JP7287961B2 - 同時複数平面撮像のためのシステム、装置および方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、「ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＤＵＡＬ－ＰＬＡＮＥ ＲＥＭＯＴＥ ＦＯＣＵＳＩＮＧ ＩＭＡＧＩＮＧ」と題する、２０１７年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５９７，８６４号、および「ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＦＯＲ ＤＵＡＬ－ＰＬＡＮＥ ＲＥＭＯＴＥ ＦＯＣＵＳＩＮＧ ＩＭＡＧＩＮＧ」と題する、２０１８年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７５４，７２２号に対する優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に援用される。

本開示は、一般的に同時複数平面撮像のためのシステム、装置、および方法に関連する。より具体的には、本開示は、複数の遠隔フォーカスユニットを用いて迅速な画像取得を可能にするシステム、装置、および方法に関する。

二光子レーザ走査顕微鏡（ＴＰＬＳＭ）は、散乱媒体内の構造体の高解像度、高コントラスト画像を提供する。例えば、米国特許公開第２０１７／０１２３１９６号を参照する。例えば、二光子顕微鏡では、米国特許第９，６３８，９０９号に記載されるように、撮像体積のＺ位置を迅速に調整するために遠隔フォーカスユニットが使用される。しかしながら、二光子顕微鏡での撮像速度はラスタ走査速度によって制限され、それによって十分な時間分解能で逐次的に撮像することができる関心領域の数を制限する。

いくつかの実施形態では、システムは、光信号を生成する光源を含み、光信号は、第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む。システムはまた、光学マルチプレクサ回路を含んで、光学信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成する。第二の繰り返し速度は、第一の繰り返し速度のｎ倍数である。第二の繰り返し速度のパルスのセットには、ｎセットのパルスが含まれ、ｎセットのパルスの各セットのパルスは、ｎセットのパルスの互いとは異なる偏光状態を有し、第一の繰り返し速度である。システムはまた多重化光信号を受信し、多重化光信号をｎ個の励起信号の１セットに分割して、試料を励起するフォーカスユニットを含み、ｎ個の励起信号のセットの各励起信号は、ｎセットのパルスのうちの１セットのパルスに対応する。システムはまた、対物レンズを含んで、ｎ励起信号のセットを受信し、試料を照射する。対物レンズとフォーカスユニットは、ｎ個の励起信号のセットの互いの励起信号とは異なる試料の焦点面上のｎ個の励起信号のセットの各励起信号に集合的に焦点を合わせて、ｎ個の励起信号のセットに応じて応答信号を生成する。システムはまた、異なる焦点面からの放射を分離する電子デマルチプレクサ回路を含み、応答信号に基づいてｎ個の放射信号の１セットを生成し、ｎ個の放射信号のセットの各放射信号は、ｎ個の励起信号のセットのうちの一励起信号に対応する。

いくつかの実施形態では、一方法は、第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む光信号を生成することを含み、第一の繰り返し速度は、第二の繰り返し速度のｎの倍数である。第二の繰り返し速度のパルスのセットには、ｎセットのパルスが含まれ、ｎセットのパルスの各セットのパルスは、ｎセットのパルスの互いとは異なる偏光状態を有し、第一の繰り返し速度で動作する。その方法はまた、試料を励起するため光信号をｎ個の励起信号の１セットに分割することを含み、ｎ個の励起信号のセットの各励起信号は、ｎセットのパルスのうちの１セットのパルスに対応する。方法はまた、ｎ個の励起信号のセットの互いの励起信号とは異なる試料の焦点面にｎ個の励起信号のセットの各励起信号に焦点を合わせることを含んで、ｎ個の励起信号のセットに応じて応答信号を生成する。方法はまた、応答信号における異なる焦点面からの放射をｎ個の放射信号の１セットに分離することを含み、ｎ個の放射信号のセットの各放射信号は、ｎ個の励起信号のセットの一励起信号に対応する。

いくつかの実施形態では、システムは、光信号を生成するためのレーザ源を含み、その光信号は第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む。システムはまた、電気光学変調器および偏光ビームスプリッタを含んで、光信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成し、そこで第二の繰り返し速度は第一の繰り返し速度の二倍である。第二の繰り返し速度のパルスのセットは、第一の繰り返し速度でパルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットそれぞれを含み、パルスの第一のセットは、パルスの第二のセットとは異なる偏光状態を有する。システムはまた、多重化光信号を受信し、多重化光信号を第一の励起信号および第二の励起信号に分割して試料を励起するフォーカスユニットを含む。第一の励起信号はパルスの第一のセットに対応し、第二の励起信号はパルスの第二のセットに対応する。フォーカスユニットは、フォーカスオプティックの第一のセットと、フォーカスオプティックの第一のセットとは異なる長手方向軸を有するフォーカスオプティックの第二のセットを含む。フォーカスオプティックの第一のセットおよびフォーカスオプティックの第二のセットはそれぞれ、１／４波長板、第二の対物レンズ、およびその対応する励起信号の焦点面の位置を独立して調節するためのフォーカスミラーを含む。システムはまた、第一の励起信号および第二の励起信号を受信し、試料に光学的に結合して試料を照射し、試料から放射を生成する対物レンズを含む。第一の励起信号は、試料の第一の焦点面に焦点を合わせており、第二の励起信号は、第一の焦点面とは異なる試料の第二の焦点面に焦点を合わせている。システムはまた、試料からの放射に基づいて応答信号を生成するように構成された検出器を含む。システムはまた、応答信号を第一の励起信号に対応する第一の放射信号と第二の励起信号に対応する第二の放射信号に分離するスイッチを含む。

当然のことながら、前述の概念および以下でより詳細に考察する追加的概念のすべての組み合わせは（このような概念は相互に矛盾していないという前提で）、本明細書に開示する本発明の主題の一部であると考えられる。特に、本開示の最後に現れる、特許請求の範囲に記載する主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示する発明主題の一部であると考えられる。また当然のことながら、参照により組み込まれるあらゆる開示において明示的に用いられる用語には、本明細書に開示する特定の概念と最も一致する意味を与える必要がある。

特許または出願ファイルには、色付きで作成された少なくとも一つの図面が包含されている。色付き図面を伴う本特許または特許出願公開の複製は、要請および必要な料金の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。

当業者であれば、図面が主として例示的な目的であること、そして本明細書に記載する本発明の主題の範囲を制限することを意図していないことを理解するだろう。図面は必ずしも一定の比率ではなく、一部の例では、本明細書に開示する本発明の主題の様々な態様は、異なる特徴の理解を容易にするために、図面内で誇張または拡大されて示されうる。図面では、同様の参照文字は概して、同様の特徴（例えば、機能的に類似した、および／または構造的に類似した要素）を意味する。

