JP7242539B2 - Fiber manufacturing method and fabric manufacturing method - Google Patents
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Description
本発明は、繊維の製造方法及び布帛の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for manufacturing fibers and a method for manufacturing fabrics.
タンパク質繊維は、水分、熱との接触（例えば、水又は湯への浸漬、及び高湿度環境への暴露等）などによって収縮する特性を有するものがある。この特性は、製造工程及び製品化において種々の問題を発生させる要因となる。 Some protein fibers have the property of shrinking due to contact with moisture, heat (eg, immersion in water or hot water, exposure to high humidity environments, etc.). This characteristic causes various problems in the manufacturing process and commercialization.
水分との接触による繊維の収縮を抑制する技術として、例えば、特許文献１には、精錬を完了した強撚糸使用の絹織物を、緊張した状態で水、その他の溶媒、又はその混合系に浸漬して所定時間加温することを特徴とする絹織物の防縮加工方法が開示されている。また特許文献２には、製織して生地状にしたシルク繊維にウォッシャブル性と防汚性とを付与するシルク繊維の加工方法であって、前記シルク繊維に、水溶性塩化シアヌル誘導体若しくは水溶性ビニルスルホン誘導体を架橋剤として用いる劣化防止処理と、蒸絨法、真空蒸絨法、若しくはサンフォライズ法のいずれかを用いる防縮処理と、フッ素系撥水加工剤を用いる撥水加工処理とを施すことを特徴とするシルク繊維の加工方法が開示されている。
As a technique for suppressing fiber shrinkage due to contact with moisture, for example, Patent Document 1 discloses that silk fabrics using hard-twisted yarns that have undergone refining are immersed in water, other solvents, or a mixed system thereof while under tension. A method for shrink-proofing a silk fabric is disclosed, which is characterized by heating for a predetermined period of time. Further,
ところで、タンパク質繊維は、環境保全意識の高まりから、繊維強化プラスチック（ＦＲＰ）等の複合材料に使用されるガラス繊維、及び炭素繊維等の繊維の代替繊維として期待されている。複合材料として利用するためには、複合材料を製造する工程において、高温環境（例えば、１３０℃以上）にさらされても、所定の寸法形状を維持することが求められる。 By the way, protein fibers are expected as substitute fibers for fibers such as glass fibers and carbon fibers used in composite materials such as fiber reinforced plastics (FRP) due to the growing awareness of environmental conservation. In order to use it as a composite material, it is required to maintain predetermined dimensions and shape even when exposed to a high temperature environment (for example, 130° C. or higher) in the process of manufacturing the composite material.
しかしながら、本発明者らの検討によれば、特許文献１、２のような加工方法を施した絹織物等は水分との接触による収縮抑制には一定の効果を発揮するものの、熱に対する収縮を充分に抑制するものとはなっていないことが判明した。
However, according to the studies of the present inventors, silk fabrics and the like subjected to processing methods such as those in
そこで、本発明は、熱による収縮が充分に抑制された、タンパク質を含む繊維及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、熱による収縮が充分に抑制された、タンパク質を含む繊維を有する布帛及びその製造方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a protein-containing fiber in which shrinkage due to heat is sufficiently suppressed, and a method for producing the same. Another object of the present invention is to provide a fabric having protein-containing fibers in which shrinkage due to heat is sufficiently suppressed, and a method for producing the same.
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
タンパク質繊維を含む原料繊維を用意し、上記原料繊維の端部を固定する固定工程と、上記端部が固定された上記原料繊維を気体中で加熱する加熱工程と、を備える、繊維の製造方法。
［２］
上記加熱工程が前記原料繊維を１００℃以上に加熱する工程である、［１］に記載の繊維の製造方法。
［３］
上記タンパク質繊維が構造タンパク質繊維を含む、［１］又は［２］に記載の繊維の製造方法。
［４］
上記構造タンパク質繊維がフィブロイン様タンパク質繊維を含む、［３］に記載の繊維の製造方法。
［５］
上記フィブロイン様タンパク質繊維がクモ糸フィブロイン様タンパク質繊維を含む、［４］に記載の繊維の製造方法。
［６］
タンパク質繊維を含む原料布帛を用意し、上記原料布帛の外周部を固定する固定工程と、上記外周部が固定された上記原料布帛を気体中で加熱する加熱工程と、を備える、布帛の製造方法。
［７］
上記加熱工程が上記原料布帛を１００℃以上に加熱する工程である、［６］に記載の布帛の製造方法。
［８］
上記タンパク質繊維が構造タンパク質繊維を含む、［６］又は［７］に記載の布帛の製造方法。
［９］
上記構造タンパク質繊維がフィブロイン様タンパク質繊維を含む、［８］に記載の布帛の製造方法。
［１０］
上記フィブロイン様タンパク質繊維がクモ糸フィブロイン様タンパク質繊維を含む、［９］に記載の布帛の製造方法。The present invention relates to, for example, the following inventions.
[1]
A method for producing fibers, comprising: a fixing step of preparing raw fibers containing protein fibers; fixing the ends of the raw fibers; and a heating step of heating the raw fibers with the fixed ends in gas. .
[2]
The method for producing a fiber according to [1], wherein the heating step is a step of heating the raw material fiber to 100° C. or higher.
[3]
The method for producing fibers according to [1] or [2], wherein the protein fibers include structural protein fibers.
[4]
The method for producing a fiber according to [3], wherein the structural protein fiber comprises a fibroin-like protein fiber.
[5]
The method for producing a fiber according to [4], wherein the fibroin-like protein fiber contains a spider fibroin-like protein fiber.
[6]
A fabric manufacturing method comprising: a fixing step of preparing a raw material fabric containing protein fibers; fixing the outer peripheral portion of the raw material cloth; and a heating step of heating the raw material fabric with the fixed outer peripheral portion in gas. .
[7]
The fabric manufacturing method according to [6], wherein the heating step is a step of heating the raw fabric to 100°C or higher.
