JP7302085B2 - Ｒｎａシークエンシング法 - Google Patents

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年７月１０日に出願された米国仮出願第６２／８７２，５５８号に基づく優先権の利益を主張しており、前記仮出願は、すべての目的のために、参照により本明細書に援用される。
発明の分野
ｍＲＮＡ分子内の目的の領域をシークエンシングするための方法が、本明細書に記載される。
背景
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）シークエンシングは、リアルタイム遺伝子発現、異なる組織中の遺伝子発現プロファイル、および遺伝子発現のレベルについての情報を提供することができる。特定の遺伝子の発現レベルにおける変動は、環境刺激に応答して、異なる発達段階の間に、または原因であるか結果であるかについての疾患との関係において、変動し得る。
直接ｍＲＮＡシークエンシングは困難であり、標的となるｍＲＮＡ分子は、典型的には、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子に逆転写される。次いで、ｃＤＮＡ分子をシークエンシングして、元のｍＲＮＡ分子についてのシークエンシング情報を提供する。真核生物のｍＲＮＡは、一般に、ｍＲＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テイルを含み、これは、ｃＤＮＡ分子の５’末端のポリ（Ｔ）領域に反映される。必要に応じて、ｃＤＮＡ分子に対する相補的ＤＮＡ鎖が合成され、その結果、ＤＮＡ分子の３’末端にポリ（Ａ）テイルが得られる。
ある特定の非常に効率的なシークエンシング法は、核酸分子をシークエンシングするために非終結ヌクレオチドを用いる。これらのシークエンシング法は、「フローシークエンシング」、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」法と呼ばれることがある（例えば、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第８，７７２，４７３号を参照されたい）。
米国特許第８，７７２，４７３号
発明の簡単な要旨
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法が、本明細書に記載される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ；（ｂ）ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用されるヌクレオチドは、非終結ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用されるヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される標識ヌクレオチドは、同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される。一部の実施形態では、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的領域の配列は、非標識ヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、バーコード領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、各ポリヌクレオチドの標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）で使用される全ヌクレオチドの５０％以下は、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用される全ヌクレオチドの０．１％以下は、標識されている。一部の実施形態では、方法は、プライマーがホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ（ｃ）を１または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドは、反復ステップの間で除去される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第１の割合で使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第２の割合で使用して、プライマーを伸長するステップであって、第２の割合は、第１の割合よりも大きく、プライマー伸長は、ホモポリマー領域内で失速する、ステップ；（ｄ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ；ならびに（ｅ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドおよび非終結非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用される非標識ヌクレオチドは、非終結非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｅ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的領域の配列は、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを使用して決定される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）または（ｅ）で使用されるヌクレオチドの５０％またはそれ未満は、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用されるヌクレオチドの５０％より多くは、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用されるヌクレオチドの０．１％またはそれ未満は、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用されるヌクレオチドのすべては、標識されていない。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）は、プライマーがホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、１または複数回、反復して、取り込まれていないヌクレオチドを除去すること、および新鮮なヌクレオチドを添加することを含む。一部の実施形態では、各ポリヌクレオチドの標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、バーコード領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ；（ｂ）複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように、所定のサイクルおよびポリヌクレオチドのバーコード領域が構成されている、ステップ；（ｃ）非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用される非標識ヌクレオチドは、非終結非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される標識ヌクレオチドは、同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用されるヌクレオチドの５０％またはそれ未満は、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用されるヌクレオチドの０．１％またはそれ未満は、標識されている。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）で使用されるヌクレオチドのすべては、標識されていない。一部の実施形態では、プライマーがホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ（ｃ）を１または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドは、ステップ（ｃ）を反復する前に除去される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、各ポリヌクレオチドの標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドを第１のプライマーとハイブリダイズして、第１の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）複数のポリヌクレオチドを第２のプライマーとハイブリダイズして、第２の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、第２のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される標識ヌクレオチドは、同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される。一部の実施形態では、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前に実行される。一部の実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）の前に実行される。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）の後に第１のプライマーを、またはステップ（ｄ）の後に第２のプライマーを除去するステップを含む。一部の実施形態では、第２のプライマーは、プライマーの３’末端に３’アンカーを含み、３’アンカーは、第２のプライマーのホモポリマー領域中に存在する塩基以外の塩基を含む。一部の実施形態では、第２のプライマーは、プライマーの５’末端に５’アンカーを含み、アンカーは、リンカーを介して第２のプライマーのホモポリマー領域に共有結合されている。一部の実施形態では、５’アンカーは、第１のプライマーの少なくとも一部と同一の配列を含む核酸セグメントを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧホスホルアミダイトリンカーである。一部の実施形態では、方法は、ヌクレオチドを使用して、第２のプライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内の第２のプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非終結ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内の第２のプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的領域またはバーコード領域の配列は、非標識ヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、各ポリヌクレオチドの標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、および第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップ；（ｃ）切断可能なリンカーでプライマーを切断するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で標的領域の配列を決定するために使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）でバーコード領域の配列を決定するために使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される標識ヌクレオチドは、同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、１つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ウラシル塩基を含み、プライマーは、プライマーをウラシル特異的切断酵素と接触させることにより切断される。一部の実施形態では、方法は、ヌクレオチドを使用して、第２のプライマーセグメントをホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントをホモポリマー領域内で伸長するために使用されるヌクレオチドは、非終結ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントをホモポリマー領域内で伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的領域またはバーコード領域の配列は、非標識ヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、標的領域を決定するために使用される標識ヌクレオチドの異なる塩基は、別々に使用される。一部の実施形態では、各ポリヌクレオチドの標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）同じ塩基のヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域中に伸長するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を１または複数回反復して、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）でプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）で標的領域の配列を決定するために使用される標識ヌクレオチドは、非終結標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）で使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的領域の配列は、非標識ヌクレオチドおよび標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、バーコード領域をさらに含み、標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられ、方法は、標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基は、アデニンまたはチミン塩基である。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域は、少なくとも８つの連続する同一の塩基を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域は、少なくとも５０の連続する同一の塩基を含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、バーコード領域は、試料バーコードを含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、バーコード領域の決定された配列を、同じ標的核酸分子由来のｍＲＮＡコード領域に関連する決定された配列に関連付けるステップをさらに含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子である。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子の目的の領域は、ｍＲＮＡ分子のコード領域を含む。
上記方法のいずれかの一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子の目的の領域は、ｍＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域または５’－非翻訳領域を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記バーコード領域が、前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ；
（ｂ）前記ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ；
（ｃ）前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに
（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目２）
ステップ（ｂ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｃ）で使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｄ）で使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ｂ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）で使用される全ヌクレオチドの５０％以下が、標識されている、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｃ）で使用される全ヌクレオチドの０．１％以下が、標識されている、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ（ｃ）を１または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、反復ステップの間で除去される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；
（ｂ）標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第１の割合で使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ；
（ｃ）前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第２の割合で使用して、前記プライマーを伸長するステップであって、前記第２の割合が、前記第１の割合よりも大きく、プライマー伸長が、前記ホモポリマー領域内で失速する、ステップ；
（ｄ）前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ；ならびに
（ｅ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目１５）
ステップ（ｂ）で使用される前記標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドおよび非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ｃ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｄ）で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ｅ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記標的領域の配列が、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを使用して決定される、項目１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ｂ）または（ｅ）で使用される前記ヌクレオチドの５０％またはそれ未満が、標識されている、項目１４から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ｃ）で使用される前記ヌクレオチドの５０％より多くが、標識されている、項目１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
ステップ（ｄ）で使用される前記ヌクレオチドの０．１％またはそれ未満が、標識されている、項目１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
ステップ（ｄ）で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、項目１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ｄ）が、前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、１または複数回、反復して、取り込まれていないヌクレオチドを除去すること、および新鮮なヌクレオチドを添加することを含む、項目１４から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目１４から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目１４から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ；
（ｂ）複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域中に伸長される前に、前記複数のポリヌクレオチドにわたって前記バーコード領域の末端まで伸長されるように、前記所定のサイクルおよび前記ポリヌクレオチドの前記バーコード領域が構成されている、ステップ；
