い、得られた結果に基づいて各がん遺伝子に対して有効な抗がん剤を決定する工程を含む。薬剤の感受性の評価方法は、培養工程を複数の薬剤の存在下で行うことで、複数の抗がん剤について一度に行ってもよい。これにより、組み合わせ薬剤又は組み合わせ療法に対する感受性を評価することができる。また、薬剤の感受性の評価方法は、薬剤ごとに独立して行い、複数の薬剤について独立に感受性を評価してもよい。これにより、各薬剤の感受性を比較し、より感受性の高い薬剤を決定することができる。この場合、各遺伝子の様々な薬剤感受性等を広く検証するため、各薬剤の作用機構が異なっていることが好ましい。特に、本発明者は、各がん遺伝子の抗体に対する感受性と低分子化合物に対する感受性が大きく異なっていることを見出したことから、抗体と薬剤の両方について感受性を評価することで、より適切な薬剤を選択することができる。
＜がん検出用マーカー＞
一態様において、本発明は、がん検出用マーカーに関する。がん検出用マーカーとは、がんを検出するための指標となる因子を意味する。本発明のがん検出用マーカーにより検出されるがんとしては、限定はしないが、例えば、脳腫瘍、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、小腸がん、大腸がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは肺がんが挙げられる。
一実施形態において、本発明のがん検出用マーカー、好ましくは肺がん検出用マーカーは、A767V、A871G、E865K、G874S、H304Y、H773Y、L838P、P741L、S1153I、及びS752-I759del、V786M、及びV802Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
本明細書において、EGFRタンパク質は、配列番号1で示されるヒトEGFRタンパク質のアミノ酸配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。また、EGFRタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号2で示される塩基配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。
本明細書において、置換変異は「X1a1X2」の記号で表され、これはタンパク質のアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときにa1位のX1アミノ酸がX2アミノ酸に置換されていることを意味する。例えば、EGFRタンパク質における上記A767Vは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の767位のロイシンがアルギニンに置換されていることを意味する。なお、本明細書におけるアミノ酸の一文字表記は、通常のアミノ酸表記方法に従う。
また、本明細書において、挿入変異は「X1a1-X2a2insX3」の記号で表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸とa2位のX2アミノ酸の間に、X3アミノ酸が挿入（ins：insert）されていることを意味する。ここでX3は二以上のアミノ酸残基であってよい。例えば、EGFRタンパク質におけるK745-E746insVPVAIKは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の745位のリシンと746位のグルタミン酸の間にバリン、プロリン、バリン、アラニン、イソロイシン、及びリシンが挿入されていることを意味する。
本明細書において、欠失変異は「X1a1-X2a2del」又は「delX1a1-X2a2」の記号で表される。これはタンパク質のa1位（のX1アミノ酸）からa2位（のX2アミノ酸）が欠失（del:delete）していることを意味する。例えば、EGFRタンパク質におけるL747-A750delは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の747位のロイシンから750位のアラニンが欠失していることを意味する。
本明細書において、欠失置換変異は、「X1a1-X2a2>X3」の記号によって表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸からa2位のX2アミノ酸が、X3アミノ酸に置換されていることを意味する。X3アミノ酸は二以上のアミノ酸残基であってよい。ここで「欠失置換変異」とは、元のアミノ酸配列の1又は2以上のアミノ酸が異なる1又は2以上のアミノ酸と置換された変異を意味する。欠失置換変異は、欠失したアミノ酸残基数と置換後のアミノ酸残基数が異なる点で、通常置換変異とは区別され得る。例えば、EGFRタンパク質におけるE709-T710>Dは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の709位のグルタミン酸から710位のトレオニンが欠失し、アスパラギン酸に置換されていることを意味し、EGFRタンパク質におけるE746-A750>IPは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の746位のグルタミン酸から750位のアラニンが欠失し、イソロイシン及びプロリンに置換されていることを意味する。
一態様において、本発明のがん検出用マーカーは、複合変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。複合変異とは、1つの野生型遺伝子に存在する異なる複数の変異をいう。
本明細書において、2以上の変異を含む複合変異は、「X1a1X2及びX3a2X4」又は「X1a1X2+X3a2X4」のように、上記変異の記号の組み合わせとして表される。これはタンパク質のa1位のX1アミノ酸がX2アミノ酸に置換され、かつa2位のX3アミノ酸がX4アミノ酸に置換されていることを意味する。例えば、EGFRタンパク質におけるR108K及びL858Rは、配列番号1で示されるアミノ酸配列の108位のR（アルギニン）がKに置換され、かつ858位のLがRに置換されていることを意味する。複合変異には、同一の染色体の1つの遺伝子内に複数の変異を含むシス型と、異なる染色体上の対立遺伝子の各々が異なる変異を含むトランス型が存在する。本明細書において、シス型の複合変異は（cis）、トランス型の複合変異は（trans）で表される。
一実施形態において、本発明のがん検出用マーカー、好ましくは肺がん検出用マーカーは、L62R及びG719S（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、I744M及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される複合変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
一実施形態において、本発明のがん検出用マーカーは、R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、P2329L、D2913H、P2639L、S3291C、D23V、I2664M、K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、及びW2970*、好ましくは、R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、及びP2329Lからなる群から選択される変異を有するBRCA2タンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。
本明細書において、BRCA2タンパク質は、配列番号13で示されるヒトBRCA2タンパク質のアミノ酸配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。また、BRCA2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号13で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号14で示される塩基配列を含むことが好ましいがこれには限定されない。
本明細書において、ナンセンス変異は、「X1a1*」の記号で表され、これはタンパク質のアミノ酸配列において開始メチオニンを1位としたときにa1位のX1アミノ酸をコードするヌクレオチドが、ストップコドンをコードするヌクレオチドに置換されていることを意味する。例えば、BRCA2タンパク質における上記K485*は、配列番号13で示されるアミノ酸配列の485位のリシンをコードするヌクレオチドが、ストップコドンをコードするヌクレオチドに置換されていることを意味する。
＜COL1A2とDCAF6の融合タンパク質＞
一態様において、本発明は、COL1A2（collagen type I alpha 2）タンパク質とDCAF6（DDB1 and CUL4 associated factor 6）タンパク質の融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。COL1A2タンパク質及びDCAF6の起源は特に限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
COL1A2タンパク質は、好ましくは配列番号3で示されるヒトCOL1A2タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号3で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、COL1A2タンパク質は配列番号3で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。COL1A2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号3で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号4で示される塩基配列、配列番号4で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、COL1A2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号4で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列に関する同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。また、本明細書において、「１若しくは複数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。
