JP7318931B2 - 高発現性ｍＲＮＡスイッチ - Google Patents

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Description

本発明は細胞内での発現量が高い高発現性mRNAスイッチに関する。
多細胞生物の組織や器官は、多種類の細胞で構成されている。ヒトは、６０兆（６ｘ１０１３）個もの細胞から構成され、その種類は、成熟細胞だけでも４００種以上にも及ぶ。これらの細胞については、個々の細胞の機能を解析するだけでなくて、医療応用のための細胞調製において、細胞種を判別したり、同定したりする技術が重要になってきている。
本発明者らは、細胞内在性のマイクロRNA（miRNA）に応答してタンパク質を発現するmiRNA応答性mRNAを開発し、これにより、miRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法を開発してきた（例えば、特許文献１）。また、これに先立って、特定のタンパク質の発現に応答して、他のタンパク質を発現するタンパク質応答性mRNAを開発してきた（例えば、特許文献２）。
miRNA応答性mRNAや、タンパク質応答性mRNAなどのmRNAスイッチの細胞内への導入にあたっては、天然のmRNAに含まれる通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン（Ψ）、５－メチルシチジン（m5C）などの修飾塩基を有するヌクレオチドを含むことが好ましいことが開示されている（特許文献１）。他にも、修飾塩基を有するヌクレオチドを用いたmRNAにより、レポーター遺伝子の発現の促進を可能にしたことが報告されている（例えば、非特許文献１）。
国際公開WO2015/105172 特開2009-142259号公報
Journal of Controlled Release 217 (2015) 337-344
mRNAスイッチを用いた技術は、特定の細胞の識別、同定、あるいは特定細胞の運命制御に応用が可能であり、さらなる発展が望まれる。中でも、mRNAスイッチは細胞に導入されて、コードするタンパク質の発現もしくは発現抑制により機能するため、その発現量を増加させることは重要な課題となる。mRNAスイッチの発現量は、コードするタンパク質や導入する細胞種によって異なる場合があり、特に、膜タンパクや分泌タンパクをコードするmRNAを細胞に導入しても、その発現量が低く、スイッチとして十分に機能しない場合があった。
本発明者らは、鋭意検討の結果、所定の修飾塩基を用いてmiRNA応答性mRNAやタンパク質応答性mRNAなどのmRNAスイッチを調製することにより、発現の増加および免疫反応の低減を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
［１］ （i）miRNAもしくはタンパク質によって特異的に認識される核酸配列と、（ii）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNAであって、当該mRNAに含まれるヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含むmRNA。
［２］ 前記（i）の核酸配列がmiRNAによって特異的に認識される核酸配列であり、前記（i）および（ii）の核酸配列が5'から3'の方向に連結されている、［１］に記載のmRNA。
［３］ 前記mRNAが、前記（ii）の核酸配列が、前記（i）の核酸配列の3'側に連結され、さらに前記（ii）の核酸配列の3'側に翻訳抑制配列を含む、［１］に記載のmRNA。
［４］ 前記（i）の核酸配列がタンパク質によって特異的に認識される核酸配列であり、前記（i）および（ii）の核酸配列が5'から3'の方向に連結されている、［１］に記載のmRNA。
［５］ 前記マーカータンパク質が、膜タンパク質または分泌タンパク質である、［１］～［４］のいずれか１項に記載のmRNA。
［６］ 前記マーカータンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、薬剤耐性タンパク質、細胞死誘導性タンパク質、細胞死抑制性タンパク質である、［１］～［４］のいずれか１項に記載のmRNA。
［７］ （１）（i）miRNAもしくはタンパク質によって特異的に認識される核酸配列と、（ii）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNAであって、当該mRNAに含まれるヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含むmRNAを、細胞に導入する工程と、
（２）当該マーカータンパク質の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程と
を含む、細胞の判別方法。
［８］ 前記マーカータンパク質が、膜タンパク質または分泌タンパク質である、［７］に記載の方法。
本発明によれば、細胞に導入した際に、コードするタンパク質の発現量が多く、また免疫の問題を回避した、機能性の高いmRNA、及びこれを用いた細胞の判別方法を可能にする。
図１（ａ）及び（ｂ）は、Native及び様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAを、293FT細胞で発現させた結果を示すグラフである。 図１（ｂ）は、Native及び様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAを、201B7、201B7D20、A2780、Hela、SH-5YSY、及びNHDF細胞で発現させた結果を示すグラフである。 図２は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなる3種のアルカリフォスファターゼmRNAを、細胞で発現させた結果を示すグラフである。 図３は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAの、Rabbit Reticulocyte Lysateにおけるin vitro翻訳を行った場合の、時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。 図４は、239FT細胞におけるEGFP mRNAの経時的な発現を示すグラフである。 図５は、EGFPを発現するHeLa細胞（HeLa EGFP）におけるiRFP670 mRNAの経時的な発現を示すグラフである。 図６は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAの細胞内における量の経時的な変化を示す。 図７は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNA、PALP mRNAを293FTにトランスフェクトした６時間後の、活性な免疫応答マーカーの量を示す。 図８（ａ）は、修飾塩基を有するあるいは有さないヌクレオチドから構成されたタンパク質応答性EGFP mRNAのダイナミックレンジを示すグラフである。 図８（ｂ）は、RNA－タンパク質結合モチーフの二次構造の模式図と、これに特異的に結合するトリガータンパク質の組み合わせを示す図であり、トリガータンパク質としては、L7Ae、MS2CP、Lin28を用いた。 図９（ａ）は、miR-302aスイッチ（miR-302a応答性Off Switch mRNA）は、m1Ψ修飾塩基を用いることで、m5C/Ψ修飾塩基を用いたときと比較して、より大きなダイナミックレンジが得られることを示す。 図９（ｂ）は、m5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなる4ｘmiR-302aスイッチを用いて、201B7 iPSCをトランスフェクトした結果を示す図である。 図９（ｃ）は、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなる4ｘmiR-302aスイッチを用いて、201B7 iPSCをトランスフェクトした結果を示す図である。 図１０は、HeLa細胞中で、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなる複数種のmiRスイッチが、ダイナミックレンジを向上させたことを示す。 図１１（ａ）は、HeLa細胞及び293FT細胞を、左図はm5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなるmiR-21-5p応答性mRNAにより、右図はm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなるmiR-21-5p応答性mRNAにより、トランスフェクトした結果を示す図である。 図１１（ｂ）の左図はm5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなるmiR-21-5p応答性mRNAを用いたHeLa細胞と293FT細胞の分離のヒストグラムであり、右図はm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなるmiR-21-5p応答性mRNAを用いたHeLa細胞と293FT細胞の分離のヒストグラムであり、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドからなるmRNAを用いた場合に、HeLa細胞と293FT細胞の空間分離能が向上することを示す。 図１２はアルカリフォスファターゼ(ALP)により染色したiPSCの写真である。 図１３はアルカリフォスファターゼ(ALP)により染色した、部分的に分化したiPSCの写真である。 図１４は、Native及び様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmiR-21-5p応答性EGFPスイッチの293FT細胞におけるFold Changeを示すグラフである。 図１５は修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドの融解温度Tm（melting temperature）を調べた結果であり、図１５（Ａ）は、天然型オリゴヌクレオチド、図１５（Ｂ）はΨオリゴヌクレオチド、図１５（Ｃ）はm1Ψオリゴヌクレオチドの典型的なfirst derivative report及び Second derivative reportを示す。 図１６は天然型、Ψ、m1Ψ、またはm5C/Ψ修飾塩基を有するmiR-661応答性EGFPスイッチ、miR-210応答性EGFPスイッチ、またはmiR-335応答性EGFPスイッチにおいて、天然型オリゴヌクレオチドからなるスイッチのダイナミックレンジを１としたときの相対ダイナミックレンジを示すグラフである。 図１７は天然型、Ψ、m1Ψ、またはm5C/Ψ修飾塩基を有する4xmiR-302a-hmAG mRNAスイッチの293FT細胞における発現を５０％抑制するために必要なmiR-302a模倣体の量を示すグラフである。 図１８は天然型、Ψ、またはm1Ψ修飾塩基を有するmiR-335-EGFP mRNAスイッチの293FT細胞におけるSlicer efficiencyを示すグラフである。 図１９は天然型、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ、m5C/m1Ψ修飾塩基を有するU1A応答性EGFP mRNAスイッチの293FT細胞におけるFold Changeを示すグラフである。
以下に本発明を、実施態様を示して詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
本発明は、一実施形態によれば、mRNAに関する。特には、（i）miRNAもしくはタンパク質によって特異的に認識される核酸配列と、（ii）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNAであって、当該mRNAに含まれるヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含むmRNAに関する。
本実施形態によるmRNAは、細胞内に導入されると、細胞内在性のmiRNAもしくはタンパク質に特異的に応答して、マーカータンパク質の発現が制御されるmRNAである。本明細書において、このような、細胞内在性物質に応答してマーカータンパク質の発現が制御されるmRNAを、miRNA応答性mRNA、タンパク質応答性mRNA、あるいは、これらを総称してmRNAスイッチと指称する。miRNA応答性mRNAには、miRNAに応答してマーカータンパク質の発現量が増加するmiRNA応答性On-Switch mRNAと、miRNAに応答してマーカータンパク質の発現量が抑制されるmiRNA応答性Off-Switch mRNAとが含まれる。また、細胞内に導入されると、細胞内在性の物質に関係なくマーカータンパク質を発現するmRNAを、コントロールRNAと指称する。
本発明において、mRNAスイッチが導入される細胞とは、特に限定されるものではなく任意の細胞であってよい。例えば、多細胞生物種から採取した細胞であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞であってもよい。当該細胞は、特には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）採取した細胞、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞である。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における細胞として用いることができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