（ｃ）非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに
（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目２９）
ステップ（ｂ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ステップ（ｃ）で使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
ステップ（ｄ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される前記ヌクレオチドの５０％またはそれ未満が、標識されている、項目２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ステップ（ｃ）で使用される前記ヌクレオチドの０．１％またはそれ未満が、標識されている、項目２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ステップ（ｃ）で使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、項目２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、ステップ（ｃ）を１または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、ステップ（ｃ）を反復する前に除去される、項目２６から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目２６から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目２６から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目２６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドを第１のプライマーとハイブリダイズして、第１の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；
（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ；
（ｃ）前記複数のポリヌクレオチドを第２のプライマーとハイブリダイズして、第２の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記第２のプライマーが、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ；ならびに
（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目４１）
ステップ（ｂ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ｄ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）が、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前に実行される、項目４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）の前に実行される、項目４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
ステップ（ｂ）の後に前記第１のプライマーを、またはステップ（ｄ）の後に前記第２のプライマーを除去するステップを含む、項目４０から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第２のプライマーが、前記プライマーの３’末端に３’アンカーを含み、前記３’アンカーが、前記第２のプライマーの前記ホモポリマー領域中に存在する前記塩基以外の塩基を含む、項目４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記第２のプライマーが、前記プライマーの５’末端に５’アンカーを含み、前記アンカーが、リンカーを介して前記第２のプライマーの前記ホモポリマー領域に共有結合されている、項目４０から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記５’アンカーが、前記第１のプライマーの少なくとも一部と同一の配列を含む核酸セグメントを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記リンカーが、１つまたは複数の核酸を含む、項目４８または４９に記載の方法。
（項目５１）
前記リンカーが、ＰＥＧホスホルアミダイトリンカーである、項目４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
ヌクレオチドを使用して、前記第２のプライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、項目４０から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記ホモポリマー領域内の前記第２のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ホモポリマー領域内の前記第２のプライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目５２または５３に記載の方法。
（項目５５）
前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目４０から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目４０から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目４０から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目４０から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、前記プライマーが、第１のプライマーセグメント、前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、および前記第１のプライマーセグメントおよび前記第２のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ；
（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ；
（ｃ）前記切断可能なリンカーで前記プライマーを切断するステップ；ならびに
（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目６０）
ステップ（ｂ）で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
ステップ（ｄ）で前記バーコード領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目５９または６０に記載の方法。
（項目６２）
ステップ（ｂ）またはステップ（ｄ）で使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、項目５９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記切断可能なリンカーが、１つまたは複数の核酸を含む、項目５９から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記切断可能なリンカーが、ウラシル塩基を含み、前記プライマーが、前記プライマーをウラシル特異的切断酵素と接触させることにより切断される、項目５９から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
ヌクレオチドを使用して、前記第２のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップをさらに含む、項目５９から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第２のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記第２のプライマーセグメントを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目６５または６６に記載の方法。（項目６８）
前記標的領域または前記バーコード領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目５９から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目５９から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、項目５９から６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
各ポリヌクレオチドの前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられる、項目５９から７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；
（ｂ）前記同じ塩基のヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域中に伸長するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）を１または複数回反復して、前記プライマーが前記ホモポリマー領域にわたって伸長するステップ；ならびに
（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
を含む方法。
（項目７３）
ステップ（ｂ）で前記プライマーを伸長するために使用される前記ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
ステップ（ｄ）で前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
ステップ（ｂ）で使用される前記ヌクレオチドが、標識ヌクレオチドを含む、項目７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
ステップ（ｂ）で使用される前記ヌクレオチドが、非標識ヌクレオチドを含む、項目７２から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記標的領域の配列が、非標識ヌクレオチドおよび前記標識ヌクレオチドの混合物を使用して決定される、項目７２から７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域をさらに含み、前記標的領域が、固有のバーコード領域に関連付けられ、前記方法が、標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップをさらに含む、項目７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基が、アデニンまたはチミン塩基である、項目１から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも８つの連続する同一の塩基を含む、項目１から７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも５０の連続する同一の塩基を含む、項目１から８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記バーコード領域が、試料バーコードを含む、項目１から７１および７８から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記バーコード領域の決定された配列を、同じ標的核酸分子由来のｍＲＮＡコード領域に関連する決定された配列に関連付けるステップをさらに含む、項目１から７１および７８から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ分子である、項目１から８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記ｍＲＮＡ分子の前記目的の領域が、前記ｍＲＮＡ分子のコード領域を含む、項目１から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記ｍＲＮＡ分子の前記目的の領域が、前記ｍＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域または５’－非翻訳領域を含む、項目１から８５のいずれか一項に記載の方法。
図１は、本明細書に記載される方法を使用してシークエンシングすることができるポリヌクレオチドを得るための例示的方法を説明する。
図２Ａは、バーコード領域がホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図２Ｂは、グラフ形式で、バーコード領域がホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図３Ａは、プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図３Ｂは、グラフ形式で、プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図４Ａは、フローサイクルおよびポリヌクレオチドの異なるバーコード領域が、プライマーが、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように構成される、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図４Ｂは、グラフ形式で、異なるバーコード領域の配列を有するが同じフロー長さである複数のポリヌクレオチドによる、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図５Ａは、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図５Ｂは、グラフ形式で、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図５Ｃは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる２つのプライマーの配列が、図５Ａに示されている例示的方法と比較して逆である、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための別の例示的方法のフローチャートを示す。
図５Ｄは、グラフ形式で、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる２つのプライマーの配列が、図５Ａに示されている例示的方法と比較して逆である、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図６Ａは、切断可能なプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図６Ｂは、グラフ形式で、切断可能なプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図７Ａは、プライマー伸長がポリヌクレオチドのホモポリマー領域内で失速および再開する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。
図７Ｂは、グラフ形式で、プライマー伸長がポリヌクレオチドのホモポリマー領域内で失速および再開する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法を示す。
図８は、バーコード領域、ホモポリマー領域および目的の領域を含む、３つの例示的配列についてのシークエンシングフローマトリックスおよびシグナルトレースを示す。
発明の詳細な説明
ｍＲＮＡ分子内の目的の領域（例えば、コード領域、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）および／または５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ））の配列を決定する方法が、本明細書に記載される。この方法により、ホモポリマー領域（例えば、ポリＡ領域またはその相補体、ポリＴ領域）の全部または実質的に一部のシークエンシングを回避しながら、ｍＲＮＡ分子内の目的の領域をシークエンシングすることが可能になる。ｍＲＮＡ分子のポリＡ領域は、一般に、それがｍＲＮＡ配列または遺伝子発現レベルについての重大な情報を提供しないので、関心をひかない、および有益な情報をもたらさないと考えられる。したがって、ポリヌクレオチドのより情報価値のある領域に達するように、ホモポリマー領域をわたってシークエンシングプライマーが伸長するために必要なコストおよび時間の低減において実質的な利益が存在する。例えば、コストは、非標識ヌクレオチド対応物よりも実質的に費用がかかる標識ヌクレオチドの使用を低減または排除しながら、シークエンシングプライマーを伸長することによって、低減することができる。さらに、シークエンシングプライマーの伸長時間は、取り込まれた各塩基に対する検出ステップをスキップすること、およびプライマーがホモポリマー領域をわたって連続的に伸長するのを可能にすることによって、低減することができる。
シークエンシングされたポリヌクレオチドは、バーコード領域を含み得、これは、例えば、試料バーコードおよび／または固有分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。ホモポリマー領域は、バーコード領域およびｍＲＮＡ分子中の目的の領域の間のポリヌクレオチドに位置することができる。これは、配列の知識が所望される２つの領域（すなわち、バーコード領域およびｍＲＮＡ分子由来の目的の配列）が、関心をひかない領域（ホモポリマー領域）により分離される状況を生じる。一部の本明細書に記載される方法により、ホモポリマー領域の存在により引き起こされる破壊を最小化しながら、バーコード領域および目的のｍＲＮＡ領域の両方をシークエンシングすることが可能になる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ；（ｂ）ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第１の割合で使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第２の割合で使用して、プライマーを伸長するステップであって、第２の割合は、第１の割合よりも大きく、プライマー伸長は、ホモポリマー領域内で失速する、ステップ；（ｄ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ；ならびに（ｅ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ；（ｂ）複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように、所定のサイクルおよびポリヌクレオチドのバーコード領域が構成されている、ステップ；（ｃ）非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドを第１のプライマーとハイブリダイズして、第１の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）複数のポリヌクレオチドを第２のプライマーとハイブリダイズして、第２の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、第２のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、および第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップ；（ｃ）切断可能なリンカーでプライマーを切断するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）同じ塩基のヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域中に伸長するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を１または複数回反復して、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。必要に応じて、ヌクレオチドは非終結非標識ヌクレオチドである。
定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明白な指示がない限り、複数形の言及対象を含む。
本明細書での「約」ある値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する変動を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
