JP7308366B2 - アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子及びその調製方法 - Google Patents

アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子及びその調製方法 Download PDF

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Description

本発明は、手術ナビゲーションシステムに用いられる近赤外蛍光分子及び細胞に対するラベリングやイメージングなどの分野に属し、具体的には、アクティブターゲティング型近赤外蛍光低分子及びその調製方法に関する。
インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ、ＩＣＧ）は、分子量約７７６Ｄａの親水性蛍光トレーサーであり、蛍光トレーサーのほか、肝機能の評価や、心拍出量の評価、眼底血管造影にも広く使用されている。また、ＩＣＧは、波長が７８０ｎｍの近赤外光の照射により、高透過性を持つ波長が８３０ｎｍの蛍光を発光するので、ＩＣＧを利用して深部組織を観察することも可能となる。ＩＣＧは、血液に入ると血漿タンパク質と急速に結合し、タンパクで囲まれるＩＣＧナノ分子を形成する。このようなＩＣＧナノ分子は、ＥＰＲ効果により腫瘍組織に蓄積し、さらに細網内皮系に貪食されるため、腫瘍の部分の可視化やリンパ節追跡が可能になる。また、研究により、ＩＣＧは、患者の短期および長期の合併症の発生リスクを高めることがなく、生物学的に安全であることを見出した。したがって、ＩＣＧの利用により、非侵襲的な深部血管やリンパ管の造影を実現するだけでなく、外科手術での蛍光トレースにも使用することができる。しかしながら、近年の臨床試験や動物試験の結果によると、腫瘍蛍光トレーサーとしてのＩＣＧには以下のような問題点があると報告された。
１）蛍光発光の効率が低い（水溶液での量子収率が１％未満）ため、装置感度に対する要求が高い。中国の医薬品管理規定により、ＩＣＧのヒトへの最大投与量は２ｍｇ／ｋｇ未満とする。従来の文献や我々独自の測定データによると、この投与量では、ヒト腫瘍におけるＩＣＧの濃度範囲が１０～１０００ｎＭであるのに対して、現在のほとんどの装置の有効検出範囲は１０～１０００μＭであり、１０００倍の差がある。
２）臨床現場では、腫瘍組織と正常組織におけるＩＣＧの代謝速度に大きな差がなく、十分な蛍光像のコントラスト（腫瘍組織：正常組織）が得られるまで少なくとも１２時間待つ必要があり、病院や患者の負担が増えることがわかった。
よって、高い蛍光量子収率と、腫瘍へのアクティブターゲティングと、正常組織からの迅速なクリアランスという特性を持つ新世代蛍光トレーサーの開発は、ＩＣＧの実用化の不足を補うことができ、科学的、臨床的に高い価値がある。過去の研究により、インテグリンは、例えば胃癌、卵巣癌、乳癌など、多くの悪性腫瘍細胞の表面や腫瘍組織の新生血管内皮細胞で発現レベルが高く、正常組織の細胞や成熟血管内皮細胞ではほとんど発現しないことがわかった。したがって、腫瘍組織で発現レベルが高いインテグリンへのターゲティングは、高精度な薬物投与を実現できる可能性がある。現在、成熟且つ安全な標的抗腫瘍薬としてのペメトレキセド二ナトリウム及びその誘導体は、細胞表面のインテグリンに強固に結合し、細胞内における葉酸に依存した正常な代謝過程を阻害することで、細胞の複製を抑制し、腫瘍の増殖を抑えることができる。ペメトレキセド二ナトリウムおよびその誘導体は、良好ながんターゲティング特性を備え、より優れた生体内安定性を持つため、近赤外蛍光による低分子への修飾に関して言えばまだ可能性がある。
本発明は、アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光低分子及びその調製方法を提供することを目的とする。その分子の分子式は、以下の通りである。
Figure 0007308366000001
 そのうち、Ｘは、以下の構造から選択されるものである。
Figure 0007308366000002
 Ｙは、Ｓ０４５６及びその誘導体から選択されるものである。
Ｙは、Ｘのチロシン側鎖のフェノール部分とエーテル結合を形成することでＸに結合する。
更に、アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光低分子は、以下の構造を有する。
Figure 0007308366000003
そのうち、Ｍは、Ｈ、ＮａおよびＫから独立して選択されるものである。
例として、次のような分子構造を有する。
Figure 0007308366000004
その調製プロセスは、
Ｓ０４５６を合成するステップＳ１と、
ペメトレキセド標的薬剤を合成、及びＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒを調製するステップＳ２と、
Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－ＴｙｒとＳ０４５６を反応させてＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を生成するステップＳ３と、を含む。
更に、上記ステップＳ１は、ステップＳ１１、ステップＳ１２およびステップＳ１３を含む。
