JP7252890B2 - 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド - Google Patents

血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、血液凝固障害の処置を改善するための製品及び方法に関する。
発明の背景
血液凝固因子の欠乏により引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は、それぞれ第ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）及び第ＩＸ血液凝固因子の欠乏により生じる血友病Ａ及びＢである。別の公知の出血障害はフォン・ヴィルブランド病（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＶＷＤ）である。
血漿中で、ＦＶＩＩＩは大部分はフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）との非共有結合複合体として存在し、そしてその凝固機能は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への第ＩＸａ因子依存性変換を加速することである。
古典的血友病又は血友病Ａは遺伝性の出血性障害である。これは染色体Ｘ連鎖性血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠損から生じ、そして１０，０００人あたり１人と２人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。Ｘ染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は増加した出血傾向である。
予防的処置を受けている重篤な血友病Ａ患者において、ＦＶＩＩＩは、約１２～１４時間というＦＶＩＩＩの短い血漿半減期のために週に約３回静脈内（ｉ．ｖ．）投与されなければならない。各ｉ．ｖ．投与は煩雑であり、痛みを伴い、そして特に大部分は家庭で患者自身により、又は血友病Ａと診断された児童の両親により行われるので、感染のリスクを伴う。
従って、このようなＦＶＩＩＩを含有する医薬組成物がより少ない頻度で投与されなければならないように、ＦＶＩＩＩの半減期を増加させることは非常に望ましいだろう。
細胞受容体との相互作用を減少させることにより（特許文献１、特許文献２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合で結合することにより（特許文献３、特許文献４及び特許文献５）、ＦＶＩＩＩの封入により（特許文献６）、新しい金属結合部位の導入により（特許文献７）、ペプチド連結（特許文献８及び特許文献９）若しくはジスルフィド連結（特許文献１０）のいずれかによりＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合で結合することにより、又はＡ１ドメインをＡ２ドメインに共有結合で結合すること（特許文献１１）のいずれかにより、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期を延長させるための幾つかの試みがなされた。
ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの機能的半減期を増強するための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）又はＶＷＦのＰＥＧ化（特許文献１５）によるもである。ペグ化ＶＷＦの増加された半減期は、血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期も間接的に増強するだろう。また、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（特許文献１６、特許文献１７及び特許文献１８）。
フォン・ビルブラント病（ＶＷＤ）の様々な形態において、欠失しているか、機能不全であるか又は減少した量でしか利用可能でないＶＷＦは、哺乳動物の血漿中に存在するマルチマーの接着性糖タンパク質であり、多数の生理学的機能を有する。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンのような細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして作用する。さらに、ＶＷＦは、プロコアグラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）ＦＶＩＩＩのための担体及び安定化タンパク質として役立つ。ＶＷＦは、内皮細胞及び巨核球において２８１３アミノ酸の前駆体分子として合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、非特許文献１に開示される。前駆体ポリペプチドのプレ－プロ－ＶＷＦは、Ｎ末端２２残基のシグナルペプチド、続いて７４１残基のプロペプチド及び成熟血漿ＶＷＦにおいて見出される２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献２）。小胞体におけるシグナルペプチドの切断後に、Ｃ末端ジスルフィド架橋が、ＶＷＦの２つのモノマー間に形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、１２のＮ連結及び１０のＯ連結炭水化物側鎖が付加される。より重要なことには、ＶＷＦダイマーは、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、そして７４１アミノ酸長のプロペプチドは、後期（ｌａｔｅ）ゴルジ体において酵素ＰＡＣＥ／フューリンにより開裂される。
血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１ドメイン内で高分子量ＶＷＦマルチマーを切断することができる。従って、血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一のダイマーから、１０，０００ｋＤａを超える分子量の２０まで又は２０より多くのダイマーからなるマルチマーまでの全範囲からなる。これによってＶＷＦ－ＨＭＷＭは最も強い止血活性を有し、これはリストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）で測定され得る。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比が高くなるほど、高分子量マルチマーの相対的な量が高くなる。
血漿中で、ＦＶＩＩＩは高い親和性でＶＷＦに結合し、これはそれを早期排出から保護し、従って、一次止血におけるその役割に加えてＦＶＩＩＩを安定化するための重大な役割を果たし、ＦＶＩＩＩの血漿レベルを調節し、そして結果として、二次止血を制御する中心的因子でもある。ＶＷＦに結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は血漿中で約１２～１４時間である。ＶＷＦが全く又はほとんど存在しない３型フォン・ヴィルブランド病において、ＦＶＩＩＩの半減期は約２～６時間しかなく、このような患者ではＦＶＩＩＩの減少した濃度に起因して軽度から中程度の血友病Ａの症状を生じる。ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの安定化効果はまた、ＣＨＯ細胞におけるＦＶＩＩＩの組み換え発現を補助するために使用されてきた（非特許文献３）。２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病は、ＦＶＩＩＩのＶＷＦに対する結合に影響を及ぼすＶＷＦにおける変異に起因する低いＦＶＩＩＩレベルに特徴づけられる。２Ｎ型ＶＷＤ患者におけるＦＶＩＩＩレベルは、ＶＷＦ中の特定の変異に依存して約３ＩＵ／ｄＬと３０ＩＵ／ｄＬとの間の範囲、典型的には２０ＩＵ／ｄＬ未満である。１型フォン・ヴィルブランド病は、正常ヒト血漿における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルと比較して減少した内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる（非特許文献４）。
ＶＷＦ由来ポリペプチド、特にＶＷＦフラグメントは、インビトロ及びインビボでＦＶＩＩＩを安定化すると記載されている。特許文献１９は、特定のＶＷＦフラグメント及びＦＶＩＩＩタンパク質を含むキメラタンパク質に関する。ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦフラグメントのこれらのキメラヘテロダイマーは、１：１のＶＷＦ対ＦＶＩＩＩの固定モル比を有する。特許文献２０及び特許文献２１は、ＶＷＦフラグメント及び血友病の処置のおけるそれらの使用を記載する。ＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティが、同様のモル量のＶＷＦフラグメントの血管外同時投与で有意に改善され得るということが見出された。ＦＶＩＩＩに対する高モル過剰のＶＷＦは望ましくないと言われ、そしてＦＶＩＩＩと皮下当時投与されるＶＷＦを用いた実験において、ＶＷＦ用量はＦＶＩＩＩバイオアベイラビリティに関して決定的ではないということが見出された。従って、ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦフラグメントのモル比は、最大５０：１に制限され、そして最大で１．５：１までの範囲が好ましいとされた。特許文献２２は、特定のＶＷＦフラグメント及び抗体Ｆｃ領域を含む融合ポリペプチドを開示し、１０：１までのＦＶＩＩＩに対するＶＷＦフラグメントの特定のモル比を提案する。特許文献２３は、同時発現するＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの切断型形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ）を含むＶＷＦポリペプチドを含むタンパク質を組み換えα－２，３－シアリルトランスフェラーゼを用いて製造するための方法を記載する。非特許文献５は、Ｄ’Ｄ３ドメインを含有するＶＷＦフラグメントが、ＶＷＦ欠損マウスにおいて第ＶＩＩＩ因子を安定化するために十分であるということを見出した。しかし、ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３－Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスに輸液された場合に顕著に長期の残存を示したが、ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３－Ｆｃ融合タンパク質は、同時輸液されたＦＶＩＩＩの残存を延長しなかった。
ＷＯ ０３／０９３３１３Ａ２ ＷＯ ０２／０６０９５１Ａ２ ＷＯ ９４／１５６２５ ＷＯ ９７／１１９５７ ＵＳ ４９７０３００ ＷＯ ９９／５５３０６ ＷＯ ９７／０３１９３ ＷＯ ９７／４０１４５ ＷＯ ０３／０８７３５５ ＷＯ ０２／１０３０２４Ａ２ ＷＯ２００６／１０８５９０ ＷＯ ２００７／１２６８０８ ＷＯ ２００６／０５３２９９ ＷＯ ２００４／０７５９２３ ＷＯ ２００６／０７１８０１ ＷＯ ２００４／１０１７４０ ＷＯ２００８／０７７６１６ ＷＯ ２００９／１５６１３７ ＷＯ ２０１３／１０６７８７ Ａ１ ＷＯ ２０１４／１９８６９９ Ａ２ ＷＯ ２０１３／０８３８５８ Ａ２ ＷＯ２０１１／０６０２４２ Ａ２ ＷＯ２０１３／０９３７６０ Ａ２
Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ． １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：４３９３-４３９７ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５１：３４５－３４８， １９９４ Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１２３３－１２４２ Ｓａｄｌｅｒ Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｂｌｉｎｄｅｒ Ｍ．， Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｉｎ：Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ， ｅｄｓ． Ｃｏｌｍａｎ， Ｍａｒｄｅｒ， Ｃｌｏｗｅｓ， Ｇｅｏｒｇｅ， Ａｉｒｄ， ａｎｄ Ｇｏｌｄｈａｂｅｒ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００６， ｐｐ ９０５－９２１ Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｂｌｏｏｄ １２４（３）：４４５－４５２
ＦＶＩＩＩの半減期を増加させる方法及び減少した投与頻度を用いるＦＶＩＩＩ製品に対する継続した必要性がある。
発明の要旨
内在性第ＶＩＩＩ因子のインビボ半減期が、切断型半減期延長ＶＷＦポリペプチド（本発明のポリペプチド）の投与により延長され得るということが、本発明者らにより見出された。内在性第ＶＩＩＩ因子のインビボ半減期が外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を必要とすることなくとも本発明の上記ポリペプチドの投与により延長され得るということも見出された。患者は、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩのレベルと比べて上記ポリペプチドを用いた処置の前に減少したレベルの内在性ＦＶＩＩＩを有する。上記患者における内在性ＦＶＩＩＩのレベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩのレベルの少なくとも０．５％である。本発明のポリペプチドは、内在性ＦＶＩＩＩレベルを上昇させることができる。これは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与する必要なく、患者の予防的処置を可能にする。外来性ＦＶＩＩＩが同時投与される場合、出血事象の経過観察処置を、本発明のポリペプチドのみを用いて、すなわち外来性ＦＶＩＩＩを継続した同時投与することなく行うことができる。外来性ＦＶＩＩＩの投与及びそれにより該被験体において内在性ＦＶＩＩＩを提供することにより、このような内在性第ＶＩＩＩ因子のインビボ半減期が延長され、患者は本発明のポリペプチドを用いた処置から利益を得ることができるということも見出された。
従って、本発明は特に以下の実施態様［１］～［９１］に関する：
［１］ 血液凝固障害の処置における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び半減期延長部分を含むポリペプチドであって、該処置は、血液凝固障害を有しかつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは正常ヒト血症（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、ここでポリペプチドは内在性ＦＶＩＩＩに結合することができ、そして内在性ＦＶＩＩＩレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで
－ （ｉ） 該ポリペプチドは、出血事象の予防のために投与され、ここで
ａ） 該処置はいずれも外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まず、もしくは
ｂ） 該処置は、外来性ＦＶＩＩＩが投与され、そしてそれにより該被験体において内在性ＦＶＩＩＩを提供することを含み；又は
－ （ｉｉ） 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく投与される、
上記使用のためのポリペプチド。
本発明は特に、本発明のポリペプチドにより安定化することができる残りの低レベルの内在性ＦＶＩＩＩから利益を得ることができるという利点を提供する。内在性ＦＶＩＩＩの安定化は、ＦＶＩＩＩのより高い保護的血漿レベルを可能にし得る。本発明の特定の局面によれば、ポリペプチドは、切断型ＶＷＦ及び半減期延長部分を含む上記ポリペプチドの血管外投与を場合により可能にする。さらに、本発明のポリペプチドを適用することにより投与頻度を減少させることができる。ポリペプチドの投与は、内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加を可能にし、これは生理的範囲に上昇され得るか又は生理的範囲で延長され得る。ポリペプチドの投与により、病理的ａＰＴＴ値は生理的値まで減少され得る。本発明の治療によれば外来性ＦＶＩＩＩは必ずしも投与される必要はなく、ＦＶＩＩＩに対する阻害剤の形成の可能性は減少され得る。従って、患者はＦＶＩＩＩの同時投与を必要とすることなくとも、本発明のポリペプチドを用いた処置から利益を受け得る。
［２］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）は、内在性ＦＶＩＩＩに結合するポリペプチドの能力を提供する、実施態様［１］に記載の使用のためのポリペプチド。
［３］ 内在性ＦＶＩＩＩレベルは、上記ポリペプチドの投与後に、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも１％、又は好ましくは少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％のレベルまで増加する、実施態様［１］又は実施態様［２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４］ 切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）は、ヒト切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）である、実施態様［１］～［３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５］ 上記ポリペプチドを用いた処置の前の上記被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの８０％未満、６０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満である、実施態様［１］～［４］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［６］ 上記被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％又は少なくとも５％である、実施態様［１］～［５］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７］ 上記血液凝固障害は、血友病Ａ又はフォン・ヴィルブランド病、好ましくは２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病、３型フォン・ヴィルブランド病又は１型フォン・ヴィルブランド病である、実施態様［１］～［６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８］ 上記血液凝固障害は、典型的には処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルがＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの１％～５％の間の範囲であることにより特徴づけられる中程度血友病Ａである、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［９］ 処置選択肢（ｉ）ａ）又は処置選択肢（ｉｉ）が適用されている、実施態様［８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［１０］ 上記血液凝固障害は、典型的には、処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルがＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの５％より高くかつ４０％までであることにより特徴づけられる軽度血友病Ａである、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［１１］ 処置選択肢（ｉ）ａ）又は処置選択肢（ｉｉ）が適用されている、実施態様［１０］に記載の使用のためのポリペプチド。
［１２］ 上記血液凝固障害は、典型的には、処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルが、通常は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％～約２０％に対応する約１ＩＵ／ｄＬと約２０ＩＵ／ｄＬとの間の範囲のＦＶＩＩＩ活性レベルであることにより特徴づけられる３型フォン・ヴィルブランド病である、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。患者の大部分は１０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの１０％未満のレベルを有する。
［１３］ 上記血液凝固障害は、典型的には、処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルが、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約３％～約３０％に対応する約３ＩＵ／ｄＬと約３０ＩＵ／ｄＬとの間の範囲のＦＶＩＩＩ活性レベルであることにより特徴づけられる２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病である、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。患者の大部分は２０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの２０％未満のレベルを有する。従って、２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病を有する被験体は、血漿中０．０ＩＵ／ｍＬ～０．３ＩＵ／ｍＬ、典型的には０．２ＩＵ／ｍＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
［１４］ 上記血液凝固障害は、典型的には、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルと比較して減少している処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる１型フォン・ヴィルブランド病である、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［１５］ 処置選択肢（ｉ）ａ）又は処置選択肢（ｉｉ）が適用されている、実施態様［１２］～［１４］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［１６］ 処置選択肢（ｉ）ｂ）が適用されている、実施態様［１］～［７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［１７］ 上記血液凝固障害は血友病Ａである、実施態様［１６］に記載の使用のためのポリペプチド。
［１８］ 凝固障害は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性の１％未満である処置前又は未処置の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより典型的に特徴づけられる重症血友病Ａである、実施態様［１７］に記載の使用のためのポリペプチド。
［１９］ 上記外来性ＦＶＩＩＩは、上記ポリペプチドの投与前もしくは投与後に投与されたか；又は上記外来性ＦＶＩＩＩは上記ポリペプチドと同時に投与されている、実施態様［１７］又は［１８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［２０］ 上記外来性ＦＶＩＩＩは上記ポリペプチドの前に投与された、実施態様［１９］に記載の使用のためのポリペプチド。
［２１］ 被験体は、内在性ＦＶＩＩＩ活性の供給のためにＦＶＩＩＩ遺伝子療法又はＦＶＩＩＩ遺伝子導入アプローチにより現在処置されているか又は処置されたが、内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルは好ましくは実施態様［５］において定義されるＦＶＩＩＩ活性レベルのうちの１つより低い。実施態様［１］～［２０］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［２２］ 処置選択肢（ｉ）ｂ）が適用されている一方で、「外来性」ＦＶＩＩＩがＦＶＩＩＩ遺伝子療法又はＦＶＩＩＩ遺伝子導入アプローチにより提供され、それにより内在性ＦＶＩＩＩを供給する、実施態様［２１］に記載の使用のためのポリペプチド。
［２３］ 投与された外来性ＦＶＩＩＩから生じた被験体の血漿内のＦＶＩＩＩの活性レベル及び被験体により内因的に形成された被験体の血漿内のＦＶＩＩＩの活性レベルは、いずれかのＦＶＩＩＩが被験体により形成される場合、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であるとみなされている、実施態様［１６］～［２０］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。他の言葉を用いて、この実施態様によれば、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％である内在性ＦＶＩＩＩは、外来性ＦＶＩＩＩが起源であるＦＶＩＩＩ、好ましくは以前に投与されたＦＶＩＩＩ、及び被験体により形成された内在性ＦＶＩＩＩの混合物であってもよく、又はＦＶＩＩＩが被験体により形成されない場合に以前に投与された残留ＦＶＩＩＩだけでもよい。
［２４］ ポリペプチドは静脈内及び／又は血管外に投与される、実施態様［１］～［２３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。血管外投与の場合、皮下投与が好ましい。
［２５］ 外来性ＦＶＩＩＩは静脈内投与され、すなわち、従って内在性ＦＶＩＩＩを提供する、実施態様［１６］～［２３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［２６］ 上記ポリペプチドは、ＶＩＩＩと異なる経路を介して投与され、好ましくは上記ポリペプチドは皮下投与される、実施態様［２５］に従う使用のためのポリペプチド。
［２７］ 上記ポリペプチドは静脈内投与される、実施態様［１６］～［２５］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［２８］ 被験体はヒトである、実施態様［１］～［２７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［２９］ ポリペプチドはダイマーである、実施態様［１］～［２８］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３０］ 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７７６～８０５又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸７７６～８０５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様［１］～［２９］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３１］ 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６６～８６４又は（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６６～８６４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％；少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施態様［１］～［３０］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３２］ 切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２を含む、実施態様［１］～［３２］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３３］ 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｃ） （ａ）もしくは（ｂ）のフラグメントからなる、実施態様［１］～［３２］のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド。
［３４］ 切断型ＶＷＦは配列番号４のアミノ酸１２４３～２８１３を欠失している、実施態様［１］～［３３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３５］ 半減期延長部分は、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、実施態様［１］～［３４］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３６］ 上記異種アミノ酸配列は、トランスフェリン又はそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモ－アミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アルブミン又は免疫グロブリン定常領域に生理条件下で結合することができるポリペプチド、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができるポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域及びその部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又は該ポリペプチドからなる、実施態様［３５］に記載の使用のためのポリペプチド。免疫グロブリン定常領域又はその部分は、好ましくは、免疫グロブリンＧ１のＦｃフラグメント、免疫グロブリンＧ２のＦｃフラグメント又は免疫グロブリンＡのＦｃフラグメントである。
［３７］ 半減期延長部分はポリペプチドに結合されている、実施態様［１］～［３６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［３８］ 上記半減期延長部分は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖又はアルブミン結合ペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施態様［３７］に記載の使用のためのポリペプチド。
［３９］ 内在性ＦＶＩＩＩの薬物動態パラメーターはポリペプチドの投与により改善され、特にここで内在性ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は増加し、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩの半減期は延長され、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩのクリアランスは減少する、実施態様［１］～［３８］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［４０］ 内在性ＦＶＩＩＩの血漿半減期を安定化及び／又は増加するための、実施態様［１］～［３９］のいずれか１つにおいて定義されるポリペプチドの使用。
［４１］ 提供された処置選択肢（ｉｉ）が適用され、そして上記ポリペプチドは、出血事象の処置のため、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく投与され、ここで外来性ＦＶＩＩＩに対する同時投与しようとするポリペプチドのモル比は５０より大きい、実施態様［１］～［４０］のいずれかに記載の使用のためのポリペプチド。同時投与される外来性ＦＶＩＩＩは、血漿由来であってもいずれかの組み換えＦＶＩＩＩであってもよい。組み換え外来性ＦＶＩＩＩは、例えば好ましくはアミノ酸配列配列番号５からなる単鎖第ＶＩＩＩ因子であり得る。