用語「個体」、「患者」および「対象」は、同義語として使用され、ヒトを含む動物を指す。
用語「標識」は、本明細書で使用される場合、別の部分、例えばヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、とカップリングされる、またはカップリングされ得る、検出可能な部分を指す。標識は、標識に送達されたシグナルを放出することまたはシグナルを変更することができ、したがって、標識の存在または非存在を検出することができる。一部のケースでは、カップリングは、リンカーを介してのカップリングであり得、リンカーは、切断可能、例えば、光切断可能（例えば、紫外線下で切断可能）、化学的に切断可能（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの、還元剤によって）、または酵素的に切断可能（例えば、エステラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼもしくはプロテアーゼによって）であり得る。
「非終結ヌクレオチド」は、ポリメラーゼまたはトランスクリプターゼを使用してポリヌクレオチドの３’末端に結合させることができる、およびポリメラーゼまたはトランスクリプターゼを使用してそれに結合された別の非終結核酸を有することができ、そのヌクレオチドから保護基または可逆的ターミネーターを除去する必要がない、核酸部分である。天然に存在する核酸は、非終結核酸の一種である。非終結核酸は、標識されていることがあり、または未標識であることもある。
本明細書に記載される本発明の態様および変形形態が、態様および変形形態「からなること」および／または「から本質的になること」を含むことは理解されよう。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間に介在する各々の値、およびその述べられている範囲内の、任意の他の述べられているまたは介在する値が、本開示の範囲内に包含されることは、理解されるはずである。述べられている範囲が上限値または下限値を含む場合、これらの含まれる限界値のどちらかを含まない範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載される主題を限定するものと解釈すべきでない。この説明は、当業者による本発明の実施および使用を可能にするために提供され、特許出願およびその要件に関連して提供される。記載される実施形態の様々な修飾形態が当業者には容易に分かることになり、本明細書における一般原理を他の実施形態に応用することができる。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されるように意図されたものではなく、本発明には、本明細書に記載される原理および特徴に対応する最も広い範囲が与えられる。
図１～８は、様々な実施形態によるプロセスを例証する。これらの例示的プロセスでは、一部のブロックは、必要に応じて組み合わせられ、一部のブロックの順序は、必要に応じて変更され、一部のブロックは、必要に応じて割愛される。一部の例では、追加のステップが例示的プロセスと組み合わせて遂行され得る。したがって、例証される（および下記でより詳細に説明される）ような操作は、本質的に例示的なものであり、したがって、限定と見なすべきではない。
本明細書で言及されるすべての公表文献、特許および特許出願の開示は、これにより各々その全体が参照により本明細書に取り込まれる。参照により取り込まれるいずれかの参考文献が本開示と矛盾する場合には、本開示が優先されるものとする。
ポリヌクレオチド
本明細書に記載される方法で使用されるポリヌクレオチドは、ホモポリマー領域および標的領域を含むことができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、バーコード領域をさらに含む。一般に、ポリヌクレオチドは、例えば、逆転写酵素から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成することにより、ｍＲＮＡに由来する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子の相補体である。複数のポリヌクレオチドは、複数のｍＲＮＡ分子に由来することができ、異なるポリヌクレオチドは、異なるｍＲＮＡ分子を反映する配列を含むことができる。異なるｍＲＮＡ分子は、目的の領域および／または異なるホモポリマー（例えば、ポリＡ領域）の長さについて異なる配列を含み得るので、同様に、ポリヌクレオチドは、異なる標的領域および／または異なるホモポリマーの長さを含むことができる。
ポリヌクレオチドの標的領域は、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む。配列は、例えば、ｍＲＮＡ分子由来の目的の配列と同じまたは相補的であり得る。目的の領域は、ｍＲＮＡ分子由来の、１もしくは複数の３’－ＵＴＲ、５’－ＵＴＲおよび／またはコード領域、あるいはこれらの領域のいずれか１つの一部を含み得る。
ポリヌクレオチドは、ホモポリマー領域（例えば、ポリＡまたはポリＴ領域）を含み、これは、ｍＲＮＡ分子中のポリＡ領域またはその相補体を代表する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域は、長さ約５塩基もしくはそれより長く、長さ約８塩基もしくはそれより長く、長さ約１０塩基もしくはそれより長く、長さ約２０塩基もしくはそれより長く、長さ約３０塩基もしくはそれより長く、長さ約４０塩基もしくはそれより長く、長さ約５０塩基もしくはそれより長く、長さ約１００塩基もしくはそれより長く、または長さ約２００塩基もしくはそれより長い。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域は、長さ約５塩基～約２００塩基、例えば、長さ約５塩基～約８塩基、長さ約８塩基～約１０塩基、長さ約１０塩基～約２０塩基、長さ約２０塩基～約３０塩基、長さ約３０塩基～約４０塩基、長さ約４０塩基～約５０塩基、長さ約５０塩基～約１００塩基、または長さ約１００塩基～約２００塩基である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、バーコード領域（例えば、試料バーコードおよび／またはＵＭＩ）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なるｍＲＮＡ分子に由来し、したがって、異なるｍＲＮＡ分子由来の目的の異なる標的領域を含むことができ、存在する場合、元のｍＲＮＡ分子を固有に識別するための異なるバーコード領域を含み得る。一部の実施形態では、バーコード領域は、試料バーコードを含む。試料バーコードは、所与の試料に対して固有であり得、したがって、同じ試料（例えば、同じ患者由来、同じ患者の組織、または同じ細胞由来）について使用される捕捉用プライマーにわたって共通し得る。したがって、異なる試料由来のポリヌクレオチドは、多重シークエンシングのために組み合わせることができ、任意の所与のシークエンシングされるポリヌクレオチドの起源は、試料バーコードに基づいて決定することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置する。例えば、一部の実施形態では、ホモポリマー領域の５’末端は、標的領域の３’末端の近位にあり、ホモポリマー領域の３’末端は、バーコード領域の５’末端の近位にある。一部の実施形態では、ホモポリマー領域の３’末端は、標的領域の５’末端の近位にあり、ホモポリマー領域の５’末端は、バーコード領域の３’末端の近位にある。一部の実施形態では、バーコード領域およびホモポリマー領域の間に介在する塩基は存在しない。一部の実施形態では、ホモポリマー領域および標的領域の間に介在する塩基は存在しない。
ｍＲＮＡは、捕捉用プライマー（例えば、ＤＮＡ捕捉用プライマー）を使用して生体試料（例えば、血液試料、細胞試料、組織試料または他の生物試料に由来する試料）から単離することができる。例えば、生物試料を得るために、血液試料が採取され得るか、または組織試料が生検され得る。一部の実施形態では、生体試料は単一細胞であり、単一細胞由来のｍＲＮＡは、共通の試料バーコードで標識することができる（例えば、単一細胞ＲＮＡシークエンシングまたは「ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ」）。一部の実施形態では、捕捉用プライマーは、ｍＲＮＡの３’末端でポリＡテイルとハイブリダイズするポリＴ配列を含む。捕捉用プライマーは、表面、例えば、ビーズまたは他の結合表面に結合し得、未結合核酸分子または他の生物残屑を除去することができる。一部の実施形態では、捕捉用プライマーは、バーコード領域を含むことができる。バーコード領域は、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含み得、これは、特定の捕捉用プライマーとハイブリダイズされるｍＲＮＡ分子に関連付けられる。したがって、複数の異なるｍＲＮＡ分子は、固有のバーコード領域で捕捉することができる。
ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズされる捕捉用プライマーは、逆転写酵素を使用して伸長されて、ｃＤＮＡ分子が生成し得る。ｃＤＮＡ分子は、バーコードが最終ポリヌクレオチド中に存在する場合、捕捉用プライマーのバーコード領域と一緒に、ポリＴホモポリマー領域を含む。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子の相補体が生成し、ｃＤＮＡ分子および／またはｃＤＮＡ分子の相補体は、シークエンシングのための鋳型として使用される。一部の実施形態では、捕捉用プローブ中のポリＴホモポリマー領域は、長さ約５塩基～長さ約５０塩基、例えば、長さ約１０～約３０塩基、または長さ約２０塩基である。
図１は、本明細書に記載される方法を使用してシークエンシングすることができるポリヌクレオチドを得るための例示的方法を説明する。ｍＲＮＡ分子１０２は、標的領域１０４、および標的領域１０２の３’末端の近位にあるポリＡホモポリマー領域１０６を含む。標的領域は、３’－ＵＴＲ１０８、コード領域１１０、および５’－ＵＴＲを含むことができる。試料から得られるｍＲＮＡ分子１０２は、一般に、表面１１４、例えば、ビーズまたは他の好適な表面と融合された捕捉用プローブ１１６とハイブリダイズすることができる。捕捉用プローブ１１６は、捕捉用プローブ１１６を表面１１４に結合する連結領域１１８、バーコード領域１２０（必要に応じて）、およびポリＴホモポリマー領域１２２を含む。捕捉用プローブのポリＴホモポリマー領域１２２は、ｍＲＮＡ分子のポリＡホモポリマー領域１０６とハイブリダイズする。ｍＲＮＡ分子１０２とハイブリダイズされた結合した捕捉用プローブ１１６を含む表面１１４を洗浄して、捕捉されていないポリヌクレオチドまたは試料由来の他の物質を除去し得る。逆転写酵素１２４は、鋳型としてｍＲＮＡ分子１０２を使用して捕捉用プローブ１１６を伸長した。これは、ｍＲＮＡ分子１０２の標的領域に相補的な標的領域１２８、ポリＴホモポリマー領域１２２、およびバーコード領域１２０を含むｃＤＮＡ分子１２６を生成する。連結領域１１８は、表面１１４から切断することができ、それによってｃＤＮＡ分子１２６が放出される。アダプター１３０および１３２は、ｃＤＮＡ分子１２６の３’および／または５’末端にライゲートされ得る。ｃＤＮＡ分子１２６の相補体１３４を生成することができ、これは、シークエンシングプライマー１３６とハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた鋳型を生成することができる。いずれかの実施形態では、ハイブリダイズされた鋳型は、本明細書に記載されるシークエンシング法のいずれかに進行し得る。
フローシークエンシング法
本明細書に記載される方法を使用して、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定することができる。ｍＲＮＡに由来するポリヌクレオチドは、シークエンシングプライマーとハイブリダイズして、シークエンシングのためのハイブリダイゼーション鋳型を生成する。本明細書に記載される方法は、「自然な合成によるシークエンシング」または「非終結型の合成によるシークエンシング」方法と呼ばれることもあるフローシークエンシング法を使用してポリヌクレオチドをシークエンシングすることを含み得る。例示的な方法は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる米国特許第８，７７２，４７３号に記載されている。以下の説明は、フローシークエンシング法に関して提供されるが、すべてまたは一部分（例えば、１つまたは複数の領域、例えば、バーコード領域および／または標的領域）をシークエンシングするために他のシークエンシング法が使用され得ることは、理解されよう。フローシークエンシングは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーを伸長するためのヌクレオチドの使用を含む。所与の塩基タイプのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕなど）をハイブリダイズされた鋳型と混合して、相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、プライマーを伸長することができる。ヌクレオチドは、例えば、非終結ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドが、非終結ヌクレオチドであるとき、１つより多くの連続する相補的塩基が鋳型鎖内に存在する場合には、１つより多くの連続する塩基を伸長プライマー鎖に取り込むことができる。非終結ヌクレオチドは、３’可逆的ターミネーターを有するヌクレオチドと対照をなし、一般に、連続ヌクレオチドが結合される前にブロッキング基は除去される。相補的塩基が鋳型鎖内に存在しない場合、鋳型鎖内の次の塩基と相補的であるヌクレオチドが導入されるまで、プライマー伸長は停止する。ヌクレオチドの少なくとも一部分に標識することができ、その結果、取り込みを検出することができる。最も一般的には、単一のヌクレオチドタイプのみが一度に導入される（すなわち、個々に付加される）が、ある特定の実施形態では、２つまたは３つの異なるタイプのヌクレオチドが同時に導入されることもある。この方法論は、あらゆる単一塩基の伸長後、ターミネーターが反転されて次に続く塩基の取り込みが可能になるまで、プライマー伸長が停止される、可逆的ターミネーターを使用するシークエンシング法と対比され得る。
ヌクレオチドを決定された順序で導入することができ、この過程をフローサイクルにさらに分けることができる。ヌクレオチドが段階的に付加され、これにより、付加されたヌクレオチドを鋳型鎖内に存在する相補的塩基のシークエンシングプライマーの末端に組み込むことが可能になる。サイクルは、ヌクレオチドの同じ順序および異なる塩基タイプ（すなわち、対称サイクル）の数、またはヌクレオチドの異なる順序、および／または異なる数の異なる塩基タイプ（すなわち、対称サイクル）を有し得る。しかし、いずれの塩基も、同じサイクルで反復されず、異なるサイクルを区別するためのマーカーとなる。単に例として、第１のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃであり得、第２のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇであり得る。さらに、１つまたは複数のサイクルが、１つまたは複数のヌクレオチドを含まないこともある。単に例として、第１のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｇ－Ｃであり得、第２のサイクルの順序は、Ａ－Ｔ－Ｃであり得る。代替順序を当業者は容易に企図することができる。異なるヌクレオチドの導入と導入の間に、例えば洗浄液でシークエンシングプラットフォームを洗浄することにより、取り込まれていないヌクレオチドを除去することができる。
ポリメラーゼを使用して、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマーの末端に鋳型依存的に取り込むことによりシークエンシングプライマーを伸長させることができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼであることもあり、または合成（例えば、突然変異型）ポリメラーゼであることもある。ポリメラーゼをプライマー伸長の最初のステップで付加させることができるが、補足ポリメラーゼを、必要に応じて、シークエンシング中に、例えば、ヌクレオチドの段階的付加を用いて、またはいくつかのフローサイクル後に、付加させることができる。
取り込まれた標識核酸の存在または非存在を検出して配列を決定することができる。標識は、例えば、光学活性標識（例えば、蛍光標識）または放射性標識であることがあり、標識により放出または変更されたシグナルを、検出器を使用して検出することができる。
フローグラムを、取り込まれたヌクレオチドの検出およびヌクレオチド導入の順序に基づいて生成することができる。例えば、以下の鋳型配列：ＣＴＧおよびＣＡＧ、ならびにＴ－Ａ－Ｃ－Ｇの反復フローサイクルをとる。結果として生じるフローグラムが表１に示され、この表中の１は、導入されたヌクレオチドが組み込まれること示し、０は、導入されたヌクレオチドが組み込まれないことを示す。フローグラムを使用して、鋳型鎖の配列を決定することができる。
Figure 0007302085000001
導入されるヌクレオチドは、鋳型鎖の配列を決定する場合、標識ヌクレオチドを含むことができる。標識は、例えば、蛍光標識であり得る。鋳型ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在を検出することができ、このことによって配列の決定が（例えば、フローグラムを生成することにより）可能になる。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、蛍光部分、発光部分、または他の光出射部分で標識される。一部の実施形態では、標識は、リンカーを介してヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、光化学的または化学的切断反応によって、切断可能である。例えば、標識を、検出後かつ連続ヌクレオチドの取り込み前に切断することができる。一部の実施形態では、標識（またはリンカー）は、ヌクレオチド塩基に結合されるか、または新生ＤＮＡ鎖の延長に干渉しないヌクレオチド上の別の部位に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、ジスルフィドまたはＰＥＧ含有部分を含む。
一部の実施形態では、導入されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドのみを含み、一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約９０％もしくはそれ未満、約８０％もしくはそれ未満、約７０％もしくはそれ未満、約６０％もしくはそれ未満、約５０％もしくはそれ未満、約４０％もしくはそれ未満、約３０％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約５０％であるかもしくはそれより多く、約４０％であるかもしくはそれより多く、約３０％であるかもしくはそれより多く、約２０％であるかもしくはそれより多く、約１０％であるかもしくはそれより多く、約５％であるかもしくはそれより多く、約４％であるかもしくはそれより多く、約３％であるかもしくはそれより多く、約２．５％であるかもしくはそれより多く、約２％であるかもしくはそれより多く、約１．５％であるかもしくはそれより多く、約１％であるかもしくはそれより多く、約０．５％であるかもしくはそれより多く、約０．２５％であるかもしくはそれより多く、約０．１％であるかもしくはそれより多く、約０．０５％であるかもしくはそれより多く、約０．０２５％であるかもしくはそれより多く、または約０．０１％であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約０．０１％～約１００％、例えば、約０．０１％～約０．０２５％、約０．０２５％～約０．０５％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約０．２５％、約０．２５％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０％～１００％未満、または約９０％～約１００％である。
シークエンシングの前に、ポリヌクレオチドは、固体支持体に固定されたプライマーとハイブリダイズされ得る。プライマーは、ポリヌクレオチドの３’および／または５’末端のアダプター領域とハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドを、ハイブリダイズ後に（例えば、ブリッジ増幅または他の増幅技法により）増幅させて、ポリヌクレオチドシークエンシングコロニーを生成することができる。コロニー形成により、検出器が標識ヌクレオチド取り込みをコロニーごとに正確に検出することができるようなシグナル増幅が可能になる。