[8]
The method for producing a fabric according to [6] or [7], wherein the protein fibers comprise structural protein fibers.
[9]
The method for producing a fabric according to [8], wherein the structural protein fibers include fibroin-like protein fibers.
[10]
The method for producing the fabric according to [9], wherein the fibroin-like protein fibers include spider fibroin-like protein fibers.
本発明によれば、熱による収縮が充分に抑制された、タンパク質を含む繊維及びその製造方法を提供することができる。本発明によれば、熱による収縮が充分に抑制された、タンパク質を含む繊維を有する布帛及びその製造方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a protein-containing fiber in which shrinkage due to heat is sufficiently suppressed, and a method for producing the same. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the fabric which has the fiber containing protein which shrinkage|contraction by heat was suppressed sufficiently, and its manufacturing method can be provided.
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。 Preferred embodiments of the present invention are described below. However, the present invention is by no means limited to the following embodiments.
本実施形態に係る繊維の製造方法は、タンパク質繊維を含む原料繊維を用意し、原料繊維の端部を固定する固定工程と、端部が固定された原料繊維を気体中で加熱する加熱工程と、を備える。 The method for producing a fiber according to the present embodiment includes a fixing step of preparing raw fibers containing protein fibers, fixing the ends of the raw fibers, and a heating step of heating the raw fibers with the fixed ends in gas. , provided.
タンパク質は、好ましくは構造タンパク質である。本明細書において、構造タンパク質とは、生体構造を形成するタンパク質又はそれに由来するタンパク質を示す。すなわち、構造タンパク質は、天然由来の構造タンパク質であってよく、天然由来の構造タンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列の一部（例えば、当該アミノ酸配列の１０％以下）を改変した改変タンパク質であってよい。 The protein is preferably a structural protein. As used herein, a structural protein indicates a protein that forms a biological structure or a protein derived therefrom. That is, the structural protein may be a naturally occurring structural protein, and is a modified protein in which a part of the amino acid sequence (for example, 10% or less of the amino acid sequence) is altered based on the amino acid sequence of the naturally occurring structural protein. can be
構造タンパク質は、具体的には、フィブロイン（例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等）、コラ－ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン、並びにこれらに由来するタンパク質等を挙げることができる。 Specific examples of structural proteins include fibroin (eg, spider silk, silkworm silk, etc.), collagen, resilin, elastin, keratin, and proteins derived from these.
フィブロイン様タンパク質（フィブロイン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ１］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフの、Ａはアラニン残基を示し、ｎは好ましくは２～２７の整数であり、４～２０の整数、８～２０の整数、１０～２０の整数、４～１６の整数、８～１６の整数、又は１０～１６の整数であってよい。また式１において、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。ＲＥＰ１は１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰ１は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。フィブロイン様タンパク質としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。Fibroin-like proteins (fibroin or proteins derived therefrom) include, for example, proteins comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP1] m . Here, in Formula 1, (A) n motif, A represents an alanine residue, n is preferably an integer of 2 to 27, an integer of 4 to 20, an integer of 8 to 20, an integer of 10 to 20 It may be an integer, an integer from 4-16, an integer from 8-16, or an integer from 10-16. Further, in Formula 1, the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the (A) n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 100% (meaning that it is composed only of alanine residues). REP1 shows an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues. m represents an integer of 10-300. A plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Multiple REP1s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Fibroin-like proteins include, for example, proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1.
コラーゲン様タンパク質（コラーゲン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式２中、ｐは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。コラーゲン様タンパク質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Collagen-like proteins (collagen or proteins derived therefrom) include, for example, proteins containing a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] p . Here, in Formula 2, p represents an integer of 5-300. REP2 shows an amino acid sequence composed of Gly-XY, where X and Y represent any amino acid residue other than Gly. Multiple REP2s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Examples of collagen-like proteins include proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. Here, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the repeat portion and motif of the partial sequence of
レシリン様タンパク質（レシリン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式３中、ｑは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ－Ｊ－Ｊ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、好ましくはＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、好ましくはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基である。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。レシリン様タンパク質としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈがＳｅｒに置換され、かつ９５残基目のＡｓｎがＡｓｐに置換された配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列）が付加されたものである。Resilin-like proteins (resilin or proteins derived therefrom) include, for example, proteins comprising a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] q . Here, in Formula 3, q represents an integer of 4-300. REP3 shows an amino acid sequence consisting of Ser-JJ-Tyr-Gly-U-Pro. J represents any amino acid residue, preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Ser and Thr. U represents any amino acid residue, preferably an amino acid residue selected from the group consisting of Pro, Ala, Thr and Ser. Multiple REP3s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. Examples of resilin-like proteins include proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3. Here, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of resilin (NCBI GenBank accession number NP 611157, Gl: 24654243), in which Th at the 87th residue is replaced with Ser, and 95 residues The amino acid sequence (His tag sequence) shown in SEQ ID NO: 7 is added to the N-terminal of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the sequence in which Asn is substituted with Asp.
エラスチン様タンパク質（エラスチン又はそれに由来するタンパク質）としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。エラスチン様タンパク質としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。 Elastin-like proteins (elastin or proteins derived therefrom) include, for example, proteins having amino acid sequences of NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), NP786966 (bovine), and the like. Examples of elastin-like proteins include proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4. Here, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 at the N-terminus of the amino acid sequence from the 121st residue to the 390th residue of the amino acid sequence of NCBI GenBank accession number AAC98395. (tag sequence and hinge sequence) are added.
ケラチン様タンパク質（ケラチン又はそれに由来するタンパク質）として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等が挙げられる。ケラチン様タンパク質としては、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。 Examples of keratin-like proteins (keratin or proteins derived therefrom) include type I keratin of Capra hircus. Examples of keratin-like proteins include proteins containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence of NCBI GenBank accession number ACY30466).
構造タンパク質は、好ましくはフィブロイン様タンパク質であり、より好ましくはクモ糸フィブロイン様タンパク質である。 The structural protein is preferably a fibroin-like protein, more preferably a spider silk fibroin-like protein.