図１は、一部の実施形態による、複数平面撮像用のシステムを図示する。 図２は、一部の実施形態による、複数平面撮像のための方法を図示する。 図３は、例示的な実施形態による、走査光学の前の二重平面遠隔フォーカスユニットの配置を図示する。 図４は、例示的な実施形態による、走査光学の後の二重平面遠隔フォーカスユニットの配置を図示する。 図５は、例示的な実施形態による、走査光学の二つの独立したセット後の二重平面遠隔フォーカスユニットの配置を図示する。 図６は、一部の実施形態による二重平面遠隔フォーカスユニットを図示する。ＰＢＳ－偏光ビームスプリッタ、ＱＷＰ－１／４波長板、Ｏｂｊ－対物レンズ、Ｍ－遠隔フォーカスミラー、ｓ－ｓ－偏光、ｐ－ｐ－偏光。 図７Ａ～７Ｃは、例示的な実施形態による、時間的にインターリーブされたパルス励起の急速な時間的多重化および多重分離のためのシステムの構成要素を図示する。図７Ａは、時間的にインターリーブされたフェムト秒レーザパルスを作り出すセットアップを図示する。図７Ｂは、二重平面遠隔集束アセンブリを図示する。図７Ｃは、時間的にインターリーブされた光ルミネセンス信号を多重分離するセットアップを図示する。 図８Ａ～８Ｃは、例示的な実施形態による、スキャンラインまたは画素トリガにより特徴付けられるｓ－偏光ビームとｐ－偏光ビームとの間の切り替えに基づいて、比較的遅い時間的多重化および多重分離のためのシステムの構成要素を示す。図８Ａは、ｓ偏光ビームとｐ偏光ビームの間の切り替えのためのセットアップを図示する。図８Ｂは、二重平面遠隔集束アセンブリを図示する。図８Ｃは、取得された光ルミネセンス信号を多重分離するスキームを示す。 図９Ａ～９Ｃは、例示的な実施形態による、両方の焦点面からの情報を含む画像から関心のある特徴部を抽出するために後処理アルゴリズムが使用される時間的符号化の無いシステムの構成要素を示す。図９Ａは、ｓ偏光ビーム間とｐ偏光ビームとの間を切り替えるセットアップを図示する。図９Ｂは、二重平面遠隔集束アセンブリを図示する。図９Ｃは、重ねられた画像から数値方法で関数型データを復号するセットアップを図示する。 図１０は、一時的に多重化された励起および放射を有する例示的な二重平面多光子撮像システムの例を示す。ＥＯＭ－電気光学変調器、ＰＰＣ－パルス プリズム圧縮機、Ｏｂｊ－対物レンズ、ＲＦＵ－遠隔フォーカスユニット、Ｍ－ミラー、ＱＷＰ－１／４波長板、ＰＲ－瞳孔リレー；ＲＦＳ－共振ガルバノメータスキャナ、ＧＳ－ガルバノメータスキャナ、ＤＭ－ダイクロイックミラー、ＰＭＴ－光電子増倍管、ＢＰ－バンドパスフィルタ、ＬＰ－低パス フィルタ、ＤＡＱ－データ収集チャネル。 図１１は、時間的にインターリーブされた光ルミネセンス信号をアナログ乗算で復号するための例示的なスキーム／セットアップを示す。 図１２は、ｓ偏光ビームおよびｐ偏光ビームの力を制御するための例示的なセットアップを示す。 図１３は、ｓ偏光ビームおよびｐ偏光ビームの力を制御するための別の例示的なセットアップを図示する。 図１４Ａ～１４Ｂは、遠隔フォーカスユニットを有する（図１４Ｂ）システムおよび有さない（図１４Ａ）システムの一部分を示すＣＡＤ図である。図１４Ｃは、据え付けられたフォーカスユニットアセンブリの画像である。 同上。 図１５Ａ～１５Ｃは、それぞれおよそ５０％（図１５Ａ）、４５％（図１５Ｂ）、および３０％（図１５Ｃ）の異なるデューティサイクルを有するフェムト秒レーザからの同期シグナルから得られた二つの基準信号を示す。 図１６Ａ～１６Ｃは、実施形態による、本明細書に開示されるシステム、装置、および方法で達成可能な異なる走査パラダイムを示す。図１６Ａは、二重アーム遠隔集束を有する二光子顕微鏡での体積測定撮像を図示する。図１６Ｂは、大容量の同時二重平面撮像を図示したものであり、各撮像平面は独立したＺ座標を有するが、同じＸＹ座標を有する。図１６Ｃは、大容量の同時二重平面撮像を図示したもので、各撮像平面は独立したＺ座標およびＸＹ座標を有する。 図１７Ａ～１７Ｃは、第一（図１７Ａ）、第二（図１７Ｂ）、および同時に信号の多重分離なく両方の撮像チャネル（図１７Ｃ）において励起を用いて取得されたインビボニューロンの画像の例の画像を図示する。撮像された二重特徴を図示するために、二つのＺ平面をＸＹ方向に故意にオフセットした。 図１８Ａは、１６０ＭＨｚの合計パルス速度でパルス励起から生じる、３ｎｓの寿命および４００ＭＨｚの検出器帯域幅を有する蛍光信号のシミュレーションされた時間的プロファイルを図示する。図１８Ｂは、時間統合窓幅の関数として、二つの撮像チャネル間の演算クロストーク値を示す。 図１８Ｃは、５０％のデューティサイクルでの蛍光信号に対する可変デューティサイクルの関数としての蛍光信号損失を示す。図１９Ａは、図１０のＲＦスイッチ１０５０の入力および出力で記録された信号を有する、例示的な多重分離電子機器操作の例を示す。図１９Ｂは、ＰＭＴおよびプリアンプからの時間分解インパルス応答信号およびインビボＧＣＡｍｐ６ｆ蛍光に対応する信号を示す。図１９Ｃは、高速緑色ＣＦＣで染色された花粉粒（ＰＧ）試料からの時間分解された平均蛍光信号を示す。垂直グリッド線間の間隔は６．２５ｎｓである。 図２０Ａは、第一のチャネルのみの励起を使用して同時に記録された二つの撮像チャネル内のマウス大脳皮質の平均インビボ画像を示す。図２０Ｂおよび２０Ｃは、時間遅延の関数として二つの撮像チャネルにおける正規化平均放射強度の比較を示す。図２０Ｂのプロファイルは、ＧＣＡｍｐ６ｆで標識化されたニューロンの蛍光信号に対応し、図２０Ｃのプロファイルは、染色されたＰＧで標識化されたニューロンの蛍光信号に対応する。 図２１Ａ～２１Ｄは、平均４００倍の、Ｔｈｏｒｌａｂｓの多光子メソスコープ（「ＭＭ」）システムおよび図１０の修正二平面システム（「ＭＭ２ｘ」）で記録されたＧＣＡｍｐ６ｆ標識化組織片の二光子画像を示す。チャネル１およびチャネル２に記録された画像は、それぞれ７０ｍＷおよび８２ｍＷの励起出力レベルで記録された。図２１Ａ－チャネル１、ＭＭシステム、図２１Ｂ－チャネル１、ＭＭ２ｘシステム、図２１Ｃ－チャネル２、ＭＭシステム、図２１Ｄ－チャネル２、ＭＭ２ｘシステム 図２２Ａは、異なる励起出力レベルで両方の撮像システム（ＭＭ、ＭＭ２×）を用いて同じ実験条件で記録された、図２１Ａ～２１Ｄの赤い線で概説した細胞本体内の選択された関心領域（ＲＯＩｓ）の平均蛍光信号を示す。 図２２Ｂは、図２１Ａおよび２１Ｂの画像から計算された平均分散プロットである。 図２３Ａ～２３Ｃは、ＭＭおよびＭＭ２ｘシステムの様々な態様の比較を図示する。図２３Ａは、二つの撮像チャネルで励起を使用してＭＭおよびＭＭ２ｘシステムで記録されたＰＧ試料の画像を示す。画像は、２８ｍＷの励起出力で、平均１００倍で記録されている。図２３Ｂは、異なる励起出力レベルで図２３Ａの矢印で示された花粉粒の平均蛍光信号強度のプロットである。図２３Ｃは、ＭＭおよびＭＭ２ｘシステムのチャネル１の記録されたすべてのＰＧ画像から計算された平均分散プロットである。 図２４Ａおよび２４Ｂは、チャネル１（図２４Ａ）およびチャネル２（図２４Ｂ）における異なる関心領域における、記録された点分布関数（ＰＳＦ）の例を示す。図示のＰＳＦ画像を、０μｍの深さで記録した。 同上。 図２５Ａ～２５Ｄ、２６Ａ～２６Ｃは、レーザ励起が第一のチャネル（チャネル１）または第二のチャネル（チャネル２）のいずれかに存在する場合、関数カルシウム信号記録のクロストークを図示し、画像は両方の撮像チャネルに同時に記録される。図２５Ａは、チャネル１で励起され、チャネル１で検出されるマウス脳組織の平均インビボ画像を図示する。図２５Ｂは、チャネル１で励起され、チャネル２で検出される、１０倍された画素強度を有するマウス脳の平均インビボ画像平均を図示する。図２５Ｃは、チャネル２で励起され、チャネル１で検出される、１０倍された画素強度を有するマウス脳の平均インビボ画像を図示する。図２５Ｄは、チャネル２で励起され、チャネル２で検出されたマウス脳の平均インビボ画像を図示する。 図２６Ａは、図２７Ａおよび２７Ｂの細胞１からのカルシウム信号を示すプロットである。図２６Ｂは、図２７Ｃおよび２７Ｄの細胞２からのカルシウム信号を示すプロットである。図２６Ｃは、図２６Ａおよび２６Ｂのカルシウム信号トレースの比を示すプロットである。 図２７は、それぞれ四つの長手方向（Ｚ）面を有する二つのＸ、Ｙ領域およびそれぞれ二つの長手方向面を有する四つのＸ、Ｙ面を有するデータ取得のための二つの例示的な顕微鏡構成を示す。Ｖ１－視覚皮質、ＬＭ－後内側領域、ＡＭ－前内側領域、およびＡＬ－前外側領域。 図２８Ａ～２８Ｄは、クロストーク不混合のための例示的なワークフローを示す。具体的には、図２８Ａは、（第一の）ビーム１がブロックされ、画像が両方のチャネル上で取得されるグラウンドトゥルースクロストークを記録するための実験手法を示し、これにより、一つの区画に対するクリーンな信号を記録し、第二のチャネルへの信号漏出のクリーンな読み取りを記録する。この手順は、ビーム２をブロックして繰り返される。図２８Ｂは、信号（水平軸）を表す平面およびクロストーク測定値（垂直軸）を表す平面のすべての細胞からのカルシウムトレースの２Ｄヒストグラムを示す。リニアフィットが作成／図示され、その傾斜はクロストークの測定値とみなされる。図２８Ｃは、両方向で測定された一つの実験のすべての対の面に対するリニアフィットを示し、図２８Ｄは、三つの実験にわたる全ての対の面に対するクロストークを特徴付けるリニアフィットを表す。 図２９Ａおよび２９Ｂは、クロストークの不混合の結果を示す。図２９Ａは、一部の細胞（矢印を参照）が両方の平面でセグメンテーションアルゴリズムを介して検出される、不混合する（「未修正」の列）前の二つの平面を示す。第二の列（「修正済」）は、クロストークの不混合後の画像を表す。ここでは、細胞は一つの平面にのみ現れ、セグメンテーションアルゴリズムによって検出されない。図２９Ｂは、その元の平面（青色）における細胞に対するカルシウムトレースを示し、クロストーク面（オレンジ）で検出された同一の細胞の活性に対して示されているが、この細胞は不混合後のクロストーク面（緑）で検出されない。 図３０Ａおよび３０Ｂは、二つの皮質柱のインビボ撮像を示す。顕微鏡は、Ｖ１と同様にＬＭの、それぞれの四つの長手方向面において撮像するように構成される。図３０ＡはＶ１に対応し、図３０ＢはＬＭに対応する。 図３１Ａ～３１Ｄは、四つの皮質領域のインビボ撮像を図示する。Ｖ１、ＬＭ、ＡＬ、ＡＭの、二つの長手方向面それぞれで撮像するように顕微鏡を構成した。図３１Ａは、Ｖ１に対応し、図３１ＢはＡＬに対応し、図３１ＣはＬＭに対応し、図３１ＤはＡＭに対応する。 図３２Ａ～３２Ｄは、二つの皮質柱にわたる相関関係を図示する。図３２Ａは、Ｖｉｐ動物のＶ１およびＬＭにおける４０個の細胞からのｚスコアのニューロン活性を示す。図３２Ｂは、生理学的反応の類似性によって分類されたニューロン活性を示す。図３５Ｃは、第一の１００００フレーム（図３２Ａのｚスコアデータの記録の１０００秒に対応）の拡大図である。図３２Ｄは、図３２Ｂの分類されたデータの第一の１０００秒の拡大図である。 同上。 同上。 同上。

以下には、同時複数平面焦点および撮像のためのシステム、装置および方法に関連するさまざまな概念の詳細な説明、およびその実装の詳細な説明がある。上記に導入され、以下でより詳細に考察された様々な概念が、多数の方法で実装されうることが理解されるべきである。特定の実装および用途の例は、主に当業者が当業者にとって明らかであるその実装および代案を実施するための例示的な目的のために提供される。

以下に説明する図および例示的実装は、本実装の範囲を単一の実施形態に限定することを意味していない。記述された要素または図示された要素の一部またはすべてを交換することによって、その他の実装が可能である。さらに、開示された例示的実装の特定の要素が既知の構成要素を使用して部分的または完全に実装されてもよい場合、一部の例では、本実装の理解に必要なそのような既知の構成要素の一部のみが記述され、かかる既知の構成要素のその他の部分の詳細な説明は、本実装を不明瞭にしないよう省略される。

図１は、複数平面撮像を実装および／または実行できる環境／システム１００のブロック図である。いくつかの実施形態では、システム１００の態様は、図３～１０に関して本明細書に記載されるシステム、装置、および／またはデバイスと構造的ならびに／あるいは機能的に類似しており、かつ／または図２に記述された方法２００を実施できる。

システム１００は、光源１１０、マルチプレクサ回路１２０、フォーカスユニット１３０、対物レンズ１４０、およびデマルチプレクサ回路１５０を含む。いくつかの実施形態では、システム１００のすべての構成要素を、例えば、ユーザ用の統合された一体型デバイスとしてシステム１００を提示する単一のハウジングなどの共通ケーシングに含めることができる。他の実施形態では、システム１００の少なくともいくつかの構成要素は、別々の位置、ハウジング、および／またはデバイス内にあり得る。例えば、一部の実施形態では、光学的接続、電気的および／または電子的相互接続、および／またはこれに類するものを、必要に応じて接続用に用いることができる。

いくつかの実施形態では（図示せず）、システム１００は少なくともコントローラおよびメモリを含む。いくつかの実施形態では、システム１００はまた、データベースを含むことができるが、一部の実施形態では、データベースおよびメモリは共通のデータストアとすることができる。いくつかの実施形態では、データベースは一つ以上のデータベースを構成する。さらに、その他の実施形態では、少なくとも一つのデータベースは、システム１００の外部であり得る。システム１００および／またはそれに関連付けられた演算装置は、一つ以上の入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース（図示せず）も含むことができ、ソフトウェアおよび／またはハードウェアに実装される。

メモリおよび／またはデータベースは、独立して、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、メモリバッファ、ハードドライブ、データベース、消去可能なプログラム可能な読み出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能読み出し専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ等であり得る。メモリおよび／またはデータベースは、命令を保存して、コントローラにシステム１００に関連付けられたプロセスおよび／または機能を実行させることができる。

コントローラは、システム１００に関連付けられた一組の命令またはコードを実行および／または遂行するように構成された任意の適切な処理デバイスとすることができる。コントローラは、例えば、適切にプログラムされたプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、および／またはこれに類するものとすることができる。

システム１００は、一つ以上のネットワークを介して他のシステム、装置、および／またはデバイスと電子的に通信することができ、それぞれが、例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、仮想ネットワーク、通信ネットワーク、ならびに／あるいは有線ネットワークおよび／または無線ネットワークとして実装されるインターネットなどの任意の種類のネットワークでありうる。当技術分野で知られているように、任意のまたはすべての通信をセキュアに（例えば、暗号化）するか、アンセキュアにすることができる。システム１００は、パーソナルコンピュータ、サーバ、ワークステーション、タブレット、モバイルデバイス、クラウドコンピューティング環境、これらのプラットフォーム上で実行されるアプリケーションまたはモジュール、および／またはこれに類するものを包含することができる。