本明細書に記載される方法に従って使用され得るシークエンシングするためおよび／またはシークエンシングデータを解析するための追加の方法は、米国特許出願第１６／８６４，９７１号、米国特許出願第１６／８６４，９８１号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３１１９６号に記載されており、これらの各々の内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
バーコード領域設計による制御されたプライマー伸長
バーコード領域は、生体試料由来の個々のｍＲＮＡ分子を標識するために使用される人工構築物である。したがって、一部の実施形態では、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外するように設計される。バーコード領域は、例えば、フローシークエンシング法を使用してシークエンシングされ、これにより、シークエンシングプライマーがバーコード領域にわたって伸長することが可能になる。しかし、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する塩基（例えば、アデニンまたはチミン塩基）を含まないので、ホモポリマー領域の塩基に相補的な塩基は、フローシークエンシングサイクル順序から除外され得る一方、バーコード領域は、シークエンシングされ、バーコード領域内でプライマーが伸長される。プライマーが、ホモポリマー領域の開始まで伸長されると、プライマーは、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチド（例えば、非終結ヌクレオチド）を使用して伸長されて、ホモポリマー領域内でプライマーが伸長し得る。ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識であることがあり、標識されていることがあり、または標識および非標識ヌクレオチド（例えば、非終結非標識ヌクレオチド）の混合物であることもある。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチド、例えば、非終結非標識ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドおよび標識ヌクレオチド（例えば、非標識非終結ヌクレオチドおよび標識非終結ヌクレオチド）を含み、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される総ヌクレオチドと比較した標識ヌクレオチドの割合は、ポリヌクレオチドのバーコード領域および／または標的領域内でプライマーを伸長するために使用される割合よりも低い。
一部の実施形態では、ホモポリマー領域は、ポリＡ領域であり、バーコード領域は、アデニン塩基を除外する。一部の実施形態では、ホモポリマー領域は、ポリＴ領域であり、バーコード領域は、チミン塩基を除外する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ；（ｂ）ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する、ステップ；（ｂ）ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠く標識非終結ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非終結ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
シークエンシングプライマーは、ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドとハイブリダイズされて、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成する。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’および／または５’末端にアダプター領域を含むことができ、アダプター領域は、シークエンシングプライマーとハイブリダイズすることができる。
ハイブリダイズされた鋳型が形成されると、プライマーは、例えば、フローシークエンシング法を使用して、バーコード領域にわたって伸長することができる。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。しかし、規定された順序は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を除外するが、プライマーは、バーコード領域内で伸長する。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、ホモポリマー領域中の塩基に相補的な塩基を除く）は、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触し得る。つまり、ヌクレオチドは、所定の順序で、１つずつ付加される。一部の実施形態では、２つまたは３つの異なるヌクレオチドのタイプが同時に使用される。ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。相補的塩基（つまり、付加されるヌクレオチドに相補的）が新たに取り込まれる塩基の位置の反対の位置の鋳型ポリヌクレオチド鎖中に存在する場合、プライマーの鋳型依存的な伸長が起こる。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。したがって、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して繰り返され、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基は、他のものから除外される。このようにして、プライマーは、バーコード領域にわたって伸長されるが、ホモポリマー領域中には伸長しない。したがって、プライマー伸長は、ホモポリマー領域に相補的な塩基が導入されるまで、ホモポリマー領域の開始の前に失速する。
ホモポリマー領域の配列は、一般に、関心をひかないので、プライマーは、例えば、非標識ヌクレオチドを使用することにより、または標識（例えば、蛍光）を検出しないことにより、ヌクレオチドの取り込みの存在または非存在を検出することなく、ホモポリマー領域内で伸長することができる。標識ヌクレオチドは、一般に、より費用がかかり、プライマー伸長が失速するリスクの増加を有し、そのため、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域にわたるプライマー伸長中において、（バーコード領域の配列を決定するために使用される部分と比較して）全ヌクレオチドに対するより低い割合で含まれ得るか、または排除され得る。プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速するようなら、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより除去することができ、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な新鮮なヌクレオチドが添加され得る。
一部の実施形態では、プライマーは、非標識ヌクレオチドを使用してホモポリマー領域内で伸長される。一部の実施形態では、プライマーは、標識ヌクレオチドを使用してホモポリマー領域内で伸長される。一部の実施形態では、プライマーは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドの両方を使用してホモポリマー領域内で伸長される。例えば、一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約９０％もしくはそれ未満、約８０％もしくはそれ未満、約７０％もしくはそれ未満、約６０％もしくはそれ未満、約５０％もしくはそれ未満、約４０％もしくはそれ未満、約３０％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約５０％であるかもしくはそれより多く、約４０％であるかもしくはそれより多く、約３０％であるかもしくはそれより多く、約２０％であるかもしくはそれより多く、約１０％であるかもしくはそれより多く、約５％であるかもしくはそれより多く、約４％であるかもしくはそれより多く、約３％であるかもしくはそれより多く、約２．５％であるかもしくはそれより多く、約２％であるかもしくはそれより多く、約１．５％であるかもしくはそれより多く、約１％であるかもしくはそれより多く、約０．５％であるかもしくはそれより多く、約０．２５％であるかもしくはそれより多く、約０．１％であるかもしくはそれより多く、約０．０５％であるかもしくはそれより多く、約０．０２５％であるかもしくはそれより多く、または約０．０１％であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約０．０１％～約１００％、例えば、約０．０１％～約０．０２５％、約０．０２５％～約０．０５％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約０．２５％、約０．２５％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０％～１００％未満、または約９０％～約１００％である。
バーコード領域のシークエンシングとは対照的に、標的化領域のシークエンシングは、４つすべての塩基が標的領域中に存在し得るので、ホモポリマー領域中に存在する塩基を除外することなく、４つすべての塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の順序付けされた使用を含むことができる。ポリメラーゼを使用して、標識ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーをホモポリマー領域の末端から標的領域中に伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図２Ａは、バーコード領域がホモポリマー領域に存在する同じ塩基を除外する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図２Ｂは、グラフ形式で例示的方法を示す。ステップ２０２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有するポリヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位である。図２Ｂに示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。しかし、バーコード領域は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基を除外する。例えば、ホモポリマー領域がポリＡ配列である場合、異なるバーコードは、Ｔ、Ｃおよび／またはＧの異なる配列を含有するが、Ａを除外する。同様に、ホモポリマー領域がポリＴ配列である場合、異なるバーコードは、Ａ、Ｃおよび／またはＧの異なる配列を含有する。ポリヌクレオチドは、アダプター領域をさらに含むことができ、プライマーはアダプター領域とハイブリダイズする。したがって、プライマー伸長中に、ポリヌクレオチドは、プライマー鎖の伸長からの鋳型鎖として機能する。
図２Ａおよび図２Ｂのステップ２０４で、バーコード領域の配列は、ホモポリマー領域中に存在する同じ塩基の相補的塩基を欠くヌクレオチドを使用して決定される。例えば、バーコード領域は、フローシークエンシング法を使用してシークエンシングされ得る。ヌクレオチドの少なくとも一部が標識される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを含む。
図２Ａおよび図２Ｂのステップ２０６で、プライマーは、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用してホモポリマー領域内で伸長される。ヌクレオチドは、標識されていることがあり、非標識であることがあり、または標識および非標識ヌクレオチドの両方の混合物であることもある。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内のプライマー伸長中のヌクレオチド取り込みの存在または非存在は検出されない。
プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されたら、標的領域の配列は、図２Ａおよび図２Ｂ中のステップ２０８に示されているように、ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。ヌクレオチドの少なくとも一部が、シークエンシング中に標識される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを含む。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスにより、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
ホモポリマー領域内で失速するプライマー伸長
ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法の一部の実施形態では、ホモポリマー領域内のプライマー伸長は、ポリヌクレオチドの他の領域（例えば、バーコード領域および／または標的領域）の配列を決定する場合に使用される標識ヌクレオチドの割合と比較して、標識ヌクレオチドのより高い割合を使用することにより失速する。プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドは、標識ヌクレオチド、または標識および非標識ヌクレオチドの混合物を含むことができる。ヌクレオチドの全量（すなわち、標識および非標識ヌクレオチドの合計）に対する標識ヌクレオチドの割合が増加するにつれて、プライマーを伸長するために使用されるポリメラーゼが失速する可能性が増加する。したがって、プライマー伸長は、標識ヌクレオチドのより高い割合を使用して、ホモポリマー領域内で意図的に失速させることができ、取り込まれていないヌクレオチドを除去することができ、プライマー伸長を、非標識ヌクレオチドを使用して継続することができる。
例えば、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第１の割合で使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な標識ヌクレオチドを、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する第２の割合で使用して、プライマーを伸長するステップであって、第２の割合は、第１の割合よりも大きく、プライマー伸長は、ホモポリマー領域内で失速する、ステップ；（ｄ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ；ならびに（ｅ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識非終結ヌクレオチドおよび非標識非終結ヌクレオチドを、標識非終結ヌクレオチドの全非終結ヌクレオチドに対する第１の割合で使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な標識非終結ヌクレオチドを、標識非終結ヌクレオチドの全非終結ヌクレオチドに対する第２の割合で使用して、プライマーを伸長するステップであって、第２の割合は、第１の割合よりも大きく、プライマー伸長は、ホモポリマー領域内で失速する、ステップ；（ｄ）ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識非終結ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域の末端まで伸長するステップ；ならびに（ｅ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。一部の実施形態では、バーコード領域およびホモポリマー領域の間に介在する塩基は存在しない。したがって、プライマーは、バーコード領域をわたって、必要に応じて標識ヌクレオチドの割合が増加する前にホモポリマー領域中に、伸長することができる。
ハイブリダイズされた鋳型が形成されると、プライマーは、例えば、フローシークエンシング法を使用して、バーコード領域にわたって伸長することができる。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復される。
プライマーがホモポリマー領域まで伸長されたら、プライマーを伸長するために使用される標識ヌクレオチドの割合を増加させて、プライマー伸長を意図的に失速させることができる。標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する割合の増加は、ポリメラーゼが失速する可能性を増加させるので、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する割合は、ホモポリマー領域内のプライマー伸長が失速する場合、バーコード領域および標的化領域の配列を決定するために使用される標識ヌクレオチドの割合よりも高い。つまり、標識ヌクレオチドのバーコード領域の配列を決定するために使用される全ヌクレオチドに対する割合は、標識ヌクレオチドのホモポリマー領域内のプライマーを伸長するために使用される全ヌクレオチドに対する割合よりも低く、その結果、プライマー伸長は、ホモポリマー領域内で失速する。
ポリメラーゼが失速する可能性は、ポリメラーゼのタイプ、標識ヌクレオチドの構造（例えば、標識、または標識およびヌクレオチドの間のリンカーの構造）、および標識ヌクレオチドのプライマー伸長中に使用される全ヌクレオチドに対する割合に依存する。配列決定中（例えば、バーコード領域または標的領域の配列を決定する時）のポリメラーゼの失速は、一般に、望ましくない。しかし、ホモポリマー領域の配列が、一般に、重要でないので、一部の実施形態では、ポリメラーゼは意図的に失速される。したがって、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される標識ヌクレオチドの割合は、ポリマー領域内のプライマー伸長を失速させることにより、一般に、配列（例えば、バーコード領域および／または標的領域の配列）を決定する場合に使用される標識ヌクレオチドの割合よりも高い。プライマー伸長の失速を誘導または制限するために使用される標識ヌクレオチドの割合は、当業者によって容易に選択され得る。例えば、一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約９０％もしくはそれ未満、約８０％もしくはそれ未満、約７０％もしくはそれ未満、約６０％もしくはそれ未満、約５０％もしくはそれ未満、約４０％もしくはそれ未満、約３０％もしくはそれ未満、約２０％もしくはそれ未満、約１０％もしくはそれ未満、約５％もしくはそれ未満、約４％もしくはそれ未満、約３％もしくはそれ未満、約２．５％もしくはそれ未満、約２％もしくはそれ未満、約１．５％もしくはそれ未満、約１％もしくはそれ未満、約０．５％もしくはそれ未満、約０．２５％もしくはそれ未満、約０．１％もしくはそれ未満、約０．０５％もしくはそれ未満、約０．０２５％もしくはそれ未満、または約０．０１％もしくはそれ未満である。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約５０％であるかもしくはそれより多く、約４０％であるかもしくはそれより多く、約３０％であるかもしくはそれより多く、約２０％であるかもしくはそれより多く、約１０％であるかもしくはそれより多く、約５％であるかもしくはそれより多く、約４％であるかもしくはそれより多く、約３％であるかもしくはそれより多く、約２．５％であるかもしくはそれより多く、約２％であるかもしくはそれより多く、約１．５％であるかもしくはそれより多く、約１％であるかもしくはそれより多く、約０．５％であるかもしくはそれより多く、約０．２５％であるかもしくはそれより多く、約０．１％であるかもしくはそれより多く、約０．０５％であるかもしくはそれより多く、約０．０２５％であるかもしくはそれより多く、または約０．０１％であるかまたはそれより多い。一部の実施形態では、全ヌクレオチドと比較して標識ヌクレオチドの部分は、約０．０１％～約１００％、例えば、約０．０１％～約０．０２５％、約０．０２５％～約０．０５％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約０．２５％、約０．２５％～約０．５％、約０．５％～約１％、約１％～約１．５％、約１．５％～約２％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約３％～約４％、約４％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約９０％～１００％未満、または約９０％～約１００％である。
プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速した後、伸長は、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して再開することができる。必要に応じて、標識および非標識ヌクレオチドの両方を使用することができるが、プライマー伸長が失速した後にホモポリマー領域内のプライマー伸長を継続するために使用される標識ヌクレオチドの割合は、プライマー伸長が失速する場合に使用される割合よりも低くなければならず、領域（例えば、バーコード領域および／または標的領域）の配列を決定する場合に使用される割合よりもさらに低くあり得る。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域内のプライマーが失速した後にホモポリマー領域内のプライマーが伸長する場合に使用されない。一部の実施形態では、プライマー伸長が失速した後にホモポリマー領域内のプライマーの伸長を継続するために使用される全ヌクレオチドの約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０１％未満が、標識ヌクレオチドである。
プライマー伸長が失速する可能性は、標識ヌクレオチドの割合を低減または排除することにより低減されるが、プライマー伸長は、プライマー伸長が意図的に失速された場合に含まれる割合に対して標識ヌクレオチドの割合を低減した後も、ホモポリマー領域内で依然として失速し得る。失速後にプライマー伸長を再開するために、取り込まれていないヌクレオチドおよびポリメラーゼを除去することができ（例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより）、次いで、ハイブリダイズされた鋳型を、新鮮な非標識ヌクレオチドおよびポリメラーゼと再び接触させる。このプロセスは、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されるまで、１、２、３、４回またはそれより多くの回数、反復され得る。
プライマーは、標的領域に対して非標識ヌクレオチド（または少ない割合の標識ヌクレオチド）を使用して、ホモポリマー領域の末端まで伸長することができる。標的領域が目的のｍＲＮＡ領域に関連する配列を含むので、シークエンシングは、プライマーが標的領域まで伸長したら、例えば、フローシークエンシング法を使用して、再開される。ポリメラーゼを使用して、標識ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーをホモポリマー領域の末端から標的領域中に伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図３Ａは、プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速する、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図３Ｂは、グラフ形式で例示的方法を示す。ステップ３０２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有するポリヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位であり得る。図３Ｂに示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。
図３Ａおよび図３Ｂのステップ３０４で、バーコード領域の配列は、標識ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。一部の実施形態では、標識および非標識ヌクレオチドの両方が使用される。一部の実施形態では、ホモポリマー領域内のプライマー伸長中のヌクレオチド取り込みの存在または非存在は検出されない。
図３Ａおよび図３Ｂのステップ３０６で、プライマーは、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な標識ヌクレオチドを使用して、ホモポリマー領域内で伸長され、それによって、ホモポリマー領域内のプライマー伸長が失速する。一部の実施形態では、両方のヌクレオチドは、標識および非標識ヌクレオチドの両方を含む。標識ヌクレオチドのプライマーを伸長するために使用される全ヌクレオチドに対する割合は、バーコード領域内でプライマーを伸長するために使用される割合よりも高く、したがって、ホモポリマー領域内のプライマー伸長が失速する。
図３Ａおよび図３Ｂのステップ３０８で、ホモポリマー領域内のプライマー伸長は、プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速した後に、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識ヌクレオチドを使用して、継続する。必要に応じて、標識ヌクレオチドもホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用されるが、プライマー伸長が失速した後にホモポリマー領域内のプライマー伸長を継続するために使用される標識ヌクレオチドの割合は、プライマー伸長が失速する場合に使用される割合よりも低くなければならず、領域（例えば、バーコードおよび／または標的領域）の配列を決定する場合に使用される割合よりもさらに低くあり得る。
プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されたら、標的領域の配列は、図３Ａおよび図３Ｂ中のステップ３１０に示されているように、ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。ヌクレオチドの少なくとも一部が、シークエンシング中に標識される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを含む。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスにより、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
共通フロー長さを有するバーコード領域
ポリヌクレオチドにわたる異なるバーコード領域および異なるバーコード領域をシークエンシングするために使用されるフローシークエンシングサイクルは、プライマーが、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように構成することができる。これは、バーコードが同じ物理的長さ（すなわち、同じ塩基の数）である必要はなく、異なるバーコード領域の、バーコード配列およびサイクル順序によって決定される、フロー長さが同じであるということのみを必要とする。領域のフロー長さは、領域の開始から領域の末端までプライマーが伸長するために必要なサイクルの数である。このようにして、プライマーは、同じフローサイクル内のホモポリマー領域の開始まで伸長し、その結果、ホモポリマー領域内のプライマー伸長は、ポリヌクレオチドにわたって同じ時に開始される。
一部の実施形態では、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。一部の実施形態では、バーコード領域およびホモポリマー領域の間に介在する塩基は存在しない。バーコード領域中の最後の塩基は、一般に、ホモポリマー領域内の塩基とは異なる。
サイクルおよびサイクルの順序は、バーコード領域のシークエンシングの開始前に、予め決定することができる。しかし、バーコード領域のシークエンシング中に使用されるサイクルは、同じ（すなわち、対称サイクル）または異なる（すなわち、非対称サイクル）ことがある。さらに、所与のサイクルは、４つの異なる塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）をすべて含む必要はないが、２つ、３つまたは４つの異なる塩基を含むことができる。つまり、サイクルは、対称サイクルまたは非対称サイクルであり得る。しかし、上記で論じられたように、塩基は同じサイクル内で反復されない。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ；（ｂ）複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように、所定のサイクルおよびポリヌクレオチドのバーコード領域が構成されている、ステップ；（ｃ）非標識ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法があり、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、標的領域は、固有のバーコード領域に関連付けられる、ステップ；（ｂ）複数の所定のサイクルで標識非終結ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように、所定のサイクルおよびポリヌクレオチドのバーコード領域が構成されている、ステップ；（ｃ）非標識非終結ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
ハイブリダイズされた鋳型が形成されると、プライマーは、例えば、フローシークエンシング法を使用して、バーコード領域にわたって伸長することができる。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型をヌクレオチド（標識ヌクレオチド、一部の実施形態では、非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。異なるヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、所与のサイクル内でハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。バーコード領域は、複数の所定のサイクルを使用してシークエンシングされる。バーコード領域をシークエンシングするために使用されるサイクルは、ヌクレオチドのタイプの同じ（すなわち、対称）または異なる（すなわち、非対称）の順序を有することができ、これは、必要に応じて別々に使用される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、所定のサイクルを反復する。所定のサイクルおよびバーコード領域の配列は、プライマーが、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように構成される。これは、任意の所与のポリヌクレオチドについてのホモポリマー領域中へのプライマーの伸長が、複数のポリヌクレオチドのすべてについて、ホモポリマー領域へのプライマーの伸長なしで起こらないように、プライマー伸長を制御する。
プライマーの伸長が、バーコード領域の末端で、プライマーがホモポリマー領域中に伸長する前に制御されるので、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される標識ヌクレオチドの割合を制御することができる。例えば、ホモポリマー領域内のプライマー伸長は、バーコード領域および／または標的領域内でプライマーを伸長するために使用される割合とは異なる標識ヌクレオチドの割合を使用することができる。一部の実施形態では、非標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される。一部の実施形態では、標識および非標識ヌクレオチドの両方は、ホモポリマー領域内でプライマーを伸長するために使用される。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域内のプライマーが失速した後にホモポリマー領域内のプライマーが伸長する場合に使用されない。一部の実施形態では、全ヌクレオチドの約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０１％未満が、ホモポリマー領域内に伸長するために使用される。
プライマー伸長が失速する可能性は、標識ヌクレオチドの割合を低減または排除することにより低減されるが、プライマー伸長は、プライマー伸長が意図的に失速された場合に含まれる割合に対して標識ヌクレオチドの割合を低減した後も、ホモポリマー領域内で依然として失速し得る。失速後にプライマー伸長を再開するために、取り込まれていないヌクレオチドおよびポリメラーゼを除去することができ（例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより）、次いで、ハイブリダイズされた鋳型を、新鮮な非標識ヌクレオチドおよびポリメラーゼと再び接触させる。このプロセスは、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されるまで、１、２、３、４回またはそれより多くの回数、反復され得る。
プライマーは、ホモポリマー領域の末端までおよび標的領域の開始まで伸長することができる。標的領域が目的のｍＲＮＡ領域に関連する配列を含むので、標的領域の配列が、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。ポリメラーゼを使用して、標識ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーをホモポリマー領域の末端から標的領域中に伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図４Ａは、フローサイクルおよびポリヌクレオチドの異なるバーコード領域が、プライマーが、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように構成される、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図４Ｂは、グラフ形式で、同じフロー長さであるが異なるバーコード領域の配列を有する複数のポリヌクレオチドによる、例示的方法を示す。ステップ４０２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有するポリヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位である。図４Ｂの４０２で示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。
図４Ａのステップ４０４で、バーコード領域の配列は、標識ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。一部の実施形態では、標識および非標識ヌクレオチドの両方が使用される。所定のサイクルおよびポリヌクレオチドの異なるバーコード領域は、プライマーが、ホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたってバーコード領域の末端まで伸長されるように構成される。
図４Ｂを見ると、４０４ａで、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされたプライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を、必要に応じて別々に使用される異なる標識ヌクレオチドのタイプと接触させることにより、バーコード領域内で伸長される。ポリメラーゼは、相補的塩基が鋳型鎖中に存在する場合、鋳型依存的にプライマーを伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは除去され、取り込まれたヌクレオチドの存在または非存在が検出されて、シークエンシング情報が得られる。このプロセスを、所定のサイクルを使用して反復して、プライマーがホモポリマー領域の開始まで伸長されるまで、プライマー伸長を継続する。図４Ｂの４０４ｂで示されているように、プライマーは、プライマーがホモポリマー領域中に伸長される前に、複数のポリヌクレオチドにわたるバーコード領域にわたって伸長される。
プライマーは、プライマーが異なるバーコード領域にわたって伸長されるまで、ポリヌクレオチドにわたるホモポリマー領域内に伸長されない。しかし、プライマーがバーコード領域にわたって伸長されたら、図４Ａおよび図４Ｂの４０６に示されているように、プライマーは、ヌクレオチドを使用してホモポリマー領域内で伸長することができる。ヌクレオチドは、標識されていることがあり、非標識であることがあり、または標識および非標識ヌクレオチドの混合物であることもある。ホモポリマー領域の配列は、一般に、関心をひかないので、プライマーは、例えば、非標識ヌクレオチドを使用することにより、または標識（例えば、蛍光）を検出しないことにより、ヌクレオチドの取り込みの存在または非存在を検出することなく、ホモポリマー領域内で伸長することができる。標識ヌクレオチドは、一般に、より費用がかかり、プライマー伸長が失速するリスクの増加を有し、そのため、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域にわたるプライマー伸長中において、（バーコード領域の配列を決定するために使用される部分と比較して）全ヌクレオチドに対するより低い割合で含まれ得るか、または排除され得る。プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速するようなら、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより除去することができ、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な新鮮なヌクレオチドが添加され得る。
プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されたら、標的領域の配列は、図４Ａおよび図４Ｂ中のステップ４１０に示されているように、ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。ヌクレオチドの少なくとも一部が、シークエンシング中に標識される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを含む。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスにより、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
二重プライマーシークエンシング
一部の実施形態では、２つのプライマーを使用して、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定し、第１のプライマーは、バーコード領域の配列まで伸長され、第２のプライマーは、標的領域の配列まで伸長される。第２のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域内でハイブリダイズして、ホモポリマー領域内のプライマー伸長を回避または制限する。プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長の順序は、可逆的である。つまり、バーコード領域の配列を決定するための第１のプライマーの伸長は、標的領域の配列を決定するための第２のプライマーの伸長の前または後に起こり得る。したがって、下記で提供される「第１のプライマー」および「第２のプライマー」の記載は、明確にするためにのみ提供され、プライマーの配列は逆にすることができる。
第２のプライマーは、標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー中の塩基に相補的な塩基を含むホモポリマー領域を含む。例えば、標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＴ領域を含む場合、第２のプライマーはポリＡ領域を含むことができ、または標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＡ領域である場合、第２のプライマーはポリＴ領域を含むことができる。これにより、第２のプライマーが、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域と効率的にハイブリダイズすることが可能になる。プライマーのホモポリマー領域は、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域より、長い、短い、またはおよそ同じ長さであり得る。
一部の実施形態では、第２のプライマーの３’末端は、複数のポリヌクレオチドにわたる標的領域を含むポリヌクレオチド中のホモポリマー領域の５’末端とハイブリダイズしない。したがって、ホモポリマー領域とハイブリダイズされるプライマーは、ホモポリマー領域内で伸長することができ、それによって、プライマーの３’末端をポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端にアラインメントする。プライマーは、標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチドまたは標識ヌクレオチドの混合物を使用して、ホモポリマー領域にわたって伸長することができる。プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速するようなら、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより除去することができ、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な新鮮なヌクレオチドが添加され得る。プライマーがポリヌクレオチドのホモポリマー領域にわたって伸長されたら、ポリヌクレオチドの標的領域は、プライマーを標的領域内でさらに伸長することによって、シークエンシングすることができる。