本実施形態にかかるタンパク質は、例えば、目的とするタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることによって生産したものを用いることができる。 A protein according to this embodiment can be obtained, for example, by a host transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein of interest and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Those produced by expressing the nucleic acid can be used.
目的とするタンパク質をコードする核酸の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどから入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって核酸を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする核酸を合成してもよい。 There is no particular limitation on the method for producing the nucleic acid encoding the protein of interest. For example, the nucleic acid can be produced using a gene encoding a naturally occurring structural protein, amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned, or chemically synthesized. The method for chemically synthesizing nucleic acids is not particularly limited, and for example, AKTA oligopilot plus 10/100 (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) is used based on the amino acid sequence information of structural proteins obtained from the NCBI web database. A nucleic acid can be chemically synthesized by a method of linking oligonucleotides automatically synthesized by PCR or the like. At this time, in order to facilitate purification and confirmation of the protein, a nucleic acid encoding a protein consisting of an amino acid sequence obtained by adding an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag to the N-terminus of the above amino acid sequence may be synthesized. good.
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、及び転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因によって、転写を制御できるプロモーターである。 A regulatory sequence is a sequence that controls expression of a recombinant protein in a host (eg, promoter, enhancer, ribosome binding sequence, transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected according to the type of host. As the promoter, an inducible promoter that functions in the host cell and can induce the expression of the target protein may be used. An inducible promoter is a promoter whose transcription can be controlled by physical factors such as the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、及び人工染色体ベクター等であってよく、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。 The type of expression vector may be a plasmid vector, a virus vector, a cosmid vector, a fosmid vector, an artificial chromosome vector, or the like, and can be appropriately selected according to the type of host. As the expression vector, those capable of autonomous replication in host cells or capable of integration into the chromosome of the host and containing a promoter at a position at which a nucleic acid encoding the desired protein can be transcribed are preferably used. .
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。 As hosts, both prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be suitably used.
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。 Preferred examples of prokaryotes include bacteria belonging to the genera Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, and the like.
原核生物を宿主とする場合、目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、及びｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。 When a prokaryote is used as a host, examples of vectors for introducing a nucleic acid encoding a protein of interest include pBTrp2 (manufactured by Boehringer Mannheim), pGEX (manufactured by Pharmacia), pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, Examples include pUB110 and pNCO2 (JP-A-2002-238569).
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、及びシゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。 Eukaryotic hosts include, for example, yeast and filamentous fungi (such as molds). Examples of yeast include yeast belonging to the genera Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, and the like. Examples of filamentous fungi include filamentous fungi belonging to the genera Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, and the like.
真核生物を宿主とする場合、目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、及びＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。 When a eukaryote is used as a host, examples of a vector into which a nucleic acid encoding a protein of interest is introduced include YEp13 (ATCC37115) and YEp24 (ATCC37051).
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０ （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びコンピテント法等を挙げることができる。 Any method for introducing DNA into the host cell can be used as the method for introducing the expression vector into the host cell. Examples of the method for introducing the expression vector into the host cell include a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method, spheroplast method, protoplast method, lithium acetate method, and competent method.
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、及び融合タンパク質発現等を行うことができる。 As a method for expressing nucleic acids by a host transformed with an expression vector, in addition to direct expression, secretory production and fusion protein expression can be performed according to the methods described in Molecular Cloning 2nd Edition. can.
目的とするタンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することによって製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。 A target protein can be produced, for example, by culturing a host transformed with an expression vector in a culture medium, producing and accumulating the protein in the culture medium, and collecting the protein from the culture medium. The method of culturing the host in the culture medium can be carried out according to a method commonly used for culturing the host.
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、及び合成培地のいずれを用いてもよい。 When the host is a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, the culture medium for the host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the host so that the host can be efficiently cultured. Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can be used for
炭素源としては、上記形質転換された宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類などを用いることができる。 Any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the transformed host. Examples include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch and starch hydrolysates, acetic acid and propionic acid. and alcohols such as ethanol and propanol.
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物などを用いることができる。 Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium acetate and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolysates, soybean meal and soybean meal hydrolysates, various fermented cells and their digests, and the like can be used.
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムなどを用いることができる。 Examples of inorganic salts that can be used include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。 Prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be cultured under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stir culture. The culture temperature is, for example, 15-40°C. Culture time is usually 16 hours to 7 days. The pH of the culture medium during cultivation is preferably maintained between 3.0 and 9.0. The pH of the culture medium can be adjusted using inorganic acids, organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, and the like.
培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。 Antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during culture. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside or the like is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a lac promoter, and indole acrylic when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a trp promoter. Acids and the like may be added to the medium.
宿主が生成蓄積した目的とするタンパク質の単離、及び精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離によって回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等によって宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することによって得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法によって精製標品を得ることができる。また、当該タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことによって、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体は、タンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によってタンパク質の精製標品を得ることができる。 The target protein produced and accumulated by the host can be isolated and purified by commonly used methods. For example, when the protein is expressed in a dissolved state in cells, the host cells are recovered by centrifugation after the completion of culture, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to ultrasonication, French press, Mantongaurin. The host cells are disrupted with a homogenizer, a dyno mill, or the like to obtain a cell-free extract. A purified sample can be obtained from the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract by a method commonly used for protein isolation and purification. In addition, when the protein forms an insoluble form in cells and is expressed, the host cells are similarly collected, disrupted, and centrifuged to collect an insoluble form of the protein as a precipitate fraction. The collected insoluble protein can be solubilized with a protein denaturant. After this operation, a purified sample of protein can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法によって処理することで培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることによって、精製標品を得ることができる。 When the protein is extracellularly secreted, the protein can be recovered from the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation, and a purified preparation can be obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
タンパク質の単離精製に通常用いられている方法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、及びフェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、並びに、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を挙げることができる。これらの方法は、単独又は組み合わせて使用してもよい。 Methods commonly used for isolating and purifying proteins include solvent extraction, salting out with ammonium sulfate, etc., desalting, precipitation with organic solvents, diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Anion exchange chromatography using resins such as Kasei Co., Ltd.), cation exchange chromatography using resins such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia), and resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose. methods such as hydrophobic chromatography, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing. These methods may be used alone or in combination.