いくつかの実施形態では、光源１１０は、第一の周波数／繰り返し速度で１セットのパルスを含む光信号を生成する。いくつかの実施形態では、光源１１０は、約３００～２０００ｎｍの波長で動作するパルスレーザ源であり、中間に全ての値および部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、光源１１０は、約３００～１０００ｎｍの波長で作動する。いくつかの実施形態では、第一の繰り返し速度は約１ＭＨｚ～約２００ＭＨｚであり、中間にすべての値と部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、第一の繰り返し速度は最大約８０ＭＨｚである。いくつかの実施形態では、第一の繰り返し速度は約８０ＭＨｚ～約１６０ＭＨｚであり、中間にすべての値と部分範囲を含む。例示的な実施形態では、システム１００は、二光子モードで動作し、光源１１０は、約４０～１６０ＭＨｚの第一の繰り返し速度および約１００～１５０ｆｓのパルス幅を有する約３００～１０００ｎｍの波長で動作するパルスレーザ源である。別の例示的な実施形態では、システム１００は３光子モードで動作し、光源１１０は、約０．３～５ＭＨｚの第一の繰り返し速度および約３０～７０ｆｓのパルス幅を有する約１０００～２０００ｎｍの波長で動作するパルスレーザ源である。

いくつかの実施形態では、マルチプレクサ回路１２０（「光マルチプレクサ回路」とも呼ばれる）は、光源から光信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成する。いくつかの実施形態では、第二の繰り返し速度は、第一の繰り返し速度のｎ倍数（例えば、第一の繰り返し速度の２倍、３倍、５倍、および／またはこれに類するもの）である。第二の繰り返し速度のパルスには、パルスのｎセットが含まれ、パルスの各セットは、パルスの互いのセットとは異なる偏光状態を有し、第一の繰り返し速度である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎは、試料中の標的発蛍光団の蛍光の寿命、第一の繰り返し速度、および／またはこれに類するものなどの要因に基づいて変化する場合がある。一例として、試料の蛍光寿命が約３ｎｓで第一の繰り返し速度が８０ＭＨｚである実験では、ｎ＝２、すなわち、二つのチャネルを使用できる。別の例として、試料の蛍光寿命が約３ｎｓで第一の繰り返し速度が４０ＭＨｚである実験では、ｎ＝４、すなわち、四つのチャネルを用いることができ、一部の実施形態では、パルスの各セットは約５０％のデューティサイクルを有する。例えば、光信号は８０ＭＨｚ（第一の繰り返し速度）でのパルストレインを含むことができ、多重化光信号は、光信号からのパルスの２セットの生成による１６０ＭＨｚの第二の繰り返し速度（すなわち、二倍）を有することができ、それぞれ８０ＭＨｚであるが、他方に対して遅延し、一方はｓ偏光状態を有し、他方はｐ偏光状態を有する。

いくつかの実施形態では、マルチプレクサ回路１２０は、ナイフエッジミラーを含むミラーなど、ビーム操作のための他の反射素子を含みうる。いくつかの実施形態では、および本明細書でより詳細に説明されるように、マルチプレクサ回路１２０は、一つ以上のビーム変調器を含んで、ｎセットのパルスの生成に影響を及ぼしうる。いくつかの実施形態では、ビーム変調器は、電気光学変調器を含む。いくつかの実施形態では、マルチプレクサ回路１２０は、一つ以上のビームスプリッタを含んで、多重化光信号を生成するためｎセットのパルスの組み換えに影響を与えうる。いくつかの実施形態では、ビームスプリッタは、偏光ビームスプリッタを含む。いくつかの実施形態では、マルチプレクサ回路は、例えば、光ファイバーなどの遅延線を含んで、ｎセットのパルスの間で引き起こされた時間遅延を制御する。いくつかの実施形態では、時間遅延／分離は、ｎセットのパルスのそれぞれに関連付けられたデューティサイクルに基づくか、またはそれに基づいて選択できる。追加的または代替的に、一部の実施形態では、時間遅延／分離は、ｎ個の励起信号に応じる試料からの蛍光放射に関連付けられた減衰時間に基づくか、またはそれに基づいて選択できる。

いくつかの実施形態では、フォーカスユニット１３０は、多重化光信号を受信して、試料１０５を励起するためそれをｎ個の励起信号に分割する。ｎ個の励起信号はそれぞれ、ｎセットのパルスのうちの１セットのパルスに対応する。いくつかの実施形態では、ｎ個の励起信号はそれぞれ、本明細書でより詳細に説明するように、対物レンズを介して試料の異なる焦点面に焦点を合わせることができる。別の方法として、フォーカスユニット１３０は、ｎ個の励起信号のそれぞれの焦点深さを同じになるように（例えば、より強い励起信号が必要な深さでの撮像の場合）、または異なるように調節できる。いくつかの実施形態では、フォーカスユニット１３０は、ｎ個の励起信号それぞれに対して１セットのフォーカスオプティックである、ｎセットのフォーカスオプティックを含む。いくつかの実施形態では、フォーカスオプティックの各セットは、その対応する励起信号の焦点面を調節するために移動できる可動ミラーを含みうる。

いくつかの実施形態では、フォーカスオプティックの各セットは、フォーカスオプティックの他のセットの長手方向軸とは異なる長手方向軸を有する。いくつかの実施形態では、フォーカスユニット１３０は、偏光ビームスプリッタなどのビームスプリッタを含んで、ｎ個の励起信号をフォーカスオプティックのそれぞれのセットの長手方向軸に沿って分割することができる。いくつかの実施形態では、フォーカスオプティックの各セットは、本明細書でより詳細に説明するように、１／４波長板を含んで、同じ偏光ビームスプリッタを使用して同じ光学経路に沿った組み換えを可能にするために、その対応する励起信号を位相シフトすることもできる。いくつかの実施形態では、フォーカスオプティックの各セットは対物レンズを含むことができる（それぞれが「第二の対物レンズ」と呼ばれる場合もある）。

フォーカスユニット１３０は、「遠隔フォーカスユニット」と呼ばれることがあり、フォーカスオプティックの各セットも、フォーカスユニット／遠隔フォーカスユニットと呼ばれることがある。

いくつかの実施形態では、システム１００はさらに、マルチプレクサ回路１２０とフォーカスユニット１３０との間に、ＸＹ走査ユニット（例えば、ガルバノメータスキャナ）などの走査ユニットを含み得る。この方法では、ｎ個の励起信号はそれぞれ、それぞれの焦点面でスキャンされうる。

いくつかの実施形態では、システム１００は、光学経路およびフォーカスユニット１３０の前に、ビームスプリッタをさらに含んで、ｎセットのパルスを分離／分割することができる。ｎ ＝ ２を例として使用して、ビームスプリッタは、パルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを分離することができる。このような実施形態では、システム１００は、ビームスプリッタとフォーカスユニット１３０との間の光学経路に第一の走査ユニットをさらに含んで、パルスの第一のセットを受信し、試料１０５内のそれぞれの画像平面内のパルスの第一のセットを走査することができる。システム１００はまた、ビームスプリッタとフォーカスユニット１３０との間の光学経路に第二の走査ユニットを含んで、パルスの第二のセットを受信し、試料内のそれぞれの焦点平面内のパルスの第二のセットを走査することができる。この方法では、試料内の異なる深さ／Ｚ軸値だけでなく、異なるＸＹパラメータを有する焦点平面も同様に可能である。

いくつかの実施形態では、対物レンズ１４０（「第一の対物レンズ」とも呼ばれる場合がある）は、フォーカスユニットからｎ個の励起信号を受信し、試料１５０を照射する。この方法では、対物レンズおよびフォーカスユニットは、試料１０５の異なる焦点面上のｎ個の励起信号のそれぞれに集合的に焦点を合わせる。試料は、ｎ個の励起信号に応じて応答信号（例えば、蛍光、燐光、および／またはこれに類するもの）を生成できる。多重化された光信号／励起信号と同様に、応答信号は、試料１０５からの複数の応答／放射の多重化表現でもよい。

いくつかの実施形態では、システム１００は、フォーカスユニット１３０と対物レンズ１４０との間に、ＸＹ走査ユニット（例えば、ガルバノメータスキャナ）などの走査ユニットをさらに含みうる。この方法では、ｎ個の励起信号はそれぞれ、それぞれの焦点面でスキャンされうる。

いくつかの実施形態では、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはカメラなどの光検出器は、応答信号を受信する。いくつかの実施形態では、システムは、デマルチプレクサ回路１５０（「電子デマルチプレクサ回路」とも呼ばれる場合がある）を含んで、応答信号から一つ以上の放射信号を分離する。いくつかの実施形態では、デマルチプレクサ回路１５０は、応答信号に基づいてｎ個の放射信号を生成し、デマルチプレクサ回路によって生成された各放射信号は、ｎ個の励起信号のうちの一つに対応し、その励起信号に対する試料応答を反映する。いくつかの実施形態では、応答信号および／またはデマルチプレクサ回路１５０によって受信される応答信号の表示は、アナログ信号であり、デマルチプレクサ回路１５０は、ｎ個のアナログ放射信号に応答信号を分離するため、アナログスイッチなどの任意の適切な回路であってもよい。いくつかの実施形態では、デマルチプレクサ回路１５０によって受信された応答信号の表示は、ＰＭＴ検出器に結合されたデジタルアナログコンバータ（ＤＡＣ）などからのデジタル信号である。いくつかの実施形態では、応答信号は画像であり、デマルチプレクサ回路は一つ以上の画像処理技術を実行して、ｎ個の放射信号としてｎ個の発光画像を生成する。いくつかの実施形態では、デマルチプレクサ回路１５０は、例えば、無線周波数回路などの高速スイッチング回路を含んで、ｎ個の放射信号を生成する。いくつかの実施形態では、デマルチプレクサ回路１５０は、光源１１０から受信した一つ以上の基準／タイミング信号に基づくｎ個の放射信号を生成する。

図２は、一部の実施形態による、複数平面撮像のための方法を図示する。一部の実施形態では、方法２００の一部またはすべての態様は、例えば、図１、図３～１０に示されるシステムおよび／またはその構成要素など、本明細書で説明したシステム、装置、および／またはデバイスのうちの一つ以上によって実装されうる。

方法２００は、２１０で、（例えば、図１のマルチプレクサユニット１２０を介して）第一の周波数／繰り返し速度の１セットのパルスを含む光信号を生成することを含む。第一の繰り返し速度（例えば、１６０ＭＨｚ）は、第二の繰り返し速度（例えば、８０ＭＨｚ）のｎ倍数である。第二の繰り返し速度のパルスのセットには、ｎセットのパルスが含まれ、ｎセットのパルスはそれぞれ、異なる偏光状態を有し、第一の繰り返し速度で動作する。しかし、いくつかの実施形態では、ｎセットのパルスの二つ以上の偏光状態は同じでありうる。いくつかの実施形態では、ｎセットのパルスは、２セットのパルスを含み、生成することにはさらに、ｓ偏光パルスの第一のセットとｐ偏光パルスの第二のセットとして２セットのパルスを生成することが含まれる。

方法２００はまた、２２０で、多重化光信号をｎ個の励起信号の１セットに分割して、試料を励起することを含む。ｎ個の励起信号はそれぞれ、ｎセットのパルスのうちの１セットに対応する。

方法２００はまた、２３０で、ｎ個の励起信号のセットの互いの励起信号とは異なる試料の焦点面にｎ個の励起信号のセットの各励起信号の焦点を合わせることを含み、それにより、ｎ個の励起信号のセットに応じて応答信号を生成する。いくつかの実施形態では、方法２００は、（例えば、フォーカスユニット１３０の可動ミラーを介して）各励起信号の焦点面の位置を独立して調整することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法２００は、試料内のそれぞれの焦点面内のｎ個の励起信号のセットの各励起信号を走査することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法２００はさらに、試料内のそれぞれの焦点面内のｎセットのパルスの各セットのパルスをさらに含む。いくつかの実施形態ではｎセットのパルスは、パルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを含み、方法２００は、パルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを分割することをさらに含む。このような実施形態では、方法２００はさらに、試料内のそれぞれの焦点面内のパルスの第一のセットを走査すること、および試料内のそれぞれの焦点面内のパルスの第二のセットを走査することを含む。いくつかの実施形態では、方法２００は、検出器を介して応答信号を受信することをさらに含む。

