JP7247253B2 - 経験的バリアントスコア（ｅｖｓ）ベースの深層学習バリアントコーラ - Google Patents

経験的バリアントスコア（ｅｖｓ）ベースの深層学習バリアントコーラ Download PDF

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Description

優先出願
本出願は、2018年1月15日に出願された「DEEP LEARNING-BASED VARIANT CLASSIFIER」という表題の米国仮特許出願第62/617,552号(代理人整理番号第ILLM 1005-1/IP-1663-PRV)の優先権または利益を主張する。優先出願はすべての目的のために参照により本明細書において引用される。
引用
以下は、本明細書に完全に記載されるかのようにすべての目的のために参照により引用される。
https://github.com/Illumina/strelkaにおいてホストされ、T Saunders, Christopher、Wong, Wendy、Swamy, Sajani、Becq, Jennifer、J Murray, Lisa、Cheetham, Keira、2012年、Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics (イングランド、オックスフォード)、28、1811-7という論説において説明される、Illumina IncによるStrelka(商標)アプリケーション
https://github.com/Illumina/strelkaにおいてホストされ、Kim, S、Scheffler, K、Halpern, A.L、Bekritsky, M.A、Noh, E、Kallberg, M、Chen, X、Beyter, D、Krusche, P、およびSaunders, C.T (2017年)という論説において説明される、Illumina IncによるStrelka2(商標)アプリケーション
A.van den Oord、S.Dieleman、H.Zen、K.Simonyan、O.Vinyals、A.Graves、N.Kalchbrenner、A.Senior、およびK.Kavukcuoglu、「WAVENET: A GENERATIVE MODEL FOR RAW AUDIO」、arXiv:1609.03499、2016
S.O.Arik、M.Chrzanowski、A.Coates、G.Diamos、A.Gibiansky、Y.Kang、X.Li、J.Miller、A.Ng、J.Raiman、S.Sengupta、およびM.Shoeybi、「DEEP VOICE: REAL-TIME NEURAL TEXT-TO-SPEECH」、arXiv:1702.07825、2017
F.YuおよびV.Koltun、「MULTI-SCALE CONTEXT AGGREGATION BY DILATED CONVOLUTIONS」、arXiv:1511.07122、2016
K.He、X.Zhang、S.Ren、およびJ.Sun、「DEEP RESIDUAL LEARNING FOR IMAGE RECOGNITION」、arXiv:1512.03385、2015
R.K.Srivastava、K.Greff、およびJ.Schmidhuber、「HIGHWAY NETWORKS」、arXiv:1505.00387、2015
G.Huang、Z.Liu、L.van der Maaten、およびK.Q.Weinberger、「DENSELY CONNECTED CONVOLUTIONAL NETWORKS」、arXiv:1608.06993、2017
C.Szegedy、W.Liu、Y.Jia、P.Sermanet、S.Reed、D.Anguelov、D.Erhan、V.Vanhoucke、およびA.Rabinovich、「GOING DEEPER WITH CONVOLUTIONS」、arXiv:1409.4842、2014
S.Ioffe、およびC.Szegedy、「BATCH NORMALIZATION: ACCELERATING DEEP NETWORK TRAINING BY REDUCING INTERNAL COVARIATE SHIFT」、arXiv:1502.03167、2015
Srivastava, Nitish、Hinton, Geoffrey、Krizhevsky, Alex、Sutskever, Ilya、およびSalakhutdinov, Ruslan、「DROPOUT: A SIMPLE WAY TO PREVENT NEURAL NETWORKS FROM OVERFITTING」、The Journal of Machine Learning Research、15 (1):1929-1958、2014年
J.M.Wolterink、T.Leiner、M.A.Viergever、およびI.Isgum、「DILATED CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORKS FOR CARDIOVASCULAR MR SEGMENTATION IN CONGENITAL HEART DISEASE」、arXiv:1704.03669、2017
L.C.Piqueras、「AUTOREGRESSIVE MODEL BASED ON A DEEP CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORK FOR AUDIO GENERATION」、Tampere University of Technology、2016
J.Wu、「Introduction to Convolutional Neural Networks」、Nanjing University、2017
I.J.Goodfellow、D.Warde-Farley、M.Mirza、A.Courville、およびY.Bengio、「CONVOLUTIONAL NETWORKS」、Deep Learning、MIT Press、2016
J.Gu、Z.Wang、J.Kuen、L.Ma、A.Shahroudy、B.Shuai、T.Liu、X.Wang、およびG.Wang、「RECENT ADVANCES IN CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORKS」、arXiv:1512.07108、2017
M. Lin、Q. Chen、およびS. Yan、「Network in Network」、Proc. of ICLR所収、2014年
L. Sifre、「Rigid-motion Scattering for Image Classification」、博士論文、2014年
L. SifreおよびS. Mallat、「Rotation, Scaling and Deformation Invariant Scattering for Texture Discrimination」、Proc. of CVPR所収、2013年
F. Chollet、「Xception: Deep Learning with Depthwise Separable Convolutions」Proc. of CVPR所収、2017年
X. Zhang、X. Zhou、M. Lin、およびJ. Sun、「ShuffleNet: An Extremely Efficient Convolutional Neural Network for Mobile Devices」、arXiv:1707.01083所収、2017年
K. He、X. Zhang、S. Ren、およびJ. Sun、「Deep Residual Learning for Image Recognition」、Proc. of CVPR所収、2016年
S. Xie、R. Girshick、P. Dollar、Z. Tu、およびK. He、「Aggregated Residual Transformations for Deep Neural Networks」、Proc. of CVPR所収, 2017年
A. G. Howard、M. Zhu、B. Chen、D. Kalenichenko、W. Wang、T. Weyand、M. Andreetto、およびH. Adam、「Mobilenets: Efficient Convolutional Neural Networks for Mobile Vision Applications」、arXiv:1704.04861所収、2017年
M. Sandler、A. Howard、M. Zhu、A. Zhmoginov、およびL. Chen、「MobileNetV2: Inverted Residuals and Linear Bottlenecks」、arXiv:1801.04381v3所収、2018年
Z. Qin、Z. Zhang、X. Chen、およびY. Peng、「FD-MobileNet: Improved MobileNet with a Fast Downsampling Strategy」、arXiv:1802.03750所収、2018年
2017年11月4日に出願された、「Validation Methods and Systems for Sequence Variant Calls」という表題のPCT国際特許出願第PCT/US17/61554号
2017年1月17日に出願された、「Validation Methods and Systems for Sequence Variant Calls」という表題の米国仮特許出願第62/447,076号
2016年11月16日に出願された、「Methods and Systems to Improve Accuracy in Variant Calling」という表題の米国仮特許出願第62/422,841号
N. ten DIJKE、「Convolutional Neural Networks for Regulatory Genomics」、修士論文、Universiteit Leiden Opleiding Informatica、2017年6月17日
開示される技術の分野
開示される技術は、人工知能タイプコンピュータならびにデジタルデータ処理システムならびに知性のエミュレーションのための対応するデータ処理方法および製品(すなわち、知識ベースシステム、推論システム、知識取得システム)に関し、不確実性を伴う推論のためのシステム(たとえば、ファジー論理システム)、適応システム、機械学習システム、および人工ニューラルネットワークを含む。具体的には、開示される技術は、順序付けられたデータを分析するために深層学習および畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を使用することに関する。
このセクションにおいて論じられる主題は、このセクションにおける言及の結果として、単なる従来技術であると見なされるべきではない。同様に、このセクションにおいて言及される問題、または背景として提供される主題と関連付けられる問題は、従来技術においてこれまで認識されていたと見なされるべきではない。このセクションの主題は異なる手法を表すにすぎず、それらの異なる手法自体も、特許請求される技術の実装形態に対応し得る。
遺伝子配列におけるバリアントの正確な特定には、多くの重要な影響があり、重大な関心を集めてきた。GoogleのInceptionエンジンをバリアントコーリングに適用しようという最新の試みは興味深いが、極度にリソース集約的である。より効率的な手法が必要である。
次世代シーケンシングは、大量のシーケンシングされたデータをバリアント分類に利用可能にした。シーケンシングされたデータは、高度に相関し、複雑な相互依存関係を有しており、このことが、サポートベクターマシンのような従来の分類器をバリアント分類のタスクに適用することを妨げている。したがって、シーケンシングされたデータから高水準の特徴量を抽出することが可能な進化した分類器が望まれている。
深層ニューラルネットワークは、高水準の特徴量を連続的にモデル化して逆伝播を介してフィードバックを提供するために、複数の非線形の複雑な変換層を使用する、あるタイプの人工ニューラルネットワークである。深層ニューラルネットワークは、大きな訓練データセット、並列および分散コンピューティングの能力、および洗練された訓練アルゴリズムが利用可能になることとともに進化してきた。深層ニューラルネットワークは、コンピュータビジョン、音声認識、および自然言語処理などの、多数の領域において大きな進化を促進してきた。
畳み込みニューラルネットワークおよび再帰型ニューラルネットワークは、深層ニューラルネットワークの構成要素である。畳み込みニューラルネットワークは、畳み込み層、非線形層、およびプーリング層を備えるアーキテクチャにより、画像認識において特に成功してきた。再帰型ニューラルネットワークは、パーセプトロン、長短期メモリユニット、およびゲート付き回帰型ユニットのようなビルディングブロックの間で、巡回接続を用いて入力データの連続的情報を利用するように設計される。加えて、深層空間時間ニューラルネットワーク、多次元再帰型ニューラルネットワーク、および畳み込みオートエンコーダなどの、多くの他の新興の深層ニューラルネットワークが、限られた文脈に対して提案されている。
深層ニューラルネットワークを訓練する目的は、各層における重みパラメータの最適化であり、このことは、最も適した階層的表現をデータから学習できるように、より単純な特徴を複雑な特徴へと徐々に合成する。最適化プロセスの単一のサイクルは次のように編成される。まず、ある訓練データセットのもとで、フォワードパスが各層の中の出力を順番に計算し、ネットワークを通じて関数信号を前に伝播させる。最後の出力層において、目的損失関数が、推論された出力と所与のラベルとの間の誤差を測定する。訓練誤差を最小にするために、バックワードパスは、連鎖律を逆伝播誤差信号に使用し、ニューラルネットワーク全体のすべての重みに関する勾配を計算する。最後に、重みパラメータは、確率的勾配降下に基づく最適化アルゴリズムを使用して更新される。一方、バッチ勾配降下は、各々の完全なデータセットに対するパラメータ更新を実行し、確率的勾配降下は、データ例の各々の小さいセットに対する更新を実行することによって確率的近似を提供する。いくつかの最適化アルゴリズムは、確率的勾配低下に由来する。たとえば、AdagradおよびAdam訓練アルゴリズムは、確率的勾配降下を実行しながら、それぞれ、各パラメータのための更新頻度および勾配のモーメントに基づいて学習率を適応的に修正する。
深層ニューラルネットワークの訓練における別のコア要素は正則化であり、これは、過剰適応を避けることで良好な一般化性能を達成することを意図した戦略を指す。たとえば、重み減衰は、重みパラメータがより小さい絶対値へと収束するように、目的損失関数にペナルティ項を追加する。ドロップアウトは、訓練の間にニューラルネットワークから隠れユニットをランダムに除去し、可能性のあるサブネットワークのアンサンブルであると見なされ得る。ドロップアウトの能力を高めるために、新しい活性化関数であるmaxoutと、rnnDropと呼ばれる再帰型ニューラルネットワークのためのドロップアウトの変形が提案されている。さらに、バッチ正規化は、ミニバッチ内の各活性化のためのスカラー特徴量の正規化と、各平均および分散をパラメータとして学習することとを通じた、新しい正則化方法を提供する。
シーケンシングされたデータが多次元かつ高次元であるとすると、深層ニューラルネットワークは、その広い適用可能性および高い予測能力により、バイオインフォマティクスの研究に対して高い将来性がある。畳み込みニューラルネットワークは、モチーフの発見、病原性バリアントの特定、および遺伝子発現の推論などの、ゲノミクスにおける配列に基づく問題を解決するために適合されてきた。畳み込みニューラルネットワークの特徴は、畳み込みフィルタの使用である。精巧に設計され人間により作られた特徴に基づく従来の分類手法とは異なり、畳み込みフィルタは、生の入力データを知識の有用な表現へとマッピングする処理と類似した、特徴の適応学習を実行する。この意味で、畳み込みフィルタは一連のモチーフスキャナとして機能し、それは、そのようなフィルタのセットが、入力の中の関連するパターンを認識し、訓練手順の間にそれらを更新することが可能であるからである。再帰型ニューラルネットワークは、タンパク質またはDNA配列などの、可変の長さの連続的データにおける長距離の依存関係を捉えることができる。
したがって、バリアント分類のために深層ニューラルネットワークを使用する機会が生じる。
国際特許出願第PCT/US17/61554号 米国仮特許出願第62/447,076号 米国仮特許出願第62/422,841号 国際特許出願公開第WO07010252号 国際特許出願第PCTGB2007/003798号 米国特許出願公開第2009/0088327号 米国特許出願公開第2016/0085910号 米国特許出願公開第2013/0296175号 国際特許出願公開第WO 04/018497号 米国特許第7057026号 国際特許出願公開第WO 91/06678号 国際特許出願公開第WO 07/123744号 米国特許第7329492号 米国特許第7211414号 米国特許第7315019号 米国特許第7405281号 米国特許出願公開第2008/0108082号 米国特許第5641658号 米国特許出願公開第2002/0055100号 米国特許第7115400号 米国特許出願公開第2004/0096853号 米国特許出願公開第2004/0002090号 米国特許出願公開第2007/0128624号 米国特許出願公開第2008/0009420号 米国特許出願公開第2007/0099208A1号 米国特許出願公開第2007/0166705A1号 米国特許出願公開第2008/0280773A1号 米国特許出願第13/018255号 国際特許出願第PCT/US2013/030867号(公開番号第WO 2014/142831号)
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図面において、同様の参照文字は一般に様々な図全体で同様の部分を指す。また、図面は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、開示される技術の原理を示す際に一般に強調が行われる。以下の説明では、開示される技術の様々な実装形態が、以下の図面を参照して説明される。
本明細書で開示される訓練されたバリアント分類器によるバリアントコーリングの一実装形態を示す図である。訓練されたバリアント分類器は畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を含む。 バリアント候補を備えるラベリングされた訓練データを使用して図1Aのバリアント分類器を訓練することの一実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワーク処理の入力モジュールおよび出力モジュールの一実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークに供給される入力特徴量のアレイの一実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャの一実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャの別の実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャのさらに別の実装形態を示す図である。 図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャのさらに別の実装形態を示す図である。 全結合(FC)ネットワークを示す図である。 経験的バリアントスコア(EVS)特徴量のみを入力として取り込むバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのアーキテクチャの一実装形態を示す図である。このアーキテクチャはいずれの畳み込みも使用しない。 バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによる一塩基多型(SNP)分類性能と、経験的バリアントスコア(EVS)モデルと呼ばれる基準のStrelka(商標)モデルによるSNP分類性能とを比較する、適合率-再現率曲線の一例を示す図である。 バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによるSNP分類性能と、EVSモデルによるSNP分類性能とを比較する、適合率-再現率曲線の別の例を示す図である。 バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによるインデル分類性能と、EVSモデルによるインデル分類性能とを比較する、適合率-再現率曲線の一例を示す図である。 訓練および妥当性確認の間のバリアント分類器の収束曲線を示す図である。 訓練および検定(推論)の間のバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークの収束曲線を示す図である。 (i)EVSモデルバージョン2.8.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのSNP分類性能、(ii)EVSモデルバージョン2.9.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのSNP分類性能、(iii)EVSモデルバージョン2.8.2のSNP分類性能、および(iv)EVSモデルバージョン2.9.2のSNP分類性能を比較するために適合率-再現率曲線を使用する図である。 (i)EVSモデルバージョン2.8.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのインデル分類性能、(ii)EVSモデルバージョン2.9.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのインデル分類性能、(iii)EVSモデルバージョン2.8.2のインデル分類性能、および(iv)EVSモデルバージョン2.9.2のインデル分類性能を比較するために適合率-再現率曲線を使用する図である。 バリアント分類器を実装するために使用され得るコンピュータシステムの簡略化されたブロック図である。