本発明における細胞は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞であってよく、例えば、前記体細胞から調製したｉＰＳ細胞を含んでなる細胞群であり、あるいはES細胞やｉＰＳ細胞などによって例示される多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群であってもよい。本発明における細胞は、特には生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明においては、細胞にmiRNA応答性mRNAを導入した後にも、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる細胞である。
（１）mRNAスイッチ
（ａ）miRNA-応答性Off Switch mRNA
本発明において、miRNA-応答性Off Switch mRNAは、以下の（iａ）および（iiａ）の核酸配列を含むmRNAを意味する：
（iａ）miRNAによって特異的に認識される核酸配列、および
（iiａ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列。
当該（iａ）miRNAによって特異的に認識される核酸配列と（iiａ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。miRNA-応答性Off Switch mRNAは、miRNA Off Switch、あるいはmiRNA Switchと指称することもある。
本発明における「miRNA」とは、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害やmRNAの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する、細胞内に存在する短鎖（20-25塩基）のノンコーディングRNAである。このmiRNAは、miRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を取ることが可能な一本差のpri-miRNAとして転写され、核内にあるDroshaと呼ばれる酵素により一部が切断されpre-miRNAとなって核外に輸送された後、さらにDicerによって切断されて機能する。
（iａ）のmiRNAとしては、ある特定の細胞においてマーカータンパク質の発現を制御、特にはマーカータンパク質の発現を抑制または活性化することを目的として、その細胞で特異的に発現している、あるいは特異的に発現していないmiRNAを適宜選択することができる。特異的に発現しているmiRNAとは、他の細胞と比較してある特定の細胞において、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上あるいはそれ以上の割合で高く発現しているmiRNAが例示される。このようなmiRNAは、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/）に登録されたmiRNA、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより適宜選択することができる
本発明において、miRNAによって特異的に認識される核酸配列は、例えば、当該miRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％程度の不一致があっても良い。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているmRNA上のmiRNA標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちmiRNAの3'側16塩基程度に対応する、標的配列内の5'側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、ＲＩＳＣが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されないが、好ましくは、１８塩基以上、２４塩基未満の配列、より好ましくは、２０塩基以上、２２塩基未満の配列である。本発明において、miRNAによって特異的に認識される核酸配列は、所望の細胞および他の細胞へ当該配列を有するmiRNA-応答性Off Switch mRNAを導入し、所望の細胞においてのみ対応するマーカータンパク質の発現が抑制されることを確認することによって、適宜決定して用いることができる。
本発明において使用される前記（iiａ）の「マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列」とは、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能しうる、以下に詳述するマーカータンパク質を発現し得る核酸配列をいうものとする。なお、マーカータンパク質を、レポータータンパク質と指称することもある。
細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうるタンパク質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発光又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができるタンパク質であってよい。蛍光タンパク質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光タンパク質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光タンパク質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光タンパク質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光タンパク質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光タンパク質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光タンパク質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。
発光タンパク質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、beta-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質をマーカー遺伝子として使用する場合、所望の細胞の判別において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
また、細胞内でマーカーとして機能しうるタンパク質の別の例としては、細胞の機能に直接影響を与えるタンパク質類が挙げられる。細胞増殖タンパク質、細胞死滅タンパク質、細胞シグナル因子、薬剤耐性遺伝子、転写制御因子、翻訳制御因子、分化制御因子、リプログラミング誘導因子、RNA結合タンパク質因子、クロマチン制御因子、膜タンパク質、分泌タンパク質を例示することができるが、これらには限定されない。例えば、細胞増殖タンパク質は、それを発現した細胞のみを増殖させ、増殖した細胞を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅タンパク質は、それを発現した細胞の細胞死を引き起こすことで、特定のmiRNAを含有、もしくは含有しない細胞自体を死滅させ、細胞の生死を示すマーカーとして機能する。細胞シグナル因子は、それを発現した細胞が、特定の生物学的信号を発し、この信号を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅タンパク質として、例えば、BaxまたはBimが例示される。翻訳制御因子は、一例としては、特定のRNAの3次構造を認識して結合することで他のmRNAからのタンパク質への翻訳を制御することでマーカーとして機能する。翻訳制御因子として、5R1、5R2（Nat Struct Biol. 1998 jul; 5(7):543-6）、B2（Nat Struct Mol Biol. 2005 Nov;12(11):952-7）、Fox-1（EMBO J. 2006 Jan 11;25(1):163-73.）、GLD-1（J Mol Biol. 2005 Feb 11;346(1):91-104.）、Hfq（EMBO J. 2004 Jan 28;23(2):396-405）、HuD（Nat Struct Biol. 2001 Feb;8(2):141-5.）、SRP19（RNA. 2005 Jul;11(7):1043-50）、L1（Nat Struct Biol. 2003 Feb;10(2):104-8.）、L11（Nat Struct Biol. 2000 Oct;7(10):834-7.）、L18（Biochem J. 2002 Mar 15;362(Pt 3):553-60）、L20（J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36522-30.）、L23（J Biomol NMR. 2003 Jun;26(2):131-7）、L25（EMBO J. 1999 Nov 15;18(22):6508-21.）、L30（Nat Struct Biol. 1999 Dec;6(12):1081-3.）、LicT（EMBO J. 2002 Apr 15;21(8):1987-97.）、MS2 coat（FEBS J. 2006 Apr;273(7):1463-75.）、Nova-2（Cell. 2000 Feb 4;100(3):323-32）、Nucleocapsid（J Mol Biol. 2000 Aug 11;301(2):491-511.）、Nucleolin（EMBO J. 2000 Dec 15;19(24):6870-81.）、p19（Cell. 2003 Dec 26;115(7):799-811）、L7Ae（RNA. 2005 Aug;11(8):1192-200.）、PAZ（PiWi Argonaut and Zwille）（Nat Struct Biol. 2003 Dec;10(12):1026-32.）、RnaseIII（Cell. 2006 Jan 27;124(2):355-66）、RR1-38（Nat Struct Biol. 1998 Jul;5(7):543-6.）、S15（EMBO J. 2003 Apr 15;22(8):1898-908.）、S4（J Biol Chem. 1979 Mar 25;254(6):1775-7.）、S8（J Mol Biol. 2001 Aug 10;311(2):311-24.）、SacY（EMBO J. 1997 Aug 15;16(16):5019-29.）、SmpB（J Biochem (Tokyo). 2005 Dec;138(6):729-39）、snRNP U1A（Nat Struct Biol. 2000 Oct;7(10):834-7.）、SRP54（RNA. 2005 Jul;11(7):1043-50）、Tat（Nucleic Acids Res. 1996 Oct 15;24(20):3974-81.）、ThrRS（Nat Struct Biol. 2002 May;9(5):343-7.）、TIS11d（Nat Struct Mol Biol. 2004 Mar;11(3):257-64.）、Virp1（Nucleic Acids Res. 2003 Oct 1;31(19):5534-43.）、Vts1P（Nat Struct Mol Biol. 2006 Feb;13(2):177-8.）、およびλN（Cell. 1998 Apr 17;93(2):289-99.）が例示される。より好ましい翻訳制御因子は、MS2 coat 、L7Aeである。
膜タンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、表面抗原、膜輸送体（イオン輸送体）が挙げられる。分泌タンパク質としては、例えば、ホルモン類、消化酵素類が挙げられる。従来のmRNAスイッチにおいて、膜タンパク質や分泌タンパク質をマーカー遺伝子として設計しても発現量が低く、スイッチとしての機能が充分に発揮されない問題があった。しかし、本発明のmRNAスイッチにより、十分な発現量を確保することができるようになった。
本発明において、（iａ）miRNAによって特異的に認識される核酸配列と、（iiａ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNA機能的に連結される。これらが機能的に連結されるとは、マーカータンパク質のコード領域に対応するオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の5'UTR内、3'UTR内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備えることを意味する。miRNA-responsive Off Switch mRNAは、好ましくは、5'末端から、5'から3'の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン5'リン酸）、マーカータンパク質のコード領域に対応するオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、5'UTR内、3'UTR内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備える。mRNAにおけるmiRNAの標的配列の位置は、5'UTRであっても、3'UTRであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの3'側）であってもよく、これらのすべてにmiRNAの標的配列を備えていてもよい。したがって、miRNA標的配列の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。
