JP7302865B2 - 未成熟卵母細胞の誘導方法及び成熟卵母細胞の作製方法 - Google Patents

未成熟卵母細胞の誘導方法及び成熟卵母細胞の作製方法 Download PDF

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Description

本発明は、未成熟卵母細胞の誘導方法及び成熟卵母細胞の作製方法に関する。
哺乳動物において、一細胞からの個体発生能として定義される全能性は単細胞に備わる特別な性質である。しかしながら、こうした全能性を形成するメカニズムは、不妊治療等の社会的要望が強い分野にも関わらず、難航している。その原因は、胎児卵巣で進行する卵形成過程を体外で再現できないことにある。
発明者らはこれまでにマウス多能性幹細胞から卵母細胞を再構築するインビトロ培養系を開発している。具体的には、マウスＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞をＢＭＰ４等の液性因子を含む培地を用いて始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣｓ）に分化誘導し、得られたＰＧＣＬＣｓを卵巣体細胞と混合させて再構築卵巣を作製する。次いで、該再構築卵巣においてＰＧＣＬＣｓから第２減数分裂中期卵の形成までの期間を「ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化期間」、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長期間」及び「ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟期間」の３つの期間に分割し、それぞれの培養期間において、２次卵胞、卵核胞期卵、第２減数分裂中期卵を得るために最適な培養条件を確立している（例えば、非特許文献１等参照）。
Hikabe O et al., "Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line.", Nature, Vol. 539, p299-303, 2016.
しかしながら、非特許文献１に記載の方法では、マウス多能性幹細胞から原始卵胞の卵母細胞を得るために、３週間以上４週間以下程度の期間が必要であり、また、霊長類やその他大型哺乳動物において多能性幹細胞から卵母細胞をインビトロ培養系で作製するためには１年以上の培養が必要になることが見込まれている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から未成熟卵母細胞を誘導する方法を提供する。また、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から成熟卵母細胞を作製する方法を提供する。
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、卵母細胞の形成に関与する特定の遺伝子を多能性幹細胞に導入し５日間以上１０日間以下程度の短期間培養することで未成熟卵母細胞に分化誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法は、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞、エピブラスト様細胞及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入することを含む。
上記第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法は、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子を前記細胞に導入することを含んでもよい。
上記第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法は、ＳＴＡＴ３の遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含んでもよい。
上記第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法は、ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含んでもよい。
上記第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法は、ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる３種類の遺伝子を前記細胞に更に導入することを含んでもよい。
前記細胞が多能性幹細胞であってもよい。
上記第１態様に係る未成熟卵母細胞の誘導方法において、前記遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されており、
前記導入後に、前記細胞を増殖させることと、
前記増殖後に、前記発現誘導物質を培地に添加し、前記遺伝子の発現を誘導することと、をさらに含んでもよい。
本発明の第２態様に係る成熟卵母細胞の作製方法は、
ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入することと、
導入後の前記細胞及び卵巣体細胞を共培養することと、
を含む。
上記第２態様に係る成熟卵母細胞の作製方法は、ＳＴＡＴ３の遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含んでもよい。
上記態様の未成熟卵母細胞の誘導方法によれば、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から未成熟卵母細胞を誘導することができる。上記態様の成熟卵母細胞の作製方法によれば、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から成熟卵母細胞を大量に作製することができる。
実施例１におけるマウスＥＳ細胞から誘導された未成熟卵母細胞の明視野像及び蛍光像（倍率：２００倍）である。 実施例１における各培養日数での卵母細胞形成遺伝子が導入された多能性幹細胞と卵巣体細胞とからなる凝集塊の蛍光像（倍率：８倍）である。上段では、生殖細胞及び卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａの発現制御下に発現させている改良されたシアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）の蛍光により、卵母細胞を可視化した。下段では、活性化（成熟）卵母細胞マーカーであるＮｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ２（Ｎｐｍ２）の発現制御下に発現させている赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光により、卵母細胞を可視化した。 実施例２におけるマウスｉＰＳ細胞から誘導された未成熟卵母細胞の明視野像及び蛍光像（倍率：８倍）である。 実施例３における卵母細胞形成遺伝子中の重要因子を同定した結果を示す図である。左の図において、縦軸はサンプル名、横軸は卵母細胞形成遺伝子の種類を示している。白抜きの欄は当該遺伝子が導入されていないことを示している。中央の図は、各細胞株から形成された卵母細胞の数を示している。右の図は、各サンプルでのStella遺伝子の下流に発現させている青色蛍光タンパク質CFPの蛍光面積から算出された、卵母細胞の面積を示している。
＜未成熟卵母細胞の誘導方法＞
一実施形態において、本発明は、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞、エピブラスト様細胞及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞（以下、これらの細胞を総じて「卵母細胞への分化能を有する細胞」と称する場合がある）に導入することを含む、未成熟卵母細胞の誘導方法を提供する。
従来の方法では、マウスの場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞から未成熟卵母細胞まで分化誘導するために、１か月弱程度の時間を要し、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏで始原生殖細胞から未成熟卵母細胞まで分化誘導するために、約１１日程度要していた。これに対して、本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法では、多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞に上記４種類の遺伝子を導入し、５日間以上１０日間以下程度の短期間培養することで、未成熟卵母細胞に分化誘導することができる。さらにヒトの場合は、生体では始原生殖細胞から未成熟卵母細胞まで分化誘導するために、９ヶ月以上の期間を有するが、本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法を用いることで、当該期間を劇的に短縮することができる。
また、従来の方法では、多能性幹細胞からＰＧＣＬＣｓに分化誘導し、該ＰＧＣＬＣｓをさらに未成熟卵母細胞に分化誘導するために、培養条件の異なる少なくとも２段階の工程を経る必要があった。これに対して、本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法では、多能性幹細胞を未成熟卵母細胞に直接分化誘導することができる。
なお、本明細書において、「未成熟卵母細胞」とは、卵胞成長を経ていない１次卵母細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｏｏｃｙｔｅ）のことである。未成熟卵母細胞は、必ずしも卵胞構造をとる必要はない。また、未成熟卵母細胞では、後述する実施例に示すように、卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａ遺伝子やＰａｄｉ６遺伝子等の一部の母性効果遺伝子を発現している。
また、本明細書において、「卵胞」とは、卵母細胞とそれを取り巻く体細胞（顆粒膜細胞及び莢膜細胞）とからなるものである。
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法について、以下に詳細を説明する。
［卵母細胞形成遺伝子］
多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞への導入に用いられる卵母細胞形成遺伝子は、発明者らがこれまで卵母細胞系列における遺伝子の発現動態をＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）解析を行なうことで同定したものである。卵母細胞形成遺伝子として具体的には、例えば、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＳＵＢ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１等が挙げられる。後述の実施例に示すように、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子が多能性幹細胞から未成熟卵母細胞への誘導に特に重要である。よって、上述の卵母細胞形成遺伝子の中でも、少なくともＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を細胞に導入することで、卵母細胞への分化能を有する細胞を未成熟卵母細胞に誘導することができる。
また、上記４種類の遺伝子又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質に加えて、ＳＴＡＴ３遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を更に導入することが好ましく、ＳＴＡＴ３遺伝子を更に導入することがより好ましい。後述する実施例に示すように、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２に加えて、ＳＴＡＴ３を細胞に導入することで、卵母細胞の形成率をより向上させることができる。