［４２］ 処置選択肢（ｉ）ｂ）又は処置選択肢（ｉｉ）が適用される場合、外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも５０である、実施態様［１］～［４１］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［４３］ 外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも７５である、実施態様［４２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４４］ 外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも１００である、実施態様［４２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４５］ 外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも２００である、実施態様［４２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４６］ 外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも３００である、実施態様［４２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４７］ 外来性ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドのモル比は少なくとも４００又は少なくとも５００である、実施態様［４２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［４８］ ポリペプチドはＮ－グリカンを含む糖タンパク質であり、そしてここで該Ｎ－グリカンの少なくとも７５％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、実施態様［１］～［４７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［４９］ 上記Ｎ－グリカンの少なくとも８５％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、実施態様［４８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［５０］ 上記Ｎ－グリカンの少なくとも９５％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、実施態様［４９］に記載の使用のためのポリペプチド。
［５１］ ポリペプチドはダイマーであり、好ましくは本明細書において開示される実施態様のうちの１つにおいて定義される２つのポリペプチド（モノマー）を含むホモダイマーであり、そしてダイマーを形成する２つのモノマーは、切断型ＶＷＦ内のシステイン残基により形成される１つ又はそれ以上のジスルフィド架橋を介して互いに共有結合で連結される、実施態様［１］～［５０］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５２］ １つ又はそれ以上のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、Ｃｙｓ－１０９９、Ｃｙｓ－１１４２、Ｃｙｓ－１２２２、Ｃｙｓ－１２２５、Ｃｙｓ－１２２７及びそれらの組み合わせからなる群より選択され、好ましくはＣｙｓ－１０９９及びＣｙｓ－１１４２であり、ここでアミノ酸番号付けは配列番号４を参照する、実施態様［５１］に記載の使用のためのポリペプチド。
［５３］ 上記ダイマーポリペプチドのＦＶＩＩＩ（外来性又は内在性ＦＶＩＩＩのいずれか）に対する親和性は、ダイマーポリペプチドのモノマーサブユニットと同じアミノ酸配列を有するモノマーポリペプチドの該ＦＶＩＩＩに対する親和性より高い、実施態様［５１］～［５２］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５４］ 本発明のポリペプチドの比ダイマー：モノマーは、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５又は少なくとも３である、実施態様［５１］～［５３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。最も好ましくは、本発明の全てのポリペプチドはダイマーとして存在する。
［５５］ ポリペプチドは、１ｎＭ未満、好ましくは５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満の解離定数ＫＤにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有する、実施態様［５１］～［５４］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５６］ 解離定数ＫＤは、０．１ｐＭ～５００ｐＭ、０．５ｐＭ～２００ｐＭ、０．７５ｐＭ～１００ｐＭ又は最も好ましくは１ｐＭ～８０ｐＭの範囲に及ぶ、実施態様［５５］に記載の使用のためのポリペプチド。
［５７］ ダイマーポリペプチドは、解離定数ＫＤにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有し、そしてダイマーポリペプチドの該解離定数ＫＤは、モノマーポリペプチドの解離定数ＫＤと比較して、好ましくは少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも５００分の１又は少なくとも１０００分の１に減少する、実施態様［５１］～［５６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５８］ 内在性ＦＶＩＩＩの薬物動態パラメーターは、ポリペプチドの投与により改善され、好ましくはここで、特に正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における対応するＦＶＩＩＩ薬物動態パラメーターと比較した場合、又はポリペプチドを投与されていない被験体における対応するＦＶＩＩＩ薬物動態パラメーターと比較した場合に、内在性ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は増加し、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩの半減期は延長され、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩのクリアランスは減少する 実施態様［１］～［５７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［５９］ 内在性ＦＶＩＩＩのＭＲＴ及び／又は終末相半減期の上記増加は少なくとも５０％である、実施態様［５８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６０］ 内在性ＦＶＩＩＩのＭＲＴ及び／又は終末相半減期の上記増加は少なくとも１００％である、実施態様［５９］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６１］ 内在性ＦＶＩＩＩのクリアランスはポリペプチドの投与により減少し、そして該減少は少なくとも２５％である、実施態様［５８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６２］ 上記減少は少なくとも５０％である、実施態様［６１］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６３］ 上記減少は少なくとも１００％である、実施態様［６２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６４］ 上記ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期と比較した場合、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期と比較した場合に増加する、実施態様［１］～［６３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［６５］ 上記ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの半減期及び／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの半減期よりも少なくとも２５％高く、特に少なくとも５０％高く、少なくとも７５％高く、又は少なくとも１００％高い、実施態様［６４］に記載の使用のためのポリペプチド。
［６６］ ポリペプチドのＭＲＴは、内在性ＶＷＦのＭＲＴと比較した場合、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦのＭＲＴと比較した場合、特に少なくとも２５％高く、少なくとも５０％高く、少なくとも７５％高く、又は少なくとも１００％高く増加する、実施態様［１］～［６５］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［６７］ ポリペプチドのＭＲＴ及び／又は血漿半減期は、参照ポリペプチドが半減期延長部分を欠いていることを除いて該ポリペプチドと同一である参照ポリペプチドのＭＲＴ及び／又は血漿半減期と比較した場合、増加している、実施態様［１］～［６６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［６８］ ポリペプチドは、未処置の被験体と比較して内在性第ＶＩＩＩ因子の最大濃度（Ｃｍａｘ）が増加する、実施態様［１］～［６７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［６９］ 上記ポリペプチドの投与後に、ＦＶＩＩＩについてのＣｍａｘは、少なくとも１０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも５０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００ｍＩＵ／ｍＬ又は少なくとも４００ｍＩＵ／ｍＬに達する、実施態様［６８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［７０］ ポリペプチドは、未処置の被験体と比較して、内在性第ＶＩＩＩ因子のゼロから最終測定時点までの血漿濃度－時間曲線下ピーク面積（ＡＵＣ）が増加する、実施態様［１］～［６９］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７１］ ポリペプチドの投与後に、内在性ＦＶＩＩＩについてのＡＵＣは、少なくとも１０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも５０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ又は少なくとも２００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬの発色ＦＶＩＩＩ活性レベルまで増加する、実施態様［７０］に記載の使用のためのポリペプチド。
［７２］ ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸は、野生型ＶＷＦのアミノ酸配列と比較して置換されており、ここでこのように改変されたポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する結合親和性は、上記改変以外は同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較して、該少なくとも１つの置換の導入によりさらに増加されている、実施態様［１］～［７１］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７３］ 切断型ＶＷＦ内の上記少なくとも１つの置換は、ポリペプチドの投与後に内在性ＦＶＩＩＩの半減期をさらに増加させる能力を有し、かつ／又は組み換えポリペプチドの投与しようとする用量の減少を可能にし得る、実施態様［７２］に記載の使用のためのポリペプチド。
［７４］ 置換は、アミノ酸番号付けに関して配列番号４の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、及びＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａからなる組み合わせの群から選択される、実施態様［７２］～［７３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７５］ 上記置換は組み合わせＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ又はＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａのいずれかである、実施態様［７４］に記載の使用のためのポリペプチド。
［７６］ 上記ポリペプチドは、血管外に、特に皮下投与され、そして投与後にポリペプチドは、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又は少なくとも８０％のバイオアベイラビリティを示す、実施態様［１］～［７５］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７７］ ポリペプチドの投与後に、被験体の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加が達成され、好ましくは内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルは、生理的ＦＶＩＩＩレベル（１００％＝１ＩＵ／ｍＬ）まで増加するか、又はポリペプチドの投与後に生理的ＦＶＩＩＩレベルより高くは実質的に増加せず、好ましくは、それぞれ正常ヒト血漿における平均ＦＶＩＩＩ活性レベルの３００％＝３ＩＵ／ｍＬを超えない、より好ましくは２５０％＝２．５ＩＵ／ｍＬを超えない、２００％＝２ＩＵ／ｍＬを超えない、１５０％＝１．５ＩＵ／ｍＬを超えない、又は１２０％＝１．２ＩＵ／ｍＬを超えない内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加を生じる、実施態様［１］～［７６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７８］ 血液凝固障害に罹患している被験体へのポリペプチドの投与後に、増加した血栓形成リスクが予防される、実施態様［１］～［７７］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［７９］ 血栓形成リスクの予防は、ポリペプチドの投与後の被験体における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの限定的増加のみによって決定されるか又は達成され、好ましくは内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルは、生理的ＦＶＩＩＩレベル（１００％＝１ＩＵ／ｍＬ）まで増加するか、又はポリペプチドの投与後に生理的ＦＶＩＩＩレベルより高くは実質的に増加せず、好ましくは、それぞれ正常ヒト血漿の血漿中の平均ＦＶＩＩＩ活性レベルの３００％＝３ＩＵ／ｍＬを超えない、より好ましくは２５０％＝２．５ＩＵ／ｍＬを超えない、２００％＝２ＩＵ／ｍＬを超えない、１５０％＝１．５ＩＵ／ｍＬを超えない、又は１２０％＝１．２ＩＵ／ｍＬを超えない内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加を生じる、実施態様［７８］に記載の使用のためのポリペプチド。
［８０］ 上記ポリペプチドの投与後に、ポリペプチドについての最大濃度（Ｃｍａｘ）は、少なくとも２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも４０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも６０ｎｍｏｌ／ｋｇ、少なくとも８０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は少なくとも１６０ｎｍｏｌ／ｋｇである、実施態様［１］～［７９］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８１］ 上記ポリペプチドの投与後に、投与されたポリペプチドについてのｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０－ｉｎｆ）は、少なくとも２ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬ、少なくとも３ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬ、少なくとも４ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬ、又は少なくとも８０ｎｍｏｌ ＊ ｈ／ｍＬである、実施態様［１］～［８０］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８２］ 上記ポリペプチドの投与後に、ポリペプチドについてのクリアランス（ＣＬ）値は、参照処置と比較して少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に減少し、ここで該参照処置は、投与しようとするポリペプチドが半減期延長部分を含まないこと以外は上記処置と同じである、実施態様［１］～［８１］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８３］ ポリペプチドは、ポリペプチド少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも３ｍｇ／ｋｇの量で投与される、実施態様［１］～［８２］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８４］ 組み換えポリペプチドは、２０ｍｇ／ｋｇを超えない、１５ｍｇ／ｋｇを超えない、１０ｍｇ／ｋｇを超えない、又は５ｍｇ／ｋｇを超えないポリペプチドの量で投与される、実施態様［１］～［８３］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８５］ ポリペプチドの投与後に、生理的活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）値が達成され、特に病理的ａＰＴＴ値が生理的値に減少する、実施態様［１］～［８４］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８６］ ポリペプチドの投与後に、活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）は、少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも２．５分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に減少する、実施態様［８５］に記載の使用のためのポリペプチド。
［８７］ ポリペプチドは、好ましくは月に１回、３週ごとに１回、２週ごとに１回、７日ごとに１回、週に２回、又は２日ごとに１回の投薬で繰り返し投与される、実施態様［１］～［８６］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［８８］ 上記繰り返し、すなわち複数回のポリペプチドの投与の後に、被験体における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの定常状態レベルが達成され、ここで定常状態ＦＶＩＩＩ活性レベルは、１％より高いトラフレベル、好ましくは５％より高いトラフレベル、好ましくは１０％より高いトラフレベル、より好ましくは２０％より高いトラフレベル、より好ましくは５０％より高いトラフレベルをもたらし、そしてさらに最も好ましくは定常状態ＦＶＩＩＩ活性レベルは、本質的に生理的ＦＶＩＩＩ活性レベルの範囲内である、実施態様［８７］に記載の使用のためのポリペプチド。
［８９］ 上記繰り返し、すなわち複数回の投与の後に、活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）の持続的減少が被験体において達成され、ここでａＰＴＴは好ましくは、本質的にａＰＴＴの生理的範囲内である、実施態様［８７］～［８８］のいずれか１つに記載の使用のためのポリペプチド。
［９０］ ＦＶＩＩＩを同時投与することなく、実施態様［１］～［８９］のいずれか１つにおいて定義されるポリペプチドの有効量を患者に投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法であって、該患者は内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有し、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該患者における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少するが、ただし該患者における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは該ポリペプチドの投与後に増加する、上記方法。上記ポリペプチドは、好ましくは出血事象の予防のために投与され、ここで該処置は外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まないか、又は該ポリペプチドは、出血事象の処置のためもしくは予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく該ポリペプチドが投与される。
［９１］ 実施態様［１］～［８９］のいずれか１つにおいて定義されるポリペプチドの有効量を患者に投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法であって、該患者は内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有し、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該患者における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少しているが、ただし該患者における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは該ポリペプチドの投与後に増加する、上記方法。該処置は、外来性ＦＶＩＩＩを投与し、それにより該被験体において内在性ＦＶＩＩＩを供給することを含む。該ポリペプチドは、好ましくは出血事象の予防のために投与される。好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは皮下投与され、そしてＦＶＩＩＩは静脈内投与される。
図１は、実施例１．１に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの静脈内（ｉ．ｖ．）投与後のＣＤラットにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露、ＦＶＩＩＩ活性及びａＰＴＴを示す。図１Ａは、そのアルブミン成分を介して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータは時点あたりｎ＝２～３匹のラットについて平均±ＳＤとして示される；図１Ｂは、発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩをＩＵ／ｍＬで示し、そしてデータは時点あたりｎ＝１～３匹のラットについて平均±ＳＤとして示される（投薬前（ｐｒｅｄｏｓｅ）データを除く：ｎ＝７）。点線は投薬前データの最小及び最大を表す。ＵＬＮと印をつけられた点線は正常の上限を表す；図１Ｃは、凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータは時点あたりｎ＝１～３匹のラットについての平均±ＳＤとして示される（投薬前データを除く：ｎ＝７）。点線は投薬前データの最小及び最大を表す。ＵＬＮと印をつけられた点線は正常の上限を表す；図１Ｄは、上記のように発色又は凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示す。ＡＵＣを時間ゼロから１４日目までの血漿濃度－時間曲線下のピーク面積として計算した図１Ｅは、Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬを使用した活性化部分トロンビン時間を示し、そしてデータは時点あたりｎ＝１～３匹のラットについての平均±ＳＤとして示される（投薬前データを除く：ｎ＝７）。点線は投薬前データの最小及び最大を表す。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図２は、実施例１．２に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．投与後のウサギにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露、ＦＶＩＩＩ活性及びａＰＴＴを示す。図２Ａは、そのアルブミン成分を介して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータは時点あたりｎ＝１～３匹のウサギについての平均±ＳＤとして示される；図２Ｂは、発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩをＩＵ／ｍＬで示し、そしてデータは時点あたりｎ＝１～３匹のウサギについての平均±ＳＤとして示される。点線は投薬前データの最小及び最大を表す；図２Ｃは、凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～３匹のウサギについての平均±ＳＤとして示される。点線は投薬前データの最小及び最大を表す；図２Ｄは、上記のように発色又は凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示す。ＡＵＣを時間ゼロから１０日目までの血漿濃度－時間曲線下ピーク面積として計算した；図２Ｅは、Ａｃｔｉｎ（Ｒ）ＦＳＬを使用した活性化部分トロンビン時間を示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～３匹のウサギについての平均±ＳＤとして示す。点線は投薬前データの最小及び最大を表す。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図３は、実施例１．３に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．投与後のサルにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露及びＦＶＩＩＩ活性を示す。図３Ａは、そのアルブミン成分を介して定量された標準に対して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のサルについての平均±ＳＤとして示す；図３Ｂは、発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のサルについての平均±ＳＤとして示す。点線は投薬前データの最小及び最大を表し、そして破線は投薬前データの平均を表す（投薬前データ：ｎ＝２２）。 図４は、実施例１．４に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．投与後のＶＷＦノックアウトラットにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露、ＦＶＩＩＩ活性及びａＰＴＴを示す。図４Ａは、そのアルブミン成分を介して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す；図４Ｂは、発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩをＩＵ／ｍＬで示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す（投薬前データを除く：ｎ≦８）。ＶＷＦノックアウト（ｋｏ）ラットにおける投薬前データは定量限界未満であった。網掛け領域は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表し；ＵＬＮと印をつけられた点線は正常の上限を表す；図４Ｃは、凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す（投薬前データを除く：ｎ≦８）。網掛け領域は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表し；ＵＬＮと印を付けられた点線は正常の上限を表す；図４Ｄは、上記のように発色又は凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示す。ＡＵＣを時間ゼロから１０日目までの血漿濃度－時間曲線下ピーク面積として計算した；図４Ｅは、Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬを使用した活性化部分トロンビン時間を示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～３匹のラットについての平均±ＳＤとして示す（投薬前データを除く：ｎ≦７）。点線はＶＷＦ ｋｏラットの投薬前データの最小及び最大を表す。網掛け領域は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表す。 図４－１の続き。 図４－２の続き。 図５は、実施例１．５に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後のＶＷＦノックアウトマウスにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露及びＦＶＩＩＩ活性を示す。図５Ａは、そのアルブミン成分を介して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す；図５Ｂは、発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩをｍＩＵ／ｍＬで示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のマウスの平均±ＳＤとして示す。ＶＷＦ ｋｏマウスにおけるビヒクルデータは定量限界未満（ＬＬＯＱ）である。網掛け領域は健常ＮＭＲＩマウスからの投薬前データの最小及び最大を表す；図５Ｃは、凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３～４匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す。ＶＷＦ ｋｏマウスにおけるビヒクルデータは検出限界未満である；図５Ｄは、上記のように発色又は凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示す。ＡＵＣを時間ゼロから７日目までの血漿濃度－時間曲線下ピーク面積として計算した； 図５－１の続き。 図６は、実施例１．６に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３変異体のｉ．ｖ．投与後のＶＷＦノックアウトラットにおけるｒＤ’Ｄ３変異体曝露及びＦＶＩＩＩ活性を示す。図６Ａは、そのアルブミン成分を介して（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）又はＤ’Ｄ３成分を介して（ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰ）ＶＷＦ ｋｏラットにおいて定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＷＴ、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹ、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹＡ又はｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。点線はそれぞれアルブミン及びｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰについての検出限界を表す；図６Ｂは、ＶＷＦ ｋｏラットにおいて発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩをｍＩＵ／ｍＬで示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す；図６Ｃは、ＶＷＦ ｋｏラットにおける凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを標準の％で示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す；図６Ｄは、上記のように発色又は凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示す。