好ましくは、miRNA-responsive Off Switch mRNAは、（iａ）および（iiａ）の核酸配列が、5'から3'の方向にこの順序で連結されている。このとき、ｃａｐ構造とmiRNAの標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、ｃａｐ構造とmiRNA標的配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、miRNA標的配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
本発明において、miRNA-responsive mRNA中のmiRNA標的配列内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。例えば、miRNAの標的配列が5'UTRに存在し、かつ、当該標的配列内にAUGを含む場合には、3'側に連結されるマーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、標的配列内にAUGを含む場合、標的配列内のAUGをGUGに変換して使用することも可能である。また、標的配列内のAUGの影響を最小限に留めるために、5'UTR内における標的配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、ｃａｐ構造と標的配列内のAUG配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。
所望のmiRNA及びマーカータンパク質の既知の核酸配列に基づき、上記の（iａ）及び（iiａ）の核酸配列を備えるmRNA設計する場合、天然の核酸を利用する場合、通常、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）の４種の塩基をもつヌクレオチドで構成されるmRNAを設計することができる。本発明のmRNAは、上記のようにして設計されたmRNAにおいて、ウラシルを塩基としてもつウリジンに代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むように調製する。Ｎ１－メチルシュードウリジンは、「m1Ψ」あるいは1NUと表記することもある。以下に、Ｎ１－メチルシュードウリジン-5’-三リン酸のリチウム塩の構造式を示す。
Figure 0007318931000001
miRNA-responsive Off Switch mRNAでは、上記の設計されたmRNAに含まれるすべてのウリジンに代えてＮ１－メチルシュードウリジンを含んでもよく、一部にＮ１－メチルシュードウリジンを含み他はウリジンが存在していてもよい。一部にＮ１－メチルシュードウリジンを含む場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができるが、例えば、ウリジンと、Ｎ１－メチルシュードウリジンとの総数に対するＮ１－メチルシュードウリジンの数が、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、あるいは、９５％以上であることが好ましい。もっとも好ましくは、すべてのウリジンに代えてＮ１－メチルシュードウリジンを含む。このような修飾塩基を含むmRNAは、化学合成により、あるいは、遺伝子工学的な手法により合成することができ、重合させる核酸として、ウリジン三リン酸に代えてＮ１－メチルシュードウリジン-5’-三リン酸を使用することで得ることができる。なお、本発明のmRNAスイッチは、Ｎ１－メチルシュードウリジン以外の修飾塩基、例えば、シュードウリジン（Ψ）、5-メチルシチジン（m5C）、N6-メチルアデノシン（m6A）のいずれか、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでもよいが、好ましくは、Ｎ１－メチルシュードウリジン以外の修飾塩基をもつヌクレオチドは含まない。
（ｂ）miRNA-応答性On Switch mRNA
本発明において、miRNA-応答性On Switch mRNAは、以下の（iｂ）、（iiｂ）および（iiiｂ）の核酸配列を含むmRNAを意味する：
（iｂ）polyA配列の3’側に連結したmiRNAによって特異的に認識される核酸配列、
（iiｂ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列、及び
（iiiｂ）前記miRNAによって特異的に認識される核酸配列の3'側に連結した翻訳抑制配列。
miRNA-応答性On Switch mRNAは、miRNA On Switch、あるいはmiRNA Switchと指称することもある。
miRNA-応答性On Switch mRNAにおいても、（iｂ）中のmiRNAによって特異的に認識される核酸配列、（iiｂ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列は、先の（ａ）Off Switch mRNAにおいて定義した配列であってよい。
miRNA-応答性On Switch mRNAは、好ましくは、5'末端から、5'から3'の向きに、Cap構造
（７メチルグアノシン5'リン酸）、所望のタンパク質遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム並びに、PolyA配列を備え、PolyA配列の3'側に連結するmiRNA標的配列、及びmiRNA標的配列の3'側に連結する翻訳抑制配列を備えている。
5'UTRの構造は、5'末端にCap構造を備え、miRNA標的配列を備えていないものであれば、塩基数についても、塩基配列についても特に限定されるものではない。一例として、5'UTRの構造は２０塩基以上であって、例えば、４０～１５０塩基、好ましくは４０～１００塩基程度で構成され、Stem-loopなどのRNAの構造をとりにくく、開始コドンを含まない配列とすることができるが、特定の配列には限定されない。PolyA配列は、特に長さの上限はないが、例えば５０～３００塩基、好ましくは、１００～１５０塩基のAからなる配列であってよい。
PolyA配列の3'側に連結するmiRNA標的配列の数は、１つであることが好ましい。これは、miRNAによる標的配列の切断後にPolyAの3'側に配列が残ると、PolyAとして認識されにくくなり、遺伝子の発現が開始しない（発現抑制を解除できない）場合があるためである。しかしながら、miRNAによる標的配列の切断後に、発現抑制を解除することができる場合には、複数のmiRNA標的配列を備えていてもよい。「PolyA配列の3'側に連結するmiRNA標的配列」とは、PolyA配列とmiRNA標的配列とが直接連結されていてもよく、これらの間に機能に影響を及ぼさない程度の配列、例えば１～５塩基程度の配列を備えてもよいことをいう。
miRNA標的配列の3'側には、翻訳抑制配列を連結する。（iiiｂ）中、「miRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列」とは、miRNA標的配列と翻訳抑制配列とが直接連結される場合のみならず、これらの間に、他の配列が存在していてもよいことをいうものとする。例えば、miRNA標的配列と翻訳抑制配列との間には、２０～１００塩基のアダプター配列を含んでもよい。また、２つ以上のmiRNA標的配列を備える場合、miRNA標的配列の3'側とは、最も3’側に位置するmiRNA標的配列の3'末端側をいうものとする。
翻訳抑制配列は、PolyA配列の翻訳に関与する作用を妨げることが可能な配列であってよく、好ましくは、（α）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、（β）5'UTRを特異的に認識する配列、及び（γ）１００塩基以上の配列から選択される塩基配列を含む。
（α）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列としては、PolyA配列に完全に相補的なPolyU配列が挙げられ、例えば、20以上、40以上、60以上、または80以上のウリジンからなるPolyU配列が挙げられるが、これらには限定されない。また、PolyA配列を特異的に認識することができれば、ミスマッチが存在してもよい。また、PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列を含んでいれば、その3'側及び／または5'側に、任意の配列をさらに含んでいてもよい。なお、PolyA配列を特異的に認識し、翻訳抑制することができれば、必ずしも２０以上でなくとも、５以上、１０以上、あるいは１５以上の塩基からなる配列であってもよい。
（β）5'UTRを特異的に認識する配列としては、5'UTRに完全に相補的な配列であることが好ましい。しかしながら、5'UTRを特異的に認識することができれば、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。また、5'UTRを特異的に認識する配列を含んでいれば、その3'側及び／または5'側に、任意の配列をさらに含んでいてもよい。
（γ）100塩基以上の配列としては、塩基の種類及びおよび塩基の配列は問わず、翻訳抑制が可能な程度の長い配列であればよい。100塩基以上、好ましくは300塩基以上、500塩基以上、1000塩基以上、1500塩基以上であってもよい。
このような構造的特徴を備えるmiRNA応答性On Switch mRNAは、細胞内の翻訳システムからpolyA配列を隠し、翻訳を阻害することができる。mRNAは細胞の中で、5'末端に存在するCAP構造と3'末端に存在するpolyA配列により認識、翻訳の活性化が起こるとされているところ、上記のように設計された人工的なmiRNA応答性On Switch mRNAは、一時的に不活性化されているといえる。そして、標的配列に特異的に結合するmiRNAの存在下においては、翻訳抑制配列による翻訳の抑制が解除され、マーカータンパク質の翻訳がなされる。
上記に従って、（iｂ）、（iiｂ）及び（iiiｂ）の核酸配列を含むmiRNA-応答性On Switch mRNAを設計する場合、天然の核酸を用いる場合には、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）の４種の塩基をもつ核酸で構成されるmRNAを設計することができる。しかし、本発明のmRNAは、上記のようにして設計されたmRNAにおいて、ウラシルを塩基としてもつウリジンに代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むように調製する。Ｎ１－メチルシュードウリジンの含有割合や、他の修飾塩基を備えるヌクレオチドの含有については、先の（ａ）Off Switch mRNAにおいて説明した態様と同様の態様であってよい。
（ｃ）タンパク質応答性Off Switch mRNA
本発明において、タンパク質応答性mRNAは、以下の（iｃ）、及び（iiｃ）の核酸配列を含むmRNAを意味する：
（iｃ）トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列、及び
（iiｃ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列。
当該（iｃ）トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列と（iiｃ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。タンパク質応答性Off Switch mRNAは、タンパク質応答性mRNAあるいはタンパク質応答性Switchと指称することもある。
本態様において、（iｃ）トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列とは、RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むRNAである。RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むRNAとは、天然または既知のRNA－タンパク質複合体における、RNAとタンパク質との結合モチーフに含まれるRNA側、または試験管内進化法（in vitro selection法）により得られた人工的なRNA－タンパク質結合モチーフに含まれるRNA側である。したがって、トリガータンパク質は、天然または既知のRNA－タンパク質複合体における、RNAとタンパク質との結合モチーフに含まれるタンパク質側を含む。
天然のRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、通常、約５～３０塩基で構成されており、特定のアミノ酸配列を保有するタンパク質と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/image/dna-protein/RNA/RNA.htmlから、所望の構造変化を生ずるモチーフを適宜選択して入手することができる。本実施形態において好ましく用いられるRNA－タンパク質結合モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同タンパク質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、タンパク質がRNAの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることが好ましい。