DCAF6タンパク質は、好ましくは配列番号5で示されるヒトDCAF6タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号5で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、DCAF6タンパク質は配列番号5で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。DCAF6タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号5で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号6で示される塩基配列、配列番号6で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、DCAF6タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号6で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、分化抑制能を有する限り、限定しない。好ましくは、COL1A2タンパク質の一部を融合タンパク質のN末端側に含み、DCAF6タンパク質の一部を融合タンパク質のC末端側に含む。
COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、好ましくは配列番号7で示されるヒトCOL1A2タンパク質とヒトDCAF6タンパク質の融合タンパク質のアミノ酸配列、又は配列番号7で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。また、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は配列番号7で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号7で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号8で示される塩基配列、配列番号8で示される塩基配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。また、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号8で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含むポリヌクレオチドであってよい。
COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質は、分化抑制能、例えば筋肉細胞への分化を抑制する能力、及び／又は分化抑制能に起因するがん化能を有し得るため、該融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分化抑制変異検出用マーカー又は肺がん等のがん検出用マーカーとして用いることができる。分化抑制変異検出用マーカーとは、分化抑制変異を検出するための指標となる因子を意味する。
＜薬剤感受性又は耐性マーカー＞
一態様において、本発明は薬剤感受性マーカー又は薬剤耐性マーカーに関する。薬剤感受性マーカーは薬剤に対する感受性を評価するための指標となる因子を意味し、薬剤耐性マーカーは薬剤に対する耐性を評価するための指標となる因子を意味する。本発明の薬剤感受性マーカー又は薬剤耐性マーカーは、適切な薬剤を選択するために用いることができる。
薬剤感受性マーカー又は耐性マーカーは、本発明の評価方法に基づいて、例えば基準遺伝子（例えば野生型遺伝子）又は他の目的遺伝子と比較して定めることができる。例えば、EGFRタンパク質に関する薬剤感受性又は耐性マーカーについては、本願明細書の図５又は図６に基づいて、野生型（WT）を基準にして定めることができる。例えば、ゲフィチニブについては、図５又は図６に基づいて、WTよりも細胞生存性が高い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ感受性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、L62R、R108K、A289D、H304Y、P596L、G719C、G719S、S720F、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、V765M、R776C、R776H、V786M、V802I、R831H、R831L、V834M、H835L、P848L、L858R、A864T、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153Iからなる群から選択される変異が挙げられる。一方、ゲフィチニブについて、図５又は図６に基づいて、WTよりも細胞生存性が低い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ耐性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、E709-T710>D、E709A、E709G、V769-D770insASV、V769L、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、V774-C775insHV、V774M、T790M、T7900M及びC797S、V851I、及びT854Aからなる群から選択される変異が挙げられる。図５又は図６に基づいて、同様にエルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブについても、それぞれの薬剤に対する感受性又は耐性マーカーを定めることができる。
また、薬剤感受性又は耐性は、薬剤の種類及び生体内の薬剤濃度等を考慮して薬剤濃度を適宜定め、その薬剤濃度における生存率に基づいて決定することもできる。抗がん剤が上記低分子化合物である場合、例えば、薬剤濃度0.0001μM～10μM、0.0005μM～5μM、0.001μM～1μM、0.005μM～0.5μM、又は0.01μM～0.1μMの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができ、抗がん剤が抗体である場合、0.001μg/mL～100μg/mL、例えば、0.01μg/mL～10μg/mL、又は、0.1μg/mL～1μg/mLの濃度での細胞性生存率に基づいて、薬剤感受性又は耐性を評価することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が高い場合、例えば細胞生存率が50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は100%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤耐性があると判断することができる。これらの薬剤濃度において細胞生存性が低い場合、例えば細胞生存率が50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、又は0%である場合、目的遺伝子を有する細胞は薬剤感受性があると判断することができる。
例えば、ゲフィチニブについては、図５又は図６に基づいて、例えば0.05μM、0.1μM、又は0.5μM、好ましくは0.1μMにおいて細胞生存率が低い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ感受性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、図５において着色がなされている、L62R、R108K、A289D、H304Y、P596L、G719C、G719S、S720F、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、V765M、R776C、R776H、V786M、V802I、R831H、R831L、V834M、H835L、P848L、L858R、A864T、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153Iからなる群から選択される変異が挙げられる。
一方、ゲフィチニブについて、図５又は図６に基づいて、例えば0.1μM、0.5μM、又は1μM、好ましくは0.5μMにおいて細胞生存性が高い変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲフィチニブ耐性マーカーとして用いることができる。そのような変異の具体例として、図５において着色がなされていない、E709-T710>D、E709A、V769-D770insASV、V769L、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、V774-C775insHV、V774M、T790M、T7900M及びC797S、V851I、並びにT854Aからなる群から選択される変異が挙げられる。
同様にエルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブについても、図５又は図６に基づいて、それぞれの薬剤に対する感受性又は耐性マーカーを定めることができる。例えば、図５又は６において、エルロチニブであれば、0.05μM、0.1μM、又は0.5μM、好ましくは0.1μMにおいて着色がなされている変異、アファチニブ及びオシメルチニブであれば0.0005μM、0.001μM、又は0.005μM、好ましくは0.001μMにおいて着色がなされている変異、ロシレチニブであれば0.5μM、1μM、又は5μM、好ましくは1μMにおいて着色がなされている変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、それぞれの薬剤に対する感受性マーカーとして用いることができる。
また、図５又は６において、例えば、エルロチニブであれば、0.1μM、0.5μM、又は1μM、好ましくは0.5μMにおいて着色がなされていない変異、アファチニブ及びオシメルチニブであれば0.001μM、0.005μM、又は0.01μM、好ましくは0.005μMにおいて着色がなされていない変異、ロシレチニブであれば1μM、5μM、又は10μM、好ましくは5μMにおいて着色がなされていない変異を有するタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、それぞれの薬剤に対する耐性マーカーとして用いることができる。