ＡＵＣを時間ゼロから１０日目までの血漿濃度－時間曲線下のピーク面積として計算した。 図６－１の続き。 図７は、実施例１．７において記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．又は皮下（ｓ．ｃ．）投与後のＦＶＩＩＩノックアウト、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩマウス並びにＶＷＦ ｋｏ若しくはＣＤラット又はブタにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を示す。図７Ａ－１は、そのアルブミン成分を介してＦＶＩＩＩ ｋｏ、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩマウスにおいて定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～３匹のマウスについての平均±ＳＤとして示す；図７Ａ－２は、ＶＷＦ ｋｏ及びＣＤラットにおいてそのアルブミン成分を介して定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰ を示し、そしてデータを時点あたりのｎ＝２～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。点線はｒＤ’Ｄ３－ＦＰについての検出限界を表す；図７Ａ－３は、そのアルブミン成分を介してブタにおいて定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝１～３匹のブタについての平均±ＳＤとして示す。破線はｒＤ’Ｄ３－ＦＰについての検出限界を表す；図７Ｂ－１は、ＶＷＦ ｋｏラットにおける発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２～４匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。点線は未処置の健常ＣＤラットからのデータの最小及び最大を表す；図７Ｂ－２は、ブタにおける発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２～３匹のブタについての平均±ＳＤとして示す。点線はブタからの投薬前値からの範囲を表す。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 図８は、実施例１．８に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．投与後のＦＶＩＩＩノックアウト、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩマウス並びにＶＷＦ ｋｏ若しくはＣＤラット又はブタにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露及びＦＶＩＩＩ発色活性を示す。図８Ａは、そのアルブミン成分を介してＶＷＦ ｋｏラットにおいて定量されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。破線はｒＤ’Ｄ３－ＦＰについての検出限界を表す；図８Ｂは、ＶＷＦ ｋｏラットにおいて発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２～３匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。点線の付いた灰色網掛けは未処置の健常ＣＤラットからのデータの最小及び最大を表す；図８Ｃは、ＶＷＦ ｋｏラットにおいて凝固ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。灰色網掛けは未処置の健常ＣＤラットからのデータの最小から最大の範囲を表す；図８Ｄは、ＶＷＦ ｋｏラットにおいてＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬを使用した活性化部分トロンビン時間を示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２匹のラットについての平均±ＳＤとして示す。灰色網掛けはＶＷＦ ｋｏラットの投薬前データの最小及び最大を表す。網掛け領域は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表す。 図８－１の続き。 図９は、実施例１．９に記載されるように、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．投与又は／及び又はｓ．ｃ．投与と組み合わされた投与後のＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ及びＦＶＩＩＩ曝露を示す。図９Ａは、ＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおいて発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝３匹のＦＶＩＩＩ ｋｏマウスについての平均±ＳＤとして示す。検出限界は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表す；図９Ｂは、ＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおいて発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２～３匹のＦＶＩＩＩ ｋｏマウスについての平均±ＳＤとして示す。検出限界は、健常ＣＤラットからの投薬前データの最小及び最大を表す；図９Ｃは、ＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおいて発色ＦＶＩＩＩ活性として定量されたＦＶＩＩＩを示し、そしてデータを時点あたりｎ＝２～３匹のＦＶＩＩＩ ｋｏマウスについての平均±ＳＤとして示す。検出限界は健常ＣＤラットからの投薬前データの最小および最大を表す。 図９－１の続き。
詳細な説明
第一の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置における使用のための、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び（ｉｉ）半減期延長部分を含むポリペプチドに関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しており、かつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そして該ポリペプチドは出血事象の予防のために投与され、ここで該処置は外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まない。
第二の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置における使用のための、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び（ｉｉ）半減期延長部分を含むポリペプチドに関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しており、かつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで該ポリペプチドは、出血事象の処置のため又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩと同時投与すること無く投与される。
第三の局面は、血液凝固障害の処置における使用のための、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子 （ＶＷＦ）及び（ｉｉ）半減期延長部分を含むポリペプチドを含む医薬組成物に関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しており、かつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは該ポリペプチドの投与後に増加し、そして該ポリペプチドは、出血事象の予防のために投与され、ここで該処置は外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まない。
第四の局面は、血液凝固障害の処置における使用のための、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び（ｉｉ）半減期延長部分を含むポリペプチドを含む医薬組成物に関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しておりかつ内在性第ＶＩＩＩ因子 （ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで該ポリペプチドは、出血事象の処置のため又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩと同時投与することなく投与される。
第五の局面は、血液凝固障害の処置のための薬剤の製造のための、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び（ｉｉ）半減期延長部分を含む組み換えポリペプチドの使用に関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しておりかつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体の内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比較して減少しているが、ただし内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、そしてそれにより内在性ＦＶＩＩＩレベルは、該ポリペプチドの投与後の増加し、そしてここで
－ （ｉ） 該ポリペプチドは出血事象の予防のために投与され、ここで
該処置は外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まず；又は
－ （ｉｉ） 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため若しくは予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく投与される。
切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び半減期延長部分を含むポリペプチドは、本明細書において「本発明のポリペプチド」と呼ばれる。
切断型ＶＷＦ
本明細書で使用される用語「フォン・ヴィルブランド因子」（ＶＷＦ）は、天然に存在する（天然）ＶＷＦを含むが、天然に存在するＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を少なくとも保持するその変異体、例えば１つ又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換されている配列変異体も含む。ＦＶＩＩＩ結合活性は、実施例２に記載されるＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ結合アッセイにより決定される。
本発明に従うＶＷＦは、配列番号４に示されるアミノ酸配列により表されるヒトＶＷＦであり、そして好ましくは切断型ＶＷＦである。配列番号４をコードするｃＤＮＡは配列番号３で示される。
ヒト天然ＶＷＦをコードする遺伝子は、９ｋｂ ｍＲＮＡに転写され、これが３１０，０００ Ｄａの推定分子量を有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチド（ｐｒｅ－ｐｒｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）に翻訳される。プレプロポリペプチドは、Ｎ末端２２アミノ酸シグナルペプチド、続いて７４１アミノ酸プロポリペプチド（配列番号４のアミノ酸２３～７６３）及び成熟サブユニット（配列番号４のアミノ酸７６４～２８１３）を含有する。７４１アミノ酸プロポリペプチドのＮ末端からの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦを生じる。ヒト天然ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。別の指示がなければ、ＶＷＦ分子が配列番号４の全ての残基を含むのではない場合でも、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸番号付けは配列番号４を参照する。
天然ＶＷＦのプロポリペプチドは多数のドメインを含む。様々なドメインアノテーションを文献に見ることができる（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｂｌｏｏｄ １２０（２）：４４９－４５８を参照のこと）。ＶＷＦの天然プレプロポリペプチドの以下のドメインアノテーションが本出願において適用される：
Ｄ１－Ｄ２－Ｄ’－Ｄ３－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ｄ４－Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－ＣＫ
配列番号４に関して、Ｄ’ドメインは、アミノ酸７６４～８６５からなり；そしてＤ３ドメインはアミノ酸８６６～１２４２からなる。
特徴「切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、成熟ＶＷＦのアミノ酸配列全体（配列番号４のアミノ酸７６４～２８１３）を含むのではないということを意味する。典型的には、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４～２８１３全てを含むのではなく、そのフラグメントだけ含む。切断型ＶＷＦはまた、ＶＷＦフラグメントと呼ばれても、複数形でＶＷＦフラグメントと呼ばれてもよい。
典型的には、切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。好ましくは、切断型ＶＷＦは、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合することができる。切断型ＶＷＦは、内在性及び／又は外来性第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。特定の実施態様において、切断型ＶＷＦは、同時投与された組み換えＦＶＩＩＩに、好ましくは本明細書に記載されるＦＶＩＩＩに、より好ましくは配列番号５のアミノ酸配列からなる単鎖第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。切断型ＶＷＦの第ＶＩＩＩ因子への結合は、実施例２に記載されるように、ＦＶＩＩＩ－ＶＷＦ結合アッセイにより決定することができる。
本発明の切断型ＶＷＦは、好ましくは配列番号４のアミノ酸７７６～８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７７６～８０５に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは配列番号４のアミノ酸７７６～８０５を含むかこれらからなる。本明細書において別の指示がなければ、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号４のアミノ酸７７６～８０５）の全長にわたって決定される。
本発明の切断型ＶＷＦは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸７６６～８６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６～８６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６６～８６４を含むか又はこれらからなるものである。
別の好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦは、なおＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２、又は（ｂ）そのフラグメントからなるが、ただし、切断型ＶＷＦは、なおＦＶＩＩＩに結合することができる。
以下により詳細に記載されるように、ポリペプチドは、切断型ＶＷＦを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を使用する方法により製造され得る。核酸は、それ自体公知の技術により適切な宿主細胞に導入される。
好ましい実施態様において、宿主細胞中の核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型成熟ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１～１２４２に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。もっとも好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号４のアミノ酸１～１２４２、又は（ｂ）そのフラグメントをコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおＦＶＩＩＩに結合することができる。特に本発明のポリペプチドがダイマーである場合、たとえポリペプチドにおける切断型ＶＷＦがＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１～７６３を含まなくても、核酸はＶＷＦ（例えば配列番号４）のアミノ酸１～７６３をコードする配列を含む。
他の実施態様において、切断型ＶＷＦは、それぞれが配列番号４を参照する以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むか又はそれからなる：
７７６－８０５；７６６－８０５；７６４－８０５；７７６－８１０；７６６－８１０；７６４－８１０；７７６－８１５；７６６－８１５；７６４－８１５；
７７６－８２０；７６６－８２０；７６４－８２０；７７６－８２５；７６６－８２５；７６４－８２５；７７６－８３０；７６６－８３０；７６４－８３０；
７７６－８３５；７６６－８３５；７６４－８３５；７７６－８４０；７６６－８４０；７６４－８４０；７７６－８４５；７６６－８４５；７６４－８４５；
７７６－８５０；７６６－８５０；７６４－８５０；７７６－８５５；７６６－８５５；７６４－８５５；７７６－８６０；７６６－８６０；７６４－８６０；
７７６－８６４；７６６－８６４；７６４－８６４；７７６－８６５；７６６－８６５；７６４－８６５；７７６－８７０；７６６－８７０；７６４－８７０；
７７６－８７５；７６６－８７５；７６４－８７５；７７６－８８０；７６６－８８０；７６４－８８０；７７６－８８５；７６６－８８５；７６４－８８５；
７７６－８９０；７６６－８９０；７６４－８９０；７７６－８９５；７６６－８９５；７６４－８９５；７７６－９００；７６６－９００；７６４－９００；
７７６－９０５；７６６－９０５；７６４－９０５；７７６－９１０；７６６－９１０；７６４－９１０；７７６－９１５；７６６－９１５；７６４－９１５；
７７６－９２０；７６６－９２０；７６４－９２０；７７６－９２５；７６６－９２５；７６４－９２５；７７６－９３０；７６６－９３０；７６４－９３０；
７７６－９３５；７６６－９３５；７６４－９３５；７７６－９４０；７６６－９４０；７６４－９４０；７７６－９４５；７６６－９４５；７６４－９４５；
７７６－９５０；７６６－９５０；７６４－９５０；７７６－９５５；７６６－９５５；７６４－９５５；７７６－９６０；７６６－９６０；７６４－９６０；
７７６－９６５；７６６－９６５；７６４－９６５；７７６－９７０；７６６－９７０；７６４－９７０；７７６－９７５；７６６－９７５；７６４－９７５；
７７６－９８０；７６６－９８０；７６４－９８０；７７６－９８５；７６６－９８５；７６４－９８５；７７６－９９０；７６６－９９０；７６４－９９０；
７７６－９９５；７６６－９９５；７６４－９９５；７７６－１０００；７６６－１０００；７６４－１０００；７７６－１００５；７６６－１００５；７６４－１００５；
７７６－１０１０；７６６－１０１０；７６４－１０１０；７７６－１０１５；７６６－１０１５；７６４－１０１５；７７６－１０２０；７６６－１０２０；７６４－１０２０；
７７６－１０２５；７６６－１０２５；７６４－１０２５；７７６－１０３０；７６６－１０３０；７６４－１０３０；７７６－１０３５；７６６－１０３５；７６４－１０３５；
７７６－１０４０；７６６－１０４０；７６４－１０４０；７７６－１０４５；７６６－１０４５；７６４－１０４５；７７６－１０５０；７６６－１０５０；７６４－１０５０；
７７６－１０５５；７６６－１０５５；７６４－１０５５；７７６－１０６０；７６６－１０６０；７６４－１０６０；７７６－１０６５；７６６－１０６５；７６４－１０６５；
７７６－１０７０；７６６－１０７０；７６４－１０７０；７７６－１０７５；７６６－１０７５；７６４－１０７５；７７６－１０８０；７６６－１０８０；７６４－１０８０；
７７６－１０８５；７６６－１０８５；７６４－１０８５；７７６－１０９０；７６６－１０９０；７６４－１０９０；７７６－１０９５；７６６－１０９５；７６４－１０９５；
７７６－１１００；７６６－１１００；７６４－１１００；７７６－１１０５；７６６－１１０５；７６４－１１０５；７７６－１１１０；７６６－１１１０；７６４－１１１０；
７７６－１１１５；７６６－１１１５；７６４－１１１５；７７６－１１２０；７６６－１１２０；７６４－１１２０；７７６－１１２５；７６６－１１２５；７６４－１１２５；
７７６－１１３０；７６６－１１３０；７６４－１１３０；７７６－１１３５；７６６－１１３５；７６４－１１３５；７７６－１１４０；７６６－１１４０；７６４－１１４０；
７７６－１１４５；７６６－１１４５；７６４－１１４５；７７６－１１５０；７６６－１１５０；７６４－１１５０；７７６－１１５５；７６６－１１５５；７６４－１１５５；
７７６－１１６０；７６６－１１６０；７６４－１１６０；７７６－１１６５；７６６－１１６５；７６４－１１６５；７７６－１１７０；７６６－１１７０；７６４－１１７０；
７７６－１１７５；７６６－１１７５；７６４－１１７５；７７６－１１８０；７６６－１１８０；７６４－１１８０；７７６－１１８５；７６６－１１８５；７６４－１１８５；
７７６－１１９０；７６６－１１９０；７６４－１１９０；７７６－１１９５；７６６－１１９５；７６４－１１９５；７７６－１２００；７６６－１２００；７６４－１２００；
７７６－１２０５；７６６－１２０５；７６４－１２０５；７７６－１２１０；７６６－１２１０；７６４－１２１０；７７６－１２１５；７６６－１２１５；７６４－１２１５；
７７６－１２２０；７６６－１２２０；７６４－１２２０；７７６－１２２５；７６６－１２２５；７６４－１２２５；７７６－１２３０；７６６－１２３０；７６４－１２３０；
７７６－１２３５；７６６－１２３５；７６４－１２３５；７７６－１２４０；７６６－１２４０；７６４－１２４０；７７６－１２４２；７６６－１２４２；７６４－１２４２；
７６４－１４６４；７６４－１２５０；７６４－１０４１；７６４－８２８；７６４－８６５；７６４－１０４５；７６４－１０３５；７６４－１１２８；７６４－１１９８；
７６４－１２６８；７６４－１２６１；７６４－１２６４；７６４－１４５９；７６４－１４６３；７６４－１４６４；７６４－１６８３；７６４－１８７３；７６４－１４８２；
７６４－１４７９；７６４－１６７２；及び７６４－１８７４。
特定の実施態様において、切断型ＶＷＦは、成熟野生型ＶＷＦと比較して内部欠失を有する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ＣＫドメイン又はそれらの組み合わせが欠失され得、そしてＤ’ドメイン及び／又はＤ３ドメインが保持される。さらなる実施態様において、切断型ＶＷＦは、血小板糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）、コラーゲン及び／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩ（Ｃ１ドメイン内のＲＧＤＳ配列）についての結合部位を含まない。他の実施態様において、切断型ＶＷＦは、ＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５－Ｍｅｔ１６０６）を含まない。さらに別の実施態様において、切断型ＶＷＦはＧＰＩｂαについての結合部位を含まず、かつ／又はコラーゲンについての結合部位を含まず、かつ／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩについての結合部位を含まず、かつ／又はＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５－Ｍｅｔ１６０６）を含まない。
他の実施態様において、切断型ＶＷＦは、前の段落において列挙されるアミノ酸配列のうちの１つに対して、少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかそれからなるものであり、ただし切断型ＶＷＦはＦＶＩＩＩに結合することができる。
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの２つのモノマーが共有結合で連結されている場合、本発明において「ダイマー」と称される。好ましくは、２つのモノマーサブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド架橋により、例えば１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド架橋を介して共有結合により連結される。少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは本発明のポリペプチドの切断型ＶＷＦ部分内に位置する。一実施態様において、これらのシステイン残基は、Ｃｙｓ－１０９９、Ｃｙｓ－１１４２、Ｃｙｓ－１２２２、Ｃｙｓ－１２２５、若しくはＣｙｓ－１２２７又はそれらの組み合わせである。
ダイマーは好ましくはホモダイマーであり、それにより各モノマーは好ましくは本明細書に開示される半減期延長部分を含む。本発明のポリペプチドがダイマーである場合、切断型ＶＷＦは、好ましくは配列番号４のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、又はアミノ酸７６４～１２２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含むか又はそれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、又はアミノ酸７６４～１２２７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれからなるものであり、かつＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、配列番号４のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、アミノ酸７６４～１２２７又はアミノ酸７６４～１２４２を含むか又はそれらからなる。
切断型ＶＷＦは、ＷＯ ２０１３／１０６７８７Ａ１、ＷＯ ２０１４／１９８６９９Ａ２、ＷＯ ２０１１／０６０２４２Ａ２又はＷＯ ２０１３／０９３７６０ Ａ２（その開示は本明細書に参照により加入される）において開示されるＶＷＦフラグメントのいずれか１つであってもよい。
さらなる好ましい実施態様によれば、上で開示される切断型ＶＷＦは、ＷＯ２０１６／００００３９Ａ１に開示されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み得る。切断型ＶＷＦのそれらの改変バージョンは、配列番号４に従う野生型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列と比較して、そのＤ’ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。切断型ＶＷＦの改変バージョンのアミノ酸配列は、それぞれの野生型配列と比べて１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有し得る。修飾された切断型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号４のＤ’ドメインと比べて１つ又は２つのアミノ酸置換を有する。配列番号４の位置７６４（配列番号２の位置１に対応する）におけるＳが、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群より選択されるアミノ酸で置換されていることが好ましい。配列番号４の位置７６６（配列番号２の位置３に対応する）におけるＳが、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群より選択されるアミノ酸で置換されていることも好ましい。置換の好ましい組み合わせとしては、配列番号４の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ及びＳ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌが挙げられる。本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する結合親和性は、上記修飾を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドをの結合親和性と比較して、上記置換の導入によりさらに増加し得る。切断型ＶＷＦ内の上記置換は、内在性ＦＶＩＩＩの半減期若しくは同時投与されるＦＶＩＩＩの半減期をさらに増加するように寄与し得、かつ／又は投与しようとする本発明の組み換えポリペプチドの用量の減少を可能にし得る。
半減期延長部分
ヒト血漿における内在性ＶＷＦの半減期は約１６時間である（Ｌｅｎｔｉｎｇ ＰＪ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ ＯＤ、Ｄｅｎｉｓ ＣＶ． ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、ａｎｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｒ ｅｎｄｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２０１５．１２５（１３）：２０１９－２８）。
本発明のポリペプチドは、特定の好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦに加えて半減期延長部分をさらに含む。半減期延長部分は、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列であり得る。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合と異なる共有結合により切断型ＶＷＦを含むポリペプチドに化学的に結合され得る。
本発明の特定の実施態様において、本発明のポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の結合により延長される。別の実施態様において、本発明のポリペプチドは、アルブミンのようなＨＬＥＰに化学リンカーを介して結合される。この結合技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ ＬＬＣにより例となる方法で記載されている（例えば、米国特許第７，２５６，２５３号）。
他の実施態様において、半減期延長部分は半減期増強タンパク質（ＨＬＥＰ）である。好ましくは、ＨＬＥＰはアルブミン又はそのフラグメントである。アルブミンのＮ末端は、切断型ＶＷＦのＣ末端に融合され得る。あるいは、アルブミンのＣ末端は、切断型ＶＷＦのＮ末端に融合され得る。１つ又はそれ以上のＨＬＥＰは、ＶＷＦのＮ末端又はＣ末端部分に融合され得るが、ただしそれらは切断型ＶＷＦのＦＶＩＩＩへの結合能を妨げず、消失もしない。
組み換えポリペプチドは、好ましくは切断型ＶＷＦとＨＬＥＭとの間に位置づけられた化学結合又はリンカー配列を更に含む。
上記リンカー配列は、互いに等しくても異なっていてもよい１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば１～５０、１～３０、１～２０、１～１５、１～１０、１～５若しくは１～３（例えば、１、２又は３つ）のアミノ酸からなるペプチドリンカーであり得る。好ましくは、リンカー配列は野生型ＶＷＦにおける対応する位置には存在しない。上記リンカー配列に存在する好ましいアミノ酸としてはＧｌｙ及びＳｅｒが挙げられる。リンカー配列は非免疫原性であるべきである。好ましいリンカーは、交互のグリシン及びセリン残基から構成され得る。適切なリンカーは例えばＷＯ２００７／０９０５８４に記載される。