また、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８、ＴＢＰＬ２及びＳＴＡＴ３の５種類の遺伝子又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質に加えて、さらに、ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を更に導入することが好ましく、ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる３種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を更に導入することがより好ましい。後述する実施例に示すように、上記全８種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を細胞に導入することで、卵母細胞への分化能を有する細胞を未成熟卵母細胞により効率よく誘導することができる。
なお、ＦＩＧＬＡ遺伝子は、複数の卵母細胞特異的遺伝子（卵胞形成に関与する遺伝子及び透明帯（ＺＰ１、ＺＰ２及びＺＰ３）をコードする遺伝子を含む）を調節する塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子をコードしている。転写因子ＦＩＧＬＡは、ＺＰ（ＺＰ１、ＺＰ２及びＺＰ３）プロモーターのＥ－ｂｏｘ（５’－ＣＡＮＮＴＧ－３’）に結合する。ＦＩＧＬＡに関連した疾患としては、例えば、早発卵巣不全（６型）、仮性半陰陽等が挙げられる。ＦＩＧＬＡの遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションには、配列特異的ＤＮＡ結合性及びタンパク質二量体化活性が含まれる。ＦＩＧＬＡの重要なパラログは、ＳＣＸである。ＦＩＧＬＡは、Ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＢＨＬＨ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ、Ｆａｃｔｏｒ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ａｌｐｈａ、Ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＦＩＧａ、ＢＨＬＨＣ８（ＢＨＬＨｃ８）、Ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ、ＦＩＧＡＬＰＨＡ（ＦＩＧａｌｐｈａ）、ＰＯＦ６とも呼ばれる。
ＦＩＧＬＡ遺伝子等の卵母細胞形成遺伝子の塩基配列、該遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列、及び該遺伝子がコードしているタンパク質のアミノ酸配列の情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから入手できる。
ヒトＦＩＧＬＡ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：３４４０１８」として開示されている。ヒトＦＩＧＬＡ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１００４３１１として開示されている。ヒトＦＩＧＬＡのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１００４３１１として開示されている。
マウスＦＩＧＬＡ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：２６９１０」として開示されている。マウスＦＩＧＬＡ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１２０１３として開示されている。マウスＦＩＧＬＡのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０３６１４３として開示されている。
ＮＯＢＯＸ遺伝子は、卵形成に関与する転写因子をコードしている。ＮＯＢＯＸに関連した疾患としては、例えば、早発卵巣不全（５型）等が挙げられる。ＮＯＢＯＸのＧＯアノテーションには、ＤＮＡ結合性転写因子活性及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ近傍プロモーター配列特異的なＤＮＡ結合性が含まれる。具体的には、「５’－ＴＡＡＴＴＧ－３’」、「５’－ＴＡＧＴＴＧ－３’」及び「５’－ＴＡＡＴＴＡ－３’」等の塩基配列に好ましく結合する。ＮＯＢＯＸの重要なパラログは、ＵＮＣＸである。ＮＯＢＯＸは、ＮＯＢＯＸ Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ、Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＯＢＯＸ、Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｏｖａｒｙ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ－Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ、Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｏｖａｒｙ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ－Ｅｎｃｏｄｉｎｇ、ＴＣＡＧ＿１２０４２、ＯＧ－２（ＯＧ２）、ＯＧ２Ｘ、ＰＯＦ５とも呼ばれる。
ヒトＮＯＢＯＸ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：１３５９３５」として開示されている。ヒトＮＯＢＯＸ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１０８０４１３、ＸＭ＿００１１３４４２０として開示されている。ヒトＮＯＢＯＸのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１０７３８８２、ＸＰ＿００１１３４４２０として開示されている。
マウスＮＯＢＯＸ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：１８２９１」として開示されている。マウスＮＯＢＯＸ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿１３０８６９として開示されている。マウスＮＯＢＯＸのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿５７０９３９として開示されている。
ＳＯＨＬＨ１遺伝子は、精子形成、卵形成及び卵胞形成に必須の生殖巣特異的な転写因子の一つであり、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子をコードしている。ＳＯＨＬＨ１は第１減数分裂に影響を与えずに卵母細胞の分化を調整する役割を有する。ＳＯＨＬＨ１に関連した疾患としては、例えば、非閉塞性無精子症、卵巣形成不全等が挙げられる。ＳＯＨＬＨ１のＧＯアノテーションには、ＤＮＡ結合性転写因子活性及びタンパク質二量体化活性が含まれる。ＳＯＨＬＨ１遺伝子の重要なパラログは、ＳＯＨＬＨ２である。ＳＯＨＬＨ１は、Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎｄ Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ １、Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ－Ａｎｄ Ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｓｉｃ Ｈｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２７、Ｃ９ｏｒｆ１５７、ＮＯＨＬＨ、ＴＥＢ２、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ９ Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ １５７、Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｏｖａｒｙ Ｈｅｌｉｘ Ｌｏｏｐ Ｈｅｌｉｘ、ＢＡ１００Ｃ１５．３、ＳＰＡＴＡ２７、ＢＨＬＨｅ８０、ＳＰＧＦ３２、ＯＤＧ５とも呼ばれる。
ヒトＳＯＨＬＨ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０２３８１」として開示されている。ヒトＳＯＨＬＨ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１０１２４１５、ＸＭ＿４９７０８２として開示されている。ヒトＳＯＨＬＨ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１０１２４１５、ＸＰ＿４９７０８２として開示されている。
マウスＳＯＨＬＨ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２７６３１」として開示されており、マウスＳＯＨＬＨ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１００１７１４、ＸＭ＿１３０１８０として開示されており、マウスＳＯＨＬＨ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１００１７１４、ＸＰ＿１３０１８０として開示されている。
ＬＨＸ８は、ＬＩＭホメオボックスファミリーのタンパク質のメンバーであり、様々な組織のパターン形成及び分化に関与している。ＬＩＭホメオボックスファミリーのタンパク質は、ＤＮＡ結合ホメオドメインに加えて、ＬＩＭドメインとして知られている、２つのタンデムに反復したシステインに富んだダブルジンクフィンガーモチーフを含む。ＬＩＭホメオボックスファミリーのタンパク質は、歯の形態形成、卵形成及びニューロン分化に関与する転写因子である。ＬＨＸ８遺伝子に関連した疾患としては、例えば、口蓋裂、歯牙腫等が挙げられる。ＬＨＸ８は、ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ８、ＬＩＭ／Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｈｘ８、ＬＩＭ－Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｈｘ８、ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８、ＬＨＸ７とも呼ばれる。
ヒトＬＨＸ８遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：４３１７０７」として開示されている。ヒトＬＨＸ８遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１００１９３３、ＸＭ＿０８６３４４、ＮＭ＿００１２５６１１４、ＸＭ＿０１７００１３１６、ＸＭ＿０１７００１３１７として開示されている。ヒトＬＨＸ８のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１００１９３３、ＸＰ＿０８６３４４、ＮＰ＿００１２４３０４３、ＸＰ＿０１６８５６８０５、ＸＰ＿０１６８５６８０６として開示されている。
マウスＬＨＸ８遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：１６８７５」として開示されている。マウスＬＨＸ８遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１０７１３、ＸＭ＿００６５０１０７２、ＸＭ＿０１７３１９４７０として開示されている。マウスＬＨＸ８のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０３４８４３、ＸＰ＿００６５０１１３５、ＸＰ＿０１７１７４９５９として開示されている。
ＳＵＢ１遺伝子は、転写調節因子をコードする遺伝子である。ＳＵＢ１は、ＴＡＦと協調して機能し、上流のアクチベーター及び一般的な転写機能間の機能的相互作用を仲介するコアクチベーターとして働く。ＳＵＢ１に関連する疾患としては、例えば、爪白癬等が挙げられる。ＳＵＢ１のＧＯアノテーションには、一本鎖ＤＮＡ結合性が含まれる。ＳＵＢ１は、ＳＵＢ１ Ｈｏｍｏｌｏｇ， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｆａｃｔｏｒ ４、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐ１５、ＰＣ４、Ｐ１４、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｆａｃｔｏｒ ４、ＲＰＯ２ＴＣ１、Ｐ１５とも呼ばれる。