以下の議論は、あらゆる当業者が開示される技術を作成して使用することを可能にするために提示され、特定の適用例およびその要件の文脈で与えられる。開示される実装形態への様々な修正が当業者に容易に明らかとなり、本明細書で定義される一般的な原理は、開示される技術の趣旨および範囲から逸脱することなく他の実装形態および適用例に適用され得る。したがって、開示される技術は、示される実装形態に限定されることは意図されず、本明細書で開示される原理および特徴と矛盾しない最も広い範囲を認められるべきである。
導入
開示される技術は、DNAシーケンシングデータに対して直接動作し、その固有の特徴量フィルタを導く。開示される技術は、標的塩基場所にまたがる複数のアラインメントされたリード(たとえば、10から500にわたるリード深さ)を処理する。開示される技術は、軽量なハードウェアを使用して良好な再現率および適合率を生み出すために、リードのエレガント符号化を軽量な分析と組み合わせる。たとえば、各々50個から100個のリードを伴う標的塩基バリアントサイトの100万個の訓練例を、良好な再現率および適合率で、10時間未満で単一のGPUカード上で訓練することができる。単一のGPUカードが望ましく、それは、GPUが単一であるコンピュータは安価であり、遺伝子データを求めているユーザのほとんどすべてにとって手が届くからである。そのようなコンピュータはクラウドベースのプラットフォーム上で容易に利用可能である。
エレガント符号化は、各側に110個以上の塩基がある標的塩基を中心とするリードに対する、以下のデータを組み合わせる。当然、221個の塩基配列にわたるリードはあったとしても少ないので、大半のリードはリード配列の一端または両端にヌル塩基を有する。リード配列の中の各塩基に対して符号化されるデータは、個々のリード、基準リードからの対応する基準塩基、塩基を読み取ることからの基準コール正確度スコア、塩基を読み取ることのデオキシリボ核酸(DNAと省略される)鎖状態、塩基に隣接する挿入変化の挿入カウント、およびリードが個々のリードサイトにおいて欠失を有していたことをアラインメントが決定したことを示すための欠失フラグを含む。
この符号化において、挿入および欠失は異なるように扱われる。任意の2つのリードの場所の間には、任意の数の挿入があり得る。挿入のこの数のカウントが、基準場所間の任意の数を表すために使用される。挿入された塩基のコールは使用されず、それはリード間でミスアラインメントが生じるからである。欠失は、フラグを立てることができる特定の場所で発生する。2つの個々のリード間に複数の欠失がある場合、アラインメントの後で、複数の欠失フラグが欠失サイトにおいて設定され得る。欠失した塩基はACGTコードを割り当てられるべきではなく、それはいずれにも当てはまらないからである。
これは単純な符号化システムであり、色空間への変換またはInceptionなどの画像処理エンジンによる処理への適応を伴わない。単純さは、高速な訓練に寄与する。
より多くのコンピューティングリソースが利用可能であるとき、221個の塩基場所より長い配列が使用され得る。プラットフォームがより長いリード配列を作り出すように進化するにつれて、より多くの側にある塩基を使用することの利益がより明らかになると予想される。
上記のリード毎のデータは、訓練の間に、かつ任意選択で動作の間に、レガシーシステムによって生成されるバリアント毎の特性データによって補足され得る。特定の場所におけるバリアントを特徴付ける、多数の規則ベースの手作業で作られたシステムがある。バリアント毎の1つまたは複数の入力を、畳み込み層を通じて複数のリードを処理した後の入力として使用することができる。遅く追加されるバリアント毎の入力は訓練を短くする。これは、レガシーシステムの正確度がすでに高く、90%を超えると推定されるので、予想されることである。
軽量な分析構造も高速な訓練に寄与する。いくつかの実施形態では、リード毎のデータを処理するための5つの畳み込み層と、それに続く、畳み込み出力からの入力およびバリアント毎のデータからの入力を受け入れる2層の全結合構造とが、軽量で正確なネットワーク構造になることが証明されている。7つおよび8つの畳み込み層でも成功しているので、2つから8つの層がうまくいき、より多くの層を使用できる可能性がある。
より詳細には、第1の畳み込み層は、221(塩基)×100(リード)×12(属性、ACGTリードのワンホット符号化を伴う)の列挙された符号化を受け入れる。中心の塩基が標的場所と見なされる。いくつかのランダムに初期化された、または以前に訓練されたフィルタが適用される。一設計では、32個の畳み込みフィルタがある層において使用される。多次元フィルタは行を折り畳む傾向がある。
100万個の訓練および検証のサンプルが利用可能である場合、7つの訓練エポックが良好な結果を与えた。訓練エポックの数は、過剰適応を避けるために制限されるべきである。過剰適応を避けるために、エポックの数を制限することがドロップアウトと組み合わされ得る。
用語
用語
限定はされないが、特許、特許出願、論説、書籍、論文、およびウェブページを含む、本出願において引用されるすべての文献および同様の資料は、そのような文献および同様の資料のフォーマットとは無関係に、全体が参照によって明確に引用される。限定はされないが、定義される用語、用語の使用法、説明される技法などを含めて、引用される文献および同様の資料のうちの1つまたは複数が、本出願とは異なる場合、または本出願と矛盾する場合、本出願が優先する。
本明細書では、以下の用語は示される意味を有する。
塩基は、ヌクレオチド塩基またはヌクレオチド、すなわちA(アデニン)、C(シトシン)、T(チミン)、またはG(グアニン)を指す。本出願は、「塩基」および「ヌクレオチド」を交換可能に使用する。
「染色体」という用語は、生きている細胞の遺伝情報を持っている遺伝子の担体を指し、これはDNAおよびタンパク質の構成要素(特にヒストン)を備えるクロマチン鎖に由来する。従来の国際的に認識されている個々のヒトゲノム染色体ナンバリングシステムが本明細書で利用される。
「サイト」という用語は、基準ゲノム上の一意な場所(たとえば、染色体ID、染色体の場所および向き)を指す。いくつかの実装形態では、サイトは、残基、配列タグ、または配列上のセグメントの場所であり得る。「座」という用語は、基準染色体上での核酸配列または多型の具体的な位置を指すために使用され得る。
本明細書の「サンプル」という用語は、典型的には、シーケンシングおよび/もしくはフェージングされるべき少なくとも1つの核酸配列を含有する核酸もしくは核酸の混合物を含有する、体液、細胞、組織、器官、または生物体に由来する、サンプルを指す。そのようなサンプルは、限定はされないが、唾液/口腔液、羊水、血液、血液の断片、細針生検サンプル(たとえば、直視下生検、細針生検など)、尿、腹膜液、胸膜液、組織外植、器官培養、および任意の他の組織もしくは細胞の標本、またはそれらの一部もしくはそれらの派生物、またはそれらから分離されたものを含む。サンプルはしばしば、ヒト対象(たとえば、患者)から取られるが、サンプルは、限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタなどを含む、染色体を有する任意の生物体から取ることができる。サンプルは、生物学的な供給源から得られるものとして直接使用されることがあり、または、サンプルの特性を修正するための前処理の後に使用されることがある。たとえば、そのような前処理は、血液から血漿を調製すること、粘液を希釈することなどを含み得る。前処理の方法はまた、限定はされないが、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、遠心分離、凍結、凍結乾燥、濃縮、増幅、核酸断片化、干渉する要素の不活性化、試薬の追加、溶解などを伴い得る。
「配列」という用語は、互いに結合されたヌクレオチドの鎖を含み、または表す。ヌクレオチドはDNAまたはRNAに基づき得る。1つの配列は複数の部分配列を含み得ることを理解されたい。たとえば、(たとえばPCRアンプリコン)の単一配列は350個のヌクレオチドを有し得る。サンプルリードは、これらの350個のヌクレオチド内の複数の部分配列を含み得る。たとえば、サンプルリードは、たとえば20～50個のヌクレオチドを有する、第1および第2のフランキング部分配列を含み得る。第1および第2のフランキング部分配列は、対応する部分配列(たとえば、40～100個のヌクレオチド)を有する反復的なセグメントの両側に位置し得る。フランキング部分配列の各々は、プライマー部分配列(たとえば、10～30個のヌクレオチド)を含み得る(またはその一部を含み得る)。読むのを簡単にするために、「部分配列」という用語は「配列」と呼ばれるが、2つの配列は必ずしも共通の鎖上で互いに別々であるとは限らないことを理解されたい。本明細書で説明される様々な配列を区別するために、配列は異なるラベル(たとえば、標的配列、プライマー配列、フランキング配列、基準配列など)を与えられ得る。「アレル」などの他の用語は、同様の物を区別するために異なるラベルを与えられ得る。本出願は、「リード」および「配列リード」を交換可能に使用する。
「ペアエンドシーケンシング(paired-end sequencing)」という用語は、標的フラグメントの両端をシーケンシングするシーケンシング方法を指す。ペアエンドシーケンシングは、ゲノム再配置および反復セグメント、ならびに遺伝子融合および新規転写物の検出を容易にし得る。ペアエンドシーケンシングの方法論は、各々が本明細書において参照によって引用される、国際特許出願公開第WO07010252号、国際特許出願第PCTGB2007/003798号、および米国特許出願公開第2009/0088327号において説明されている。一例では、一連の操作は次のように実行され得る。(a)核酸のクラスタを生成する。(b)核酸を直線化する。(c)第1のシーケンシングプライマーをハイブリダイゼーションし、上で記載されたような延長、走査、およびデブロッキングの繰り返されるサイクルを実行する。(d)相補的なコピーを合成することによってフローセル表面上の標的核酸を「逆にする」。(e)再合成された鎖を直線化する。(f)第2のシーケンシングプライマーをハイブリダイゼーションし、上で記載されたような延長、走査、およびデブロッキングの繰り返されるサイクルを実行する。この逆転操作は、ブリッジ増幅の単一サイクルについて上に記載されたように試薬を導入するために実行され得る。
「基準ゲノム」または「基準配列」という用語は、対象からの特定された配列の基準にするために使用され得る任意の生物体の任意の特定の既知のゲノム配列を、それが部分的なものであるか完全なものであるかにかかわらず指す。たとえば、ヒト対象ならびに多くの他の生物体のために使用される基準ゲノムは、ncbi.nlm.nih.govの米国国立生物工学情報センターにおいて見つかる。「ゲノム」は、核酸配列で表現される、生物体またはウイルスの完全な遺伝情報を指す。ゲノムは、遺伝子とDNAのノンコーディング配列の両方を含む。基準配列は、それとアラインメントされるリードより大きいことがある。たとえば、それは少なくとも約100倍大きいことがあり、または少なくとも約1000倍大きいことがあり、または少なくとも約10000倍大きいことがあり、または少なくとも約105倍大きいことがあり、または少なくとも約106倍大きいことがあり、または少なくとも約107倍大きいことがある。一例では、基準ゲノム配列は、完全な長さのヒトゲノムの基準ゲノム配列である。別の例では、基準ゲノム配列は、13番染色体などの特定のヒト染色体に限定される。いくつかの実装形態では、基準染色体は、ヒトゲノムバージョンhg19からの染色体配列である。そのような配列は染色体基準配列と呼ばれ得るが、基準ゲノムという用語がそのような配列を包含することが意図される。基準配列の他の例には、他の種のゲノム、ならびに任意の種の染色体、部分染色体領域(鎖など)などがある。様々な実装形態において、基準ゲノムは、複数の個体に由来するコンセンサス配列または他の組合せである。しかしながら、いくつかの適用例では、基準配列は特定の個体から取られることがある。他の実装形態では、「ゲノム」はいわゆる「グラフゲノム」もカバーし、これはゲノム配列の特定の記憶フォーマットおよび表現を使用する。一実装形態では、グラフゲノムは線形ファイルにデータを記憶する。別の実装形態では、グラフゲノムは、代替配列(たとえば、小さな違いがある染色体の異なるコピー)がグラフの中の異なる経路として記憶されるような表現を指す。グラフゲノムの実装形態に関する追加の情報は、https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/03/20/194530.full.pdfにおいて見出すことができ、その内容の全体が参照によって本明細書において引用される。
「リード」という用語は、ヌクレオチドサンプルまたは基準のフラグメントを記述する配列データの集合体を指す。「リード」という用語は、サンプルリードおよび/または基準リードを指し得る。通常、必須ではないが、リードは、サンプルまたは基準における連続的な塩基対の短い配列を表す。リードは、サンプルまたは基準フラグメントの塩基対配列によって文字で(ATCGで)表され得る。リードは、メモリデバイスに記憶され、リードが基準配列と一致するかどうか、または他の基準を満たすかどうかを決定するために適宜処理され得る。リードは、シーケンシング装置から直接、またはサンプルに関する記憶された配列情報から間接的に得られ得る。いくつかの場合、リードは、たとえば染色体またはゲノム領域または遺伝子にアラインメントされ具体的に割り当てられ得る、より大きい配列または領域を特定するために使用され得る、十分な長さの(たとえば、少なくとも約25bp)DNA配列である。
次世代シーケンシング方法には、たとえば、合成技術によるシーケンシング(Illumina)、パイロシーケンシング(454)、イオン半導体技術(Ion Torrentシーケンシング)、単一分子リアルタイムシーケンシング(Pacific Biosciences)、およびライゲーションによるシーケンシング(SOLiDシーケンシング)がある。シーケンシング方法に応じて、各リードの長さは、約30bpから10000bp以上にまで変動し得る。たとえば、SOLiDシーケンサを使用するDNAシーケンシング方法は、約50bpの核酸リードを生成する。別の例では、Ion Torrentシーケンシングは最高で400bpの核酸リードを生成し、454パイロシーケンシングは約700bpの核酸リードを生成し得る。さらに別の例では、単一分子リアルタイムシーケンシング方法は、10000bpから15000bpのリードを生成し得る。したがって、いくつかの実装形態では、核酸配列リードは、30～100bp、50～200bp、または50～400bpの長さを有する。
「サンプルリード」、「サンプル配列」、または「サンプルフラグメント」という用語は、サンプルからの対象のゲノム配列の配列データを指す。たとえば、サンプルリードは、フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列を有するPCRアンプリコンからの配列データを備える。配列データは、任意の配列選択方法から得られ得る。サンプルリードは、たとえば、sequencing-by-synthesis(SBS)反応、sequencing-by-ligation反応、または、そのために反復要素の長さおよび/または正体を決定することが望まれる任意の他の適切なシーケンシング方法からのものであり得る。サンプルリードは、複数のサンプルリードに由来するコンセンサス(たとえば、平均または加重)配列であり得る。いくつかの実装形態では、基準配列を提供することは、PCRアンプリコンのプライマー配列に基づいて対象座を特定することを備える。
「生フラグメント」という用語は、サンプルリードまたはサンプルフラグメント内で指定場所または二次的な対象場所と少なくとも部分的に重複する、対象のゲノム配列の部分に対する配列データを指す。生フラグメントの非限定的な例には、duplex stitchedフラグメント、simplex stitchedフラグメント、duplex un-stitchedフラグメント、およびsimplex un-stitchedフラグメントがある。「生」という用語は、生フラグメントがサンプルリードの中の潜在的なバリアントに対応しそれが本物であることを証明または確認する、支持バリアントを呈するかどうかにかかわらず、サンプルリードの中の配列データに対する何らかの関連を有する配列データを含むことを示すために使用される。「生フラグメント」という用語は、フラグメントが、サンプルリードの中のバリアントコールを妥当性確認する支持バリアントを必ず含むことを示さない。たとえば、サンプルリードが第1のバリアントを呈することが、バリアントコールアプリケーションによって決定されるとき、バリアントコールアプリケーションは、1つまたは複数の生フラグメントが、サンプルリードの中にそのバリアントがあるとすれば存在することが予想され得る対応するタイプの「支持」バリアントを欠いていることを決定し得る。
「マッピング」、「アラインメントされる」、「アラインメント」、または「アラインメントしている」という用語は、リードまたはタグを基準配列と比較し、それにより、基準配列がリード配列を含むかどうかを決定するプロセスを指す。基準配列がリードを含む場合、リードは、基準配列にマッピングされることがあり、またはいくつかの実装形態では、基準配列の中の特定の位置にマッピングされることがある。いくつかの場合、アラインメントは単に、リードが特定の基準配列のメンバーであるかどうか(すなわち、リードが基準配列の中に存在するかしないか)を伝える。たとえば、ヒト13番染色体の基準配列に対するリードのアラインメントは、リードが13番染色体の基準配列の中に存在するかどうかを伝える。この情報を提供するツールは、セットメンバーシップテスターと呼ばれ得る。いくつかの場合、アラインメントは追加で、リードまたはタグがマッピングする基準配列の中の位置を示す。たとえば、基準配列がヒトゲノム配列全体である場合、アラインメントは、リードが13番染色体上に存在することを示すことがあり、さらに、リードが13番染色体の特定の鎖および/またはサイトにあることを示すことがある。
「インデル」という用語は、生物体のDNAにおける塩基の挿入および/または欠失を指す。マイクロインデルは、1～50個のヌクレオチドの正味の変化をもたらすインデルを表す。ゲノムのコーディング領域において、インデルの長さが3の倍数ではない限り、インデルはフレームシフト変異を生み出す。インデルは点変異と対比され得る。インデルは配列からヌクレオチドを挿入または削除するが、点変異はDNAの全体の数を変えることなくヌクレオチドのうちの1つを置き換えるある形式の置換である。インデルは、タンデム塩基変異(TBM)とも対比することができ、TBMは隣接するヌクレオチドにおける置換として定義され得る(主に2つの隣接するヌクレオチドにおける置換、しかし3つの隣接するヌクレオチドにおける置換が観察されている)。