方法２００はまた、２４０で、ｎ個の放射信号のセットの各放射信号がｎ個の励起信号のセットのうちの一励起信号に対応する、ｎ個の放射信号の１セットに応答信号を分離することを含む。いくつかの実施形態では、２４０で分離することは、応答信号をｎ個の放射信号のセットに分離することおよび／または１セットの基準信号に基づいて、ｎ個の放射信号のセットを生成することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、システムは、光学信号を生成するためのレーザ源を含み、その光信号は第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む。システムはまた、電気光学変調器および偏光ビームスプリッタを含んで、光信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成する。第二の繰り返し速度は、第一の繰り返し速度の二倍であり、第二の繰り返し速度のパルスのセットは、第一の繰り返し速度でそれぞれパルスの第一のセットおよびパルスのセットを含む。パルスの第二のセットは、パルスの第二のセットとは異なる偏光状態を有する。

システムはまた、多重化光信号を受信し、多重化光信号を第一の励起信号および第二の励起信号に分割して試料を励起するフォーカスユニットを含む。第二の励起信号はパルスの第二のセットに対応し、第二の励起信号はパルスの第二のセットに対応する。フォーカスユニットは、フォーカスオプティックの第一のセットと、フォーカスオプティックの第一のセットとは異なる長手方向軸を有するフォーカスオプティックの第二のセットを含む。フォーカスオプティックの第一のセットおよびフォーカスオプティックの第二のセットはそれぞれ、１／４波長版、第二の対物レンズ、およびその対応する励起信号の焦点面の位置を独立して調節するためのミラーを含む。フォーカスオプティックの第一のセットおよびフォーカスオプティックの第二のセットはそれぞれ、第一の励起信号および第二の励起信号を受信し、試料を照射するために光学的に結合され、試料からの放射を生成する対物レンズをさらに含む。第一の励起信号は、試料の第一の焦点面に焦点を合わせており、第二の励起信号は、第一の焦点面とは異なる試料の第二の焦点面に焦点を合わせている。システムはまた、試料からの放射に基づいて応答信号を生成するように構成された検出器を含む。システムはまた、応答信号を第一の励起信号に対応する第一の放射信号と第二の励起信号に対応する第二の放射信号に分離するための無線周波数スイッチを含む。

簡略化のために、２セットのフォーカスオプティックを有するフォーカスユニット（「二重平面遠隔フォーカス」と呼ばれる場合もある）に関して説明するが、三つ以上のセットのフォーカスオプティックを有するシステムは、本明細書に開示された実施形態の範囲内であることが理解される。同様の名称および／または参照される構成要素（例えば、図３の光源１１０およびレーザ源／光源３１０）は、別段の記載がない限り、構造的および／または機能的に類似していてもよいことも理解される。

いくつかの実施形態では、システムは、一つ以上のスキャン組立品／ユニットを含むことができる。スキャン組立品（例えば、ＸＹスキャナ）に対するフォーカスユニットの位置に基づいて、異なる構成が可能である。図３は、レーザ光源３１０およびマルチプレクサ回路３２０を含む例示的なシステム３００を示す。ビームコンディショニング／マルチプレクサ回路３２０は、レーザ特性を修正するためのレーザ出力制御構成要素３２４およびパルス成形ユニット３２６を含みうる。ビームコンディショニングユニット３２０はまた、遅延線を含むことができ、ビームコンディショニングユニット３２０の出力は、本明細書に記載の多重化光信号である。システム３００はまた、顕微鏡本体／ケーシング内に、多重化光信号を受信し、二つの励起信号を生成する二重平面遠隔フォーカスユニット３３０を含む。ＸＹスキャナ３３５は、二つの励起信号を受信し、それぞれの励起信号をＸ、Ｙ方向のそれぞれの焦点面内で走査する。対物レンズ３４０は、二つの励起信号を試料（図示せず）に印加して、検出器３４５は試料からの応答信号を捕捉する。

図４は、図３のものと類似しうるレーザ４１０および多重化ユニット４２０を有する別の例示的なシステム４００を図示する。ここで、ＸＹスキャナ４３５は多重化光信号を受信し、二重平面遠隔フォーカスユニット４３０はＸＹスキャナ４３５の下流にある。

図５は、図３のものと類似しうるレーザ５１０および多重化ユニット５２０を有する別の例示的なシステム５００を図示する。ビームスプリッタ５３３（例えば、偏光ビームスプリッタ）は、パルスの第一および第二のセットを分離し、これはそれぞれのＸＹスキャナ５３５ａ、５３５ｂに送信される。ビームコンバイナ５３７（例えば、別の偏光ビームスプリッタ）は、２セットのパルスを組み合わせ、これは次に二つの励起信号を生成するため二重平面遠隔フォーカスユニットに送信される。

図６は、例示的な二重平面遠隔フォーカスユニット６３０の詳細を図示する。多重化光信号には、偏光ビームスプリッタ６４２によって分割されるパルスのｓ偏光セットおよびｐ偏光セットが含まれ、パルスのｓセットをフォーカスオプティック６６０ａの第一のセットに送信させ、偏光オプティックのｐセットをフォーカスオプティック６６０ｂの第二のセットに反射し、これにより（図示するように）同一オプティックをオプティック６６０ａのセットに含めることができる。オプティック６６０ａのセットに関して説明すると、オプティック６６０ａ、６６０ｂのセットはそれぞれ、１／４波長板６４２、対物レンズ６４４（「遠隔対物レンズ」とも呼ばれる場合がある）、および可動ミラー６４６を含みうる。１／４波長板は、パルスの入ってくるセットの偏光、ならびにパルスの出ていくセットをそれぞれ９０°まで変更することができ、その結果、ビームスプリッタ６４２に戻るパルスのセットは１８０°まで回転する。この方法で、オプティック６６０ａのセットは、パルスの入射のｓセットからパルスのｐセットを生成し、オプティック６６０ｂのセットは、パルスの入射のｐセットからパルスのｓセットを生成する。これにより、図６に図示するように、共通の光経路に沿って、オプティック６６０ａ、６６０ｂのセットの偏光ビームスプリッタ６４２によって受信されたパルスのセットの組み換えが可能になる。いくつかの実施形態では、可動ミラー６４６の位置は、パルスの対応するセットの焦点面のＺ位置、または深さに影響を与えるように独立して調整されうる。いくつかの実施形態では、可動ミラー６４６は、フォーカスミラー（「遠隔フォーカスミラー」とも呼ばれる場合もある）であってもよい。

図７Ａ～７Ｃは、８０ＭＨｚでフェムト秒パルストレインを生成するパルスレーザ光源（図示せず）と仮定して、システム１００のさまざまな構成要素の例示的なセットアップを示す。図７Ａは、時間的にインターリーブされたフェムト秒パルスとして多重化光信号を生成するためのマルチプレクサ回路７２０を図示する。パルストレインは、パルスのｓ偏光セットおよびｐ偏光セットを生成する電気光学変調器７２４に印加される。パルスのｐセットは、偏光ビームスプリッタ７２６を介してパルスのｓセットを組み換える前に６．２５ｎｓの時間遅延を誘発する遅延線（例えば、光ファイバー）を介して送信され、１６０ＭＨｚで多重化光信号を生成する。

図７Ｂは、図６に図示するユニット６３０と類似しうる二重平面遠隔フォーカスユニット７３０への図７Ａの多重化光信号の印加を図示したものである。図７Ｂ～７Ｃに示すように、フォーカスユニット７３０によって生成される二つの励起信号は、試料（図示せず）における深さｚ１に焦点を合わせたｓ偏光励起信号、試料内のｚ１と異なる深さｚ２に焦点を合わせたｐ偏光励起信号を含む。図７Ｃはまた、光電子増倍管７５５を介した試料からの応答信号の収集を図示する。応答信号は、分離可能ではなく、かつ／またはその他の方法でＰＭＴ７５５を介して区別できる、二つの励起信号によって時間的にインターリーブする応答を含む。ここでアナログ多重分離ユニット（例えば、スイッチング回路）として図示されるデマルチプレクサ回路７５０は、インターリーブされた応答を二つの放射信号に分離する。図７Ｃの例示的な実施形態では、データ取得ボード（ＤＡＱ）７５６は、複数のＸＹ値にわたって放射信号を収集して、それぞれ焦点面／位置ｚ１、ｚ２の個々の信号７５８ａ、７５８ｂを生成する。いくつかの実施形態では（図示せず）、信号７５８ａ、７５８ｂは、焦点面／位置ｚ１、ｚ２に対応する画像を生成する基礎とすることができる。簡潔に述べると、画像をラスタスキャン方式で生成することができ、また横方向スキャナのタイミングを使用して、所与の画素に対応する試料においてスキャナがＸ－Ｙ位置を通過した時間にわたって積分された検出器からの強度値を所与の画素に割り当てることができる。

図８Ａ～８Ｃは、システム１００の様々な構成要素の他の例示的なセットアップを図示する。図８Ａは、多重化光信号が入力レーザ信号と同じ繰り返し速度を有するような、多重化光信号生成を図示する。具体的には、図７Ａに示すとおり、単一ｓパルスおよびｐパルスをインターリーブする代わりに、ｓパルスおよびｐパルスの群を交互にインターリーブし、ｐパルスをｓパルスよりも低い出力に調整する。図８Ｂは、図７Ｂと類似した方法での二つの励起信号の生成を図示する。図８Ｃは、その後増幅器ユニット８５６を介して増幅される、ＰＭＴ ８５５を介した応答信号の収集を図示する。ＤＡＱ８５７および画像処理ユニット８５０（例えば、プロセッサで実行される）は、増幅された応答信号を集合的に分析して、図８Ａに示す時間符号化に基づいて、対応する画像８５８ａ、８５８ｂをそれぞれ生成するために、それぞれｚ１、ｚ２位置で画素データを分離する。たとえば、ＤＡＱ８５７は、ピクセルクロックのタイミングに基づいて画素をデインターリーブすることによって、画素データを二つに分解できる。

図９Ａ～９Ｃは、例えば、カルシウム撮像を介したニューロン活性の推定など、機能的分析の目的で、システム１００の様々な構成要素の他の例示的なセットアップを図示したものである。図９Ａは、多重化光信号が入力レーザ信号と同じ繰り返し速度を有するように、かつｓパルスおよびｐパルスが多重化光信号内に重ねられるように、多重化光信号生成を図示する。言い換えれば、偏光ビームスプリッタ９２６による組み換えに伴いパルスのｓセットとｐセットとの間の時間符号化／遅延はない。図９Ｂは、図７Ｂと類似した方法での二つの励起信号の生成を図示する。応答信号は、二つの放射信号の間の時間的な分離を含まないため、図９Ｃは、ＤＡＣ９５７およびデータ処理ユニット９５０を使用して関数型データ９５８ａ、９５８ｂを時間的に分離できることを示す。非限定的な例として、データ処理ユニット９５０は、独立した構成要素分析、ソースデミキシング、および／または同種のものなどであるが、それに限定されない一つ以上の計算手法を用いて、異なる焦点面から関数型データ９５８ａ、９５８ｂへの信号を分離することができる。

図１０は、一部の実施形態による、例示的なシステム１０００を示す。いくつかの実施形態では、図１０は、本明細書に詳述されるように、二重平面遠隔フォーカスユニット１０３０および時間ドメイン多重化／多重分離能力を有する修正多光子メソスコープ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）システムを図示する。システム１０００は、８０ＭＨｚでのＴｉ：サファイアレーザの動作としてここに図示されるレーザ源１０１０を含む。システム１０００はまた、二つのＥＯＭ１０１１、１０１３を直列に備えるデマルチプレクサユニット１０２０を含む。直列に配置された二つのＥＯＭは、焦点面／撮像面の両方で完全な出力入力制御を達成でき、利用可能なレーザ出力のより効率的な使用を可能にすることができる。第一のＥＯＭ１０１１は、総出力入力を制御するが、第二のＥＯＭ１０１３は、偏光ビームスプリッタ１０１４の前に入ってくるレーザビームの偏光を回転させて、二つのビーム間の出力スリッティング比を制御する。多重化ユニットはまた、直交偏光ビームの経路／遅延線１０１５を含んで、６．２５ｎｓの時間遅延を与える。