Figure 0007318931000002
Figure 0007318931000003
人工のRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むRNAとは、人工的に設計したRNA－タンパク質複合体における、RNAとタンパク質との結合モチーフ中のRNA側である。このようなRNAの塩基配列は、通常、約１０～８０塩基で構成されており、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するよう設計する。このような人工的なRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むRNAとしては、特定のタンパク質に特異的に結合するRNAアプタマーが例示される。標的となる所望のタンパク質に対し特異的に結合するRNAアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法より得ることができる。このときのトリガータンパク質は、当該RNAアプタマーが結合するタンパク質となる。例えば、以下の表３に挙げるRNA配列が知られており、これらもまた本発明のRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列として用いることができる。
Figure 0007318931000004
本実施形態において、RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列は、対応するトリガータンパク質との解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ～約１μＭ程度であるものが好ましい。
また、これらのRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明による当該配列に包含される。ここでいう変異体とは、RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、RNA－タンパク質複合体が形成できる限り、適宜選択して用いることができる。また、このような変異体の塩基配列は、当該RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列でもよい。ここでストリンジェントな条件は、Bergerand Kimmel (1987, Guideto Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖は、かかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、上述のRNA－タンパク質結合モチーフに含まれるRNAの配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、RNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間で、一定の結合を保持し、RNA－タンパク質複合体の形成に寄与することができる。
本実施形態によるRNA－タンパク質結合モチーフを形成する配列の具体的な例としては、下記表４に示す、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｖｏｌ． １２， ｐｐ． ８０７－８１８ （２００４））が結合する配列である、boxCmotif（５’－ＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣ－３’）（配列番号１）、ｋｉｎｋ－ｌｏｏｐ（配列番号２）、ｋｉｎｋ－ｌｏｏｐ２（配列番号３）が挙げられる。
Figure 0007318931000005
別の具体例としては、ＭＳ２コートタンパク質が特異的に結合する配列であるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100: 125-138）、バチルスのリボソームタンパク質Ｓ１５が結合する配列であるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus Stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16SrRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261: 536-549）が挙げられる。
さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のmRNAに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているThreonyl-tRNAsynthetase（Cell (Cambridge,Mass.）v97, pp. 371-381(1999)）が結合する配列である、5’-GGCGUAUGUGAUCUUUCGUGUGGGUCACCACUGCGCC-3’（配列番号４）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性タンパク質であるＢｃｌ－２ファミリーＣＥＤ－９由来のRNA－タンパク質結合モチーフを形成する塩基配列である、R9-2; 5’-GGGUGCUUCGAGCGUAGGAAGAAAGCCGGGGGCUGCAGAUAAUGUAUAGC-3’（配列番号５）、およびその変異体、NF-kappaBに結合するRNA配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。
（iiｃ）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列は、先の（ａ）miRNA-応答性Off Switch mRNAについて説明したとおりであり、（ａ）miRNA-応答性Off Switch mRNAの（iiａ）と同様の構成とすることができる。
好ましくは、タンパク質応答性mRNAは、（iｃ）および（iiｃ）の核酸配列が、5'から3'の方向にこの順序で連結されている。このとき、ｃａｐ構造とトリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、ｃａｐ構造とトリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
本発明において、タンパク質応答性mRNA中のトリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。例えば、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列が5'UTRに存在し、かつ、当該核酸配列内にAUGを含む場合には、3'側に連結されるマーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列内にAUGを含む場合、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列内のAUGをGUGに変換して使用することも可能である。また、トリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列内のAUGの影響を最小限に留めるために、5'UTR内におけるトリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、ｃａｐ構造とトリガータンパク質によって特異的に認識される核酸配列内のAUG配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。
上記に従って、（iｃ）、及び（iiｃ）の核酸配列を含むタンパク質応答性Off Switch mRNAを設計する場合、天然の核酸を用いる場合には、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）の４種の塩基をもつ核酸で構成されるmRNAを設計することができる。しかし、本発明のmRNAは、上記のようにして設計されたmRNAにおいて、ウラシルを塩基としてもつウリジンに代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むように調製する。Ｎ１－メチルシュードウリジンの含有割合や、他の修飾塩基を備えるヌクレオチドの含有については、先の（ａ）Off Switch mRNAにおいて説明した態様と同様の態様であってよい。
タンパク質応答性Off Switch mRNAにおいて、トリガータンパク質が細胞内在性のタンパク質ではない場合、タンパク質応答性Off Switch mRNAを制御するための、トリガータンパク質をコードするmRNAを同時に用いることができる。トリガータンパク質をコードするmRNAは、トリガータンパク質の発現を制御可能なmRNAであってもよく、トリガータンパク質の発現は制御されないmRNAであってもよい。前者のmRNAは、例えば、miRNAによって特異的に認識される核酸配列と前記トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを機能的に連結して含むmRNAであってよい。この場合、5'UTRは、先の（ａ）Off Switch mRNAの5'UTRと同様に設計することができる。後者の場合、miRNAによって特異的に認識される核酸配列を有さず、トリガータンパク質のコード領域に対応する核酸配列を含むmRNAであってよい。いずれの場合であっても、タンパク質応答性Off Switch mRNAの（iｃ）の核酸配列を特異的に認識し得るタンパク質を、トリガータンパク質として設計することができる。そして、この場合も、天然の核酸を用いる場合には、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）の４種の塩基をもつ核酸で構成されるmRNAを設計することができるところ、ウラシルを塩基としてもつウリジンに代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むmRNAとすることが好ましい。Ｎ１－メチルシュードウリジンの含有割合や、他の修飾塩基を備えるヌクレオチドの含有については、先の（ａ）Off Switch mRNAにおいて説明した態様と同様の態様であってよい。
（２）細胞の判別方法
本発明は一実施形態によれば、細胞の判別方法であって、
（１）（i）miRNAもしくはタンパク質によって特異的に認識される核酸配列と、（ii）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNAであって、当該mRNAに含まれるヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含むmRNAを、細胞に導入する工程と、
（２）当該マーカータンパク質の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程と
を含む。
本実施形態に係る方法において、細胞を「判別する」とは、２種以上の細胞を含む細胞群の中から、所望の、特定の１以上の細胞種について、他の細胞種と異なる検出可能な信号情報を提示することをいい、特には、視覚的に認識可能な情報を提示することをいうものとする。なお、視覚的に認識可能な情報とは、細胞が直接的に視認しうる信号を発することに限定されるものではなく、細胞が発した信号を、数値、図表又は画像等によって視覚的に認識可能な情報に変換された情報であり、当業者が視覚的に認識可能な情報をいう。本明細書において、判別するという文言には、当該判別の後に、所望の細胞種を認識し、所望の細胞種を識別し、所望の細胞種を同定し、所望の細胞種を分類し、所望の細胞種を単離し、所望しない細胞種を除去し、所望の細胞種の生死を判定し、所望の細胞種の特定の生物学的な信号を検出あるいは定量し、所望の細胞種の特定の物理的あるいは化学的な信号に基づいて分画することを含んでもよい。
本発明の方法において、細胞に導入するmRNAスイッチは、典型的には、（ａ）miRNA-応答性Off Switch mRNA、（ｂ）miRNA-応答性On Switch mRNA、または（ｃ）タンパク質応答性Off Switch mRNAであってよい。（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれか１種類であってもよく、２種、または３種であってもよい。また、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のいずれかの構成を持つ、mRNAスイッチを１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、あるいは８種類以上用いてもよい。いずれの場合も、例えば、miRNA標的部位もしくはトリガータンパク質標的部位の配列が異なり、異なるmiRNAもしくはトリガータンパク質に応答して、異なるマーカータンパク質を発現する複数種のmRNAを用いることができる。
mRNAスイッチの導入
本発明において、mRNAスイッチを細胞に導入する方法としてはmRNAの形態で導入することができる。例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