「バリアント」という用語は、核酸基準と異なる核酸配列を指す。典型的な核酸配列バリアントには、限定はされないが、一塩基多型(SNP)、短い欠失および挿入の多型(インデル)、コピー数変異(CNV)、マイクロサテライトマーカー、またはショートタンデムリピートおよび構造変異がある。体細胞バリアントコーリング(somatic variant calling)は、DNAサンプルにおいて低頻度に存在するバリアントを特定するための試みである。体細胞バリアントコーリングは、癌治療の文脈において関心の対象である。癌はDNAの変異の蓄積により引き起こされる。腫瘍からのDNAサンプルは一般に異質であり、いくつかの正常細胞、癌進行の早期段階にあるいくつかの細胞(少数の変異を伴う)、およびいくつかの後期段階の細胞(多数の変異を伴う)を含む。この異質さにより、(たとえば、FFPEサンプルから)腫瘍をシーケンシングするとき、体細胞突然変異がしばしば低頻度で現れる。たとえば、ある所与の塩基を含むリードの10%だけにおいて、SNVが見られることがある。バリアント分類器によって体細胞性または生殖細胞性であると分類されるべきバリアントは、「検定対象バリアント(variant under test)」とも本明細書では呼ばれる。
「ノイズ」という用語は、シーケンシングプロセスおよび/またはバリアントコールアプリケーションにおける1つまたは複数のエラーに起因する誤ったバリアントコールを指す。
「バリアント頻度」という用語は、割合または百分率で表される、ある集団の中の特定の座におけるアレル(遺伝子のバリアント)の相対的な頻度を表す。たとえば、この割合または百分率は、そのアレルを持つ集団の中のすべての染色体の割合であり得る。例として、サンプルバリアント頻度は、ある個人からの対象のゲノム配列について取得されたリードおよび/またはサンプルの数に対応する「集団」にわたる、対象のゲノム配列に沿った特定の座/場所におけるアレル/バリアントの相対的な頻度を表す。別の例として、基準バリアント頻度は、1つまたは複数の基準ゲノム配列に沿った特定の座/場所におけるアレル/バリアントの相対的な頻度を表し、リードおよび/またはサンプルの数に対応する「集団」は、正常な個人の集団からの1つまたは複数の基準ゲノム配列について取得される。
「バリアントアレイ頻度(VAF)」という用語は、標的場所における、バリアントと一致することが観察されたシーケンシングされたリードをカバレッジ全体で割った百分率を指す。VAFはバリアントを持つシーケンシングされたリードの比率の尺度である。
「場所」、「指定場所」、および「座」という用語は、ヌクレオチドの配列内の1つまたは複数のヌクレオチドの位置または座標を指す。「場所」、「指定場所」、および「座」という用語は、ヌクレオチドの配列の中の1つまたは複数の塩基対の位置または座標も指す。
「ハプロタイプ」という用語は、一緒に受け継がれる染色体上の隣接するサイトにおけるアレルの組合せを指す。ハプロタイプは、所与の座のセット間で組み換え事象が発生した場合にはその数に依存して、1つの座、いくつかの座、または染色体全体であり得る。
本明細書の「閾値」という用語は、サンプル、核酸、またはその一部(たとえば、リード)を特徴付けるためにカットオフとして使用される、数値または数字ではない値を指す。閾値は経験的な分析に基づいて変動し得る。閾値は、そのような値の示唆をもたらす源がある特定の方式で分類されるべきであるかどうかを決定するために、測定された値または計算された値と比較され得る。閾値は経験的または分析的に特定され得る。閾値の選択は、ユーザが分類を行うために有することを望む信頼性のレベルに依存する。閾値は特定の目的で(たとえば、感度と選択度のバランスをとるように)選ばれ得る。本明細書では、「閾値」という用語は、分析のコースが変更され得る点、および/または活動が惹起され得る点を示す。閾値は所定の数である必要はない。代わりに、閾値は、たとえば、複数の要因に基づく関数であり得る。閾値は状況に適応するものであり得る。その上、閾値は、上限、下限、または制限値間の範囲を示し得る。
いくつかの実装形態では、シーケンシングデータに基づく尺度またはスコアが閾値と比較され得る。本明細書では、「尺度」または「スコア」という用語は、シーケンシングデータから決定された値もしくは結果を含むことがあり、または、シーケンシングデータから決定された値もしくは結果に基づく関数を含むことがある。閾値と同様に、尺度またはスコアは状況に適応するものであり得る。たとえば、尺度またはスコアは正規化された値であり得る。スコアまたは尺度の例として、1つまたは複数の実装形態は、データを分析するときにカウントスコアを使用し得る。カウントスコアはサンプルリードの数に基づき得る。サンプルリードは1つまたは複数のフィルタリング段階を経ていることがあるので、サンプルリードは少なくとも1つの一般的な特性または品質を有する。たとえば、カウントスコアを決定するために使用されるサンプルリードの各々は、基準配列とアラインメントされていることがあり、または潜在的なアレルとして割り当てられることがある。一般的な特性を有するサンプルリードの数はリードカウントを決定するためにカウントされ得る。カウントスコアはリードカウントに基づき得る。いくつかの実装形態では、カウントスコアはリードカウントに等しい値であり得る。他の実装形態では、カウントスコアはリードカウントおよび他の情報に基づき得る。たとえば、カウントスコアは、遺伝子座の特定のアレルに対するリードカウントおよび遺伝子座に対するリードの総数に基づき得る。いくつかの実装形態では、カウントスコアは、遺伝子座に対するリードカウントおよび以前に得られたデータに基づき得る。いくつかの実装形態では、カウントスコアは複数の所定の値の間の正規化されたスコアであり得る。カウントスコアはまた、サンプルの他の座からのリードカウントの関数、または対象サンプルと同時に実行された他のサンプルからのリードカウントの関数であり得る。たとえば、カウントスコアは、特定のアレルのリードカウントおよびサンプルの中の他の座のリードカウントおよび/または他のサンプルからのリードカウントの関数であり得る。一例として、他の座からのリードカウントおよび/または他のサンプルからのリードカウントが、特定のアレルに対するカウントスコアを正規化するために使用され得る。
「カバレッジ」または「フラグメントカバレッジ」という用語は、配列の同じフラグメントに対するサンプルリードの数のカウントまたは他の尺度を指す。リードカウントは対応するフラグメントをカバーするリードの数のカウントを表し得る。あるいは、カバレッジは、履歴の知識、サンプルの知識、座の知識などに基づく指定された係数を、リードカウントと乗じることによって決定され得る。
「リード深さ」(慣習的に「×」が後に続く数)という用語は、標的場所における重複するアラインメントを伴うシーケンシングされたリードの数を指す。これはしばしば、平均として、または間隔(エクソン、遺伝子、またはパネルなど)のセットにわたってカットオフを超える百分率として表される。たとえば、パネル平均カバレッジが1.105×であり、カバーされる標的塩基の98%が>100×であるということを、臨床報告が述べることがある。
「塩基コール品質スコア」または「Qスコア」という用語は、単一のシーケンシングされた塩基が正しい確率に反比例する、0～50の範囲のPHREDスケーリングされた確率を指す。たとえば、Qが20であるT塩基コールは、99.99%の確率を伴い正しい可能性が高いと見なされる。Q<20であるあらゆる塩基コールは低品質であると見なされるべきであり、バリアントを支持するシーケンシングされたリードのかなりの部分が低品質であるようなあらゆる特定されたバリアントは、偽陽性の可能性があると見なされるべきである。
「バリアントリード」または「バリアントリード数」という用語は、バリアントの存在を支持するシーケンシングされたリードの数を指す。
「鎖状態」(またはDNA鎖状態)に関して、DNAにおける遺伝的メッセージは、文字A、G、C、およびTの列として表され得る。たとえば、5'-AGGACA-3'である。しばしば、配列はここで示される方向で、すなわち、5'末端を左側に、3'末端を右側にして書かれる。DNAは時々(一部のウイルスのように)単鎖分子として存在することがあるが、普通は、DNAは二本鎖のユニットとして見出される。DNAは、2つの逆平行の鎖を持つ二重螺旋構造を有する。この場合、「逆平行」という言葉は、2つの鎖が平行であるが、逆の極性を有することを意味する。二本鎖DNAは、塩基間のペアリングによって一緒に保持され、このペアリングは常に、アデニン(A)がチミン(T)とペアになり、シトシン(C)がグアニン(G)とペアになるようなものである。このペアリングは相補性と呼ばれ、DNAの一方の鎖が他方の鎖の相補鎖であると言われる。したがって、二本鎖DNAは5'-AGGACA-3'および3'-TCCTGT-5'のように、2つの文字列として表され得る。2つの鎖は反対の極性を有することに留意されたい。したがって、2つのDNA鎖の鎖状態は、基準鎖およびその相補鎖、順鎖および逆鎖、上鎖および下鎖、センス鎖およびアンチセンス鎖、またはワトソン鎖およびクリック鎖と呼ばれ得る。
リードアラインメント(リードマッピングとも呼ばれる)は、配列がゲノムの中のどこに由来するかを見つけ出すプロセスである。アラインメントが実行されると、所与のリードの「マッピング品質」または「マッピング品質スコア(MAPQ)」が、ゲノム上のリードの場所が正しい確率を定量化する。マッピング品質はphred scaleで符号化され、ここでPはアラインメントが正しくない確率である。確率はP=10(-MAQ/10)として計算され、ここでMAPQはマッピング品質である。たとえば、40というマッピング品質=10の-4乗であり、これはリードが誤ってアラインメントされた確率が0.01%であることを意味する。したがって、マッピング品質は、リードの塩基品質、基準ゲノムの複雑さ、およびペアエンド情報などの、いくつかのアラインメントの要因と関連付けられる。第1のものに関して、リードの塩基品質が低い場合、それは、観察された配列が誤っている可能性があり、したがってそのアラインメントが誤っていることを意味する。第2のものに関して、マッピング可能性はゲノムの複雑さを指す。繰り返し領域はマッピングがより難しく、これらの領域に該当するリードは通常低いマッピング品質を得る。この文脈では、MAPQは、リードが一意にアラインメントされず、それらの本当の由来を決定できないという事実を反映する。第3のものに関して、ペアエンドシーケンシングデータの場合、合致するペアは、良好にアラインメントされる可能性がより高い。マッピング品質が高いほど、アラインメントは良くなる。良好なマッピング品質でリードがアラインメントされるリードは通常、リード配列が良好であったことと、マッピング可能性の高い領域においてミスマッチがほとんどない状態でアラインメントされたこととを意味する。MAPQ値は、アラインメント結果の品質管理として使用され得る。通常は、20より高いMAPQとアラインメントされるリードの部分が、下流分析のためのものである。
シーケンシングプロセス
本明細書に記載される実装形態は、配列の変異を特定するために核酸配列を分析することに適用可能であり得る。実装形態は、遺伝子の場所/座の潜在的なバリアント/アレルを分析し、遺伝子座の遺伝子型を決定するために、言い換えると、座に対する遺伝子型コールを提供するために使用され得る。例として、核酸配列は、米国特許出願公開第2016/0085910号および米国特許出願公開第2013/0296175号において説明される方法およびシステムに従って分析されることがあり、これらの出願公開の完全な主題の全体が、本明細書において参照によって明確に引用される。
一実装形態では、シーケンシングプロセスは、DNAなどの核酸を含む、または含むことが疑われるサンプルを受け取ることを含む。サンプルは、動物(たとえばヒト)、植物、バクテリア、または菌類などの、既知のまたは未知の源からのものであり得る。サンプルは源から直接採取され得る。たとえば、血液または唾液が個体から直接採取され得る。代わりに、サンプルは源から直接採取されないことがある。次いで、1つまたは複数のプロセッサは、シーケンシングのためのサンプルを調製するようにシステムに指示する。この調製は、外来の物質を除去することおよび/または何らかの物質(たとえば、DNA)を隔離することを含み得る。生体サンプルは、特定のアッセイのための特徴を含むように調製され得る。たとえば、生体サンプルは、sequencing-by-synthesis(SBS)のために調製され得る。いくつかの実装形態では、調製することは、ゲノムのいくつかの領域の増幅を含み得る。たとえば、調製することは、STRおよび/またはSNRを含むことが知られている所定の遺伝子座を増幅することを含み得る。遺伝子座は、所定のプライマー配列を使用して増幅され得る。
次に、1つまたは複数のプロセッサは、サンプルをシーケンシングするようにシステムに指示する。シーケンシングは、様々な既知のシーケンシングプロトコルを通じて実行され得る。特定の実装形態では、シーケンシングはSBSを含む。SBSでは、複数の蛍光ラベリングされたヌクレオチドが、光学基板の表面(たとえば、フローセルの中のチャネルを少なくとも部分的に画定する表面)上に存在する増幅されたDNAの複数のクラスタ(場合によっては数百万個のクラスタ)をシーケンシングするために使用される。フローセルはシーケンシングのための核酸サンプルを含むことがあり、ここでフローセルは適切なフローセルホルダ内に配置される。
核酸は、未知の標的配列に隣接する既知のプライマー配列を備えるように調製され得る。最初のSBSシーケンシングサイクルを開始するために、1つまたは複数の異なるようにラベリングされたヌクレオチド、およびDNAポリメラーゼなどが、流体サブシステムによってフローセルの中へと/フローセルを通って流され得る。単一のタイプのヌクレオチドが一度に追加されるか、または、シーケンシング手順において使用されるヌクレオチドが反転可能な末端の性質を持つように特別に設計されるかのいずれかであってよく、これにより、シーケンシング反応の各サイクルが、いくつかのタイプのラベリングされたヌクレオチド(たとえば、A、C、T、G)の存在下で同時に発生することが可能になる。ヌクレオチドは、蛍光色素などの検出可能なラベル部分を含み得る。4つのヌクレオチドが一緒に混合される場合、ポリメラーゼは組み込むべき正しい塩基を選択することが可能であり、各配列は一塩基だけ延長される。組み込まれないヌクレオチドは、洗浄液をフローセルに流すことによって洗い落とされ得る。1つまたは複数のレーザーが、核酸を励起して蛍光を誘導し得る。核酸から放出される蛍光は組み込まれた塩基の蛍光色素に基づき、異なる蛍光色素は異なる波長の放出光を放出し得る。デブロッキング試薬が、延長され検出されたDNA鎖から反転可能な末端グループを除去するためにフローセルに追加され得る。次いでデブロッキング試薬が、洗浄液をフローセルに流すことによって洗い落とされ得る。そうすると、フローセルは、上に記載されたようなラベリングされたヌクレオチドの導入で開始するシーケンシングのさらなるサイクルの準備ができる。流体および検出の操作は、シーケンシングの実行を完了するために何回か繰り返され得る。例示的なシーケンシング方法は、たとえば、Bentley他、Nature 456:53-59(2008)、国際特許出願公開第WO 04/018497号、米国特許第7057026号、国際特許出願公開第WO 91/06678号、国際特許出願公開第WO 07/123744号、米国特許第7329492号、米国特許第7211414号、米国特許第7315019号、米国特許第7405281号、および米国特許出願公開第2008/0108082号において説明されており、これらの各々が参照によって本明細書において引用される。
いくつかの実装形態では、核酸は表面に付着され、シーケンシングの前または間に増幅され得る。たとえば、増幅は、表面上に核酸クラスタを形成するためにブリッジ増幅を使用して行われ得る。有用なブリッジ増幅方法は、たとえば、米国特許第5641658号、米国特許出願公開第2002/0055100号、米国特許第7115400号、米国特許出願公開第2004/0096853号、米国特許出願公開第2004/0002090号、米国特許出願公開第2007/0128624号、および米国特許出願公開第2008/0009420号において説明されており、これらの各々の全体が参照によって本明細書において引用される。表面上で核酸を増幅するための別の有用な方法は、たとえば、Lizardi他、Nat. Genet. 19:225-232(1998)、および米国特許出願公開第2007/0099208A1号において説明されるようなローリングサークル増幅(RCA)であり、これらの各々が参照によって本明細書において引用される。
1つの例示的なSBSプロトコルは、たとえば、国際特許出願公開第WO 04/018497号、米国特許出願公開第2007/0166705A1号、および米国特許第7057026号において説明されるような、除去可能な3'ブロックを有する修正されたヌクレオチドを利用し、これらの各々が参照によって本明細書において引用される。たとえば、SBS試薬の反復されるサイクルが、たとえばブリッジ増幅プロトコルの結果として、標的核酸が付着されたフローセルに導入され得る。核酸クラスタは、直線化溶液を使用して単鎖の形態へと変換され得る。直線化溶液は、たとえば、各クラスタの1本の鎖を開裂することが可能な制限エンドヌクレアーゼを含み得る。とりわけ化学開裂(たとえば、過ヨード酸塩を用いたジオール結合の開裂)、熱またはアルカリへの曝露によるエンドヌクレアーゼ(たとえば、米国マサチューセッツ州イプスウィッチのNEBにより供給されるような「USER」、部品番号M5505S)を用いた開裂による無塩基サイトの開裂、そうされなければデオキシリボヌクレオチドからなる増幅産物へと組み込まれるリボヌクレオチドの開裂、光化学開裂またはペプチドリンカーの開裂を含む、開裂の他の方法が、制限酵素またはニッキング酵素に対する代替として使用され得る。直線化操作の後で、シーケンシングプライマーは、シーケンシングされるべき標的核酸へのシーケンシングプライマーのハイブリダイゼーションのための条件下で、フローセルに導入され得る。
次いで、フローセルが、単一のヌクレオチドの追加によって各標的核酸にハイブリダイゼーションされるプライマーを延長するための条件下で、除去可能な3'ブロックおよび蛍光ラベルを伴う修正されたヌクレオチドを有するSBS延長試薬と接触させられ得る。単一のヌクレオチドだけが各プライマーに追加され、それは、修正されたヌクレオチドが、シーケンシングされているテンプレートの領域と相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖へと組み込まれると、さらなる配列延長を指示するために利用可能な自由な3'-OH基がないので、ポリメラーゼがさらなるヌクレオチドを追加できないからである。SBS延長試薬は、除去され、放射線による励起のもとでサンプルを保護する構成要素を含む走査試薬により置き換えられ得る。走査試薬の例示的な構成要素は、米国特許出願公開第2008/0280773A1号および米国特許出願第13/018255号において説明され、これらの各々が参照によって本明細書に引用される。次いで、延長された核酸が、走査試薬の存在下で蛍光により検出され得る。蛍光が検出されると、3'ブロックが、使用されるブロッキンググループに適切なデブロック試薬を使用して除去され得る。それぞれのブロッキンググループに対して有用な例示的なデブロック試薬は、国際特許出願公開第WO004018497号、米国特許出願公開第2007/0166705A1号、および米国特許第7057026号において説明されており、これらの各々が参照によって本明細書において引用される。デブロック試薬は、3'OH基を有する延長されたプライマーにハイブリダイゼーションされる標的核酸を残して洗浄されてよく、このプライマーはこれで、さらなるヌクレオチドの追加が可能になる。したがって、延長試薬、走査試薬、およびデブロック試薬を追加するサイクルは、操作のうちの1つまたは複数の間の任意選択の洗浄とともに、所望の配列が得られるまで繰り返され得る。上記のサイクルは、修正されたヌクレオチドの各々に異なるラベルが付けられているとき、特定の塩基に対応することが知られている、サイクルごとに単一の延長試薬導入操作を使用して行われ得る。異なるラベルが、各組み込み操作の間に追加されるヌクレオチドの区別を容易にする。代わりに、各サイクルは、延長試薬導入の別個の操作と、それに続く走査試薬導入と検出の別個の操作とを含むことがあり、この場合、ヌクレオチドのうちの2つ以上が同じラベルを有することが可能であり、それらを導入の既知の順序に基づいて区別することができる。