また、図８において、セツキシマブであれば、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、又は100μg/mL、好ましくは1μg/mLにおいて着色がなされていない変異を感受性マーカーとすることができ、逆に着色がなされている変異を耐性マーカーとして用いることができる。
本明細書において、感受性マーカーは、薬剤が奏功する蓋然性が高い「狭義感受性マーカー」と、薬剤が奏功する蓋然性が感受性に比べて劣る「一部感受性マーカー」にさらに区別され得る。各薬剤の狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、耐性マーカーは、例えばIC90（細胞の90%阻害濃度）に基づいて、以下の様に定めることができる。例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びオシメルチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる変異を狭義感受性マーカー、0.1μM ≦ IC90 ≦ 0.5μMとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 0.5μMとなる変異を耐性マーカーとすることができる。また、アファチニブであれば、IC90 < 0.005μMとなる変異を狭義感受性マーカー、0.005μM ≦ IC90 ≦ 0.01μMとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 0.01μMとなる変異を耐性マーカーとすることができる。ロシレチニブであれば、IC90 < 0.1μMとなる場合を狭義感受性マーカー、0.1μM ≦ IC90 ≦ 1μMとなる場合を一部感受性マーカー、IC90 > 1μMとなる場合を耐性マーカーとすることができる。この定義に従って定められる、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、及びロシレチニブの狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、及び耐性マーカーを以下に示す。
ゲフィチニブの狭義感受性マーカーとしては、R108K及びL858R（cis）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R831L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、並びにA1118T及びE746-A750del（cis）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ゲフィチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（trans）、K714R、G719A、G719S、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、E865K、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
ゲフィチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、A864T、A871T、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
エルロチニブの狭義感受性マーカーとしては、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719C（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、S768I及びG719C（cis）、S768I及びL858R（cis）、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、L833V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（cis）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、L861Q及びL858R（cis）、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A1118T、並びにA1118T及びE746-A750del（cis）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。エルロチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、V292L、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703I、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K、E709V、K714R、G719A、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776G、R776H、G779S、V786M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（trans）、V843I、P848L、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（trans）、A864T、E865K、A871G、A871T、G874S、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
エルロチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709G、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769L、N771-P772insN、N771-P772insN、H773L、V774M、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、V851I、T854A、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、G873E、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
アファチニブの狭義感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709G、E709G及びL858R（trans）、E709K、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M、I744M及びL858R（cis）、L747-P753>Q、L747S、T751-I759>N、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、V769M、H773Y、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、K860I、L861Q、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、A864T、E865K、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、A871T、G874S、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。アファチニブの一部感受性マーカーとしては、T751I、S768I、V769L、H773L、V774M、G779S、T854A、A859T、及びG873Eからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
アファチニブの耐性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719S（trans）、V769-D770insASV、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、V774-C775insHV、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、C797S、V851I、L861Q及びG719A（cis）、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
オシメルチニブの狭義感受性マーカーとしては、L62R、R108K、R108K及びL858R（cis）、R108K及びL858R（trans）、A216T、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、R222C、R252C、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289T及びL858R（trans）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、V292L及びL858R（trans）、H304Y、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、P596L、G598V、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、L703P、E709A及びG719C（trans）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（trans）、E709G及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、G719C、G719S、S720F、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、P741L、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I及びL858R（cis）、V769-D770insASV、V769L、V769M、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、R776H、G779S、V786M、T790M、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、V834M、H835L、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、P848L、V851I、T854A、L858R、A859T、K860I、L861Q、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、A864T、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、G874S、E746-S752>V、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。オシメルチニブの一部感受性マーカーとしては、L62R及びG719S（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A、E709A及びG719C（cis）、E709G、E709K、E709V、K714R、G719A、I744M、S768I、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、T790M及びE746-A750del（trans）、L838V、L861Q及びG719A（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、並びにL861R及びG719A（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