異なる２種以上のmRNAスイッチを導入する場合、あるいはmRNAスイッチと、コントロールとなるmRNA（以下、コントロールmRNAとも指称する）とを用いる場合には、複数のmRNAを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２種以上のmRNAの細胞内での割合は個々の細胞で維持されるため、これらのmRNAから発現するタンパク質の活性比は、細胞集団内において一定となるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量のマーカーを得るために当業者は適宜これらを選択することができる。本発明において、コントロールmRNAとは、miRNAもしくはトリガータンパク質の標的部位を有さないmRNAをいう。すなわち、コントロールmRNAは、細胞内在性のmiRNAもしくはトリガータンパク質の発現量の影響を受けることなく、細胞に導入されて翻訳されるmRNAである。コントロールmRNAは、好ましい態様においては、mRNAスイッチとともに細胞群に導入されて、mRNAスイッチが導入された細胞を確認し、識別するためのコントロールとして機能し得る。コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
mRNAスイッチが細胞に導入されると、（ａ）miRNA-応答性Off Switch mRNA、（ｂ）miRNA-応答性On Switch mRNA、または（ｃ）タンパク質応答性Off Switch mRNAのそれぞれの構造的特徴に応じて、細胞内に存在するmiRNAもしくはタンパク質に応答して、マーカータンパク質の翻訳が制御される。一方、コントロールmRNAは、細胞内に存在する物質の存否に関わらず翻訳される。
次いで、マーカータンパク質の翻訳量を指標として、細胞を判別する工程（以下、判別工程とも指称する）を実施する。判別工程では、上記のようなマーカータンパク質の翻訳量から、細胞を判別する。例えば、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞、あるいは多い細胞は、２種以上の細胞を含む細胞群に属する細胞間で、マーカータンパク質の翻訳量の比率を得ることにより決定することができる。マーカータンパク質として細胞死滅タンパクを用いた場合、指標となるmiRNAの発現量に応じて、特異的に細胞死を誘導され、取り除くことができる。
判別工程は、所定の検出装置を用いて、マーカータンパクからの信号を検出することにより実施することができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカータンパク及び判別の態様により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカータンパクが、蛍光タンパク又は発光タンパクの場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカータンパクの定量が可能であり、マーカータンパクが、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパクの場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカータンパクの定量方法が可能であり、マーカータンパクが、膜局在タンパクの場合には、抗体などの細胞表面タンパク特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカータンパクの定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置 (MACS)といった、マーカータンパクの定量過程を経ない細胞の単離方法が可能であり、マーカータンパクが薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤投与によりマーカータンパク質の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
マーカータンパクが蛍光タンパクの場合の好ましい検出方法の一例として、フローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーは、個々の細胞において翻訳されたマーカータンパクである、蛍光タンパク、発光酵素が発する光の強度を、判別の情報として提供することができる。
本発明によれば、従来技術と比較して、マーカータンパク質の発現量を増大させることができ、例えば、３～２５倍とすることができる。特には、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含まないmRNAスイッチを用いてもほとんど発現させることができなかった膜タンパク質や、分泌タンパク質を、細胞の判別が十分に可能な程度に発現することができる。これにより、例えば、本発明のスイッチを用いて、特定の細胞の細胞膜にアルカリフォスファターゼを発現させてホスホDペプチドの一種であるD-3ペプチド（WO2016/114341）で当該細胞を除去したり、目的の細胞でのみ特定の膜タンパク質を発現させて、抗体やビースで選別したりすることが可能になる。
以下、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。実施例で用いたmRNAスイッチは、miRNA応答性off swtich mRNAまたはタンパク質応答性off swtich mRNAであって、特定のmiRNAあるいはタンパク質に応答して、マーカータンパク質の翻訳が抑制されるmRNAである。以下の表記においては、「off swtich」を省略している。また、miRNA XXX応答性YYY mNRAと表記する場合、miRNA XXXの標的配列を備え、マーカータンパク質としてYYYをコードするmRNAをいうものとする。
DNAテンプレートの構築
本実施例にて、全てのmRNAを生成するために用いたプライマーを表５に示す。EGFPオープンリーディングフレームは、plasmid pFr15-EGFP、pCTp-EGFPあるいはpAptamerCassette-EGFPから、TAP_IVTrev及びTAP EGFP_IVT fwdあるいはKWC00405_EGFP mRNA1 ORF_Fw及びKWC00427_EGFP ORF_Rvのプライマーセットを用いて増幅した。BFPオープンリーディングフレームは、plasmid pcDNA3.1-tagBFPから、TAP_IV Trev及びTAP tagBFP_IVT fwdのプライマーセットを用いて増幅した。iRFP670オープンリーディングフレームは、plasmid pC9-NirFPから、TAP_IV Trev及びiRFP670 orf fwdのプライマーセットを用いて増幅した。hmAGオープンリーディングフレームは、plasmid pCTp-hmAG1-M9あるいはpFucci-S/G2/M Greenから、hmAG1_IVT fwd及びhmAG1_IV Trevのプライマーセットを用いて増幅した。MS2CPオープンリーディングフレームは、plasmid pTAP-MS2CPから、TAP MS2CP_IVTfwd及びTAP_IVTrevのプライマーセットを用いて増幅した。Lin28オープンリーディングフレームは、plasmid pLIN28Amyc-T2A -tagRFPから、Lin28_Tfwd及びLin28_Trevのプライマーセットを用いて増幅した。L7Aeオープンリーディングフレームは、plasmid pTAP-L7Aeから、L7Ae_IVTfwd及びL7AeRevのプライマーセットを用いて増幅した。U1Aオープンリーディングフレームは、plasmid pU1Afullmyc-T2A -tagRFPから、KWC00430_U1Afull ORF_Fw及びKWC00431_U1Afull ORF_Rvのプライマーセットを用いて増幅した。アルカリフォスファターゼ（PALP）のオープンリーディングフレームは、plasmid OHU18818から、5'AL Porf及び3'AL Porf newのプライマーセットを用いて増幅した。ここで、アルカリフォスファターゼとは、GPIフラグメントを含有するヒト胎盤アルカリフォスファターゼである。SEAPのオープンリーディングフレームは、plasmid OHU18818から、5'AL Porf及びALPP_rev_2のプライマーセットを用いて増幅した。pDisplay-ALPの生成には、まずALPの触媒ドメインを、plasmid 18818から、ALPP_ORF_fwd及びALPP_ORF_revのプライマーセットを用いて増幅した。pDisplayALPは、GPIフラグメントが除去され、pDisplayフラグメントが追加されたヒト胎盤アルカリフォスファターゼである。5’Igkシグナルペプチド配列は予め、pDisplay plasmid (Invitrogen)から、Signal Peptide_IVT_fwd及びSignal Peptide_IVT_revのプライマーセットを用いて増幅した。3’PDGFR膜貫通ドメインは、同じpDisplay plasmidから、PDGFR_IVT_fwd及びPDGFR_IVT_revのプライマーセットを用いて増幅した。トランケートされたALPPペプチド、特に触媒性の残基の二次構造は、Phyre２オンラオンソフトウェア（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）により判定された野生型ALPPの既知の構造と厳密に一致すると予測された。全長pDisplay-ALPorfは、fusion PCRにより、３つのフラグメントと、Signal Peptide_IVT_fwd及びPDGFR_IVT_revのプライマーセットを用いて生成した。
Figure 0007318931000006
3'UTRフラグメントは、テンプレートIVT_3prime_UTRから、Fwd3UTR及びRev3UTR2T20のプライマーセットを用いてPCR増幅した。miRNA標的部位をもたないコントロールmRNAについては、5'UTRフラグメントは、テンプレートIVT_5prime_UTRから、TAP_T73GC及びRev5UTRのプライマーセットを用いてPCR増幅した。miRNA標的部位をもつスイッチmRNAの5UTRは、以下の表６に挙げる各配列を用いた。
Figure 0007318931000007
タンパク質応答性スイッチmRNAの5UTRは、以下の表７に挙げる各配列を用いた。Lin28応答性mRNAについては、stbC Fwd primer及びstbC spacerの２つのプライマーをフュージョンPCRにおける5’UTR配列として用いた。TAP_T73GCは、この反応では用いなかった。MS2CP応答性mRNAについては、5’UTRはテンプレートplasmid pscMS2(WTx2)-EGFPからGCT7CMV_G及びRev 5UTRのプライマーセットを用いて得た。L7Ae応答性mRNAについては、KWC0131_T7-kt-EGFP_Fw及びSpacer 5UTR Fwdの２つのプライマーを、フュージョンPCRにおける5UTR配列として用いた。TAP_T73GCは、この反応では用いなかった。U1A応答スイッチは3つのプライマーKWC00433_T7-U1utr-EGFP_v2_fw、KWC00434_T7+g_Fw、KWC0137_Spacer5UTR_ver2及び、蛍光レポーターのオープンリーディングフレーム, 3'UTRフラグメント、3UTR120Aを用いてフュージョンPCRにて作製した。
Figure 0007318931000008
mRNAの合成のためのIVT DNAテンプレートは、fusion PCRから増幅した。すべてのmRNAスイッチについて、タンパク質オープンリーディングフレームフラグメント（10ng）、5’UTR配列 (10nM)、及び3’UTR配列(10nM)を用い、GCT7pro_5UTR及び3UTR120Aのプライマーセットを用いた。スイッチではないコントロールmRNAについては、特記しない限り、TAP_T73GC及び3UTR120Aのプライマーセットを用いた。fusion PCRに用いたプライマーを表８に示す。
Figure 0007318931000009
In vitro Transcription
全てのmRNAは、Mega Script T7kit (Ambion)を用いてプロトコルに従って調製した。この反応において、Ψ-mRNAの合成についてはウリジン三リン酸に代えて、シュードウリジン-5’-三リン酸を用い、m1Ψ-mRNAの合成についてはウリジン三リン酸に代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジン-5’-三リン酸（N1-methyl-pseudouridine-5’-triphosphate）を用いた。m5C-mRNAの合成についてはシチジン三リン酸に代えて、5-メチルシチジン-5’-三リン酸を用いた。m5C/m1Ψ-mRNAの合成についてはウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に代えて、シュードウリジン-5’-三リン酸及び5-メチルシチジン-5’-三リン酸を用いた。m5C/m1Ψ-mRNAの合成についてはウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジン-5’-三リン酸及び5-メチルシチジン-5’-三リン酸を用いた。m6A-mRNAの合成についてはアデノシン三リン酸に代えて、N6-メチルアデノシン-5’-三リン酸を用いた。m6A/m1Ψ-mRNAの合成についてはウリジン三リン酸及びアデノシン三リン酸に代えて、Ｎ１－メチルシュードウリジン-5’-三リン酸及びN6-メチルアデノシン-5’-三リン酸を用いた。すべての修飾核酸は、Tri Link Bio Technologiesから入手した。なお、本実施例で「修飾塩基で構成された」mRNAと表記した核酸は、全ての該当する塩基が、修飾塩基からなるものを用いた。