シーケンシング操作は特定のSBSプロトコルに関して上で論じられたが、シーケンシングのための他のプロトコルおよび様々な他の分子分析法のいずれもが、必要に応じて行われ得ることが理解されるであろう。
次いで、システムの1つまたは複数のプロセッサは、後続の分析のためのシーケンシングデータを受け取る。シーケンシングデータは、.BAMファイルなどの様々な方式でフォーマットされ得る。シーケンシングデータは、たとえばいくつかのサンプルリードを含み得る。シーケンシングデータは、ヌクレオチドの対応するサンプル配列を有する複数のサンプルリードを含み得る。1つだけのサンプルリードが論じられるが、シーケンシングデータは、たとえば、数百個、数千個、数十万個、または数百万個のサンプルリードを含み得ることを理解されたい。異なるサンプルリードは異なる数のヌクレオチドを有し得る。たとえば、サンプルリードは、10個のヌクレオチドから約500個以上のヌクレオチドにまでわたり得る。サンプルリードは源のゲノム全体にわたり得る。一例として、サンプルリードは、疑わしいSTRまたは疑わしいSNPを有する遺伝子座などの、所定の遺伝子座の方を向いている。
各サンプルリードは、サンプル配列、サンプルフラグメント、または標的配列と呼ばれ得る、ヌクレオチドの配列を含み得る。サンプル配列は、たとえば、プライマー配列、フランキング配列、および標的配列を含み得る。サンプル配列内のヌクレオチドの数は、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個以上を含み得る。いくつかの実装形態では、サンプルリード(またはサンプル配列)のうちの1つまたは複数は、少なくとも150個のヌクレオチド、200個のヌクレオチド、300個のヌクレオチド、400個のヌクレオチド、500個のヌクレオチド、またはそれより多くを含む。いくつかの実装形態では、サンプルリードは、1000個を超えるヌクレオチド、2000個を超えるヌクレオチド、またはそれより多くを含み得る。サンプルリード(またはサンプル配列)は、一端または両端にプライマー配列を含み得る。
次に、1つまたは複数のプロセッサは、シーケンシングデータを分析して、潜在的なバリアントコールおよびサンプルバリアントコールのサンプルバリアント頻度を取得する。この操作は、バリアントコールアプリケーションまたはバリアントコーラとも呼ばれ得る。したがって、バリアントコーラはバリアントを特定または検出し、バリアント分類器は検出されたバリアントを体細胞性または生殖細胞性であるものとして分類する。代替的なバリアントコーラが本明細書の実装形態に従って利用されることがあり、ここで、異なるバリアントコーラは、実行されているシーケンシング操作のタイプ、対象のサンプルの特徴などに基づき使用され得る。バリアントコールアプリケーションの1つの非限定的な例は、https://github.com/Illumina/Piscesにおいてホストされ、論説Dunn, TamsenおよびBerry, GwennおよびEmig-Agius, DorotheaおよびJiang, YuおよびIyer, AnitaおよびUdar, NitinおよびStromberg, Michael、(2017)、Pisces: An Accurate and Versatile Single Sample Somatic and Germline Variant Caller、595-595、10.1145/3107411.3108203において説明される、Illumina Inc.(カリフォルニア州サンディエゴ)によるPisces(商標)アプリケーションであり、上記の論説の完全な主題の全体が、参照によって本明細書において引用される。
そのようなバリアントコールアプリケーションは4つの順番に実行されるモジュールを備え得る。
(1)Pisces Read Stithcer:BAMの中の対になっているリード(同じ分子のリード1およびリード2)をコンセンサスリードへとステッチングすることによってノイズを減らす。出力はステッチングされたBAMである。
(2)Pisces Variant Caller:小さいSNV、挿入および欠失をコールする。Piscesは、リード境界、基本的なフィルタリングアルゴリズム、および単純なポワソンベースのバリアント信頼性スコアリングアルゴリズムによって分解される、合祖バリアントへのバリアント折り畳み(variant-collapsing)アルゴリズムを含む。出力はVCFである。
(3)Pisces Variant Quality Recalibrator(VQR):バリアントコールが熱損傷またはFFPE脱アミノ化と関連付けられるパターンに圧倒的に従う場合、VQRステップは疑わしいバリアントコールのバリアントQスコアを下げる。出力は調整されたVCFである。
(4)Pisces Variant Phaser(Scylla):クローンの亜集団から少数のバリアントを複雑なアレルへと組み立てるために、read-backed greedy clustering法を使用する。このことは、下流のツールによる機能的な結果のより正確な決定を可能にする。出力は調整されたVCFである。
加えて、または代わりに、この操作は、https://github.com/Illumina/strelkaにおいてホストされ、論説T Saunders, ChristopherおよびWong, WendyおよびSwamy, SajaniおよびBecq, JenniferおよびJ Murray, LisaおよびCheetham, Keira、(2012)、Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs、Bioinformatics (Oxford, England)、28、1811-7、10.1093/bioinformatics/bts271において説明される、Illumina Inc.によるバリアントコールアプリケーションStrelka(商標)アプリケーションを利用することがあり、上記の論説の完全な主題の全体が、参照によって本明細書において明確に引用される。さらに、加えて、または代わりに、この操作は、https://github.com/Illumina/strelkaにおいてホストされ、論説Kim, S、Scheffler, K、Halpern, A.L.、Bekritsky, M.A、Noh, E、Kallberg, M、Chen, X、Beyter, D、Krusche, P、およびSaunders, C.T、(2017)、Strelka2: Fast and accurate variant calling for clinical sequencing applicationsにおいて説明される、Illumina Inc.によるバリアントコールアプリケーションStrelka2(商標)アプリケーションを利用することがあり、上記の文書の完全な主題の全体が、参照によって本明細書において明確に引用される。その上、加えて、または代わりに、この操作は、https://github.com/Illumina/Nirvana/wikiにおいてホストされ、論説Stromberg, MichaelおよびRoy, RajatおよびLajugie, JulienおよびJiang, YuおよびLi, HaochenおよびMargulies, Elliott、(2017)、Nirvana: Clinical Grade Variant Annotator、596-596、10.1145/3107411.3108204において説明される、Illumina Inc.によるNirvana(商標)アプリケーションなどのバリアントアノテーション/コールツールを利用することがあり、上記の文書の完全な主題の全体が、参照によって本明細書において明確に引用される。
そのようなバリアントアノテーション/コールツールは、Nirvanaにおいて開示されるものなどの異なるアルゴリズム技法を適用することができる。
a.区間アレイ(Interval Array)を用いてすべての重複する転写産物を特定する。機能的なアノテーションのために、バリアントと重複するすべての転写産物を特定することができ、区間木を使用することができる。しかしながら、区間のセットは静的であり得るので、区間木を区間アレイへとさらに最適化することが可能であった。区間木は、O(min(n,k lg n))時間においてすべての重複する転写産物を返し、ここでnは木の中の区間の数であり、kは重複する区間の数である。実際には、kは大半のバリアントに対してnと比較して本当に小さいので、区間木上での実効的なランタイムはO(k lg n)である。我々は、最初の重複する区間を見つけて、次いで残りの(k-1)にわたって数え上げるだけでよいように、ソートされたアレイにすべての区間が記憶されるような区間アレイを作成することによって、O(lg n+k)へと改善した。
b.CNV/SV(Yu):コピー数変異および構造変異のためのアノテーションが提供され得る。小さいバリアントのアノテーションと同様に、SVと重複する転写産物、および以前に報告された構造変異も、オンラインデータベースにおいてアノテートされ得る。小さいバリアントと異なり、すべての重複する転写産物がアノテートされる必要はなく、それは、あまりにも多くの転写産物が大きなSVと重複するからである。代わりに、部分的な重複遺伝子に属するすべての重複する転写産物がアノテートされ得る。具体的には、これらの転写産物に対して、影響を受けるイントロン、エクソン、および構造変異により引き起こされる結果が報告され得る。すべての重複する転写産物の出力を許可するための選択肢が可能であるが、遺伝子名、転写産物との正規の(canonical)重複であるか部分的な重複であるかのフラグなどの、これらの転写産物の基本情報が報告され得る。各SV/CNVに対して、これらのバリアントが研究されているかどうか、および異なる集団におけるそれらの頻度を知ることも関心事である。したがって、1000 genomes、DGV、およびClinGenなどの外部データベースにおいて重複するSVを報告した。どのSVが重複しているかを決定するための恣意的なカットオフを使用するのを避けるために、代わりに、すべての重複する転写産物が使用されてよく、相互の重複率、すなわち、重複する長さをこれらの2つのSVの長さのうちの短い方で割ったものが計算されてよい。
c.補足アノテーションを報告する。補足アノテーションには、小さいバリアントと構造バリアント(SV)という2つのタイプがある。SVは、区間としてモデル化されてよく、重複するSVを特定するために上で論じられた区間アレイを使用することができる。小さいバリアントは、点としてモデル化され、場所および(任意選択で)アレルによって照合される。したがって、それらは二分探索様のアルゴリズムを使用して検索される。補足アノテーションデータベースは非常に大きいことがあるので、補足アノテーションが存在するファイル位置に染色体場所をマッピングするために、はるかにより小さなインデックスが作成される。インデックスは、場所を使用して二分探索され得るオブジェクト(染色体場所とファイル位置からなる)のソートされたアレイである。インデックスサイズを小さく保つために、(ある最大のカウントまでの)複数の場所が、第1の場所の値と後続の場所に対する差分のみを記憶する1つのオブジェクトへと圧縮される。二分探索を使用するので、ランタイムはO(lg n)であり、nはデータベースの中の項目の数である。
d.VEPキャッシュファイル
e.転写産物データベース:転写産物キャッシュ(キャッシュ)および補足データベース(SAdb)ファイルは、転写産物および補足アノテーションなどのデータオブジェクトのシリアル化されたダンプである。キャッシュのためのデータソースとして、Ensembl VEPキャッシュを使用する。キャッシュを作成するために、すべての転写産物が区間アレイに挿入され、アレイの最終状態がキャッシュファイルに記憶される。したがって、アノテーションの間に、事前に計算された区間アレイをロードしてそれについて探索を実行するだけでよい。キャッシュはメモリへとロードされて探索は非常に高速(上で説明された)であるため、重複する転写産物を見つけることはNirvanaにおいては非常に高速である(総ランタイムの1%未満であると鑑定されている?)。
f.補足データベース:SAdbのデータソースは補足材料のもとで列挙される。小さいバリアントに対するSAdbは、データベースの中の各オブジェクト(参照名および場所によって特定される)がすべての関連する補足アノテーションを保持するように、すべてのデータソースのk-wayマージによって生み出される。データソースファイルを解析する間に遭遇する問題は、Nirvanaのホームページにおいて詳細に文書化されている。メモリ使用量を制限するために、SAインデックスのみがメモリにロードされる。このインデックスは、補足アノテーションのためのファイル位置の高速なルックアップを可能にする。しかしながら、データはディスクからフェッチされなければならないので、補足アノテーションを追加することは、Nirvanaの最大のボトルネックであると特定されている(総ランタイムの約30%であると鑑定されている)。
g.結果および配列オントロジー(Consequence and Sequence Ontology):Nirvanaの機能的アノテーション(提供されるとき)は、Sequence Ontology(SO)(http://www.sequenceontology.org/)ガイドラインに従う。時として、現在のSOにおける問題を特定して、アノテーションの状態を改善するためにSOチームと協力する機会があった。
そのようなバリアントアノテーションツールは、前処理を含み得る。たとえば、Nirvanaは、ExAC、EVS、1000 Genomes project、dbSNP、ClinVar、Cosmic、DGV、およびClinGenのような、外部データソースからの多数のアノテーションを含んでいた。これらのデータベースを完全に利用するには、それらからの情報をサニタイジングしなければならない。我々は、様々なデータソースからの存在する様々な矛盾に対処するための異なる戦略を実施した。たとえば、同じ場所および代替のアレルに対する複数のdbSNPエントリがある場合、すべてのidをカンマで分けられたidのリストへと加える。同じアレルに対する異なるCAF値を伴う複数のエントリがある場合、第1のCAF値を使用する。矛盾するExACエントリとEVSエントリに対して、サンプルカウントの数を考慮し、よりサンプルカウントの高いエントリが使用される。1000 Genome Projectsでは、矛盾するアレルのアレル頻度を除去した。別の問題は不正確な情報である。我々は主に、1000 Genome Projectsからアレル頻度情報を抽出したが、GRCh38について、情報フィールドにおいて報告されているアレル頻度が利用可能ではない遺伝子型を伴うサンプルを除外していないことに気付き、これは、すべてのサンプルに対して利用可能ではないバリアントに対する頻度の低下につながる。我々のアノテーションの正確さを保証するために、個体レベルの遺伝子型のすべてを使用して真のアレル頻度を計算する。知られているように、同じバリアントは異なるアラインメントに基づく異なる表現を有し得る。すでに特定されたバリアントについての情報を正確に報告できることを確実にするために、異なるリソースからのバリアントを前処理してそれらを一貫した表現にしなければならない。すべての外部データソースに対して、基準アレルと代替アレルの両方における重複したヌクレオチドを除去するためにアレルをトリミングした。ClinVarについては、xmlファイルを直接解析し、すべてのバリアントに対する5'アラインメントを実行した。この手法はしばしばvcfファイルにおいて使用される。異なるデータベースは同じ情報のセットを含み得る。不必要な重複を避けるために、一部の重複した情報を除去した。たとえば、1000 genomesにおけるこれらのバリアントをより詳細な情報とともにすでに報告したので、1000 genome projectsをデータソースとして有するDGVの中のバリアントを除去した。
少なくともいくつかの実装形態によれば、バリアントコールアプリケーションは、低頻度バリアント、生殖細胞系コーリングなどに対するコールを提供する。非限定的な例として、バリアントコールアプリケーションは、腫瘍のみのサンプルおよび/または腫瘍-正常ペアサンプルに対して実行され得る。バリアントコールアプリケーションは、一塩基変異(SNV)、多塩基変異(MNV)、インデルなどを探索し得る。バリアントコールアプリケーションは、バリアントを特定しながら、シーケンシングまたはサンプル調製エラーによる不一致をフィルタリングする。各バリアントに対して、バリアントコーラは、基準配列、バリアントの場所、および可能性のあるバリアント配列(たとえば、AからCへのSNV、またはAGからAへの欠失)を特定する。バリアントコールアプリケーションは、サンプル配列(またはサンプルフラグメント)、基準配列/フラグメント、およびバリアントコールを、バリアントが存在することを示すものとして特定する。バリアントコールアプリケーションは、生フラグメントを特定し、生フラグメントの指定、潜在的なバリアントコールを検証する生フラグメントの数のカウント、支持バリアントが発生した生フラグメント内での場所、および他の関連する情報を特定し得る。生フラグメントの非限定的な例には、duplex stitchedフラグメント、simplex stitchedフラグメント、duplex un-stitchedフラグメント、およびsimplex un-stitchedフラグメントがある。
バリアントコールアプリケーションは、.VCFファイルまたは.GVCFファイルなどの様々なフォーマットでコールを出力し得る。単なる例として、バリアントコールアプリケーションは、MiSeqReporterパイプラインに含まれ得る(たとえば、MiSeq(登録商標)シーケンサ装置で実装されるとき)。任意選択で、このアプリケーションは様々なワークフローを用いて実装され得る。分析は、所望の情報を得るために指定された方式でサンプルリードを分析する、単一のプロトコルまたはプロトコルの組合せを含み得る。
次いで、1つまたは複数のプロセッサは、潜在的なバリアントコールに関連して妥当性確認操作を実行する。妥当性確認操作は、以下で説明されるように、品質スコア、および/または階層化された検定のヒエラルキーに基づき得る。妥当性確認操作が、潜在的なバリアントコールを確証または実証するとき、妥当性確認操作は(バリアントコールアプリケーションからの)バリアントコール情報をサンプル報告生成器に渡す。代わりに、妥当性確認操作が潜在的なバリアントコールを無効とするとき、または失格と判定するとき、妥当性確認操作は対応する指示(たとえば、否定的インジケータ、コールなしインジケータ、無効コールインジケータ)をサンプル報告生成器に渡す。妥当性確認操作はまた、バリアントコールが正しいことまたは無効なコール指定が正しいことの信頼性の程度に関する信頼性スコアを渡し得る。
次に、1つまたは複数のプロセッサがサンプル報告を生成して記憶する。サンプル報告は、たとえば、サンプルに関する複数の遺伝子座に関する情報を含み得る。たとえば、遺伝子座の所定のセットの各遺伝子座に対して、サンプル報告は、遺伝子型コールを提供すること、遺伝子型コールを行えないことを示すこと、遺伝子型コールの確実さについての信頼性スコアを提供すること、または、1つまたは複数の遺伝子座に関するアッセイについての潜在的な問題を示すことのうちの少なくとも1つを行い得る。サンプル報告はまた、サンプルを提供した個体の性別を示し、かつ/またはサンプルが複数の源を含むことを示し得る。本明細書では、「サンプル報告」は、ある遺伝子座もしくは遺伝子座の所定のセットのデジタルデータ(たとえば、データファイル)および/または遺伝子座もしくは遺伝子座のセットの印刷された報告を含み得る。したがって、生成することまたは提供することは、データファイルを作成することおよび/もしくはサンプル報告を印刷すること、またはサンプル報告を表示することを含み得る。