本発明の別の実施態様において、切断型ＶＷＦ部分とＨＬＥＭとの間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質において天然ドメイン間リンカーとして役立つペプチド配列からなる。好ましくは、それらの天然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、そして免疫系に対してアクセス可能である。ＷＯ ２００７／０９０５８４に例が示される。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ ２０１３／１２０９３９ Ａ１に記載される。
組み換えポリペプチドの好ましい実施態様において、切断型ＶＷＦとＨＬＥＭとの間のリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列４８０～５１０を有するか又はこれらからなるグリシン／セリンペプチドリンカーである。
一実施態様において、ポリペプチドは以下の構造を有する：
ｔＶＷＦ－Ｌ１－Ｈ、［式１］
式中、ｔＶＷＦは切断型ＶＷＦであり、Ｌ１は化学結合又はリンカー配列であり、そしてＨはＨＬＥＰである。
Ｌ１は、化学結合、又は互いに等しくても異なっていてもよい１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、例えば１～５０、１～３０、１～２０、１～１５、１～１０、１～５若しくは１～３（例えば、１、２又は３つ）のアミノ酸からなるリンカー配列であり得る。通常は、リンカー配列は野生型ＶＷＦにおける対応する位置には存在しない。Ｌ１に存在する適切なアミノ酸の例としてはＧｌｙ及びＳｅｒが挙げられる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、そして切断不可リンカーでも切断可能リンカーでもよい。切断不可リンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４において例示されるように交互のグリシン及びセリンから構成されていてもよい。本発明の別の実施態様において、切断型ＶＷＦとアルブミン部分との間のペプチドリンカーはペプチド配列からなり、これがヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然の環境におけるこのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、そして免疫系に対してアクセス可能である。例はＷＯ２００７／０９０５８４に示される。切断可能なリンカー配列は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９ Ａ１に記載される。
好ましいＨＬＥＰ配列は以下に記載される。それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」若しくは正確な「Ｃ末端アミノ酸」への融合、又はそれぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」若しくは「Ｃ末端部分」への融合が本発明により同様に包含され、これはＨＬＥＰの１つ又はそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠失を含む。ポリペプチドは、１つより多くのＨＬＥＰ配列、例えば、２つ又は３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの多数のＨＬＥＰ配列は、例えば連続的な繰り返しとして縦一列にＶＷＦのＣ末端部分に融合され得る。
半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）であり、より好ましくはＨＬＥＰは、アルブミン又はそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及び部分、例えばＦｃフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖（例えばＸＴＥＮ （Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２７：１１８６－１１９０）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）又はプロリン－アラニン－セリン反復（ＰＡＳ））、アファミン、アルファ－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。
本明細書で使用される「半減期増強ポリペプチド」は、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンＧの定常領域及びそのフラグメント、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域の部分に結合することができる領域及びポリペプチドからなる群より選択される。これは、本明細書に記載される全長半減期増強タンパク質（例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー又は免疫グロブリンＧの定常領域）でも、凝固因子の治療活性又は生物学的活性を安定化又は延長することができるその１つ又はそれ以上のフラグメントでもよい。このようなフラグメントは、ＨＬＥＰフラグメントがＨＬＥＰを含まないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも２５％の機能的半減期延長をもたらす限り、１０若しくはそれ以上のアミノ酸長のフラグメントであってもよく、又はＨＬＥＰ配列からの少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいてもよく、又はそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部若しくは全てを含んでいてもよい。
本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰの変異体であってもよい。用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、保存的又は非保存的のいずれかの、挿入、欠失及び置換を含み、ここでこのような変化は切断型ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変更しない。
特に、本発明の提案されたＶＷＦ ＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰ及びＨＬＥＰのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。ＨＬＥＰは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物ＨＬＥＰとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。
本開示の特定の実施態様によれば、半減期延長部分、特にＨＬＥＰ、本発明のポリペプチドの一部は、代替の用語「ＦＰ」で特定され得る。好ましくは、用語「ＦＰ」は別の指示がなければヒトアルブミンを表す。
特定の好ましい実施態様によれば、ポリペプチドは融合タンパク質である。本発明については融合タンパク質は、切断型ＶＷＦ、さらにはＨＬＥＰをコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列のインフレーム連結により生成されたタンパク質である。当業者は、融合タンパク質ＤＮＡ配列の翻訳が単一のタンパク質配列を生じることを理解する。さらなる好ましい実施態様に従うペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列のインフレーム挿入の結果として、切断型ＶＷＦ、適切なリンカー及びＨＬＥＰを含む融合タンパク質が得られ得る。
ＨＬＥＰとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）及び「ヒトアルブミン」（ＨＡ）及び「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、かつヒト血清アルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）、さらには他の種由来のアルブミン（並びにそのフラグメント及び変異体）を包含する。
本明細書で使用される「アルブミン」は、集合的に、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくはそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン若しくはそのフラグメント、特に本明細書において配列番号６で示されるヒトアルブミンの成熟形態又は他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそのフラグメント、又はこれらの分子若しくはそのフラグメントのアナログ若しくは変異体を指す。
本開示の特定の実施態様によれば、代替の用語「ＦＰ」はＨＬＥＰを識別するため、特にアルブミンをＨＬＥＰとして定義するために使用される。
特に、本発明の提案されたポリペプチドは、ヒトアルブミン及びヒトアルブミンのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０より多いアミノ酸長である。
本発明の好ましい実施態様は、ＦｃＲｎ受容体への増強された結合を有する本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用されるアルブミン変異体を含む。このようなアルブミン変異体は、野生型アルブミンとの切断型ＶＷＦ融合物と比較して、切断型ＶＷＦアルブミン変異体融合タンパク質のより長い血漿半減期をもたらし得る。
本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はそれらの保存的改変を含み得る。
ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療的タンパク質の半減期を増加させることが当該分野で公知である（Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ． ２００６． ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０：１５１－１６０）。重鎖のＩｇＧ定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３）及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれかの哺乳動物由来、又はそれぞれサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないＩｇＧ及びＩｇＧフラグメントもまた、ＨＬＥＰとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくは、切断可能であってもよい、抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してＩｇＧ又はＩｇＧフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療的タンパク質のインビボ半減期を増強するために免疫グロブリン定常領域に治療的タンパク質を融合させることを記載する。ＵＳ ２００４／００８７７７８及びＷＯ ２００５／００１０２５は、Ｆｃドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これは他の方法ではインビボで急速に排出される。Ｆｃ－ＩＦＮ－β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより大きな溶解度を達成したと記載された（ＷＯ ２００６／０００４４８）。長い血清半減期及び増加したインビボ効力を有するＦｃ－ＥＰＯタンパク質が開示され（ＷＯ ２００５／０６３８０８）、さらに全て半減期増強特性を有する、Ｇ－ＣＳＦ（ＷＯ ２００３／０７６５６７）、グルカゴン様ペプチド－１（ＷＯ ２００５／０００８９２）、凝固因子（ＷＯ ２００４／１０１７４０）及びインターロイキン－１０（米国特許第６，４０３，０７７号）とのＦｃ融合物も開示された。
本発明に従って使用することができる様々なＨＬＥＰは、ＷＯ ２０１３／１２０９３９ Ａ１において詳細に記載される。
本発明のポリペプチドのＮ－グリカン及びシアリル化
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ－グリカンを含み、そして該Ｎ－グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。好ましい実施態様において、該Ｎ－グリカンの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたＶＷＦフラグエントを含むポリペプチドが、延長された半減期自体を有するだけでなく、同時投与されるＦＶＩＩＩの半減期も延長することができるということを見出した。換言すれば、本発明のポリペプチドの投与は、同時投与されたＦＶＩＩＩの延長された半減期及び／又は減少したクリアランスをもたらす。
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ－グリカンを含み、そして糖タンパク質のＮ－グリカンのシアリル基の少なくとも５０％は、α－２，６－連結シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、α－２，３－又はα－２，６－連結を介してガラクトース基に結合され得る。典型的に、本発明のポリペプチドのＮ－グリカンは、α－２，３－連結シアリル基よりもα－２，６－シアリル基を多く含む。好ましくは、Ｎ－グリカンのシアリル基の少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％は、α－２，６－連結シアリル基である。これらの実施態様は、例えば、ヒトα－２，６－シアリルトランスフェラーゼの哺乳動物細胞における同時発現により得ることができる。
一実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ－グリカンの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ－グリカンの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。
別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ－グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又は１％未満がアシアロ－Ｎ－グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を欠いたＮ－グリカンである。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのＮ－グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又は１％未満がアシアロ－Ｎ－グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を有していない。
このような糖タンパク質を製造する適切な方法は、係属中のＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６１４４０に記載される。従って、増加したシアリル化を有するＮ－グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法がそこで記載され、この方法は、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む糖タンパク質のダイマーを製造するか、又は該糖タンパク質の二量体化を増加するための方法が記載され、この方法は、（ｉ）糖タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）該細胞を３６．０℃未満の温度で培養することを含む。さらに、増加したシアリル化を有するＮ－グリカンを含む糖タンパク質を製造する方法がそこで記載され、この方法は、（ｉ）切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸及びα－２，６－シアリルトランスフェラーぜをコードする組み換え核酸を含む細胞を供給すること、及び（ｉｉ）糖タンパク質及びα－２，６－シアリルトランスフェラーゼの発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。
上記の実施態様は互いに組み合わされ得る。上述のＮ－グリカンのいずれのパーセンテージ、又はシアリル化度のいずれの指示も、平均のパーセンテージ又はシアリル化度と理解されるべきであり、すなわち、それらは単一の分子ではなく分子の集団を指す。糖タンパク質の集団内の個々の糖タンパク質分子のグリコシル化又はシアリル化がいくらかの不均質性を示すことは明らかである。
ダイマー
本発明のポリペプチドは好ましくは高い比率のダイマーを有する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。一実施態様において、ポリペプチドの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％はダイマーとして存在する。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのダイマー：モノマー比は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５又は少なくとも３である。最も好ましくは、本発明の全てのポリペプチドはダイマーとして存在する。ダイマーがモノマーと比較して第ＶＩＩＩ因子に対する改善された親和性を有するので、ダイマーの使用は有利である。本発明のポリペプチドのダイマー含有量、及びモノマーに対するダイマーの比は、実施例に記載されるように決定することができる。
一実施態様において、第ＶＩＩＩ因子に対する本発明のポリペプチドの親和性は、同じ第ＶＩＩＩ因子分子に対するヒト天然ＶＷＦの親和性よりも高い。第ＶＩＩＩ因子親和性は、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子、又は配列番号５により特徴づけられる第ＶＩＩＩ分子を参照してもよい。
高い比率のダイマーを有する本発明のポリペプチドの調製物は、第ＶＩＩＩ因子に対して増加した親和性を有することが見出されている。このような第ＶＩＩＩ因子に対する増加した親和性は、本発明のポリペプチドによる第ＶＩＩＩ因子の増強された安定化をもたらす。あるいは、又は増加したダイマー比率と組み合わせても、第ＶＩＩＩ因子に対する親和性を増加させる第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン内の変異を有する本発明に従うポリペプチドは、本発明の好ましい実施態様である。適切な変異は、例えばＷＯ ２０１３／１２０９３９ Ａ１に記載される。
ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の方法に従って製造され得る。ＶＷＦのｃＤＮＡ配列（配列番号３）に基いて、上述の切断型ＶＷＦ構築物又は本発明のポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡを設計し生成することができる。
たとえ宿主細胞により分泌されるポリペプチドがＶＷＦのアミノ酸１～７６３を含んでいなくても、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）が配列番号４のアミノ酸２３～７６３に対して、又は好ましくはアミノ酸１～７６３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。最も好ましくは、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号４のアミノ酸２３～７６３、又は配列番号４のアミノ酸１～７６３をコードするヌクレオチド配列を含む。
ＤＮＡが正確な方向で発現プラスミド中に挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含有する構築物が、タンパク質発現のために使用され得る。典型的な発現ベクターは、プラスミド保有細胞において挿入された核酸に対応する大量のｍＲＮＡの合成を方向づけるプロモーターを含有する。これらはまた、宿主生物内でのそれらの自律増殖を可能にする複製起点配列、及び合成されたｍＲＮＡが翻訳される効率を増加させる配列を含み得る。安定な長期ベクターは、例えば、ウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のＯｒｉＰ配列）の調節エレメントを使用することにより自由に複製する実体として維持され得る。ゲノムＤＮＡ中にベクターを組み込まれた細胞株もまた製造され得、そしてこの方法では、遺伝子産物は連続して産生される。
典型的に、供給しようとする細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物宿主細胞に導入することにより得られる。
細胞培養しやすく、かつ糖タンパク質を発現しやすいいずれかの宿主細胞が、本発明に従って利用され得る。特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物である。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ １、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｓ）（ＰＥＲ．Ｃ６ （ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養用にサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞 ＋／－ＤＨＦＲ （ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３ ２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；水牛ラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ ＮＹ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、３８３：４４－６８、１９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＰＳ４細胞；ヒト羊膜細胞（ＣＡＰ）；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。好ましくは、細胞株は、齧歯動物細胞株、特にハムスター細胞株、例えばＣＨＯ又はＢＨＫである。
目的の糖タンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するために適した方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０－６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０－４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＥＰ １１７，０６０；及びＥＰ １１７，０５８を参照のこと。哺乳動物細胞については、遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入する一般的方法としては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂのリン酸カルシウム沈降法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６－４５７、１９７８）又はＨａｗｌｅｙ－ＮｅｌｓｏｎのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）法（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌにより記載されている。遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７－５３７、１９９０、及びＭａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８－３５２、１９８８を参照のこと。
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養する。ポリペプチドは、当業者に公知の方法を使用して回収そして精製され得る。
内在性ＦＶＩＩＩの最大濃度及び時間－濃度曲線下面積
本発明の好ましい局面によれば、本明細書の上で定義されたポリペプチドは、本発明のポリペプチド単独での、すなわちＦＶＩＩＩを同時投与しない投与により、未処置の被験体と比較して内在性第ＶＩＩＩ因子のＣｍａｘ又はＡＵＣを増加させるために使用される。
最大濃度（Ｃｍａｘ）は、測定された最も高い血漿濃度値である。上記組み換えポリペプチドの投与後に、ＦＶＩＩＩについてのＣｍａｘは、少なくとも１０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも５０ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００ｍＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００ｍＩＵ／ｍＬ又は少なくとも４００ｍＩＵ／ｍＬであり得る。
ＡＵＣ０－ｔは、ゼロから最後の測定された時点までの血漿濃度－時間曲線下のピーク面積である。組み換えポリペプチドの投与後に、内在性ＦＶＩＩＩ増加についてのＡＵＣは、少なくとも１０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも２０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも３０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも５０００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ、少なくとも１００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ又は少なくとも２００００ｍＩＵ＊ｈ／ｍＬ 発色ＦＶＩＩＩ活性であり得る。
皮下投与後のｒＤ’Ｄ３－ＦＰのバイオアベイラビリティ
本発明のさらなる局面は、本明細書の上で定義されるポリペプチドの皮下バイオアベイラビリティを提供するか又は改善することに関する。
本明細書で使用される用語バイオアベイラビリティは、静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の本発明のポリペプチドのＡＵＣ０－ｉｎｆに関して、皮下（ｓ．ｃ．）投与後の本発明のポリペプチドのＡＵＣ０－ｉｎｆのパーセンテージとして定義される。ＡＵＣ０－ｉｎｆは、ゼロから無限大までの血漿濃度－時間曲線下面積である。ＡＵＣ０－ｉｎｆの計算のための薬物動態データの評価のために、２コンパートメントモデル（二相薬物動態プロフィール）を適用した。
特定の実施態様によれば、同時投与されたＦＶＩＩＩの存在しない場合の組み換えポリペプチドのバイオアベイラビリティは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％である。
特定の実施態様によれば、ＦＶＩＩＩの同時投与後の組み換えポリペプチドのバイオアベイラビリティは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％である。
凝固障害の処置
本発明のさらなる局面は、それを必要とする患者に有効量の本明細書の上で定義されるポリペプチドを投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法である。
本発明のポリペプチドは、血友病Ａ及びフォン・ヴィルブランド病を含む血液凝固障害を処置するために有用である。用語「血友病Ａ」は、機能的凝固ＦＶＩＩＩの欠乏を指し、これは通常は遺伝性である。フォン・ヴィルブランド病は、２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病、３型フォン・ヴィルブランド病、及び１型フォン・ヴィルブランド病からなる群より選択される。
別の実施態様において、血液凝固障害は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルと比較して減少している処置前の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる１型フォン・ヴィルブランド病である。
処置しようとする患者は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩと比較して減少した内在性ＦＶＩＩＩの活性及び／又はレベルを有し得る。患者における内在性ＦＶＩＩＩ活性は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性の８０％未満、又は７０％未満、又は６０％未満、又は５０％未満、又は４０％未満、又は３０％未満、又は２０％未満、又は２０％未満、又は１０％未満、又は５％未満であり得る。処置しようとする患者における内在性ＦＶＩＩＩ活性は、全血の０．８ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．７ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．６ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．５ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．４ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．３ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．２ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．１ＩＵ／ｍｌ未満、又は０．０５ＩＵ／ｍｌ未満であり得る。
本発明のポリペプチドは、少なくとも０．００５ＩＵ／ｍＬの内在性ＦＶＩＩＩ活性を有する患者に投与されるべきである。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、全血の０．０１～０．４ＩＵ／ｍｌ、又は０．０２～０．３ＩＵ／ｍｌ、又は０．０３～０．２ＩＵ／ｍｌ、又は０．０４～０．１ＩＵ／ｍｌの内在性ＦＶＩＩＩの活性を有する患者に投与されるべきである。
一実施態様において、血液凝固障害は中程度血友病Ａである。中程度血友病Ａは、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％～約５％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。典型的に、中程度血友病Ａを有する被験体は、血漿中０．０１～０．０５ＩＵ／ｍＬの内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
別の実施態様において、血液凝固障害は軽度血友病Ａである。軽度血友病Ａは、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約５％～約４０％である内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。典型的には、軽度血友病Ａを有する被験体は、血漿中０．０５～０．４ＩＵ／ｍＬの内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
別の実施態様において、血液凝固障害は重症血友病Ａである。重症血友病Ａは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性の１％未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。
別の実施態様において、血液凝固障害は２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病である。２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病は、好ましくは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約３％～約３０％に対応する、約３ＩＵ／ｄＬと約３０ＩＵ／ｄＬ ＦＶＩＩＩ活性レベルとの間の範囲である処置前の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる。患者の大部分は、２０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの２０％未満のレベルを有する。従って、２Ｎ型フォン・ヴィルブランド病を有する被験体は、血漿中０．０３ＩＵ／ｍＬ～０．３ＩＵ／ｍＬ、典型的には０．２ＩＵ／ｍＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルを有する。