ヒトＳＵＢ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０９２３」として開示されている。ヒトＳＵＢ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００６７１３、ＸＭ＿０１７００８９８６、ＸＭ＿０１７００８９８７、ＸＭ＿０１１５１３９４４として開示されている。ヒトＳＵＢ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００６７０４、ＸＰ＿０１６８６４４７５、ＸＰ＿０１６８６４４７６、ＸＰ＿０１１５１２２４６として開示されている。
マウスＳＵＢ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：２００２４」として開示されている。マウスＳＵＢ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１１２９４、ＸＭ＿００６５２００４２として開示されている。マウスＳＵＢ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０３５４２４、ＸＰ＿００６５２０１０５として開示されている。
ＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーメンバーである。ＳＴＡＴタンパク質ファミリーは、インターフェロン（ＩＦＮ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）等のサイトカイン及び成長因子に応答して、受容体関連キナーゼにリン酸化され、次いで、ホモ又はヘテロダイマーを形成し、それらが転写活性因子として作用する細胞核に移行し、細胞増殖やアポトーシス等の多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている。ＳＴＡＴ３に関連する疾患としては、例えば、幼児期発症多臓器性自己免疫疾患、常染色体優性の高ＩｇＥ症候群等が挙げられる。ＳＴＡＴ３のＧＯアノテーションには、ＤＮＡ結合性転写因子活性及び配列特異的ＤＮＡ結合性が含まれる。ＳＴＡＴ３遺伝子の重要なパラログはＳＴＡＴ１である。ＳＴＡＴ３は、Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ３、Ａｃｕｔｅ－Ｐｈａｓｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｆａｃｔｏｒ、ＡＰＲＦ、Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ Ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３、ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＰＲＦ、ＡＤＭＩＯ１、ＡＤＭＩＯ、ＨＩＥＳとも呼ばれる。
ヒトＳＴＡＴ３遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：６７７４」として開示されている。ヒトＳＴＡＴ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１３６９５１２、ＮＭ＿００１３６９５１３、ＮＭ＿００１３６９５１４、ＮＭ＿００１３６９５１６、ＮＭ＿００１３６９５１７、ＮＭ＿００１３６９５１８、ＮＭ＿００１３６９５１９、ＮＭ＿００１３６９５２０、ＮＭ＿００３１５０、ＮＭ＿１３９２７６、ＮＭ＿２１３６６２、ＸＭ＿０１７０２４９７３、ＸＭ＿０１１５２５１４６、ＸＭ＿０１１５２５１４５、ＸＭ＿０１７０２４９７２、ＸＭ＿００５２５７６１７、ＸＭ＿００５２５７６１６、ＸＭ＿０１７０２４９７５、ＸＭ＿０２４４５０８９６、ＸＭ＿０１７０２４９７４、ＸＭ＿０１７０２４９７６として開示されている。ヒトＳＴＡＴ３のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１３５６４４１、ＮＰ＿００１３５６４４２、ＮＰ＿００１３５６４４３、ＮＰ＿００１３５６４４５、ＮＰ＿００１３５６４４６、ＮＰ＿００１３５６４４７、ＮＰ＿００１３５６４４８、ＮＰ＿００１３５６４４９、ＮＰ＿００３１４１、ＮＰ＿６４４８０５、ＮＰ＿９９８８２７、ＸＰ＿０１６８８０４６２、ＸＰ＿０１１５２３４４８、ＸＰ＿０１１５２３４４７、ＸＰ＿０１６８８０４６１、ＸＰ＿００５２５７６７４、ＸＰ＿００５２５７６７３、ＸＰ＿０１６８８０４６４、ＸＰ＿０２４３０６６６４、ＸＰ＿０１６８８０４６３、ＸＰ＿０１６８８０４６５として開示されている。
マウスＳＴＡＴ３遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：２０８４８」として開示されている。マウスＳＴＡＴ３遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１１４８６、ＮＭ＿２１３６５９、ＮＭ＿２１３６６０、ＸＭ＿０１１２４８８４６、ＸＭ＿０１７３１４４０１として開示されている。マウスＳＴＡＴ３のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０３５６１６、ＮＰ＿９９８８２４、ＮＰ＿９９８８２５、ＸＰ＿０１１２４７１４８、ＸＰ＿０１７１６９８９０として開示されている。
ＴＢＰＬ２遺伝子は、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質様２をコードする遺伝子である。ＴＢＰＬ２は、筋芽細胞の筋細胞への分化を誘導するために、ＴＡＦ３と複合体を形成する転写因子であり、該複合体は、分化の初期段階で特定のプロモーターにおいてＴＦＩＩＤを置換する。ＴＢＰＬ２に関連する疾患としては、例えば、網膜色素変性等が挙げられる。ＴＢＰＬ２のＧＯアノテーションには、ＤＮＡ結合性転写因子活性が含まれる。ＴＢＰＬ２遺伝子の重要なパラログはＴＢＰである。ＴＢＰＬ２は、ＴＡＴＡ－Ｂｏｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｋｅ ２、ＴＡＴＡ Ｂｏｘ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ３、ＴＡＴＡ Ｂｏｘ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＴＢＰ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ３、ＴＢＰ－Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＴＢＰ２、ＴＲＦ３とも呼ばれる。
ヒトＴＢＰＬ２遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：３８７３３２」として開示されている。ヒトＴＢＰＬ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿１９９０４７として開示されている。ヒトＴＢＰＬ２のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿９５０２４８として開示されている。
マウスＴＢＰＬ２遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２７６０６」として開示されている。マウスＴＢＰＬ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１２８９６８９、ＮＭ＿１９９０５９として開示されている。マウスＴＢＰＬ２のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１２７６６１８、ＮＰ＿９５１０１４として開示されている。
ＤＹＮＬＬ１遺伝子は、分子量約１２００ｋＤａの酵素複合体である細胞質ダイニンを構成するタンパク質のうち、軽鎖に分類されるタンパク質をコードする遺伝子である。ＤＹＮＬＬ１に関連する疾患としては、例えば、慢性腸管静脈不全等が挙げられる。ＤＹＮＬＬ１のＧＯアノテーションには、タンパク質ホモ二量体化活性及びタンパク質ドメイン特異的結合性が含まれる。ＤＹＮＬＬ１遺伝子の重要なパラログはＤＹＮＬＬ２である。ＤＹＮＬＬ１は、Ｄｙｎｅｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ ＬＣ８－Ｔｙｐｅ １、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｄｙｎｅｉｎ， Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ， Ｌｉｇｈｔ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １、Ｄｙｎｅｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ １， Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ、８ ＫＤａ Ｄｙｎｅｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ、ＤＮＣＬＣ１、ＤＮＣＬ１、ＤＬＣ１、ＤＬＣ８、ＰＩＮ、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｄｙｎｅｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、Ｈｄｌｃ１（ＨＤＬＣ１）、ＬＣ８ａ、ＬＣ８とも呼ばれる。
ヒトＤＹＮＬＬ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：８６５５」として開示されている。ヒトＤＹＮＬＬ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７４９４、ＮＭ＿００１０３７４９５、ＮＭ＿００３７４６として開示されている。ヒトＤＹＮＬＬ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００１０３２５８３、ＮＰ＿００１０３２５８４、ＮＰ＿００３７３７として開示されている。
マウスＤＹＮＬＬ１遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋの「Ｇｅｎｅ ＩＤ：５６４５５」として開示されている。マウスＤＹＮＬＬ１遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１９６８２として開示されている。マウスＤＹＮＬＬ１のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０６２６５６として開示されている。
［卵母細胞への分化能を有する細胞］
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法で用いられる卵母細胞への分化能を有する細胞としては、多能性幹細胞、エピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞であることが好ましい。
（多能性幹細胞）
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞を意味する。多能性幹細胞としては、以下に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、精巣組織からのＧＳ（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｓｔｅｍ）細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ＧＳ細胞（ｍＧＳ細胞）、骨髄間葉系細胞から単離されるＭｕｓｅ細胞等が挙げられる。なお、ＥＳ細胞は体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であってもよい。上記に列挙した多能性幹細胞は、それぞれ公知の方法により得ることができる。
