JP7268043B2 - ラムノガラクツロナン－ｉが強化されたペクチン性多糖の製造方法 - Google Patents

ラムノガラクツロナン－ｉが強化されたペクチン性多糖の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、ラムノガラクツロナン-Ｉ（ＲＧ-Ｉ）多糖が強化されたペクチン性多糖を製造する方法に関する。特に、本発明は、有機溶媒を使用せずに植物材料から得た、かなりのＲＧ-Ｉ多糖を含むペクチンに富む基質の酵素による加水分解と、その後の限外ろ過及び保持液の回収によって、そのような多糖を製造する方法に関する。
ペクチンは、陸生植物の一次細胞壁に存在する構造ヘテロ多糖である。ペクチン性多糖の組成と微細構造は、用いる植物源及び抽出条件で大きく変化する。ペクチン性多糖の生物活性は、その微細構造に大きく依存する。
ペクチン性多糖は、以下の多糖成分を様々な量で含む不均一な多糖類である：
（ｉ） ホモガラクツロナン（ＨＧ）、
（ｉｉ） キシロガラクツロナン（ＸＧ）、
（ｉｉｉ） アピオガラクツロナン（ＡＧ）、
（ｉｖ） ラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ-Ｉ）、及び
（ｖ） ラムノガラクツロナンＩＩ（ＲＧ-ＩＩ）。
図１は、上述した４つの多糖成分を含むペクチン性多糖の構造の概略図である。多糖成分のＡＧ、ＸＧ及びＲＧ-ＩＩは、通常、ペクチン性多糖のごく一部であることに留意されたい。
多糖成分ＨＧ、ＸＧ及びＲＧ-ＩＩは、それぞれ、α-(1－4)結合D-ガラクツロン酸単糖ユニットの直鎖からなる骨格で構成される。
ＲＧ-Ｉのみが、反復二糖単位 4)-α-D-ガラクツロン酸-(1,2)-α-L-ラムノース-(1 の直鎖からなる骨格で構成される。ＲＧ-Ｉの構造の概略図を図２に示す。
ホモガラクツロナンドメインは、約１００までの連続したD-ＧａｌＡ残基を有することができる。側鎖を有するＲＧ-Ｉドメインは、通常、「分岐領域」又は「毛深い領域」と呼ばれ、一方、（２つのＲＧ-Ｉドメインの間の）ホモガラクツロナンドメインは、通常、オリゴ糖で置換されない。
ＲＧ-１のＧａｌＡ残基は、１位及び４位でＲｈａ残基に結合し、一方、Ｒｈａ残基は、アノマー位及び2-ＯＨ位でＧａｌＡ残基に結合する。一般に、Ｒｈａ残基の約２０～８０％は4-ＯＨ位で分岐し（植物源及び分離方法による）、中性及び酸性の側鎖を有する。これらの側鎖は、さまざまな様式で結合したＡｒａ及びＧａｌ残基から主に構成され、アラビノガラクタンＩ（ＡＧ-Ｉ）及び／又はＡＧ-ＩＩとして知られているポリマーを形成する。ＡＧ-Ｉは、3-ＯＨ位がα-L-アラビノシル基で置換されたβ-(1,4)-結合D-Ｇａｌ骨格で構成され、当該Ｇａｌ骨格は、間にα(1,5)-L-Ａｒａ単位を有してもよい。ＡＧ-ＩＩは、β(1,3)結合したD-Ｇａｌを主鎖とし、短い(1,6)結合の側鎖で置換された、高度に分岐したガラクタンで構成される。側鎖は、さらに、(1,3)-及び／又はα(1,5)-結合L-Ａｒａを有する。オリゴ糖側鎖は、直鎖状又は分枝状であってもよく、そのいくつかは、α-L-フコシド、β-D-グルクロニド、及び4-O-メチル β-D-グルクロニル残基で終結してもよい。
Khodaei及びKarbouneは、アルカリ（ＮａＯＨ及びＫＯＨ）と酵素（Aspergillus niger由来エンドポリガラクツロナーゼ）を用いる、ガラクタンに富むラムノガラクツロナンＩ型（ＲＧ-Ｉ）のペクチン性多糖の抽出について説明した（"Extraction and structural characterisation of rhamnogalacturonan I-type pectic polysaccharides from potato cell wall". Food Chemistry, 1:39 (2013), p. 617-623）。
Khodaei及びKarbouneは、Aspergillus niger由来エンドポリガラクツロナーゼを用いる、ガラクタンに富むラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ-Ｉ）の酵素抽出におけるさまざまなパラメーターの影響をさらに調査した（"Enzymatic extraction of galactan-rich rhamnogalacturonan I from potato cell wall by-product". LWT - Food Science and Technology, 57 (2014), p. 207-216）。
国際公開第２０１５／１９２２４７号には、ジャガイモからラムノガラクツロナンを抽出し、抽出したラムノガラクツロナンを酵素混合物で処理して、抽出されたラムノガラクツロナンから難消化性オリゴ糖を得、難消化性オリゴ糖を分離することによる、ジャガイモから難消化性オリゴ糖を分離する方法が記載されている。
国際公開第２０１６／１３２１３０号には、ジャガイモからＲＧ-１のフラグメントを製造する方法、及び被験者に免疫調節活性を提供するためのその使用が記載されている。当該方法は、ジャガイモの酵素抽出で得たＲＧ-１の提供し、前記ＲＧ-１を選択的に解重合して、平均分子量が５～３０ｋＤａで、単糖組成が、アラビノース７～１３％、ラムノース５～１０％、キシロース０～１％、ガラクツロン酸２０～４０％、及びガラクトース３５～６０％であるＲＧ-１のフラグメントを調製する工程を含む。
中国特許出願公開第１０２７８４１９３号明細書には、Hedysarum polybotrysから多糖類を分離する方法が記載されている。
韓国公開特許第２０１７－０５３１４４号公報には、オオムギの葉からの多糖画分の抽出について記載されている。この多糖類画分は、免疫機能促進活性を示すと記載されている。
本発明者らは、高い生物学的機能を有するラムノガラクツロナン-Ｉ（ＲＧ-Ｉ）多糖が強化された多糖の単離物を、
・有機溶媒を使用せずに植物材料から得た、かなりのＲＧ-Ｉ多糖を含むペクチンに富む基質を酵素で加水分解し、ＲＧ-Ｉ多糖を部分的に加水分解する工程、
・前記ＲＧ-Ｉ多糖部分加水分解物を、分画分子量が５～１００ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行う工程、及び
・前記限外ろ過保持液を回収する工程
を含む方法により得ることができることを発見した。酵素による加水分解は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ラムノガラクツロナン ガラクツロノヒドラーゼ（EC 3.2.1.173）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼの助けを借りて行われる。
本発明の第１の側面は、ラムノガラクツロナン-Ｉが強化されたペクチン性多糖加水分解物の製造方法であって、当該方法は、
・有機溶媒を使用せずに植物材料から得たペクチンに富む基質を準備する工程、
ここで、前記ペクチンに富む基質は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格を有するペクチン性多糖を少なくとも３乾燥重量％含み、前記ラムノース残基は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格に含まれ、前記ラムノース残基は、α(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基に含まれる、
・前記ペクチンに富む基質を酵素処理し、ペクチン性多糖を部分的に加水分解する工程、
ここで、前記酵素処理は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ラムノガラクツロナン ガラクツロノヒドラーゼ（EC 3.2.1.173）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼの使用を含む、