別の実施態様において、血液凝固障害は、好ましくは、通常は、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの約１％～約２０％に対応する約１ＩＵ／ｄＬと約２０ＩＵ／ｄＬとの間のＦＶＩＩＩ活性レベル範囲である処置前の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルにより特徴づけられる３型フォン・ヴィルブランド病である。患者の大部分は、１０ＩＵ／ｄＬ未満の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベル、従ってＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの１０％未満のレベルを有する。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、出血事象の予防のために被験体に投与される。この処置はいずれの外来性ＦＶＩＩＩの投与も含まない。本発明のポリペプチドはまた、出血事象の処置のために被験体に投与され得る。その場合、本発明のポリペプチドは、外来性ＦＶＩＩＩと同時投与され得る。出血事象のこのような処置の後、次いで経過観察処置が外来性ＦＶＩＩＩの同時投与をすることなく行われる。すなわち、経過観察処置は本発明のポリペプチドのみを用いて行われる。
典型的には、本発明のポリペプチドのみを用いた処置、すなわち外来性ＦＶＩＩＩを当時投与しない処置を、出血事象が発生するまで継続する。本発明のポリペプチドのみを用いた処置、すなわち外来性ＦＶＩＩＩを同時投与しない処置の期間は、特に限定されず、通常は少なくとも１週間、又は少なくとも２週間、又は少なくとも３週間、又は少なくとも４週間、又は少なくとも２ヶ月継続される。
疾患の処置は、いずれかの臨床病期であるか又は顕性化した疾患のいずれかの形態を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状若しくは徴候の開始若しくは発展若しくは増悪若しくは悪化を遅延させること；並びに／又は疾患の重症度を防止及び／若しくは低減させることを包含する。
本発明のポリペプチドが投与される「被験体」又は「患者」は、好ましくはヒトである。特定の局面において、ヒトは小児患者である。他の局面において、ヒトは成人患者である。
本発明のポリペプチド及び、場合によりＦＶＩＩＩを含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、典型的には薬学的に許容しうる担体を含む無菌医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者にそれを投与する所望の方法に依存して）任意の適切な形態であり得る。
用語「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書において交換可能に使用され、そして血漿由来のＦＶＩＩＩ及び組み換えＦＶＩＩＩの両方を包含する。組み換えＦＶＩＩＩは、限定することなく、全長ＦＶＩＩＩ、さらには二本鎖Ｂドメイン欠失又は切断型変異体、さらには単鎖Ｂドメイン欠失又は切断変異体、例えばＷＯ ２００４／０６７５６６に記載されるもの及びＢドメインの外側に変異を有するがＦＶＩＩＩの生物学的活性を有する他のＦＶＩＩＩ変異体を包含する。
本発明のポリペプチドは、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋内、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）又は局所（ｌｏｃａｌｌｙ）のような様々な経路により患者に投与され得る。いずれかの所定の症例における投与に最も適切な経路は、特定のポリペプチド、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度並びに被験体の身体状態に依存する。典型的には、本発明のポリペプチドは静脈内投与される。
本発明によれば、本発明のポリペプチドを用いて処置される患者はまた、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を用いて処置されるが、ただし経過観察処置は、本発明のポリペプチドのみを用いて、すなわち外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく行われる。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、同時に投与されても逐次的様式で投与されてもよく、両方の投与様式が用語「組み合わせ治療」及び「同時投与」により包含される。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、混合物として、すなわち同じ組成物内で投与されても、別々に、すなわち別個の組成物として投与されてもよい。
ポリペプチド及び場合によりＦＶＩＩＩは好ましくは静脈内または皮下に投与される。
第一の実施態様において、ポリペプチド及び場合によりＦＶＩＩＩの両方が静脈内投与される。第二の実施態様において、ポリペプチド及び場合によりＦＶＩＩＩの両方が皮下投与される。
別の実施態様において、ＦＶＩＩＩは静脈内投与され、そしてポリペプチドは異なる経路を介して投与される。さらなる実施態様において、ポリペプチドは皮下投与され、そしてＦＶＩＩＩは異なる経路を介して投与される。例えば、ポリペプチドは皮下投与され得、そしてＦＶＩＩＩは静脈内投与され得る。
さらなる実施態様において、ＦＶＩＩＩは皮下投与され、そしてポリペプチドは異なる経路を介して投与される。さらなる実施態様において、ポリペプチドは静脈内投与され、そしてＦＶＩＩＩは異なる経路を介して投与される。例えば、ポリペプチドは静脈内投与され得、そしてＦＶＩＩＩは皮下投与され得る。
本発明のポリペプチドを用いた処置の総投薬数、及び長さの決定は、当業者の能力の十分範囲内である。投与しようとする本発明のポリペプチドの投薬量は、内在性ＦＶＩＩＩの濃度、処置しようとする患者における内在性ＶＷＦの濃度、又はその両方に依存し得る。本明細書に記載される比に基づく有効投薬量は、本発明のポリペプチドの分子量を考慮して、当業者により決定され得る。ＦＶＩＩＩについての典型的な投薬量は、約２０Ｕ／体重ｋｇ～１００Ｕ／体重ｋｇの範囲に及び得る。
使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、典型的には１０～１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲である。異なる実施態様において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は、本明細書において定義される本発明のＶＷＦポリペプチドに対する比に関する要件が満たされることを条件として、１０～８，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１０～５，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２０～３，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは５０～１，５００ＩＵ／ｍｌの範囲、又は３，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２，５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，２００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１，０００ＩＵ／ｍｌ、若しくは８００ＩＵ／ｍｌ、若しくは７５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは６００ＩＵ／ｍｌ、若しくは５００ＩＵ／ｍｌ、若しくは４００ＩＵ／ｍｌ、若しくは３００ＩＵ／ｍｌ、若しくは２５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは２００ＩＵ／ｍｌ、若しくは１５０ＩＵ／ｍｌ、若しくは１２５ＩＵ／ｍｌ、若しくは１００ＩＵ／ｍｌ、若しくは６２．５ＩＵ／ｍｌ、若しくは５０ＩＵ／ｍｌであるが、ただし本明細書において定義される本発明のＶＷＦポリペプチドに対する比に関する要件は満たされる。
「国際単位」又は「ＩＵ」は、「ＩＵ」で較正された国際標準品に対して較正された標準を使用して一段階凝固アッセイ又は発色性基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の尺度の単位である。一段階凝固アッセイは、Ｎ Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ Ｌ、ｅｔ ａｌ．、Ａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）３０、５１１ ５１９（１９８３）に記載されるように、当該分野で公知である。一段階アッセイの原理：この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）－アッセイの改変バージョンとして行われる：リン脂質及び表面活性剤とともに血漿をインキュベートすることにより、内在凝固系の因子が活性化される。カルシウムイオンの添加が凝固カスケードを誘発する。測定可能なフィブリン血栓の形成までの時間が決定される。アッセイは、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の存在下で行われる。欠乏血漿の凝固能は、試験しようとするサンプル中に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子により回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、国際単位で第ＶＩＩＩの既知の活性を有する標準品との直接比較により定量化される。
別の標準的なアッセイは、発色性基質アッセイである。発色性基質アッセイは、市販で購入され得る、例えばＦＶＩＩＩ試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ Ｖ． ｌｅ Ｍｏｎｚａ ３３８－２０１２８ Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）。発色性アッセイの原理：カルシウム及びリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を第ＩＸａ因子により第Ｘａ因子へと活性化させる。この反応は、補因子としての第ＶＩＩＩａ因子により刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定しようとするサンプル中のＦＶＩＩＩ由来の混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のＣａ２＋、リン脂質及び第ＩＸａ因子並びに過剰量の第Ｘ因子を使用する場合、第Ｘ因子の活性化は、第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化第Ｘ因子は、発色性基質Ｓ－２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。従って、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出は、形成されたＦＸａの量に比例し、従って、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。
ポリペプチドの使用のいくつかの好ましい実施態様によれば、内在性ＦＶＩＩＩレベルは、上記ポリペプチドの投与後に、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも１％、又は好ましくは少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも１００％のレベルに増加する。
さらなる好ましい実施態様において、内在性ＦＶＩＩＩレベルは、上記ポリペプチドの投与後に、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの１％～５００％の間、好ましくは１％～４００％の間、１％～３００％の間、１％～２００％の間、１％～１５０％の間、又は１％～１００％の間の範囲にあるレベルに増加する。
さらなる好ましい実施態様において、内在性ＦＶＩＩＩレベルは、上記ポリペプチドの投与後に、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの５％～４００％の間、好ましくは５％～３００％の間、１０％～２００％の間、１０％～１５０％の間、２０％～１５０％の間、又は４０％～１５０％の間の範囲にあるレベルに増加する。
さらなる好ましい実施態様において、内在性ＦＶＩＩＩレベルは、上記ポリペプチドの投与後に本明細書に記載されるレベルに増加し、それにより投与されるポリペプチドの投薬量及び／又はポリペプチドの投薬頻度は、被験体における内在性ＦＶＩＩＩレベルの上記レベルの達成のために調整される。
比
特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、出血事象の処置のために、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、上記ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく投与される。本発明のポリペプチドを外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与することを含むこれらの実施態様について、本発明のポリペプチドは、好ましくは、同時投与しようとするポリペプチドの外来性ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きくなるような用量で投与される。
本発明のポリペプチドは、モノマーであっても、ダイマーであっても、又はそれらの混合物であってもよい。本発明に従うモル比は、実際にモノマーとして存在してもダイマーとして存在しても、本発明のポリペプチドのモノマーサブユニットのモル濃度の比を指す。比は、内在性ＦＶＩＩＩのモル濃度に対して、若しくは、少なくとも特定の実施態様については、同時投与されるＦＶＩＩＩのモル濃度に対して、又は存在する場合は内在性ＶＷＦサブユニットのモル濃度に対して形成される。別の指示がなければ、本出願におけるＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドの比は、投与しようとする本発明のポリペプチド（好ましくはダイマーとして存在する）に含まれるモノマーの量（モル）を、投与しようとするＦＶＩＩＩの量（モル）で割ったものを指す。非限定的な例として、本発明のモノマーポリペプチド １００μＭのＦＶＩＩＩ １μＭとの同時投与は、比１００を意味する。本発明のダイマーポリペプチド５０μＭがＦＶＩＩＩ １μＭと同時投与される場合に同じ比１００が得られる。
内在性ＶＷＦは、存在する場合、本発明のポリペプチドを投薬しようとしている動物又はヒトの血漿中に存在するＶＷＦである。これは通常、ＶＷＦの約２～４０のモノマーサブユニットの様々な範囲のオリゴマーからなる。別の指示がなければ、本出願において内在性ＶＷＦに対する本発明のポリペプチドの比は、本発明のポリペプチドの投与直後の処置された被験体の体重１ｋｇあたりの本発明のポリペプチドのモル血漿濃度を、処置された被験体の体重１ｋｇあたりの内在性ＶＷＦのモル血漿濃度で割ったものを指す。本発明のポリペプチドの投与直後の本発明のポリペプチドの血漿モル濃度は、投与のすぐ後の投与された本発明のポリペプチドの希釈を４０ｍＬ／ｋｇと仮定して計算される。静脈投与された場合に投与直後の本発明のポリペプチドの量は、本発明の目的のために、投与された量と同じであると仮定される。
本発明の一局面によれば、内在性ＶＷＦに対する本発明のポリペプチドのモル比は０．５より大きい。処置しようとする被験体の血漿中の内在性ＶＷＦの濃度は、例えば実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡ又は及び活性アッセイにより決定され得る。典型的には、測定される濃度はＵ／ｍＬで与えられる。この値は、以下に記載されるようにモル濃度に変換され得る。
正常ヒト血漿（ＮＨＰ）は、定義により１Ｕ／ｍＬ又は１００％の濃度でＶＷＦを含有する。これは、約１０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に相当する（Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｒ．Ｒ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ；Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、ｅｄｓ． Ｍａｒｄｅｒ、Ａｉｒｄ、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｓｃｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２０１３、ｐｐ １９７－２０７）。ＮＨＰ中のこのＶＷＦ濃度及び１８～１９％のグリコシル化を含む約２６７，５００ Ｄａの成熟ＶＷＦモノマーの分子量に基づいて、約３７ ｘ １０－９ Ｍｏｌ／ＬのＶＷＦモノマー単位の血漿モル濃度がＮＨＰについて算出され得る。
それぞれ正常ラット又はウサギの血漿中のラット又はウサギＶＷＦサブユニットのモル濃度の計算のために、ヒトＶＷＦに相当するモノマーサブユニットの分子量を、仮定された相当する特異的活性（１００ Ｕ／ｍｇ）及びラット又はウサギ血漿中の測定された内在性ＶＷＦ活性とともに使用した（２６７，５００ Ｄａ）（実施例も言及する）。
ヒト集団におけるＶＷＦの濃度は、ＮＨＰ中のＶＷＦ濃度約６０％から約２００％まで変化する。本発明の特定の実施態様において、内在性ＶＷＦの濃度は、ＮＨＰ中の濃度として定義される。他の実施態様において、内在性ＶＷＦの濃度は、処置しようとする被験体において決定され、そしてポリペプチドの用量は、この個々の値に基づく。
内在性ＶＷＦに対する投与されたポリペプチドのモル比は、好ましくは少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも４０、又は少なくとも５０、又は少なくとも７５である。
内在性ＶＷＦに対する投与しようとする本発明のポリペプチドのモル比は、０．５～１，０００、又は１～５００、又は２～４００、又は３～３００、又は４～２５０、又は５～２００、又は６～１５０、又は７～１４０、又は８～１３０、又は９～１２０、又は１０～１１０の範囲に及び得る。好ましくは、内在性ＶＷＦに対する投与された本発明のポリペプチドのモル比は、３～１００、又は４～９０、又は５～８０、又は６～７５、又は１０～６０の範囲に及ぶ。
投与しようとする本発明のポリペプチドの内在性ＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは少なくとも２、又は少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０であり、より好ましくはこの比は５０より大きく、又は少なくとも７５、少なくとも１００であり、又は１００より大きく、又は少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００である。
投与しようとする本発明のポリペプチドの内在性ＦＶＩＩＩに対するモル比は、２～１０，０００、又は５～５，０００、又は１０～４，０００、又は２０～３，０００、又は３０～２，０００、又は４０～１，０００の範囲に及び得る。好ましくは、投与しようとする本発明のポリペプチドの内在性ＦＶＩＩＩに対するモル比は、６０～２，５００、又は１１０～２，０００、又は１５０～１，５００、又は２００～１，０００の範囲に及ぶ。
投与しようとする本発明のポリペプチドの、同時投与しようとする外来性ＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは少なくとも２、又は少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０であり、より好ましくはこの比は５０より大きく、又は少なくとも７５、少なくとも１００であり、又は１００より大きく、又は少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００である。
投与しようとする本発明のポリペプチドの、同時投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、２～１０，０００、又は５～５，０００、又は１０～４，０００、又は２０～３，０００、又は３０～２，０００、又は４０～１，０００の範囲に及び得る。投与しようとする本発明のポリペプチドの、同時投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは５０～１０，０００、又は５０～５，０００、又は５０～４，０００、又は５０～３，０００、又は５０～２，０００、又は５０～１，０００の範囲に及び得る。好ましくは、投与しようとする本発明のポリペプチドの、同時投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、６０～２，５００、又は１１０～２，０００、又は１５０～１，５００、又は２００～１，０００の範囲に及ぶ。
医薬組成物
本明細書に記載される方法において適した本発明のポリペプチドの治療用製剤は、当該分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定剤（これらは全て本明細書で「担体」と呼ばれる）、すなわち、緩衝化剤、安定剤、保存料、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒｓ）、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種種雑多な添加物と、所望の程度の純度を有するポリペプチドを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての貯蔵のために製造され得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ、ｅｄ． １９８０）を参照のこと。このような添加物は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。
緩衝化剤は、生理条件に近い範囲にｐＨを維持するために役立つ。これらは約２ｍＭ～約５０ｍＭの範囲に及ぶ濃度で存在し得る。適切な緩衝化剤としては、有機及び無機の両方のその酸及び塩、例えばクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸酸ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸－水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸－フマル酸にナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸－グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及びＴｒｉｓのようなトリメチルアミン塩が使用され得る。
保存料は微生物増殖を妨害するために添加され得、そして０．２％～１％（質量／体積）の範囲に及ぶ量で添加され得る。適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ－クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３－ペンタノールが挙げられる。「安定剤」としても知られる等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために加えられ得、そしてこれらとしては多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。安定剤は、増量剤から、治療剤を可溶化するか又は変性もしくは容器壁への付着を防止する添加剤に及ぶ機能を有し得る広義の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上で列挙された）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、（イノシトールのようなシクリトール類を含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基又はそれ以下のペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン 単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロース及び三糖、例えばラフィノース；及び多糖、例えばデキストランであり得る。安定剤は、活性タンパク質１質量部あたり０．１～１０，０００質量部の範囲で存在し得る。
非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）又は洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を促進するため、さらには撹拌誘導凝集に対して治療用タンパク質を保護するために加えられ得、これはまた、タンパク質の変性を引き起こすことなく圧力を加えられたせん断面に製剤が曝露されることを可能にする。適切な界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（Ｒ）－２０、ＴＷＥＥＮ（Ｒ）－８０など）の非イオン界面活性剤が挙げられる。界面活性剤は、約０．０５ ｍｇ／ｍｌ～約１．０ ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約０．０７ ｍｇ／ｍｌ～約０．２ ｍｇ／ｍｌの範囲で存在し得る。
さらなる様々な賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。
本明細書における製剤は、本発明のポリペプチドに加えて第二の治療剤も含んでいてもよい。適切な第二の治療剤の例は以下に示される。
投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重篤度、及び本発明のポリペプチドに対する患者の感受性を含む、多数の臨床因子に依存して月に１回から毎日まで変化し得る。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、週に２回、５日ごと、週に１回、１０日ごと、２週間毎、３週間ごと、４週間ごと、又は月に１回、又は前述の値のいずれか２つの間の任意の範囲で、例えば、４週ごとから毎月、１０日ごとから２週ごと、又は週に２回から３回などで投与される。
投与しようとする本発明のポリペプチドの投薬量は、特定のポリペプチド、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度、被験体の身体状態、治療計画（例えば、第二の治療剤が使用されるかどうか）、及び選択された投与経路によって変わる；適切な投薬量は、当業者により容易に決定され得る。
本発明のポリペプチドの最適な量及び個々の投薬の間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路、及び部位、並びに処置される特定の被験体の年齢及び状態により決定されること、そして医師が、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するということは、当業者により認識されるだろう。この投薬は、必要なだけ頻繁に繰り返され得る。副作用が発生する場合、投薬の量及び／又は頻度が、通常の臨床診療に従って変更されるか又は減少され得る。
配列表に示されるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を表１に要約する。
Figure 0007252890000001
以下の実施例は本発明を説明するが、本明細書以下に記載される特定の実施態様に本発明を限定すると解釈されるべきではない。
実施例１：ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後の血漿におけるＦＶＩＩＩレベル分析
我々は、内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するｒＤ’Ｄ３－ＦＰの影響を特徴づけし、それにより、軽度から中程度若しくは重症の血友病Ａの患者又は低レベルＶＷＦ及び機能的内在性ＦＶＩＩＩを有する特定の型のフォン・ヴィルブランド病の処置を広く支持することを目的とした。我々はこの影響を様々なアプローチで調べた：
－ 健常被験体において静脈内（ｉ．ｖ．）ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投与後の内在性ＦＶＩＩＩの潜在的なさらなる増加を調べるための、正常内在性ＦＶＩＩＩ及びＶＷＦレベルを有するモデル、すなわちラット（実施例１．１）、ウサギ（実施例１．２）及びサル（実施例１．３）への静脈内投与
－ 病気の被験体におけるｉ．ｖ． ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投与後の内在性ＦＶＩＩＩの増加の大きさを調べるための、ＶＷＦ欠乏に起因して低ＦＶＩＩＩレベルを有するモデル、すなわちＶＷＦ ｋｏラット（実施例１．４）及びＶＷＦ ｋｏマウス（実施例１．５）への静脈内投与。
－ 病気の被験体におけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰ変異体のｉ．ｖ．投与後の内在性ＦＶＩＩＩの増加の大きさを調べるための、ＶＷＦ欠乏に起因して低ＦＶＩＩＩレベルを有するモデル、すなわちＶＷＦ ｋｏラットへの静脈内投与（実施例１．６）。
－ 正常又は低いＦＶＩＩＩレベルを有するモデル、すなわちブタ、ＦＶＩＩＩ ｋｏ及びＶＷＦ ｋｏマウス並びにＦＶＩＩＩ ｋｏ及びＶＷＦ ｋｏラット及び（実施例１．７）への皮下投与を、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのｉ．ｖ．及びｓ．ｃ．バイオアベイラビリティさらには内在性ＦＶＩＩＩに対する効果を比較するために調べた。
－ 最終実験は、ＶＷＦ ｋｏラットにおける複数回ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ用量（ｉ．ｖ．）の効果を調べた（実施例１．８）。
－ 血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおいて皮下投与されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰ及び静脈内投与されたｒＶＩＩＩ－単鎖の調査（実施例１．９）。
材料及び方法
実施例について、配列番号２において定義されるアミノ酸配列を有する切断型ＶＷＦを含むポリペプチドを使用した。この特定の融合タンパク質は、ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３領域を表すＮ末端アミノ酸配列１～４７９（ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸７６４～１２４２）、続いて３１アミノ酸のグリシン／セリンリンカーペプチド及びＣ末端ヒトアルブミンアミノ酸配列５１１～１０９５からなる。配列番号２において定義される配列を有するこの融合タンパク質は、以下においてｒＤ’Ｄ３－ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＷＴと呼ばれる。
半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）としてアルブミンの代替として、いくつかの実施例において、アルブミンの代わりにグリシン／セリンリンカーを介してＤ’Ｄ３に融合されたＣＴＰ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのＣ末端ペプチド）を有する別の半減期延長ｒＤ’Ｄ３変異体（本明細書以後でｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰと呼ばれる）を使用した。融合タンパク質ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰは配列番号７に定義される配列を有する。