一部の実施形態では、第２のプライマーは、標的領域および３’アンカーを含むポリヌクレオチドのホモポリマー中の塩基に相補的な塩基を含むホモポリマー領域を含む。３’アンカーは、第２のプライマーのホモポリマー領域の３’末端がポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端とハイブリダイズする可能性を増加させる。３’アンカーは、例えば、第２のプライマーのホモポリマー領域中に存在する塩基以外の塩基を含み得る。したがって、可変塩基は、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端の後の最初の塩基（すなわち、標的領域の最初の塩基）とハイブリダイズすることができる。例えば、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＡ配列である場合、第２のプライマーは、５’－（ポリＴ）－Ｖ－３’［ここで、Ｖは、Ｔ以外の任意の塩基（すなわち、Ｇ、ＣまたはＡ）である］を含み得る。
一部の実施形態では、第２のプライマーは、標的領域および５’アンカーを含むポリヌクレオチドのホモポリマー中の塩基に相補的な塩基を含むホモポリマー領域を含む。必要に応じて、第２のプライマーは、３’アンカーおよび５’アンカーの両方を含み得る。５’アンカーは、例えば、ポリヌクレオチドのアダプター配列に相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、バーコード領域の３’末端の近位に位置し得る）を含むことができる。５’アンカーにより、第２のプライマーのホモポリマー領域は、ホモポリマー領域の３’末端とより近くでハイブリダイズする可能性がより高くなる。ホモポリマー領域および５’アンカーは、リンカー、例えば、ＰＥＧホスホラミダイトリンカーまたは脱塩基デオキシリボースもしくは脱塩基リボースリンカーによって、連結され得る。リンカーの長さは、例えば、バーコード領域とおよそ同じ長さ、バーコード領域より長く、またはバーコード領域よりも短くあり得る。
第１のプライマーは、バーコード領域、およびバーコード領域の３’末端の近位の位置で標的領域を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、３’アダプター領域を含むことができ、第１のプライマーはアダプター領域とハイブリダイズすることができる。第１のプライマーを、バーコード領域内で伸長して、バーコード領域の配列を決定する。
一部の実施形態では、第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズする前に、ハイブリダイズされた鋳型から除去される。プライマーは、例えば、高ｐＨ溶液、例えば、水酸化ナトリウム溶液を使用して、除去することができる。一部の実施形態では、第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズする前に、ハイブリダイズされた鋳型から除去されない。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドを第１のプライマーとハイブリダイズして、第１の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）複数のポリヌクレオチドを第２のプライマーとハイブリダイズして、第２の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、第２のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、第２のプライマーは、ヌクレオチド（標識されていることがあり、非標識であることがあり、またはそれらの混合物であることもある）を使用して、ホモポリマー領域内で伸長される。一部の実施形態では、第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズされる前に、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。一部の実施形態では、第２のプライマーは、第１のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズされる前に、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドを第１のプライマーとハイブリダイズして、第１の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップ；（ｃ）複数のポリヌクレオチドを第２のプライマーとハイブリダイズして、第２の複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、第２のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域を含む、ステップ；ならびに（ｄ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。一部の実施形態では、第２のプライマーは、非終結ヌクレオチド（標識されていることがあり、非標識であることがあり、またはそれらの混合物であることもある）を使用して、ホモポリマー領域内で伸長される。一部の実施形態では、第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズされる前に、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。一部の実施形態では、第２のプライマーは、第１のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズされる前に、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。
図５Ａは、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図５Ｂは、グラフ形式で例示的方法を示す。ステップ５０２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有するポリヌクレオチドは、第１のプライマーとハイブリダイズして、第１のハイブリダイズされた鋳型を形成する。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位であり得る。図５Ｂに示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。
図５Ａおよび図５Ｂのステップ５０４で、バーコード領域の配列は、例えば、フローシークエンシング法を使用して、標識ヌクレオチドを使用して第１のプライマーを伸長することにより、決定される。標識ヌクレオチドは、必要に応じて、非標識ヌクレオチドと組み合わされる。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復される。
図５Ａおよび図５Ｂのステップ５０６で、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な塩基を有するホモポリマー領域を含む第２のプライマーとハイブリダイズされ、それによって、第２のハイブリダイズされた鋳型を形成する。必要に応じて、第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズする前に除去される。一部の実施形態では、第２のプライマーは、ステップ５０８に示されているように、ホモポリマー領域内で伸長され、その結果、プライマーの３’末端がポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端に位置する。これは、例えば、プライマーの鋳型依存的伸長により行われ得る。ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識および／または標識ヌクレオチドは、第２のハイブリダイズされた鋳型と接触され、例えば、ポリメラーゼを使用して、第２のプライマーの末端に取り込まれることができ、それによって、第２のプライマーが伸長する。第２のプライマーは、プライマーの３’末端が、例えば３’アンカーの使用により、ハイブリダイゼーションにおいてポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端に位置するように構成され得るので、ステップ５０８は常に必要というわけではない。
図５Ａおよび図５Ｂのステップ５１０で示されているように、第２のプライマーは、標識（および必要に応じて非標識）ヌクレオチドを使用して、例えば、本明細書に記載されるフローシークエンシング法を使用して、標的領域中に伸長され、それにより、標的領域の配列を決定する。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、必要に応じて、第２のハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドを第２のプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、第２のプライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図５Ｃは、ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる２つのプライマーの配列が、図５Ａに示されている例示的方法と比較して逆である、２つのプライマーを使用するｍＲＮＡ由来の目的の領域の配列を決定するための別の例示的方法のフローチャートを示す。図５Ｄは、グラフ形式で例示的方法を示す。図５Ｃおよび図５Ｄのステップ５１２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有することにより、第１のプライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。第１のプライマーは、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な塩基を有するホモポリマー領域を含む。一部の実施形態では、第２のプライマーは、ステップ５１４に示されているように、ホモポリマー領域内で伸長され、その結果、プライマーの３’末端がポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端に位置する。これは、例えば、プライマーの鋳型依存的伸長により行われ得る。ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識および／または標識ヌクレオチドは、第２のハイブリダイズされた鋳型と接触され、例えば、ポリメラーゼを使用して、第２のプライマーの末端に取り込まれることができ、それによって、第１のプライマーが伸長する。
図５Ｃおよび図５Ｄのステップ５１６で示されているように、第１のプライマーは、標識（および必要に応じて非標識）ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、標的領域中に伸長され、それにより、標的領域の配列を決定する。標的領域のシークエンシング中に、第１のプライマーは、第１のハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、第１のハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくはそれより多くの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドを第１のプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、第１のプライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図５Ｃおよび図５Ｄのステップ５１８で、ポリヌクレオチドは、第２のプライマーとハイブリダイズされて、第２のハイブリダイズされた鋳型を形成する。必要に応じて、伸長した第１のプライマーは、第２のプライマーがポリヌクレオチドとハイブリダイズされる前に除去される。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位であり得る。図５Ｄに示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。
図５Ｃおよび図５Ｄのステップ５２０で、バーコード領域の配列は、例えば、フローシークエンシング法を使用して、標識ヌクレオチドを使用して第１のプライマーを伸長することにより、決定される。標識ヌクレオチドは、必要に応じて、非標識ヌクレオチドと組み合わされる。バーコード領域のシークエンシング中に、第２のプライマーは、第２のハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復される。
切断可能なリンカーを有するプライマー
一部の実施形態では、切断可能なリンカーを有するプライマーを使用して、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する。プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、ならびに第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間の切断可能なリンカーを含む。第１のプライマーセグメントは、プライマーの３’末端の近位にあり、第２のプライマーセグメントは、プライマーの５’末端の近位にある。
第２のプライマーセグメントを伸長して、例えば、フローシークエンシング法を使用してポリヌクレオチドの標的領域をシークエンシングすることができる。本明細書中でさらに論じられるように、一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントは、プライマーが標的領域中に伸長し、プライマー領域の配列を決定する前に、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域の末端まで伸長される。次いで、切断可能なリンカーは切断され得、プライマーの第１のセグメントを伸長して、例えば、フローシークエンシング法を使用してポリヌクレオチドのバーコード領域をシークエンシングすることができる。
第２のプライマーセグメントは、標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー中の塩基に相補的な塩基を含むホモポリマー領域を含む。例えば、標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＴ領域を含む場合、第２のプライマーはポリＡ領域を含むことができ、または標的領域を含むポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＡ領域である場合、第２のプライマーはポリＴ領域を含むことができる。これにより、第２のプライマーが、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域と効率的にハイブリダイズすることが可能になる。プライマーのホモポリマー領域は、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域より、長い、短い、またはおよそ同じ長さであり得る。
一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントの３’末端は、複数のポリヌクレオチドにわたる標的領域を含むポリヌクレオチド中のホモポリマー領域の５’末端とハイブリダイズしない。第２のプライマーセグメントは、ホモポリマー領域内で伸長することができ、それによって、プライマーの３’末端をポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端にアラインメントする。第２のプライマーセグメントは、標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチドまたは標識ヌクレオチドの混合物を使用して、ホモポリマー領域にわたって伸長することができる。プライマー伸長がホモポリマー領域内で失速するようなら、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより除去することができ、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な新鮮なヌクレオチドが添加され得る。第２のプライマーセグメントがポリヌクレオチドのホモポリマー領域にわたって伸長されたら、ポリヌクレオチドの標的領域は、プライマーを標的領域内でさらに伸長することによって、シークエンシングすることができる。
一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントは、標的領域および３’アンカーを含むポリヌクレオチドのホモポリマー中の塩基に相補的な塩基を含むホモポリマー領域を含む。３’アンカーは、第２のプライマーセグメントのホモポリマー領域の３’末端がポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端とハイブリダイズする可能性を増加させる。３’アンカーは、例えば、第２のプライマーセグメントのホモポリマー領域中に存在する塩基以外の塩基を含み得る。したがって、可変塩基は、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端の後の最初の塩基（すなわち、標的領域の最初の塩基）とハイブリダイズすることができる。例えば、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域がポリＡ配列である場合、第２のプライマーは、５’－（ポリＴ）－Ｖ－３’［ここで、Ｖは、Ｔ以外の任意の塩基（すなわち、Ｇ、ＣまたはＡ）である］を含み得る。
切断可能なリンカーは、切断を制御することができる、第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントを共有結合的に連結する、任意の好適なリンカーであり得る。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、ウラシル（Ｕ）塩基を含むポリヌクレオチド配列を含む。ウラシル塩基は、ウラシル特異的切断酵素（例えば、ウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ（登録商標））酵素、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能）を使用して、制御可能に切断することができる。ウラシル塩基はＲＮＡに固有であるので、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはプライマーを切断するリスクはない。
第１のプライマーセグメントは、バーコード領域の５’末端の近位にある配列（例えば、アダプター配列）とハイブリダイズするように構成される。プライマーが切断されたら、第１のプライマーセグメントの３’末端を伸長して、例えば、フローシークエンシング法を使用してバーコード領域の配列を決定することができる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、および第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ；（ｂ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップ；（ｃ）切断可能なリンカーでプライマーを切断するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含み、プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、および第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間に切断可能なリンカーを含む、ステップ；（ｂ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップ；（ｃ）切断可能なリンカーでプライマーを切断するステップ；ならびに（ｄ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、バーコード領域の配列を決定するステップを含む。
図６Ａは、切断可能なプライマーを使用するｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図６Ｂは、グラフ形式で例示的方法を示す。ステップ６０２で、ホモポリマー領域、バーコード領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域を有するポリヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズして、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。プライマーは、第１のプライマーセグメント、ポリヌクレオチドのホモポリマー領域中の塩基に相補的な複数の塩基を含むホモポリマー領域を含む第２のプライマーセグメント、ならびに第１のプライマーセグメントおよび第２のプライマーセグメントの間の切断可能なリンカーを含む。異なるポリヌクレオチドは、異なるバーコード領域および異なる標的領域を含有し、その結果、ポリヌクレオチドにわたる異なる標的領域は、固有分子識別子に関連付けられる。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、第１のプライマーセグメントは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、バーコード領域の３’末端の近位である。図６Ｂに示されているように、ホモポリマー領域は、標的領域およびバーコード領域の間に位置し、バーコード領域は、ホモポリマー領域の３’末端の近位にある。