サンプル報告は、バリアントコールが決定されたが妥当性確認されなかったことを示すことがある。バリアントコールが無効であると決定されるとき、サンプル報告は、バリアントコールの妥当性を確認できないという決定の基礎に関する追加の情報を示し得る。たとえば、報告の中の追加の情報は、生フラグメントの記述と、生フラグメントがバリアントコールを支持または否定する程度(たとえば、カウント)とを含み得る。加えて、または代わりに、報告の中の追加の情報は、本明細書で説明される実装形態に従って得られる品質スコアを含み得る。
バリアントコールアプリケーション
本明細書で開示される実装形態は、潜在的なバリアントコールを特定するためにシーケンシングデータを分析することを含む。バリアントコールは、以前に実行されたシーケンシング操作について記憶されたデータに対して実行され得る。加えて、または代わりに、バリアントコーリングは、シーケンシング操作が実行されている間にリアルタイムで実行され得る。サンプルリードの各々が、対応する遺伝子座を割り当てられる。サンプルリードは、サンプルリードのヌクレオチドの配列、または言い換えると、サンプルリード内のヌクレオチドの順序(たとえば、A、C、G、T)に基づいて、対応する遺伝子座に割り当てられ得る。この分析に基づいて、サンプルリードは、特定の遺伝子座の潜在的なバリアント/アレルを含むものとして指定され得る。サンプルリードは、遺伝子座の潜在的なバリアント/アレルを含むものとして指定された他のサンプルリードとともに収集(または集約または貯蔵)され得る。割当て操作はコーリング操作とも呼ばれることがあり、コーリング操作において、サンプルリードは特定の遺伝子場所/座と関連付けられる可能性があるものとして特定される。サンプルリードは、サンプルリードを他のサンプルリードから区別するヌクレオチドの1つまたは複数の識別配列(たとえば、プライマー配列)を位置特定するために分析され得る。より具体的には、識別配列は、特定の遺伝子座と関連付けられるものとしてサンプルリードを他のサンプルリードから特定し得る。
割当て操作は、識別配列の一連のn個のヌクレオチドが選択配列のうちの1つまたは複数と実質的に一致するかどうかを決定するために、識別配列の一連のn個のヌクレオチドを分析することを含み得る。特定の実装形態では、割当て操作は、サンプル配列の最初のn個のヌクレオチドが選択配列のうちの1つまたは複数と実質的に一致するかどうかを決定するために、サンプル配列の最初のn個のヌクレオチドを分析することを含み得る。数nは様々な値を有することがあり、この値はプロトコルへとプログラムされることがあり、またはユーザにより入力されることがある。たとえば、数nは、データベース内の最短の選択配列のヌクレオチドの数として定義され得る。数nは所定の数であり得る。所定の数は、たとえば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のヌクレオチドであり得る。しかしながら、他の実装形態では、より少数または多数のヌクレオチドが使用され得る。数nはまた、システムのユーザなどの個人によって選択されてもよい。数nは1つまたは複数の条件に基づき得る。たとえば、数nは、データベース内の最短のプライマー配列のヌクレオチドの数または指定された数のうちの小さい方の数として定義され得る。いくつかの実装形態では、15個未満のヌクレオチドであるあらゆるプライマー配列が例外として指定され得るように、15などのnの最小値が使用され得る。
いくつかの場合、識別配列の一連のn個のヌクレオチドは、選択配列のヌクレオチドと正確に一致しないことがある。それでも、識別配列は、選択配列とほぼ同一である場合、選択配列と実質的に一致し得る。たとえば、識別配列の一連のn個のヌクレオチド(たとえば、最初のn個のヌクレオチド)が、不一致が指定された数(たとえば、3)を超えずに、かつ/またはシフトが指定された数(たとえば、2)を超えずに、選択配列と一致する場合、サンプルリードが遺伝子座に対してコールされ得る。各不一致またはシフトが、サンプルリードとプライマー配列との間の差としてカウントされ得るように、規則が確立され得る。差の数が指定された数未満である場合、サンプルリードは、対応する遺伝子座(すなわち、対応する遺伝子座に割り当てられる)に対してコールされ得る。いくつかの実装形態では、サンプルリードの識別配列と遺伝子座に関連付けられる選択配列との間の差の数に基づく、マッチングスコアが決定され得る。マッチングスコアが指定されたマッチング閾値に合格する場合、選択配列に対応する遺伝子座は、サンプルリードに対する潜在的な座として指定され得る。いくつかの実装形態では、サンプルリードが遺伝子座に対してコールされるかどうかを決定するために、後続の分析が実行され得る。
サンプルリードがデータベースの中の選択配列のうちの1つと実質的に一致する(すなわち、厳密に一致する、または上で説明されたようにほぼ一致する)場合、サンプルリードは、選択配列と相関する遺伝子座に割り当てられ、または指定される。これは、座コーリングまたは予備的座コーリングと呼ばれることがあり、選択配列に相関する遺伝子座に対してサンプルリードがコールされる。しかしながら、上で論じられたように、サンプルリードは2つ以上の遺伝子座に対してコールされ得る。そのような実装形態では、潜在的な遺伝子座のうちの1つだけに対するサンプルリードをコールするために、または割り当てるために、さらなる分析が実行され得る。いくつかの実装形態では、基準配列のデータベースと比較されるサンプルリードは、ペアエンドシーケンシングからの最初のリードである。ペアエンドシーケンシングを実行するとき、サンプルリードに相関する第2のリード(生フラグメントを表す)が得られる。割当ての後で、割り当てられたリードについて実行される後続の分析は、割り当てられたリードに対してコールされた遺伝子座のタイプに基づき得る。
次に、潜在的なバリアントコールを特定するために、サンプルリードが分析される。とりわけ、分析の結果は、潜在的なバリアントコール、サンプルバリアント頻度、基準配列、および対象のゲノム配列内でのバリアントが発生した場所を特定する。たとえば、遺伝子座がSNPを含むことが知られている場合、遺伝子座に対してコールされた割り当てられたリードは、割り当てられたリードのSNPを特定するための分析を経ることがある。遺伝子座が多型の反復的なDNA要素を含むことが知られている場合、サンプルリード内の多型の反復的なDNA要素を特定するために、または特徴付けるために、割り当てられるリードが分析され得る。いくつかの実装形態では、割り当てられるリードがSTR座およびSNP座と実質的に一致する場合、警告またはフラグがサンプルリードに割り当てられ得る。サンプルリードは、STR座とSNP座の両方として指定され得る。この分析は、割り当てられたリードの配列および/または長さを決定するために、割当てプロトコルに従って割り当てられたリードをアラインメントすることを含み得る。アラインメントプロトコルは、全体が参照によって本明細書において引用される、2013年3月15日に出願された国際特許出願第PCT/US2013/030867号(公開番号第WO 2014/142831号)において説明される方法を含み得る。
次いで、1つまたは複数のプロセッサは、支持バリアントが生フラグメント内の対応する場所に存在するかどうかを決定するために、生フラグメントを分析する。様々なタイプの生フラグメントが特定され得る。たとえば、バリアントコーラは、元のバリアントコールを妥当性確認するバリアントを示すあるタイプの生フラグメントを特定し得る。たとえば、そのタイプの生フラグメントは、duplex stitchedフラグメント、simplex stitchedフラグメント、duplex un-stitchedフラグメント、またはsimplex un-stitchedフラグメントを表し得る。任意選択で、前述の例の代わりに、またはそれに加えて、他の生フラグメントが特定され得る。各タイプの生フラグメントを特定することに関連して、バリアントコーラはまた、支持バリアントが発生した生フラグメント内での場所、ならびに、支持バリアントを示した生フラグメントの数のカウントを特定する。たとえば、バリアントコーラは、生フラグメントの10個のリードが、特定の場所Xにおいて支持バリアントを有するduplex stitchedフラグメントを表すことが特定されたことを示すものを、出力し得る。バリアントコーラはまた、生フラグメントの5個のリードが、特定の場所Yにおいて支持バリアントを有するsimplex un-stitchedフラグメントを表すことが特定されたことを示すものを、出力し得る。バリアントコーラはまた、基準配列に対応し、したがって対象のゲノム配列における潜在的なバリアントコールを妥当性確認する証拠を提供する支持バリアントを含まなかった、生フラグメントの数を出力し得る。
次に、支持バリアント、ならびに支持バリアントが発生した場所を含む、生フラグメントのカウントが維持される。加えて、または代わりに、(サンプルリードまたはサンプルフラグメントの中の潜在的なバリアントコールの場所に対する相対的な)対象の場所において支持バリアントを含まなかった生フラグメントのカウントが維持され得る。加えて、または代わりに、基準配列に対応し潜在的なバリアントコールを確証または確認しない、生フラグメントのカウントが維持され得る。潜在的なバリアントコールを支持する生フラグメントのカウントおよびタイプ、生フラグメントの中の支持バリアントの場所、潜在的なバリアントコールを支持しない生フラグメントのカウントなどを含む、決定された情報が、バリアントコール妥当性確認アプリケーションに出力される。
潜在的なバリアントコールが特定されるとき、プロセスは、潜在的なバリアントコール、バリアント配列、バリアント場所、およびそれらと関連付けられる基準配列を示すものを出力する。エラーはコールプロセスに誤ったバリアントを特定させ得るので、バリアントコールは「潜在的な」バリアントを表すように指定される。本明細書の実装形態によれば、誤ったバリアントまたは偽陽性を減らして除去するために、潜在的なバリアントコールが分析される。加えて、または代わりに、プロセスは、サンプルリードと関連付けられる1つまたは複数の生フラグメントを分析し、生フラグメントと関連付けられる対応するバリアントコールを出力する。
バリアント分類器
図1Aは、本明細書で開示される訓練されたバリアント分類器による、バリアントコーリングの一実装形態を示す。訓練されたバリアント分類器は畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を含む。バリアント分類器への入力は、入力特徴量のアレイ(図2を参照して説明される)である。アレイはリード(または配列リード)から符号化される。リードの中の塩基(またはヌクレオチド)が、sequencing-by-synthesis (SBS)のようなシーケンシングプロトコルを使用してゲノム分析器によって作り出されるシーケンシングデータの初期分析を通じて、特定または塩基コーリングされる。リードにまたがるバリアント候補サイトにおけるバリアント候補はアラインメントプロセスによって特定され、その一実装形態が以下で論じられる。
最近のハードウェアおよびソフトウェアの改善は、Illuminaシーケンシングシステム(たとえば、HiSeqX(商標)、HiSeq3000(商標)、HiSeq4000(商標)、NovaSeq6000(商標)、MiSeqDx(商標)、Firefly(商標))などのゲノム分析器のデータ出力容量の大幅な向上をもたらした。約3億個の2×100塩基ペア(bp)リードを備える、33ギガバイト(GB)を超える配列出力が、今や10日以内で日常的に生成され得る。一実装形態では、開示される技術は、IlluminaのConsensus Assessment of Sequence And Variation (CASAVA)ソフトウェアを使用し、これは、この大量のシーケンシングデータをシームレスに処理し、大きいまたは小さいゲノムのシーケンシング、標的を絞ったデオキシリボ核酸(DNA)の再シーケンシング、およびリボ核酸(RNA)のシーケンシングをサポートする。
CASAVAは、ゲノム分析器によって生成されたシーケンシングデータ(たとえば、画像データ、検出データ)を2つのステップで分析することができる。第1のステップ(初期分析)において、計器コンピュータ上で実行される、Sequencing Control Software Real Time Analysis (SCS/RTA)が、リアルタイムのデータ分析および塩基コーリングを実行する。塩基コーリングはリードを生み出す。第2のステップにおいて、CASAVAは、リードを基準リード(または基準ゲノム)に対してアラインメントして配列の差(たとえば、一塩基多型(SNP)、挿入/欠失(インデル)などのバリアント候補)、より大きな全体の配列などを決定するように、リードの完全な二次分析を実行する。リードのアラインメントおよびバリアント候補の検出のためのアルゴリズムは、Illuminaの国際特許出願公開第WO05068089号および「Complete Secondary Analysis Workflow for the Genome Analyzer」(http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_casava_secondary_analysis.pdfで入手可能)という表題のIlluminaの技術ノートにおいて説明されており、これらは本明細書に完全に記載されるかのように参照によって引用される。
他の実装形態では、初期分析および二次分析は、Whole Genome Sequencing and DRAGENなどの他のIlluminaアプリケーションによって実行され、これらの追加の詳細は、https://www.illumina.com/products/by-type/informatics-products/basespace-sequence-hub/apps/whole-genome-sequencing.html?langsel=/us/およびhttps://support.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/illumina-proactive-technical-note-1000000052503.pdfにおいて見出すことができ、これらは本明細書に完全に記載されるかのように参照によって引用される。
入力特徴量のアレイ
図2は、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークに供給される入力特徴量のアレイの一実装形態である。アレイは、基準リードにアラインメントされるリードのグループを符号化する。グループの中の各リードは標的塩基場所(灰色で強調される)を含む。標的塩基場所は、バリアント候補サイト(たとえば、SNP、インデル)におけるバリアント候補に対応する。標的塩基場所は、各側に塩基(たとえば、左側のフランキング塩基および右側のフランキング塩基)があり、またはそれらの塩基にパディングされる。いくつかの実装形態では、左側のフランキング塩基の数は右側のフランキング塩基の数と同じである。他の実装形態では、左側のフランキング塩基の数は右側のフランキング塩基の数と異なる。各側のフランキング塩基の数は、30、70、90、110などであり得る。
一実装形態によれば、リードのグループはx軸に沿って(すなわち、第1の空間的な次元、たとえば高さの次元に沿って)アレイにおいて行毎に並べられる。すなわち、アレイの中の各行は、基準リードにアラインメントされるリードを表し、標的塩基場所を含む。一実装形態によれば、リードの中の塩基場所は、y軸に沿って(すなわち、第2の空間的な次元、たとえば幅の次元に沿って)アレイにおいて列毎に並べられる。すなわち、アレイの中の各列は、特定の順序的な場所におけるリードの中の塩基を表す。
アレイの中の各ユニットは、入力特徴量(図2の前を向いているボックスによって示される)である。アレイの中の各入力特徴量は、リードの中の塩基に対応する。アレイの中の各入力特徴量は、複数の次元を有する。一実装形態によれば、複数の次元は、z軸に沿って(たとえば、深さ、チャネル、特徴量、またはファイバー次元に沿って)アレイにおいて並べられる。
一実装形態によれば、複数の次元は、(i)塩基を特定する第1の次元セット、(ii)塩基にアラインメントされる基準塩基を特定する第2の次元セット、(iii)塩基の塩基コール正確度スコアを特定する第3の次元セット、(iv)塩基の鎖状態(すなわち、DNA鎖状態)を特定する第4の次元セット、(v)塩基の場所に隣接する変化の挿入カウント(INS)を特定する第5の次元セット、(vi)塩基の場所における欠失フラグ(DEL)を特定する第6の次元セットを含む。
他の実装形態では、アレイはボリュームと見なされ得る。さらに他の実装形態では、アレイはテンソルと見なされ得る。いくつかの実装形態では、アレイはバリアント候補の周りのリードのパイルアップを表す。いくつかの実装形態では、入力特徴量の次元は入力チャネルと見なされ得る。
一例では、各入力特徴量は12個の次元を有する。そうすると、第1の次元セットは、入力特徴量の塩基を特定するためにワンホット符号化を使用する4つの次元を含む。塩基は、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、またはチミン(T)であり得る。第2の次元セットは、塩基にアラインメントされる基準塩基を特定するためにワンホット符号化を使用する4つの次元も含む。基準塩基は、A、C、G、またはTでもあり得る。
ワンホット符号化において、配列の中の各塩基は4ビットのバイナリベクトルを用いて符号化され、ビットのうちの1つがホット(すなわち、1)であり、他のビットが0である。たとえば、A=(1,0,0,0)、C=(0,1,0,0)、G=(0,0,1,0)、およびT=(0,0,0,1)である。いくつかの実装形態では、未知の塩基はN=(0,0,0,0)として符号化される。
したがって、各入力特徴量は、リードの中の塩基と基準リードの中の対応する基準塩基との間のアラインメントを「ローカルに」符号化する。結果として、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークの畳み込みフィルタのカーネルがアレイの中の入力特徴量のウィンドウにわたって適用されるとき、それらは、基準リードの中の塩基とリードの中の塩基との間のいわゆる「1対1のコンテクスト依存性」、ならびにリードの中の塩基間のいわゆる「隣接コンテクスト依存性」を考慮する。
第3の次元セット、第4の次元セット、第5の次元セット、および第6の次元セットは各々、連続的な数としての塩基の塩基コール正確度スコア、ワンホット符号化を使用した塩基の鎖状態(たとえば、順鎖に対して0および逆鎖に対して1)、数としての塩基の場所に隣接する変化の挿入カウント(INS)(たとえば、4つの挿入される塩基に対して4)、および数としての塩基の場所における欠失フラグ(DEL)(たとえば、4つの欠失した塩基場所に対して1111)をそれぞれ特定するための、1つの次元を含む。図2において、入力特徴量の6つの次元セットは、異なる灰色の影を使用してグラフィカルに区別される。
いくつかの実装形態では、各リードのマッピング品質はアレイの中にも符号化される。マッピング品質(MAPQ)は、アレイの中の各ユニットまたは各入力特徴量の追加の次元もしくはチャネルにおいて符号化され得る数(たとえば、40)である。
塩基コール正確度スコアに関して、一実装形態では、塩基コーリングエラー確率(P)2に対数的に関係する性質として定義される、Phred品質スコア(たとえば、Q10、Q20、Q30、Q40、Q50)として特定され得る。塩基コール正確度スコアについての追加の情報は、「Quality Scores for Next-Generation Sequencing」および「Understanding Illumina Quality Scores」という表題のIlluminaの技術ノート(https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf、https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_understanding_quality_scores.pdfにおいて入手可能である)において見出すことができ、これらは本明細書に完全に記載されるかのように参照によって引用される。
塩基の場所に隣接する変化の挿入カウント(INS)に関して、一実装形態では、挿入カウントは塩基の前または後に挿入されるいくつかの塩基を特定することができる。塩基の場所における欠失フラグ(DEL)に関して、一実装形態では、欠失フラグは、塩基の場所における決定されていない、読み取られていない、特定されていない、空の、または欠失した塩基を特定することができる。