一連の超短波パルスからなる入ってくるビーム／光信号を、ＰＢＳ１０１４で二つの直交偏光ビームに分割し、６．２５ｎｓだけ他方に対して一方を遅らせ、これらのビームをＰＢＳ１９１６と組み換えることによって、励起パルストレインの時間符号化を効果的に生成する。ビームは、最初に直交偏光ビームを分離し、独立して位置付けられたミラーＭ１およびＭ２を有する二つの遠隔フォーカスユニットにそれらを向ける二重平面遠隔フォーカスユニット１０３０に向けられる。次に遠隔フォーカスユニット１０３０はビームを再び組み換え、それらをＸＹ走査オプティックＧＳ１、ＧＳ２、ＧＳ３に向ける。この構成では、焦点面／撮像面は、軸方向に独立して配置されるが、横方向に結合されたままである。ＰＭＴ１０４５（例えば、Ｈ１１７０６－４０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）信号は、４００ＭＨｚアンプ１０４６（例えば、ＨＣＡ－４００Ｍ－５Ｋ－Ｃ、ＦＥＭＴＯ）で増幅され、カスタム多重分離回路１０５０に向けられる。図示したように、一部の実施形態では、回路１０５０は、無線周波数（ＲＦ）スイッチ（例えば、ＣＭＤ１９６Ｃ３、カスタムＭＭＩＣ）に基づくことができる。システム１０００はまた、ビーム位置決めオプティック１０３２、１０３４、１０３６を含む。

いくつかの実施形態では時間的多重分離には、時間がかかるレーザ動作周波数との同期を必要とすることがある。ここでは、フェムト秒レーザ同期信号出力からＲＦスイッチ制御に対する相補的なＲＦ信号を導き出すために、８０ＭＨｚ帯域パスフィルタ１０１８およびコンパレータ１０１９（例えば、ＬＴＣ６９５７－ＨＭＳ３、アナログデバイス）が用いられる。これらの制御／基準信号は、約５Ｖのピーク間振幅および約－１．０Ｖの共通モードでの相補的な方形波信号である。多重分離後に、高帯域幅信号は５０ＭＨｚのローパスフィルタ１０５４ａ、１０５４ｂ（ミニ回路）を通過し、デジタイザ入力ＤＡＱ１、ＤＡＱ２（例えば、ＮＩ ＦｌｅｘＲＩＯ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に向けられる。Ｖｉｄｒｉｏによってカスタマイズされた制御ソフトウェア（ＳｃａｎＩｍａｇｅ、Ｖｉｄｒｉｏ ＬＬＣ）は、二重平面遠隔フォーカスユニット１０３０およびＥＯＭ１０１１、１０１４の両方に対する完全制御を提供し、二つの撮像面での走査に適応できる。

図１１は、アナログ乗算を使用して時間的にインターリーブされた光ルミネセンス信号（応答信号内の）を復号するための例示的な実施形態を図示する。この例ではフェムト秒レーザである光源１１１０からの同期信号は、ＲＦ帯域パスフィルタ１１１８およびコンパレータ１１１９に印加され、二つの方形波基準信号を生成する。検出器／ＰＭＴ１１４５からの検出された信号は、ＲＦスプリッタ１１５０を使用して分割される。ＲＦスプリッタ１１５０からの二つの信号は、ＲＦ乗算器１１５２ａ、１１５２ｂそれぞれを介して基準信号で乗算され、続いてＤＡＱ１１５７ａ、１１５７ｂそれぞれを介してデジタル化される。

図１２～１３は、パルスのｓセットおよびｐセットの制御のための例示的な手法に関する追加的詳細を含む。図１２は、図１０と類似したセットアップ／手法を図示したものであり、第一のＥＯＭ１２２２は総出力入力を制御し、一方で第二のＥＯＭ１２２４はパルスのｓセットとｐセットとの間の出力分割比を制御する。図１３は、パルスの各セットの出力がインラインで調節され、ビームスプリッタ１３２２によって後分割されるセットアップ／手法を図示する。第一のＥＯＭ１３２４は、パルスのｓセットの出力レベルを制御し、第二のＥＯＭ１３２６はパルスのｐセットの出力レベルを制御する。

図１４Ａ～１４Ｃは、既存のシステムへの取り外し可能な付属品として、本明細書に記述した二重平面遠隔フォーカスユニットなどのフォーカスユニット上に追加する例示的な手法を示す。図１４Ａは、第二の遠隔フォーカスユニットなしの元のシステムのＣＡＤモデルを図示し、図１４Ｂは、図１４Ａのシステムに追加された二つの遠隔フォーカスユニットを含む付属品のＣＡＤモデルを示す。図１４Ｃは、既存のシステムのブレッドボードに取り付けられた例示的な二重平面遠隔フォーカスアドオンモジュール写真である。こうした実施形態では、二重平面遠隔フォーカスモジュールは、既存の構成要素を修正する必要なしに、既存のシステムに取り付け、かつ取り外すことができる付属品として設計されうる。二重平面遠隔フォーカスモジュール追加の一つのこうした例は、以下のように、光学系を取り付けられたブレッドボード用とすることができる。第一に、既存のねじ穴を使用して、ツーピース連結板をブレッドボード上に取り付けることができる。次に、高速／急速移動ステージ、取付けブラケット、および二次遠隔フォーカスユニットがこのプレート上に取り付けられる（図２ｂ）。一部の機械的制約と仮定すると、ビームスプリッタ（立方体）の後の二次的なｓ偏光ビームは、第二の遠隔フォーカスユニットの方のブレッドボードに直交する方向に（第一の遠隔フォーカスユニットおよび第二の遠隔フォーカスユニットを図１０のフォーカスユニット１０３０に図示された方法と同様の方法で互いに対して位置付けて）向けることができる。いくつかの実施形態では、この機械的設計は、ブレッドボードのＸＹＺおよび傾斜調整を制限することなく、多光子メソスコープ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）のエンクロージャの内側に収まる。

本明細書に開示されるように、一部の実施形態では、一つ以上の基準信号は、反応信号の時間復号で使用するための光源（例えば、パルスレーザ源）から導き出されうる。図１５Ａ～１５Ｃは、異なるデューティサイクルを有するフェムト秒レーザシグナルから得られたいくつかの例示的な基準信号を示す。図１５Ａの基準信号のデューティサイクルは約５０％である。図１５Ｂの基準信号のデューティサイクルは約４５％である。図１５Ｃの基準信号のデューティサイクルは約３０％である。

さまざまな走査技術を説明すると、図１６Ａ～１６Ｃは、本明細書に開示された実施形態毎に可能な例示的な走査パラダイムを示す。図１６Ａは、本明細書に記載される二重平面遠隔フォーカスユニットを用いた、二光子顕微鏡での体積測定イメージを図示する。二つの励起信号（ｓ偏光およびｐ偏光）はそれぞれ、異なる平面に焦点を合わせることができ、次いで両方とも他の平面に移動することができる。図１６Ｂは、大容量の同時二重平面撮像を図示したものであり、各撮像面は独立したＺ位置／焦点面位置を有するが、ＸＹの位置決めの範囲を維持する。図１６Ｃは、大容量の同時二重平面撮像を図示したもので、各撮像面は独立したＺおよびＸＹの位置決めの範囲を有する。

図１７Ａ～１７Ｃは、図１０のシステムで取得されたニューロンインビボの画像であり、図１７Ａは第一のチャネルからの画像であり、図１７Ｂは第二のチャネルからの画像であり、図１７Ｃは両方の撮像チャネルからの組み合わされた画像である。撮像された二重特徴を図示するために、二つのＺ平面をＸＹ 方向に故意にオフセットした。

実施例１

二光子レーザ走査顕微鏡（ＴＰＬＳＭ）は、カルシウム信号のインビボ機能記録用標準ツールになっている。非常に大きな視野を有する新規のメゾスコピック撮像システムの進歩により、機能的撮像および分析にほぼ１００倍大きい容量へのアクセスが与えられ、複数の皮質領域にわたるインビボ脳機能の研究および情報交換のための新たなフロンティアが開かれた。フレームレートの制限により、研究者は撮像領域のサイズ、横方向移動の回数（ＲＯＩ）、およびＲＯＩ内の軸方向平面数の間のバランスを見つける必要があり、その結果、各平面を満足のいく時間的分解能で撮像できる。より速いＴＰＬＳＭ撮像方法は、脳光生理学的研究の範囲をさらに拡大するために非常に望ましい。この要望に対処するために、近年、様々な方法が導入されてきた。これらの手法はそれぞれ、解像度、有用な信号振幅、および許容されるレーザ出力入力間の異なる形態のトレードオフを利用して、解像度の減少、ノイズに対する信号の低下（ＳＮＲ）、および撮像深度の低減を犠牲にしてより高い撮像スループットを達成する。例えば、ベッセルビームを用いた撮像は、被写界深度を拡大するため横方向解像度を維持し、軸方向の解像度を故意に犠牲にし、ベッセルビームの長さにほぼ比例したレーザ出力の増加を要求して、従来のＴＰＬＳＭと同様の信号振幅を有する個別の細胞から蛍光信号を記録する。レーザ出力の入力の増大により、特にインビボ深部の撮像のとき、より高い背景蛍光が生じ、かつ、出力調整と組み合わせて光散乱によって生じる信号減衰を補正するとき、有意に小さな深さで生物学的に許容可能な出力レベル閾値に達する。

複数の励起ビームおよび単一の検出器を用いた同時複数サイト記録を可能にするより速いカルシウム撮像スループット多重化技術を実現するための成長する必要性に対処することが、浮かび上がる。ただし、これらの方法は、原則実証の証明として考慮することができ、ニューロサイエンスで使用する準備が整う前にさらなる開発が必要である。理想的には、ＴＰＬＳＭシステムは、複数の皮質領域、異常補正機構および最適化された収集効率から情報を記録する大きな視野を有し、効率的な二光子励起および蛍光信号検出、光学的にアクセス可能な体積内で撮像平面を移動するため高速走査ならびに高速な横方向および軸方向位置決め機構を確実にする必要がある。Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗらによって開発され、Ｔｈｏｒｌａｂによって商品化された多光子メソスコープ（ＭＭ）は、現在これらの要件を満足する唯一の商業システムである。システムは、遠隔フォーカスの原理を利用して、誤差補正された二光子撮像を達成する。

本明細書では、既存のものに同一の第二の撮像チャネルを追加することによって、その撮像スループットを効果的に倍にするＭＭシステムに対する修正が開示される。追加された励起経路は、撮像面の軸方向位置付けに責任を有する独自の遠隔フォーカスユニットを利用し、横方向の位置決めをする光力学を元のビームと共有する。時間分割多重化（ＴＤＭ）の原理を利用して、励起レーザパルストレインを時間遅延で符号化し、検出器へのそれらの到着時間に基づいて各チャネルから時間的にインターリーブされた蛍光信号を復号する。この結果、軸方向に独立して位置付けられた二つの焦点面からの同時撮像が達成された。

図１０は、使用されるシステム１０００を図示する。図１４Ａ～１４Ｃは、元のＭＭシステムのブレッドボードに取り付けられたアドオン式モジュールを示す。

元のＭＭおよび修正された二重平面多光子メソスコープ（ＭＭ２ｘ）の詳細な評価および比較は、両方のシステムの動的範囲および雑音レベル、撮像チャネル間のクロストーク、異なる深度での撮像体積の異なる領域内の点広がり関数を測定することによって実施された。元のＭＭシステムを特徴付けるために、多重分離電子機器は信号検出経路から取り外され、電流増幅器およびローパスＲＦフィルタのみが配置されている。