・前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が５～１００ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行う工程、及び
・前記限外ろ過保持液を回収する工程
を含む。
本発明者らは、上述した１以上のペクチナーゼを使用するペクチン性多糖の酵素による部分加水分解と、その後の、加水分解で生成する小分子を含む小分子成分の除去が、非常に高い生物学的機能を示すペクチン性多糖加水分解物をもたらすことを発見した。
本発明者らは、理論に羈束されることを望むものではないが、この高い生物学的機能は、基質に含まれるペクチン性多糖のホモガラクツロナンドメインの少なくとも一部を除去し、そして、セルロースやヘミセルロースなどの不活性成分を除去することにより達成されると信じられている。ホモガラクツロナンドメインの除去は、ＲＧ-Ｉ多糖の物理化学的特性を変え、腸管及びヒト末梢血単核球のいわゆるパターン認識受容体とより効果的に相互作用することが可能な分子の三次元構成をもたらす。ペクチン性多糖からホモガラクツロナンドメインを除去することにより、ＲＧ-Ｉドメイン含量が増加する。腸管細胞や他の免疫学的に活性な細胞で発現するパターン認識受容体とＲＧ-Ｉ多糖ドメインとの相互作用は、それらの機能的応答性を調節することができ、そのことは、メディエーターの産生及び免疫学的に活性な細胞の再循環により、腸管のみならず、口腔、気道、尿路、膣、皮膚などの体の他の部位での感染に対する耐性を改善できると信じられている。
この方法は、高活性のペクチン性多糖加水分解物が有機溶媒を使用せずに得たペクチンに富む基質から得られるという利点をさらに提供する。ペクチン性多糖の単離を助けるための有機溶媒による沈殿を利用する先行技術とは異なり、この方法は、有機溶媒と接触していないペクチンに富む基質を使用し、また、この方法による基質のさらなる処理は、有機溶媒を必要としない。
さらに、本発明は、この方法によって得られるペクチン性多糖加水分解物に関し、また、上述したペクチン性多糖加水分解物を添加することを含む、栄養製剤、食品、サプリメント、飲料又は医薬品から選択される製品を製造する方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明の第１の側面は、ラムノガラクツロナン-Ｉが強化されたペクチン性多糖加水分解物の製造方法であって、当該方法は、
・有機溶媒を使用せずに植物材料から得たペクチンに富む基質を準備する工程、
ここで、前記ペクチンに富む基質は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格を有するペクチン性多糖を少なくとも３乾燥重量％含み、前記ラムノース残基は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格に含まれ、前記ラムノース残基は、α(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基に含まれる、
・前記ペクチンに富む基質を酵素処理し、ペクチン性多糖を部分的に加水分解する工程、
ここで、前記酵素処理は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ラムノガラクツロナン ガラクツロノヒドラーゼ（EC 3.2.1.173）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼの使用を含む、
・前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が５～１００ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行う工程、及び
・前記限外ろ過保持液を回収する工程
を含む方法に関する。
この方法で使用されるペクチンに富む基質は、有機溶媒を使用せずに植物材料から得られ、このことは、この基質が有機溶媒と接触していない植物材料から得られたことを意味する。したがって、このペクチンに富む基質は、有機溶媒による抽出又は沈殿では得られない。
本明細書において、「骨格鎖」及び「骨格」という用語は同義語である。
本明細書において、「糖」という用語は、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖を包含する。
本明細書において、「オリゴ糖」という用語は、３～１０個の単糖を含む糖のポリマーを指す。
本明細書において、「多糖」という用語は、特に明記しない限り、少なくとも１１の単糖を含む糖のポリマーを指す。
本明細書において、「ペクチン性多糖」という用語は、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有し、ラムノース残基がα(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基に含まれるガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格を含む、場合により分岐した多糖を指す。本明細書において、「ペクチン性多糖」という用語は、特に明記しない限り、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するペクチン性多糖加水分解物も包含する。
本明細書において、「分岐した多糖」という用語は、骨格鎖内の少なくとも１つの単糖がグリコシド結合によって結合した単糖の側鎖を１つ以上の有する、グリコシド結合で結合する単糖の直線状骨格鎖を含む多糖を指す。
本明細書において、「ストレッチ」という用語は、多糖骨格中のグリコシド結合した２つの単糖であって、結合した側鎖を含まない単糖の並びを指す。
本明細書において、「ドメイン」という用語は、ストレッチとストレッチに結合する側鎖を指す。
「ラムノガラクツロナンＩストレッチ」又は「ＲＧ-Ｉストレッチ」という用語は、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）及びラムノース（Ｒｈａ）から成るストレッチを指し、ここで、ＧａｌＡ残基は１位及び４位でＲｈａ残基で結合し、Ｒｈａ残基はアノマー位及び2-ＯＨ位でＧａｌＡ残基に結合し、すなわち、α(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基の繰り返しである。ＲＧ-１ドメインは、例えばガラクタン、アラビナン及びアラビノガラクタン側鎖などの側鎖を含むことができる。
「ラムノガラクツロナンＩ多糖」又は「ＲＧ-Ｉ多糖」という用語は、１以上のラムノガラクツロナンＩストレッチを含む骨格を含む、場合により分岐したペクチン性多糖を指す。
「α(1,4)-結合ガラクツロン酸ストレッチ」という用語は、α(1→4)-ガラクツロン残基から成るストレッチを指す。
ＲＧ-Ｉドメインのほかに、本発明の方法により得られるペクチン性多糖加水分解物は、１以上の以下のドメインを含んでいてもよい：
・ホモガラクツロナン（ＨＧ）、
・キシロガラクツロナン（ＸＧ）、
・アピオガラクツロナン（ＡＧ）、
・ラムノガラクツロナンＩＩ（ＲＧ-ＩＩ）。
ドメインＸＧ、ＡＧ、及びＲＧ-ＩＩは、通常、ＲＧ-Ｉ多糖のごく一部である。
本発明のＲＧ-１ポリサッカライド中に場合によって存在するＨＧドメイン、ＸＧドメイン、ＡＧ及びＲＧ-ＩＩドメインは、２以上のα-(1-4)-結合D-ガラクツロン酸の直鎖から成る骨格を含む。
ＨＧドメインは側鎖を含まない。ＨＧドメインの骨格中のガラクツロン酸残基のカルボキシル基は、エステル化されていてもよい。エステル化されたガラクツロン酸は、メチルエステル又はアセチルエステルであってもよい。
ＸＧドメインの骨格は、D-キシロース側鎖を１つ以上含む。
ＡＧドメインの骨格は、１以上のD-アピオース残基を含む側鎖を１以上含む。
ＲＧ-ＩＩドメインの骨格は、D-キシロース又はD-アピオースのみから成るものではない側鎖を１以上含む。ＲＧ-ＩＩドメインの骨格中のガラクツロン酸残基のカルボキシル基は、エステル化されていてもよい。エステル化されたガラクツロン酸は、メチルエステル又はアセチルエステルであってもよい。