本明細書において、「ｉＰＳ細胞」とは、分化した体細胞にいくつかの遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞を意味する。本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法で用いられるｉＰＳ細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来であってもよく、樹立細胞株由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系及び内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞として好適である。ｉＰＳ細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、例えば、「Okita K. et al., “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.”, Nature, Vol. 448, p313-317, 2007.」（参考文献１）、「Hamanaka S. et al., “Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells.”, PLoS One, Vol. 6, Issue 7, e22008, 2011.」（参考文献２）等の公知の文献に記載されている調製方法を利用できる。
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法で用いられるＥＳ細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を採取し、当該内部細胞塊を繊維芽細胞に由来するフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。その他、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞も使用することができる。また、後述する実施例に示すように、ＥＳ細胞は、フィーダー細胞を用いずに、２ｉ（２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＤ０３２５９０１及びＣＨＩＲ９９０２１）、並びにＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）を添加した無血清培地で維持培養することができる（参考文献３：「Ying QL et al., “The ground state of embryonic stem cell self-renewal.”, Nature, Vol. 453, No. 7194, p519-523, 2008.」）。
（エピブラスト様細胞）
なお、本明細書において、「エピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）」は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等）から特定の培養条件で分化させた細胞であり、エピブラスト（生体内で始原生殖細胞へと分化する組織）によく似た特徴を有する。
多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞）からＥｐｉＬＣｓを分化誘導する方法は、公知の方法、例えば、特表２０１３－５３８０３８号公報（参考文献４）や、「Hayashi K. et al., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.”, Cell, Vol. 146, No. 4, p519-532, 2011.」（参考文献５）等を参考にして行なうことができる。
（始原生殖細胞）
また、本明細書において、「始原生殖細胞」とは、生殖細胞へ分化する予定の細胞であり、減数分裂を経て最終的に卵子や精子に分化する細胞を意味する。始原生殖細胞は、生体由来のものであってもよく、多能性幹細胞より分化誘導した始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣｓ）であってもよい。生体より始原生殖細胞を回収する場合には、例えば、雌マウスの胎仔（１１．５日齢から１２．５日齢まで）より生殖巣とともに回収することができる。なお、生体より生殖巣を回収する際には、中腎を伴う形で回収してもよく、中腎を切り離しても回収してもよい。
また、上述のとおり、「始原生殖細胞」には多能性幹細胞より分化した始原生殖細胞様細胞が含まれる。多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞）からＰＧＣＬＣｓを分化誘導する方法は、公知の方法、例えば、上記参考文献５等を参考にして行うことができる。
なお、多能性幹細胞由来のＰＧＣＬＣｓを始原生殖細胞として用いる場合には、分化誘導させた多能性幹細胞集団から未分化な状態の細胞を予め取り除くことが好ましい。このような方法は公知であり、例えば、多能性幹細胞に、始原生殖細胞のマーカー遺伝子であるＢｌｉｍｐ１とレポータータンパクとが結合した融合タンパクをコードする核酸を導入しておくことで、多能性幹細胞より分化誘導されたＰＧＣＬＣｓと未分化な細胞とをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法等により容易に分離することができる。
また、「始原生殖細胞」には生体由来の始原生殖細胞や多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した細胞も含まれる。生体由来の始原生殖細胞及び多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞の遺伝子を改変する方法としては、ＣＲＩＳＰＲシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法、相同組み換え法等の公知のゲノム編集法を用いて、目的とする核酸やベクター等の導入を行うことができる。核酸やベクター等の導入法としては、例えば、顕微注入法（マイクロインジェクション）、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いた核酸導入法等が挙げられる。また、外来遺伝子や外来の核酸フラグメントの導入法は、遺伝子改変された始原生殖細胞が本実施形態の方法により機能的な卵母細胞へ分化できる限りにおいて、上記に列挙した方法に限定されない。なお、始原生殖細胞に対する遺伝子改変は、始原生殖細胞の培養期間中の適切なタイミングで行うことができる。例えば、マウスにおいては、１１．５日齢から１２．５日齢までの期間に行うことができる。また、多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞を用いる場合には、始原生殖細胞様細胞への分化誘導前の多能性幹細胞を公知の方法により遺伝子改変することもできる。
中でも、本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法で用いられる卵母細胞への分化能を有する細胞としては、多能性幹細胞が好ましい。特に、ＥＳ細胞を用いた場合には、その増殖能の高さから、大量の未成熟卵母細胞を得ることができる。
また、卵母細胞への分化能を有する細胞は、哺乳動物に由来するものを用いることができる。哺乳動物としては、以下に限定されないが、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、ハムスター、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。
［導入工程］
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法において、上記卵母細胞形成遺伝子は、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入される。
また、卵母細胞形成遺伝子の代わりに、その転写物であるｍＲＮＡ又はその発現タンパク質を導入してもよい。卵母細胞形成遺伝子のｍＲＮＡ及びその発現タンパク質としては、上記Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号で示される塩基配列からなるｍＲＮＡ及びアミノ酸配列からなる発現タンパク質を用いることができる。
導入方法としては、特に限定されず、対象細胞、導入材料の種類（核酸であるのか、或いはタンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。
卵母細胞形成遺伝子を細胞に導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
卵母細胞形成遺伝子のｍＲＮＡを細胞に導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等の、市販のＲＮＡトランスフェクション試薬等を用いる方法が挙げられる。
卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質を細胞に導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
卵母細胞形成遺伝子は、発現ベクターの形で、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入し、一過的に発現させてもよく、卵母細胞形成遺伝子を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞の染色体に組み込んでもよい。中でも、遺伝子を安定して発現させることができることから、卵母細胞形成遺伝子を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞の染色体に組み込むことが好ましい。
卵母細胞形成遺伝子を発現ベクターの形で多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入する場合には、卵母細胞形成遺伝子の塩基配列と、該卵母細胞形成遺伝子の塩基配列の発現を制御するプロモーターを含む発現ベクターを用いることができる。該発現ベクターにおいて、卵母細胞形成遺伝子の塩基配列は、プロモーターに機能的に連結している。また、上記８種の卵母細胞形成遺伝子のうち、使用する遺伝子全てを一つの発現ベクターに組み込んでもよく、それらを１種類ずつ異なるベクターに組み込んでもよいが、中でも、導入効率の観点から、使用する遺伝子全てを一つの発現ベクターに組み込むことが好ましい。
プロモーターとしては、特別な限定はなく、対象細胞において活性を有するものであってもよく、薬剤等により活性を誘導可能な発現誘導型プロモーターであってもよい。
対象細胞において活性を有するプロモーターとしては、例えば、ほぼ全ての細胞において強いプロモーター活性を有する、サイトメガロウイルス・プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＣＭＶ ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ（ＣＡＧプロモーター）等が挙げられる。
発現誘導型プロモーターとしては、人為的にプロモーター活性を制御することのできる、ドキシサイクリン誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター）等が挙げられる。
発現ベクターは、卵母細胞形成遺伝子の塩基配列及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。「マーカー遺伝子」とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子を指す。マーカー遺伝子の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。前記発光酵素遺伝子の具体例としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。前記発色酵素遺伝子の具体例としては、例えば、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。
卵母細胞形成遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