１６０ＭＨｚのパルス速度を組み合わせた時間的にインターリーブされた励起パルスは、異なる位置から生じる対応する一連のインターリーブされた蛍光信号を作り出す。単一レーザパルスからの蛍光信号を含む時間ウィンドウの幅は、６．２５ｎｓに等しい。したがって、これらの信号を分類するため、多重分離電子機器は十分に高い帯域幅を有するべきである。高い帯域幅要件が必要である一方、正常な時間的多重分離は使用中の染料の蛍光寿命にも依存する。緑色蛍光タンパク質に基づくカルシウムインジケータの蛍光寿命τは、２．７～３．２ｎｓである。この寿命は、蛍光信号を次の時間ウィンドウに延長させるのに十分に長く、それにより、撮像チャネル間の著しいクロストークを生成する。

予想されるクロストーク値を評価するために、ＰＭＴおよび増幅器の測定器応答に関連する約４００ＭＨｚおよび約５００ＭＨｚの帯域幅を有する二つのガウスプロファイルの畳み込みおよび蛍光寿命によって定義される指数関数系崩壊信号によって蛍光信号を表現する数値モデルが作成された（図１８Ａ）。最初と次の時間ウィンドウ間のクロストークは、これらの時間間隔で統合された信号の最小比として特徴付けられた。クロストークの減少は、時間窓幅、すなわちそのデューティサイクルを減少させることによって達成することができる。図１８Ｂは、デューティサイクルの関数としての異なる蛍光寿命の演算クロストーク値を示す。例えば、τ＝３ｎｓおよび５０％デューティサイクルの場合、推定クロストーク値は、約１６％に等しい。デューティサイクルを減少することで、図１８Ｃに示すように、有用な蛍光信号の一部を失うことを犠牲にして、クロストークが減少する。顕著なクロストークの減少は、デューティサイクル値が４０～５０％で発生する。図１８Ｃは、６．２５ｎｓの窓内の統合信号に対する信号損失を示し、この時間間隔を超えて延長する信号による追加的な１０～１６％の損失を考慮しない。

図１９Ａは、多重分離電子機器の動作を示す。ここでは、０～１Ｖのステップおよび１００ｎｓの持続時間を有する入力方形波形が、レーザ同期信号から得られる制御信号によって二つのＤＡＱチャネル間で切り替わる。図１９Ａにおける信号の１０～９０％の上昇／下落時間は約０．６ｎｓである。両方の信号は、１２．５ｎｓの期間、および約３９％のデューティサイクルを有する。出力信号の振幅は、１．６±０．２ｄＢだけ減衰され、これは、製造者が明記した挿入損失と一致する。単一の光子検出イベントに対応する平均ＰＭＴ信号、およびＧＣＡｍｐ６ｆ標識化細胞および花粉粒（ＰＧ）の測定された時間分解蛍光信号の例が、図１９Ｂ、１９Ｃに示されている。図１９Ｂにおけるインパルス応答トレースは、プリアンプの帯域幅によって定義される約２．５ｎｓのＦＷＨＭを有する主ピーク、ならびにＰＭＴプリアンプ接続内のブロードバンドパルスの反射に起因するより小さいサイドローブを示す。測定された時間分解蛍光信号は、図１８Ａのシミュレーションされたトレースよりもわずかに広がっており、これは回路のインパルス応答の増加した幅、測定中の電子ジッタによって引き起こされる場合があり、３ｎｓ ＧＣａＭＰ６ｆの蛍光寿命よりも長い。ＰＧ試料（図１９Ｃ）の時間分解蛍光測定値は、鉛被ケーブルの長さを４５ｃｍから５ｃｍに低減する前に記録され、トレースは反射によって引き起こされるより顕著な二次ピークを示し、主ピークから約５ｎｓほどオフセットする。

撮像チャネル間のクロストークは、単一チャネルの励起を使用して試験試料からの信号を記録し、両方のチャネルの放射信号を記録することによって測定された。蛍光クロストーク値は、マウス脳のインビボ画像、および染色された花粉粒（ＰＧ）（Ｃａｒｏｌｉｎａ）の試料（図２０Ａ～２０Ｃ参照）を用いて、時間遅延の関数として評価もされた。特に、ＰＧ試料は、ＧＣＡｍｐ６ｆと比較してはるかに短い蛍光寿命を示した。図２０Ａは、第一のチャネル内に存在する励起と共に記録された両方のチャネルにおけるマウス大脳皮質のインビボ画像を示し、平均１０００倍である。異なる時間遅延で記録されたマウスおよびＰＧの画像内の選択された領域の平均信号に対応する正規化された蛍光強度プロファイルが、図２０Ｂ、２０Ｃにそれぞれ示される。撮像チャネル間のクロストーク値は異なり、脳組織およびＰＧ画像ではそれぞれ約７％および１％のレベルで表される。

二つの撮像システムの間の定量的な類似性を示す例が、図２１Ａ～２１Ｄに示されている。ＧｃａＭＰ６ｆ標識化脳組織切片の二光子画像を、チャネル１またはチャネル２のいずれかの励起経路を使用して、ＭＭおよびＭＭ２ｘで記録した。絶対強度値は、元のＭＭと比較して多重化システムで記録された画像でわずかに弱められている。平均強度値は、異なる励起強度で取得された４００画像の他、図２１Ａ～２１Ｄに示される選択されたＲＯＩ内の平均強度から計算された。結果は、図２２Ａ、２２Ｂに示されている。対応する画像から計算された平均分散プロットを図２２Ｂに示す。両方の撮像システムでほぼ同じ雑音レベルが観察された。

ＧＣａＭＰ６ｆは高励起強度で光退色するため、この発蛍光団を使用して二つの撮像システムの全ての動的範囲を評価し比較することは、困難でありうる。この目的のため、より明るくより光安定性のある蛍光試料が使用された。それらの画像が異なる励起出力レベルで記録された時、同様の実験のセットがＰＧを使用して実施された。取得された画像の一例を図２３Ａに示す。図２３Ｂは、選択されたＰＧの入力出力に基づく蛍光強度依存性を示す。４０００カウント未満の強度レベルでのＭＭおよびＭＭ２ｘからの信号の定量的な類似性が観察された。ＭＭ２における蛍光信号は、このレベルより上の飽和の明瞭な兆候を示す。したがって、ＭＭ２ｘの動的範囲は、ＭＭと比較して５０％低くなる。これらの画像から計算された対応する平均分散プロットは、図２３Ｃに示され、チャネル１からのデータを提示する。信号飽和限界より低い両方の撮像システムの雑音関係に対してほぼ同一の信号が観察された。

ポイント拡散機能（ＰＳＦ）測定は、０～５００μｍの異なる撮像深度およびシステムの視野の異なる領域の水性ゲルマトリックス内の固定された２００ｎｍ蛍光ビーズのｚスタックを取得することによって、撮像体積全体で実施された。３００μｍの深さで記録された二つの撮像チャネルからのＰＳＦの例は、を図２４Ａ、２４Ｂに示される。グレーの円の内側の点の位置は、ＰＳＦが測定された視野の位置を示す。偽色画像は、体積測定ＰＳＦの単一平面（ＸＹ、ＸＺ、ＹＺ）への突起を示す。ラインプロットは、対応する突起部の断面を示す。測定されたＰＳＦ値の完全なリストは、表１に提供される。両方の撮像チャネルに全体的にほぼ同一のＰＳＦ値が観察された。
表１．撮像体積にわたるＭＭ２ｘシステムのポイント拡散機能特性

二光子時間分割多重化方法が年数前に実証されているものの、この方法は商業的計測器のレベルに進展していない。今日まで、わずかな二光子撮像コミュニティの研究グループのみが、この方法を独自の実験セットアップで実施した。特に、１００ＭＨｚを超える時間的にインターリーブされた高帯域幅のＰＭＴ信号の多重分離は、技術的に困難である。この撮像技術を可能にするために解決すべき問題は二つある。第一は、撮像チャネルへの信号の正しい割り当てに重要なレーザ繰り返し速度を有する検出電子回路の同期である。レーザパルス速度は共振経路長に依存するため、例えば、周囲温度の変化によって任意の経路長さ変化はパルスレート周波数を変える。これにより、任意の形状の時系列信号の周期シーケンスが、主要周波数を中心とする個別の周波数セットによって表されることを思い出させる。従って、８０ＭＨｚを中心とした適切なＲＦフィルタを使用して主要周波数構成要素を絶縁することが可能であり、結果得られる正弦波を方形波形、またはＲＦコンパレータ回路を使用して相補的方形波形に変換することが可能である（図１０）。

第二および最も困難な問題は、多重分離である。インビボカルシウム信号に対応するＰＭＴ出力での電気信号は、個々の光子検出イベントから生じる絶縁された高帯域幅スパイクから高光子流束からの信号の著しく高く長いバーストに及ぶ、大きなダイバーシティを示す。全体的に、デジタル化された信号の動的範囲は、４桁より多くにわたる。検出感度、検出帯域幅、および動的範囲の観点から、多重分離電子機器のための結果的な要件を満たすことは困難である。発行済みのレポートはそれぞれ独自の多重分離方法を説明する。同一の実験条件で測定した従来的なＴＰＬＳＭとの詳細な比較は通常、提供されなかったため、撮像システムの性能がどの程度多重分離電子機器によって影響を受けるかは不明確なままであった。初期の多重分離スキームは、同じアナログ乗算器ＡＤＬ５３９１（アナログデバイス）を利用したカスタム回路に基づいた。この手法は多重分離（データは非表示）を達成したが、この解決策は、追加の増幅段階の存在および高振幅低帯域幅信号によって引き起こされる著しい背景変化により、暗雑音が５倍以上増加した。図１０の多重分離回路は、製造者が明記した１．８ｎｓのスイッチング時間を有する高速ＲＦスイッチに基づく。０～－５Ｖの制御電圧を印加することを推奨しているが、正電圧に向かってスイッチ操作を制御する相補的な８０ＭＨｚ方形ＲＦ信号をわずかに変化させることによって、もっと速いスイッチ力を達成することが可能でありうる。図１９Ａに示されるように、信号統合窓のデューティサイクルが低減された制御信号の段階的変化に続く約１ｎｓの遅れ時間が観察された。

検出電子機器の帯域幅および蛍光染料の時間的プロファイルは、平均された信号の幅に影響し、それは現在の窓内にどれだけ適合するか、かつそれが次の時間窓にどの程度漏れるかに影響する。例えば、図１９Ａ～１９Ｃ、２０Ａ～２０Ｃは、ＰＧ試料のクロストークが、それぞれの蛍光寿命の違いにより試料のＧＣａＭＰ６ｆ標識化試料より著しく小さいことを示す。興味深いことに、ＧＣａＭＰ６ｆに対する約８％の測定されたクロストーク値は、図１８における数値分析による予測よりも顕著に小さい。検出システム（図１９Ｂ）のインパルス応答は、次の時間窓内に延びる蛍光信号の振幅を減少させる可能性が高い小さなアンダーシュートを有することに留意されたい。

一つの有用なパラメータは、多重化撮像システムで失われた有用な信号の一部分である。染料の検出電子機器および蛍光寿命の帯域幅は、蛍光信号の時間的な幅に影響し、測定間隔内に適合する量、および次の時間窓への漏れの量に影響を与える。本明細書に開示されるＴＤＭ システムは、一部の実施形態では、より短い蛍光寿命を有する試料を好んで、クロストークの低減および有用な信号の損失を低減する。図２３Ａ～２３Ｂに示したＭＭおよびＭＭ２ｘで撮像されたＰＧ試料からの蛍光信号の蛍光信号の一対一の比較は、信号飽和効果が発生する前の特定の制限内ではあるが、両方のシステムの性能がほぼ同一であることを示す。図２１Ａ～２１Ｄおよび図２２Ａ～２２ＢにおけるＧＣａＭＰ６ｆ標識化試料からの蛍光信号の同様の比較は、それぞれ修正システムでの信号振幅の最大２４％減少を示す。このような信号損失は、平均ＧＣａＭＰ６ｆ蛍光信号が、図１９Ａ、１９Ｂに示す通り、４．９ｎｓの時間間隔に適合しないため予測される。図１９Ａ、１９Ｂからのデータを使用して、合計ＧｃａＭＰ６ｆ蛍光信号の約１７％が時間窓の外側に表示され、約５％が次のところに表示されることが推定される。これらの推定は、図２６Ａ～２６Ｃにおける実験的に観察されたクロストーク値と十分に一致する。図２２Ａの蛍光信号の直接的な比較は、２４％の信号損失を示した。その一部は、システムの増幅因子（またはシステム変換利得）のみを変更し、検出された光子の数に影響を与えない、多重分離電子機器の挿入損失に起因する可能性がある。