「アセチル化度」という用語は、割合として表される、ガラクツロン酸残基あたりのアセチル残基の数を指す。
「メチル化度」という用語は、割合として表される、ガラクツロン酸残基あたりのメチル残基の数を指す。
多糖の濃度及び単糖組成は、当業者に公知の分析技術で決定することができる。メタノリシス後、単糖組成はパルスアンペロメトリー検出器付の高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ-ＰＡＤ）によって適切に決定できる。
分子サイズ分布は、高速サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、屈折率（ＲＩ）検出（濃度）、光散乱検出（分子量検出）、ＵＶ検出（タンパク質の存在を示す）及び差圧検出（固有粘度検出）により決定できる。
上記分析方法は、Analytical Biochemistry Vol. 207, Issue 1, 1992, pg 176（メタノリシス及び中性糖分析）、並びにMol. Nutr. Food Res., Vol 61, Issue 1, 2017, 1600243（ガラクツロン酸分析及び分子サイズ分布）に記載されている。
本明細書において、「搾りかす」又は「ケーキ」という用語は、ジュース又はオイルを搾った後に残る果物、野菜又は種子の残留物を指し、これは場合によって乾燥していてもよい。「オイルケーキ」という用語は、種子、果物又は野菜から油分を取り除いた後に得られるケーキを指す。
本明細書において、すべての割合は、特に明記しない限り重量パーセントを指す。
この方法は、好ましくは、いかなる有機溶媒も使用しない。言い換えると、有機溶媒を使用せずに植物材料から得たペクチンに富む基質は、有機溶媒を使用せずにさらに処理（酵素処理及び限外ろ過）し、目的のペクチン性多糖加水分解物を得る。
本方法で使用されるペクチンに富む基質は、好ましくは少なくとも４乾燥重量％、より好ましくは少なくとも６乾燥重量％、さらにより好ましくは少なくとも８乾燥重量％のペクチン性多糖を含有する。
ペクチンに富む基質中のペクチン性多糖は、好ましくは少なくとも１００ｋＤａ、より好ましくは少なくとも１５０ｋＤａ、最も好ましくは少なくとも２００ｋＤａの重量平均分子量により特徴付けられる。
ペクチンに富む基質中のペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、通常、その総単糖組成に基づき、少なくとも０．１モル％、より好ましくは少なくとも０．５モル％、さらにより好ましくは少なくとも１モル％、最も好ましくは少なくとも２モル％である。
この方法で用いるペクチンに富む基質は、異なる作物から得てもよい。好ましい態様では、ペクチンに富む基質は、果物（トマトを含む）、ニンジン、オリーブ、エンドウ豆、甜菜、チコリー、大豆、ヒマワリ、菜種及びトウモロコシから選択される１以上の作物から得られる。より好ましくは、ペクチンに富む基質は、リンゴ、ナシ、柑橘類、ニンジン、甜菜及びチコリーから選択される１以上の作物から得られる。さらにより好ましくは、ペクチンに富む基質は、リンゴ、ナシ、ニンジン及びチコリーから選択される１以上の作物から得られる。特に好ましい態様では、ペクチンに富む基質は、ニンジン及び／又はリンゴから得られる。
この方法では、ペクチンに富む作物材料はペクチンに富む基質などとして用いることができる。そのような作物材料は、ペクチナーゼが基質中のペクチン性多糖を分解することを可能にするためのパルプ又はジュースを製造するために細かく砕かれるべきである。細かく砕かれた作物材料は、この方法で使用する前に乾燥又は濃縮してもよい。
好ましくは、ペクチンに富む基質は、出発原料として作物材料を使用する製造方法からの副産物として得られ、ここで、この副産物が得られる段階まで、有機溶媒又は化学反応は用いられない。この方法の特に好ましい態様では、ペクチンに富む基質は、搾りかす、搾りかすの水性抽出物、オイルケーキ、オイルケーキの水性抽出物、削りくず、皮（skin）、皮（peel）、種（pit）、種（seed）及びその組合せから選択される。最も好ましくは、ペクチンに富む基質は、搾りかす、搾りかすの水性抽出物及びその組合せから選択される。
この方法で用いるペクチンに富む基質は、細胞壁を破壊しペクチン性多糖の酵素による加水分解を促進する粉砕、加熱、マイクロ波照射、乾燥又は代替技術を含む方法で適当に得ることができる。
ペクチンに富む基質の含水量は、好ましくは１５重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、最も好ましくは８重量％以下である。
ペクチンに富む基質は、好ましくは０．５～４０乾燥重量％、より好ましくは１～３０重量％、さらにより好ましくは２～２０重量％、最も好ましくは３～１５重量％のペクチンに富む基質を含む水性液体の形態で酵素処理される。この水性液体は、ペクチンに富む基質を水と混合することにより適当に得ることができる。
酵素処理される水性液体の、好ましくは少なくとも５０乾燥重量％、より好ましくは少なくとも７５乾燥重量％、最も好ましくは少なくとも８５乾燥重量％が、ペクチンに富む基質である。
本発明に係る方法の酵素処理は、好ましくは３．０～７．５、より好ましくは４～７．５、さらにより好ましくは４．５～７、最も好ましくは５～７のｐＨで行われる。
ペクチン性多糖を部分的に加水分解するために使用される処理は、好ましくは、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）及びエキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼを使用する。
好ましい態様では、ペクチン性多糖は、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）及びエキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼで部分的に加水分解される。
別の好ましい態様では、ペクチン性多糖は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）及びペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）から選択される１以上のペクチナーゼで部分的に加水分解される。これらのリアーゼによるペクチン性多糖の加水分解は、必然的に不飽和非還元末端ガラクツロン酸残基を含む多糖の断片をもたらす。
この方法では、ペクチン性多糖は、好ましくは、上述した１以上のペクチナーゼ及び１以上のペクチンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）の組合せで加水分解される。１以上のペクチンエステラーゼは、１以上のペクチナーゼの前に、又は同時に、使用してもよい。ペクチナーゼとペクチンエステラーゼの組合せは、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ及びその組合せから選択されるペクチナーゼを用いる場合に特に有利である。ペクチナーゼとペクチンエステラーゼの組合せは、通常、メチル化度が低く、アセチル化／メチル化の比率が高い、ペクチン性多糖部分加水分解物をもたらす。
特に好ましい態様では、ペクチンに富む基質は、１以上のペクチナーゼを使用する部分的な加水分解の前に、又は同時に、１以上のペクチンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）で酵素処理される。最も好ましくは、ペクチンエステラーゼによる酵素処理と１以上のペクチナーゼによる酵素処理は同時に行われる。