IVT反応（mRNA合成）の前に、グアノシン三リン酸を、Anti Reverse Cap Analog (New England Biolabs)を用いて５倍希釈した。反応混合物は37℃で、４時間インキュベーションし、これに、TURBO DNasc (Ambion)を添加した。得られた混合物を、37℃でさらに３０分インキュベーションした。得られたmRNAは、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (Qiagen)を用いて精製し、これをAntarctic Phosphatase (New England Biolabs)を用いて、37℃で３０分インキュベーションし、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (Qiagen)を用いてさらに精製した。調製したmRNAはA260readingonNanodrop (Thermo Fisher)により決定した。mRNAの純度は、100ngのmRNAと、RNA kit (Shimazu)またはRNA6000 Nano kit (Agilent)を用いて、Bio Analyzer (Agilent)により決定した。品質確認を経たmRNAは100ng/μlまで希釈し、使用まで-30℃で保存した。
細胞培養
全ての細胞は、37℃、5%CO2の条件で培養した。HeLa細胞(ATCC)は、10%の胎児ウシ血清(FBS)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、0.1mMの非必須アミノ酸(NEAA) (Invitrogen)を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル培DMEM(Naclai-Tesq)で培養した。安定的にEGFPを過剰発現するHeLa細胞は、上記同様の培地で培養した。293FT細胞 (Invitrogen)は、10%FBS、0.1 mMのNEAA、1 mMのピルビン酸ナトリウムを含む高グルコースDMEMで培養した。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF; Lonza)は、complete fibroblast basal medium中で培養した。ヒト卵巣癌細胞A2780(Sigma)は、10%FBS及び2mML-glutamineを添加した1640RPMI培地中で培養した。SH-5YSY細胞(Sigma)は、10%FBS、2mML-glutamine、及び0.1mMのNEAAを添加したDMEM-F12 (1:1)で培養した。ヒトフィーダーフリーhiPSC株201B7 (Ff-201B7)は、京都大学の中川誠人博士及び京都大学ｉＰＳ細胞研究所の細胞調製施設から提供を受け、complete Stem Fit(AK03)培地(Ajinomoto)中の、iMatrix-511 (Nippi)で維持した。自然分化細胞は、上記Ff-201B7に基づきStem Fit培地から基本成長因子を除去して２週間培養することにより得た。
トランスフェクション
培養細胞は、0.5x105cells/wellで24ウェルプレートに播種した。翌日、mRNAを細胞に導入した。導入には1μLのLipofectamine MessengerMax (Thermo Fisher Scientific)を用い、製造者の指示にしたがって導入を実施した。mRNAの発現の測定については、異なる修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNA(200ng)を各細胞に導入した。細胞質の蛍光タンパク質の発現については、導入の24時間後に細胞をAccuriC6 (BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。生細胞(7-AAD陰性細胞)のEGFPの平均発現量を測定し、修飾塩基を用いないNative mRNAによりトランスフェクトされた細胞の発現量と比較した。生細胞のパーセンテージ（7-AAD陰性細胞の全ての細胞に対する割合）及びトランスフェクションのパーセンテージ（EGFP陽性細胞の全ての生細胞に対する割合）もまた、AccuriC6により測定した。膜タンパク質の発現については、導入の24時間後に各サンプルの溶解物をCell Lytic-M (Sigma)を用いて採取した。各サンプルの総タンパク質量は、BCA Protein Assay Kit (Pierce)により測定し、各サンプルのアルカリフォスファターゼ活性は、同量の総タンパク質を用いて、アルカリフォスファターゼ検出キット、Fluorescence (Sigma)により測定した。タンパク質の相対発現量は、Native mRNAでトランスフェクトされた細胞の発現と比較した。分泌タンパク質SEAPについては、各サンプルの培養培地におけるアルカリフォスファターゼ活性を、同量の培地を用いて、アルカリフォスファターゼ検出キット、Fluorescence (Sigma)により測定した。タンパク質の相対発現量は、Native mRNAでトランスフェクトされた細胞の発現と比較した。
miRNA応答性mRNAを用いた実験においては、100ngのmiRNA応答性mRNAを、90ngのコントロールmRNAと共導入した。コントロールmRNAはm5C/Ψ修飾塩基で構成されたものを用いた。導入の24時間後に細胞をAccuri C6 (BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。各細胞におけるmiRNA応答性mRNAがコードするマーカータンパク質の平均蛍光強度は、コントロールmRNAの平均強度により規格化した。ダイナミックレンジは、miRNAを含まないサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の強度を、対応するmiRNAを含むサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の強度で割ることにより識別した。なお、ダイナミックレンジと、後述するFold Changeは同じ意味で使用される。
miRNA模倣体アッセイにおいては、3～0.0003nMのmiRNA模倣体を、90ngのmiRNA応答性mRNA、90ngのコントロールmRNAとともに、293FT細胞に共導入した。導入の24時間後に、細胞をAccuriC6またはAria (BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより測定した。各細胞におけるmiRNA応答性mRNAがコードするマーカータンパク質の平均蛍光強度は、コントロールmRNAの平均強度により規格化した。miRNA模倣体による抑制のパーセンテージは、各サンプルの規格化されたマーカータンパク質の平均蛍光強度を、miRNA模倣体を含まないサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の平均蛍光強度と比較することにより計算した。
タンパク質応答性mRNAを用いた実験においては、200ngのタンパク質応答性mRNAと、90ngのコントロールmRNAを、トリガータンパクをコードするmRNAとともに、あるいはトリガータンパクをコードするmRNAを含まずに細胞に共導入した。トリガータンパクをコードするmRNAは、タンパク質応答性mRNAに特異的に結合するトリガータンパク質をコードするmRNAである。トリガータンパク質がL7Aeの場合には、30ngのL7Ae mRNA（L7AeをコードするmRNA）、トリガータンパク質がMS2またはLin28の場合には、100ngのMS2 mRNA（MS2をコードするmRNA）またはLin28mRNA（Lin28をコードするmRNA）を共導入した。導入の24時間後、細胞をAccuri C6を用いたフローサイトメトリーにより測定した。各細胞におけるタンパク質応答性mRNAがコードするマーカータンパク質の平均蛍光強度は、コントロールmRNAの平均強度により規格化した。ダイナミックレンジは、トリガータンパクをコードするmRNAを含まないサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の強度を、対応するトリガータンパクをコードするmRNAを含むサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の強度で割ることにより識別した。
フローサイトメトリー
トランスフェクションの24時間後に細胞を培養皿から分離し、メッシュを通過させてフローサイトメトリーにより分析した。hmAG1及びEGFPは、90% cut FITC filter (530/30nm)を備えた波長が488nmの青色レーザーで検出した。tagBFPは、Pacific Blue filter(450/40nm)を備えた波長が405nmの紫色レーザーで検出した。iRFP670は、それぞれBP filter(675/25nm)を備えた波長が633nmの赤色レーザー及び紫色レーザーで検出した。死細胞及びデブリは、前方及び後方光散乱シグナルにより除去し、さらに、7-AAD染色により識別した。
タイムラプスイメージング
トランスフェクション直後に、EGFPを安定的に発現するHela細胞をCell aview (KELLERMSR)に載置し、37°C、5%CO2で、暗所で培養した。各セルの異なる４つのエリアの蛍光強度は、1時間ごとに記録した。各サンプルの蛍光強度は、iRFP670の蛍光強度で平均化し（averaging）、次いで、平均化された内在性EGFPの強度により規格化することにより得た。
Pathscan（登録商標）アッセイ
トランスフェクションの6時間後、pathscanアッセイ(Cell signaling)のプロトコルにしたがって細胞溶解物を採取した。同じプロトコルにしたがって、Lipofectamine MessengerMaxを用いて、ポジティブコントロールとしての10μg/mLのpoly ICを細胞に導入した。ネガティブコントロールとしては、これらの細胞をトランスフェクション試薬であるLipofectamine MessengerMaxのみで処理した。
Invitrotranslation
平底の黒のハーフエリア96ウェルソリッドプレート中のRabbit reticulocytelysate (Ambion) 中で、プロトコルにしたがってin vitro translationを実施した。Rabbit reticulocytelysateアッセイについては、25μlの反応物を300ngのEGFP mRNAに添加した。EGFPの蛍光は上部から10分おきに、12時間、37℃で、TECAN plate-readerにより測定した。
図１（ａ）及び（ｂ）は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAを、異なる複数の細胞で発現させた結果を示すグラフである。EGFP mRNAは、miRNA標的部位も、トリガータンパク質の標的部位も持たないコントロールmRNAである。細胞は、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのmRNAと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。EGFPの発現は、トランスフェクションの24時間後に、90%cutFL-1filterを用いて、Accuri flowcytometer（BDバイオサイエンス社製）により測定した。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さないヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAを表し、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ、m5C/m1Ψ、m5C、m6A、m6A/m1Ψは、それぞれ、NativeのmRNAに対し「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。
図２は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなる3種のアルカリフォスファターゼmRNAを、細胞で発現させた結果を示すグラフである。これらのmRNAは、miRNA標的部位も、トリガータンパク質の標的部位も持たないコントロールmRNAである。細胞は、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのmRNAと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。アルカリフォスファターゼの発現は、Alkaline Phosphatase Detection Kitを用い、トランスフェクションの24時間後の蛍光を測定した。また、発現は、総タンパク質量に対して調整した。グラフ中、PALPは、GPIフラグメントを含有するヒト胎盤アルカリフォスファターゼをコードするmRNAに基づき発現したタンパク質、pDisplay-ALPは、GPIフラグメントが除去され、pDisplayフラグメントが追加されたヒト胎盤アルカリフォスファターゼをコードするmRNAに基づき発現したタンパク質、SEAPは、GPIフラグメントを有さないヒト胎盤アルカリフォスファターゼをコードするmRNAに基づき発現したタンパク質をそれぞれ意味する。PALPとpDisplay-ALPは細胞溶解物中で測定し、SEAPの発現は培養液中で測定した。Lipofectamin MessengerMaxのみでトランスフェクトした細胞溶解物または培養液中の細胞からの発現をこの実験のブランクとして用いた。また、グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さないヌクレオチド配列からなるアルカリフォスファターゼmRNAを表し、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ、NativeのmRNAに対し「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。