一実装形態では、アレイの次元は100×221×12であり、ここで、(a)100は、基準リードにアラインメントされ標的塩基場所におけるバリアント候補サイトにわたる、グループの中のリードの数を表し、(b)221は、リードの各々の中の塩基場所の数を表し、111番目の順序的な場所における標的塩基場所の各側に110個の塩基場所があり、(c)12はアレイの中の各入力特徴量の局所的な次元、すなわち入力特徴量の各々の次元の数を表す。
他の実装形態では、入力特徴量は異なる数の次元を有することができ、これらの次元はさらに、異なる符号化方式を使用して可変のサイズの次元セットへと区分され得る。
さらなる他の実装形態では、ワンホット符号化は、訓練されたニューラルネットワークによって作り出される埋め込み空間または埋め込み行列に基づく密な符号化方式または実数値の符号化方式などの、他の符号化方式によって置換され得る。またさらなる実装形態では、符号化方式は、定量的または数値的データタイプ、定性的データタイプ、離散的データタイプ、連続的データタイプ(下限および上限を伴う)、整数データタイプ(下限および上限を伴う)、ノミナルデータタイプ、順序的またはランク付けされたデータタイプ、カテゴリカルデータタイプ、間隔データタイプ、および/または比データタイプに基づき得る。たとえば、符号化は、0と1の間の実数値、0と256との間の赤、緑、青(RGB)値などの連続的な値、16進数の値、特定の次元(たとえば、高さおよび幅)のサイズ、異なる値およびデータタイプのセットなどに、またはそれらの任意の組合せに基づいてよい。
バリアント分類器CNNアーキテクチャ
上で論じられたように、入力特徴量のアレイは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークに供給される。図3Aは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャ300Aの一実装形態を示す。具体的には、図3Aに示される畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャは、8つの畳み込み層を有する。バリアント分類器畳み込みニューラルネットワークは、複数の畳み込み層が後に続く入力層を含み得る。畳み込み層のいくつかの後には最大プーリング(またはサンプリング)層があってもよく、中間バッチ正規化層が畳み込み層と最大プーリング層の間にある。示される実装形態では、畳み込みニューラルネットワークは、8つの畳み込み層、3つの最大プーリング層、および8つのバッチ正規化層を有する。
バッチ正規化に関して、バッチ正規化は、データ標準化をネットワークアーキテクチャの必須の部分にすることによって深層ネットワークの訓練を加速するための方法である。バッチ正規化は、訓練の間に時間とともに平均および分散が変化しても、データを適応的に正規化することができる。バッチ正規化は、訓練の間に見られるデータのバッチごとの平均と分散の指数移動平均を内部的に維持することによって機能する。バッチ正規化の主な影響は、残差接続とよく似て、勾配伝播を助けるので、深層ネットワークを可能にするということである。一部の超深層ネットワークは、複数のバッチ正規化層を含む場合にのみ訓練することができる。
バッチ正規化は、全結合層または畳み込み層のように、モデルアーキテクチャへと挿入され得るさらに別の層として見ることができる。バッチ正規化層は通常、畳み込み層または密結合層の後で使用される。バッチ正規化層は、畳み込み層または密結合層の前でも使用され得る。両方の実装形態が、開示される技術によって使用されることが可能であり、図1Lにおいて示されている。バッチ正規化層は軸引数を取り込み、軸引数は正規化されるべき特徴軸を指定する。この引数はデフォルトでは1であり、これは入力テンソルにおける最後の軸である。これは、data_formatが「channels_last」に設定された状態でDense層、Conv1D層、RNN層、およびConv2D層を使用するときの適切な値である。しかし、data_formatが「channels_first」に設定されるConv2D層のニッチな使用事例では、特徴軸は軸1であり、バッチ正規化における軸引数は1に設定され得る。
バッチ正規化は、入力をフィードフォワードすることと、バックワードパスを介してパラメータに関する勾配およびそれ自体の入力(its own input)を計算することとのための定義を提供する。実際には、バッチ正規化層は、畳み込み層または全結合層の後に挿入されるが、それは出力が活性化関数へと供給される前である。畳み込み層では、異なる位置にある同じ特徴マップの異なる要素、すなわち活性化が、畳み込みの性質に従うために同じ方法で正規化される。したがって、ミニバッチの中のすべての活性化は、活性化ごとにではなく、すべての位置にわたって正規化される。
内部的な共変量のシフトは、深層アーキテクチャが訓練するのに時間がかかることで悪名高かった主な理由である。これは、深層ネットワークが各層において新しい表現を学習しなければならないだけではなく、それらの分布の変化も考慮しなければならないという事実によるものである。
一般に共変量シフトは、深層学習の領域における既知の問題であり、現実世界の問題において頻繁に発生する。よくある共変量シフト問題は、最適ではない一般化性能につながり得る、訓練セットと検定セットでの分布の違いである。この問題は通常、標準化または白色化前処理ステップ(whitening preprocessing step)によって対処される。しかしながら、特に白色化動作は、計算負荷が高いので、共変量シフトが様々な層全体で発生する場合には特に、オンラインの状況では非現実的である。
内部的な共変量シフトは、ネットワーク活性化の分布が、訓練の間のネットワークパラメータの変化により複数の層にわたって変化するという現象である。理想的には、各層は、各層が同じ分布を有するが機能的な関係は同じままであるような空間へと変換されるべきである。それぞれの層およびステップにおいてデータを脱相関および白色化するための、共分散行列の高価な計算を避けるために、各ミニバッチにわたる各層における各入力特徴量の分布を、平均が0になり標準偏差が1になるように正規化する。
フォワードパスの間、ミニバッチの平均および分散が計算される。これらのミニバッチの統計により、データは、平均を差し引き、標準偏差で除算することによって正規化される。最後に、データは、学習されたスケールおよびシフトパラメータを用いて、スケーリングおよびシフトされる。正規化は微分可能な変換であるので、誤差はこれらの学習されたパラメータへと伝播され、したがって、恒等変換を学習することによってネットワークの再現能力を復元することが可能である。逆に、対応するバッチ統計と同一のスケールおよびシフトパラメータを学習することによって、それが実行すべき最適な操作であった場合、バッチ正規化変換はネットワークに対する効果を持たない。検定時に、バッチ平均および分散はそれぞれの母集団の統計により置き換えられ、それは、入力がミニバッチからの他のサンプルに依存しないからである。別の方法は、訓練の間にバッチ統計の平均をとり続け、検定時にこれらを使用してネットワーク出力を計算することである。
畳み込み層は、畳み込みフィルタの数(たとえば、32個のフィルタ)および畳み込みウィンドウサイズによってパラメータ化され得る。畳み込みフィルタはさらに、2つの空間的な次元、すなわち高さおよび幅(たとえば、5×5または5×1)によって、ならびに、第3の深さ、特徴量、またはファイバー次元(たとえば、12、10、32)によってパラメータ化され得る。実装形態では、畳み込みニューラルネットワークの第1の畳み込み層の畳み込みフィルタの深さ次元は、アレイの入力特徴量の次元の数と一致する。
畳み込みニューラルネットワークはまた、1つまたは複数の全結合層を含み得る。示される実施形態では、畳み込みニューラルネットワークは2つの全結合層を含む。実装形態では、畳み込みニューラルネットワークは、畳み込み層を通じてリードのグループを処理し、補足入力層によって提供される対応する経験的バリアントスコア(EVS)特徴量と畳み込み層の出力を連結する。畳み込みニューラルネットワークの補足入力層は、畳み込みニューラルネットワークの第1の畳み込み層への入力としてアレイを提供する入力層と異なり得る。一実装形態では、畳み込みニューラルネットワークの最後の畳み込み層の出力は、畳み込みニューラルネットワークの平坦化層によって平坦化され、次いでEVS特徴量と組み合わされる。
EVS特徴量に関して、EVS特徴量のセットは、アレイの中のバリアント候補サイトと関連付けられ得る(たとえば、SNPに対する23個のEVS特徴量およびインデルに対する22個のEVS特徴量)。EVS特徴量のいくつかの例は、生殖細胞系列特徴量、RNA-seq特徴量、体細胞性特徴量、生殖細胞系列SNV特徴量、生殖細胞系列インデル特徴量、RNA-seq SNV特徴量、RNA-seqインデル特徴量、体細胞性SNV特徴量、および体細胞性インデル特徴量がある。EVS特徴量の追加の例は、「EVS特徴量」という表題のセクションで本出願において後で提供される。
各EVS特徴量は、バリアント候補サイトの特定の属性を表す数である。したがって、一実装形態によれば、バリアント候補サイトのEVS特徴量のセットは、数字のベクトルまたは数値的な記述子によって特定される。EVS特徴量の数字は畳み込みニューラルネットワークに直接供給される。たとえば、GenotypeCategoryは、ヘテロ接合型サイトに対しては0、ホモ接合型サイトに対しては1、オルトヘテロ接合型(alt-heterozygous)サイトに対しては2である。SampleRMSMappingQualityのような他のものは、浮動小数点数である。RMSは、二乗平均平方根EVS特徴量を意味し、サイトをカバーする各リードに対するマッピング品質の二乗を合計し、それをリードの数で割り、次いで除算の結果の平方根をとることによって決定される。ConservativeGenotypeQuality EVS特徴量についてより高い正確度が観察される。
最後の畳み込み層の出力がEVS特徴量と連結された後で、畳み込みニューラルネットワークは次いで、連結の結果を全結合層に供給する。全結合層の後の分類層(たとえば、ソフトマックス層)が、標的塩基場所における各バリアント候補が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアを作り出すことができる。他の実装形態では、分類層は、標的塩基場所における各バリアント候補がホモ接合型バリアントである確率、ヘテロ接合型バリアントである確率、バリアントではない確率、または複合バリアント(complex-variant)である確率に対する分類スコアを作り出すことができる。
図3Bは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャ300Bの別の実装形態を示す。図3Bはまた、畳み込みニューラルネットワークの様々な処理段階における入力/出力の次元を示す。具体的には、図3Bに示される畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャは、7つの畳み込み層を有する。この例示的なアーキテクチャでは、32個のフィルタおよび第1の連続する最大プーリング層を伴う第1の5×5の畳み込み層によって作り出される出力の次元は108×48×32であってよく、32個のフィルタおよび第2の連続する最大プーリング層を伴う第2の5×5の畳み込み層によって作り出される出力の次元は52×22×32であってよく、32個のフィルタおよび第3の連続する最大プーリング層を伴う第3の5×5の畳み込み層によって作り出される出力の次元は24×9×32であってよい。前に進み、32個のフィルタを伴い連続する最大プーリング層を伴わない第4の5×5の畳み込み層によって作り出される出力の次元は20×5×32であってよく、32個のフィルタを伴い連続する最大プーリング層を伴わない第5の5×5の畳み込み層によって作り出される出力の次元は16×1×32であってよく、32個のフィルタを伴い連続する最大プーリング層を伴わない第6の5×1の畳み込み層によって作り出される出力の次元は11×1×32であってよく、32個のフィルタを伴い連続する最大プーリング層を伴わない第7の5×1の畳み込み層によって作り出される出力の次元は7×1×32であってよい。前に進み、7×1×32の出力は、224次元のベクトルへと平坦化され、23次元または22次元のEVS特徴量ベクトルとさらに連結されて、247次元または246次元の連結されたベクトルを作り出すことができる。連結されたベクトルは、256個のユニットを伴う全結合層へと供給され、次いで分類層へと供給されて、分類スコアを作り出すことができる。
図3Cは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャ300Cのさらに別の実装形態を示す。具体的には、図3Cにおいて示される畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャは、5つの畳み込み層を有する。この例示的なアーキテクチャでは、バリアント分類器畳み込みニューラルネットワークは、32個の畳み込みフィルタを各々伴う5つの3×3の畳み込み層が後に続く入力層を含み得る。各畳み込み層の後には、バッチ正規化層および2×2の最大プーリング層が続き得る。畳み込みニューラルネットワークはさらに、平坦化層、補足入力層、連結層、2つの全結合(FC)層、および分類層を含み得る。図3Cはまた、畳み込みニューラルネットワークの様々な処理段階における入力/出力の次元を示す。
図3Dは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャ300Dのさらに別の実装形態を示す。具体的には、図3Dに示される畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャは、深さ毎の分離可能(depthwise separable)畳み込みを使用する。標準的な畳み込みとは対照的に、深さ毎の分離可能畳み込みは、入力データの各チャネルの別々の畳み込みを実行し、次いで点毎の(pointwise)畳み込みを実行してチャネルを混合する。深さ毎の分離可能畳み込みについての追加の情報については、A.G.Howard、M.Zhu、B.Chen、D.Kalenichenko、W.Wang、T.Weyand、M.Andreetto、およびH.Adam、「Mobilenets: Efficient Convolutional Neural Networks for Mobile Vision Applications」、arXiv:1704.04861所収、2017年を参照することができ、これは本明細書において完全に記載されるかのように参照によって引用される。
バリアント分類器FCネットワークアーキテクチャ
図4Aは、計算ユニットが前の層のすべての計算ユニットへの全結合を有する、全結合(FC)ネットワーク400Aを示す。層はm個の計算ユニットを有し、前の層はn個の出力を与え、そして合計でm*n個の重みを得ると仮定する。
図4Bは、畳み込み層を伴わない、バリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのアーキテクチャ400Bの一実装形態を示す。アーキテクチャ400Bは全結合層(「密層」とも呼ばれる)を使用する。図4Bでは、7つの密層があり、バッチ正規化層およびドロップアウト層が散在する。
一実装形態では、バリアント分類器の全結合ニューラルネットワークは、層当たり64個のユニットがありドロップアウト率が10%である4つの全結合層と、各全結合層の後のバッチ正規化層とを有する。
全結合ニューラルネットワークへの入力は、バリアント候補サイトの経験的バリアントスコア(EVS)特徴量である。各EVS特徴量は、バリアント候補サイトの特定の属性を表す数字である。したがって、一実装形態によれば、バリアント候補サイトのEVS特徴量のセットは数字のベクトルまたは数値的な記述子によって特定される。EVS特徴量の数字は畳み込みニューラルネットワークに直接供給される。たとえば、GenotypeCategoryは、ヘテロ接合型サイトに対しては0、ホモ接合型サイトに対しては1、オルトヘテロ接合型サイトに対しては2である。SampleRMSMappingQualityのような他のものは、浮動小数点数である。RMSは、二乗平均平方根EVS特徴量を意味し、サイトをカバーする各リードに対するマッピング品質の二乗を合計し、それをリードの数で割り、次いで除算の結果の平方根をとることによって決定される。ConservativeGenotypeQuality EVS特徴量についてより高い正確度が観察される。
全結合ニューラルネットワークへの入力は、以下で列挙されるEVS特徴量の任意の組合せであり得る。すなわち、バリアントコーラによって評価されている特定のバリアント候補サイトに対するEVS特徴量ベクトルは、以下で列挙されるEVS特徴量のいずれかに対する数値を含むように符号化または構築され得る。
EVS特徴量
以下は、次の4つのカテゴリのもとにあるEVS特徴量の例を列挙する。
(1)生殖細胞系列SNV特徴量: GenotypeCategory、SampleRMSMappingQuality、SiteHomopolymerLength、SampleStrandBias、SampleRMSMappingQualityRankSum、SampleReadPosRankSum、RelativeTotalLocusDepth、SampleUsedDepthFraction、ConservativeGenotypeQuality、NormalizedAltHaplotypeCountRatio
(2)生殖細胞系列インデル特徴量: GenotypeCategory、SampleIndelRepeatCount、SampleIndelRepeatUnitSize、SampleIndelAlleleBiasLower、SampleIndelAlleleBias、SampleProxyRMSMappingQuality、RelativeTotalLocusDepth、SamplePrimaryAltAlleleDepthFraction、ConservativeGenotypeQuality、InterruptedHomopolymerLength、ContextCompressability、IndelCategory、NormalizedAltHaplotypeCountRatio
(3)体細胞性SNV特徴量: SomaticSNVQualityAndHomRefGermlineGenotype、NormalSampleRelativeTotalLocusDepth、TumorSampleAltAlleleFraction、RMSMappingQuality、ZeroMappingQualityFraction、TumorSampleStrandBias、TumorSampleReadPosRankSum、AlleleCountLogOddsRatio、NormalSampleFilteredDepthFraction、TumorSampleFilteredDepthFraction
(4)体細胞性インデル特徴量: SomaticIndelQualityAndHomRefGermlineGenotype、TumorSampleReadPosRankSum、TumorSampleLogSymmetricStrandOddsRatio、RepeatUnitLength、IndelRepeatCount、RefRepeatCount、InterruptedHomopolymerLength、TumorSampleIndelNoiseLogOdds、TumorNormalIndelAlleleLogOdds、AlleleCountLogOddsRatio
以下は上で列挙されたEVS特徴量の定義である。
Figure 0007247253000001
Figure 0007247253000002
Figure 0007247253000003
Figure 0007247253000004
Figure 0007247253000005
Figure 0007247253000006
体細胞性特徴量の説明:
体細胞性特徴量に対しては、「すべてのサンプル」とは腫瘍および照合された正常サンプルを一緒に指すことに留意されたい。
Figure 0007247253000007
Figure 0007247253000008
Figure 0007247253000009
Figure 0007247253000010