特定の実施例において、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの高親和性変異体を使用した。１つの特定の変異体融合タンパク質は、ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３領域を表すＮ末端アミノ酸配列１～４７９（ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸７６４～１２４２）、続いて３１アミノ酸グリシン／セリンリンカーペプチド及びＣ末端ヒトアルブミンアミノ酸配列５１１～１０９５からなるが、ただし上記ポリペプチドのＤ’ドメイン内に２つのアミノ酸置換、すなわちＳ７６４Ｅ及びＳ７６６Ｙが存在する。この融合タンパク質は、Ｄ’Ｄ３領域内に上記２つの置換、すなわちＳ７６４Ｅ及びＳ７６６Ｙを有する配列番号２において定義される配列からなる。ＶＷＦアミノ酸Ｓ７６４は、配列番号２の配列内のアミノ酸番号１に対応する（表１も参照のこと）。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹ変異体はＷＯ２０１６／００００３９Ａ１に記載されるように生成された。上記変異体は本明細書以後でｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹと呼ばれる。
特定の実施例において、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの別の高親和性変異体を使用した。この特定の変異体融合タンパク質は、ＶＷＦ Ｄ’Ｄ３領域を表すＮ末端アミノ酸１～４７９（ヒト天然ＶＷＦのアミノ酸７６４～１２４２）、続いて３１アミノ酸グリシン／セリンリンカーペプチド及びＣ末端ヒトアルブミンアミノ酸配列５１１～１０９５からなるが、ただし上記ポリペプチドのＤ’Ｄ３ドメイン内に３つのアミノ酸置換、すなわちＳ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙ及びＶ１０８３Ａが存在する。この融合タンパク質は、Ｄ’Ｄ３領域内に上記３つの置換Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙ、及びＶ１０８３Ａを有する配列番号２において定義される配列からなる。上記変異体は本明細書以後においてｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹＡと呼ばれる。
分析
全ての実施例において、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡにより定量された用量レベルで適用され、すなわちタンパク質のアルブミン部分を測定した。このｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＬＩＳＡを製剤及び血漿サンプルに使用した（関連するヒトアルブミン交差反応性を示したサル血漿サンプルを除く）。
ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰをｒＤ’Ｄ３変異体として使用した実施例において、ポリペプチドはＯＤ２８０測定により定量された用量レベルで適用され、そしてタンパク質の量をｒＤ’Ｄ３－ＦＰと同じ高い範囲のモル濃度に調整した。
（「標準的」）ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＬＩＳＡは、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＵＳＡ）からのポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン捕捉抗体を使用した。検出溶液は、ポリクローナルペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン検出抗体調製物（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＵＳＡ）からなる。発色読み出し、すなわち、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＴＭＢを、停止直後に４５０／６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８０８、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）において定量するために使用した。標準として、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを含む薬物製剤を使用した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの量をｍｇアルブミンで示し、すなわち、分子のＤ’Ｄ３部分についての調整を行わなかった。
サル血漿サンプルについてのｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＬＩＳＡを混合ＥＬＩＳＡとして設定し、ここでＤ’Ｄ３ドメインを捕捉し、そしてアルブミンドメインを検出した。このアッセイは、抗Ｄ’Ｄ３モノクローナル捕捉抗体（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、社内研究等級調製物）を使用した。検出溶液は、ポリクローナルペルオキシダーゼ標識抗ヒトアルブミン検出抗体調製物（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＵＳＡ）からなる。発色読み出し、すなわちＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ （Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＴＭＢを、停止直後に４５０／６５０ｎｍでマイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８０８、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）における定量のために使用した。標準として、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを含有する薬物製剤を使用した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの量はをｍｇアルブミンで示し、すなわち分子のＤ’Ｄ３部分について調整を行わなかった。
ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰを含有するＰＫの血漿サンプルを抗Ｄ’Ｄ３ ＥＬＩＳＡにおいて測定した。この抗Ｄ’Ｄ３ ＥＬＩＳＡは、２つのモノクローナル抗ヒトＤ’Ｄ３抗体をサンドイッチ形式で用いて行われた。捕捉及び検出のための両方の抗体は、社内研究調製物から誘導された。抗ヒトＤ’Ｄ３検出抗体をペルオキシダーゼ標識した。発色読み出し、すなわちＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ （Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＴＭＢを、停止直後に４５０／６５０ｎｍでのマイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８０８、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＵＳＡ）における定量のために使用した。標準として、ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰを含有する薬物製剤を使用した。ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰの量をｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰ濃度として示す。
ヒトＦＶＩＩＩ：Ａｇ血漿レベルを、試験指示マニュアルに従ってＳｔａｇｏ、Ｓ．Ａ．Ｓ．、ＦｒａｎｃｅからのＦＶＩＩＩ Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＥＬＩＳＡ試験キットを用いて決定した。Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ試験キットは、停止液以外の全ての試薬を含んでおり、停止液はＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。標準として、ｒＶＩＩＩ－単鎖を含有する薬物製剤を使用した。
ＦＶＩＩＩ発色活性血漿レベルを、ＣＯＡＭＡＴＩＣ（Ｒ）ＦＶＩＩＩアッセイ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ発色アッセイ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）により製造者の試験使用説明書マニュアルに従ってＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＢＣＳ ＸＰ分析機で検出した。較正のために、標準ヒト血漿を使用した。あるいは、これらは、同じＣＯＡＭＡＴＩＣ（Ｒ）ＦＶＩＩＩアッセイにより、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿中にサンプルを予備希釈（ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、続いてＴｅｃａｎ（Ｔｅｃａｎ Ｔｒａｄｉｎｇ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からのＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＥＬＩＳＡ－リーダーで読み出しすることにより検出された。較正のために、ヒト血漿由来フォン・ヴィルブランド因子及びＣＳＬ ＢｅｈｒｉｎｇからのＦＶＩＩＩ含有製品、Ｈａｅｍａｔｅ（Ｒ）Ｐを使用した。サンプルを参照なしで４０５ｎｍで測定した。一般に、ＦＶＩＩＩ発色活性はＦＶＩＩＩ：Ｃと略される。
ＦＶＩＩＩ凝固活性血漿レベルを、Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬ、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏血漿及び塩化カルシウム溶液（これらはすべてＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている）を含む一段階凝固アッセイを使用して検出した。Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＢＣＳ ＸＰ分析機で測定を行った。較正のために、標準ヒト血漿を使用した。
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を、血漿サンプルにおいてＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬ試薬（マウス及びラット）又はＡｃｔｉｎ（Ｒ）ＦＳＬ（ウサギ）及び塩化カルシウム溶液を使用してＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＢＣＳ ＸＰ分析機で分析した。全ての試薬はＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
実験動物
ＦＶＩＩＩ ｋｏマウス
ＦＶＩＩＩ遺伝子のエクソン１６及び１７を欠失し、したがって血漿第ＶＩＩＩ因子活性を有していないので（Ｂｉ Ｌ． ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９５、Ｖｏｌ １０（１）、１１９－１２１；Ｂｉ Ｌ． ｅｔ ａｌ、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、Ｖｏｌ ８８（９）、３４４６－３４５０）、（血友病Ａ表現型を表す）ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスを選択した。これは、これらのマウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を定量することによりＦＶＩＩＩを用いた処置後のＦＶＩＩＩ活性レベルの分析を可能にする。
ＦＶＩＩＩ ｋｏラット
血友病Ａ表現型を表すＦＶＩＩＩ ｋｏラットを、ＳＡＧＥ Ｌａｂｓ （Ａ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３１４６、ＵＳＡ）にてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して生成した。エクソン１８内の位置２３４７１～２３４７２に２ｂｐ（塩基対）欠失及び１ｂｐ挿入を導入し、初期終止コドンをもたらす。生成されたＦＶＩＩＩ ｋｏ変異は、ＦＶＩＩＩ機能を破壊されたＦＶＩＩＩ ｋｏラットを生じた。これは、これらのラットの血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の定量化によりＦＶＩＩＩを用いた処置後のＦＶＩＩＩ活性レベルの分析を可能にする。
ＶＷＦ ｋｏマウス
ＶＷＦ遺伝子のエクソン４及び５を欠いており、したがって血漿ＶＷＦ活性を有していないので（Ｄｅｎｉｓ Ｃ． ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９８、Ｖｏｌ ９５、９５２４－９５２９）、ＶＷＦノックアウト（ｋｏ）マウス（ＶＷＤ表現型を表す）を選択した。これは、これらのマウスの血漿における内在性ＦＶＩＩＩ活性でのＤ’Ｄ３ポリペプチドの分析を可能にする。
ＶＷＦ ｋｏラット
ＶＷＤ表現型を表すＶＷＦ ｋｏラットを、Ｓｉｇｍａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （ＳＡＧＥ） Ｌａｂｓ （Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ ６３１４６、ＵＳＡ）でＣｏｍｐｏＺｒＴＭ 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術及びＳＡＧＥｓｐｅｅｄＴＭ動物ノックアウト製造プロセスを使用して生成した。ゲノム配列における位置３３９２６ｂｐ～３３９４１ｂｐでの１６ｂｐ（塩基対）欠失を、エクソン７内に誘導し初期終止コドンを生じた。一般にＺＦＮ技術を使用してＳｉｇｍａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （ＳＡＧＥ） Ｌａｂｓ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるノックアウトラットの生成は、Ｘ． Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０）、ＭＨ． Ｐｏｒｔｅｕｓ ＆ Ｄ． Ｃａｒｒｏｌｌ （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５）に記載される。生成されたＶＷＦ ｋｏ変異は、ＶＷＦ機能が破壊されたＶＷＦ ｋｏラットを生じた。これは、これらのラットの血漿における内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルに対するＤ’Ｄ３ポリペプチドの分析を可能にする
Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質（Ｄ’Ｄ３－ＦＰ）の生成：
ＶＷＦアミノ酸１～１２４２をコードするｃＤＮＡ、グリシン／セリンリンカー及びヒトアルブミンのｃＤＮＡからなるＤ’Ｄ３－ＦＰの発現カセットを、カスタム遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により製造した。隣接する制限部位（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ）を介して発現カセットを供給されたクローニングベクターから切除し、そしてＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩと線状化したｐＩＲＥＳｎｅｏ３ベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に挿入した。得られた発現プラスミドは、ＶＷＦプロペプチド、ＣＭＶプロモーター制御下にある短いリンカーコード配列を介してアルブミンコード配列に融合されたＤ’及びＤ３（配列番号４のＶＷＦアミノ酸１～１２４２）をコードするヌクレオチド配列を含有していた。コード配列のヌクレオチド配列は配列番号１として表示され、成熟Ｄ’Ｄ３－ＦＰのアミノ酸配列を配列番号２として示す。発現の間のＤ１Ｄ２ ＶＷＦプロペプチド（７４１アミノ酸）の存在は、合成されたポリペプチドの二量体化に不可欠である。
同様のアプローチを使用して、グリシン／セリンリンカーを介して連結され、そして融合タンパク質のＣ末端で８つのヒスチジンによりタグ化された、ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのＣ末端ペプチドへのＤ’Ｄ３融合タンパク質のための発現プラスミドを生成した。成熟ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰのアミノ酸配列を配列番号７として示す。
上記の発現プラスミドをＸＬ１０ Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、そして標準的プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。
ＣＨＯ Ｋ１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトし、そして無血清培地（ＣＤ－ＣＨＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で５００～１０００μｇ／ｍｌジェネテシンの存在下にて増殖させた。ＷＯ２００７／１４４１７３に記載されるようにＰＡＣＥ／フリン（ｐＦｕ－７９７）をコードする発現プラスミドを、プロペプチド切断効率を最大にするために同時トランスフェクトした。単細胞由来クローンを増殖させ、そしてアルブミン特異的酵素イムノアッセイ（以下を参照のこと）により定量したそれらのＤ’Ｄ３－ＦＰ発現収率に従って選択した。Ｄ’Ｄ３－ＦＰ発酵のために最終的に選択した細胞株をＴ２０５０－ＣＬ３と呼んだ。
発酵プロセスを灌流モードで適用してｒＤ’Ｄ３－ＦＰの製造をバイオリアクターで行った。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの製造のための発酵プロセスは、細胞株Ｔ２０５０－ＣＬ３の解凍から開始し、続いて振盪フラスコで細胞増殖させ、そして最終的に発酵プロセスを灌流モードでＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＢｉｏＳｔａｔ Ｂ－ＤＣＵ ５Ｌバイオリアクター及びＢｉｏＳｔａｔ ＳＴＲ ５０Ｌ単回使用バイオリアクターを使用して行った。それぞれＢｉｏＳｅｐｓ １０Ｌ又は２００Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）を細胞保持デバイスとして使用した。細胞培地は８ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１μＭ ＣｕＳＯ４を含むＰｏｗｅｒＣＨＯ３ （Ｌｏｎｚａ ＢＥＳＰ１２０４）又は１０ ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１μＭ ＣｕＳＯ４を含むＰｒｏＣＨＯ５ （Ｌｏｎｚａ ＢＥＳＰ１０７２）のいずれかであった。
振盪フラスコ中のシードトレインを３７℃、７．５％ ＣＯ２で振盪速度１６０ｒｐｍにて行った。
５Ｌバイオリアクターに２．５ｘ１０５細胞／ｍＬの標的ＶＣＤを播種した。８ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１μＭ ＣｕＳＯ４を含むＰｏｗｅｒＣＨＯ３中で＋３７．０℃の温度、ｐＨ７．００、及び３０％酸素飽和にて細胞を培養した。＋３７℃でのバイオリアクター実行からの初期収穫を採取した後に＋３４．０℃への温度シフト（評価範囲＋３１℃～＋３５℃）を行った。酸として散布されたＣＯ２及び塩基としてＮａＨＣＯ３を使用してｐＨを制御した。オーバーレイ空気流量を０．５Ｌ／分に設定した。リングスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は、２倍ピッチ羽根を用いてダウンプルモードで１５０ｒｐｍだった。
５０Ｌバイオリアクターに標的ＶＣＤ ３．０ｘ１０５細胞／ｍＬを播種した。１０ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１μＭ ＣｕＳＯ４を含むＰｒｏＣＨＯ５培地で＋３７．０℃の温度、ｐＨ６．９０、及び３０％酸素飽和で細胞を培養した。＋３４．０℃への温度シフトを初期の１又は２回の収穫後に行った。上記のＰＨ制御、オーバーレイ空気流量を２Ｌ／分に設定した。マイクロスパージャーを散布ユニットとして使用した。撹拌速度は２倍ピッチ羽根を用いてダウンプルモードで９０ｒｐｍだった。
バイオリアクター中のＶＣＤが≧１．０ｘ１０６細胞／ｍＬになった場合に灌流を開始した。灌流速度を１．０体積／体積／日に設定した。ＢｉｏＳｅｐをバックラッシュモードで５（１０）分ランタイム及び１０秒バックラッシュで７（３０）Ｗの電源入力で操作した（カッコ内の数字は５０Ｌバイオリアクターを指す）。灌流液及びブリード（ｂｌｅｅｄ）をインラインろ過し、そして４８時間にわたって＋２～＋８℃にてバッグに集めた。能動的ブリードにより濁度プローブを使用して２ｇ／Ｌグルコースの標的とともにパラメーターとしてグルコース消費を使用してＶＣＤを制御した。収穫及びブリードをインラインろ過し、使い捨てフィルター及び使い捨てバッグからなる収穫システムを２日ごとに変更した。
以下に記載されるＰＫ分析のための材料を製造するために、収穫物をアフィニティ及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。手短には、バイオリアクターからの無細胞収穫物をＴＦＦシステム（例えば、Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ５００ Ｓ）を使用して３０ｋＤ膜（例えば、Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ＯＳ０３０Ｔ１２）を用いて３０倍濃縮した。その濃縮物をＮａＣｌ及びＥＤＴＡを用いて最終濃度０．７５Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＥＤＴＡまでスパイクし、そして終夜、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．４で予め平衡化したＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒトアルブミンカラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にロードした。カラムを平衡緩衝液で洗浄した後、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で溶出した。次いで溶出液を１０倍濃縮し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して３０ｋＤカットオフを有する超遠心フィルター（例えば、Ａｍｉｃｏｎ． ＵＦＣ９０３０２４）を用いて透析した。モノマー部分からｒＤ’Ｄ３－ＦＰダイマーを分離するために、その材料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ コード：１７－１０６９－０１）にロードし、そしてＤ’Ｄ３－ＦＰダイマーを含有するピークフラクションをプールした。ダイマー及びモノマーピークフラクションについての曲線下面積を使用して、ダイマー対モノマー比を計算した。上記Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質のダイマー調製物を、実施例１．１～１．６における薬物動態実験に使用した。このようなダイマー調製物は、別の指示がなければ、以下においてＤ’Ｄ３－ＦＰ又はｒＤ’Ｄ３－ＦＰと呼ばれる。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹ及びＥＹＡ変異体は同等の方法の工程により生成された。
実施例１．１：ラットにおける生理的内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた静脈内処置の影響
動物
２００～２９４ｇの体重範囲の雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（スプラーグドーリー）ラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内でこれらの動物を標準的飼育条件、すなわち２０～２４℃にて１２時間／１２時間明－暗サイクル下に維持した。動物に自由に標準的マウス及びラット食餌を与えた（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
１ｍｇ／ｋｇ群について、群サイズはｎ＝９であり、コントロール（ｎ＝３動物のみ）を除いて３つのコホートに分けた。１ｍｇ／ｋｇ群の群サイズはｎ＝６であり、２つのコホートに分けた。したがって、１時点あたりｎ＝３の動物を常に使用した。
実験詳細
試験品をラット（群あたりｎ＝３）の外側尾静脈への単回注射により静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミン値に基づいて１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。１ｍｇ／ｋｇ群の血液サンプルを後眼窩で（大動脈穿刺による１０及び１４日目の終末サンプリング）投薬前、静脈内ボーラス注射後の投与後（ｐ．ａ．）６時間（ｈ）並びに１、２、３、４、５、７、１０及び１４日後に採取した。３ｍｇ／ｋｇ群の血液サンプルを投与の０．０８３、３、８ｈ並びに１、２、３及び４日後に採取した。これらをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてｒＤ’Ｄ３－ＦＰ及び／又はＦＶＩＩＩ活性の決定のために約ー７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。ＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを、発色アッセイ、さらには一段階凝固アッセイを使用して検出した。
曲線下総ピーク面積（ＡＵＣ）の計算をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて１４日間の期間の間にわたって、ベースラインとして処置前の値を使用し、そして最小値から最大値までの距離が≦３０％であるピークを同定して行った。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを投与後（ｐ．ａ．）４日（ｄ）（３ｍｇ／ｋｇ）又は１４ｄ（１ｍｇ／ｋｇ）まで定量し、そして測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図１Ａ）。線形用量依存性が２つの試験された用量で観察された。
ＦＶＩＩＩ活性を１ ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰで処置された群について発色及び一段階凝固活性として測定し、そして両方のＦＶＩＩＩ活性試験は、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に食塩水コントロールと比較して、投与後２日目（発色活性）又は１日目（凝固活性）と５日目との間のピークで、内在性ＦＶＩＩＩレベルの一時的な増加を示した（図１Ｂ及び１Ｃ）。再び両方のアッセイについて、平均ＦＶＩＩＩ濃度は、投薬前最大値、すなわち発色ＦＶＩＩＩ活性について３．１ＩＵ／ｍＬ及び凝固ＦＶＩＩＩ活性について４５４％（４．５ＩＵ／ｍＬ）をほとんど超えることはなかった。サンプルの定量のために使用される１：４希釈を用いた正常値上限（ＵＬＮ）にはいずれの動物も達しなかったということに言及するべきだろう。これと一致して、図１Ｄに示されるようにＡＵＣ（投与後０日目から１４日目にわたって評価された）は、１ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量で発色アッセイ、さらには凝固アッセイで増加した。
ＦＶＩＩＩ活性の増加と一致して、ビヒクル処置動物と比較して生理学的活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）は減少し（図１Ｅ）、これは投与直後に始まり、投与後約７日目までピークを有していた。再び、平均値は投薬前範囲内の範囲に及び、そして投与後１日目にのみ、平均値は最低投薬前値１６．５ｓを下回った。
少なくとも１４日間のｒＤ’Ｄ３－ＦＰへの所定の曝露で、ＦＶＩＩＩ活性のわずかな増加が観察された。ピーク値は投与後１～５日後に得られ、これらはいずれの場合も食塩水処置動物よりも＜２倍高く（ＦＶＩＩＩ発色活性：最大増加約１ＩＵ／ｍＬ又は１００％から約３．５ＩＵ／ｍＬ＝３５０％；ＦＶＩＩＩ凝固活性：最大増加約３００％～約７００％、大部分は約１００％～約５００％ － ヒトと比較したこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致）、そして大部分は生理的変動内であった。ＦＶＩＩＩ活性のこのわずかな増加はａＰＴＴの短縮をもたらし、平均値は最小投薬前値よりわずかにかつ短期間低いだけであった。したがって、健常ラットにおいて、ＦＶＩＩＩレベルの僅かな増加は１ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量で観察されたが、これらの値は生理的範囲外にはほとんど変化しなかった。
実施例１．２：ウサギにおける生理的内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた静脈内処置の影響
動物
２．０～３．２ｋｇの体重範囲の雌性ＣＨＢウサギ（Ｂａｕｅｒ、Ｎｅｕｅｎｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、鋼線ケージで１ケージあたり１匹で標準的な飼育条件、すなわち２０～２３℃及び５０％相対湿度で１２時間／１２時間明－暗サイクル下で飼育した。動物は水道水を自由に与えられ、そしてウサギペレット食餌を与えられた（Ｄｅｕｋａｎｉｎ（Ｒ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｔｉｅｒｎａｈｒｕｎｇ Ｃｒｅｍｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
実験詳細
試験品を、ウサギの外側耳介静脈（ｌａｔｅｒａｌ ｅａｒ ｖｅｉｎ）への単回注射によりｉ．ｖ．投与した（群あたりｎ＝３）。ヒトアルブミン値に基づいて１、３又は１０ｍｇ／ｋｇの用量でｒＤ’Ｄ３－ＦＰを適用した。血液サンプルを投薬前、静脈内ボーラス注射の後、投与後（ｐ．ａ．）１、３及び６時間に採取し、続いて１０日まで毎日サンプリングした。これらをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてｒＤ’Ｄ３－ＦＰ及び／又はＦＶＩＩＩ活性の決定のために約－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。ＦＶＩＩＩ活性血漿レベルを、発色アッセイさらには一段階凝固アッセイを使用して検出した。さらに、ａＰＴＴをＡｃｔｉｎ（Ｒ）ＦＳＬ試験を使用して定量した。いずれの凝固したサンプルも評価から除外した。
曲線下総ピーク面積（ＡＵＣ）の計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて１０日の期間にわたってベースラインとして処置前の値を使用して行い、そして最小値から最大値まで≦３０％の距離を有するピークを同定した。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを投与後１０日目（１０ ｄ ｐ．ａ．）まで定量し、そして測定されたデータは、７日目又はそれ以後にいくつかの動物において観察された低下を除いて、観察期間全体にわたって１６又は３１ｎｇ／ｍＬの検出限界より十分高かった（図２Ａ）。曝露のこの突然の低下は単一の動物において観察され、７～１０日目に始まり、そして特により高い用量について観察された。一つの可能性のある原因は、試験した他の種と比較してウサギ及びヒトにおけるＤ’Ｄ３領域のより低い相同性と一致して、抗薬物抗体の形成であり得る。
ＦＶＩＩＩ活性を、発色及び一段階凝固活性として測定し、両方とも食塩水対照と比較して内在性レベルの増加を示した（図２Ｂ及び２Ｃ）。データは、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に内在性ＦＶＩＩＩレベルのわずかな増加を示唆し、ピークは投与後３～７日目の間であった。それにもかかわらず、平均値は、発色ＦＶＩＩＩ活性試験において投薬前の値２．８ＩＵ／ｍＬ及び凝固ＦＶＩＩＩ活性試験において標準の６１１％（６．１ＩＵ／ｍＬ）の範囲を一時的に増加させたのみであった。このことと一致して、図２Ｄに示されるようにＡＵＣ（投薬後０～１０日にわたって評価された）は増加した：発色アッセイでは、用量３ｍｇ／ｋｇで開始したが、凝固アッセイでの効果は１０ｍｇ／ｋｇでしか見えななかった。このことは凝固アッセイにおけるベースライン値のより高い変動と関連している可能性があり、これは処置された群においてはすでにわずかにより高かった。
