JP7320121B2 - 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ） - Google Patents

眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ） Download PDF

Info

Publication number
JP7320121B2
JP7320121B2 JP2022501046A JP2022501046A JP7320121B2 JP 7320121 B2 JP7320121 B2 JP 7320121B2 JP 2022501046 A JP2022501046 A JP 2022501046A JP 2022501046 A JP2022501046 A JP 2022501046A JP 7320121 B2 JP7320121 B2 JP 7320121B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
aflibercept
chromatography
buffer
isoelectric point
steps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022501046A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022540838A (ja
Inventor
ハ、ビョン－ジプ
パク、ヨン－ソプ
ソ、ミ－ラン
リー、ジェ－ホ
キム、ドン－ギュ
ジョン、ジェ－イン
Original Assignee
サム チュン ダン ファーム．カンパニー，リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サム チュン ダン ファーム．カンパニー，リミテッド filed Critical サム チュン ダン ファーム．カンパニー，リミテッド
Publication of JP2022540838A publication Critical patent/JP2022540838A/ja
Priority to JP2023118537A priority Critical patent/JP2023139142A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7320121B2 publication Critical patent/JP7320121B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

本発明は、眼科用タンパク質医薬品の活性成分として用いられるアフリベルセプトを精製する方法に関する。本発明によれば、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーまたは陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを特定の条件で行い、特定範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することができるので、眼科用タンパク質医薬品の品質及び生産性の向上を図ることができる。
血管新生（Angiogenesis）は、固形腫瘍（Solid tumor）、増殖網膜症（Proliferative retinopathies）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、関節リウマチ（Rheumatoid arthritis）のような種々の疾患の発症機転に関与することが知られている。このような血管新生に必要とされる因子の一つである血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ヒトの癌において発現しており、腫瘍血管新生（Tumor neoangiogenesis）においても重要な役割を果たす。また、眼液中（Eye fluid）の高濃度のＶＥＧＦは、糖尿病性及びその他の虚血性の網膜症患者における血管増殖活性と高い相関関係があり（Aiello LP et al., N Engl J Med 1994;331:1480-1487）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）患者の脈絡膜新生血管膜（Choroidal Neovascular Membranes）における増殖因子の局在化（localization）につながることが知られている（Amin R1 et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 1994 Jul;35(8):3178-88）。したがって、抗－ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ阻害剤は、固形腫瘍と眼内血管新生関連疾患の治療に有望な候補であることができる。
ＶＥＧＦ阻害剤のうちの１つであるアフリベルセプト（Aflibercept）は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したヒト血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）受容体１及び２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ結合部位からなる組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、商標ＥｙｌｅａＴＭとして滲出型加齢黄斑変性症の治療のために米国及びヨーロッパなどで承認されている。
アフリベルセプトは、遺伝子組換え技術を用いて、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞などの動物細胞において発現され得、二量体形態で存在し、生物学的活性を示す。発現された二量体は、合計１０個のアスパラギン残基に糖鎖構造が結合した形態を示すことが知られており、それぞれの糖鎖構造の末端部位には、負電荷を帯びたシアル酸（sialic acid）が含まれ得るので、細胞培養工程を通じて発現される、アフリベルセプト物質は、多様な含有量で存在するシアル酸糖によりｐＨ６．０～１０以上の非常に広い範囲で等電点値を有する複合物の形態を示す。
ところで、遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質医薬品を人体に使用するためには、極めて厳しい安全性と有効性検証の手続きが必要とされ、そのためには、極めて高純度に精製することができる効果的な精製工程が必要となる。すなわち、細胞培養工程を通じて生成された培養液には、さまざまな工程に由来する不純物のみならず、上記の種々の含有量で存在するシアル酸糖が含まれるので、このことから安定性や有効性を厳密に検証するために設けられた基準内に分布する等電点値を有するタンパク質のみを高純度に精製する工程が要求される。さらに、そのようなたんぱく質は、十分な精製収率を確保することによってはじめて経済性が確保され、工業的に利用可能となる。