オシメルチニブの耐性マーカーとしては、S306L、L703I、E709A及びG719S（cis）、E709A及びL858R（cis）、L718Q、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、S768I及びG719A（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びG719A（cis）、C797S、L861Q及びG719A（cis）、E865K、A871T、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
ロシレチニブの狭義感受性マーカーとしてはE746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、T751-I759>N、S752-I759del、H835L、L858R、A871T、A1118T、からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ロシレチニブの一部感受性マーカーとしては、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、H304Y、P596L、L62R、G719A、G719C、G719S、G735S、K745-E746insVPVAIK、L747S、T751I、D761-E762insEAFQ、V765M、H773L、V774-C775insHV、V774M、V786M、T790M、P798H、R831H、L833F、V851I、K860I、L861Q、G873E、G874S、及びS1153Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
ロシレチニブの耐性マーカーとしては、A289V、S492R、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、S720F、P741L、P753S、A763-Y764insFQEA、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773Y、R776C、R776H、G779S、C797S、V802I、R831L、L833V、V834L、V834M、V843I、P848L、T854A、A859T、A864T、E865K、及びA871Gからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
セツキシマブであれば、例えば、IC90 < 1μg/mLとなる変異を狭義感受性マーカー、1μg/mL ≦ IC90 ≦ 100μg/mLとなる変異を一部感受性マーカー、IC90 > 100μg/mLとなる変異を耐性マーカーとすることができる。この定義に従って定められる、セツキシマブの狭義感受性マーカー、一部感受性マーカー、及び耐性マーカーを以下に示す。
セツキシマブの狭義感受性マーカーとして、L62R、L62R及びL858R（cis）、R108K、R108K及びL858R（cis）、A216T、A289D、A289T、A289T及びL858R（cis）、A289V、V292L、V292L及びL858R（cis）、H304Y、S306L、P596L、G598V、R669Q、E709A、E709A及びG719C（trans）、E709K、E709V、K714R、L718Q、S720F、L747V、P753S、A767V、V769L、V769M、H773L、V774M、R776H、C797S、L833V、並びにV843Iからなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。セツキシマブの一部感受性マーカーとして、R776C及びR831Lから選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
セツキシマブの耐性マーカーとして、L62R及びG719S（trans）、L62R及びL858R（trans）、R108K及びL858R（trans）、A216T及びE746-S752>V（cis）、A216T及びE746-S752>V（trans）、A289T及びL858R（trans）、S306L及びL858R（cis）、S306L及びL858R（trans）、S492R、R669Q及びL858R（cis）、R669Q及びL858R（trans）、L703I、L703I及びL858R（cis）、L703I及びL858R（trans）、I706T及びG719A（cis）、I706T及びG719A（trans）、E709-T710>D、E709A及びG719C（cis）、E709A及びG719S（cis）、E709A及びG719S（trans）、E709A及びL858R（cis）、E709A及びL858R（trans）、E709K及びL858R（cis）、E709K及びL858R（trans）、E709V及びL858R（cis）、E709V及びL858R（trans）、K714R及びL858R（cis）、K714R及びL858R（trans）、L718Q及びL858R（cis）、L718Q及びL858R（trans）、G719A、G719C、G719S、S720F及びL858R（cis）、S720F及びL858R（trans）、G735S、K739N、K739N及びL858R（cis）、K739N及びL858R（trans）、I744M、I744M及びL858R（cis）、K745-E746insVPVAIK、E746-S752>V、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、L747V及びL858R（cis）、L747V及びL858R（trans）、T751-I759>N、S752-I759del、I759M、I759M及びL858R（cis）、I759M及びL858R（trans）、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、S768I、S768I及びG719A（cis）、S768I及びG719A（trans）、S768I及びG719C（cis）、S768I及びG719C（trans）、S768I及びG719S（cis）、S768I及びG719S（trans）、S768I及びL858R（cis）、S768I及びL858R（trans）、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773Y、V774-C775insHV、R776C及びL858R（cis）、R776C及びL858R（trans）、R776G、R776G及びL858R（cis）、R776G及びL858R（trans）、T790M、T790M及びC797S（cis）、T790M及びE746-A750del（cis）、T790M及びE746-A750del（trans）、T790M及びG719A（cis）、T790M及びG719A（trans）、T790M及びL858R（cis）、T790M及びL858R（trans）、P798H、V802I、L833V及びL858R（cis）、L833V及びL858R（trans）、V834L、L838V、L838V及びL858R（cis）、L838V及びL858R（trans）、V843I及びL858R（cis）、V843I及びL858R（trans）、V851I、T854A、L858R、A859T、L861Q、L861Q及びG719A（cis）、L861Q及びG719A（trans）、L861Q及びL858R（cis）、L861Q及びL858R（trans）、L861R、L861R及びG719A（cis）、L861R及びG719A（trans）、E865K及びL858R（cis）、A871G、A871G及びL858R（cis）、A871G及びL858R（trans）、G873E、A1118T、A1118T及びE746-A750del（cis）、並びにA1118T及びE746-A750del（trans）からなる群から選択される変異を有するEGFRタンパク質、又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
一態様において、本発明は、A839T変異を有するEGFRタンパク質又は該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる、EGFRチロシンキナーゼインヒビター耐性マーカーに関する。EGFRチロシンキナーゼの例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、及びオシメルチニブが挙げられる。
＜マーカーを検出するための手段又はキット＞
一態様において、本発明は、上記がん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、薬剤感受性マーカー、又は薬剤耐性マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットに関する。これらは、上記マーカーに応じて、当業者であれば容易に設計することができる。
プライマーセットは、上記の様々なマーカー、特に各マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を特異的に検出できるものであれば特に限定しないが、例えば、上記マーカーがEGFRタンパク質の変異である場合、
（１）フォワードプライマーが配列番号2の連続する14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号2の配列の相補的な配列の連続する14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基を含むヌクレオチドからなるか、又は