一部の実施形態では、第２のプライマーセグメントは、ステップ６０４に示されているように、ホモポリマー領域内で伸長され、その結果、プライマーの３’末端がポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端に位置する。これは、例えば、プライマーの鋳型依存的伸長により行われ得る。ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的な非標識および／または標識ヌクレオチドは、第２のハイブリダイズされた鋳型と接触され、例えば、ポリメラーゼを使用して、第２のプライマーの末端に取り込まれることができ、それによって、第２のプライマーが伸長する。第２のプライマーは、プライマーの３’末端が、例えば３’アンカーの使用により、ハイブリダイゼーションにおいてポリヌクレオチドのホモポリマー領域の５’末端に位置するように構成され得るので、ステップ５０４は常に必要というわけではない。
図６Ａおよび図６Ｂのステップ６０６で示されているように、プライマーは、標識（および必要に応じて非標識）ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、標的領域中に伸長され、それにより、標的領域の配列を決定する。標的領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、第１のハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドを第１のプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、第１のプライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
図６Ａおよび図５Ｂのステップ６０８で、プライマーは、切断可能なリンカーで切断される。切断可能なリンカーは、好適な切断試薬と接触させることができ、これは、第１のプライマーセグメントの３’末端を自由にする。必要に応じて、第２のプライマーセグメントは、例えば、高ｐＨ溶液（例えば、水酸化ナトリウムを含有する溶液）を使用して除去される。
図６Ａおよび図６Ｂのステップ６１０で、バーコード領域の配列は、例えば、フローシークエンシング法を使用して、標識ヌクレオチドを使用して第１のプライマーセグメントを伸長することにより、決定される。標識ヌクレオチドは、必要に応じて、非標識ヌクレオチドと組み合わされる。バーコード領域のシークエンシング中に、第２のプライマーは、第２のハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復される。
失速したプライマー伸長の再開
長いホモポリマー領域内のプライマー伸長は、プライマー伸長の失速を生じ得る。ポリメラーゼが、一般に、ネイティブまたはネイティブに近いヌクレオチドを取り込むためにより良く適合されるので、プライマー伸長の失速の可能性は、標識ヌクレオチドの全ヌクレオチドに対する割合の増加につれて大きくなる。それにもかかわらず、プライマー伸長は、十分に長いホモポリマー領域、例えば、一部のｍＲＮＡ分子のポリＡ領域の場合、ネイティブヌクレオチドがプライマー伸長のために使用される場合でさえ失速する傾向がある。
取り込まれていないヌクレオチドを除去すること、およびハイブリダイズされた鋳型を新鮮なヌクレオチドと接触させることにより、プライマー伸長を再開することができる。一部のケースでは、ハイブリダイズされた鋳型は、新鮮なヌクレオチドと接触させる。このプロセスは、プライマーがホモポリマー領域をわたって完全に伸長されることを確実にするために、１、２、３、４、５回またはそれより多くの回数、反復され得る。この戦略は、本明細書に記載される他の戦略と組み合わせて利用されてもよく、プライマーの伸長は、ホモポリマー領域内のプライマーの伸長中に失速し得る。例えば、プライマー伸長は、ポリヌクレオチドがバーコード領域（例えば、ホモポリマー領域中に存在する塩基を除外するバーコード領域、複数のポリヌクレオチド中の他のバーコード領域と共通するフロー長さを有するバーコード領域）を有する場合、プライマー伸長が、ホモポリマー領域内で意図的に失速される場合（例えば、プライマーを伸長するために使用される標識ヌクレオチドの割合を増加させることにより）、または二重プライマーもしくは切断可能なプライマー系を使用する場合に、ホモポリマー領域内で失速および再開し得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）同じ塩基のヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域中に伸長するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていないヌクレオチドを除去する、ステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を１または複数回反復して、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法は、（ａ）ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、ポリヌクレオチドは、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に関連する配列を含む標的領域を含む、ステップ；（ｂ）同じ塩基の非終結ヌクレオチドを使用して、プライマーをホモポリマー領域中に伸長するステップであって、プライマーは、ホモポリマー領域内で失速し、取り込まれていない非終結ヌクレオチドを除去する、ステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）を１または複数回反復して、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長するステップ；ならびに（ｄ）標識非終結ヌクレオチドを使用して、標的領域の配列を決定するステップを含む。
図７Ａは、プライマー伸長がポリヌクレオチドのホモポリマー領域内で失速し、再開される、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定するための例示的方法のフローチャートを示す。図７Ｂは、グラフ形式で例示的方法を示す。下記に記載される例示的方法は、ホモポリマー領域および標的領域を有するポリヌクレオチドを参照するが、ポリヌクレオチドは、追加の領域、例えば、ホモポリマー領域の３’末端の近位にあるバーコード領域をさらに含み得る。
ステップ７０２で、ホモポリマー領域、および目的のｍＲＮＡ領域に関連する（例えば、相補的または同一）配列を含む標的領域（および必要に応じてバーコード領域、これは図７Ｂ中に示されない）を有するポリヌクレオチドは、プライマーとハイブリダイズされて、ハイブリダイズされた鋳型を形成する。ポリヌクレオチドの３’末端は、アダプター領域を含むことができ、プライマーは、ポリヌクレオチドのアダプター領域とハイブリダイズすることができる。アダプター領域は、存在する場合、バーコード領域の３’末端、またはホモポリマー領域の３’末端の近位にあり得る。
バーコード領域が存在する場合、バーコード領域の配列は、ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定することができる。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。ヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーが伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、バーコード領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復される。
図７Ａおよび図７Ｂのステップ７０４で、プライマーは、ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用してホモポリマー領域内で伸長される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、または標識および非標識ヌクレオチドの両方を含む。上記で論じられたように、標識ヌクレオチドの割合が増加するにつれて、プライマー伸長の失速の可能性が増加する。しかし、ヌクレオチドが全体的に非標識である場合でさえ、プライマー伸長は、より長いホモポリマー領域内で伸長する場合に失速し得る。
図７Ａのステップ７０６で、取り込まれていないヌクレオチドが除去される。例えば、ハイブリダイズされた鋳型は、洗浄緩衝液を使用して洗浄され得る。このステップは、プライマー伸長が失速後に再開し得るように、ハイブリダイズされた鋳型を効率的に「リセットする」。
図７Ａおよび図７Ｂのステップ７０８で、ホモポリマー領域内のプライマー伸長は、ステップ７０４および７０６を反復することにより再開される。ホモポリマー領域中に存在する塩基に相補的なヌクレオチドを使用して、ホモポリマー領域内でプライマーがさらに伸長される。ヌクレオチドは、非標識であることがあり、標識されていることがあり、または標識および非標識ヌクレオチドの混合物であることもある。一部の実施形態では、標識ヌクレオチドは、ホモポリマー領域内のプライマーが失速した後にホモポリマー領域内のプライマーが伸長する場合に使用されない。一部の実施形態では、プライマー伸長が失速した後にホモポリマー領域内のプライマーの伸長を継続するために使用される全ヌクレオチドの約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０１％未満が、標識ヌクレオチドである。
ステップ７０４および７０６は、プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長するように、１、２、３、４、５回またはそれより多くの回数、反復され得る。プライマー伸長は、この方法が有効であるために、複数のポリヌクレオチド中のすべてのポリヌクレオチドにおいて、実際に失速しているか、または失速している必要はない。取り込まれていないヌクレオチドは、除去され得、新鮮なヌクレオチドは、失速後にポリメラーゼを再開するため、または先手をとって失速を阻止するために使用され得る。例えば、取り込まれていないヌクレオチドの除去、および新鮮なヌクレオチドを使用するさらなるプライマー伸長は、実際の失速の数に関係なく、定期的または不定期的な間隔で周期的に、例えば、１５秒ごと、３０秒ごと、６０秒ごと、２分ごと、５分ごとなどで、反復することができる。
プライマーがホモポリマー領域にわたって伸長されたら、標的領域の配列は、図７Ａおよび図７Ｂ中のステップ７１０に示されているように、ヌクレオチドを使用して、例えば、フローシークエンシング法を使用して、決定される。ヌクレオチドの少なくとも一部が、シークエンシング中に標識される。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドを含む。バーコード領域のシークエンシング中に、プライマーは、ハイブリダイズされた鋳型を規定された順序でヌクレオチド（標識ヌクレオチド、および必要に応じて非標識ヌクレオチドを含む）と接触させることによって、伸長される。異なるヌクレオチドのタイプ（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）が、ハイブリダイズされた鋳型と別々に接触され得るか、または２つもしくは３つの異なるヌクレオチドのタイプが、同時に使用され得る。ポリメラーゼを使用して、ヌクレオチドをプライマーの３’末端に鋳型依存的に取り込むことができ、それによって、プライマーを伸長する。取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイズされた鋳型を洗浄することにより、除去することができる。次いで、取り込まれた標識ヌクレオチドの存在または非存在は、その位置の配列を決定するために検出される。このプロセスは、標的領域の配列が決定されるまで、ヌクレオチドの順序を使用して反復され、それによって、ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を推測することが可能になる。
ホモポリマー領域内および非ホモポリマー領域内を含む、失速したシークエンシングプライマー伸長を再開するための追加の方法は、この内容が、すべての目的のために参照により本明細書に取り込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３１１９６号に記載されている。
本願の例示的実施形態として提供する以下の非限定的実施例を参照することにより、本願をよりよく理解することができる。以下の実施例を、実施形態をより十分に説明するために提示するが、いかなる点においても本願の広い範囲を限定するものと解釈すべきでない。本願のある特定の実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態を単なる例として提供することは明らかであろう。本発明の趣旨および範囲から逸脱しない非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態に当業者なら想到するであろう。本明細書に記載する実施形態の様々な代替形態を、本明細書に記載する方法を実施する際に利用することができることは、理解されるはずである。
（実施例１）
試料細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、液状溶解物を、遠心分離を使用して分離する。分離した液状溶解物を捕捉用ビーズとともにインキュベートし、各捕捉用ビーズは、１０～３０の連続したチミン塩基を含有するポリＴ領域の５’と融合されたバーコード領域（共通の試料バーコードおよびＵＭＩを含有する）を含有するＤＮＡオリゴマーを含有する。液状溶解物中のｍＲＮＡ分子を、捕捉用ビーズを使用して、捕捉用ビーズを分離および洗浄することにより単離する。ｍＲＮＡ分子を、捕捉用プローブＤＮＡオリゴマーおよび逆転写酵素を使用して逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡ分子は、試料バーコードおよびＵＭＩを有するバーコード領域、ホモポリマーポリＴ領域、ならびに目的のｍＲＮＡ領域に相補的な標的領域（コード領域の少なくとも一部を含む）を含む。バーコード領域は、アデニン塩基を除外するように特異的に設計される。
ｃＤＮＡライブラリーを、アダプター配列をｃＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端に結合させて、シークエンシングライブラリーを生成することにより、シークエンシングのために調製する。シークエンシングライブラリーを、表面に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するシークエンシングアレイ表面に付与する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子のアダプター領域とハイブリダイズする配列を含む。シークエンシングコロニーを、ｃＤＮＡ分子のコピーおよびｃＤＮＡ分子の相補体を生成するブリッジ増幅により形成する。
シークエンシングプライマーをシークエンシング表面に付与し、これは、ｃＤＮＡ分子相補体の３’末端でアダプター領域とハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼもシークエンシング表面に付与し、ＤＮＡポリメラーゼはハイブリダイズされた鋳型に結合する。第１のヌクレオチド（例えば、デオキシ－Ａ、デオキシ－Ｇ、またはデオキシ－Ｃ）、例えば、非終結ヌクレオチドを含有する第１の溶液、およびシークエンシング表面を、洗浄緩衝液を使用して、洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。コロニーにわたる塩基取り込みの存在および非存在は、蛍光検出器を使用して検出する。このプロセスを、フローサイクルを完了するために異なる（すなわち、第２および第３の）ヌクレオチドを各々含有する第２の溶液および第３の溶液を使用して完了し、フローサイクルを反復して、バーコード領域をシークエンシングする。第２および第３の溶液中のヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。このプロセス中に、チミン塩基はサイクルに含まれない。蛍光標識を、各イメージングステップ後に、成長するポリヌクレオチドから切断する。
シークエンシングプライマーがバーコード領域にわたって伸長されたら、１００％の非標識チミジン三リン酸を含有する第４の溶液をシークエンシング表面に付与し、これにより、ホモポリマー領域にわたるプライマーの伸長を開始する。表面を、表面が洗浄緩衝液で洗浄される前の期間、反応させ、プロセスを反復して、失速したプライマー伸長を排除する。これにより、プライマーがポリＡホモポリマー領域をわたって、かつｃＤＮＡ分子相補体の標的領域の開始まで、伸長することが可能になる。
チミンヌクレオチド（約２．５％の蛍光標識および約９７．５％の非標識）を含有する第５の溶液に加えて、第１、第２および第３の溶液を使用して、標的領域をシークエンシングする。溶液をシークエンシング表面に別々に付与し、表面を洗浄し、塩基取り込みの存在または非存在を検出した後、一連のサイクルのために、サイクルにおける次の溶液を付与する。蛍光標識を、各イメージングステップ後に、成長するポリヌクレオチドから切断する。
（実施例２）
試料細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、液状溶解物を、遠心分離を使用して分離する。分離した液状溶解物を捕捉用ビーズとともにインキュベートし、各捕捉用ビーズは、１０～３０の連続したチミン塩基を含有するポリＴ領域の５’と融合されたバーコード領域（共通の試料バーコードおよびＵＭＩを含有する）を含有するＤＮＡオリゴマーを含有する。液状溶解物中のｍＲＮＡ分子を、捕捉用ビーズを使用して、捕捉用ビーズを分離および洗浄することにより単離する。ｍＲＮＡ分子を、捕捉用プローブＤＮＡオリゴマーおよび逆転写酵素を使用して逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡ分子は、試料バーコードおよびＵＭＩを有するバーコード領域、ホモポリマーポリＴ領域、ならびに目的のｍＲＮＡ領域に相補的な標的領域（コード領域の少なくとも一部を含む）を含む。
ｃＤＮＡライブラリーを、アダプター配列をｃＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端に結合させて、シークエンシングライブラリーを生成することにより、シークエンシングのために調製する。シークエンシングライブラリーを、表面に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するシークエンシングアレイ表面に付与する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子のアダプター領域とハイブリダイズする配列を含む。シークエンシングコロニーを、ｃＤＮＡ分子のコピーおよびｃＤＮＡ分子の相補体を生成するブリッジ増幅により形成する。
シークエンシングプライマーをシークエンシング表面に付与し、これは、ｃＤＮＡ分子相補体の３’末端でアダプター領域とハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼもシークエンシング表面に付与する。第１のヌクレオチド（例えば、デオキシ－Ａ、デオキシ－Ｇ、デオキシ－Ｃまたはデオキシ－Ｔ）、例えば、非終結ヌクレオチドを含有する第１の溶液、およびシークエンシング表面を、洗浄緩衝液を使用して、洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。コロニーにわたる塩基取り込みの存在および非存在は、蛍光検出器を使用して検出する。このプロセスを、フローサイクルを完了するために異なる（すなわち、第２、第３および第４の）ヌクレオチドを各々含有する第２、第３および第４の溶液を使用して完了し、フローサイクルを反復して、バーコード領域をシークエンシングする。第２および第３の溶液中のヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。蛍光標識を、各イメージングステップ後に、成長するポリヌクレオチドから切断する。
シークエンシングプライマーがバーコード領域にわたって伸長されたら、８０％の標識チミジン三リン酸を含有する第５の溶液をシークエンシング表面に付与し、これにより、ホモポリマー領域内のプライマーの伸長を、それが迅速に失速する前に、開始する。次いで、シークエンシング表面を洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。