プラスミドベクターは、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞内で発現可能なプラスミドベクターであれば、特に限定されない。例えば、哺乳動物細胞発現用プラスミドベクターとして、一般的に用いられているものを用いることができる。哺乳動物細胞発現用プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＸ４５９、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。
中でも、発現ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。
卵母細胞形成遺伝子を染色体に組み込む場合には、公知のノックインシステムを用いて行なうことができる。公知のノックインシステムとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ等の公知のゲノム編集法で染色体を切断し、相同組換え用のドナーベクターを用いて相同組換えを行なう方法や、トランスポゾンベクターシステムを用いた方法等が挙げられる。
ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。ドナーベクターは、５’アームと３’アームとの間に卵母細胞形成遺伝子の塩基配列（以下、「ノックイン配列」という場合がある）を含むことができる。また、卵母細胞形成遺伝子を安定して発現させるために、セーフ・ハーバー領域内に標的領域を設定することが好ましい。
ドナーベクターは、環状ＤＮＡベクター（例えばプラスミドベクター）であってもよく、線状ＤＮＡベクターであってもよい。ドナーベクターは、ホモロジーアーム及びノックイン配列に加えて、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、例えば、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。マーカー遺伝子としては、上記と同様のものが挙げられる。
ドナーベクターの導入方法は、特に限定されず、対象細胞に応じて、適宜選択することができる。ドナーベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
トランスポゾンベクターシステムでは、後述する実施例に示すように、卵母細胞形成遺伝子の塩基配列が組み込まれたトランスポゾンベクターを細胞に導入し、トランスポザーゼを作用させることにより、容易に細胞の染色体中に組み込むことができる。また、再度トランスポザーゼを作用させることにより、染色体中に組み込まれた上記卵母細胞形成遺伝子の塩基配列を、染色体から切り出し、痕跡を残さずに除去することもできる。トランスポゾンとしては、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｔｏｌ ＩＩ、ｍａｒｉｎｅｒ等が挙げられる。
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法は、上記導入工程に加えて、任意の工程を含んでもよい。任意の工程としては、例えば、細胞を増殖させる工程（増殖工程）や、導入された卵母細胞形成遺伝子、又はその転写物若しくはその発現タンパク質が導入された細胞を選択する工程（選択工程）、導入工程後の細胞を細胞内で卵母細胞形成遺伝子が発現している又は卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質が存在している状態で培養する工程（培養工程）等が挙げられる。また、導入工程において、卵母細胞形成遺伝子を導入する場合には、導入された卵母細胞形成遺伝子の発現を誘導する工程（発現誘導工程）を含むことができる。
［増殖工程］
増殖工程では、より大量の未成熟卵母細胞を得るために、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を増殖させる。
増殖工程では、例えば、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を増殖用培地で培養することで増殖させることができる。増殖用培地としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥｐｉＬＣｓ、始原生殖細胞等を培養するための公知に培地を用いることができるが、これに限定されず、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥｐｉＬＣｓ、始原生殖細胞の培養に適した培地であればどのようなものであってもよい。増殖用培地として具体的には、例えば、後述する実施例において示すように、２ｉ（２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＤ０３２５９０１及びＣＨＩＲ９９０２１）、並びにＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ）を添加した無血清培地等が挙げられる。
増殖工程における培養条件としては、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を培養する公知の条件で行なうことができる。具体的には、例えば、培養温度は３０℃以上３７℃以下程度とすることができる。培養期間は、マウスの場合には、特別な限定はないが、例えば、１日以上１０日以下程度とすることができ、３日以上７日以下程度とすることができる。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
増殖工程は、上記導入工程の前であってもよく、後であってもよい。なお、導入工程の後である場合には、卵母細胞形成遺伝子が発現している又は卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質を存在していると、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞から未成熟卵母細胞への分化誘導が開始されるために、増殖が停止する。そのため、後述する発現誘導工程に示すように、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されている場合には、導入工程の後に、発現誘導物質の非存在下で増殖工程を行なうことができる。
また、一過性の発現ベクターの形で卵母細胞形成遺伝子を導入する場合、又は、卵母細胞形成遺伝子の転写物又は発現タンパク質を導入する場合には、上記導入工程の前に増殖工程を行なうことが好ましい。
［選択工程］
選択工程では、卵母細胞形成遺伝子、又はその転写物若しくはその発現タンパク質が導入された細胞を選択する。
選択工程では、例えば、レポーター遺伝子を用いることで、卵母細胞形成遺伝子、又はその転写物若しくはその発現タンパク質が導入された細胞を選択することができる。具体的には、例えば、卵母細胞形成遺伝子を発現ベクターの形で細胞に導入する場合には、該発現ベクターにレポーター遺伝子を含むことで、細胞内で、卵母細胞形成遺伝子の発現と共に、或いは、卵母細胞形成遺伝子の発現とは独立してレポーター遺伝子を発現させて、細胞を選択することができる。卵母細胞形成遺伝子を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞の染色体に組み込む場合には、卵母細胞形成遺伝子の上流又は下流にレポーター遺伝子を機能的に連結させたコンストラクトを組み込むことで、卵母細胞形成遺伝子の発現と共に、或いは、卵母細胞形成遺伝子の発現とは独立してレポーター遺伝子を発現させて、細胞を選択することができる。卵母細胞形成遺伝子の転写物を導入する場合には、卵母細胞形成遺伝子の転写物の上流又は下流にレポーター遺伝子の転写物を機能的に連結させたコンストラクトを細胞に導入することで、卵母細胞形成遺伝子の発現と共に、レポーター遺伝子を発現させて、細胞を選択することができる。卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質を細胞に導入する場合には、卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質とレポーター遺伝子の発現タンパク質との融合タンパク質を細胞に導入することで、細胞を選択することができる。レポーター遺伝子としては、上記「導入工程」の説明においてマーカー遺伝子として例示されたものを用いることができる。
［発現誘導工程］
上記導入工程において、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されている場合に、発現誘導物質を培地に添加することで、卵母細胞形成遺伝子の発現が誘導される。多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞から未成熟卵母細胞へ分化誘導されると、細胞の増殖が停止する。そのため、より大量の未成熟卵母細胞を得るために、発現誘導工程を行なう前に、増殖工程を行なうことが好ましい。すなわち、卵母細胞形成遺伝子を発現ベクターの形で細胞に導入する場合には、増殖工程、導入工程及び発現誘導工程をこの順で行なうことが好ましい。一方、卵母細胞形成遺伝子を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞の染色体に組み込む場合には、導入工程、増殖工程及び発現誘導工程をこの順で行なうことが好ましい。
卵母細胞形成遺伝子の発現誘導は、例えば、卵母細胞形成遺伝子を発現誘導型プロモーター（例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター））に機能的に連結させた形で細胞に導入し、発現誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）を培地に添加することで卵母細胞形成遺伝子を発現させる方法等が挙げられる。或いは、例えば、後述する実施例に示すように、ＰｒｏｔｅｏＴｕｎｅｒ（登録商標）システム（クロンテック社製）を用いる方法等が挙げられる。具体的には、卵母細胞形成遺伝子の上流又は下流に不安定化ドメイン（Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＤＤ、１２ｋＤａ）をコードする配列を機能的に連結させたコンストラクトを細胞に導入することで、該コンストラクトが発現した融合タンパク質は、発現誘導物質が非存在下では、プロテアソームにより迅速に分解される。一方、発現誘導物質としてプロテアソームによる分解から保護する低分子化合物Ｓｈｉｅｌｄ１（膜透過性の低分子化合物、７５０Ｄａ）を培地に添加することで、卵母細胞形成遺伝子を安定的に発現させ、細胞内に蓄積させることができる。
発現誘導物質の添加量としては、卵母細胞形成遺伝子の発現量が所望の量となるような濃度であればよく、特別な限定はない。例えば、発現誘導物質がドキシサイクリンである場合には、培地中の濃度は例えば１ｎＭ以上１０μＭ以下程度とすることができる。発現誘導物質がＳｈｉｅｌｄ１である場合には、培地中の濃度は例えば１０ｎＭ以上１０μＭ以下程度とすることができる。
発現誘導工程で用いられる培地としては、上記増殖工程で増殖用培地として例示されたものを使用することができる。
［培養工程］
培養工程では、上記導入工程後の細胞を、細胞内で卵母細胞形成遺伝子が発現している又は卵母細胞形成遺伝子の発現タンパク質が存在している状態で培養する。
培養条件としては、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を培養する公知の条件で行なうことができる。具体的には、例えば、培養温度は３０℃以上３７℃以下程度とすることができる。培養期間は、マウスの場合には、１日以上１０日以下程度とすることができ、３日以上７日以下程度とすることができる。
培養工程で用いられる培地としては、上記増殖工程で増殖用培地として例示されたものを使用することができる。なお、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されている場合には、培地に上記発現誘導物質を添加して、細胞内で卵母細胞形成遺伝子が発現している状態で培養する。
好ましい実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法としては、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されており、以下の１）～５）を含む。
１）ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＳＵＢ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２及びＤＹＮＬＬ１からなる群より選ばれる１種以上の卵母細胞形成遺伝子を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞（特に好ましくは、多能性幹細胞）の染色体に導入すること；