ステップＳ１１において、４－ヒドラジノベンゼンスルホン酸、３－メチル－２－ブタンおよび氷酢酸を混合して、１１０－１３０°Ｃに加熱し、そして、窒素雰囲気下で１６－２０時間還流させ、さらに酢酸エチル中で沈殿させた後、ろ過してピンク色の固形物としての粗生成物を収集し、得られた生成物をメタノールに溶解し、温和な条件で、溶解液を例えば水酸化カリウムとイソプロパノールの溶液に滴下し、粗混合物をろ過、洗浄し、生成物１として褐色の固形物を得た。褐色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000005
ステップＳ１２において、生成物１および１，４－ブタンスルトンを、窒素雰囲気下でトルエン溶液に加え、１００～１２０°Ｃで４０～５５時間加熱し、混合物を室温まで冷却した後、粗混合物をメタノールに入れ、３０分撹拌し、その後、沈殿、ろ過、収集したあと、水：メタノール＝２：１の液に再溶解し、滴下漏斗により溶解液をアセトニトリルにゆっくりと加え、更に沈殿物をろ過、収集し、生成物２としてピンク色の固形物を得た。ピンク色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000006
ステップＳ１３において、生成物２、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ－Ｈａａｃｋ試薬および無水酢酸ナトリウムを、無水エタノール中で窒素雰囲気下で６～８時間還流加熱し、反応生成物を室温まで冷却した後、ろ過し、エタノールおよびメタノールで洗浄、吸引ろ過し、乾燥させ、生成物３として緑色の固形物を収集した。緑色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000007
更に、上記ステップＳ２において、ペメトレキセド標的薬剤を合成するステップは、ペメトレキセド二ナトリウム加水分解酸をＤＭＦに溶解し、フラスコに、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－チロシンｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩、ＤＩＥＡを順に加え、完全に溶解するまで撹拌し、窒素雰囲気で室温で２５－３５分間反応させたあと、反応液をＨＣｌ溶液中に滴下して、薄黄色の沈殿物を生成し、沈殿物を乾燥し、生成物４として固形物を得た。固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000008
Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒを調製するステップは、生成物４を丸底フラスコに入れ、ＴＦＡ水溶液を加え、２時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを入れ、沈殿、ろ過し、真空乾燥して、生成物５を得た。その構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000009
更に、上記ステップＳ３は、
１８～２８℃でＳ０４５６の水溶液にｐＨ１０～１２のＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒトリアニオン溶液を滴下するステップＳ３１と、
反応混合物の温度を８５－９５℃に上昇させ、４０－５５分間攪拌し、７の生成をＴＬＣにてモニターするステップＳ３２と、
生成物の形成が完了したあと、反応混合物を室温まで冷却し、カニューレを介して攪拌中のアセトンに定常流で移し、緑色の沈殿物を得たステップＳ３３と、
沈殿物を真空ポンプによる真空下で、焼結ロートを用いて濾過し、アセトンで洗浄したステップＳ３４と、
緑色の粉末状の固体を乾燥させ、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を得たテップＳ３５と、を含む。
本発明は、従来技術と比較して、以下の利点を有する。
本発明は、アクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の調製方法を開示するものであり、アクティブターゲティング型官能基のアクティブターゲティング型近赤外蛍光低分子としてペメトレキセド二ナトリウムおよびその誘導体を有機全合成で調製した。このアクティブターゲティング近赤外蛍光分子は、高いアクティブ標的指向性、高い特異性、良好な水溶性、高い蛍光量子収率などの優位性を持ち、腫瘍手術のナビゲーションイメージングや細胞ラベリングの分野で大きな発展を遂げる可能性がある。