（２）フォワードプライマーが配列番号2の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーが配列番号2の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14～30塩基、例えば16～28塩基、好ましくは18～26塩基の配列を含むヌクレオチドからなる、
フォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。
マーカーがCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質である場合、配列番号4、6、又は8で示される塩基配列に基づいて、同様にプライマーセットを調製することができる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、公知のハイブリダイゼーション法の条件を利用することができる。例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定すればよい。具体的には、ハイブリダイゼーション法温度や溶液に含まれる塩濃度、及びハイブリダイゼーション法の洗浄工程における温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定すればよい。より詳細なストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25～500mM、好ましくは25～300mMであり、温度が42～68℃、好ましくは42～65℃が挙げられる。より具体的には、5×SSC (83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃が挙げられる。
上記マーカーをコードするポリヌクレオチドを検出するためのプローブは、上記マーカー、特に上記マーカーのタンパク質又は遺伝子の変異部分を検出できるものであれば特に限定しない。
例えば、マーカーがEGFRタンパク質の変異である場合、
（１）配列番号2の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は
（２）配列番号2の連続する少なくとも14、例えば20、好ましくは30の塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
から構成されることが好ましい。
マーカーがCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質である場合、配列番号4、6又は8で示される塩基配列に基づいて、同様にプローブを調製することができる。この場合、特にCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合部分を検出できるプローブを作製することが好ましい。
プライマー及びプローブは、当業者に知られる公知の方法により調製することができ、限定されるものではないが、例えば化学合成法によって調製することができる。
上記マーカーに対するアプタマーは、公知の方法、例えばSELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法等により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有する核酸分子で構成されるプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後に増幅した後、次のラウンドの核酸プールにするという一連のサイクルを数～数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い核酸を選択する方法である（例えば、Tuerk C, Gold L (1990) Science 249(4968):505-510を参照されたい）。
上記マーカーと特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、及び合成抗体のいずれであってもよい。「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識して結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体は、例えば、免疫を行った動物から抗体を産生するB細胞を単離し、これをミエローマがん細胞と融合したハイブリドーマを用いて作製することができる。本明細書において「組換え抗体」は、キメラ抗体及びヒト化抗体等の異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体を意味する。また、本明細書において「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法によって合成した抗体を意味し、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。
本発明のキットは、上記プライマーセット、プローブ、アプタマー、又は抗体に加えて、例えば、バッファー、酵素、及び使用説明書等を含んでもよい。
＜がんの罹患又は分化抑制変異の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法＞
一態様において、本発明は、がんの罹患の有無又はがんの罹患可能性の判別を補助する方法に関する。本態様において罹患判別されるがんの種類は、限定はしないが、例えば、脳腫瘍、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、小腸がん、大腸がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮頸がん、卵巣がん、リンパ腫、若しくは黒色腫、好ましくは肺がんが挙げられる。
本方法は、被験者被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載のがん検出用マーカー又は分化抑制変異検出用マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。
また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載のがん検出用マーカーが検出された場合に、被験者ががんに罹患しているか又はがんの罹患可能性が高いと決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
本明細書において、被験者の生物種は、限定しないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジー等の霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
本明細書において、「サンプル」とは、本発明の方法に供される生体試料を意味する。本発明において使用可能なサンプルとしては、限定するものではないが、例えば生体から単離した細胞又は組織が挙げられる。組織の例として、がんの病変部位、例えば、脳、咽頭、甲状腺、肺、乳房、食道、胃、肝臓、膵臓、腎臓、小腸、大腸、膀胱、前立腺、子宮、卵巣、好ましくは肺等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。
一態様において、本発明は、分化抑制変異の有無の判別を補助する方法に関する。本方法は、被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の分化抑制変異検出用マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記分化抑制変異検出用マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載の分化抑制変異検出用マーカーが検出された場合に、被験者が分化抑制変異を有すると決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
＜薬剤感受性を評価する方法＞
一態様において、本発明は、抗がん剤等の薬剤感受性（又は耐性）の判別を補助する方法に関する。本方法は、被験者から得られたサンプルにおいて、本明細書に記載の薬剤感受性又は耐性マーカーを検出する工程（検出工程）を含む。検出工程における検出方法は限定されず、上記薬剤感受性又は耐性マーカーを検出するための手段、例えばプライマーセット、プローブ、アプタマー、若しくは抗体、又はこれらのいずれかを含むキットを用いて検出してもよいし、次世代シーケンサーによる配列解析により検出してもよい。
また、本方法は、検出工程に加えて、本明細書に記載の薬剤感受性マーカーが検出された場合に、被験者が薬剤感受性を有すると決定し、及び／又は本明細書に記載の薬剤耐性マーカーが検出された場合に、被験者が薬剤耐性を有すると決定する工程（決定工程）を、任意の工程として含む。
本方法により、被験者の薬剤感受性又は耐性を評価し、それに基づいて適切な薬剤を選択することができる。
＜細胞集団＞
一態様において、本発明は、細胞集団に関する。本発明の細胞集団は、本明細書に記載のがん検出用マーカー、分化抑制変異検出用マーカー、薬剤感受性又は耐性マーカーを構成するポリヌクレオチドを含む異なる細胞を少なくとも2つ、例えば3以上、4以上、5以上、7以上、10以上、20以上、50以上、また500以下、200以下、又は100以下含む。
特に、これらのポリヌクレオチドは、それぞれ固有のタグ配列に連結されていることが好ましい。この場合、このような細胞集団は、本発明の評価方法において用いることができる。本発明の細胞集団を本発明の評価方法において用いる場合、挿入工程、及び混合工程を省略し得る。
＜実施例１：MANO（Mixed All Nominated mutants in One）法の感度及び精度の評価＞
材料と方法
１．細胞株
HEK（Human Embryonic kidney）293細胞及びマウス3T3線維芽細胞は、American Type Culture Collectionから入手し、10%FBSを補充したダルベッコ改変イーグル培地F-12（DMEM-F12）（いずれもThermo Fisher Scientific, Waltham, MA）で維持した。Ba/F3細胞は、10%FBS及びマウスIL-3（20U/mL;Sigma, St. Louis, MO）を補充したRPMI 1640培地（Thermo Fisher Scientific）で培養した。
２．ランダムバーコード配列を有するレトロウイルスベクターの構築