この方法では、ペクチンに富む基質は、ペクチナーゼによる酵素処理の前に、又は前記処理の一部として、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼ（EC 3.2.1.4、EC 3.2.1.176、EC 3.2.1.203）で適当に処理することができる。セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼによる処理は、基質中の植物の細胞壁を破壊し、細胞壁に含まれるペクチンの放出を誘発し、したがって、これらのペクチンはペクチナーゼの影響を受けやすくなる。
１以上のペクチナーゼによるペクチンに富む基質の酵素処理は、好ましくは１５～７０℃、より好ましくは２５～５５℃で行われる。酵素処理の時間は、好ましくは少なくとも１０分、より好ましくは２０分～３時間である。
この方法は、植物のほとんど無傷の細胞壁を比較的大量に含むペクチンに富む基質を適当に用いてもよい。通常、そのようなペクチンに富む基質は、セルロース、ヘミセルロース及びその組合せから選択されるセルロース成分を少なくとも４０乾燥重量％含む。通常、これらの基質中のペクチン性多糖の大部分は水不溶性、つまり、細胞壁（破片）のセルロース／ヘミセルロースのマトリックス中に閉じ込められているペクチン性多糖である。好ましくは、基質中のペクチン性多糖の少なくとも５０重量％は、ペクチン性多糖の濃度が１ｇ／ｌの場合、４５℃、ｐＨ５．５の蒸留水に溶解しない。
この方法の特に好ましい態様では、酵素処理後であって、限外ろ過を行う前に、ペクチン性多糖部分加水分解物を含む水性液体を固液分離することで、水溶性のペクチン性多糖が非水溶性の固体から分離される。使用してもよい固液分離技術には、沈殿、デカンテーション、遠心分離、ハイドロサイクロン及び／又はろ過が含まれる。この実施の形態は、所望のペクチン性多糖の高い収量を達成できるという利点を提供する。
この方法のある態様では、ペクチンに富む基質は、ペクチン、セルロース、ヘミセルロース及びその組合せから選択される細胞壁多糖を１０～８０乾燥重量％含む。最も好ましくは、前記基質は、２０～７０乾燥重量％の細胞壁多糖を含む。最も好ましくは、前記基質は、３０～６０乾燥重量％の細胞壁多糖を含む。搾りかすは、この方法で使用することができ、比較的大量の細胞壁多糖を含むペクチンに富む基質の例である。
搾りかすは、通常、分子量が２０ｋＤａ未満の炭水化物を２～５０乾燥重量％、好ましくは５～４０乾燥重量％、より好ましくは１０～３０乾燥重量％含む。
搾りかすのタンパク質含有量は、通常、０～２０乾燥重量％、より好ましくは１～１８乾燥重量％、さらにより好ましくは２～１６乾燥重量％である。
ペクチンに富む基質が搾りかす又はオイルケーキである場合、限外ろ過の前に、酵素処理された搾りかす又はオイルケーキから非溶解性物質（粒子サイズ＞５μｍ）が取り除かれる。非溶解性物質は、好ましくは固液分離により、より好ましくはデカンテーション、遠心分離及び／又はろ過により取り除かれる。
この方法の別の態様では、ペクチンに富む基質は、少なくとも１０乾燥重量％、好ましくは少なくとも２０乾燥重量％、より好ましくは少なくとも４０乾燥重量％のペクチン性多糖を含み、２０乾燥重量％未満のセルロース、ヘミセルロース及びその組合せから選択される細胞壁多糖を含むペクチンの単離物である。より好ましくは、前記ペクチン単離物は、１０乾燥重量％未満、さらにより好ましくは５乾燥重量％未満の細胞壁多糖類を含む。搾りかすの水性抽出物及びオイルケーキの水性抽出物は、この方法においてペクチンに富む基質として使用されてもよいペクチンの例である。
好ましくは、水性の搾りかす抽出物は、一連の水性抽出工程、より好ましくは少なくとも２つの水性抽出工程によって得られる。第１の抽出工程は、好ましくは、搾りかすと水の混合と、その後の固液分離を含む。第２の工程は、好ましくは、回収した固体画分と水の混合と、その後の第二の固液分離を含む。適当な固液分離法は、例えば、デカンテーション、遠心分離及びろ過である。
水性抽出のｐＨは、好ましくは２．０～８．５、より好ましくは４．５～７．５、さらにより好ましくは６．０～７．０である。
この方法の特に好ましい態様では、ペクチン性多糖部分加水分解物を、６～５０ｋＤａ、好ましくは７～４０ｋＤａ、好ましくは８～３０ｋＤａの分画分子量を有する限外ろ過膜で限外ろ過を行う。
回収された限外ろ過保持液は、噴霧乾燥、凍結乾燥、風乾、ローラー乾燥、平面乾燥、ベルト乾燥及びドラム乾燥から選択される１以上の乾燥技術で適当に乾燥することができる。
好ましくは、回収された限外ろ過保持液は、含水量が１５重量％未満、より好ましくは１３重量％未満、さらにより好ましくは１１重量％未満、最も好ましくは９重量％未満まで乾燥される。
回収された限外ろ過保持液は、好ましくは６：１以下、より好ましくは５：１以下、さらにより好ましくは４：１以下、最も好ましくは３．５：１以下のモル比でガラクツロン酸残基及びラムノース残基を含む。
回収された限外ろ過保持液中に存在するペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、その総単糖組成に基づき、好ましくは少なくとも４％、より好ましくは５～５０％、さらにより好ましくは６～４５％、さらにより好ましくは６．５～４０％、最も好ましくは７～３０％である。
回収された限外ろ過保持液は、好ましくは少なくとも５乾燥重量％、好ましくは少なくとも１５乾燥重量％、より好ましくは少なくとも２５乾燥重量％、最も好ましくは少なくとも５０乾燥重量％のペクチン性多糖を含み、前記ペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、その総単糖組成に基づき、少なくとも４モル％である。
より好ましい態様では、回収された保持液中のペクチン性多糖の重量平均分子量は、２０ｋＤａ、より好ましくは３０ｋＤａ、さらにより好ましくは４０ｋＤａ、最も好ましくは５０ｋＤａを超える。
本発明の方法は、好ましくは、以下に示すペクチン性多糖加水分解物をもたらす。
本発明の第２の側面は、本発明に係る方法で得られるペクチン性多糖加水分解物に関する。
ペクチン性多糖加水分解物は、通常、少なくとも８５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９５重量％の乾燥物質を有する。
好ましくは、ペクチン性多糖加水分解物は、少なくとも１０乾燥重量％、より好ましくは少なくとも２０乾燥重量％、さらにより好ましくは少なくとも４０乾燥重量％のペクチン性多糖を含み、前記ペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、その総単糖組成に基づき、少なくとも４モル％である。
特に好ましい態様では、ペクチン性多糖加水分解物の重量平均分子量は、２０ｋＤａ、より好ましくは３０ｋＤａ、さらにより好ましくは４０ｋＤａ、最も好ましくは５０ｋＤａを超える。
特定の態様では、ペクチン性多糖加水分解物に含まれる分子量が２．５ｋＤａ未満の糖（多糖、オリゴ糖、二糖、単糖）は、１５重量％未満、１０重量％未満、より好ましくは５重量％未満、最も好ましくは１重量％未満である。
好ましくは、ペクチン性多糖加水分解物は、３０重量％未満、より好ましくは２０重量％未満、さらにより好ましくは１０重量％未満の、２０ｋＤａ未満の分子量の有機物を含む。
通常、ペクチン性多糖加水分解物は、１５乾燥重量％未満、好ましくは１０乾燥重量％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１乾燥重量％未満のセルロース、ヘミセルロース、リグニン及びデンプンから選択される不溶性多糖を含む。
ペクチン性多糖加水分解物のタンパク質含有量は、好ましくは１５乾燥重量％を超えず、より好ましくは０．５～１０乾燥重量％、最も好ましくは１～５乾燥％である。
好ましくは、ペクチン性多糖加水分解物は、少なくとも１０乾燥重量％、好ましくは少なくとも乾燥重量２０％、より好ましくは少なくとも乾燥重量３０％のペクチン性多糖を含み、前記ペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、その総単糖組成に基づき、少なくとも５モル％、より好ましくは少なくとも６％である。