２）導入後の細胞を増殖させること；
３）増殖後の細胞のうち、卵母細胞形成遺伝子が染色体に導入された細胞を選択すること；
４）選択後の細胞において、発現誘導物質を培地に添加して、卵母細胞形成遺伝子の発現を誘導すること；
５）発現誘導後の細胞を細胞内で卵母細胞形成遺伝子が発現している状態で培養すること
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法では、上述したように、卵母細胞形成遺伝子、又はその転写物若しくはその発現タンパク質の導入から５日以上１０日以下程度の短い培養期間で、多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞を未成熟卵母細胞に分化誘導することができる。
多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞が未成熟卵母細胞に分化誘導されたことは、公知の卵母細胞のマーカー遺伝子（例えば、Ｓｔｅｌｌａ等）の発現から確認することができる。具体的には、後述する実施例に示すように、卵母細胞のマーカー遺伝子であるＳｔｅｌｌａとレポータータンパク質（例えば、改良されたシアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ））とが結合した融合タンパク質をコードする核酸を予め多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞の染色体に導入しておくことで、Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの発現により検出される蛍光から未成熟卵母細胞に分化誘導されたことを確認することができる。さらに、Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの発現から、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法等により、分化誘導させた細胞集団から未分化な状態の細胞を取り除き、未成熟卵母細胞を容易に分離することができる。
＜成熟卵母細胞の作製方法＞
一実施形態において、本発明は、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＳＵＢ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２及びＤＹＮＬＬ１からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入することと、導入後の前記細胞及び卵巣体細胞を共培養することと、を含む、成熟卵母細胞の作製方法を提供する。
本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法において、卵母細胞形成遺伝子の導入（導入工程）は、上記「未成熟卵母細胞の誘導方法」に記載の導入工程と同じであるため、説明を割愛する。
なお、本明細書において、「成熟卵母細胞」とは、第２減数分裂中期の卵を意味し、２次卵母細胞（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｏｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる。また、成熟卵母細胞では、後述する実施例に示すように、活性化卵母細胞マーカーであるＮｐｍ２遺伝子を発現している。
［凝集塊形成工程］
本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法は、上記「卵母細胞の誘導方法」に記載の導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞、並びに卵巣体細胞を共培養して、凝集塊を形成させる工程（凝集塊形成工程）を含む。
凝集塊形成工程に用いられる卵巣体細胞は、生体の卵巣から採取された体細胞であり、上記多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞と共培養することで、卵胞を構成する顆粒膜細胞や莢膜細胞へ分化する細胞である。
なお、生体の卵巣から体細胞を採取する方法は、上記参考文献５に記載の方法に従って行うことができる。
具体的には、例えば、卵巣から体細胞を採取する方法は、生体より外科的に卵巣を採取し、トリプシン処理等により卵巣を構成する体細胞を解離させることができる。なお、このとき、生体由来の卵巣に内在する生殖細胞を取り除くことが好ましい。卵巣に内在する生殖細胞を取り除く方法は、公知の方法により行うことができ、例えば、抗ＳＳＥＡ１抗体や抗ＣＤ３１抗体を用いたＭａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ法により内在する生殖細胞を取り除くことができる。ここで、卵巣体細胞を採取するため卵巣は胎仔由来のものが好ましい。マウスの場合であれば、例えば、胎齢（「胚齢」ともいう）１２．５日のマウス胎仔由来の生殖巣（卵巣）を使用することができる。また、当業者であれば、本開示及び当該技術分野における技術常識から、由来する動物種により適宜好ましい時期の生殖巣（卵巣）を選択することができる。
凝集塊形成工程において、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞、並びに卵巣体細胞を共培養することで、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞、並びに卵巣体細胞からなる凝集塊が形成させることが好ましい。
導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞、並びに卵巣体細胞からなる凝集塊を作製する方法は、例えば、後述する実施例に示すように、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１５０μＭのアスコルビン酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び５５μＭのメルカプトエタノールを添加したＳ１０培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４ ＳＦＭ、ライフテクノロジーズ社製）中で、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞と卵巣体細胞とを混合及び凝集させて培養することで実施することができる。なお、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されている場合には、培地に上記発現誘導物質を添加して、卵母細胞形成遺伝子が発現している状態で培養する。培養には低吸着の培養皿（例えば、細胞低接着Ｕ底９６ウェルプレート等）を用いることが好ましい。
マウスの場合であれば、例えば、凝集塊を作製するための培養期間を２日以上３日以下程度とすることができ、２日が好ましい。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
また、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞と卵巣体細胞との混合時の割合は、作製された凝集塊が成熟卵胞を形成する限りにおいて限定されないが、例えばマウスの場合においては、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞と卵巣体細胞との細胞数の比を、約２：１とすることが好ましい。
また、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞や卵巣体細胞、又は、卵巣体細胞を含む卵巣は、凍結保存したものを用いることもできる。凍結保存方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、導入工程後の多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞や卵巣体細胞の凍結保存は１０％ＤＭＳＯ溶液や市販の凍結剤（セルバンカー（登録商標）等）を用いた緩慢凍結法等により行うことができる。
なお、本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法で使用される卵巣体細胞は、凝集塊を構成する多能性幹細胞、ＥｐｉＬＣｓ及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞と同一種の哺乳動物に由来するものであっても、異なる種の哺乳動物に由来するものであってもよいが、同一種の哺乳動物に由来するものを用いることが好ましい。哺乳動物としては、上記卵母細胞への分化能を有する細胞の説明において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法は、上記導入工程の後であって、上記凝集塊形成工程の前に、任意の工程を含んでもよい。任意の工程としては、上記「未成熟卵母細胞の誘導方法」に記載の増殖工程、選択工程等が挙げられる。
［培養工程］
また、本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法は、上記凝集塊形成工程の後に、培養工程を含むことができる。
培養工程では、上記凝集塊形成工程後の凝集塊をコラーゲン膜上に移し、培養することが好ましい。
培養条件としては、凝集塊を培養する公知の条件で行なうことができる。具体的には、例えば、培養温度は３０℃以上３７℃以下程度とすることができる。培養期間は、マウスの場合には、７日以上３５日以下程度とすることができ、８日以上３０日以下程度とすることができる。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
培養工程で用いられる培地としては、上記増殖工程で増殖用培地として例示されたものを使用することができる。なお、卵母細胞形成遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されている場合には、培地に上記発現誘導物質を添加して、細胞内で卵母細胞形成遺伝子が発現している状態で培養する。
培養工程後の凝集塊は、２次卵胞構造を有し、卵母細胞を多層化した顆粒膜細胞が取り囲んでおり、さらに、多層化した顆粒膜細胞を取り囲む卵胞膜（ｔｈｅｃａ ｆｏｌｉｃ）が形成され、卵胞膜の内側（ｔｈｅｃａ ｉｎｔｅｒｎａ）を構成している莢膜細胞（ｔｈｅｃａ ｃｅｌｌ）が黄体化ホルモン受容体（ｌｕｔｅｒｉｎｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を、顆粒膜細胞は卵胞刺激ホルモン受容体（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現している。
次いで、培養工程で得られた卵胞を非特許文献１に記載の方法を用いて培養することで、成熟卵母細胞を作製することができる。成熟卵母細胞を得るまでの工程を成長工程と成熟工程とに分けることができる。
［成長工程］
成長工程では、培養工程で得られた卵胞を個々の卵胞に単離して、成長用培地を用いて培養する。
培養条件としては、非特許文献１に記載の条件で行なうことができる。具体的には、例えば、培養温度は３０℃以上３７℃以下程度とすることができる。培養期間は、マウスの場合には、７日以上１５日以下程度とすることができ、８日以上１３日以下程度とすることができる。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