本発明に係るアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の構造図である。 調製したアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の合成を示すフローチャートである。 調製したアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の蛍光性能（蛍光強度）を示す図である。 調製したアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の蛍光性能（検出限界）を示す図である。 調製したアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子のＳ０４５６の水素スペクトルである。 調製したアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子のＳ０４５６のマススペクトルである。 調製したＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ －Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）－ＯｔＢｕのマススペクトルである。 調製したＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ －Ｔｙｒ－ＯＨのマススペクトルである。 調製したＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ －Ｔｙｒ－Ｓ０４５６のマススペクトルである。 Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ －Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を取り込んだＫＢ細胞の蛍光顕微鏡画像である。
以下、図面を参照しながら本発明の実施例における技術案を明確かつ完全に説明する。なお、説明した実施例は、本発明の実施例の一部に過ぎず、その全てではない。本発明の実施例をもとに、当業者が発明能力を用いることなく得たすべての他の実施例は、いずれも本発明の保護範囲に属する。
図１に示すように、本発明では
Figure 0007308366000010
を母体として、Ｓ０４５６とＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄを、チロシンを介して構造的に連結し、最終的にアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子を形成させる。図１において、ａ部分はＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ構造であり、ｂ部分はチロシン構造であり、ｃ部分はＳ０４５６構造であり、Ｍは、Ｈ、ＮａおよびＫから独立して選択されるものである。
本実施例において、次の構造式を例とする。その合成は下記の通りである。
Figure 0007308366000011
図２に示すように、本発明に係るアクティブターゲティング型近赤外蛍光分子の合成は、以下のステップを含む。
Ｓ０４５６の合成：
（１）４－ヒドラジノベンゼンスルホン酸（１．６ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）、３－メチル－２－ブタン（２．１０ｍｌ、９０ｍｍｏｌ）および氷酢酸（５０ｍｌ）を混合し、１２０°Ｃに加熱し、そして、窒素雰囲気下で１８時間保持した。酢酸エチル中で沈殿させた後、ろ過してピンク色の固形物としての粗生成物を収集した。得られた生成物（６．５ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解した。温和な条件で、溶解液を、例えば水酸化カリウム（１．７ｇ、３０ｍｍｏｌ）とイソプロパノール（２０ｍｌ）の溶液に滴下し、粗混合物をろ過、洗浄して、収率が９７％となる褐色の固形物を得た。褐色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000012
（２）生成物１（２．３ｇ、８．３ｍｍｏｌ）と１，４－ブタンスルトンを、窒素雰囲気下でトルエン溶液に加え、１１０°Ｃまで昇温して、この温度環境で４８時間保持した。混合物を室温まで冷却し、溶媒を析出させた。粗混合物にメタノール（１０ｍｌ）を加え、３０分撹拌した後、ろ過して、粗混合物を収集し、水（１０ｍｌ）：メタノール（５ｍｌ）＝２：１（ｖ／ｖ）の体積比の混合液に溶解させた。滴下漏斗により混合溶液をアセトニトリル（１６０ｍｌ）にゆっくりと加え、更に沈殿物をろ過し、収率が４０％となるピンク色の固形物を収集した。ピンク色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000013
（３）生成物２（１．５ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ－Ｈａａｃｋ試薬（０．５ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）および無水酢酸ナトリウム（０．３４２ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水エタノールで窒素雰囲気下で６時間還流加熱した。反応生成物を室温まで冷却した後、ろ過し、エタノールおよびメタノールで洗浄し、収率が９０％となる緑色の固形物（Ｓ０４５６）を収集した。緑色の固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000014
図５と図６は、Ｓ０４５６の水素スペクトルとマススペクトルをそれぞれ示す。
標的薬剤の合成：