本実施形態に係る原料繊維はタンパク質繊維を含む。原料繊維は、好ましくはタンパク質繊維からなる。 The raw material fibers according to this embodiment contain protein fibers. The raw material fibers preferably consist of protein fibers.
本実施形態に係るタンパク質繊維は、上述したタンパク質を紡糸したものであり、好ましくは構造タンパク質を紡糸した繊維（構造タンパク質繊維）であり、より好ましくはフィブロイン様タンパク質を紡糸した繊維（フィブロイン様タンパク質繊維）、特に好ましくはクモ糸フィブロイン様タンパク質を紡糸した繊維（クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維）である。 The protein fiber according to the present embodiment is a fiber obtained by spinning the above-described protein, preferably a fiber obtained by spinning a structural protein (structural protein fiber), more preferably a fiber obtained by spinning a fibroin-like protein (fibroin-like protein fiber ), particularly preferably a fiber obtained by spinning a spider silk fibroin-like protein (a spider silk fibroin-like protein fiber).
タンパク質繊維は、タンパク質を公知の紡糸方法によって紡糸することによって製造することができる。すなわち、タンパク質繊維を製造する際には、まず、上述した方法に準じて製造したタンパク質を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はヘキサフルオロイソプロノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し、溶解させてドープ液を作製する。次いで、このドープ液（紡糸原液）を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸又は乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法によって紡糸して、目的とするタンパク質繊維を得ることができる。 Protein fibers can be produced by spinning proteins by known spinning methods. That is, when producing a protein fiber, first, the protein produced according to the method described above is treated with dimethylsulfoxide (DMSO), N,N-dimethylformamide (DMF), hexafluoroisopronol (HFIP), or the like. It is added to a solvent together with an inorganic salt as a dissolution accelerator and dissolved to prepare a dope solution. Then, using this dope solution (spinning stock solution), the target protein fiber can be obtained by spinning by a known spinning method such as wet spinning, dry spinning, or dry-wet spinning.
図１は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０と、洗浄浴槽２１と、乾燥装置４とを、上流側から順に有している。
FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a spinning apparatus for producing protein fibers. A
押出し装置１は貯槽７を有しており、ここにドープ液（紡糸原液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固液１１（例えば、メタノール）が貯留される。ドープ液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギヤポンプ８によって、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て凝固液１１内に供給される。凝固液１１内でドープ液６から溶媒が除去されてタンパク質が凝固する。凝固したタンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２によって洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４によって、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維３６は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維３６が、紡糸装置１０によって、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ～１８ｇは糸ガイドである。
The extrusion device 1 has a
凝固液１１としては、ノズル９から押し出されたドープ液６から、溶媒を抽出（脱溶媒）できる有機溶剤であればよい。このような有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０～３０℃であることが好ましい。凝固したタンパク質が凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１～３分であってよく、０．０５～０．１５分であることが好ましい。また、本実施形態においては、凝固したタンパク質を含む繊維を、凝固液１１中で延伸（前延伸）してもよい。
The coagulating
洗浄液１２としては、主として水を用いることができる。洗浄液１２は、凝固液１１に使用できるよう剤として列挙したものを含んでいてもよい。なお、タンパク質繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施される延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う、いわゆる湿熱延伸であってもよい。この湿熱延伸の温度としては、例えば、５０～９０℃であってよく、７５～８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１倍～１０倍延伸することができ、２～８倍延伸することが好ましい。
As the cleaning
本実施形態における乾燥装置４内を通過する際に、タンパク質繊維を更に延伸（いわゆる乾熱延伸）してもよい。
The protein fibers may be further drawn (so-called hot drawing) when passing through the
最終的なタンパク質繊維の延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上であり、その上限値が、好ましくは、４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、又は１０倍以下である。
The lower limit of the draw ratio of the final protein fiber is preferably more than 1 times, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more with respect to the undrawn yarn (or pre-drawn yarn). , 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, or 9 times or more, and the upper limit is preferably 40 times or less, 30 times or less, 20 times or less, 15 times or less, 14 times or less, 13
タンパク質繊維は、短繊維であっても、長繊維であってもよい。また、タンパク質繊維は、単独で、又は他の繊維と組み合わされて使用されてもよい。すなわち、タンパク質繊維を含む原料繊維を用意する際には、タンパク質繊維のみからなる単独糸、タンパク質繊維と他の繊維とを組み合わせてなる複合糸が、それぞれ単独で、又はそれらが組み合わされて用いられてもよい。上記単独糸及び上記複合糸は、短繊維を撚り合わせたスパン糸であってもよく、長繊維を撚り合わせたフィラメント糸であってもよい。上記単独糸及び上記複合糸としては、フィラメント糸が好適に用いられる。単独糸は、撚糸であることが好ましく、その場合、撚糸は、Ｚ撚りの撚糸であってもよく、Ｓ撚りの撚糸であってもよい。複合糸には、例えば、混紡糸、混繊糸、及びカバーリング糸等が含まれる。 Protein fibers may be short fibers or long fibers. Protein fibers may also be used alone or in combination with other fibers. That is, when preparing raw fibers containing protein fibers, single yarns made only of protein fibers and composite yarns made by combining protein fibers and other fibers are used alone or in combination. may The single yarn and the composite yarn may be a spun yarn obtained by twisting short fibers, or may be a filament yarn obtained by twisting long fibers. A filament yarn is preferably used as the single yarn and the composite yarn. The single yarn is preferably a twisted yarn, in which case the twisted yarn may be a Z-twisted yarn or an S-twisted yarn. Composite yarns include, for example, blended yarns, mixed yarns, covered yarns, and the like.