通常、ガラクツロン酸残基、ラムノース残基、アラビノース残基及びガラクトース残基は合わせて、ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の少なくとも５０モル％である。この組合せは、ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の、より好ましくは少なくとも６０モル％、さらにより好ましくは少なくとも６５モル％、さらにより好ましくは少なくとも７０モル％、最も好ましくは少なくとも７５モル％である。
ペクチン性多糖加水分解物の特に好ましい態様では、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基は合わせて、ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の少なくとも１５モル％、より好ましくは１７～７０モル％、最も好ましくは１８～６０モル％である。
ペクチン性多糖加水分解物中に、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基が、好ましくは６：１以下、より好ましくは５：１以下、さらにより好ましくは４：１以下、最も好ましくは３．５：１以下のモル比で存在する。
ラムノース残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の、通常は５～５０％、より好ましくは６～４５％、さらにより好ましくは６．５～４０％、最も好ましくは７～３０％である。
ガラクツロン酸残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の、通常は５～８０％、より好ましくは８～６０％、最も好ましくは１０～５０％である。
加水分解物中のペクチン性多糖の重量平均分子量は、好ましくは、８００ｋＤａ以下である。ペクチン性多糖の重量平均分子量は、より好ましくは、２２ｋＤａ～５００ｋＤａ、最も好ましくは２５ｋＤａ～２５０ｋＤａである。
ある態様では、本発明の加水分解物中のペクチン性多糖の平均アセチル化度は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは２０～１１０％、さらに好ましくは２５～１００％、最も好ましくは３０～８０％である。
別の態様では、加水分解物中のペクチン性多糖の平均メチル化度は、好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、最も好ましくは５～３０％である。
加水分解物中のペクチン性多糖の骨格は、１以上の側鎖を含むことができる。これらの側鎖は、アラビノース残基及び／又はガラクトース残基、並びに少量のフコース、グルコース、グルクロン酸、キシロース及び／又はウロン酸のモノマーを含んでいてもよい。１以上の側鎖は、好ましくは、ガラクタン側鎖、アラビナン側鎖及びアラビノガラクタン側鎖から選択される。
アラビナン側鎖は、１以上のα(1,5)-結合アラビノース残基を含み、かつ、ＲＧ-Ｉドメインのラムノース残基の4-ＯＨ位に結合している。アラビナン側鎖は、直鎖状又は分枝状であってもよい。側鎖が直鎖状である場合、側鎖はα(1,5)結合アラビノース残基から成る。アラビナン側鎖が分岐状側鎖である場合、１以上のα-アラビノース残基は、α(1,5)結合アラビノースの2-ＯＨ及び／又は3-ＯＨに結合する。
ガラクタン側鎖は、１以上のβ(1,4)結合ガラクトース残基を含み、かつ、ＲＧ-Ｉドメインのラムノース残基の4-ＯＨ位に結合している。
アラビノガラクタン側鎖は、ＲＧ-Ｉドメインのラムノース残基の4-ＯＨに結合しており、Ｉ型アラビノガラクタン（ＡＧ-Ｉ）又はＩＩ型アラビノガラクタン（ＡＧ-ＩＩ）であり得る。ＡＧ-Ｉは、ＧａｌｐのO-６位又はO-３位が置換される(1→4)-β-D-Ｇａｌｐ骨格から成る。ＡＧ-Ｉは、α-L－Ａｒａｆ-ｐ残基及び／又は(1→5)-α-L-Ａｒａｆの短い側鎖でさらに置換される。ＡＧ-ＩＩは、アラビノシル化された(1→6)-β-D-Ｇａｌｐ二次鎖で修飾されたα(1→3)-β-D-Ｇａｌｐ骨格から成る。
アラビノース残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の、通常は０～５０％、より好ましくは３～４８％、最も好ましくは５～４６％である。
ガラクトース残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の、通常は０～５０％、より好ましくは３～３５％、最も好ましくは５～２５％である。
ガラクトース残基及びラムノース残基は、加水分解物中のペクチン性多糖中に、好ましくは４：１未満のモル比、より好ましくは３：１未満、最も好ましくは２：１未満で存在する。
本発明の第３の側面は、少なくとも０．１乾燥重量％の本発明に係るペクチン性多糖加水分解物を最終製品に添加することを含む、栄養製剤、食品、サプリメント、飲料又は医薬品から選択される製品の製造方法に関する。
ペクチン性多糖加水分解物は、最終製品に、好ましくは０．２乾燥重量％、より好ましくは０．３～９５乾燥重量％、最も好ましくは１～８０乾燥重量％、添加される。
本発明の製品は、ペクチン性多糖加水分解物の製造で使用した１以上のペクチナーゼを僅かに含んでいてもよい。これらのペクチナーゼは、活性及び／又は不活性な形態で製品中に存在してもよい。
特に好ましい態様では、ペクチン性多糖加水分解物中のペクチン性多糖は、最終生成物中に存在するペクチン性多糖の総量の少なくとも２０重量％、より好ましくは少なくとも３０重量％、さらにより好ましくは６０重量％、最も好ましくは少なくとも８０重量％である。
本発明を、以下の非限定的な実施例でさらに説明する。
実施例１
ジュースの圧搾で得た乾燥ニンジン搾りかす（タンパク質１４～１５％、炭水化物７３％（糖質１６～１８％、食物繊維５５％）、灰分３～４％、脂質６～７％）５００ｋｇを、撹拌しながら４５℃の水４５００Ｌに分散させた。混合物に５ｋｇの酵素調製物（Pectinex（登録商標）Ultra Mash、Novozymes社、主活性はペクチンリアーゼ及びポリガラクツロナーゼ）を加え（合計５０００Ｌの０．１％）、４５℃で２時間インキュベートした。酵素の不活性化（９０℃で３０秒間）により、インキュベーションを終了し、次いで、デカンターで液固分離した。
得られた液体を１μｍフィルターでろ過し、凝集物／固形物を除去した。その後、１０ｋＤａのPolyEtherSulfone膜（Microdyn Nadir；UP010）で限外ろ過し、液体を元の容量の１／３に濃縮した。次いで、保持液を水で元の容量に希釈し、再び元の容量の１／３に濃縮した。
固形分を増加させるために、得られた保持液を蒸発により濃縮し、その後、噴霧乾燥した。
表１に、得られたペクチン性多糖加水分解物の基本組成を示す。
Figure 0007268043000001
得られた加水分解物の単糖組成を、Analytical Biochemistry Vol. 207, Issue 1, 1992, pg 176（中性糖分析）及びMol. Nutr. Food Res., Vol 61, Issue 1, 2017, 1600243（ウロン酸分析及び分子サイズ分布）に記載の分析方法で決定した。結果を表２に示す。
Figure 0007268043000002
実施例２
乾燥リンゴ搾りかす（タンパク質６．５～８％、炭水化物７１％（糖質１１％、食物繊維６０％）、灰分１．０～１．５％、脂肪３．０～４．０％）２ｋｇを、２５Ｌのステンレス製容器中で水１８ｋｇに溶解し、４５℃の水浴に入れた。不溶性成分を分散状態に保つために、混合物を連続的に撹拌した。リンゴ搾りかす分散液が４５℃に達した後、２０ｇのPectinex（登録商標）Ultra Mashを添加した。インキュベーションを２時間続けた。２時間後、容器を氷浴に入れた。次いで、分散液を遠心バケットに装填し、６０００ｇで５分間遠心分離した。上清を１０μｍフィルターでろ過し、２５Ｌのステンレス製容器に集めた。容器を９８℃の水浴に入れた。分散液が９０℃に達した後、酵素を失活させるために混合物をさらに１０分間加熱した。その後、容器を氷浴に入れ、混合物を５０℃に冷却した。