ペメトレキセド二ナトリウム加水分解酸（１．０５ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、溶解まで攪拌し、フラスコに、ＨＡＴＵ（２．００７ｇ、５．２８ｍｍｏｌ）、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－チロシンｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩（Ｏ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１．１６１ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１．３６４ｇ、１０．５６ ｍｍｏｌ）を順に加え、完全に溶解するまで撹拌し、窒素雰囲気で室温で３０分間反応させた。反応液を０．１Ｎ ａｑ．ＨＣｌ（１．０Ｌ、０．１４Ｍ）中に滴下して、薄黄色の沈殿物を生成した。沈殿物を真空乾燥し、収率が９５％となる２．０４ｇの以下の固形物（４）を得た。固形物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000015
図７は、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）－ＯｔＢｕのマススペクトルを示す。
生成物４（２．０４ｇ、３．３４ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れ、ＴＦＡ水溶液（ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９５：５）、１０ｍＬ）を加え、２時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを入れ、沈殿、ろ過して、真空乾燥して、収率が９８％となる１．５０７ｇの生成物を得た。生成物の構造式は、以下のとおりである。
Figure 0007308366000016
図８は、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ －Ｔｙｒ－ＯＨのマススペクトルを示す。
Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６の調製：
２３℃でＳ０４５６（２．９０９ｇ、３．２７６ｍｍｏｌ）を１８ｍＬの水に入れ、さらにｐＨ１１のＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ（１．５０７ｇ、３．２７６ｍｍｏｌ）トリアニオン溶液を滴下した。反応混合物の温度を９０℃に上昇させ、４５分間攪拌し、ＴＬＣにて以下の化合物（６）の生成をモニターした。生成物の形成が完了したあと、反応混合物を室温まで冷却し、カニューレを介して攪拌中のアセトン（０．５Ｌ）に定常流で移し、緑色の沈殿物を得た。その沈殿物を真空ポンプによる真空下で、焼結ロートを用いて濾過し、アセトン（３×５００ ｍＬ）で洗浄した。緑色の粉末状の固体を高真空で１２時間乾燥させ、定量的に化合物（６）（４．３４ｇ）を得た。
Figure 0007308366000017
図３、図４は、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６の蛍光特性を示し、図９は、マススペクトルを示す。
本発明の効果を検証するために、以下の検証実験を行った。
ＫＢ細胞を１ｘ１０－６ ｍｏｌ／ＬのＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を用いて２時間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を２－３回洗浄した後、実験室製の近赤外蛍光顕微鏡でＫＢ細胞を画像化して、白色光画像と蛍光画像を得、図１０に示すようにＩｍａｇｅ－Ｊで画像を合成した。明るいＫＢ細胞は、低分子がＫＢ細胞の葉酸受容体をターゲティングし、励起光の励起により、蛍光強度を検出したことを意味する。
上記記載は、本発明の具体的な実施形態にすぎず、本発明の保護範囲がこれらに限定されない。当業者は、本発明に開示された技術範囲内において、技術案を変更または置換することができ、これらの変更または置換も本発明の保護範囲内に含まれる。このため、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲に示された内容に準ずる。

Claims (9)

  1. アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子であって、その構造式は、以下のとおりであり、
    Figure 0007308366000018
     そのうち、Ｍは、Ｈ、ＮａおよびＫから独立して選択されるものである、アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子。
  2. Ｓ０４５６を合成するステップＳ１と、
    ペメトレキセド標的薬剤を合成、及び以下の式で表されるＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒを調製するステップＳ２と、
    Figure 0007308366000019
     Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－ＴｙｒとＳ０４５６を反応させてＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を生成するステップＳ３と、を含み、