いくつかの実装形態では、入力はEVS特徴量のみを含む。他の実装形態では、入力において、CNNの実装形態について上で論じられたように、EVS特徴量はリードデータによって補足され得る。
図1Bは、バリアント候補(SNPおよびインデル)を備えるラベリングされた訓練データを使用して、図1Aのバリアント分類器を訓練することの一実装形態を示す。様々な実装形態において、バリアント分類器は、5万(50000)から100万(1000000)個のバリアント候補(SNPおよびインデル)について訓練される。バリアント候補は、真のバリアントという分類でラベリングされるので、訓練の間にグラウンドトゥルースとして働く。一実装形態では、50個から100個のリードを伴うバリアント候補サイトの100万個の訓練例を各々、訓練の5～10個のエポックにわたって良好な再現率および適合率にて10時間未満で単一のGPUカード上で訓練することができる。訓練データはNA129878サンプルを含んでもよく、染色体2/20からの妥当性確認データが提供される。バリアント分類器畳み込みニューラルネットワークは、Adamなどの逆伝播ベースの確率的勾配降下アルゴリズムおよびドロップアウトのような正則化技法を使用して訓練される。
図1Cは、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワーク処理の入力モジュールおよび出力モジュールの一実装形態を示す。入力モジュールは、上で論じられたように、畳み込みニューラルネットワークに入力特徴量のアレイを供給することを含む。出力モジュールは、標的塩基場所における各バリアント候補が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、畳み込みニューラルネットワークによる分析を変換することを含む。畳み込みニューラルネットワークの最後のソフトマックス分類層は、合計で1になる2つのクラスに対する正規化された確率を作り出すことができる。示される例では、真陽性(または真のバリアント)のソフトマックス確率は0.85であり、偽陽性(または偽のバリアント)のソフトマックス確率は0.15である。その結果、標的塩基場所におけるバリアント候補は真のバリアントとして分類される。
バリアント分類器畳み込みニューラルネットワークのアーキテクチャ、訓練、推論、分析、および変換についての追加の情報について、J.Wu、「Introduction to Convolutional Neural Networks」、Nanjing University、2017年、I.J.Goodfellow、D.Warde-Farley、M.Mirza、A.Courville、およびY.Bengio「CONVOLUTIONAL NETWORKS」、Deep Learning、MIT Press、2016年、および「BATCH NORMALIZATION: ACCELERATING DEEP NETWORK TRAINING BY REDUCING INTERNAL COVARIATE SHIFT」、arXiv:1502.03167、2015年を参照することができ、これらは、本明細書に完全に記載されるかのように、参照によって引用される。
さらに他の実装形態では、図1Aのバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークは、1D畳み込み、2D畳み込み、3D畳み込み、4D畳み込み、5D畳み込み、拡張または膨張畳み込み、転置畳み込み、深さ毎の分離可能畳み込み、点毎の畳み込み、1×1の畳み込み、グループ畳み込み、平坦化(flattened)畳み込み、空間およびクロスチャネル(space and cross-channel)畳み込み、シャッフルグループ化(shuffled grouped)畳み込み、空間的分離可能(spatial separable)畳み込み、および逆畳み込みを使用することができる。畳み込みニューラルネットワークは、ロジスティック回帰/対数損失、マルチクラスクロスエントロピー/ソフトマックス損失(multi-class cross-entropy/softmax loss)、バイナリクロスエントロピー損失(binary cross-entropy loss)、平均二乗誤差損失、L1損失、L2損失、平滑化(smooth)L1損失、およびHuber損失などの、1つまたは複数の損失関数を使用することができる。畳み込みニューラルネットワークは、TFRecords、圧縮符号化(たとえば、PNG)、シャーディング、マップ変換のための並列コール、バッチング、プリフェッチング、モデル並列性、データ並列性、および同期/非同期SGDなどの、任意の並列性、効率性、および圧縮方式を使用することができる。畳み込みニューラルネットワークは、アップサンプリング層、ダウンサンプリング層、回帰接続、ゲート、およびゲート制御されたメモリユニット(LSTMまたはGRUのような)、残差ブロック、残差接続、ハイウェイ接続、スキップ接続、活性化関数(たとえば、正規化線形ユニット(ReLU)、leaky ReLU、指数関数的線形ユニット(ELU)、シグモイドおよび双曲線正接(tanh)のような非線形変換関数)、バッチ正規化層、正則化層、ドロップアウト、プーリング層(たとえば、最大または平均プーリング)、グローバル平均プーリング層、および注意機構を含み得る。
実験結果
図5は、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによる一塩基多型(SNP)分類性能と、経験的バリアントスコア(EVS)モデルと呼ばれる基準のStrelka(商標)モデルによるSNP分類性能を比較する、適合率-再現率曲線の一例を示す。図5に示されるように、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークは、EVSモデルより良いSNPに対する適合率-再現率を有する。
図6は、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによるSNP分類性能と、EVSモデルによるSNP分類性能を比較する、適合率-再現率曲線の別の例を示す。ここで、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークは、より大きい訓練セットについて訓練されるので、性能がEVSモデルをさらに上回る。
図7は、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークによるインデル分類性能と、EVSモデルによるインデル分類性能を比較する、適合率-再現率曲線の一例を示す。図7に示されるように、バリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークは、EVSモデルより良いインデルに対する適合率-再現率を有する。
図8は、訓練および妥当性確認の間のバリアント分類器の畳み込みニューラルネットワークの収束曲線を示す。図8に示されるように、畳み込みニューラルネットワークは、訓練および妥当性確認の間の8～9個前後のエポックで収束し、各エポックは単一のGPU上で完了するのに約1時間かかる。
図9は、訓練および検定(推論)の間のバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークの収束曲線を示す。図9に示されるように、全結合ニューラルネットワークは、訓練および検定の間の14個のエポックの後で収束する。
他の実装形態では、バリアント分類器は50個のエポックに対して訓練されてもよく、過剰適応なしでは20～30個のエポックの後の改善は小さい。
図10は、(i)EVSモデルバージョン2.8.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのSNP分類性能、(ii)EVSモデルバージョン2.9.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのSNP分類性能、(iii)EVSモデルバージョン2.8.2のSNP分類性能、および(iv)EVSモデルバージョン2.9.2のSNP分類性能を比較するために適合率-再現率曲線を使用する。図10に示されるように、バリアント分類器の全結合ニューラルネットワークの性能はEVSモデルを上回る。
図11は、(i)EVSモデルバージョン2.8.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのインデル分類性能、(ii)EVSモデルバージョン2.9.2のEVS特徴量について訓練されるバリアント分類器の全結合ニューラルネットワークのインデル分類性能、(iii)EVSモデルバージョン2.8.2のインデル分類性能、および(iv)EVSモデルバージョン2.9.2のインデル分類性能を比較するために適合率-再現率曲線を使用する。図11に示されるように、バリアント分類器の全結合ニューラルネットワークの性能はEVSモデルを上回る。
コンピュータシステム
図12は、バリアント分類器を実装するために使用され得るコンピュータシステムの簡略化されたブロック図である。コンピュータシステム1200は、バスサブシステム1255を介していくつかの周辺デバイスと通信する、少なくとも1つの中央処理装置(CPU)1272を含む。これらの周辺デバイスは、たとえば、メモリデバイスおよびファイルストレージサブシステム1236、ユーザインターフェース入力デバイス1238、ユーザインターフェース出力デバイス1276、ならびにネットワークインターフェースサブシステム1274を含む、ストレージサブシステム1210を含み得る。入力デバイスおよび出力デバイスはコンピュータシステム1200とのユーザの対話を可能にする。ネットワークインターフェースサブシステム1274は、他のコンピュータシステムにおける対応するインターフェースデバイスへのインターフェースを含む、外部ネットワークへのインターフェースを提供する。
一実装形態では、バリアント分類器は、ストレージサブシステム1210およびユーザインターフェース入力デバイス128に通信可能に繋がれる。
ユーザインターフェース入力デバイス1238は、キーボードと、マウス、トラックボール、タッチパッド、またはグラフィクスタブレットなどのポインティングデバイスと、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーンと、音声認識システムおよびマイクロフォンなどのオーディオ入力デバイスと、他のタイプの入力デバイスとを含み得る。一般に、「入力デバイス」という用語の使用は、コンピュータシステム1200へ情報を入力するためのすべての可能なタイプのデバイスおよび方式を含むことが意図される。
ユーザインターフェース出力デバイス1276は、ディスプレイサブシステム、プリンタ、faxマシン、またはオーディオ出力デバイスなどの非視覚的ディスプレイを含み得る。ディスプレイサブシステムは、LEDディスプレイ、陰極線管(CRT)、液晶ディスプレイ(LCD)などのフラットパネルデバイス、プロジェクションデバイス、または可視の画像を創造するための何らかの他の機構を含み得る。ディスプレイサブシステムはまた、オーディオ出力デバイスなどの非視覚ディスプレイを提供することができる。一般に、「出力デバイス」という用語の使用は、コンピュータシステム1200から情報をユーザまたは別の機械もしくはコンピュータシステムに出力するためのすべての可能なタイプのデバイスおよび方式を含むことが意図される。
ストレージサブシステム1210は、本明細書で説明されるモジュールおよび方法の一部またはすべての機能を提供する、プログラミングおよびデータ構築物を記憶する。これらのソフトウェアモジュールは一般に、深層学習プロセッサ1278によって実行される。
深層学習プロセッサ1278は、グラフィクス処理装置(GPU)、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)、特定用途向け集積回路(ASIC)、および/または粗視化再構成可能(coarse-grained reconfigurable)アーキテクチャ(CGRA)であり得る。深層学習プロセッサ1278は、Google Cloud Platform(商標)、Xilinx(商標)、およびCirrascale(商標)などの深層学習クラウドプラットフォームによってホストされ得る。深層学習プロセッサ1278の例には、GoogleのTensor Processing Unit (TPU)(商標)、GX4 Rackmount Series(商標)、GX12 Rackmount Series(商標)のようなラックマウントソリューション、NVIDIA DGX-1(商標)、MicrosoftのStratix V FPGA(商標)、GraphcoreのIntelligent Processor Unit (IPU)(商標)、Snapdragonプロセッサ(商標)を用いたQualcommのZerothプラットフォーム(商標)、NVIDIAのVolta(商標)、NVIDIAのDRIVE PX(商標)、NVIDIAのJETSON TX1/TX2 MODULE(商標)、IntelのNirvana(商標)、Movidius VPU(商標)、Fujitsu DPI(商標)、ARMのDynamicIQ(商標)、IBM TrueNorth(商標)などがある。
ストレージサブシステム1210において使用されるメモリサブシステム1222は、プログラム実行の間の命令およびデータの記憶のためのメインランダムアクセスメモリ(RAM)1232と、固定された命令が記憶される読取り専用メモリ(ROM)1234とを含む、いくつかのメモリを含み得る。ファイルストレージサブシステム1236は、プログラムおよびデータファイルのための永続的なストレージを提供することができ、ハードディスクドライブ、関連する取り外し可能なメディアを伴うフロッピーディスクドライブ、CD-ROMドライブ、光学ドライブ、または取り外し可能なメディアカートリッジを含み得る。いくつかの実装形態の機能を実装するモジュールは、ストレージサブシステム1210の中の、または他のプロセッサによってアクセス可能な他の機械の中の、ファイルストレージサブシステム1236によって記憶され得る。
バスサブシステム1255は、コンピュータシステム1200の様々な構成要素およびサブシステムに意図されるように互いに通信させるための機構を提供する。バスサブシステム1255は単一のバスとして概略的に示されているが、バスサブシステムの代替的な実装形態は複数のバスを使用することができる。
コンピュータシステム1200自体が、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、コンピュータ端末、ネットワークコンピュータ、テレビジョン、メインフレーム、サーバファーム、緩やかにネットワーク化されたコンピュータの広く分布するセット、または、任意の他のデータ処理システムもしくはユーザデバイスを含む、様々なタイプであってよい。コンピュータおよびネットワークの変わり続ける性質により、図12に示されるコンピュータシステム1200の説明は、本発明の好ましい実施形態を示すことを目的とする具体的な例であることのみが意図されている。図12に示されるコンピュータシステムより多数または少数の構成要素を有する、コンピュータシステム1200の多くの他の構成が可能である。
具体的な実装形態
畳み込みニューラルネットワーク(CNN)の実装形態
開示される技術は、訓練されたバリアント分類器を備えるシステムに関する。バリアント分類器は、並列に動作しメモリに結合される多数のプロセッサを含む。バリアント分類器はまた、多数のプロセッサ上で実行される畳み込みニューラルネットワークを含む。
畳み込みニューラルネットワークは、バリアント候補サイトにまたがり真のバリアントというグループの分類でラベリングされる、リードのグループの少なくとも50000～1000000個の訓練例について訓練される。訓練において使用される訓練例の各々は、基準リードにアラインメントされるリードのグループを含む。リードの各々は、各側に少なくとも110個の塩基がある、またはそれらの塩基にパディングされる、標的塩基場所を含む。リードの中の塩基の各々には、基準リードの中の対応する基準塩基、塩基を読み取ることの塩基コール正確度スコア、塩基を読み取ることの鎖状態(すなわち、DNA鎖状態)、塩基の場所に隣接する変化の挿入カウント、塩基の場所における欠失フラグが付随する。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、畳み込みニューラルネットワークの入力モジュールは、標的塩基場所の評価のためにリードのグループを供給する。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、畳み込みニューラルネットワークの出力モジュールは、標的塩基場所における各バリアント候補が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、畳み込みニューラルネットワークによる分析を変換する。
このシステム実装形態および開示される他のシステムは任意選択で、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。システムはまた、開示される方法に関連して説明される特徴を含み得る。簡潔にするために、システム特徴の代替的な組合せは個別に列挙されない。システム、方法、および製造物品に適用可能な特徴は、基本の特徴の各statutory classセットに対して繰り返されない。このセクションにおいて特定される特徴がどのように他のstatutory classの中の基本の特徴と容易に組み合わされ得るかを、読者は理解するであろう。
畳み込みニューラルネットワークは、1つまたは複数の畳み込み層および1つまたは複数の全結合層を有し得る。畳み込みニューラルネットワークは、畳み込み層を通じてリードのグループを処理し、対応する経験的バリアントスコア(EVSと省略される)特徴量と畳み込み層の出力を連結することができる。畳み込みニューラルネットワークはさらに、全結合層に連結の結果を供給することができる。
リードの中の塩基は、ワンホット符号化を使用して符号化され得る。基準リードの中の対応する塩基は、ワンホット符号化を使用して符号化され得る。塩基を読み取ることの塩基コール正確度スコアは、連続的な数として符号化され得る。塩基を読み取ることの鎖状態は、ワンホット符号化として符号化され得る。塩基の場所に隣接する変化の挿入カウントは、数として符号化され得る。塩基の場所における欠失フラグは、数として符号化され得る。
バリアント候補は一塩基多型(SNPと省略される)候補であり得る。バリアント候補は、挿入または欠失(インデルと省略される)候補であり得る。
多数のプロセッサがグラフィクス処理装置(GPUと省略される)の一部であり得る。畳み込みニューラルネットワークは、GPU上で実行され、5～10個のエポックにわたって訓練例の評価を繰り返すことができ、1つのエポックは完了に1時間かかる。他の実装形態では、バリアント分類器は50個のエポックに対して訓練されてもよく、過剰適応なしでは20～30個のエポックの後の改善は小さい。
いくつかの実装形態では、標的塩基場所は、各側に少なくとも30個の塩基があり、またはそれらの塩基にパディングされ得る。
畳み込みニューラルネットワークはまた、1つまたは複数の最大プーリング層および1つまたは複数のバッチ正規化層を有し得る。
いくつかの実装形態では、畳み込みニューラルネットワークは、1つまたは複数の訓練サーバ上で訓練され得る。訓練の後、畳み込みニューラルネットワークは、要求側のクライアントからリードのグループを受け取る1つまたは複数の本番サーバ(クラウド環境をサポートする)上で展開され得る。本番サーバは、畳み込みニューラルネットワークの入力および出力モジュールを通じてリードのグループを処理し、クライアントに送信される分類スコアを作り出すことができる。
他の実装形態は、上で説明されたシステムの機能を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する、非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。
別の実装形態では、開示される技術はバリアントコーリングの方法に関する。方法は、畳み込みニューラルネットワークに入力特徴量のアレイを供給するステップと、畳み込みニューラルネットワークを通じてアレイを処理するステップとを含む。
基準リードにアラインメントされ、各側に少なくとも30個の塩基がありまたはそれらの塩基にパディングされる標的塩基場所を含む、リードのグループをアレイが符号化する。アレイの中の各入力特徴量は、リードの中の塩基に対応し、複数の次元を有する。