ＭＭおよびＭＭ２ｘシステムに対応する図２２Ｄ、２３Ｃにおける平均分散プロットは、信号飽和効果が発生する前に密接に一致して表示され、両方の撮像システムで同一の雑音レベルを示唆する。両方の撮像チャネルのＭＭおよびＭＭ２ｘで記録されたＧＣａＭＰ６ｆ標識化画像から計算された平均分散プロットの線形勾配は、７０±２カウントに等しく、これは平均値の±３％以内である。

８０００カウントの近くに表示されるＭＭでの信号飽和（約２^１３）（図２１Ａ）は、限定された±１Ｖの入力電圧範囲を有する１４ビットＤＡＱ電子機器によって引き起こされる。信号基準レベルは現在０Ｖに設定されていることに留意されたい。したがって、ＤＡＱ入力で表示される信号は、記録された信号で非直線性を避けるために、１Ｖより低い振幅を有する必要がある。所与のＰＭＴ利得設定における増幅されたＰＭＴ信号のピーク電圧は、常に１Ｖを超え、低パスフィルタの使用は、ＤＡＱデジタル化窓およびデジタル化速度に対する信号の一致に必須である。多重分離回路が定位置にある場合、信号飽和は約４０００カウントで発生し、これは検出ダイナミック範囲の５０％の減少に対応する。試験実験では、ＲＦスイッチが通過信号を徐々に減衰し、それらの振幅を±２Ｖに制限することが観察された。これらの電圧レベルは、プリアンプとスイッチの両方の動作制限の近くまたはそれより上に表示される。スイッチ動作は正の信号極性および負の信号極性で同一であるため、ＤＣオフセットをプリアンプ出力に導入し、新しい基準に対して信号を測定することによって、動的範囲を延長することが可能である。

実施例２

最近、直径約５ｍｍの超大型視野内でのカルシウム撮像が可能な多光子メソスコープ（ＭＭ）を開発および商品化した。二光子顕微鏡で走査速度が限定されるため、わずかな選択された関心領域のみが適切なフレームレートでの画像でありうる。一過性カルシウム信号を記録するために８～１０Ｈｚの満足のいく時間分解能を達成するために、研究者は、光学的にアクセス可能な撮像容量内の撮像領域のサイズと関心領域の数との間のバランスを見つける必要がある。図１０は、その撮像を全体的に効果的に倍にするＭＭシステムの修正を図示する。時間分割多重化および遠隔フォーカスの方法を使用して、軸方向に独立して位置付けられた二つの焦点面からの同時画像取得を可能にする。

図２５Ａ～２５Ｄ、２６Ａ～２６Ｃは、機能的カルシウム信号記録のクロストークを図示する。具体的には、図２５Ａ、２５Ｂおよび図２５Ｃ、２５Ｄは、試料を第一または第二のチャネルのみで励起すると同時に、約２００および３００μｍの深さで同時に記録されたマウス脳組織の二つのチャネルからの動き補正および平均化された対の画像を示す。したがって、画像の各セットは、関心面内のセルからの蛍光信号を示し、クロストークの存在によって、同じ細胞のゴースト画像が表示される。図２１Ａ～２１Ｄのゴースト画像内の画素強度は、１０倍される。カルシウム信号を選択した細胞から抽出して、両方の撮像チャネルにおけるそれらの相対強度を示した（図２６Ａ、２６Ｂ）。図２６Ｃは、図２６Ａ、２６Ｂで測定されたカルシウム信号の比として計算されたクロストーク値を示す。図２６Ｃのトレースから計算された平均クロストーク値は、それぞれ、チャネル１からチャネル２に対して（５．６±０．７）・１０^－２およびチャネル２からチャネル１に対して（７．０±１．１）・１０^－２である。蛍光の確率的な性質により、クロストーク値の変動が、フレームからフレームへと発生する。

実施例３

幾つかの標準的な皮質回路モデルは、感覚処理の一つの可能な基本単位として二つの完全な皮質柱間の相互作用を提案する。特に、二つの接続された皮質柱にわたるボトムアップ回路とトップダウン回路の動的相互作用は、感覚情報がどのように処理されるかにおいて重要な役割を果たす。二光子レーザ走査顕微鏡（２Ｐ－ＬＳＭ）により、神経活動の蛍光カルシウムインジケータを使用して、哺乳類脳における神経活性の記録が可能になる。最近の２Ｐ－ＬＳＭの前進は、撮像フィールド視野（ＦｏＶ）を約０．４×０．４ｍｍ^２から５×５ｍｍ^２に増大し、この大きなＦｏＶ内の複数の関心領域（ＲｏＩｓ）の無作為の位置決めを支持する。さらに、二つの相互接続された皮質柱にわたるニューロン活性の流れを同時に記録することは、皮質層の対の小さな部分集合に限定されている。図１０に、同時に記録されたＲｏＩｓの数を延ばし、最大約１１Ｈｚのフレームレートで二つの皮質柱の複数の層の撮像を達成する、二光子ランダムアクセスメソコピー（２Ｐ－ＲＡＭ）を二重平面遠隔フォーカスと組み合わせる先進的顕微鏡システムを提示する。ＰＭＴおよび多重分離は、カスタム電子機器を使用する。マウスの一次視覚皮質（Ｖ１）および異なる皮質層に位置する画像平面を有するその他の高い視覚領域（ＶＡ）内に位置する二つの皮質柱でのインビボ撮像が、本明細書において示される。図２７は、最適なフレームレートを可能にする二つの可能性のある撮像シナリオ、すなわち、二つの横方向領域（Ｖ１およびＬＭ）内の４つの軸方向に分離された平面の撮像および四つの横方向位置（Ｖ１、ＬＭ、ＡＭ、ＡＬ）内の二つの軸方向に分離された平面の撮像を示す。

図２８Ａ～２８Ｄは、クロストークの不混合のための例示的なワークフローを示す。具体的には、両方のチャネル上のデータを取得しながら、単一のビームで走査することによってグラウンドトゥルースデータを測定した。信号対クロストークの２Ｄヒストグラムをプロットし、リニアフィットを計算した（図２８Ｂ参照）。フィットの傾斜は、走査された平面から非走査平面（クロストーク）への信号の漏出量の割合を示す。混合マトリクスは、二つの傾斜およびそれらの捕捉物から構成され、クロストークからの信号を分離するために混合データに加えられた。

図２９Ａ、２９Ｂは、クロストークデミキシングの結果を示す。図２９Ａの矢印は、誤ったチャネルに漏出した細胞からの信号を示す。デミキシングの前および後の撮像データが本明細書に示され、デミキシング後に漏れが消滅することを示す。図２９Ｂは、信号面（青色）、クロストーク面（オレンジ）およびデミキシング後のクロストーク面（緑色）のカルシウムトレースを示す。

図３０Ａ、３０Ｂは、二つの皮質柱のインビボ撮像を図示する。Ｓｌｃ１７ａ７；Ａｉ９３マウスの７５μｍ、１７５μｍ、２７５μｍ、および３７５μｍの深さでＶ１（図３０Ａ）およびＬＭ（図３０Ｂ）中で１１Ｈｚで８平面の同時撮像。ＦｏＶは４００ｘ４００μｍ^２であり、Ａｌ Ｂｒａｉｎ Ｏｂｓｅｒｖａｔｏｒｙ ｄａｔａｓｅｔｓの標準サイズに合致して実行された。ＬＵＴは、異なる深さでコントラストを最適化するために調整した。フレームは、８倍で時間平均される。

図３１Ａ～３１Ｄは、四つの皮質領域のインビボ撮像を図示する。Ｖｉｐ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅ；Ａｉ１４８マウスは、７５μｍ、１９０μｍの二つの深さでＶ１（図３１Ａ）、Ｌｍ（図３１Ｂ）、ＡＬ（図３１Ｃ）、およびＡＭ（図３１Ｄ）中の視覚皮質で撮像された。フレームレートは１１Ｈｚ、ＦＯＶ ４００×４００μｍ^２である。各フレームのＬＵＴは、コントラストを最適化するために調整される。

図３２Ａ～３２Ｄは、二つの皮質柱にわたる相関関係を図示する。Ｖｉｐ－ＩＲＥＳ－Ｃｒｅ；Ａｉ１４８マウスは、７５μｍ、１７５μｍ、２７５μｍ、および３２５μｍの四つの深さでＶ１およびＬＭの視覚皮質で撮像された。約１２００の細胞を記録し、分析した（Ｖ１で４００、ＬＭで２００）。多くの細胞は、単一平面記録と類似した相関関係を示す。

二重ビーム二光子メソスコープシステムは、二つの皮質柱での同時結像を可能にする。本明細書では、２軸位置で４つの視覚領域におけるＶｉｐおよびＳｌｃのマウス、および４軸位置の二つの視覚領域での撮像が本明細書で実証されている。性能は、元のおよび二重平面２Ｐ－ＲＡＭのシステム利得の観点から比較された。クロストークは、１０％未満であることが示されているＧＣａＭＰ６標識化組織についても評価された。システムは、動作装置と統合され、活動中のニューラル活動追跡を可能にする。

以下の参照はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

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本明細書において様々な発明の実施形態を記載し、例示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実施し、ならびに／または結果および一つ以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、かかる変形および／または変更の各々は、本明細書に記載の発明に関する実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載するすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示を意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の一つまたは複数の用途に依存することを容易に理解するだろう。当業者は、本明細書に記載する特定の発明に関する実施形態の多くの同等物を認識し、またはただ通常の実験を用いて確認することができる。したがって、前述の実施形態は、例としてのみ提示され、添付した特許請求の範囲およびその同等物の範囲内であり、発明の実施形態が、具体的に記載し請求する以外の形でも実践されうることを理解されたい。本開示の発明に関する実施形態は、本明細書に記載する個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、二つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

上に記載した実施形態は、多数の手段のいずれかで実施できる。例えば、本明細書に開示される実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実装されてもよい。ソフトウェアに実装される場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピュータに提供されるか、複数のコンピュータ間に分散するかにかかわらず、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合で実行され得る。

さらに、コンピュータが、ラック搭載型コンピュータ、デスクトップ型コンピュータ、ラップトップ型コンピュータ、またはタブレット型コンピュータなど、多数の形態のいずれかで具現化されうることは理解されるべきである。加えて、コンピュータは、概してコンピュータとみなされるデバイスではなく、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、スマートフォン、またはいかなる他の適切な携帯型もしくは固定電子デバイスを含む、適切な処理能力を有するデバイスの中に埋め込まれてもよい。

また、コンピュータは一つ以上の入力および出力デバイスを有しうる。これらのデバイスは、とりわけ、ユーザインターフェースを提示するために使用できる。ユーザインターフェースを提供するために使用できる出力デバイスの例には、プリンタまたは出力の視覚的表現のためのディスプレイ画面、およびスピーカーまたは出力の可聴表現のための他の音声発生デバイスが挙げられる。ユーザインターフェースに使用できる入力デバイスの例には、キーボード、ならびにマウス、タッチパッド、およびデジタイザタブレットなどのポインティングデバイスが含まれる。別の例として、コンピュータは、音声認識によってまたは他の可聴フォーマットで、入力情報を受信してもよい。

このようなコンピュータは、ローカルエリアネットワーク、またはエンタープライズネットワークなどの広域ネットワーク、およびインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットを含む、任意の適切な形態の一つ以上のネットワークによって相互接続されてもよい。このようなネットワークは、任意の適切な技術に基づいてもよく、任意の適切なプロトコルに従って動作してもよく、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含んでもよい。