ＦＶＩＩＩ活性はわずかな増加を示したが、ａＰＴＴの減少は観察されなかった（図２Ｅ）。
少なくとも６日間ｒＤ’Ｄ３－ＦＰに対する所定の曝露で、ＦＶＩＩＩ活性のわずかな増加が観察され、これは食塩水処置動物において観察されたレベルをわずかに超えていた。ピーク値は投薬後３～７日目に生じ、これは食塩水処置動物より＜２倍高かった（ＦＶＩＩＩ発色活性：最大増加約１ＩＵ／ｍＬ又は１００％～約３．５ＩＵ／ｍＬ＝３５０％；ＦＶＩＩＩ凝固活性：最大増加約４００％～約９００％－ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致）。これらの増加したＦＶＩＩＩ活性レベルは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で３～６日目にウサギにおける生理的レベルをわずかに超えただけであり、そしてａＰＴＴを低減しなかった。したがって健常ウサギにおいて、ＦＶＩＩＩレベルのわずかな変化しか観察されなかった。
実施例１．３：サルにおける生理的内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた静脈内処置の影響
動物
約４～７ｋｇの体重範囲、年齢約５～６歳の範囲の雄性カニクイザル（ベトナムから入手 - 証拠書類は健康スクリーニング及び到着前に施されたいずれかの処置を含んでいた － Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫへ）を、標準的飼育条件、すなわち１５～２４℃及び相対湿度４０～７０％で１２時間明－暗サイクル下で非ヒト霊長類を飼育するために特別に設計されたケージにおいて２匹一組で飼育した。動物に水道水を自由に供給し、そして旧世界サル食餌（毎日動物１匹あたり２００ｇ）及び栄養補助食餌（２つのビスケット栄養補助食品、各約２５ｇ、及び新鮮な果実製品）を与えた。
実験詳細
試験品をサルの伏在静脈に単回注射により静脈内投与した（群あたりｎ＝３）。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミン値に基づいて２．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。投薬前、及び静脈内ボーラス注射の投薬の５、３０分、２、６、１６、３０、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に血液サンプルを大腿静脈から採取した。これらをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．２％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性及び／又はｒＤ’Ｄ３－ＦＰの決定のために約－７０℃で保存した。
分子のＤ’Ｄ３部分を捕捉する抗体を使用し、そしてアルブミンに対する抗体の検出を使用して構築物のアルブミン部分を測定することにより、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を決定した。ＦＶＩＩＩ発色活性血漿レベルをＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘアッセイにより検出した。
結果
その成分の両方、アルブミン及びＤ’Ｄ３へのＥＬＩＳＡ結合を使用してｒＤ’Ｄ３－ＦＰを定量し、そして測定は投与後１６８時間（７日）までに行った。測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図３Ａ）。
ＦＶＩＩＩ活性を図３Ｂに示されるように発色活性として測定した。基礎内在性レベルは関連して変化し、標準の８３．６～３１４．８％の範囲（０．８～３．１ＩＵ／ｍｌ＝図３Ｂにおける点線）及び標準の平均１７６．４％（１．８ＩＵ／ｍＬ、図３Ｂにおける破線）であった。ラット及びウサギにおけるように、標準の２５８．９％の平均最大値までの内在性ＦＶＩＩＩの小さな増加しか観察されず、そして変動性は非常に高かった。それにもかかわらず、個々の投薬前の値と比較して、約１ＩＵ／ｍＬ又は標準の約１００％までの内在性ＦＶＩＩＩレベルの増加（約２．５ＩＵ／ｍＬ又は約２．５ＩＵ／ｍＬまで － ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースラインと一致）が実証され、それにもかかわらずこれらは（平均として）サルの生理的ＦＶＩＩＩレベルを超えなかった。
実施例１．４：ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた静脈内処置のＶＷＦ ｋｏラットにおける内在性ＦＶＩＩＩレベルに対する影響
動物
体重範囲２６１～５９８ｇの雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内で、動物を標準的飼育条件、すなわち２０～２４℃で１２時間／１２時間明－暗サイクル下に維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌を自由に与えた（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
１及び１０ｍｇ／ｋｇ群の群サイズはｎ＝９であり、対照を除いて３つのコホートに分けた（ｎ＝３動物のみ）。したがって、時点あたりｎ＝３の動物を全てのビヒクル、１及び１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの時点で使用した。３ｍｇ／ｋｇ群については、群サイズは時点あたりｎ＝４であった。
実験詳細
試験品を総体積２又は３ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを、ヒトアルブミン値に基づいて１、３又は１０ｍｇ／ｋｇの投薬レベルで適用した。血液サンプルを、投薬前、投薬の６、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、３３６時間後（１及び１０ｍｇ／ｋｇ）に交互サンプリングスキームを使用して、又は各個々の動物から伏在静脈から投薬前、投薬の１、２４、４８、７２、１２０、１９２、２４０及び３３６時間後に（３ｍｇ／ｋｇ）短期間麻酔下で後眼窩から採取した。群あたりラットの３つのコホートから（１及び１０ｍｇ／ｋｇ）又は個々の動物から（３ｍｇ／ｋｇ）ＰＫプロフィールを取った。血液サンプルを、クエン酸（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性及び／又はアルブミンの決定のために－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色及び凝固活性、さらにはａＰＴＴを測定した（後者は１及び１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰで処置された群においてのみ）。
曲線下面積（ＡＵＣ）の計算を、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１７ａ （Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いてゼロから１０日目まで台形法を使用して行った。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを、ヒトアルブミンに対するＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定を投薬後１４日目まで行った。全ての測定されたデータは、１４日目までの観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図４Ａ）。線形用量依存性が１～１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰから示された。
図４Ｂに示されるように発色活性として測定されたＦＶＩＩＩ活性活性は、関連ベースラインＦＶＩＩＩレベルを生じなかった：２３のうち２２のサンプルは検出限界（０．００５ＩＵ／ｍＬ又は０．５％）未満であり、そして１匹の動物は０．００７ＩＵ／ｍＬの値を有していた。ＶＷＦ ｋｏラットにおいて（ＣＤラットと対照的に）、両方のラット系統のサンプルの定量のために使用された１：４希釈で正常上限（ＵＬＮ、４ＩＵ／ｍｌ）に達した：ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に、レベルは２日以内に増加し、１０ｍｇ／ｋｇ用量でさえ４ＩＵ／ｍＬ（又は４００％）のアッセイの定量上限を超えた。ＶＷＦ ｋｏラットにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ投薬後のＦＶＩＩＩ活性レベルはｒＤ’Ｄ３－ＦＰは健常ＣＤラットにおいて測定された値を一時的に超えた － が１又は３ｍｇ／ｋｇは超えなかった。ＦＶＩＩＩ発色活性値は、１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投与後にも他の健常種、すなわちウサギ（１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰまで投薬された）又はサル（２．５ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）よりも高かった。１０ ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後のラットにおける効果は１０日目まで続いた。１ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量でさえ、最も高い血漿濃度２．３６ＩＵ／ｍＬ（又は２３６％）に２日目に達し、そして効果は７日目になお弱く見られた。３ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰでも同様に、最高ＦＶＩＩＩ血漿濃度に１日目に達した（２．０９ＩＵ／ｍＬ又は２０９％）。これらのより低い２つの用量で、平均ＦＶＩＩＩ濃度はＣＤラットからの正常レベルの範囲内であった。
ＦＶＩＩＩ活性が図４Ｃにおいて示されるように凝固アッセイを用いて測定された場合、ベースラインＦＶＩＩＩレベルは測定可能であった（未希釈サンプル：平均 標準の２２．３％、最小 １１．７％及び最大 ４０．９％、ｎ＝１７；及び検出限界４０％で、２０サンプルが残った＜４０％）。したがって、ＣＤラット及びウサギにおけるように、ベースライン値は非常に変化しやすい。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後の全てのサンプルが１：８の希釈工程を必要とし、それにより標準の１１８６．４％のＵＬＮを生じるということに言及する必要がある。再び、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に、内在性ＦＶＩＩＩレベルは２日以内にアッセイのＵＬＮを超えさえし、すなわちウサギにおけるより高かった。この効果は１４日目まで高用量の１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰで続いた。１ｍｇ／ｋｇの用量でさえ、標準の３８８．８％の最高血漿濃度に２日目に達し、そして効果は７日目にもなお見られた。同様に３ｍｇ／ｋｇの用量で、２日目に測定された最高血漿濃度は標準の４３５．２％であった。発色ＦＶＩＩＩ活性と同様に、１０ｍｇ／ｋｇの投与後にＦＶＩＩＩ活性の生理的範囲を超え、そして１又は３ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与直後に達した。
したがって、発色及び凝固活性データは、凝固活性データと一致して、わずかにより強い応答を示し、おそらくヒトＦＶＩＩＩ標準に対してベースラインラットＦＶＩＩＩの測定と関連する。ＦＶＩＩＩ活性の増加が観察され、健常ＣＤラットにおいて観察されたレベルに達し（１及び３ｍｇ／ｋｇ）、又はそれらを超えた（１０ｍｇ／ｋｇ）。１０ｍｇ／ｋｇ用量については、ピーク値は検出上限より高く、したがって正常範囲のｘ倍の増加は決定することができなかった。
このことは、ＡＵＣ（０～１０日）において計算された増加と一致し、図４Ｄに示されるように１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量の後の増加を示す。１及び３ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量の後の増加は、ビヒクル処置と比較して発色ＦＶＩＩＩ活性について約１０倍そして凝固ＦＶＩＩＩ活性について約８０倍であり、１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰでは発色について約５０倍そしてＡＵＣ０－１０ｄに対して４３０倍の効果であった。
ＦＶＩＩＩレベルのこれらの増加と一致して、活性化部分トロンビン時間（ａＰＴＴ）は、病的な投薬前又はビヒクルデータから１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ用量群において最低平均値１２．５秒（ｓ）まで関連して減少した（図４Ｅ）。この減少は両方の測定された用量群（１及び１０ｍｇ／ｋｇ）において１４日目まで続き、そしてａＰＴＴ値を健常ＣＤラットにおいて観察された範囲（範囲１６．５～３６．６ｓ）に（１ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）又はその範囲よりわずかに低く（１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）した。
実施例１．５：ＶＷＦ ｋｏマウスにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた静脈内処置の内在性ＦＶＩＩＩレベルに対する影響
動物
３０～４５ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において飼育した。社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち、２０～２４℃で１２時間／１２時間明－暗サイクル下で飼育した。動物に標準的マウス及びラット食餌（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を自由に与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
群サイズはｎ＝１２であり、対照（ｎ＝４匹の動物）を除いて４つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝３～４匹の動物を使用した。
実験詳細
試験品（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ又はビヒクル（等張食塩水））を、総体積５ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミン値に基づいて１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。血液サンプルを、短期間麻酔下で投与の４、７、１６、２４、４８、７２、９６及び１６８時間後に交互サンプリングスキームを使用してｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投薬動物から、並びに投与の４及び１６８時間後にビヒクル処置動物から後眼窩で採取した。ＰＫプロフィールを、群あたりマウスの４つのコホートから取った。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性及び／又はアルブミンの決定のために－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露をヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色及び凝固活性を測定した。
曲線下総ピーク面積（ＡＵＣ）の計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて７日間の期間にわたって最小値から最大値までの距離≦１０％を有するピークを同定して行った。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミンに対するＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定を投与後７日目まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図５Ａ）。
発色活性として測定されたＦＶＩＩＩ活性は、関連するベースラインＦＶＩＩＩレベルを生じなかった：ビヒクル処置動物からの全ての６つの測定されたサンプルは検出限界（１０ｍＩＵ／ｍＬ又は１％）未満であった。比較のために、健常ＮＭＲＩマウスの発色活性は、約９６～３００ｍＩＵ／ｍＬ、中央値２３０ｍＩＵ／ｍＬ、平均２０６ｍＩＵ／ｍＬ（標準の１０～３０％の範囲に及ぶ、未公開データ）の範囲に及び、すなわち他の動物種又はヒトにおいて観察されたよりも低かった。図５Ｂに従って、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に、レベルは４時間以内に平均値１３８ｍＵ／ｍＬ（１４％）まで急速に増加し、そしてさらに増加して投与４８時間後に最大値に達し、平均４２１ｍＵ／ｍＬ（４２％）で投与７２時間後まで（４２９ＩＵ／ｍｌ又は４３％）であった。投与１６８時間（７日）後の最後の時点に、なお１９４ｍＵ／ｍＬ（２０％）が測定された。これを用いて、１０ ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた処置後のＦＶＩＩＩ発色活性は、ＮＭＲＩマウスにおいて測定された生理的ＦＶＩＩＩ血漿レベルを超え、そして効果はＶＷＦ ｋｏラットに匹敵するものであった。
ＦＶＩＩＩ活性を凝固アッセイを用いて測定した場合、べースラインＦＶＩＩＩレベルは測定可能であった（ビヒクル処置動物：標準の平均３１．１、最小２５．８及び最大４１．８％、ｎ＝８）。したがって、他の種におけるように、ベースライン値は非常に変化しやすかった。再び、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後に、図５Ｃに示されるようにレベルは急速に増加し、そして１：６０の希釈でしか測定することができなかった（一方、ベースライン値の定量のために使用されたビヒクル処置動物は１：１０希釈で測定された）。投与４時間後の最初のサンプリング時点で、平均値はすでに標準の１３７％であり、そして投与１６時間後までさらに増加し、平均で標準の２１８％であった。最大曝露に投与７２時間後に達し、平均で標準の３０４％であった。投与１６８時間（７日）後の最後の時点で、なお標準の２５４％が測定された。
したがって、発色及び凝固活性データは、概してより強い応答を示す凝固活性データと一致しており、おそらくヒトＦＶＩＩＩ標準に対するマウスＦＶＩＩＩ（ＶＷＦ ｋｏ動物において）の測定と関連していた。ＦＶＩＩＩ活性の増加が観察され、これは健常ＮＭＲＩマウスにおいて観察されたレベルを＜２倍超えた（ＦＶＩＩＩ発色活性：最大増加 ０．１ＩＵ／ｍＬ＝約１０％～約０．４ＩＵ／ｍｌ＝４０％ － ヒトと比較してこれらの動物におけるより低いベースラインと一致；ＦＶＩＩＩ凝固活性：約３００％への最大増加（ＮＭＲＩマウスからの範囲は決定されていない））。これは計算されたＡＵＣの増加と一致し（０～７日目）、図５Ｄに示されるようにビヒクル処置動物と比較して１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投薬後に大きな増加を示した。
実施例１．６：ＶＷＦ ｋｏラットにおける内在性ＦＶＩＩＩレベルに対する様々なｒＤ’Ｄ３ポリペプチドを用いた静脈内処理の影響
動物
２６１～５５９ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち２０～２４℃で１２時間／１２時間明－暗サイクル下にて維持した。動物に自由に標準的マウス及びラット食餌（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
群サイズは各群についてｎ＝４であった。
実験詳細
試験品を、総体積３ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミン値に基づいて３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。血液サンプルを、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投薬動物から投薬前、投与の１、２４、４８、７２、１２０、１９２、２４０及び３３６時間後に、そしてｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰ処置動物から投薬前、１、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０及び３３６時間後に伏在静脈から採取した。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性及び／又はアルブミンの決定のために－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰをＥＬＩＳＡ技術により抗ヒトＤ’Ｄ３に対する抗体を使用して決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色及び凝固活性を測定した。
０～１０日目までの曲線下面積（ＡＵＣ）の計算を、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１７ａ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を用いて台形法を使用して行った。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミンに対してＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定を投与１４日後まで行った。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ変異体の全ての測定されたデータは、観察期間全体にわたって検出限界より十分高かったが、ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰは１４日目にベースライン値に達した（図６Ａ）。変異体ＥＹ及びＥＹＡと比較してｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＷＴのわずかな有利性が回収率において観察されたが、クリアランスに関して関連する差異は見られなかった。ｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰをヒトｒＤ’Ｄ３に対してＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定値は投与後１０日目を含めて１０日目まで検出限界より十分高かった（図６Ａ）。
発色活性として測定されたＦＶＩＩＩ活性は、関連するベースラインＦＶＩＩＩレベルを生じなかった：全１８の測定された投薬前サンプルは検出限界（２０ｍＩＵ／ｍＬ又は２％）未満であった。図６Ｂによれば、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ変異体の投与後に、レベルは投与１時間後にすでに増加し（ＷＴ １９７±２０ｍＩＵ／ｍＬ又は５％、ＥＹ １７１±８４ｍＩＵ／ｍＬ又は１７％、ＥＹＡ ２０３±１１７ｍＩＵ／ｍＬ又は２０％及びＣＴＰ １１０±１０２ｍＩＵ／ｍＬ又は１１％）、そしてさらに次の測定された時点でも増加した。１日目～８日目の間に最大に達し、ＷＴについて２０８８ｍＵ／ｍＬ（２０９％）、ＥＹについて２８８９ｍＵ／ｍＬ（２８９％）、ＥＹＡについて１０４４ｍＵ／ｍＬ（１０４％）、そしてＣＴＰについて２２１４ｍＵ／ｍＬ（２２１％）の平均値であった。最後の測定可能なＦＶＩＩＩ活性はＷＴについて１０日目に（２３７±２２５ｍＵ／ｍＬ（２４％））、ＥＹについて１０日目に（５１２±６０３ｍＵ／ｍＬ（５１％））、ＥＹＡについて１４日目に（最後の測定された時点、１７９±１０７ｍＵ／ｍＬ（１８％）、及びＣＴＰについて１４日目に（２２±４ｍＵ／ｍＬ（２％））観察された。これはｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰ変異体の静脈内投与後に最も高い観察されたＡＵＣ０－１０ｄをもたらした（表２、図６Ｄ）。
ＦＶＩＩＩ活性を凝固アッセイで測定した場合、ベースラインＦＶＩＩＩレベルも測定可能ではなかった（ｎ＝２０投薬前 処置された動物、検出限界４０％）。図６Ｃに示されるように、再び、ｒＤ’Ｄ３－ＨＬＰの投与後に、レベルは投与の１時間後にすでに増加し（ＷＴ ４７±４％、ＥＹ ４１±１％、ＥＹＡ ４５±５％及びＣＴＰ ４０±１％）、そしてさらに次の測定された時点でも増加した。ＷＴについて４３５％、ＥＹについて４５３％、ＥＹＡについて７７９％、そしてＣＴＰについて３５８％の平均値で１日目～８日目の間に最大に達した。最後の測定可能なＦＶＩＩＩ活性は、ＷＴについて１０日目に（８５±３９％）、ＥＹについて１０日目に（１３０±８４％）、ＥＹＡについて１４日目に（最後の測定された時点、４６±７％）、そしてＣＴＰについて７日目（５７±２９％）に観察された。最も高い観察されたＡＵＣ０－１０ｄは、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹＡの静脈内投与後に達成された（表２、図６Ｄ）。
したがって、発色及び凝固活性データは、再びより強い応答を示した凝固活性データと概して一致していた。ＦＶＩＩＩ活性の増加は、発色ＦＶＩＩＩ活性について約１．５～２ＩＵ／ｍＬ（１５０～２００％）まで、そして凝固活性について約３００～７００％まで観察され、したがって発色ＦＶＩＩＩ活性についてＣＤラットにおいてわずかに低い値及び凝固ＦＶＩＩＩ活性についてＣＤラットにおいてわずかに高い値（実施例１．４における図４Ｂ及び図４Ｃを参照のこと）であり － ヒトのベースラインと異なるこれらの動物におけるベースラインと一致した。
Figure 0007252890000002
したがって、発色及び凝固活性データは、概して、より高い絶対ＡＵＣ０－１０ｄ値に関連してより高い絶対ＦＶＩＩＩ濃度を示す凝固活性データと一致していた。ＦＶＩＩＩ活性に対する効果が、凝固アッセイと比較して発色アッセイにおいてｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰ投与後により強かったということに言及するべきである。全ての４つのｒＤ’Ｄ３－ＦＰ変異体がほぼ匹敵する曝露を示したが、ＦＶＩＩＩに対して最も高い結合親和性を有するｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹＡ変異体は、内在性ＦＶＩＩＩに対して最も長くかつ最も高い効果を示した。
実施例１．７：ＦＶＩＩＩ ｋｏ、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩマウス、ＶＷＦ ｋｏ及びＣＤラット及びブタにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰの皮下アベイラビリティ、並びにＶＷＦ ｋｏラット及びブタにおける内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するその影響
動物
ＦＶＩＩＩ ｋｏマウス
２０～３０ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝１２であり、４つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝３匹の動物を使用した。
ＶＷＦ ｋｏマウス
２５～４０ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝１２であり、４つのコホートに分けた。したがって時点あたりｎ＝３匹のマウスを使用した。
ＮＭＲＩマウス
２７～３４ｇの体重範囲の雌性ＮＭＲＩマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝１２であり、４つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝３匹の動物を使用した。
ＣＤラット
２５０～３０２ｇの体重範囲の雌性ラットＣｒｌ：ＣＤ （スプラーグドーリー）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝６であり、２つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝３匹の動物を使用した。
ＶＷＦ ｋｏラット
２２２～５５９ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝４であった。
社内では、マウス及びラットを、標準的な飼育条件、すなわち２０～２４℃にて１２時間／１２時間明－暗サイクル下に維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を自由に与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
ブタ
ヒトについてのその予測因子に関して皮下バイオアベイラビリティの良好なモデルを表すのでブタを選択した。群サイズは２（静脈内）又は３（皮下）であった。
２３～２７ｋｇの体重範囲の雄性ブタをＳｃｈｌｏｓｓｅｒ （Ｓｃｈｗａｌｍｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。社内では、動物を家畜小屋でわら上にて１８～２１℃に維持した。動物に損傷した穀物（ｂｒｕｉｓｅｄ ｇｒａｉｎ）を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
実験詳細
ＦＶＩＩＩ ｋｏ、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩマウス
試験品を、総体積５ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与、又は総体積５ｍＬ／ｋｇで頸部への単回注射により皮下投与した。血液サンプルを短期間麻酔下で交互サンプリングスキームを使用して投与の３、８、１６、２４、３２、４８、７２及び９６時間後に後眼窩で採取し、そしてさらに投与５分後に静脈内で採取した。
血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）で抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用してタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。
ＶＷＦ ｋｏラット
試験品を、総体積３ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈投与、又は総体積２ｍＬ／ｋｇで側腹部の片側に単回注射により皮下投与した。
皮下群からの血液サンプルを、投薬前、投薬の４、２４、４８、７２、９６及び１６８時間後に各動物から、そして投薬前、投薬の１、２４、４８、７２、１２０、１９２、２４０及び３３６時間後に静脈内群から伏在静脈から採取した。
血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして-７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用するタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性を測定した。
ＣＤラット
試験品を、総体積３ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への単回注射により静脈投与、又は総体積３ｍＬ／ｋｇで腹側部の片側に単回注射により皮下投与した。
血液サンプルを、後眼窩で短期間麻酔下にて交互サンプリングスキームを使用して投与の３、８、２４、４８、７２及び９６時間後に、そしてさらに投与の５分後に静脈内で採取した。
血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（２部クエン酸ナトリウム３．１３％＋８部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用したタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。
ブタ
試験品を、０．２１１～０．７５１ｍＬ／ｋｇの範囲に及ぶ総体積で単回注射により、側腹部に皮下投与又は耳静脈に静脈内投与した。
血液サンプルを耳又は伏在静脈から採取した。１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ皮下群において時点は、投薬前、投薬の３、１２、２４、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後であり、そして静脈内群では投薬前、投薬の５分、３、１２、２４、３２、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後であった。３ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ皮下群における時点は、投薬前、投薬の１、３、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０及び２６４時間後であった。