pcx4-bleoベクター（https://www.addgene.org/vector-database/2309/）のBamHI制限酵素サイトに60bpの塩基（配列番号9）を挿入し、その後6bpのランダム配列を含むprimerを用いて部位特異的変異導入を行い、バーコード配列を付加したpcx5-bleoを作製した。野生型ヒトEGFRのcDNAを、野生型のEFGRを有する被験者の凍結検体から単離し、pcx5-bleoにライゲーションした。EGFR変異体をコードするcDNAを、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて作製し、pcx5-bleoにライゲーションした。また、EML4-ALK（Manabu Soda et al., nature, 2007, 448, pp. 561-566）、KIF5B-RET（Takashi Kohno1 et al., nature medicine, 2012, 18(3), pp. 375-377）、KRAS(G12V)、CD74-ROS1（Kengo Takeuchi et al., nature medicine, 2012, 18(3),pp.378-381）、EGFR(E746-A750del)、EGFR(L858R)、BRAF(V600E)、MET exon 14 skipping22及び23、ERBB2(V777L)のcDNAを、各変異陽性の肺がん患者凍結検体から単離してpcx5-bleoベクターにクローニングした。
３．レトロウイルスの調製及び細胞株への形質導入
上記の通り調製した組換えプラスミドをパッケージングプラスミド（Takara Bio, Shiga, Japan）と共にHEK293細胞に導入し、組換えレトロウイルス粒子を得た。フォーカス形成アッセイでは、4μg/mLのポリブレン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を用いて、3T3細胞にエコトロピックな組換えレトロウイルスを24時間感染させ、5%の仔ウシ血清を補充したDMEM-F12でさらに最大2週間培養した。細胞の形質転換は、位相差顕微鏡又はギムザ溶液による染色によって評価した。
４．MANO法による検出
細胞溶解物由来のゲノムDNAを、5’-TGGAAAGGACCTTACACAGTCCTG-3’（配列番号10）及び5’-GACTCGTTGAAGGGTAGACTAGTC-3’（配列番号11）のプライマーを用いるPCRによって、バーコード配列を含む領域を増幅した。PCRの条件は以下の通りである。
初期変性：95℃で3分間
変性：95℃で15秒間
アニーリング：60℃で30秒間
伸長：72℃で60秒間
サイクル数：30
最終伸長：72℃で10分間
増幅後のPCR産物をAMPure beads（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて精製した。NEB NextUltra DNA Library Prep Kit（NEB, Ipswich, MA）を用いて、製造業者の推奨に従ってシーケンシングライブラリーを作製した。ライブラリーの質をQubit 2.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）及びAgilent 2200 TapeStation systemにより評価した。ライブラリーを、Reagent Kit V2を用いるIllumina MiSeq（300サイクル）によって配列決定し、150 bpのペアエンドリードを作製した。これらのシークエンスリードは、バーコード配列を含む以下の配列：5’-CTAGACTGCCNNNNNNGGATCACTCT-3’（配列番号12）（ここで、Nは任意のヌクレオチドである）及びその相補的配列を含んでいた。これらのバーコード配列のリード数を数えることによって各変異体の量を推定した。DMSO処理した細胞混合物を、各細胞クローンのシグナルのスケーリングのために、参照対照として用いた。したがって、各処理細胞株由来のシグナルは、100×（リード数中央値）／（DMSO対照のリード数中央値）として算出される。リード数中央値は、独立した３回の実験におけるものである。
５．In vitro MANO法
ウイルス感染後2日後に遺伝子導入細胞の細胞数をカウントし、同数の細胞ずつ混合し、混合した細胞の一部はDNA抽出に用いた（day 0とする）。続いて、混合細胞を薬剤の非存在下（がん化能評価）、又は様々な濃度の薬剤の存在下（薬剤感受性評価）で培養を行い、観測したい時間ごとに細胞を回収しDNA抽出を行った。用いた薬剤及びメーカーを以下に示す：
ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、及びクリゾチニブ：LC laboratories、
アレクチニブ：Selleck Chemicals、
ピューロマイシン：Invitrogen、
セツキシマブ：Merck Serono。
６．In vivo MANO法
個別に形質導入を行った細胞クローンを同じ数混合し、この混合物の2.5×106細胞（すなわち、25の細胞クローンのそれぞれにつき1×105細胞）を、東京大学動物実験専門委員会によって認められた動物使用プロトコルに従って、6週齢のヌードマウスの皮下に注入した。細胞株の注入の5日後から、マウスを、EGFR TKI エルロチニブ（50 mg/kg体重）又はビヒクルコントロール（1%カルボキシメチルセルロースナトリウム）で、1日1回、16日間経管栄養で処置した。
腫瘍を切除し、各腫瘍を4つの部位に切断した。各細胞クローンの相対的存在量をMANO法により決定した：すなわち、各サンプルについて、注入に用いた細胞混合物由来のバーコード数を用いて、各細胞株ごとのバーコード数を相対的細胞数（AX/TX）に変換した。これらの相対的細胞数を、各細胞株の腫瘍に対する相対的寄与を算出するために用いた。
７．増殖能スコア、薬剤感受性スコアの算出
以下の計算式により目的遺伝子の増殖能スコア及び薬剤感受性スコアを算出した。
目的遺伝子Aの増殖能スコア = (AX×T0) / (A0×TX)
目的遺伝子Aの薬剤感受性スコア = (ADX×TX) / (AX×TDX)
［ただし、AX = Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、
T0 = Day 0で回収された細胞における全バーコードの総リード数、
A0 = Day 0で回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、TX = Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数、
ADX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、
TDX= 薬剤投与後Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数。］
目的遺伝子Aの増殖能スコアは、その値が高い程目的遺伝子Aの増殖能が高いことを示し、目的遺伝子Aの薬剤感受性スコアは、その濃度での目的遺伝子A導入細胞の生存率を示す。
８．Alamar Blue cell viability assay
（ウェルごとに100μLの培地を含む）96ウェルプレートで細胞をインキュベーションした後に、10μLのalamarBlue（Thermo Fisher Scientific）を添加し、各時間で蛍光（励起530 nm、放出590nm）を測定した。細胞を含まないウェルを陰性対照として用いた。全てのウェルについての蛍光ゲインの調整を、最大蛍光強度のウェルに対して行った。
（結果）
まず初めに、MANO法の感受性を判定するために、EML4-ALK、KIF5B-RET、KRAS(G12V)、CD74-ROS1、EGFR(E746-A750del)又はEGFR(L858R)のcDNAを、それぞれバーコード配列と共にBa/F3細胞に導入した。続いて、EGFR(L858R)のcDNAを導入した細胞のみ細胞数を変えて（100～20000細胞）、各20000個ずつの他の5種のcDNAを導入した細胞と混合した。その後、細胞混合物からゲノムDNAを単離し、PCR及び次世代シーケンスに供した。EGFR(L858R)以外の5種のcDNAを導入したBa/F3細胞に対応するバーコード配列のリード数は、混合物中で一定であったのに対し、細胞数を変えて混合したEGFR(L858R)を発現するBa/F3細胞に対応するバーコード配列のリード数は、混合した細胞数に比例して変化した（r=0.99、データ示さず）。この結果は、MANO法が非常に高感度であり、わずか0.1%程度の細胞数も定量的に検出可能であることを示している。
続いて、MANO法ががん化能を評価できるかを確かめた。最初に、標準的な3T3フォーカス形成アッセイを行い、14個のEGFR変異（EGFR(T790M)、EGFR(G719C)、EGFR(G719S)、EGFR(L861Q)、EGFR(S768I)、EGFR(E709K)、EGFR(E709A)、EGFR(A289V)、EGFR(G598V)、EGFR(E865K)、EGFR(E865R)、EGFR(P794H)、EGFR(T790M/C797S)、及びEGFR(E746-A750del)）及び野生型EGFRについて、がん化能を測定した。BRAF(V600E)、MET exon 14 skipping22及び23、ERBB2(V777L)等の他のがん化遺伝子についても同様に試験した。続いて、これらのcDNAについて、3T3細胞を用いてMANO法を実施した。3T3細胞を異なる培地条件で培養したところ、各遺伝子の割合について同様の結果が得られた（データ示さず）。また、フォーカス形成アッセイにおけるギムザ染色面積（%）と、MANO法による倍率変化（day 8/day 0）（すなわち、増殖能スコア）は、正の相関を示した（r=0.63、図2）。この結果は、MANO法がギムザ染色同様にがん化能を評価可能であることを示している。
ヌードマウスにおいても、3T3細胞を用いるMANO法によって腫瘍形成能アッセイをin vivoで行った。緑色蛍光タンパク質（GFP）又は野生型EGFR、ERBB2又はMETは移植11日後に枯渇したが、EGFR(L858R)又はEGFR(E746-A750del)を発現する細胞は、同じ時期に徐々に増殖していた（データ示さず）。このような結果は、in vitroアッセイの結果と一致する。これらの結果は、MANO法がin vivoでのがん化能を評価できる方法であることを示している。