他の繊維とは、タンパク質を含まない繊維等をいう。他の繊維としては、例えば、ナイロン、及びポリエステル等の合成繊維、キュプラ、及びレーヨン等の再生繊維、並びに、綿、及び麻等の天然繊維が挙げられる。他の繊維と組み合わせて使用する場合には、タンパク質繊維を含む原料繊維全量を基準として、タンパク質繊維の含有量が、好ましくは５質量％以上であり、より好ましくは２０質量％以上であり、更に好ましくは５０質量％以上である。 Other fibers refer to fibers or the like that do not contain protein. Other fibers include, for example, synthetic fibers such as nylon and polyester, regenerated fibers such as cupra and rayon, and natural fibers such as cotton and hemp. When used in combination with other fibers, the content of protein fibers is preferably 5% by mass or more, more preferably 20% by mass or more, based on the total amount of raw material fibers including protein fibers. Preferably, it is 50% by mass or more.
本実施形態に係る繊維の製造方法においては、上述のとおり用意したタンパク質繊維を含む原料繊維の端部を固定する（固定工程）。 In the fiber manufacturing method according to the present embodiment, the ends of the raw material fibers containing protein fibers prepared as described above are fixed (fixing step).
原料繊維の固定は、後述する加熱工程において、原料繊維の収縮を低減（例えば、原料繊維の初期長基準で収縮率５％未満）できるものであればよい。原料繊維の固定は、例えば、所定長さの原料繊維を外力のかからない状態（自然状態）で緩みなく伸ばし、この状態で繊維の両端部を固定することで行ってよい。この原料繊維の端部の固定は、原料繊維の少なくとも端部が固定されていればよく、原料繊維全体を二枚の金属板に挟み込むことによって全体を固定するような態様をとってもよい。原料繊維の固定手段は、特に制限されるものではなく、任意の固定手段を用いてよい。固定手段としては、着脱可能なものであることが好ましく、例えば、粘着テープ、接着剤、及びクランプ等が挙げられる。 The fixation of the raw material fibers may be any method as long as the shrinkage of the raw material fibers can be reduced (for example, the shrinkage rate is less than 5% based on the initial length of the raw material fibers) in the heating step described later. The fixing of the raw material fibers may be carried out, for example, by stretching the raw material fibers of a predetermined length without slack in a state (natural state) in which no external force is applied, and fixing both ends of the fibers in this state. As for the fixing of the ends of the raw material fibers, it is sufficient that at least the ends of the raw material fibers are fixed, and the entire raw material fibers may be fixed by sandwiching them between two metal plates. There are no particular restrictions on the fixing means for the raw material fibers, and any fixing means may be used. The fixing means is preferably detachable, and examples thereof include adhesive tapes, adhesives, clamps, and the like.
次に、端部を固定した状態の原料繊維を気体中で加熱する（加熱工程）。 Next, the raw material fibers with their ends fixed are heated in gas (heating step).
加熱工程は気体中で行うが、その雰囲気は限定されるものではなく、例えば、大気、不活性ガス雰囲気などであってよい。不活性ガスとしては、窒素、及びアルゴンなどを挙げることができる。加熱工程は、必要に応じて、加圧条件下で行ってもよく、減圧条件下で行ってもよい。真空に近い状況で、加熱工程を行ってもよい。 Although the heating step is performed in gas, the atmosphere is not limited, and may be, for example, air, inert gas atmosphere, or the like. Examples of inert gases include nitrogen and argon. The heating step may be performed under pressurized conditions or under reduced pressure conditions, as required. The heating step may be performed under near-vacuum conditions.
加熱工程における加熱の温度は、目的とする繊維の使用環境等に応じて適宜選択してよく、例えば、１００℃以上、１１０℃以上、又は１３０℃以上であってよい。加熱工程における加熱の温度は、タンパク質の分解等を抑制する観点から、好ましくは２４０℃以下であり、より好ましくは１８０℃以下であり、さらに好ましくは１５０℃以下である。 The heating temperature in the heating step may be appropriately selected depending on the intended usage environment of the fiber, and may be, for example, 100° C. or higher, 110° C. or higher, or 130° C. or higher. The heating temperature in the heating step is preferably 240° C. or lower, more preferably 180° C. or lower, and even more preferably 150° C. or lower, from the viewpoint of suppressing protein decomposition and the like.
加熱時間は、特に制限されるものではなく、例えば、３０分以上であってよく、又は５０分以上であってよい。加熱時間はまた、例えば、５時間以下であってよく、又は３時間以下であってよい。 The heating time is not particularly limited, and may be, for example, 30 minutes or longer, or 50 minutes or longer. The heating time may also be, for example, 5 hours or less, or 3 hours or less.
本実施形態に係る布帛の製造方法は、タンパク質繊維を含む原料布帛を用意し、原料布帛の外周部を固定する固定工程と、外周部が固定された原料布帛を気体中で加熱する加熱工程と、を備える。 The fabric manufacturing method according to the present embodiment includes a fixing step of preparing a raw fabric containing protein fibers, fixing the outer peripheral portion of the raw fabric, and a heating step of heating the raw fabric with the fixed outer peripheral portion in a gas. , provided.
タンパク質繊維は、上述したタンパク質繊維を用いることができる。 The protein fiber mentioned above can be used for the protein fiber.
タンパク質繊維を含む原料布帛の種類は特に限定されない。布帛は、例えば、織物、編物、及び不織布等であってよい。布帛は、好ましくは織布である。布帛が織布である場合、その織組織は、例えば、平織、綾織、及び朱子織等であってよい。布帛が編物である場合、その編物は、トリコット、及びラッセル等の経編物であってよく、横編、及び丸編等の緯編物であってよい。 The type of raw material fabric containing protein fibers is not particularly limited. Fabrics can be, for example, wovens, knits, nonwovens, and the like. The fabric is preferably a woven fabric. When the fabric is a woven fabric, its weave structure may be, for example, a plain weave, a twill weave, a satin weave, or the like. When the fabric is a knitted fabric, the knitted fabric may be a warp knitted fabric such as tricot and raschel, or a weft knitted fabric such as a flat knit and a circular knit.