複数の次元は、塩基を特定する第1の次元セット、塩基にアラインメントされる基準塩基を特定する第2の次元セット、塩基の塩基コール正確度スコアを特定する第3の次元セット、塩基の鎖状態(たとえば、DNA鎖状態)を特定する第4の次元セット、塩基の場所に隣接する変化の挿入カウントを特定する第5の次元セット、および塩基の場所における欠失フラグを特定する第6の次元セットを含む。
方法はさらに、標的塩基場所における各入力特徴量が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、畳み込みニューラルネットワークによるアレイの処理を変換するステップを含む。
いくつかの実装形態では、各入力特徴量は12個の次元を有し得る。いくつかの実装形態では、第1の次元セットはワンホット符号化を使用して4つの塩基を符号化することができる。いくつかの実装形態では、第2の次元セットはワンホット符号化を使用して4つの塩基を符号化することができる。
システムの実装形態についてこの特定の実装セクションにおいて論じられる特徴の各々は、この方法の実装形態に等しく適用される。上で示されたように、すべてのシステム特徴はここで繰り返されず、参照によって繰り返されるものと見なされるべきである。
他の実装形態は、上で説明された方法を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。さらに別の実装形態は、メモリと、上で説明された方法を実行するためにメモリに記憶された命令を実行するように動作可能な1つまたは複数のプロセッサとを含む、システムを含み得る。
別の実装形態では、開示される技術は訓練されたバリアント分類器を備えるシステムに関する。バリアント分類器は、並列に動作しメモリに結合される多数のプロセッサを含む。バリアント分類器はまた、多数のプロセッサ上で実行される畳み込みニューラルネットワークを含む。
畳み込みニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワークの出力を対応するグラウンドトゥルースラベルと漸進的に照合する逆伝播ベースの勾配更新技法を使用して、真のバリアントというグループの分類でラベリングされたバリアント候補サイトにまたがるリードのグループの少なくとも50000～1000000個の訓練例について訓練される。
訓練において使用される訓練例の各々は、基準リードにアラインメントされるリードのグループを含む。リードの各々は、各側に少なくとも110個の塩基がある、またはそれらの塩基にパディングされる、標的塩基場所を含む。
リードの中の塩基の各々には、基準リードの中の対応する基準塩基、塩基を読み取ることの塩基コール正確度スコア、塩基を読み取ることの鎖状態(すなわち、DNA鎖状態)、塩基の場所に隣接する変化の挿入カウント、および塩基の場所における欠失フラグが付随する。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、畳み込みニューラルネットワークの入力モジュールは、標的塩基場所の評価のためにリードのグループを供給する。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、畳み込みニューラルネットワークの出力モジュールは、標的塩基場所における各バリアント候補が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、畳み込みニューラルネットワークによる分析を変換する。
このシステム実装形態および開示される他のシステムは任意選択で、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。システムはまた、開示される方法に関連して説明される特徴を含み得る。簡潔にするために、システム特徴の代替的な組合せは個別に列挙されない。システム、方法、および製造物品に適用可能な特徴は、基本の特徴の各statutory classに対して繰り返されない。このセクションにおいて特定される特徴が他のstatutory classの中の基本の特徴とどのように容易に組み合わされ得るかを、読者は理解するであろう。
リードの中の塩基の各々にはさらに、塩基を含む対応するリードを基準リードにアラインメントすることのマッピング品質スコアが付随し得る。
畳み込みニューラルネットワークは、1つまたは複数の畳み込み層および1つまたは複数の全結合層を有し得る。畳み込みニューラルネットワークは、畳み込み層を通じてリードのグループを処理し、畳み込み層の出力を対応する経験的バリアントスコア(EVSと省略される)特徴量と連結し、連結の結果を全結合層に供給することができる。
各畳み込み層は畳み込みフィルタを有し、畳み込みフィルタの各々は畳み込みカーネルを有する。畳み込みフィルタは深さ毎の分離可能畳み込みを使用することができる。
畳み込みニューラルネットワークは、1つまたは複数の最大プーリング層および1つまたは複数のバッチ正規化層を有し得る。
畳み込みニューラルネットワークは、ソフトマックス分類層を使用して分類スコアを作り出すことができる。
畳み込みニューラルネットワークはドロップアウトを使用することができる。
畳み込みニューラルネットワークは平坦化層を使用することができる。
畳み込みニューラルネットワークは連結層を使用することができる。
畳み込みニューラルネットワークは、GPU上で実行され、5～50個のエポックにわたって訓練例の評価を繰り返すことができ、1つのエポックは完了に1時間かかる。
他の実装形態は、上で説明されたシステムの機能を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する、非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。
別の実装形態では、開示される技術はバリアントコーリングの方法に関する。方法は、畳み込みニューラルネットワークに入力特徴量のアレイを供給するステップと、畳み込みニューラルネットワークを通じてアレイを処理するステップとを含む。
畳み込みニューラルネットワークは、並列に動作しメモリに結合される多数のプロセッサ上で実行され、畳み込みニューラルネットワークの出力を対応するグラウンドトゥルースラベルと漸進的に照合する逆伝播ベースの勾配更新技法を使用して、真のバリアントというグループの分類でラベリングされたバリアント候補サイトにまたがるリードのグループの少なくとも50000個の訓練例について訓練される。
基準リードにアラインメントされ、各側に少なくとも30個の塩基がありまたはそれらの塩基にパディングされる標的塩基場所を含む、リードのグループをアレイが符号化する。アレイの中の各入力特徴量は、リードの中の塩基に対応し、複数の次元を有する。
複数の次元は、塩基を特定する第1の次元セットと、塩基にアラインメントされる基準塩基を特定する第2の次元セットと、塩基の塩基コール正確度スコアを特定する第3の次元セットと、塩基の鎖状態(たとえば、DNA鎖状態)を特定する第4の次元セットと、塩基の場所に隣接する変化の挿入カウントを特定する第5の次元セットと、塩基の場所における欠失フラグを特定する第6の次元セットとを含む。
方法はさらに、標的塩基場所における各入力特徴量が真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、畳み込みニューラルネットワークによるアレイの処理を変換するステップを含む。
システムの実装形態についてこの特定の実装セクションにおいて論じられる特徴の各々は、この方法の実装形態に等しく適用される。上で示されたように、すべてのシステム特徴はここで繰り返されず、参照によって繰り返されるものと見なされるべきである。
他の実装形態は、上で説明された方法を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。さらに別の実装形態は、メモリと、上で説明された方法を実行するためにメモリに記憶された命令を実行するように動作可能な1つまたは複数のプロセッサとを含む、システムを含み得る。
全結合ネットワーク(FCN)の実装形態
さらに別の実装形態では、開示される技術は、訓練されたバリアント分類器を備えるシステムに関する。バリアント分類器は、並列に動作しメモリに結合される多数のプロセッサを含む。バリアント分類器はまた、多数のプロセッサ上で実行される全結合ニューラルネットワークを含む。
全結合ニューラルネットワークは、全結合ニューラルネットワークの出力を対応するグラウンドトゥルースラベルと漸進的に照合する逆伝播ベースの勾配更新技法を使用して、真のバリアントというサイトの分類でラベリングされたバリアント候補サイトの経験的バリアントスコア(EVSと省略される)特徴量セットの少なくとも50000～1000000個の訓練例について訓練される。
訓練において使用される訓練例の各々は、リードのグループにおける対応するバリアント候補サイトの特性を表すEVS特徴量セットを含む。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、全結合ニューラルネットワークの入力モジュールは、標的バリアント候補サイトの評価のためにEVS特徴量セットを供給する。
多数のプロセッサのうちの少なくとも1つで実行される、全結合ニューラルネットワークの出力モジュールは、標的バリアント候補サイトにおいて発生する少なくとも1つのバリアントが真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、全結合ニューラルネットワークによる分析を変換する。
このシステム実装形態および開示される他のシステムは任意選択で、以下の特徴のうちの1つまたは複数を含む。システムはまた、開示される方法に関連して説明される特徴を含み得る。簡潔にするために、システム特徴の代替的な組合せは個別に列挙されない。システム、方法、および製造物品に適用可能な特徴は、基本の特徴の各statutory classセットに対して繰り返されない。このセクションにおいて特定される特徴がどのように他のstatutory classの中の基本の特徴と容易に組み合わされ得るかを、読者は理解するであろう。
全結合ニューラルネットワークは、1つまたは複数の最大プーリング層および1つまたは複数のバッチ正規化層を有し得る。
全結合ニューラルネットワークはドロップアウトを使用することができる。
全結合ニューラルネットワークは、ソフトマックス分類層を使用して分類スコアを作り出すことができる。
他の実装形態は、上で説明されたシステムの機能を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する、非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。
別の実装形態では、開示される技術はバリアントコーリングの方法に関する。方法は、標的バリアント候補サイトの経験的バリアントスコア(EVSと省略される)特徴量セットを全結合ニューラルネットワークに供給するステップと、全結合ニューラルネットワークを通じてEVS特徴量セットを処理するステップとを含む。
全結合ニューラルネットワークは、並列に動作しメモリに結合される多数のプロセッサ上で実行され、全結合ニューラルネットワークの出力を対応するグラウンドトゥルースラベルと漸進的に照合する逆伝播ベースの勾配更新技法を使用して、真のバリアントというサイトの分類でラベリングされたバリアント候補サイトのEVS特徴量セットの少なくとも50000個の訓練例について訓練される。
EVS特徴量セットは、標的バリアント候補サイトの特性を表す。
方法はさらに、標的バリアント候補サイトにおいて発生する少なくとも1つのバリアントが真のバリアントである確率または偽のバリアントである確率に対する分類スコアへと、全結合ニューラルネットワークによるEVS特徴量セットの処理を変換するステップを含む。
システムの実装形態についてこの特定の実装セクションにおいて論じられる特徴の各々は、この方法の実装形態に等しく適用される。上で示されたように、すべてのシステム特徴はここで繰り返されず、参照によって繰り返されるものと見なされるべきである。
他の実装形態は、上で説明された方法を実行するようにプロセッサによって実行可能な命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含み得る。さらに別の実装形態は、メモリと、上で説明された方法を実行するためにメモリに記憶された命令を実行するように動作可能な1つまたは複数のプロセッサとを含む、システムを含み得る。
先行する説明は、開示される技術の作成および使用を可能にするために提示される。開示される実装形態に対する様々な修正が明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、開示される技術の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の実装形態および適用例に適用され得る。したがって、開示される技術は、示される実装形態に限定されることは意図されず、本明細書で開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲を認められるべきである。開示される技術の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
300A バリアント分類器CNNアーキテクチャ
300B バリアント分類器CNNアーキテクチャ
300C バリアント分類器CNNアーキテクチャ
400A 全結合層
400B バリアント分類器FCNアーキテクチャ
1200 コンピュータシステム
1210 ストレージサブシステム
1222 メモリサブシステム
1232 メインランダムアクセスメモリ(RAM)
1234 読取り専用メモリ(ROM)
1236 ファイルストレージサブシステム
1238 ユーザインターフェース入力デバイス
1255 バスサブシステム
1272 中央処理装置(CPU)
1274 ネットワークインターフェースサブシステム
1276 ユーザインターフェース出力デバイス
1278 深層学習プロセッサ

Claims (15)

  1. バリアントコーリングのコンピュータ実装方法であって、
    畳み込み層と全結合層とを含むニューラルネットワークを介して、
    （i）標的塩基場所におけるバリアント候補の評価のためのゲノムサンプルからリードのグループのためのデータであって、前記データは基準配列にアラインメントされる生リードフラグメントを含む、データと
    （ii）前記バリアント候補の特性を表す少なくとも１つの経験的バリアントスコア（EVS）特徴量と
    を入力として処理するステップと、
    前記処理に基づいて、前記ニューラルネットワークが、前記バリアント候補が真のバリアントまたは偽のバリアントである確率に対する分類スコアを出力として生成するステップと
    を含み、
    前記ニューラルネットワークは、グラウンドトゥルースバリアント分類でラベリングされたバリアント候補サイトにまたがるリードのグループの訓練例について訓練されるコンピュータ実装方法。
  2. 前記生リードフラグメントの各々が、各側に1つまたは複数の塩基に隣接される標的塩基場所を含む、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  3. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、前記基準配列の中に対応する基準塩基を含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  4. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、塩基コール正確度スコアを含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  5. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、鎖状態を含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  6. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、前記塩基の場所に隣接する挿入変化の挿入カウントを含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  7. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、前記塩基の場所における前記基準配列からの欠失を示す欠失フラグを含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  8. 前記生リードフラグメントの中の前記塩基の各々に、前記データは、前記塩基を含む対応するリードを前記基準配列にアラインメントすることのマッピング品質スコアを含む、請求項２に記載のコンピュータ実装方法。
  9. 前記EVS特徴量は、生殖細胞系列一塩基変異(SNV)特徴量である、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  10. 前記EVS特徴量は、生殖細胞系列インデル特徴量である、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  11. 前記EVS特徴量は、体細胞性SNV特徴量である、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  12. 前記EVS特徴量は、体細胞性インデル特徴量である、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  13. 前記ニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワークである、請求項１に記載のコンピュータ実装方法。
  14. バリアントをコールするためのコンピュータプログラム命令を記憶している非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令は、プロセッサ上で実行されたときに、
    畳み込み層と全結合層とを含むニューラルネットワークを介して、
    （i）標的塩基場所におけるバリアント候補の評価のためのゲノムサンプルからリードのグループのためのデータであって、前記データは基準配列にアラインメントされる生リードフラグメントを含む、データと
    （ii）前記バリアント候補の特性を表す少なくとも１つの経験的バリアントスコア（EVS）特徴量と
    を入力として処理するステップと、
    前記処理に基づいて、前記ニューラルネットワークが、前記バリアント候補が真のバリアントまたは偽のバリアントである確率に対する分類スコアを出力として生成するステップと
    を含み、
    前記ニューラルネットワークは、グラウンドトゥルースバリアント分類でラベリングされたバリアント候補サイトにまたがるリードのグループの訓練例について訓練される、方法を実行させる、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
  15. メモリに結合された1つまたは複数のプロセッサを含むシステムであって、前記メモリはバリアントをコールするためのコンピュータ命令がロードされ、前記命令は、前記プロセッサ上で実行されたときに、
    畳み込み層と全結合層とを含むニューラルネットワークを介して、
    （i）標的塩基場所におけるバリアント候補の評価のためのゲノムサンプルからリードのグループのためのデータであって、前記データは基準配列にアラインメントされる生リードフラグメントを含む、データと
    （ii）前記バリアント候補の特性を表す少なくとも１つの経験的バリアントスコア（EVS）特徴量と
    を入力として処理するステップと、
    前記処理に基づいて、前記ニューラルネットワークが、前記バリアント候補が真のバリアントまたは偽のバリアントである確率に対する分類スコアを出力として生成するステップと
    を含み、
    前記ニューラルネットワークは、グラウンドトゥルースバリアント分類でラベリングされたバリアント候補サイトにまたがるリードのグループの訓練例について訓練される、動作を実行させる、システム。
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