プライマー伸張を失速させた後、１００％の非標識チミジン三リン酸を含有する第６の溶液をシークエンシング表面に付与し、これにより、ホモポリマー領域にわたるプライマーの伸長を開始する。表面を、表面が洗浄緩衝液で洗浄される前の期間、反応させ、プロセスを反復して、失速したプライマー伸長を排除する。これにより、プライマーがポリＡホモポリマー領域をわたって、かつｃＤＮＡ分子相補体の標的領域の開始まで、伸長することが可能になる。
第１、第２、第３および第４の溶液を使用して、標的領域をシークエンシングする。溶液をシークエンシング表面に別々に付与し、表面を洗浄し、塩基取り込みの存在または非存在を検出した後、一連のサイクルのために、サイクルにおける次の溶液を付与する。蛍光標識を、各イメージングステップ後に、成長するポリヌクレオチドから切断する。
（実施例３）
試料細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、液状溶解物を、遠心分離を使用して分離する。分離した液状溶解物を捕捉用ビーズとともにインキュベートし、各捕捉用ビーズは、１０～３０の連続したチミン塩基を含有するポリＴ領域の５’と融合されたバーコード領域（共通の試料バーコードおよびＵＭＩを含有する）を含有するＤＮＡオリゴマーを含有する。液状溶解物中のｍＲＮＡ分子を、捕捉用ビーズを使用して、捕捉用ビーズを分離および洗浄することにより単離する。ｍＲＮＡ分子を、捕捉用プローブＤＮＡオリゴマーおよび逆転写酵素を使用して逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡ分子は、試料バーコードおよびＵＭＩを有するバーコード領域、ホモポリマーポリＴ領域、ならびに目的のｍＲＮＡ領域に相補的な標的領域（コード領域の少なくとも一部を含む）を含む。
バーコード領域は、フローサイクル設計と組み合わせて特異的に設計され、その結果、バーコード領域は、同じフロー長を有する。対応するフローグラムを有する例示的バーコードを表２に示す。４つのバーコードの各々についてのシークエンシングプライマーは、第４のサイクル内でバーコードの末端に達する。
Figure 0007302085000002
ｃＤＮＡライブラリーを、アダプター配列をｃＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端に結合させて、シークエンシングライブラリーを生成することにより、シークエンシングのために調製する。シークエンシングライブラリーを、表面に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するシークエンシングアレイ表面に付与する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子のアダプター領域とハイブリダイズする配列を含む。シークエンシングコロニーを、ｃＤＮＡ分子のコピーおよびｃＤＮＡ分子の相補体を生成するブリッジ増幅により形成する。
シークエンシングプライマーをシークエンシング表面に付与し、これは、ｃＤＮＡ分子相補体の３’末端でアダプター領域とハイブリダイズする。バーコード領域は、フローシークエンシング法を使用して、構成された付与されるヌクレオチドの順序で調べられ、その結果、シークエンシングライブラリーにわたるすべてのバーコードは、プライマーがホモポリマー領域中に伸長される前にシークエンシングされる。簡単には、ＤＮＡポリメラーゼをシークエンシング表面に付与する。第１のヌクレオチド（例えば、デオキシ－Ａ、デオキシ－Ｇ、またはデオキシ－Ｃ）、例えば、非終結ヌクレオチドを含有する第１の溶液が付与され、その後、シークエンシング表面を、洗浄緩衝液を使用して、洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。コロニーにわたる塩基取り込みの存在および非存在は、蛍光検出器を使用して検出する。このプロセスを、フローサイクルを完了するために異なる（すなわち、第２、第３および第４の）ヌクレオチドを各々含有する第２、第３および第４の溶液を、第１の溶液に加えて使用して完了する。複数のフローサイクルを使用して（対称的であり得る）、バーコード領域をシークエンシングする。第２および第３の溶液中のヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。
プライマーは、バーコード領域のシークエンシング中に、ホモポリマー領域まで伸長されるが、バーコード領域および別々に付与されるヌクレオチドの順序は、ホモポリマー領域に達するプライマーのタイミングが制御されるように設計される。シークエンシングプライマーがバーコード領域にわたってホモポリマー領域の開始点まで伸長されたら、１００％の非標識チミジン三リン酸を含有する第５の溶液をシークエンシング表面に付与し、これにより、ホモポリマー領域にわたるプライマーの伸長を開始する。表面を、表面が洗浄緩衝液で洗浄される前の期間、反応させ、プロセスを反復して、失速したプライマー伸長を排除する。これにより、プライマーがポリＡホモポリマー領域をわたって、かつｃＤＮＡ分子相補体の標的領域の開始まで、伸長することが可能になる。
第１、第２、第３および第４の溶液をその後使用して、標的領域をシークエンシングする。溶液をシークエンシング表面に別々に付与し、表面を洗浄し、塩基取り込みの存在または非存在を検出した後、一連のサイクルのために、サイクルにおける次の溶液を付与する。
（実施例４）
試料細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、液状溶解物を、遠心分離を使用して分離する。分離した液状溶解物を捕捉用ビーズとともにインキュベートし、各捕捉用ビーズは、１０～３０の連続したチミン塩基を含有するポリＴ領域の５’末端と融合されたバーコード領域（共通の試料バーコードおよびＵＭＩを含有する）を含有するＤＮＡオリゴマーを含有する。液状溶解物中のｍＲＮＡ分子を、捕捉用ビーズを使用して、捕捉用ビーズを分離および洗浄することにより単離する。ｍＲＮＡ分子を、捕捉用プローブＤＮＡオリゴマーおよび逆転写酵素を使用して逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡ分子は、試料バーコードおよびＵＭＩを有するバーコード領域、ホモポリマーポリＴ領域、ならびに目的のｍＲＮＡ領域に相補的な標的領域（コード領域の少なくとも一部を含む）を含む。
ｃＤＮＡライブラリーを、アダプター配列をｃＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端に結合させて、シークエンシングライブラリーを生成することにより、シークエンシングのために調製する。シークエンシングライブラリーを、表面に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するシークエンシングアレイ表面に付与する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子のアダプター領域とハイブリダイズする配列を含む。シークエンシングコロニーを、ｃＤＮＡ分子のコピーおよびｃＤＮＡ分子の相補体を生成するブリッジ増幅により形成する。
第１のシークエンシングプライマーをシークエンシング表面に付与し、これは、ｃＤＮＡ分子相補体の３’末端でアダプター領域とハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼをシークエンシング表面に付与する。非終結ヌクレオチドであり得る第１のヌクレオチド（例えば、デオキシ－Ａ、デオキシ－Ｇ、デオキシ－Ｃ、またはデオキシ－Ｔ）を含有する第１の溶液、およびシークエンシング表面を、洗浄緩衝液を使用して、洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。コロニーにわたる塩基取り込みの存在および非存在は、蛍光検出器を使用して検出する。このプロセスを、フローサイクルを完了するために異なる（すなわち、第２、第３および第４の）ヌクレオチドを各々含有する第２、第３および第４の溶液を使用して完了し、フローサイクルを反復して、バーコード領域をシークエンシングする。第２および第３の溶液中のヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。
第２のシークエンシングプライマーがシークエンシング表面に付与され、これは、ポリＴホモポリマー領域、およびチミン以外の可変塩基（すなわち、Ａ、ＣまたはＧ）を含有する５’アンカーを含む。つまり、第２のシークエンシングプライマーは、実際には、プライマーの５’末端で可変塩基によってのみ異なって定義される、異なる配列を有する３つの異なるプライマーの混合物である。第２のシークエンシングプライマーは、ｃＤＮＡ相補体のホモポリマー領域とハイブリダイズし、５’アンカーは、標的領域の最初の塩基とハイブリダイズする。第１、第２、第３および第４の溶液を使用して、第２のシークエンシングプライマーを伸長し、ｃＤＮＡ分子相補体の標的領域をシークエンシングする。溶液をシークエンシング表面に別々に付与し、表面を洗浄し、塩基取り込みの存在または非存在を検出した後、一連のサイクルのために、サイクルにおける次の溶液を付与する。
バーコード領域および標的領域が別々のプライマーを使用してシークエンシングされるとしても、配列は、シークエンシング表面の空間座標に基づいて関連付けられ得る。
（実施例５）
試料細胞を、溶解緩衝液を使用して溶解し、液状溶解物を、遠心分離を使用して分離する。分離した液状溶解物を捕捉用ビーズとともにインキュベートし、各捕捉用ビーズは、１０～３０の連続したチミン塩基を含有するポリＴ領域の５’末端と融合されたバーコード領域（共通の試料バーコードおよびＵＭＩを含有する）を含有するＤＮＡオリゴマーを含有する。液状溶解物中のｍＲＮＡ分子を、捕捉用ビーズを使用して、捕捉用ビーズを分離および洗浄することにより単離する。ｍＲＮＡ分子を、捕捉用プローブＤＮＡオリゴマーおよび逆転写酵素を使用して逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。ｃＤＮＡライブラリー中の各ｃＤＮＡ分子は、試料バーコードおよびＵＭＩを有するバーコード領域、ホモポリマーポリＴ領域、ならびに目的のｍＲＮＡ領域に相補的な標的領域（コード領域の少なくとも一部を含む）を含む。
ｃＤＮＡライブラリーを、アダプター配列をｃＤＮＡポリヌクレオチドの５’および３’末端に結合させて、シークエンシングライブラリーを生成することにより、シークエンシングのために調製する。シークエンシングライブラリーを、表面に結合したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有するシークエンシングアレイ表面に付与する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子のアダプター領域とハイブリダイズする配列を含む。シークエンシングコロニーを、ｃＤＮＡ分子のコピーおよびｃＤＮＡ分子の相補体を生成するブリッジ増幅により形成する。
シークエンシングプライマーをシークエンシング表面に付与し、これは、ｃＤＮＡ分子相補体の３’末端でアダプター領域とハイブリダイズする第１のプライマーセグメント、およびｃＤＮＡ分子相補体のホモポリマー領域とハイブリダイズする第２のプライマーセグメントを含む。ウラシルＲＮＡ部分が、第１のプライマーセグメントと第２のプライマーセグメントとを分離している。１００％の非標識チミジン三リン酸を含有する第１の溶液をシークエンシング表面に付与し、これは、第２のプライマーセグメントを、ｃＤＮＡ分子相補体のホモポリマー領域の末端まで伸長する。次いで、取り込まれていないヌクレオチドを、洗浄緩衝液でシークエンシング表面を洗浄することにより除去する。
ヌクレオチド（例えば、デオキシ－Ａ、デオキシ－Ｇ、またはデオキシ－Ｃ）を含有する第２の溶液をシークエンシング表面に付与し、シークエンシング表面を、洗浄緩衝液を使用して、洗浄して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。コロニーにわたる塩基取り込みの存在および非存在は、蛍光検出器を使用して検出する。このプロセスを、フローサイクルを完了するために異なるヌクレオチドを各々含有する第３、第４および第５の溶液を使用して完了し、フローサイクルを反復して、標的領域をシークエンシングする。第２の溶液はチミンを含有しないが、第３、第４または第５のいずれか１つはチミン塩基を含有し得る。第２および第３の溶液中のヌクレオチドは、約２．５％の蛍光標識ヌクレオチドおよび約９７．５％の非標識ヌクレオチドを含有する。
プライマーを、第１および第２のプライマーセグメントの間のウラシル部分を特異的に切るウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ（登録商標））酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能）を含有する第６の溶液を付与することにより切断する。次いで、切断溶液を、洗浄緩衝液を使用して除去する。
次いで、第２、第３、第４および第５の溶液を使用して、第１のプライマーセグメントを伸長し、ｃＤＮＡ分子相補体のバーコード領域をシークエンシングする。溶液をシークエンシング表面に別々に付与し、表面を洗浄し、塩基取り込みの存在または非存在を検出した後、一連のサイクルのために、サイクルにおける次の溶液を付与する。
バーコード領域および標的領域が別々のプライマーを使用してシークエンシングされるとしても、配列は、シークエンシング表面の空間座標に基づいて関連付けられ得る。
（実施例６）
３つの合成試験配列を、非終結型の合成によるシークエンシング法を使用してシークエンシングした。試験ｃＤＮＡ配列は、開始領域、バーコード領域、ホモポリマー領域（Ｃ－Ｃ）および目的の領域を含んでいた。図８Ａを参照されたい。配列３のバーコード領域は、ホモポリマー（例えば、フロー番号１４のＴ－Ｔ－Ｔホモポリマー、フロー番号１６のＧ－Ｇ－Ｇホモポリマー、フロー番号１８のＡ－Ａ－Ａホモポリマー、およびフロー番号３０のＡ－Ａ－Ａ－Ａ－Ａホモポリマー）を含んでいたが、これらのホモポリマーは、Ｃ－Ｃホモポリマー領域とは区別される。ヌクレオチドの異なるフロー順序を使用して、（１）開始領域（Ｔ－Ａ－Ｃ－Ｇのフロー順序、２サイクルを使用する）、（２）バーコード領域（Ｔ－Ｃ－Ａフロー順序、９サイクルを使用する）、および（３）ホモポリマー領域および目的の領域（Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｃのフロー順序、２サイクルを使用する）をシークエンシングした。バーコードは、ホモポリマー領域中に含まれたＣヌクレオチドを除外するように設計された。したがって、バーコードをシークエンシングするために使用されるフロー順序は、相補的なＧヌクレオチドを除外した。さらに、ホモポリマー領域および目的の領域をシークエンシングするために使用されるフロー順序は、目的の領域をシークエンシングする前に、ホモポリマー領域をわたってシークエンシングするためにＧヌクレオチドで開始するように設計された。
図８は、各フロー位置で３つの配列の各々について得られたシークエンシングデータのフローマトリックスを示す。データは、シークエンシングされた分子のヌクレオチドに相補的であるシークエンシング反応にフローされるヌクレオチドに基づいて提供される。下記のフローマトリックスは、シークエンシングされた各分子についてのシグナルトレースである。いずれかの所与の位置におけるより大きなシグナル強度は、示されたフロー位置で取り込まれたヌクレオチドの数がより多いことを示す。
３つの配列すべてのバーコードは、フロー数９～３０で、成功裏にシークエンシングされた。バーコードフローサイクルをフロー３１～３５により継続したが、バーコードは完全にシークエンシングされ、ヌクレオチドはこれらのフロー中に取り込まれなかった。これは、さらに配列３のフロー数３０で生じ、これは、５つの連続するＴヌクレオチドの取り込みを含んでいた（追加のＴヌクレオチドは３３位で取り込まれなかった）。フロー３６で、Ｇヌクレオチドが導入され、これにより、ホモポリマー領域（Ｃ－Ｃ）にわたるシークエンシング鎖の伸長が可能になった。このスキームのさらなる利点は、３つの配列すべてのシークエンシングがフロー３６で同期化されたことである。

Claims (20)

  1. ｍＲＮＡ分子由来の目的の領域の配列を決定する方法であって、
    ｍＲＮＡに由来する複数のポリヌクレオチドをプライマーとハイブリダイズして、複数のハイブリダイズされた鋳型を形成するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、バーコード領域、複数の連続しかつ同一の塩基を含むホモポリマー領域、およびｍＲＮＡ分子由来の目的の領域に由来する配列を含む標的領域を含み、ここで、前記バーコード領域は前記標的領域を固有にバーコードしている、ステップ；
    複数の所定のサイクルで標識ヌクレオチドを使用して、前記バーコード領域の配列を決定するステップであって、前記プライマーが、前記ホモポリマー領域中に伸長される前に、前記複数のポリヌクレオチドにわたって前記バーコード領域の末端まで伸長されるように、前記所定のサイクルおよび前記ポリヌクレオチドの前記バーコード領域が構成されている、ステップ；
    非標識ヌクレオチドを使用して、前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するステップ；ならびに
    標識ヌクレオチドを使用して、前記標的領域の配列を決定するステップ
    を含む方法。
  2. 前記バーコード領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するために使用される前記非標識ヌクレオチドが、非終結非標識ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記バーコード領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、前記同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記プライマーが前記ホモポリマー領域の末端まで伸長されるまで、非標識ヌクレオチドを使用して前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で前記伸長するステップを１または複数回反復することをさらに含み、取り込まれていないヌクレオチドが、前記伸長するステップを反復する前に除去される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記標的領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域中の前記塩基が、アデニンまたはチミン塩基である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも８つの連続する同一の塩基を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ｍＲＮＡ分子の前記目的の領域が、コード領域を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記標的領域の配列を決定するのに使用される前記標識ヌクレオチドが、非終結標識ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記バーコード領域の配列を決定するのにまたは前記標的領域の配列を決定するのに使用される前記ヌクレオチドの５０％またはそれ未満が、標識されている、請求項１に記載の方法。
  13. 前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するのに使用される前記ヌクレオチドの０．１％またはそれ未満が、標識されている、請求項１に記載の方法。
  14. 前記プライマーを前記ホモポリマー領域内で伸長するのに使用される前記ヌクレオチドのすべてが、標識されていない、請求項１に記載の方法。
  15. 前記バーコード領域を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドの異なる塩基が、別々に使用される、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ポリヌクレオチドの前記ホモポリマー領域が、少なくとも５０の連続する同一の塩基を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記バーコード領域が、試料バーコードを含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記バーコード領域の決定された配列を、同じポリヌクレオチド由来のｍＲＮＡコード領域に関連する決定された配列に関連付けるステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  19. 前記ｍＲＮＡ分子の前記目的の領域が、前記ｍＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域または５’－非翻訳領域を含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記標的領域の配列を決定するために使用される前記標識ヌクレオチドが、同じ塩基の非標識ヌクレオチドと混合されている、請求項１に記載の方法。
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