タンパク質繊維を含む布帛を作製する方法としては、公知の方法を使用することができる。布帛は、織機や編機によって作製される。布帛が不織布である場合、ニードルパンチ法等の公知の方法によって作製される。 A known method can be used as a method for producing a fabric containing protein fibers. Fabrics are produced by looms and knitting machines. When the fabric is a nonwoven fabric, it is produced by a known method such as a needle punch method.
布帛の厚みは、例えば１ｍｍ以下、又は０．２ｍｍ以下であってよい。布帛の目付は、例えば１ｇ／ｍ２以上、５０ｇ／ｍ２以上、８０ｇ／ｍ２以上又は１００ｇ／ｍ２以上であってよい。The thickness of the fabric may be, for example, 1 mm or less, or 0.2 mm or less. The basis weight of the fabric may be, for example, 1 g/m 2 or more, 50 g/m 2 or more, 80 g/m 2 or more, or 100 g/m 2 or more.
本実施形態に係る布帛の製造方法においては、上述のとおり用意したタンパク質繊維を含む原料布帛の外周部を固定する（固定工程）。 In the fabric manufacturing method according to the present embodiment, the outer peripheral portion of the raw material fabric containing protein fibers prepared as described above is fixed (fixing step).
原料布帛の固定は、加熱工程において、原料布帛の収縮を低減（例えば、原料布帛の初期面積基準で収縮率５％未満）できるものであればよい。原料布帛の固定は、例えば、所定面積の原料布帛を外力のかからない状態（自然状態）でしわ等がないように広げ、この状態で原料布帛の外周部を固定することで行ってよい。この原料布帛の外周部の固定は、原料布帛の外周部の一部又は全部が固定されていればよく、原料布帛全体を二枚の金属板に挟み込むことによって全体を固定するような態様をとってもよい。原料布帛の固定手段は、特に制限されるものではなく、任意の固定手段を用いてよい。固定手段としては、着脱可能なものであることが好ましく、例えば、粘着テープ、接着剤、及びクランプ等が挙げられる。 Fixing of the raw material fabric may be any method as long as the shrinkage of the raw material fabric can be reduced in the heating process (for example, the shrinkage rate is less than 5% based on the initial area of the raw material fabric). Fixing of the raw material fabric may be performed, for example, by spreading a predetermined area of the raw material fabric in a state (natural state) in which no external force is applied so that there are no wrinkles or the like, and fixing the outer peripheral portion of the raw material fabric in this state. The fixing of the outer peripheral portion of the raw material cloth may be performed by fixing a part or the whole of the outer peripheral portion of the raw material cloth. good. The fixing means for the raw material fabric is not particularly limited, and any fixing means may be used. The fixing means is preferably detachable, and examples thereof include adhesive tapes, adhesives, clamps, and the like.
次いで、外周部を固定した状態の原料布帛を気体中で加熱する（加熱工程）。加熱条件は、上記原料繊維に対する加熱工程と同様の条件で行ってもよい。 Next, the raw fabric with the outer peripheral portion fixed is heated in gas (heating step). The heating conditions may be the same conditions as in the heating step for the raw material fiber.
本実施形態に係る製造方法によって得られる、タンパク質繊維を含む繊維やタンパク質繊維を含む布帛は、熱による収縮の発生が充分に抑制されたものとなることから、例えば、製造過程において高温処理が含まれる、繊維強化プラスチック（ＦＲＰ）等の複合材料にも好適に使用することができる。 The fibers containing protein fibers and the fabric containing protein fibers obtained by the manufacturing method according to the present embodiment are sufficiently suppressed from shrinking due to heat. It can also be suitably used for composite materials such as fiber reinforced plastics (FRP).
本実施形態に係る繊維の製造方法、及び布帛の製造方法によって得られる繊維又は布帛は、熱にさらされた際の収縮が抑制されている。このような防縮効果が奏される理由は定かではないが、本発明者らは以下のように推察している。すなわち、タンパク質繊維中のタンパク質の二次構造や三次構造が加熱によって変化することで、収縮が発生すると考えられるところ、本実施形態に係る方法では、原料繊維又は原料布帛を加熱する際に、原料繊維の端部又は原料布帛の外周部を固定しているため、上記の高次構造の変化が生じても原料繊維及び原料布帛の寸法変化を抑制することができる。さらに熱的により安定な高次構造に変化することによって、本実施形態に係る繊維の製造方法、及び布帛の製造方法によって得られる繊維又は布帛は、熱による収縮が充分に抑制されたものとなる。 The fibers or fabrics obtained by the method for producing fibers and the method for producing fabrics according to the present embodiment are inhibited from shrinking when exposed to heat. Although the reason why such an anti-shrinkage effect is exhibited is not clear, the present inventors speculate as follows. That is, it is thought that shrinkage occurs due to changes in the secondary structure or tertiary structure of the protein in the protein fiber due to heating. Since the ends of the fibers or the outer peripheral portion of the raw material fabric are fixed, it is possible to suppress the dimensional change of the raw material fibers and the raw material fabric even if the higher-order structure changes. Furthermore, by changing to a higher-order structure that is more thermally stable, the fiber or fabric obtained by the method for producing a fiber and the method for producing a fabric according to the present embodiment has sufficiently suppressed shrinkage due to heat. .
以下、実施例及び比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited to the examples.
＜クモ糸フィブロイン様タンパク質の製造＞
（１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号６で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。<Production of spider silk fibroin-like protein>
(1) Preparation of Plasmid Expression Strain Based on the nucleotide sequence and amino acid sequence of Nephila clavipes-derived fibroin (GenBank Accession No.: P46804.1, GI: 1174415), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was prepared. A modified fibroin (hereinafter also referred to as “PRT799”) having The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence obtained by subjecting the amino acid sequence of fibroin derived from Nephila clavipes to substitution, insertion and deletion of amino acid residues for the purpose of improving productivity. , and the amino acid sequence (tag sequence and hinge sequence) shown in SEQ ID NO: 6 is added to the N-terminus.