３３％（m/m）ＮａＯＨ溶液を加え、混合物のｐＨを５．０に調節した。次いで、混合物を５倍に濃縮し、５０℃で１０ｋＤａのPolyEtherSulfone膜（Microdyn Nadir；UP010）有するＬＡＢ２０セットアップを使用して、限外ろ過膜上で２００％の水で洗浄した。限外ろ過／透析ろ過の後、実験室規模の凍結乾燥機で加水分解物を凍結乾燥した。
加水分解物の単糖組成を表３に示す。
Figure 0007268043000003
実施例３
実施例１の乾燥ニンジン搾りかすを脱塩水（１００ｇ／ｌ）に分散させ、３種の異なる酵素分解条件：
１．Pectinex（登録商標）Yield Mash、Novozymes社（全分散物の０．２％）
２．Pectinex（登録商標）Ultra Mash、Novozymes社（全分散物の０．２％）
３．Pectinex（登録商標）Ultra Mash、Novozymes社（全分散物の０．０５％）
で実験室規模の加水分解を行った。
９０℃で１０分間加熱することにより酵素分解（４５℃、１２０分）を終了し、次いで、遠心分離し、１０ｋＤａのPolyEtherSulfone膜（Microdyn Nadir；UP010）を用いてその上清を徹底的に透析した。
対照は、水に乾燥ニンジン搾りかすを加え（１００ｇ／ｌ）、９０℃を１２０分間維持し、遠心分離し、酵素分解物の分散液と同じ方法でその上清を透析することにより製造した。
実施例４
実施例３の非加水分解ニンジンＲＧ-Ｉ多糖（対照）及び実施例３の酵素加水分解ニンジンＲＧ-Ｉ多糖（試料１～３）の単糖組成は、実施例１と同様の方法で決定した。
単糖分析の結果を表４に示す。（Rha＝ラムノース；GalA＝ガラクツロン酸；Ara＝アラビノース；Gal＝ガラクトース）
Figure 0007268043000004
実施例５
実施例３の非加水分解ニンジンＲＧ-Ｉ多糖（対照）及び実施例３の酵素加水分解ニンジンＲＧ-Ｉ多糖（試料１～３）の免疫調節活性は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）アッセイにより決定した。
免疫調節アッセイ
免疫機能に対する多糖の効果を評価するため、それらを新たに単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とインキュベートした。手短にいうと、ＰＢＭＣはフィコールプラーク（Amersham）を用い、血液のバフィーコートから単離した。ＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ｍＬ）を、ＲＰＭＩ培地（Gibco（登録商標）RPMI 1640培地）中で、３００μｇのＲＧ-Ｉ多糖と共に２０時間インキュベート（５％ＣＯ２、３７℃）した。続いて、上清を回収し、製造者の指示に従い、ビーズアレイ（CBA human inflammation kit、BD-Bioscience）を使用し、フローサイトメーター（BD FACSCANTO II）でサイトカインを測定した。陰性対照としてＲＰＭＩを、１００％として結果を正規化する参照としてＬＰＳ（大腸菌由来、Sigma L3012、５ｍｇ）を使用した。データは、ＬＰＳによって誘発された応答に対して正規化された％として表され、４種のサイトカインとその合計について、３種のドナーで平均化される。
表５に免疫調節アッセイの結果を示す。
Figure 0007268043000005
実施例６
ペクチナーゼ処理の有無にかかわらず、さまざまな原料からペクチン性多糖加水分解物を製造した。パプリカ、ニンジン搾りかす、リンゴ搾りかす、柑橘類パルプ、甜菜パルプ、ビルベリー搾りかす、赤ぶどう搾りかす、白ぶどう搾りかす、チコリーパルプ、オリーブの種子及び内果皮、及びオリーブ搾りかすを粉砕し、乾燥した粉末を脱塩水（１００ｇ／Ｌ）に分散し、全分散液に対する酵素濃度１ｇ／１００ｍＬで、Rapidase C600（ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼ活性を有する酵素ミックス、Militz, H. Wood Sci.Technol. (1993) 28: 9）を用いて、４５℃で１２０分間、実験室規模の加水分解を行った。１００℃で１０分間加熱することにより酵素分解を終了し、次いで、遠心分離（１８０００ｇ、１０分）し、分画分子量が１２～１４ｋＤａの膜（Visking、London、英国）で徹底的に透析した。
対照は、乾燥粉末に水（１００ｇ／Ｌ）を加え、溶液を９０℃で１２０分間維持し、遠心分離し、酵素溶解した分散液と同じ透析方法で上清を透析することにより作成した。
得られたもの（ペクチナーゼ処理；有／無）の免疫調節活性は、実施例３に記載されているように、３００μｇ／ｍＬでヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイにより決定した。
表６に免疫調節アッセイの結果を示す。
Figure 0007268043000006
単糖分析の結果を表７に示す。（Rha＝ラムノース；GalA＝ガラクツロン酸；Ara＝アラビノース；Gal＝ガラクトース）
Figure 0007268043000007
実施例７
酵素Pectinex（登録商標）Ultra Mash（Novozymes社）を使用し、異なるスケール、すなわち、２０リットル（試料１）、５，０００リットル（試料２）及び１０，０００リットル（試料３）で、実施例３を繰り返した（条件：全分散液の０．１％w/w、４５℃、２時間、酵素失活：９０℃で１０分間）。試料２及び３では、液体と固体を分けるために、遠心分離の代わりにデカンテーションを行った。上清を１０ｋＤａ膜で限外ろ過し、小さな分子を除去した。
多糖加水分解物の単糖組成を、実施例１と同様の方法で分析した。
分析結果を表８に示す。
Figure 0007268043000008
アセチル化度及びメチル化度を、以下のように決定した：多糖試料（２～５ｍｇ）を水酸化ナトリウム（０．１Ｍ、一晩、２０℃）で処理した。放出されたメタノールを、DB-WAX ETRカラム、Cryo Focus-4コールドトラップ及びＦＩＤ検出器を備えたヘッドスペースＧＣで測定した（Huisman et al., Food Hydrocolloids, 18, 4, 2004, 665-668を変更）。
試料を中和し（１Ｍ ＨＣｌ）、放出されたアセチル基を、ガードカラム付きAminex HPX 87Hカラム及びＲＩ検出器を備えたＨＰＬＣで定量した（Voragen et al. Food Hydrocolloids,1, 1, 1986, 65-70を変更）。エステル化度は、ウロン酸の量の割合として放出されるメタノール及び酢酸のモル量として表される。
エステル化度の分析結果を表９に示す。
Figure 0007268043000009
実施例８
実施例７の酵素加水分解ニンジンＲＧ-１多糖（試料１～３）の免疫調節活性は、実施例５に記載のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）アッセイで決定した。結果を表１０に示す。
Figure 0007268043000010
実施例９
実施例７の試料２の多糖加水分解物をさらに加水分解し、続いて、高分子量画分を単離した。多糖加水分解物を脱塩水（１００ｇ／ｌ）に溶解し、さらに酵素で加水分解した（Pectinex（登録商標） Ultra Mash、Novozymes社、４５℃、１４時間）。９０℃で１０分間加熱することにより酵素分解を終了した。
酵素分解された多糖溶液の一部を、セミ分取サイズ排除クロマトグラフィーにかけ、７０ｋＤａを超える分子量の多糖を含む画分を得た。
非分画多糖加水分解物及び単離した高分子画分の単糖組成を、実施例１と同様の方法で分析した。
分析結果を表１１に示す。
Figure 0007268043000011
酵素分解された多糖及びその高分子画分の免疫調節活性を、実施例５に記載の方法で決定した。結果を表１２に示す。