図３は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAの、Rabbit Reticulocyte Lysateにおけるin vitro翻訳を行った場合の、時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。300ngの各mRNAは、in vitro translation assayにおいて、Invitrogen Rabbit Reticulocyte Lysateに添加した。蛍光強度は、TECAN plate-readerを用いて、10分ごとに測定した。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m5C/Ψ、m1Ψ、Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。Backgroundは、Rabbit Reticulocyte Lysateのみからなるサンプルを意味する。
図４は、239FT細胞におけるEGFP mRNAの経時的な発現を示すグラフである。239FT細胞は、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのmRNAと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。EGFPの発現の記録は、トランスフェクションの直後から開始し、細胞イメージ解析システムCELAVIEW（オリンパス社製）により測定した。EGFPチャネルの平均強度を積算したものを、時間（hr）に対してプロットした。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m5C/Ψ、m1Ψ、Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。Mockは、1μLのLipofectamine MessengerMaxのみでトランスフェクトした細胞を示す。
図５は、EGFPを安定的に発現するHeLa細胞（HeLa@EGFP）におけるiRFP670 mRNAの経時的な発現を示すグラフである。HeLa EGFPは、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのiRFP670 mRNAと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。発現の記録は、トランスフェクションの4時間後から開始し、細胞イメージ解析システムCELAVIEW（オリンパス社製）により測定した。iRFP670の発現は内部発現EGFPに対して調節した。2回の試行の結果を平均して示す。エラーバーは、標準誤差を示す。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m5C/Ψ、m1Ψ、Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。Mockは、図４に示す結果と同様に定義される。
図６は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNAの細胞内における量の経時的な変化を示す。293FT細胞を、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのEGFP mRNAと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。トランスフェクションから、所定の時間経過の時点で、細胞溶解物を採取し、total RNAを抽出した。EGFPの量は、qPCRにより定量した。グラフにおいて、EGFPの量は、それぞれのEGFP mRNAにおいて、トランスフェクションから１時間の時点における量を１として相対量で示した。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m5C/Ψ、m1Ψ、Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。
図７は、様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるEGFP mRNA、PALP mRNAを293FTにトランスフェクトした６時間後の、活性な免疫応答マーカーの量を示す。293FT細胞は、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOptiMEMに200ngの各mRNAおよび10μg/mLのpolyICと、1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。Pathscan（登録商標）Immune Cell Signaling Antibody Array Kit (Fluorescent Readout)のプロトコルにしたがって、トランスフェクションの6時間後に各サンプルのcell lysateを回収した。活性な免疫応答マーカーの量は、Pathscan Immune Cell Signaling Antibody Array Kitを用いて測定した。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m1Ψ、Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAであり、Mockは、1μLのLipofectamine MessengerMaxのみでトランスフェクトされた細胞を示す。
図８（ａ）は、修飾塩基を有するあるいは有さないヌクレオチドから構成されたタンパク質応答性EGFPあるいはhmAG1 mRNAのダイナミックレンジを示すグラフである。図８（ｂ）は、RNA-タンパク質結合モチーフの二次構造の模式図と、これに特異的に結合するトリガータンパク質の組み合わせを示しており、配列に沿って示す実線はタンパク質結合配列（Protein binding sequence）を意味する。トリガータンパク質としては、L7Ae、MS2CP、Lin28を用い、トリガータンパク質により特異的に認識される配列は、これらに対応するRNA－タンパク質結合モチーフの核酸配列を用いた。293細胞を、24ウェルプレートの0.5mLの培地に0.5x105cellsとなるように播種した。播種の24時間後に、50μLのOpti MEMに200ngのタンパク質応答性EGFPあるいはhmAG1 mRNA、100ngコントロールiRFP670 mRNAを、トリガータンパク質をコードするmRNAの存在下または非存在下で1μLのLipofectamine MessengerMaxを溶解させてトランスフェクションを実施した。iRFP670 mRNA、及びトリガータンパク質をコードするmRNAはm5C/Ψ修飾塩基で構成されたものを用いた。EGFPあるいはhmAG1の発現は、iRFP670の発現により調節した。ダイナミックレンジは、トリガータンパク質の存在下でのEGFPあるいはhmAG1発現量に対する、トリガータンパク質の非存在下でのEGFPあるいはhmAG1発現量で定義される。タンパク質の結合能は、RNAの一次構造及び二次構造の両者によるため、ヌクレオチドの修飾は各システムに異なる影響を与えた。kink-turn及びstbCのタンパク質結合配列にはウリジンが含まれないため、ウリジンの修飾はこれらの二つのシステムに対する影響は限られていた。これらの二つのシステムでは、m5C/m1Ψ修飾が、最も高いダイアンミックレンジをもたらした。これは、m5Cとm1Ψとが共同してRNAモチーフのステム構造を安定化したためであると考えられる。最も大きなダイナミックレンジを示したサンプルはすべて、m1Ψ修飾を有するものであった。
図９（ａ）、９（ｂ）及び９（ｃ）は、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmiR-302a応答性Off Switch mRNAが、m5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmiR-302a応答性Off Switch mRNAと比較して、より大きなダイナミックレンジを有することを示す。90ngのmiR-302ahmAG mRNA及び180ngのコントロールtagBFP mRNAを、Lipofectamine MessengerMAXを用いて201B7 iPSCsにトランスフェクトした。miR-302ahmAG mRNAは、単一のmiR-302a標的配列をもつものと、４リピートのmiR-302a標的配列をもつものを用いた。Off Switch mRNAは、m5C/Ψ修飾塩基、あるいはm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されるものを用いた。コントロールtagBFPは、m5C/Ψ修飾塩基で構成されたものを用いた。ダイナミックレンジは、スイッチオンの状態における、すなわち、miRNA標的配列を持たないhmAG mRNAを用いた場合の翻訳効率（hmAGの発現強度／tagBFPの発現強度）を、スイッチオフの状態における、すなわち上記miR-302a応答性mRNAを用いた場合の翻訳効率で割ることによって計算した。この結果から、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAスイッチが、上記に定義されるスイッチオン、オフのダイナミックレンジを大きく向上させることがわかった。
図１０は、HeLa細胞中で、修飾塩基を有するヌクレオチドから構成された複数種のmiRNA応答性Off Switch mRNAが、ダイナミックレンジを向上させたことを示す。90ngのmiR-17-5p応答性hmAG mRNA、miR-92a応答性hmAG mRNA、miR-21-5p応答性hmAG mRNA(miR-21-5p標的配列1x,及び4x)、miR-206応答性hmAG mRNA、またはmiR-302a応答性hmAG mRNA(miR-302a標的配列1x,及び4x)と、180ngのコントロールtagBFP mRNAを、LipofectamineMessengerMAXを用いてHeLa細胞にトランスフェクトした。miR-206応答性hmAG mRNA及びmiR-302a応答性hmAG mRNAについては、4pmolの対応するmiRNA模倣体をコトランスフェクトした。Off Switch mRNAは、m5C/Ψ修飾塩基、あるいはm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmRNAを用いた。
図１１は、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmiR-21-5p応答性mRNAを用いることにより、HeLa細胞と293FT細胞の空間分離能が向上することを示す。ＨeLa細胞と293FT細胞の１：１共培養培地を、90ngのmiR-21-5p応答性hmAG mRNA及び180ngのコントロールtagBFP mRNAでトランスフェクトした。RNAは、m5C/Ψ修飾塩基、あるいはm1Ψ修飾塩基を用いた。標準化した翻訳効率(hmAG/tagBFP)は、HeLa細胞におけるmiR-21-5p活性を示す集団（高活性）と、293FT細胞におけるmiR-21-5p活性を示す集団（低活性）の二つに分離された（図１１（ａ））。翻訳効率を示すヒストグラムからは、m1Ψ修飾塩基を用いたmiRスイッチを用いた場合に、２つのピーク間により広い隔たりがあることが確認された（図１１（ｂ））。HeLa細胞中で、修飾塩基を有するヌクレオチドから構成された複数種のmiRNA応答性Off Switch mRNAが、ダイナミックレンジを向上させたことを示す。90ngのmiR-21-5p応答性hmAG mRNA(miR-21-5p標的配列1x,及び4x)180ngのm5C/Ψ修飾コントロールtagBFP mRNAを、LipofectamineMessengerMAXを用いてHeLa細胞にトランスフェクトした。この結果から、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAスイッチが、上記に定義されるスイッチオン、オフのダイナミックレンジを大きく向上させることがわかった。
図１２は、アルカリフォスファターゼ(ALP)により染色したiPSCの写真である。201B7細胞を、24ウェルプレートに、0.7x105cells/wellで播種した。24時間後、30ngのm5C/Ψ修飾塩基、あるいはm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmiR-4x302a-応答性puroR mRNAと、4pmolのコントロール阻害剤またはmiR-302a-5p阻害剤を細胞にトランスフェクトした。puroRは、ピューロマイシン耐性遺伝子を意味する。miR-4x302a-応答性puroR mRNAは、5'UTRに４リピートのmiR-302a-5p標的配列をもち、ピューロマイシンをコードするmRNAスイッチであって、miR-302a-5pの発現に応答して、puroRの発現が抑制されるスイッチである。コントロール阻害剤（ctrl inhibitor）は、mirVana（商標）miRNA Inhibitor, Negative Control #1を用いた。６時間後に、2μg/mlのピューロマイシンを添加した培地に交換した。翌日、培地を通常のiPSC培地に交換し、さらに6日間培養して、固定、ALP染色を実施した。その結果、201B7細胞にてmiR-302a-5pの発現に応答して、puroRの発現の抑制が確認された。次いで、ピューロマイシン処理によって、puroRを発現していない201B7細胞の細胞死が生じた。図１２に、ALP染色を行った、6日後の201B7の生細胞の写真を示す。この結果から、m1Ψ修飾塩基を有する応答性mRNAでトランスフェクトした201B7細胞の生細胞数が明らかに少ないことがわかった（左下）。miR-302a-5p阻害剤は内在性miR-302a-5pの活性を阻害するため、細胞死が発生しない。このため、細胞死は302a-5pの発現に依存することが確認された。