成長用培地しては、非特許文献１に記載の組成の培地を用いることができる。具体的には、例えば、マウスの場合には、培養開始から２日間は、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２％ポリビニルピロリドン（ここまでＳｉｇｍａ社製）、１５０μＭのアスコルビン酸、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭの２－メルカプトエタノール、５５μｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム（ここまでナカライテスク社製）、０．１ＩＵ／ｍＬの卵胞刺激ホルモン（フォリスチム（登録商標）、ＭＳＤ社製）、１５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ１５（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １５）、及び１５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ９）（ここまでＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα－ＭＥＭを用いて卵胞を培養する。次いで、培養開始から２日目に上記組成のうちＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を除いたα－ＭＥＭに交換して、０．１％のＴｙｐｅＩＶコラゲナーゼ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）中で卵胞をインキュベートする。次いで、５％ＦＣＳ含有α－ＭＥＭで数回洗浄した後、卵胞を上記組成のうちＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を除いたα－ＭＥＭを用いて培養開始から１１日目まで培養する。
成長工程後の卵胞は、胞状卵胞構造を有し、卵核胞期の卵を有する卵丘卵母細胞複合体を形成している。
［成熟工程］
成熟工程では、成長工程で得られた卵胞を、成熟用培地を用いて培養する。
培養条件としては、非特許文献１に記載の条件で行なうことができる。具体的には、例えば、培養温度は３０℃以上３７℃以下程度とすることができる。培養期間は、マウスの場合には、７日以上１５日以下程度とすることができ、８日以上１３日以下程度とすることができる。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。
成熟用培地しては、非特許文献１に記載の組成の培地を用いることができる。具体的には、例えば、マウスの場合には、５％ＦＣＳ、２５μｇ／ｍＬのピルビン酸ナトリウム、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ＩＵ／ｍＬの卵胞刺激ホルモン、４ｎｇのＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、及び１．２ＩＵ／ｍＬのｈＣＧ（Ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ、略称：ゴナドトロピン、ＡＳＫＡ社製）を含有するα－ＭＥＭが挙げられる。
成熟工程後の卵胞は、第２減数分裂中期の卵（２次卵母細胞）まで成熟している。
第２減数分裂中期の卵（２次卵母細胞）であることは、例えば、顕微鏡等を用いた目視により第一極体の放出を指標に評価することができる。
得られた成熟卵母細胞（２次卵母細胞）は、不妊治療に好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記方法で得られた成熟卵母細胞を用いる、不妊治療方法を提供する。
また、本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法を用いて得られた成熟卵母細胞は、産業動物の効率的な育種、希少動物の繁殖のために好適に用いられる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記方法で得られた成熟卵母細胞を用いる、産業動物の育種方法又は希少動物の繁殖方法を提供する。
なお、上記適用対象となる動物としては、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、上記に例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本実施形態の成熟卵母細胞の作製方法を用いて得られた成熟卵母細胞は、不妊原因の究明、閉経疾患のメカニズム解明に役立てることができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（ベクターの構築）
ＣＡＧプロモーター及び不安定化ドメイン（ＤＤ）をＣＡＧ－ＤＤ－ｈＴＦＡＰ２Ｃプラスミド（参考文献６：「Kobayashi T et al., “Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.”, Nature, Vol. 546, No. 7658, p416-420, 2017.」）からクローニングし、従来から使用しているＰｉｇｇｙＢＡＣベクター（参考文献７：「Shimamoto S et al., “Hypoxia induces the dormant state in oocytes through expression of Foxo3”, PNAS, https://doi.org/10.1073/pnas.1817223116, 2019.」）に挿入して、ＰＢ－ＣＡＧ－ＤＤベクターを作製した。次いで、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＳＵＢ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２及びＤＹＮＬＬ１の８つの遺伝子のｃＤＮＡを受精後１３．５日齢の雌マウス卵巣のｃＤＮＡから増幅し、インフュージョンＨＤクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＢ－ＣＡＧ－ＤＤベクターにクローニングした。各ｃＤＮＡの増幅は、メーカーのプロトコルに従い、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ又はＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲによって行った。
（ベクターのトランスフェクション）
ＥＳ細胞は、予め、フィーダー細胞を用いずに、２ｉ及びＬＩＦを添加した無血清培地で維持培養しておいた（上記参考文献３参照）。また、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞への分化をモニターできるように、生殖細胞系列の重要な決定因子であるＢｌｉｍｐ１の発現制御下の黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のバリアントであるｍＶｅｎｕｓ（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｖｅｎｕｓ）をコードする遺伝子、生殖細胞及び卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａの発現制御下の改良されたシアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）をコードする遺伝子、並びに、活性化（成熟）卵母細胞マーカーであるＮｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ２（Ｎｐｍ２）の発現制御下の赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｈｅｒｒｙ）をコードする遺伝子が染色体上に挿入されているマウスＥＳ細胞（Ｂｌｉｍｐ１－ｍＶｅｎｕｓ：Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰ：Ｎｐｍ２－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＢＶＳＣＮｍＣ））を用いた。構築した８つの遺伝子を含むＰＢ－ＣＡＧ－ＤＤベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によってｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ ＰＢａｓｅ（ｈｙｐＢａｓｅ）プラスミドと同時にトランスフェクションした。２ｉ及びＬＩＦを添加した無血清培地で５日間ピューロマイシン選択後に単一コロニーを増殖させた。
（未成熟卵母細胞への分化誘導）
次いで、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１５０μＭのアスコルビン酸、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び５５μＭのメルカプトエタノールを添加したＳ１０培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４ ＳＦＭ、ライフテクノロジーズ社製）に０．５μＭのＳｈｉｅｌｄ１（クロンテック社製）を混合した培地（以下、「卵母細胞分化誘導培地」と称する）を分注した細胞低接着Ｕ底９６ウェルプレートに１×１０５個のＥＳ細胞を移し、５日間培養して未成熟卵母細胞に分化誘導させた。共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）下で観察した結果を図１に示す。図１において、「卵母細胞形成遺伝子」とは、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＳＵＢ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２及びＤＹＮＬＬ１の８つの遺伝子を示す。「卵母細胞形成遺伝子発現ＯＦＦ」はＳｈｉｅｌｄ１を含む培地の添加前の細胞であり、「卵母細胞形成遺伝子発現ＯＮ」はＳｈｉｅｌｄ１を含む培地の添加し５日間培養した後の細胞である。
図１から、卵母細胞形成遺伝子の発現がＯＦＦである細胞では、コロニーを形成しており、Ｓｔｅｌｌａの発現制御下で発現されるＥＣＦＰ（Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰ）の蛍光がほとんど見られなかった。これに対して、卵母細胞形成遺伝子の発現がＯＮである細胞では、細胞同士がバラバラに存在し、Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの強い蛍光が検出され、未成熟卵母細胞に分化誘導されたことが示唆された。
（成熟卵母細胞の作製）
次いで、トランスフェクション後、５日間培養し、ピューロマイシンで選択した、単一コロニーのＥＳ細胞（１×１０５個）を上記卵母細胞分化誘導培地で、３×１０４個の受精後１２．５日齢の雌マウス由来の卵巣体細胞と混合して凝集塊を作製して２日間培養した。卵巣体細胞は、予め、非特許文献１等に記載の方法を用いて、受精後１２．５日齢の雌マウスから卵巣を摘出して、当該卵巣から単離されたものを使用した。また、次いで、該凝集塊をトランスウェル－ＣＯＬ膜（Ｃｏａｓｔｅｒ社製）上に移して、上記卵母細胞分化誘導培地で２８日間培養した。培養開始から２、６、８、１０及び１２日目の凝集塊での各マーカーの発現を共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）下で観察した結果を図２に示す。図２において、上段では、生殖細胞及び卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの蛍光により、卵母細胞を可視化した。下段では、活性化（成熟）卵母細胞マーカーであるＮｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ２（Ｎｐｍ２）の発現制御下に発現させている赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｎｐｍ２－ｍＣｈｅｒｒｙ）の蛍光により、卵母細胞を可視化した。
図２から、培養期間を通して、細胞においてＳｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの蛍光は継続して観察された。一方、培養開始から８日目には、Ｎｐｍ２－ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が観察され（図２中の「Ｄａｙ８」下段の矢印参照）、卵母細胞の成熟が進んでいることが示された。
また、培養開始から２８日目に、個々の卵胞を先鋭化タングステン針を用いて手動で単離した。単離された卵胞は、２次卵胞構造を有していた。該卵胞を非特許文献１に記載の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長期間」及び「ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟期間」における培養条件下で培養することで、胞状卵胞を経て第２減数分裂中期卵へと成熟させた。
［実施例２］
マウスｉＰＳ細胞を用いて、ＥＳ細胞と同様に卵母細胞への分化誘導について検討した。
（ベクターのトランスフェクション）