ＰＫプロフィールを個々の動物から取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（１部クエン酸ナトリウム３．１３％＋９部血液）を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして－７０℃でＦＶＩＩＩ抗原及びアルブミンの決定のために保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用したタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性を測定した。
一般
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを、ヒトアルブミン値に基づいて３、３．５又は１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。マウスにおいて、いくつかの群において、ｒＶＩＩＩ－単鎖を１００又は２００ＩＵ／ｋｇの用量で同時投与した。ＰＫプロフィールを、それぞれ群あたりマウスの４つのコホート若しくはラットの２つのコホートから、又は個々のブタから取った。
０から無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ）の計算をＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１７ａ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）で行った。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミンに対してＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定をマウスにおいて投与４日後まで、そしてラット及びブタにおいて投与１４日後まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図７Ａ）。
図７Ａ－１は、様々なマウス系統におけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰのＰＫプロフィールを示し、ｒＦＶＩＩＩ同時投与の視覚的な影響はなかった。全３つの系統における曲線はほぼ同様であったが、それにもかかわらずＮＭＲＩマウスでは、曝露はＦＶＩＩＩ ｋｏ又はＶＷＦ ｋｏ動物よりも急速に減少した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのＡＵＣ０－ｉｎｆ及び得られたバイオアベイラビリティを表３にまとめる。ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおいて、ｒＶＩＩＩ－単鎖を伴うか又は伴わないｒＤ’Ｄ３－ＦＰの静脈内投与は、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの ＡＵＣ０－ｉｎｆに対して影響を有していないということが示された（ＦＶＩＩＩを１００％に設定 －＞ ＦＶＩＩＩ無しは８９％と算出された）。したがって、この実験においてｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＰＫプロフィールに対するｒＶＩＩＩ－単鎖の関連効果はなかった。様々な系統におけるＡＵＣ０－ｉｎｆの比較は、３つの系統間に主要な差異を示さず、順位はＶＷＦ ｋｏ動物（１１９７ ｈ＊μｇ／ｍＬ）より高いＦＶＩＩＩ ｋｏ（１５９０ ｈ＊μｇ／ｍＬ）から、再びＮＭＲＩ動物におけるわずかに低いＡＵＣ０－ｉｎｆ（９４０ ｈ＊μｇ／ｍＬ）であった。
ラットにおけるＰＫプロフィールを図７Ａ－２に示し、これはＣＤ及びＶＷＦ ｋｏラットにおける皮下及び静脈内投与後のｒＤ’Ｄ３－ＦＰの同程度のクリアランスを示唆する。それにもかかわらず、皮下アベイラビリティは、ＣＤラットと比較してＶＷＦ ｋｏラットにおいて最も低かった。図７Ａ－３はブタにおけるＰＫプロフィールを示し、最も遅い２日目の後に同じ用量で同程度の曝露を示唆し、そしてｒＤ’Ｄ３－ＦＰのＰＫプロフィールに対するｒＶＩＩＩ－単鎖からの影響はなかった。
表４は種にわたるｒＤ’Ｄ３－ＦＰのバイオアベイラビリティをまとめる。ラットにおいて、バイオアベイラビリティの計算のためのＡＵＣ０－ｉｎｆ（ＣＤラット）及びＡＵＣ０－ｉｎｆ（ＶＷＦ ｋｏラット）の評価は、それぞれ４０％及び１１％の値を示し、すなわちＶＷＦ ｋｏ動物と比較してＦＶＩＩＩ－形質転換受容性ラットにおいてより良好なバイオアベイラビリティが見られた。これは、マウスＡＵＣ０－ｉｎｆ ｉｎｆ評価における観察と対照的であり、ＶＷＦ ｋｏ及びＮＭＲＩ動物からのほぼ同程度のデータを示唆した。仮にそうであるとしても、ＶＷＦ ｋｏマウスは、ＮＭＲＩマウスと比較してより良好なＡＵＣ０－ｉｎｆを有するだろう。ブタにおいて、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのＡＵＣ０－ｉｎｆは５９～１８７％の範囲に及んだ。これらをもとに種にわたって比較すると、ブタは最も高いｒＤ’Ｄ３－ＦＰバイオアベイラビリティを示した。
Figure 0007252890000003
Figure 0007252890000004
内在性ＦＶＩＩＩ発色活性は、静脈内（以前の実施例１．１～１．５を参照のこと）だけでなく、皮下ｒＤ’Ｄ－ＦＰ投与後も増加した（図７Ｂ）。
図７Ｂ－１は、ラットにおいて、値が増加して１日目（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）又は４日目（１０ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）に最大となることを示す。これにより、静脈内ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ投与と比較した（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ用量と独立して）皮下投与後のＦＶＩＩＩ ＡＵＣ０－ｉｎｆに対する効果の減少を１７％（発色）及び１４％（凝固）活性と算出した。このわずかであるが、それにもかかわらず関連した内在性ＦＶＩＩＩ活性の増加が、静脈内、さらには皮下処置について観察され（主に約０．５～１ＩＵ／ｍＬ又は５０～１００％の範囲に及ぶ）、したがってＣＤラットにおいて達成されたレベルをわずかに下回る範囲に及んだ（図４Ｂを比較のこと）。
ブタにおいて（図７Ｂ－２）、ＦＶＩＩＩ発色活性の増加がｒＤ’Ｄ３－ＦＰの皮下投与の約１日後に観察された。この効果は１１日の期間全体にわたって続いた。この増加は、最大で投薬前の値の２倍であり（約１０ＩＵ／ｍＬ＝１０００％への約５ＩＵ／ｍＬ又は５００％の最大増加 － ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致しており、すなわち、ＦＶＩＩＩ形質転換受容性動物への静脈内化合物投与後の小さな効果と一致していた。
したがって、これらのデータは、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた処置が静脈内を使用するだけでなく皮下化合物投与を使用しても行われ得るということを示唆する。
実施例１．８：ＶＷＦ ｋｏラットにおける内在性ＦＶＩＩＩレベルに対するｒＤ’Ｄ３－ＦＰの複数回静脈内投薬の影響
動物
２８１～５０４ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＶＷＦ ｋｏラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝１１であり、４つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝２～３匹の動物を使用した。
社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち２０～２４℃で１２時間／１２時間明－暗サイクルに維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌を自由に与えた（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
実験詳細
試験品を、０日目（コホート１）、０＋７日目（コホート２）、０＋７＋１４＋２１日目（コホート３）又は０＋７＋１４日目（コホート４）に総体積３ｍＬ／ｋｇで外側尾静脈への複数回注射により静脈内投与した。動物あたり２つの血液サンプルをコホートに特定の時点に短期間麻酔下で後眼窩で採取した（コホート１：投薬前＋投与７日後、コホート２：投与３＋１０日後、コホート３：投与１７＋２４日後、コホート：投与１４＋２１日後）。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを、ヒトアルブミン値に基づいて３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで適用した。ＰＫプロフィールをＶＷＦ ｋｏラットの４つのコホートから取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム（２部クエン酸ナトリウム３．１３％＋８部血液）を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてアルブミンの決定のために-７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色及び凝固活性並びにＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ（Ｒ）ＳＬを使用してａＰＴＴを測定した。
結果
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰをヒトアルブミンに対するＥＬＩＳＡを使用して定量し、そして測定を２４日目まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった（図８Ａ）。４回の投与で、ピーク（１５１％まで）さらにはトラフ（１２８％まで）レベルにおいてわずかな蓄積が観察された。
ＦＶＩＩＩ発色（図８Ｂ）活性レベルは、２回目の投与後に検出限界未満の値から検出限界まで、ＣＤラットにおいて観察された範囲に増加した（約１．８ＩＵ／ｍＬ＝１８０％への最大増加）。ＦＶＩＩＩ凝固活性（図８Ｃ）は、ＣＤラットにおいて測定されたデータよりなおわずかに高かった（約８００％への最大増加 － ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースラインと一致）。それにもかかわらず、４週間の期間にわたって２つのＦＶＩＩＩ活性アッセイについて蓄積は見られなかった。
これと一致して、ａＰＴＴはＣＤラットからの正常値の上からＣＤラットの正常範囲より低い範囲の値まで減少した（図８Ｄ）。
これらをもとに、これらのデータは、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いた複数回処置はｒＤ’Ｄ３－ＦＰのわずかな蓄積とともに行われ得るが、ＦＶＩＩＩレベルの蓄積もａＰＴＴの正常化もないということを示唆する。
実施例１．９：血友病Ａモデル、すなわちＦＶＩＩＩ ｋｏラットにおいて皮下投与されたｒＤ’Ｄ３－ＦＰ及び静脈内投与されたｒＶＩＩＩ－単鎖の調査
動物
２２０～４８７ｇの体重範囲の雄性及び雌性ＦＶＩＩＩ ｋｏラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育した。群サイズはｎ＝６であり、２つのコホートに分けた。したがって、時点あたりｎ＝３匹の動物を使用した。
社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち２０～２４℃で１２時間／１２時間明－暗サイクル下で維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌（Ｓｓｎｉｆｆ－Ｖｅｒｓｕｃｈｓｄｉａｅｔｅｎ、Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を自由に与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
実験詳細
試験品を、総体積３ｍＬ／ｋｇで単回注射により、ＦＶＩＩＩ ｋｏラットの頸部に皮下投与（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）又は外側尾静脈に静脈内投与（ｒＶＩＩＩ－単鎖）した。Ｄ’Ｄ３－ＦＰを、ヒトアルブミン値に基づいて３ｍｇ／ｋｇの用量で、ｒＶＩＩＩ－単鎖の１０分前に適用した。動物を、ｒＶＩＩＩ－単鎖で２００ＩＵ／ｋｇ発色ＦＶＩＩＩ活性の用量で静脈内処置した。ｒＶＩＩＩ－単鎖を注射用水で再構成し、そしてｒＤ’Ｄ３－ＦＰを水浴で解凍した。全ての場合に、用量体積３ｍＬ／ｋｇを投与し、ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－単鎖）について希釈緩衝液又は等張性食塩水（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）を必要な場合に化合物の溶解のために使用した。
血液サンプルを尾静脈のカニューレ挿入により採取した。群における時点は、投与の０．０８３、１、４、８、１６、２４、３２、４８及び７２時間後であった。ＰＫプロフィールを群あたりラットの２つのコホート、及び時点あたりｎ＝３から取った。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム（２部クエン酸ナトリウム３．１３％＋８部血液）を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてＦＶＩＩＩ活性及びＦＶＩＩＩ抗原の決定のために－７０℃で保存した。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ曝露を、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡを使用した構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、ＦＶＩＩＩ発色活性及びヒトＦＶＩＩＩ抗原を測定した。
最大濃度（Ｃｍａｘ）、ｔ＝０からｔ＝∞までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ０－ｉｎｆ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、クリアランス（ＣＬ）及び終末期半減期（ｔ１／２）の推定を、静脈内計算における２コンパートメントモデル、及び皮下計算における２コンパートメント吸収モデルにより行った。パラメーター推定のために、重み付き最小２乗コスト関数を適用した。バイオアベイラビリティを、静脈内投与と比較した皮下投与後のＡＵＣ０－ｉｎｆのパーセンテージとして計算した。１、５及び１０％トラフレベルまでの時間を、０．０１、０．０５又は０．１ＩＵ／ｍＬに等しいモデル等式を設定し、時間について解くことにより計算した。
結果
Ｄ’Ｄ３データの評価
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰは皮下投与後吸収された。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを、７２時間の観察期間全体にわたって定量することができ；すなわち、検出限界２７ｎｇ／ｍＬより高いままであった（図９Ａ）。
Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０－ｉｎｆ、クリアランス、ＭＲＴ及びｔ１／２を表５に示し、そしてこれらは皮下投与後の時間にわたるｒＤ’Ｄ３－ＦＰの関連する曝露を裏付ける。
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ＦＶＩＩＩデータの評価
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの皮下前投与後のｒＶＩＩＩ－単鎖のＦＶＩＩＩ ＰＫプロフィールは、ＦＶＩＩＩ発色活性（図９Ｂ）さらにはＦＶＩＩＩ抗原（図９Ｃ）について単独で投与されたｒＶＩＩＩ－単鎖と比較して延長された。
ＦＶＩＩＩ発色活性（図９Ｂ）は、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰが前投与された場合に投与７２時間後の最後の時点まで検出限界より十分高かったが、これはＦＶＩＩＩが単独で投与された場合は７２時間目にベースラインに達した。視覚的に、曝露は投与の３２時間後に始まってｒＤ’Ｄ３－ＦＰの皮下前投与で改善された。
同様の観察がＦＶＩＩＩ：Ａｇについて行われたが（図９Ｃ）、曝露はすでに投与２４時間後に始まってｒＤ’Ｄ３－ＦＰの前投与で改善され、そして単独で投与されたＦＶＩＩＩで投与４８時間後にすでにベースラインに達し、おそらく測定された濃度のより低い変動性に関連する。
ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの前投薬（Ｐｒｅｄｏｓｉｎｇ）は、ＦＶＩＩＩ発色活性及びＦＶＩＩＩ．Ａｇの両方についてクリアランス、ＭＲＴ及びｔ１／２を改善した。
ＡＵＣ０－ｉｎｆは、ＦＶＩＩＩ発色活性を４１％（表６）、そしてＦＶＩＩＩ：Ａｇについて４９％（表８）改善した。Ｃｍａｘは、ＦＶＩＩＩ発色活性について３０％、そしてＦＶＩＩＩ：Ａｇについて２３％改善した（それぞれ表６及び８）。
トラフまでの時間を、発色活性について（表７）及びＦＶＩＩＩ：Ａｇについて（表９）ｒＤ’Ｄ３－ＦＰを用いるか又は用いない両方の投与スキームについて計算した。ＡＵＣ０－ｉｎｆについては、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの前投薬もまた発色活性さらにはＦＶＩＩＩ抗原について有利なトラフを示した。それぞれ発色ＦＶＩＩＩ活性及びＦＶＩＩＩ：Ａｇについて、延長は、１％トラフについて６％及び１８％であり、そして５％トラフについて９％及び１９％であり、そして１０％トラフについて８％及び１８％であった。
Figure 0007252890000006
Figure 0007252890000007
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Figure 0007252890000009
インビボ動物実験からの結論
これらの研究は、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの静脈内又は皮下投与が、健常なラット、ウサギ、ブタ及びサルにおけるＦＶＩＩＩの内在性レベルを増加し、これらの動物における既存の生理的ＦＶＩＩＩレベルさえも増加するということを実証する。投薬前の値はほとんど超えなかったが、それによりａＰＴＴのわずかな短縮しか観察されないか又は短縮は見られなかった。
血友病Ａ出血型を示す動物（ＶＷＦ ｋｏラット又はＶＷＦ ｋｏマウス、関連して減少したＦＶＩＩＩ活性レベルを有する）において、この内在性ＦＶＩＩＩ活性の増加は健常動物におけるよりも強く、絶対ＦＶＩＩＩレベルは健常マウス及びラットのレベルにほぼ等しいかより高いレベルまで増加した。これらの動物において、生理的レベルは回復したか（生理的変動性の上端内のレベル、例えばＶＷＦ ｋｏラットにおける１及び３ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後の標準発色ＦＶＩＩＩ活性の２００～３００％まで － ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致）、又は生理的範囲を超えた（例えばＶＷＦ ｋｏラットにおける１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの投与後の標準発色ＦＶＩＩＩ活性の≧４００％）。ヒトと比較して発色ＦＶＩＩＩ活性に関してより低いベースライン値を有する例としてＶＷＦ ｋｏマウスにおいて、１０ｍｇ／ｋｇ ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの用量で標準の約４０％に達し、すなわち健常ＮＭＲＩマウスにおいて観察されたレベルの＜２倍高い増加。これは、初期に減少したＦＶＩＩＩレベルを有する個体、すなわち血友病Ａ表現型において、ＦＶＩＩＩ上昇効果は、健常被験体よりも潜在的に強くなり得る。
同様の効果が、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ ＥＹＡ若しくはＥＹ変異体の同時投与により、又はｒＤ’Ｄ３－ＣＴＰにより達成された。
ＶＷＦ ｋｏラットにおけるｒＤ’Ｄ３－ＦＰの複数回用量は、ｒＤ’Ｄ３－ＦＰの経時的なわずかな蓄積をもたらしたが、ＦＶＩＩＩ活性は、生理的レベルに達したか（発色活性）又は生理的レベルをわずかに超えて（凝固活性）、そしてａＰＴＴは正常値に回復した。
理論に束縛されることは望まないが、これは、ＶＷＦ ｋｏラット及びマウスと比較して、生理的ＦＶＩＩＩレベルを有する健常動物におけるＦＶＩＩＩ合成の生理的下方調節により説明され得る。したがって、ヒト血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩに対する効果は、ＶＷＦ ｋｏラット及びマウスにおいて観察されたものと同程度であるはずであり、したがって、長期間持続する生理的レベルを達成するはずであるということが推測され得る。これらの効果は静脈内及び皮下投与後に示された。ｒＤ’Ｄ３－ＦＰのさらなるバイオアベイラビリティは、種及び遺伝子型に依存して１１～１８７％の範囲に及び、最も高い値は、皮下バイオアベイラビリティについて十分に予測可能なモデルであることが知られているブタにおいて達成された。それにより、これらのデータは、皮下処置も実行可能であるということを示唆する。
実施例２：ＶＷＦフラグメントダイマー及びモノマーに対するＦＶＩＩＩ親和性の決定
ＶＷＦフラグメント（１～１２４２）アルブミン融合物（Ｄ’Ｄ３－ＦＰ）をバイオリアクターで発現させた；上記のように精製してモノマー及びダイマーを単離した後、これらの調製物に対するＦＶＩＩＩの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Ｔ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により表面プラズモン共鳴により評価した。
抗アルブミン抗体（ＭＡ１－２０１２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＮＨＳ （Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ （エタノールアミン塩酸塩）（両方共ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからのアミンカップリングキットに含まれる（ＢＲ１０００－５０））によりそのＮ末端を介して活性化ＣＭ ３チップに共有結合でカップリングした。固定のために、抗体３μｇ／ｍＬを酢酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ ５．０）で希釈し、そして抗体溶液をチップ上に１０μＬ／分の流量で７分間流した。固定化手順の後に、未カップリングデキストランフィラメントを、エタノールアミン溶液（１Ｍ、ｐＨ８．３）をチップ上に５分間流すことにより（流量１０μＬ／分）飽和させた。フローセルを飽和させる目的は、チップへの検体の非特異的結合を最小にするためであった。参照フローセルを、空のフローセルを上記と同じ手順を使用することによりエタノールアミンで飽和させることにより設定した。
それぞれダイマー及びモノマーＤ’Ｄ３－ＦＰタンパク質を、チップ上にＤ’Ｄ３－ＦＰタンパク質（５μｇ／ｍＬ）を３分間（流量１０μＬ／分）流すことにより抗アルブミン抗体に共有結合でカップリングして固定した。
ＦＶＩＩＩについての結合曲線を作成するために、各Ｄ’Ｄ３－ＦＰタンパク質調整物をランニングバッファ（ＨＢＳ－Ｐ＋：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％体積／体積Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４；製品コードＢＲ１００６７１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濃度０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ及び４ｎＭに希釈した。単一サイクル動力学（ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃ）を行うために、上昇する濃度の各希釈を有するサンプルを、チップ上に２分間流し（流量３０μＬ／分）、ランニングバッファＨＢＳ－Ｐ＋を用いた１０分間の解離時間がそれに続いた。全ての測定を２回行った。測定手順についての温度を＋２５℃に調節した。
結合パラメーターをＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して計算した。曲線フィッティング方法はラングミュアの式に基づくものであった。計算用の入力データは、検体ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－単鎖）のモル質量１７０ｋＤａであり、ｍａｘ．ＲＵ及び勾配のような他のパラメーターは、フィッティングされた結合及び解離曲線から自動的に抽出された。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの出力は結合速度定数及び解離速度定数であり、これらから親和性定数が計算される。結果を表１０に示す。
Figure 0007252890000010
ダイマーＤ’Ｄ３－ＦＰは、ｒＶＩＩＩ－単鎖のより早い結合及びより遅い解離を示したＤ’Ｄ３－ＦＰモノマー（ＫＤ＝３０ｎＭ）と比較して、ＦＶＩＩＩに対して有意に（ＫＤ＝３４ｐＭ）増加した親和性を示す。

Claims (14)

  1. 血液凝固障害の処置における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び半減期延長部分を含むポリペプチドを含む医薬組成物であって、該処置は、血液凝固障害を有しかつ内在性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、正常ヒト血症（ＮＨＰ）におけるＦＶＩＩＩの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは正常ヒト血症（ＮＨＰ）における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも０．５％であり、
    切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）は、配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    該ポリペプチドは内在性ＦＶＩＩＩに結合することができ、
    切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）は、内在性ＦＶＩＩＩに結合するためのポリペプチドの能力を提供し、
    半減期延長部分は、アルブミンおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン-βサブユニットのＣ末端ペプチドからなる群より選択され、
    該ポリペプチドはダイマーであり、
    該ダイマーのＦＶＩＩＩに対する親和性は、ダイマーポリペプチドのモノマーサブユニットと同じアミノ酸配列を有するモノマーポリペプチドの該ＦＶＩＩＩに対する親和性より高く、
    そして内在性ＦＶＩＩＩレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで
    － （ｉ） 該ポリペプチドは、出血事象の予防のために投与され、ここで
    ａ） 該処置はいずれも外来性ＦＶＩＩＩの同時投与を含まず、もしくは
    ｂ） 該処置は、外来性ＦＶＩＩＩが投与され、そしてそれにより該被験体において内在性ＦＶＩＩＩを提供することを含み；又は
    － （ｉｉ） 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性ＦＶＩＩＩと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性ＦＶＩＩＩを同時投与することなく投与される、
    上記医薬組成物。
  2. 内在性ＦＶＩＩＩレベルは、該ポリペプチドの投与後に、少なくとも１％のレベルまで増加する、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）はヒト切断型フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体の内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、ＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの８０％未満、６０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 処置前の上記被験体における内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルは、好ましくはＮＨＰにおける内在性ＦＶＩＩＩの活性レベルの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％又は少なくとも５％である、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 血液凝固障害は血友病Ａ及びフォン・ヴィルブランド病から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 被験体はヒト被験体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. ポリペプチドは静脈内又は血管外のいずれかに投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. ポリペプチドは、１ｎＭ未満、好ましくは５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満又は８０ｐＭ未満の解離定数ＫDにより特徴づけられるＦＶＩＩＩ結合親和性を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２、（ｂ）配列番号４のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントからなる、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 内在性ＦＶＩＩＩの薬物動態パラメーターはポリペプチドの投与により改善され、特にここで内在性ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）は増加し、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩの半減期は延長され、かつ／又は内在性ＦＶＩＩＩのクリアランスは減少する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの血漿半減期より長く、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のＶＷＦの血漿半減期より長い、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. ポリペプチドの血漿半減期は、内在性ＶＷＦの半減期より少なくとも２５％長く、かつ／又は正常ヒト血漿（ＮＨＰ）の半減期より少なくとも２５％長い、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. ポリペプチドの投与後に、被験体の内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加が達成され、好ましくは内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルは、生理的ＦＶＩＩＩレベル（１００％＝１ＩＵ／ｍＬ）まで増加するか、又はポリペプチドの投与後に生理的ＦＶＩＩＩレベルより高くは実質的に増加せず、好ましくはそれぞれ正常ヒト血漿の血漿中の平均ＦＶＩＩＩ活性レベ
    ルの３００％＝３ＩＵ／ｍＬを超えない、より好ましくは２５０％＝２．５ＩＵ／ｍＬを超えない、２００％＝２ＩＵ／ｍＬを超えない、１５０％＝１．５ＩＵ／ｍＬを超えない、もしくは１２０％＝１．２ＩＵ／ｍＬを超えない内在性ＦＶＩＩＩ活性レベルの増加を生じる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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