図１３は、アルカリフォスファターゼ(ALP)により染色した、部分的に分化したiPSCの写真である。201B7細胞から部分的に分化したiPSC（Day7）を、24ウェルプレート中のiPSC培地に、0.7x105cells/wellで播種した。24時間後、30ngのm5C/Ψ修飾塩基、あるいはm1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチドから構成されたmiR-4x302a-puroR mRNAと、4pmolのコントロール阻害剤またはmiR-302a-5p阻害剤を細胞にトランスフェクトした。６時間後に、2μg/mlのピューロマイシンを添加した培地に交換した。翌日、培地を通常のiPSC培地に交換し、さらに6日間培養して、固定、ALP染色を実施した。ALP染色によって、m1Ψ修飾塩基を有する応答性mRNAをトランスフェクトした細胞の中で、201B7細胞の生細胞数が明らかに少ないことがわかった。m1Ψ修飾塩基を有する応答性mRNAは、内在性miRに依存して特異的に細胞を除去する能力を大きく向上させることがわかった。
さらに、実施例の表６に示すテンプレートを用いて調製した、m1Ψ修飾塩基で構成されたmiR-661、miR-335、及びmiR-210に特異的に応答するmRNAスイッチも、通常のウリジンを備えるｍRNAスイッチと比較して、生細胞中で高い発現性を示し、かつダイナミックレンジの向上もみられた。
天然型及び異なる７種の修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmiR-21-5p応答性EGFPスイッチを作製し、先の「トランスフェクション」において記載したのと同様の方法で、293FT細胞にトランスフェクトした。図１４は様々な修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmiR-21-5p応答性EGFPスイッチを、293FT細胞で発現させた結果を示すグラフである。スイッチオフ状態は、miR-21-5p 模倣体をmiR-21-5p応答性EGFPスイッチと共導入することにより実現した。Fold Changeは、スイッチオンの状態におけるmiR-21-5p応答性EGFPスイッチの翻訳効率を、スイッチオフの状態における翻訳効率で割ることによって計算した。なお、Fold Changeは先に述べたダイナミックレンジと同じ意味で使用される。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ、m5C/m1Ψ、m5C、m6A、m6A/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。測定は3回実施し、データは平均±標準誤差で表した。
天然型オリゴヌクレオチド並びに、Ψ、m1Ψ修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドの融解温度Tm（melting temperature）を調べた。Tmオリゴヌクレオチドは、以下の表９に示すプライマーセットT7_fwd TAATACGACTCACTATAG と T7_rev CGCAAAACGCCTATAGTGAGTCGTATTAを用いて、IVTにより合成した。得られたRNA産物は、PAGE及びゲル抽出により精製した。逆相補ヌクレオチドは、Gene Design Inc (Osaka, Japan)より購入した。UV融解実験は、温度調節装置と８つのミクロセルホルダー(JASCO PAC-743R)を備えた分光光度計（JASCO V-650 UV/VIS）を用いて実施した。まず、モル濃度を等しくした各オリゴヌクレオチド（最終濃度4 μM）とRNA相補鎖を、20mMのリン酸ナトリウム, 50mMのNaClを含む pH 7.0のバッファー中で、ProFlex（商標） PCR システム (Thermo Fisher Scientific)を用いて８５℃から室温まで徐冷した。融解プロファイルは、260 nm の波長にて、１５℃から８５℃の温度範囲で、０．５℃/minでスキャンした。Tmは、二本鎖が半分解離した温度で計算し、各Tmは融解曲線のderivativesから決定した。下記表１０は、それぞれ天然型の相補オリゴCGCAAAACGCCとアニーリングした、天然型オリゴヌクレオチド、m1Ψオリゴヌクレオチド、ΨオリゴヌクレオチドのTm値を示す。測定は３回実施し、データは平均±標準誤差で表した。可能性のある不安定な形態のTmも測定した。図１５（Ａ）は、天然型、図１５（Ｂ）はΨ、図１５（Ｃ）はm1Ψオリゴヌクレオチドの典型的なfirst derivative report及び Second derivative reportを示す。矢印は、核酸塩基上の可能性のある水素結合部位を示す。Ψでは、可能性のある水素結合部位が多く存在するために、不安定な形態を形成しやすいと考えられる。
Figure 0007318931000010
Figure 0007318931000011
miRNA応答性mRNAスイッチの標的配列におけるm1Ψの量と翻訳効率の関係を調べた。天然型並びに、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmiR-661応答性EGFPスイッチ、miR-210応答性EGFPスイッチ、miR-335応答性EGFPスイッチを作製し、293FT細胞にトランスフェクトした。下記表１１は、miR-661、miR-210、miR-335の各配列、並びに、miR-661の相補配列、miR-210の相補配列、miR-335の相補配列を示す。表中、相補配列におけるＵは、ボールド体で示す。シード配列及びその相補配列は下線で示す。3’ compensatory sites及びその相補配列は点線からなる下線で示す。図１６は天然型、Ψ、m1Ψ、またはm5C/Ψ修飾塩基を有するmiR-661応答性EGFPスイッチ、miR-210応答性EGFPスイッチ、またはmiR-335応答性EGFPスイッチにおいて、天然型オリゴヌクレオチドからなるスイッチのダイナミックレンジを１としたときの相対ダイナミックレンジを示すグラフである。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。測定は3回実施し、データは平均±標準誤差で表した。このデータから、m1Ψが、Ψや天然型のUと比較してmiRNAスイッチを促進する効果は、miRNA標的配列に含まれるUの量に依存することがわかった。
Figure 0007318931000012
天然型並びに、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなる4xmiR-302a-hmAG mRNAを作製した。3～0.0003nMのmiRNA模倣体を、90ngの4xmiR-302a-hmAG mRNA、90ngのコントロールmRNAとともに、293FT細胞に共導入した。導入の24時間後に、細胞をAccuriC6またはAria (BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーにより測定した。各細胞における4xmiR-302a-hmAG mRNAがコードするマーカータンパク質の平均蛍光強度は、コントロールmRNAの平均強度により規格化した。miRNA模倣体による抑制のパーセンテージは、各サンプルの規格化されたマーカータンパク質の平均蛍光強度を、miRNA模倣体を含まないサンプルにおける規格化されたマーカータンパク質の平均蛍光強度と比較することにより計算した。図１７は、天然型、Ψ、m1Ψ、またはm5C/Ψ修飾塩基を有する4xmiR-302a-hmAG mRNAスイッチの293FT細胞における発現を５０％抑制するために必要なmiR-302a模倣体の量を示すグラフである。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。測定は3回実施し、データは平均±標準誤差で表した。このデータから、m1Ψ修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるスイッチは、miR模倣体との結合親和力がより高いことが示された。
293FT細胞は、トランスフェクションの前日に1x105cell/wellの濃度で１２ウェルプレートに播種した。天然型、Ψ、m1ΨのmiR-335-EGFPスイッチ mRNA (200 ng)と、コントロールRenilla RNA (30 ng)、control またはmiR-335 模倣体 (3 nM)をLipofectamine MessengerMaxを用いて293FT細胞に導入した。導入の4時間後に培地をフレッシュ培地に取り換えた。導入の8時間後に細胞を1 mLのRT PBS バッファーで洗浄し、TRIzol（商標）に添加した。duplicate setの細胞はトリプシン処理し、Accuriにより測定した。細胞のtotal RNAはmiRNeasy protocolにより生成した。100 ngのtotal RNAを用いてcDNAを製造した（ReverTra Ace（登録商標）; 0.2ngのfirefly mRNAをRT controlとして各サンプルに添加した）。残ったスイッチの量は、standard SYBR Green RT-qPCRにより測定した。図１８は、miR-loaded RISCが、天然型やΨスイッチと比較して、より効率的にm1Ψスイッチを分解することを示す。各種のmiR-335-EGFP mRNAスイッチの293FT細胞におけるSlicer efficiencyは、トランスフェクションの8時間後に測定した。Slicer efficiencyは、miR模倣体とmiRNAスイッチが共導入されて誘導された細胞における、切断されたスイッチのパーセンテージで表される指標である。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、m1Ψ、Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。測定は3回実施し、データは平均±標準誤差で表した。
異なる修飾塩基を含むU1A応答性EGFP mRNAスイッチを調製した。200 ng のU1A応答性EGFP mRNAスイッチと90 ng のコントロールiRFP670 mRNAを100 ng のU1A mRNAと一緒に、あるいはU1A mRNAを用いずに293FT細胞に共導入した。トランスフェクションの8時間後または24時間後に細胞をAccuri C6 (BD Biosciences)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。異なる修飾塩基を含むU1A応答性EGFP mRNAスイッチの293FT細胞におけるFold changeを図１９に示す。U1A mRNAを導入した場合の翻訳効率をスイッチオフ状態とし、導入しなかった場合の翻訳効率をスイッチオン状態とし、Fold Changeは、スイッチオンの状態における翻訳効率を、スイッチオフの状態における翻訳効率で割ることによって計算した。グラフ中、Nativeは修飾塩基を有さない天然型のヌクレオチド配列からなるmRNAであり、Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ、m5C/m1Ψは、それぞれ「In vitro transcription」において説明した修飾塩基を有するヌクレオチド配列からなるmRNAである。測定は3回実施し、データは平均±標準誤差で表した。

Claims (5)

  1. （i）miRNAもしくはタンパク質によって特異的に認識される核酸配列と、（ii）マーカータンパク質のコード領域に対応する核酸配列とを含むmRNAであって、当該mRNAに含まれるヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含み、当該mRNAに含まれるウリジンと、Ｎ１－メチルシュードウリジンとの総数に対するＮ１－メチルシュードウリジンの数が９５％以上であり、当該mRNAが、
    （a）前記（i）の核酸配列がmiRNAによって特異的に認識される核酸配列であり、前記（i）および（ii）の核酸配列が5'から3'の方向に連結されているmRNA、
    （b）前記（i）の核酸配列がmiRNAによって特異的に認識される核酸配列であり、前記（ii）の核酸配列が、前記（i）の核酸配列の3'側に連結され、さらに前記（ii）の核酸配列の3'側に翻訳抑制配列を含むmRNA、または
    （c）前記（i）の核酸配列がL7AeまたはMS2CPタンパク質によって特異的に認識される核酸配列であり、前記（i）および（ii）の核酸配列が5'から3'の方向に連結されているmRNA
    から選択される、mRNA。
  2. 前記マーカータンパク質が、膜タンパク質または分泌タンパク質である、請求項１に記載のmRNA。
  3. 前記マーカータンパク質が、蛍光タンパク質、発光タンパク質、薬剤耐性タンパク質、細胞死誘導性タンパク質、または細胞死抑制性タンパク質である、請求項１に記載のmRNA。
  4. （１）請求項１に記載のmRNAを、細胞に導入する工程と、
    （２）当該マーカータンパク質の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程と
    を含む、細胞の判別方法。
  5. 前記マーカータンパク質が、膜タンパク質または分泌タンパク質である、請求項４に記載の方法。
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