続いて、活性型EGFR変異体（11種）又は他のがん化タンパク質（5種）を発現する16のBa/F3細胞のプールに対して、様々なチロシンキナーゼインヒビター（以下、TKIとする）を試験した。遺伝子導入細胞ごとの異なる倍化時間を考慮するため、TKI処理したBa/F3細胞のそれぞれをビヒクル処理対象と比較して、各細胞クローンの増殖阻害（薬剤感受性スコア）を計算した（図3）。細胞傷害性の化合物であるピューロマイシンは、細胞クローン間で均一な細胞死を誘導したが、EGFR TKI（ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ及びロシレチニブ）は、細胞プール中の5個のTKI感受性EGFR変異体（L858R、E746-A750 del、G719S、E861Q、及びS768I）に対して、用量依存的な細胞死をもたらした。EGFR(T790M)を発現するBa/F3細胞は、第一及び第二世代のEGFR TKI（ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブ）に対して耐性であったが、第三世代のEGFR TKI（オシメルチニブ及びロシレチニブ）には感受性であった。これに対し、EGFR(T790M/C797S)を発現する細胞は、第三世代のEGFR TKIに対しても耐性であった。同様に、ALK及びROS1に対するTKIであるクリゾチニブはEML4-ALK又はCD74-ROS1を発現する細胞の増殖を抑制し、ALK及びRETに対する他の阻害剤であるアレクチニブは、EML4-ALK又はKIF5B-RETの増殖を阻害した（図3）。EGFR変異体の感受性を独立に評価するために、生存細胞の数を、ミトコンドリアの酵素活性に基づいて細胞の生存性を定量する方法であるAlamar Blue assayによっても測定した。MANO法におけるリードカウントの相対的倍化数（細胞数を示す）は、Alamar Blue dataのデータと相関していた（r=0.89、データ示さず）。これらの結果は、従来の方法による報告と一致するものであり、MANO法ががん遺伝子を有する細胞の薬剤感受性を評価できる方法であることを示している。
さらに、25個の3T3クローンをプールし、マウスの皮下に異種移植し、14日間ビヒクル、エルロチニブ又はアファチニブで処理した。エルロチニブ処理は、6個中6個のTKI感受性のEGFR変異体（L858R、E746-A750del、L861Q、G719C、G719S及びS768I）の相対的存在比の顕著な低減をもたらしたが、2個中2個のTKI耐性EGFR変異体（T790M及びT790M/C797S）及び他のがん遺伝子を有する9個中9個のクローンは、同じ時期に増加した（データ示さず）。同様の結果が、アファチニブ処理でも得られた（データ示さず）。これらの結果は、MANO法が薬剤感受性をin vivoでも評価できることを示している。
＜実施例２：EGFRのVUS（Variants of Unknown Significance、意義不明の変異）のMANO法による評価＞
材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、評価対象としては、以下の通りEGFRのVUSを用いた。
BaF3細胞及び3T3細胞の両方において評価対象として用いたEGFRのVUSは以下：R108K、R252C、T263P、A289D、A289T、A289V、H304Y、S492R、P596L、G598V、L62R、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、G719A、G719C、G719S、S720F、G735S、P741L、K745-A750>T、K745-A750del、K745-E746insVPVAIK、K745-E749del、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-P753del、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-P753del、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、P772-H773insPR、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773R、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776H、G779S、V786M、T790M、C797S、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、V834L、V834M、H835L、R836C、L838P、A839T、V843I、P848L、V851I、T854A、G857E、G857R、L858R、A859T、K860I、L861Q、A864T、E865K、A871G、A871T、G873E、G874S、S1153Iの98個である。上記以外に、A1118TをBaF3細胞においてのみ評価し、E746-E749del及びR222Cを3T3細胞において評価した（評価を行ったEGFR変異体は、合計101個である）。また、コントロールとして、野生型EGFR及びGFPを含めた。
（結果）
COSMICのデータベースにおいて4～7386回報告されている101個のEGFR変異体をMANO法で評価した。その結果、3T3細胞及びBa/F3細胞におけるアッセイによって、合計80個のEGFR変異体（両方に共通して見出されたのが62個、3T3細胞のみに見出されたのが11個、Ba/F3のみに見出されたのが7個）ががん化能に寄与すると評価された。3T3細胞又はBa/F3細胞において野生型に比べて強力ながん化能が見出された変異は以下の通りである：L62R、R108K、R222C、R252C、A289D、A289T、A289V、H304Y、S492R、P596L、G598V、L703P、E709-T710>D、E709A、E709G、E709K、E709V、G719A、G719C、G719S、S720F、G735S、P741L、K745-E746insVPVAIK、E746-A750>IP、E746-P753>VS、E746-T751>V、L747-A750>P、L747-A750del、L747-P753>Q、L747-P753>S、L747-T751>P、L747-T751>S、L747-T751del、L747S、T751-I759>N、T751I、S752-I759del、P753S、D761-E762insEAFQ、A763-Y764insFQEA、V765M、A767V、S768I、V769-D770insASV、V769L、V769M、D770-N771insSVD、N771-P772insN、H773-V774insH、H773-V774insPH、H773L、H773Y、V774-C775insHV、V774M、R776C、R776H、G779S、V786M、P798H、V802I、R831H、R831L、L833F、L833V、V834L、V834M、H835L、V843I、P848L、V851I、L858R、A859T、K860I、L861Q、A864T、E865K、A871G、A871T、G873E、G874S、A1118T、及びS1153I。がん化能が見出されなかった22個のEGFR変異体について試験したところ、興味深いことに、A839T変異体が、全ての世代のEGFR TKIに対して顕著な耐性をもたらすことが示された（図4）。
＜実施例３：発がん変異を有する細胞の小分子化合物に対する感受性のMANO法による評価＞
続いて、各EGFR変異体のTKI（小分子化合物）感受性を、MANO法を用いて薬剤感受性スコアを算出した。図5に示す通り、L858R及びE746-A750del変異体はいずれのTKIにも感受性であることが示されたが、T790M、C797S、T790M/C797S、及びT854A置換及びエキソン20の挿入は幾つかのTKIに耐性を示した。これらの結果は、MANO法がこれまでの研究の感受性データと一致するものであることを示している。興味深いことに、L858R又はエキソン19の欠失と比較して、細胞外ドメインの変異（エキソン2～15）、E709変異（エキソン18）、エキソン19ミスセンス変異、V769L（エキソン20）、及びV851I（エキソン21）は、全てTKIに対し非感受性であった。エキソン20挿入の感受性は、オシメルチニブ及びロシレチニブにおいて低下したが、N771-P772insN変化は、他の変異体に比べて高い感受性をもたらした（図5）。
＜実施例４：複合変異のMANO法による評価＞
材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、評価対象としては、EGFRの複合変異を用いた。
（結果）
複合変異について、同様にMANO法により薬剤感受性スコアを算出したところ、図6に示す複合変異についてもがん化能を有することが示された（データ示さず）。また、この複合変異について薬剤感受性試験を行ったところ、変異ごとに薬剤への感受性が異なることが示された（図6）。また、複合変異につき、3T3フォーカス形成アッセイを行ったところ、特にL858R及びE709V（cis）、L858R及びS720F（cis）、並びにL858R及びE709G（cis）ではがん化能がほとんど又は全く認められなかったが、試験した他の複合変異についてはがん化能を有することが認められた（図7）。
＜実施例５：発がん変異を有する細胞の抗体薬に対する感受性のMANO法による評価＞
材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、EGFRの単一変異又は複合変異を評価対象とし、薬剤としては抗体薬（セツキシマブ）を用いた。
（結果）
抗体薬（セツキシマブ）を用いて同様の実験を行い薬剤感受性スコアを算出した結果、抗体薬に対する感受性は、小分子化合物に対する感受性とは大きく異なることが示された（図8）。また、抗体薬ではドメインごと、及び変異ごとに感受性が大きく異なることも明らかとなった（図8）。
＜実施例６：分化抑制発がん遺伝子のMANO-D（MANO-Differentiation）法による評価＞
材料と方法
材料と方法は、実施例１の「１．細胞株」～「５．In vitro MANO法」において記載した通りである。但し、細胞には以下の異なるタグを付した遺伝子（GFP、BRD3-NUT（French CA et al., Oncogene, 2008 3;27(15), pp.2237-42）、及びCOL1A2とDCAF6の融合遺伝子（配列番号8））、及び分化誘導性の転写因子であるMYOD1又はRFP（Red fluorescent protein、コントロール）を、Tet-On Advanced 発現誘導システム(クロンテック社)を用いて、MYOD1又はRFPをクローニングしたpTRE-Tight Vector及びpTet-On Advanced Vectorを目的細胞に製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクションし導入した。この細胞を混合した後、細胞分化誘導条件下（2%ウマ血清及び上記導入遺伝子の発現を促す10 ng/mL DOX）又は通常条件（10% FBS）で14日間培養を行った後、細胞を回収しDNA抽出を行った。