本明細書に概説する様々な方法またはプロセスは、様々なオペレーティングシステムまたはプラットフォームのうちのいずれか一つを用いる、一つ以上のプロセッサ上で実行可能なソフトウェアとしてコード化されてもよい。加えて、このようなソフトウェアは、多数の適切なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのいずれかを使用して記述されてもよく、またフレームワークもしくは仮想マシン上で実行される、実行可能なマシン語コードまたは中間コードとしてコンパイルされてもよい。

また、様々な発明の概念が、一つ以上の方法として具現化されてもよく、その例を提供してきた。方法の一部として行われる行為は、任意の適切な手段で順序付けられうる。したがって、行為が例示するものとは異なる順序で行われる実施形態を構築してもよく、それは、例示的実施形態に連続する行為として示す場合であっても、一部の行為を同時に行うことを含みうる。

本明細書で言及するすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

本明細書で定義および使用するすべての定義は、辞書定義、参照により組み込まれる文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を統制するものと理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確にそうでないと示されない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「および／または」という語句は、結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味し、すなわち、一部の場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で挙げられる複数の要素は、同じ形式、すなわち、結合される要素のうちの「一つ以上」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に、随意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「備える」などの制限のない語法と連動して使われるときに、一実施形態においては、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢと両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。

本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的なもの、すなわち、複数の要素または要素のリスト、および随意にリストに無い追加の項目のうちの少なくとも一つを含むが、二つ以上も含むと解釈されるものとする。それとは反対であると明確に指示した用語のみ、例えば、「のうちの一つのみ」もしくは「のうちの正確に一つ」、または特許請求の範囲において使用するときの「から成る」は、多数の要素またはリストの要素のうちの正確に一つの要素の包含を指す。概して、本明細書で使用する場合、「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの一つ」、「のうちの一つのみ」、または「のうちの正確に一つ」など、排他性の用語が先行するときには、排他的な選択肢（すなわち「両方ともでなくどちらか一方」）を示すとのみ解釈されるものとする。「から基本的に成る」は、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、一つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも一つ」という語句は、要素のリストの中の要素のいずれか一つ以上から選択される、少なくとも一つの要素を意味するが、要素のリスト内で具体的に列挙したありとあらゆる要素のうちの、少なくとも一つを必ずしも含むわけではなく、要素のリストのいかなる要素の組み合せも除外するものではない、と理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも一つ」という語句が指す、要素のリスト内で具体的に識別される以外の要素が、具体的に識別される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在しうることを許容する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうち少なくとも一つ」（または、等価的に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一つ」、もしくは、等価的に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一つ」）は、一実施形態においては、Ｂは存在せず、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態においては、Ａは存在せず、任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、また別の実施形態においては、任意選択的に二つ以上のＡを含む、少なくとも一つのＡ、および任意選択的に二つ以上のＢを含む、少なくとも一つのＢ（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。

特許請求の範囲、ならびに上記の明細書で、すべての移行句、例えば、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保つ（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」、および類似のものは制限がないと理解され、すなわち、含むがそれに限定はされないということを意味する。「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から基本的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみが、米国特許局の特許審査手続便覧、セクション２１１１．０３に記載されている、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句であるものとする。

Claims (24)

1. 光信号を生成する光源であって、前記光信号が１セットのパルスを第一の繰り返し速度で含む、光源と、
   前記光信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成する光マルチプレクサ回路であって、前記第二の繰り返し速度が前記第一の繰り返し速度のｎ倍数であり、前記第二の繰り返し速度のパルスの前記セットが、ｎセットのパルスを含み、前記ｎセットのパルスの各セットのパルスが、前記ｎセットのパルスの互いとは異なる偏光状態を有し、前記第一の繰り返し速度である、光マルチプレクサ回路と、
   前記多重化光信号を受信し、前記多重化光信号をｎ個の励起信号の１セットに分割して試料を励起するフォーカスユニットであって、ｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号が前記ｎセットのパルスのうちの１セットのパルスに対応する、フォーカスユニットと、
   ｎ個の励起信号の前記セットを受信し、前記試料を照射する対物レンズであって、前記対物レンズおよび前記フォーカスユニットが、ｎ個の励起信号の前記セットの互いの励起信号とは異なる、前記試料の焦点面上のｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号に集合的に焦点を合わせて、ｎ個の励起信号の前記セットに応じて応答信号を生成する、対物レンズと、
   前記異なる焦点面からの放射を多重分離し、前記応答信号に基づいてｎ個の放射信号の１セットを生成する電子デマルチプレクサ回路であって、ｎ個放射信号の前記セットの各放射信号が、ｎ個の励起信号の前記セットのうちの一励起信号に対応する、電子デマルチプレクサ回路と、を備えるシステム。
2. 前記対物レンズが、第一の対物レンズであり、前記フォーカスユニットが、ｎセットのフォーカスオプティックを含み、フォーカスオプティックの各セットが、フォーカスオプティックの他のセットの長手方向軸とは異なる長手方向軸を有し、ｎ個の励起信号の前記セットのうちの一励起信号の焦点を設定し、フォーカスオプティックの各セットが、
   １／４波長板と、
   第二の対物レンズと、
   前記対応する励起信号の前記焦点面の位置を独立して調節するフォーカスミラーと、を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 式中、ｎ＝２であって、パルスの各セットが、約５０％のデューティサイクルを有する、請求項２に記載のシステム。
4. 式中、ｎ＝２であって、前記マルチプレクサ回路が、電気光学変調器および１セットの偏光ビームスプリッタを含んで、前記光信号を受信し、ｓ偏光パルスの第一のセットおよびｐ偏光パルスの第二のセットとして２セットのパルスを生成する、請求項１に記載のシステム。
5. 前記光源が、約７００ｎｍ～約１０００ｎｍの波長で動作するレーザ源であり、前記第一の繰り返し速度が最大約８０ＭＨｚである、請求項１に記載のシステム。
6. 前記試料内のそれぞれの焦点面内のｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号を走査するため、前記フォーカスユニットと前記対物レンズとの間の光経路に走査ユニットをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
7. 前記試料内のそれぞれの焦点面内の前記ｎセットのパルスの各セットのパルスを走査するため、前記マルチプレクサ回路と前記フォーカスユニットとの間の光経路に走査ユニットをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
8. 前記ｎセットのパルスが、パルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを含み、
   パルスの前記第一のセットとパルスの前記第二のセットを分割するように構成されたビームスプリッタと、
   前記試料内のそれぞれの画像面内のパルスの前記第一のセットを受信し、パルスの前記第一のセットを走査する、前記ビームスプリッタと前記フォーカスユニットとの間の光経路内の第一の走査ユニットと、
   前記試料内のそのそれぞれの焦点面内のパルスの前記第二のセットを受信し、パルスの前記第二のセットを走査する、前記ビームスプリッタと前記フォーカスユニットとの間の前記光経路内の第二の走査ユニットと、をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
9. 前記応答信号を受信するために、前記デマルチプレクサ回路に通信可能に結合された検出器をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
10. 前記マルチプレクサユニットが、前記ｎセットのパルスの間に時間分離を導入する遅延線を含む、請求項９に記載のシステム。
11. 前記時間分離が、ａ）前記ｎセットのパルスの各セットのパルスに関連付けられたデューティサイクル、およびｂ）ｎ個の励起信号のセットに応答して、前記試料からの蛍光放射に関連付けられた減衰時間に基づく、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記デマルチプレクサ回路が、前記光源からの１セットの基準信号に基づいて前記応答信号をｎ個の放射信号の前記セットに分離する、請求項９に記載のシステム。
13. 前記デマルチプレクサ回路が、前記光源からの１セットの基準信号に基づいてｎ個の放射信号の前記セットを生成する前記検出器に通信可能に結合されたスイッチを含む、請求項９に記載のシステム。
14. 第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む光信号を生成することであって、前記第一の繰り返し速度が、第二の繰り返し速度のｎ倍数であり、前記第二の繰り返し速度のパルスの前記セットが、ｎセットのパルスを含み、前記ｎセットのパルスの各セットのパルスは、前記ｎセットのパルスの互いとは異なる偏光状態を有し、前記第一の繰り返し速度で動作する、光信号を生成することと、
    試料を励起するため前記光信号をｎ個の励起信号の１セットに分割することであって、ｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号が、前記ｎセットのパルスのうちの１セットのパルスに対応する、分割することと、
    ｎ個の励起信号の前記セットの互いの励起信号とは異なる前記試料の焦点面にｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号の焦点を合わせて、ｎ個の励起信号の前記セットに応じて応答信号を生成することと、
    前記応答信号において、前記異なる焦点面からの放射をｎ個の励起信号の１セットへ分離することとであって、ｎ個の放射信号の前記セットの各放射信号が、ｎ個の励起信号の前記セットの励起信号に対応する、分離することと、を含む方法。
15. 各励起信号の前記焦点面の位置を独立して調節することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ｎセットのパルスが、２セットのパルスを含み、前記生成することが、ｓ偏光パルスの第一のセットとｐ偏光パルスの第二のセットとして前記２セットのパルスを生成することを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記試料内のそれぞれの焦点面内のｎ個の励起信号の前記セットの各励起信号を走査することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記試料内のそれぞれの焦点面内の前記ｎセットのパルスの各セットのパルスを走査することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
19. 前記ｎセットのパルスが、パルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを含み、
    パルスの前記第一のセットとパルスの前記第二のセットを分割することと、
    前記試料内のそれぞれの焦点面内のパルスの前記第一のセットを走査することと、
    前記試料内のそれぞれの焦点面内のパルスの前記第二のセットを走査することと、をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
20. 検出器を介して、前記応答信号を受信することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
21. 前記分離することが、前記応答信号を１セットの基準信号に基づいてｎ個の放射信号の前記セットに分離することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記分離することが、１セットの基準信号に基づいてｎ個の放射信号の前記セットを生成することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. 光信号を生成するレーザ源であって、前記光信号が第一の繰り返し速度で１セットのパルスを含む、レーザ源と、
    前記光信号を受信し、第二の繰り返し速度で１セットのパルスを含む多重化光信号を生成する電気光学変調器および偏光ビームスプリッタであって、前記第二の繰り返し速度が前記第一の繰り返し速度の二倍であり、前記第二の繰り返し速度のパルスの前記セットが、それぞれ前記第一の繰り返し速度のパルスの第一のセットおよびパルスの第二のセットを含み、パルスの前記第一のセットが、パルスの前記第二のセットとは異なる偏光状態を有する、電気光学変調器および偏光ビームスプリッタと、
    前記多重化光信号を受信し、前記多重化光信号を第一の励起信号および第二の励起信号に分割して、試料を励起するフォーカスユニットであって、前記第一の励起信号が、パルスの前記第一のセットに対応し、前記第二の励起信号が、パルスの前記第二のセットに対応し、前記フォーカスユニットがフォーカスオプティックの第一のセットおよびフォーカスオプティックの前記第一のセットとは異なる長手方向軸を有するフォーカスオプティックの第二のセットを含み、フォーカスオプティックの前記第一のセットおよびフォーカスオプティックの前記第二のセットがそれぞれ、
    １／４波長板と、
    第二の対物レンズと、
    その対応する励起信号の焦点面の位置を独立して調節するフォーカスミラーと、を含む、フォーカスユニットと、
    前記第一の励起信号および第二の励起信号を受信し、前記試料に光学的に結合して前記試料を照射し、前記試料からの放射を生成する対物レンズであって、前記第一の励起信号が、前記試料の第一の焦点面に焦点を合わせ、前記第二の励起信号が、前記第一の焦点面とは異なる前記試料の第二の焦点面に焦点を合わせる、対物レンズと、
    前記試料からの前記放射に基づいて応答信号を生成するように構成された検出器と、
    前記応答信号を前記第一の励起信号に対応する第一の放射信号と前記第二の励起信号に対応する第二の放射信号に分離するスイッチと、を備えるシステム。
24. ｎが２～５の整数である、請求項１に記載のシステム。

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