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。 Next, a nucleic acid encoding PRT799 was synthesized. The nucleic acid was added with an NdeI site at the 5' end and an EcoRI site downstream of the stop codon. The nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, excised, and then recombined with the protein expression vector pET-22b(+) to obtain an expression vector.
（２）タンパク質の発現
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。(2) Protein Expression Escherichia coli BLR(DE3) was transformed with the pET22b(+) expression vector containing the nucleic acid encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1. The transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours. The culture solution was added to 100 mL of seed culture medium (Table 1) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005. The temperature of the culture solution was kept at 30° C., and flask culture was performed until OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。The seed culture was added to a jar fermenter containing 500 mL of production medium (Table 2) to an OD 600 of 0.05. The temperature of the culture solution was kept at 37° C. and the pH was constantly controlled to 6.9 for culturing. Also, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現によって、目的とするタンパク質の発現を確認した。 Immediately after the glucose in the production medium was completely consumed, the feed solution (glucose 455 g/1 L, Yeast Extract 120 g/1 L) was added at a rate of 1 mL/min. The temperature of the culture solution was kept at 37° C. and the pH was constantly controlled to 6.9 for culturing. Also, the dissolved oxygen concentration in the culture medium was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and culture was carried out for 20 hours. After that, 1 M isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture medium to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target protein. After 20 hours from the addition of IPTG, the culture solution was centrifuged to collect the cells. SDS-PAGE was performed using the cells prepared from the culture solutions before and after the addition of IPTG, and the expression of the target protein was confirmed by the appearance of a band of the target protein size depending on the addition of IPTG.
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離によって回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することによって、クモ糸フィブロイン様タンパク質「ＰＲＴ７９９」を得た。(3) Purification of Protein Cells collected 2 hours after the addition of IPTG were washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The washed cells were suspended in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing about 1 mM PMSF, and the cells were disrupted with a high-pressure homogenizer (manufactured by GEA Niro Soavi). The disrupted cells were centrifuged to obtain a precipitate. The resulting precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) until high purity. The precipitate after washing was suspended in 8M guanidine buffer (8M guanidine hydrochloride, 10mM sodium dihydrogen phosphate, 20mM NaCl, 1mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100mg/mL, and was incubated at 60°C for 30 minutes. Stir with a stirrer for 1 minute to dissolve. After dissolution, dialysis was performed with water using a dialysis tube (
＜クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維の調製＞
（１）ドープ液の調製
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に、上述のクモ糸フィブロイン様タンパク質（ＰＲＴ７９９）を濃度２４質量％となるよう添加した後、溶解促進剤としてＬｉＣｌを濃度４．０質量％となるように添加した。その後、シェーカーを使用して、クモ糸フィブロイン様タンパク質を３時間かけて溶解させ、ＤＭＳＯ溶液を得た。得られたＤＭＳＯ溶液中のゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は９０℃において５０００ｃＰ（センチポアズ）であった。<Preparation of spider silk fibroin-like protein fiber>
(1) Preparation of dope solution After adding the spider silk fibroin-like protein (PRT799) described above to dimethyl sulfoxide (DMSO) to a concentration of 24% by mass, LiCl is added as a dissolution accelerator to a concentration of 4.0% by mass. was added as Then, using a shaker, the spider silk fibroin-like protein was dissolved for 3 hours to obtain a DMSO solution. Dust and bubbles in the obtained DMSO solution were removed to obtain a dope solution. The solution viscosity of the dope solution was 5000 cP (centipoise) at 90°C.
（２）紡糸
上記のようにして得られたドープ液と図１に示される紡糸装置１０を用いて公知の乾湿式紡糸を行って、クモ糸フィブロイン様タンパク質からなるモノフィラメントを得た。なお、ここでは、乾湿式紡糸を下記の条件で行った。
押出しノズル直径：０．１ｍｍ
押出し速度：３２７．６ｍＬ／時間
凝固液（メタノール）の温度：２℃
巻取り速度：９９．５ｍ／分
延伸倍率：４．５２倍
乾燥温度：８０℃
エアギャップ長さ：５ｍｍ(2) Spinning Using the dope solution obtained as described above and the
Extrusion nozzle diameter: 0.1 mm
Extrusion speed: 327.6 mL/hour Temperature of coagulation liquid (methanol): 2°C
Winding speed: 99.5 m/min Stretch ratio: 4.52 times Drying temperature: 80°C
Air gap length: 5mm
（実施例１）
クモ糸フィブロイン様タンパク質繊維を有する織布の調製（諸撚糸及び織布の調製）
上記のようにして得られたモノフィラメントを複数本束ねて１８０デニールとし、Ｚ撚りの撚糸を得た。この撚糸を２本用いて、３６０デニールの諸撚糸（原料繊維１）を得た。そして、この諸撚糸を用いて、厚み０．２ｍｍ、平織の織布（原料布帛１）を作製した。原料布帛１の目付は、１１４ｇ／ｍ２であった。上記で得られた原料布帛１を縦１００ｍｍ×横１００ｍｍにカットして試験片１とした。(Example 1)
Preparation of woven fabric with spider silk fibroin-like protein fibers (preparation of plied yarn and woven fabric)
A plurality of monofilaments obtained as described above were bundled into 180 denier to obtain a Z-twisted yarn. Two of these twisted yarns were used to obtain a 360 denier plied yarn (raw fiber 1). Then, using this plied yarn, a plain weave fabric (raw material fabric 1) having a thickness of 0.2 mm was produced. The basis weight of the raw material fabric 1 was 114 g/m 2 . The raw material fabric 1 obtained above was cut into a piece 1 having a length of 100 mm and a width of 100 mm.