    ステップＳ１は、ステップＳ１１、ステップＳ１２およびステップＳ１３を含み、
    ステップＳ１１において、４－ヒドラジノベンゼンスルホン酸、３－メチル－２－ブタンおよび氷酢酸を混合して、１１０－１３０°Ｃに加熱し、そして、窒素雰囲気下で１６－２０時間還流させ、さらに酢酸エチル中で沈殿させた後、ろ過してピンク色の固形物としての粗生成物を収集し、得られた生成物をメタノールに溶解し、温和な条件で、溶解液を、例えば水酸化カリウムとイソプロパノールの溶液に滴下し、粗混合物をろ過、洗浄して、生成物１として褐色の固形物を得、
    ステップＳ１２において、生成物１および１，４－ブタンスルトンを、窒素雰囲気下でトルエン溶液に加え、１００～１２０°Ｃで４０～５５時間加熱し、混合物を室温まで冷却した後、粗生成物を析出させ、粗混合物をメタノールに入れ、３０分撹拌し、その後、沈殿、ろ過、収集した後、水：メタノール＝２：１の液に再溶解し、滴下漏斗により溶解液をアセトニトリルにゆっくりと加え、更に沈殿物をろ過、収集し、生成物２としてピンク色の固形物を得、
    ステップＳ１３において、生成物２、Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ－Ｈａａｃｋ試薬および無水酢酸ナトリウムを、無水エタノール中で窒素雰囲気下で６～８時間還流加熱し、反応生成物を室温まで冷却した後、ろ過し、エタノールおよびメタノールで洗浄し、生成物３として緑色の固形物を収集した
    ことを特徴とする、アクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  3. 前記ステップＳ２は、ペメトレキセド標的薬剤を合成することは、
    ペメトレキセド二ナトリウム加水分解酸をＤＭＦに溶解し、フラスコに、ＨＡＴＵ、Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－チロシンｔｅｒｔ－ブチルエステル塩酸塩、ＤＩＥＡを順に加え、完全に溶解するまで撹拌し、窒素雰囲気で室温で２５－３５分間反応させた後、反応液をＨＣｌ溶液中に滴下して、薄黄色の沈殿物を生成し、その沈殿物を乾燥し、生成物４として固形物を得たことを含み、
    Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒを調製することは、
    生成物４を丸底フラスコに入れ、トリフルオロ酢酸を加え、２時間撹拌した後、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを入れ、沈殿、ろ過し、真空乾燥して、生成物５を得たことを含む
    ことを特徴とする請求項２に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  4. 前記ステップＳ３は、
    １８～２８℃でＳ０４５６の水溶液にｐＨ１０～１２のＰｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒトリアニオン溶液を滴下するステップＳ３１と、
    反応混合物の温度を８５－９５℃に上昇させ、４０－５５分間攪拌し、７の生成をＴＬＣにてモニターするステップＳ３２と、
    生成物の形成が完了したあと、反応混合物を室温まで冷却し、カニューレを介して攪拌中のアセトンに定常流で移し、緑色の沈殿物を得たステップＳ３３と、
    沈殿物を真空ポンプによる真空下で、焼結ロートを用いて濾過し、アセトンで洗浄したステップＳ３４と、
    緑色の粉末状の固体を乾燥させ、Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ－Ｔｙｒ－Ｓ０４５６を得たステップＳ３５と、
    を含むことを特徴とする請求項２に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  5. 前記生成物１の構造式は、
    Figure 0007308366000020
     となることを特徴とする請求項２に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  6. 前記生成物２の構造式は、
    Figure 0007308366000021
     となることを特徴とする請求項２に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  7. 前記生成物３の構造式は、
    Figure 0007308366000022
     となることを特徴とする請求項２に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  8. 前記生成物４の構造式は、
    Figure 0007308366000023
     となることを特徴とする請求項３に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
  9. 前記生成物５の構造式は、
    Figure 0007308366000024
     となることを特徴とする請求項３に記載のアクティブターゲティング型葉酸受容体近赤外蛍光分子の調整方法。
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