分化抑制能スコアの計算式は、以下の通りである。
目的遺伝子Aの分化抑制能スコア = (AIX×TX) / (AX×TIX)
［AIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード、
TX= Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数、
AX= Day Xで回収された細胞における目的遺伝子Aに付与されたバーコードのリード数、TIX = 分化誘導後Day Xで回収された細胞における全バーコードの総リード数。］
（目的遺伝子Aの分化抑制能スコアは、その値が高い程目的遺伝子Aの分化抑制能が高いことを示す。）
（結果）
本試験の結果（分化抑制能スコア）を、以下の表に示す。
Figure 0007224645000001
分化抑制がん遺伝子であるBRD3-NUTについて、分化誘導条件（2% HS +dox及びMYOD1発現）で、GFPの値（0.6807）に比べて高い値（2.5046）が検出されたことから、MANO法は分化抑制がん遺伝子についても評価可能であることが示された。また、本方法によりCOL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質が、分化誘導条件で高い値（3.4662）を示したことから、COL1A2タンパク質とDCAF6タンパク質の融合タンパク質が新規分化抑制遺伝子であることが示唆された。
＜実施例７：BRCA2遺伝子のMANO-B（MANO-BRCA）法による評価＞
材料と方法
BRCA2野生型、K2729N変異(良性)、D2723H変異(病原性)、約500アミノ酸おきにstop codonを導入したtruncate variants 7種（K485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、W2970*、C3304*）、piggyBac 空ベクター（System Biosciences, LLC）の計11種のプラスミドに特有のバーコード配列を3種類ずつ付加し(n=3で実験を行うため)、計33種類のプラスミドを準備した。DLD1 BRCA2(-/-)株に、これらのプラスミドをtransposase発現プラスミドpCMV-hyPBase(Sanger Institute)と共に製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクションし、BRCA遺伝子をゲノムに安定導入した細胞を準備した。
barcode配列で標識された変異遺伝子を導入した細胞株を同細胞数ずつ混合し、この時点で一旦ゲノムDNAを抽出した(Day 0)。様々な濃度でPARP阻害薬（olaparib）を投与して培養し、Day 12において回収した細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として用いてbarcode配列をPCR増幅し、次世代シーケンサーでdeep-sequencingした。薬剤非投与時と薬剤投与時のbarcode read数の変化比率から各変異の薬剤感受性と細胞増殖能への影響を評価した。
Day 12で回収した各検体の解析結果(n=3の平均値)を表２にまとめた。結果は、薬剤非投与時のread数値を1として正規化した。
Figure 0007224645000002
機能を有するBRCA2が細胞に導入された場合は相同組み換え修復能が回復するため、PARP阻害剤の薬剤感受性が低下し阻害剤耐性となる。一方で機能欠失型のBRCA2が導入された細胞はPARP阻害剤に感受性であるため、PARP阻害剤を加えると相対細胞数が低下する。このような基準に基づいて、変異BRCA2の機能について検討した。K2729N変異はPARP阻害剤に野生型と同程度の耐性を示したことから、機能が維持された良性の変異であると評価され、過去の報告と一致した。一方、D2723H変異については、耐性を示さなかったことから、機能が欠失した病原性の変異であると評価され、過去の報告と一致した。
また、本実施例において、新たにK485*、L997*、Q1502*、K1984*、C2535*、W2970*が、いずれも機能欠失型の発がん関連BRCA2変異であると考えられた。
＜実施例８：BRCA2遺伝子のMANO-B（MANO-BRCA）法による評価＞
Clinvar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）において登録された変異（良性変異18種、VUS又はconfricting interpretationsの変異52種、悪性変異8種）について、実施例７と同様の方法（ただしolaparibは1μM）で、MANO-B法による評価を行った。その結果、Clinvarに登録された良性変異及び悪性変異では概ねMANO-B法においても同様に良性又は悪性であると評価された（データ示さず）。VUS又はconfricting interpretationsの変異をMANO-B法により評価した結果を図9に示す。
MANO-B法とClinVarの評価が一致したもののうち、良性変異で最も低い数値が0.73860142（N2436I）であり、悪性変異で最も高い数値が0.038385294（G2724W）であったことから、閾値を0.1と0.5として良性、悪性、及び判断不能（悪性の可能性がある変異）の3つに分類した。その結果、VUS又はconfricting interpretationsの変異を、悪性9変異体（R2659G、N3124I、L2604P、W31C、E2663K、W2626R、D3073G、G2609D、及びP2329L）、判断不能5変異体（D2913H、P2639L、S3291C、D23V、及びI2664M）、及び良性38変異体（R2896C、A2643G、S142N、N854S、Y42C、G602V、T3387A、T2412A、E3096K、E2020K、S3319F、V1532F、E747G、S2697N、K2411T、P3054S、Q147R、S445Y、S755C、Y600C、K2075N、V159E、P41L、H595Y、F266L、R3385H、T2337A、I2627V、I1167V、N55S、V208G、P3292L、S1074C、T598A、T207I、R324T、A2911V、E1695V）に分類することができた。
本発明により、異なる複数の目的遺伝子の機能、例えばがん化能の評価方法、及び各目的遺伝子を有する被験者の薬剤に対する感受性を迅速かつ正確に評価することができる。本発明は、例えばVUS等の多数の変異につき、がん化能や薬剤感受性を評価することができるため、その産業上の利用価値は非常に高い。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、
    異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、
    混合した宿主細胞を被験物質の存在下かつin vitroで培養する工程、
    培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、
    抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、
    前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程、
    を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法。
  2. タグ配列及びそれに連結された目的遺伝子又はその断片を含むポリヌクレオチドを、宿主細胞のゲノムDNAに挿入する工程、
    異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞を混合する工程、
    混合した宿主細胞を被験物質の存在下かつ非ヒト動物を用いてin vivoで培養する工程、
    培養後の宿主細胞からゲノムDNAを抽出する工程、
    抽出したゲノムDNA中の前記ポリヌクレオチドのそれぞれをタグ配列に基づいて定量する工程、
    前記ポリヌクレオチドの定量値に基づいて、各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を決定する工程、
    を含む、異なる複数の目的遺伝子の評価方法。
  3. 前記目的遺伝子が基準遺伝子を含み、その基準遺伝子又は基準遺伝子以外の目的遺伝子を含む各ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養後の相対的な細胞数を比較する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記目的遺伝子ががん遺伝子であり、前記被験物質が抗がん剤であり、前記培養後の相対的な細胞数に基づいて各がん遺伝子の抗がん剤に対する感受性を評価する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 抗がん剤が、低分子化合物及び／又は抗体薬剤である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記感受性を評価する工程を複数の抗がん剤について一度に、又は独立して複数回行い、得られた結果に基づいて各がん遺伝子に対して有効な抗がん剤を決定する工程を含む、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記目的遺伝子ががん抑制遺伝子であり、宿主細胞が前記がん抑制遺伝子を欠失させた細胞であり、培養工程を前記がん抑制遺伝子によって修復され得る障害を宿主細胞にもたらす処置下で行う、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 前記処置がPARP阻害剤を用いる、請求項７に記載の方法。
  9. 異なる前記ポリヌクレオチドが挿入された複数の宿主細胞が、同一の細胞株に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記目的遺伝子が、１つの遺伝子の複数の変異体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記目的遺伝子が、野生型遺伝子に対して複数の変異を含む複合変異型遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 定量工程が、次世代シーケンスによるリード数に基づいて行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
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