上記で得られた試験片１を台板（アルミ板）に載せ、試験片１の４辺（外周）を粘着テープによって台板に固定した。固定した台板と共に上記試験片１を、大気と同じの雰囲気、且つ１３０℃に調整したオーブン内に静置し、１時間加熱した後、室温にて冷却することによって、目的の織布１を得た。 The test piece 1 obtained above was placed on a base plate (aluminum plate), and the four sides (periphery) of the test piece 1 were fixed to the base plate with an adhesive tape. The test piece 1, together with the fixed base plate, is placed in an oven adjusted to 130°C in the same atmosphere as the air, heated for 1 hour, and then cooled at room temperature to obtain the desired woven fabric 1. Obtained.
＜評価＞
得られた織布１を、台板に載せ、固定せずに、１３０℃に調整したオーブン内に静置し、１時間、高温環境下にさらした。織布１は、定規を当てて目視で確認したところ、１３０℃の環境に１時間さらしても収縮は見られず、防縮効果が得られていることが確認された。<Evaluation>
The obtained woven fabric 1 was placed on a base plate, left unfixed in an oven adjusted to 130° C., and exposed to a high temperature environment for 1 hour. When the woven fabric 1 was visually checked with a ruler, no shrinkage was observed even after being exposed to an environment of 130° C. for 1 hour, confirming that the shrinkage-proofing effect was obtained.
（比較例１）
上記で得られた試験片１を、実施例１と同様に評価した。すなわち、試験片１を台板に載せ、固定せずに、１３０℃に調整したオーブン内に静置し、１時間、高温環境下にさらした。実施例１同様に、定規をあてて目視で確認したところ、試験片１には収縮が見られた。試験片１の収縮率は、高温環境下にさらす前の試験片１の面積を基準として、約３６％の減少であった。(Comparative example 1)
The test piece 1 obtained above was evaluated in the same manner as in Example 1. That is, the test piece 1 was placed on a base plate, left unfixed in an oven adjusted to 130° C., and exposed to a high temperature environment for 1 hour. As in Example 1, shrinkage was observed in test piece 1 when visually inspected with a ruler. The shrinkage rate of the test piece 1 was reduced by about 36% based on the area of the test piece 1 before exposure to the high temperature environment.
（比較例２）
上記実施例１において、調整した試験片１をアルミ製の枠を利用して貼り４辺を、クランプを用いて固定した。この状態で試験片１を常温（２５℃）の水に３０分浸漬した。その後、水中にさらした試験片１を固定したままの状態で、自然乾燥させた。乾燥後の織布を縦１００ｍｍ×横１００ｍｍにカットした試験片を、織布Ｃ１とした。(Comparative example 2)
In Example 1 above, the adjusted test piece 1 was attached using an aluminum frame, and the four sides were fixed using clamps. In this state, the test piece 1 was immersed in water at normal temperature (25° C.) for 30 minutes. After that, the test piece 1 exposed to water was naturally dried while being fixed. A test piece obtained by cutting the dried woven fabric into a length of 100 mm and a width of 100 mm was used as the woven fabric C1.
＜評価＞
上記で得られた織布Ｃ１を実施例１と同様に評価した。織布Ｃ１の収縮率は、高温環境下にさらす前の織布Ｃ１の面積を基準として、３６％の減少であった。<Evaluation>
The woven fabric C1 obtained above was evaluated in the same manner as in Example 1. The shrinkage rate of the woven fabric C1 was reduced by 36% based on the area of the woven fabric C1 before exposure to the high temperature environment.
（実施例２）
上記試験片１と同じものを試験片２とした。(Example 2)
A
上記で得られた試験片２を平板状の金型プレス機内に静置し、平板状の金属板によって試験片２を挟み込み、０．１２５ＭＰａで加圧することによって、試験片２を全面で固定した。大気下において、３０分かけて金型プレス機の設定温度が１５０℃になるまで昇温し、１５０℃にて３時間保持することで、試験片２を加熱した。その後、金型を室温にて冷却することで、目的の織布２を得た。
The
＜評価＞
得られた織布２について、下記のとおり評価した。すなわち、得られた織布２を、台板に載せ、固定せずに、１５０℃に調整したオーブン内に静置し、１時間、高温環境下にさらした。織布２は、定規を当てて目視で確認したところ、１５０℃の環境に１時間さらしても収縮は見られず、防縮効果が得られていることが確認された。<Evaluation>
The obtained
（実施例３）
金型プレス機の設定温度を１３０℃に変更した以外は、実施例２と同様にして、織布３を得た。得られた織布３について実施例２同様に評価したところ、織布３の収縮率は、高温環境下にさらす前の織布３の面積を基準として、２％以下であり、充分防縮効果が得られていることが確認された。(Example 3)
（実施例４）
金型プレス機の設定温度を１１０℃に変更した以外は、実施例２と同様にして、織布４を得た。得られた織布４について実施例２同様に評価したところ、織布４の収縮率は、高温環境下にさらす前の織布３の面積を基準として、３％以下であり、充分防縮効果が得られていることが確認された。(Example 4)
A
１…押出し装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽、３６…タンパク質繊維。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1... Extrusion apparatus, 4... Drying apparatus, 6... Dope liquid, 10... Spinning apparatus, 20... Solidification bath, 21... Washing bath, 36... Protein fiber.
Claims (14)
前記端部が固定された前記原料繊維を気体中で外部から水分を追加供給せずに、加熱する加熱工程と、を備える、繊維の製造方法。 A fixing step of preparing raw fibers containing protein fibers and fixing at least the ends of the raw fibers;
and a heating step of heating the raw material fibers having the fixed ends in a gas without supplying additional water from the outside .
前記外周部の一部が固定された前記原料布帛を気体中で外部から水分を追加供給せずに、加熱する加熱工程と、を備える、布帛の製造方法。 A fixing step of preparing a raw material fabric containing protein fibers and fixing at least part of the outer peripheral portion of the raw material fabric;
and a heating step of heating the raw material fabric, to which a part of the outer peripheral portion is fixed , in a gas without supplying additional moisture from the outside .
The fabric manufacturing method according to any one of claims 8 to 13, wherein the fabric is a fabric for fiber-reinforced plastic .
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