Figure 0007268043000012
実施例１０
乾燥し粉砕されたエンドウ豆の莢の粉末（Cosucra社、Warcoing、ベルギー）を脱塩水（１００ｇ／Ｌ）に分散させ、熱安定性αアミラーゼ（Megazyme）を使用して、９０℃で３０分間、事前の加水分解を行い、ペクチナーゼを用いてさらに加水分解を行った（２時間、４５℃、０．２v/v％のPectinex（登録商標）Ultra Mash、Novozymes）。１００℃で１０分間加熱することにより酵素分解を終了し、次いで、遠心分離（１８０００ｇ、１０分）し、分画分子量が１２～１４ｋＤａの膜（Visking、London、英国）で徹底的に透析した。次いで、材料を凍結乾燥した。
粉砕された甜菜パルプ（Suiker Unie社、Dinteloord、オランダ）を、α-アミラーゼによる前処理工程を省略したことを除き、エンドウ豆の粉末と同じ方法で処理した。
加水分解物の単糖組成を実施例１と同じ方法で決定した。結果を表１３に示す。
Figure 0007268043000013
実施例１１
ニンジン搾りかすを水に分散（１００ｇ／Ｌ）させることにより、ペクチン性多糖加水分解物を製造した。
試料１は、酵素を添加せずに９０℃で１２０分間抽出した（抽出収率：４．８％）。
試料２は、１ｇ／１００ｍＬ（総分散液）の酵素濃度でRapidase C600（ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼ活性を有する酵素混合物、Militz, H. Wood Sci. Technol. (1993) 28: 9）を添加し、４５℃で１２０分間抽出した（抽出収率：５．６％）。
次いで、両方の試料を遠心分離（１８０００ｇ、１０分）し、上清を分画分子量が１２～１４ｋＤａの膜（Visking、London、英国）で徹底的に透析した。限外ろ過／透析ろ過の後、実験室規模の凍結乾燥機で酵素分解物を凍結乾燥した。
屈折率検出器を備えたＨＰＳＥＣで測定した試料１及び試料２の分子サイズ分布を図３に示す。
２つの試料の単糖組成を、実施例１に記載の方法で分析した。分析結果を表１４に示す。
Figure 0007268043000014
 以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ ラムノガラクツロナン-Ｉが強化されたペクチン性多糖加水分解物の製造方法であって、当該方法は、
・有機溶媒を使用せずに植物材料から得たペクチンに富む基質を準備する工程、
ここで、前記ペクチンに富む基質は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格を有するペクチン性多糖を少なくとも３乾燥重量％含み、前記ラムノース残基は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格に含まれ、前記ラムノース残基は、α(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基に含まれる、
・前記ペクチンに富む基質を酵素処理し、ペクチン性多糖を部分的に加水分解する工程、
ここで、前記酵素処理は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、ラムノガラクツロナン ガラクツロノヒドラーゼ（EC 3.2.1.173）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼの使用を含む、
・前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が５～１００ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行う工程、及び
・前記限外ろ過保持液を回収する工程
を含む、方法。
［２］ 前記ペクチンに富む基質は、搾りかす、搾りかすの水性抽出物、オイルケーキ、オイルケーキの水性抽出物及びその組合せから選択される、［１］に記載の方法。
［３］ 前記ペクチンに富む基質は、果物、ニンジン、オリーブ、エンドウ豆、甜菜、チコリー、大豆、ヒマワリ、菜種、トウモロコシから選択される１以上の作物から得られる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記ペクチンは、柑橘類、リンゴ、ナシ、甜菜、チコリー、ニンジンから得られる、［３］に記載の方法。
［５］ 前記ペクチンに富む基質は、セルロース、ヘミセルロース及びその組合せから選択されるセルロース成分を少なくとも１０～８０乾燥重量％含む、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］ 前記基質中の前記ペクチン性多糖の少なくとも５０重量％は、前記ペクチン性多糖の濃度が１ｇ／ｌの場合、４５℃、ｐＨ５．５の蒸留水に溶解しない、［５］に記載の方法。
［７］ 前記ペクチン性多糖部分加水分解物を含む水性液体を、酵素処理後、限外ろ過前に、固液分離する、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］ 前記ペクチンに富む基質は、ペクチン性多糖を少なくとも１０乾燥重量％含むペクチンである、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［９］ 前記回収された限外ろ過保持液中にガラクツロン酸残基及びラムノース残基が６：１以下のモル比で存在する、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］ 前記ペクチンに富む基質は、０．５～４０乾燥重量％の前記ペクチンに富む基質を含む水性液体の形態で酵素処理される、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］ 前記酵素処理が３．０～７．５のｐＨで行われる、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］ 前記１以上のペクチナーゼは、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）及びエキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される、［１］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］ 前記ペクチンに富む基質は酵素処理され、ここで、前記処理は、１以上のペクチナーゼを使用する部分的な加水分解の前の、又は同時の、１以上のペクチンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）の使用を含む、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］ 前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が６～５０ｋＤａの限外ろ過膜により限外ろ過する、［１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］ 前記回収された限外ろ過保持液は、含水量が１５重量％未満まで乾燥される、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］ 前記回収された限外ろ過保持液は少なくとも２０乾燥重量％のペクチン性多糖を含み、前記ペクチン性多糖は、その総単糖組成に基づき、平均で少なくとも４モル％のラムノース残基を含む、［１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７］ ［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法により得られるペクチン性多糖加水分解物。