ｉＰＳ細胞は、非特許文献１の論文において樹立されたウイルスバスターにより作製されたマウスＢＶＳＣ ｉＰＳ細胞を用いた。実施例１において構築した５つの遺伝子を含むＰＢ－ＣＡＧ－ＤＤベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によってｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ ＰＢａｓｅ（ｈｙｐＢａｓｅ）プラスミドと同時にマウスＢＶＳＣ ｉＰＳ細胞にトランスフェクションした。２ｉ及びＬＩＦを添加した無血清培地で５日間ピューロマイシン選択後に単一コロニーを増殖させた。
（未成熟卵母細胞への分化誘導）
ベクターをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞を、実施例１と同様の方法を用いて、５日間培養して未成熟卵母細胞に分化誘導させた。
（成熟卵母細胞の作製）
次いで、トランスフェクション後、５日間培養し、ピューロマイシンで選択した、ｉＰＳ細胞（１×１０５個）を上記卵母細胞分化誘導培地で、３×１０４個の受精後１２．５日齢の雌マウス由来の卵巣体細胞と混合して凝集塊を作製して２日間培養した。次いで、該凝集塊をトランスウェル－ＣＯＬ膜（Ｃｏａｓｔｅｒ社製）上に移して、上記卵母細胞分化誘導培地で２１日間培養した。培養開始から２１日目の凝集塊でのＳｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの発現を共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、型番：Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）下で観察した結果を図３に示す。図３において、左側の像は明視野像であり、右側の像は生殖細胞及び卵母細胞マーカーであるＳｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの蛍光により、卵母細胞を可視化した蛍光像である。
図３から、培養開始から２１日目の細胞においてＳｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰの蛍光が観察された。このことから、ｉＰＳ細胞においてもＥＳ細胞と同様に卵母細胞へ分化誘導できたことが確認された。
［実施例３］
（卵母細胞形成遺伝子中の重要因子の同定）
卵母細胞形成遺伝子のうち重要因子である遺伝子を同定するために、図４の左の図に記載の遺伝子の組み合わせとなるように、実施例１と同様の方法を用いて、合計２６種類のベクターを構築した。次いで、実施例１と同様の方法を用いて、マウスＥＳ細胞（Ｂｌｉｍｐ１－ｍＶｅｎｕｓ：Ｓｔｅｌｌａ－ＥＣＦＰ：Ｎｐｍ２－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＢＶＳＣＮｍＣ））に各ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクション後のＥＳ細胞を、実施例１と同様の方法を用いて、５日間培養して未成熟卵母細胞に分化誘導させた。次いで、トランスフェクション後、５日間培養し、ピューロマイシンで選択した、単一細胞由来のＥＳ細胞（１×１０５個）を上記卵母細胞分化誘導培地で、３×１０４個の受精後１２．５日齢の雌マウス由来の卵巣体細胞と混合して凝集塊を作製して２日間培養した。次いで、得られた凝集塊を実施例１と同様の方法を用いて、２１日間培養した。培養後の細胞について、各細胞株から形成された卵母細胞の数を計測した。さらに、Stella遺伝子の下流に発現させている青色蛍光タンパク質CFPの蛍光面積から算出された、卵母細胞の面積を算出した。これらの結果を図４に示す。
図４から、卵母細胞形成遺伝子のうち、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子が多能性幹細胞から未成熟卵母細胞への分化誘導及び卵母細胞の成熟に重要な因子であることが明らかとなった。また、ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子に加えて、ＳＴＡＴ３遺伝子を導入することで、卵母細胞の形成効率がより向上することが明らかとなった。
本実施形態の未成熟卵母細胞の誘導方法によれば、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から未成熟卵母細胞を誘導することができる。上記態様の成熟卵母細胞の作製方法によれば、従来よりも短期間の培養で簡便に多能性幹細胞等の卵母細胞への分化能を有する細胞から成熟卵母細胞を大量に作製することができる。

Claims (9)

  1. ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞、エピブラスト様細胞及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入することを含む、未成熟卵母細胞の誘導方法。
  2. ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子を前記細胞に導入することを含む、請求項１に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  3. ＳＴＡＴ３の遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含む、請求項１又は２に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  4. ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる群より選ばれる１種以上の遺伝子、又はそれらの転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  5. ＳＯＨＬＨ１、ＳＵＢ１及びＤＹＮＬＬ１からなる３種類の遺伝子を前記細胞に更に導入することを含む、請求項４に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  6. 前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  7. 前記遺伝子の発現が発現誘導物質の存在により誘導されるように制御されており、
    前記導入後に、前記細胞を増殖させることと、
    前記増殖後に、前記発現誘導物質を培地に添加し、前記遺伝子の発現を誘導することと、をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の未成熟卵母細胞の誘導方法。
  8. ＦＩＧＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＬＨＸ８及びＴＢＰＬ２からなる４種類の遺伝子、又はそれら転写物若しくは発現タンパク質を多能性幹細胞、エピブラスト様細胞及び始原生殖細胞からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞に導入することと、
    導入後の前記細胞及び卵巣体細胞を共培養することと、
    を含む、成熟卵母細胞の作製方法。
  9. ＳＴＡＴ３の遺伝子、又はその転写物若しくは発現タンパク質を前記細胞に更に導入することを含む、請求項８に記載の成熟卵母細胞の作製方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11845960B2 (en) 2016-09-12 2023-12-19 President And Fellows Of Harvard College Transcription factors controlling differentiation of stem cells
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US11788131B2 (en) 2018-04-06 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Methods of identifying combinations of transcription factors
EP3976804A4 (en) 2019-05-31 2023-01-25 President and Fellows of Harvard College SOX9-INDUCED OLIGODENDROCYTE PROGENITORS
CN114601914B (zh) * 2022-03-09 2023-09-08 中国人民解放军空军军医大学 Pa1蛋白在制备治疗非梗阻性无精症药物中的用途
JP7755342B1 (ja) * 2024-10-02 2025-10-16 株式会社Dioseve 卵子様細胞を製造する方法、及び卵子様細胞
CN119708193B (zh) * 2025-01-07 2025-10-28 中国海洋大学 一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白及其表达方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017047799A1 (ja) 2015-09-17 2017-03-23 学校法人東京農業大学 始原生殖細胞を機能的に成熟した卵母細胞へと分化させる培養方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6331659B1 (en) 1998-01-21 2001-12-18 University Of Hawaii Cumulus cells as nuclear donors
DE19802750A1 (de) 1998-01-26 1999-07-29 Lohmann Therapie Syst Lts Vorrichtung zum Anlocken und Fangen von Insekten
WO2012020687A1 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Kyoto University Method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to germ cells
CN102533764A (zh) * 2011-12-19 2012-07-04 西北农林科技大学 Figla基因启动子序列及其构建的标记载体和应用
CN102533778A (zh) * 2012-01-18 2012-07-04 西北农林科技大学 一种基于Figla基因的超表达促进细胞向雌性生殖细胞分化的方法
US20200362303A1 (en) 2017-11-30 2020-11-19 Kyoto University Maintenance-and-amplification method and differentiation induction method for primordial germ cells/primordial germ cell-like cells
JP6734316B2 (ja) 2018-03-22 2020-08-05 ファナック株式会社 ロボットの動作プログラムの設定装置、ロボット、およびロボットの制御方法
CN110004112B (zh) * 2019-04-18 2023-01-03 宁夏医科大学 一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂ii期的卵母细胞的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017047799A1 (ja) 2015-09-17 2017-03-23 学校法人東京農業大学 始原生殖細胞を機能的に成熟した卵母細胞へと分化させる培養方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene Expression Patterns，2005年，Vol.5，pp.475-482
Genes and Development，2009年，Vol.23，pp.2210-2223
Molecular and Cellular Endocrinology，2015年，Vol.401，pp.189-201
Nature，2016年，Vol.539，pp.299-303
PNAS，2006年，Vol.103, No.21，pp.8090-8095

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