［１８］ 前記ペクチン性多糖加水分解物中にガラクツロン酸残基及びラムノース残基が６：１以下のモル比で存在する、［１７］に記載のペクチン性多糖加水分解物。
［１９］ 前記ペクチン性多糖加水分解物に含まれる２０ｋＤａ未満の分子量の糖類が５重量％未満である、［１７］又は［１８］に記載のペクチン性多糖加水分解物。
［２０］ 前記ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の少なくとも５０モル％が、ガラクツロン酸残基、ラムノース残基、アラビノース残基及びガラクトース残基である、［１７］～［１９］のいずれか１つに記載のペクチン性多糖加水分解物。
［２１］ 栄養製剤、食品、サプリメント、飲料又は医薬品から選択される製品の製造方法であって、少なくとも０．１乾燥重量％の［１７］～［２０］のいずれか１つに記載のペクチン性多糖加水分解物を、最終製品に添加することを含む方法。

Claims (16)

  1. ラムノガラクツロナン-Ｉが強化されたペクチン性多糖加水分解物の製造方法であって、当該方法は、
    ・搾りかす、搾りかすの水性抽出物、オイルケーキ、オイルケーキの水性抽出物及びその組合せから選択されるペクチンに富む基質を準備する工程、
    ここで、前記ペクチンに富む基質は、有機溶媒を使用せずに、リンゴ、ナシ、柑橘類、ニンジン、甜菜及びチコリーから選択される１以上の作物から得られ、前記ペクチンに富む基質は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格を有するペクチン性多糖を少なくとも３乾燥重量％含み、前記ラムノース残基は、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基から成る骨格に含まれ、前記ラムノース残基は、α(1→4)-ガラクツロン酸-α(1→2)-ラムノース残基に含まれる、
    ・前記ペクチンに富む基質を酵素処理し、ペクチン性多糖を部分的に加水分解する工程、
    ここで、前記酵素処理は、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）、エキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される１以上のペクチナーゼの使用を含む、
    ・前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が５～１００ｋＤａの限外ろ過膜を使用して、限外ろ過を行う工程、及び
    ・前記限外ろ過保持液を回収する工程
    を含む、方法。
  2. 前記ペクチンに富む基質は、搾りかす、搾りかすの水性抽出物及びその組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ペクチンは、リンゴ、ナシ、チコリー、ニンジンから得られる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ペクチンは、ニンジン及び／又はリンゴから得られる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ペクチンに富む基質は、セルロース、ヘミセルロース及びその組合せから選択されるセルロース成分を少なくとも１０～８０乾燥重量％含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記基質中の前記ペクチン性多糖の少なくとも５０重量％は、前記ペクチン性多糖の濃度が１ｇ／ｌの場合、４５℃、ｐＨ５．５の蒸留水に溶解しない、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ペクチン性多糖部分加水分解物を含む水性液体を、酵素処理後、限外ろ過前に、固液分離する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記ペクチンに富む基質は、ペクチン性多糖を少なくとも１０乾燥重量％含むペクチンである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ペクチンに富む基質は、０．５～４０乾燥重量％の前記ペクチンに富む基質を含む水性液体の形態で酵素処理される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記酵素処理が３．０～７．５のｐＨで行われる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記１以上のペクチナーゼは、ペクチンリアーゼ（EC 4.2.2.10）、ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）、エンドポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.15）及びエキソポリガラクツロナーゼ（EC 3.2.1.67及びEC 3.2.1.82）から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ペクチンに富む基質は酵素処理され、ここで、前記処理は、１以上のペクチナーゼを使用する部分的な加水分解の前の、又は同時の、１以上のペクチンエステラーゼ（EC 3.1.1.11）の使用を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ペクチン性多糖部分加水分解物を、分画分子量が６～５０ｋＤａの限外ろ過膜により限外ろ過する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記回収された限外ろ過保持液は、含水量が１５重量％未満まで乾燥される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ペクチン性多糖加水分解物が、
    ・ペクチン性多糖を少なくとも１０乾燥重量％含み、前記ペクチン性多糖の平均ラムノース含有量は、その総単糖組成に基づき、少なくとも４モル％であり；
    ・１５乾燥重量％未満のセルロース、ヘミセルロース、リグニン及びデンプンから選択される不溶性多糖を含み；
    ・タンパク質含有量は１５乾燥重量％を超えず；
    ・重量平均分子量は２０～８００ｋＤａであり；
    ・分子量が２．５ｋＤａ未満の糖は、１５重量％未満であり；
    ・平均アセチル化度は少なくとも１０％であり；
    ・平均メチル化度は６０％以下であり；
    前記ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の少なくとも５０モル％が、ガラクツロン酸残基、ラムノース残基、アラビノース残基及びガラクトース残基であり；
    前記ペクチン性多糖加水分解物中に含まれる糖に存在する単糖残基の少なくとも１５モル％が、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基であり；
    ガラクトース残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の０～５０％であり；
    ペクチン性多糖加水分解物中に、ガラクツロン酸残基及びラムノース残基が、６：１以下のモル比で存在し；
    ラムノース残基は、ペクチン性多糖加水分解物中に存在するペクチン性多糖に含まれるすべての単糖残基の５～５０％であり；かつ、
    前記ペクチンに富む基質が、リンゴ、ナシ、ニンジン、甜菜及びチコリーから選択される１以上の作物から得られた、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法により得られるペクチン性多糖加水分解物。
  16. 栄養製剤、食品、サプリメント、飲料又は医薬品から選択される製品の製造方法であって、少なくとも０．１乾燥重量％の請求項１５に記載のペクチン性多糖加水分解物を、最終製品に添加することを含む方法。
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