従来の抗体医薬品またはＦｃ融合タンパク質の精製スキーム（または手順）は、種々の不純物の結合または保持力と比較した時、クロマトグラフィーカラムの固相によって好ましく結合するか、或いは保持されるかに対する抗体分子の能力を試験するクロマトグラフィー工程をしばしば含む。これらのクロマトグラフィー工程には、プロテインＡまたはプロテインＧが固定されたアフィニティクロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィー、ミックスモード（mixed-mode）またはマルチモーダル（Multimodal）クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィーなどの種々の技術からなる一連のクロマトグラフィー法を所定の条件下で行うことを特徴とする。ただし、アフリベルセプト（またはアフリベルセプトバイオシミラー）物質を高純度に精製するために行われるクロマトグラフィーの特定の条件は未だ明らかにされていない。
本発明者らは、動物細胞株を用いた細胞培養から生成されたアフリベルセプトで重合体、エンドトキシン、異種タンパク質、核酸、高等電点類似体の形態の不純物などを効果的に除去し、ヒトに使用することができる高純度医薬品として開発するための一連の工程を完成しようとした。
本発明者らは、本発明に至る工程において、試料の注入量が限られているため生産性に否定的な影響を及ぼす可能性があるサイズ排除クロマトグラフィーは除外し、有機溶媒等を使用しないのでタンパク質変性させ難いという利点を有する工程を完成しようとした。
本発明者らは、特に、アフリベルセプトは一般的な抗体医薬品に比べてはるかに多い計１０個のＮ－結合型糖鎖構造を含み、それぞれの糖鎖構造の末端部位には、負電荷を帯びるシアル酸が含まれることから、種々の含有量で存在するシアル酸糖によってｐＨ６～１０以上の非常に広い範囲で等電点値を有する複合物の形態を示すという点に着眼し、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーと陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを特定の条件で行うことにより、非常に特定な範囲（ｐＨ６．０～８．３）の等電点値を示す物質のみを高純度で精製する技術を提供することを試みた。
前記技術的課題を解決するために本発明は、
（ａ）ｐＨ４．５～６．６の緩衝液で平衡化された陽イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程；
（ｂ）ｐＨ４．５～６．６の条件で０～４０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；及び
（ｃ）ｐＨ４．５～６．６の条件で、工程（ｂ）工程よりも高い濃度で、かつ４０～１２０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲のアフリベルセプトを採取する工程；
で行われる陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を提供し、これによってｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することができる。
前記においてカラムの平衡化、洗浄及び溶出の工程に用いられる緩衝液は、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである。
また、前記において陽イオン交換樹脂のリガンドは、カルボキシメチル（ＣＭ）基である。
また、本発明は、
（ａ）ｐＨ７．５～９．０の緩衝液で平衡化された陰イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程；
（ｂ）ｐＨ７．５～９．０の条件で０～２０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；及び
（ｃ）ｐＨ７．５～９．０の条件で工程（ｂ）よりも高い濃度で、かつ２０ｍＭ～１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含んで溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程；
で行われる陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を提供することにより、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することができる。
上記においてカラムの平衡化、洗浄及び溶出の工程に用いられる緩衝液は、リン酸ナトリウムまたはトリス（Ｔｒｉｓ）である。
また、前記において陰イオン交換樹脂のリガンドは、第四級アンモニウム（Ｑ）基である。
上記においてアフリベルセプトタンパク質の混合物に対して陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーまたは陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行う前に、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、及び脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法を適用することができる。
また、前記陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー法と前記陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー法を併用することにより、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを精製することもできる。
本発明では、アフリベルセプト最終精製物を硝子体内注射（intravitreal injection）に適合するように、次の３つの組成のいずれかに製剤化する方法も提示する：
（ａ）１０ｍＭ酢酸ナトリウム、７％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成；
（ｂ）１０ｍＭ酢酸ナトリウム、６．５％スクロース、１５ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成；
（ｃ）５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成。
上記の本発明について詳細に説明する。
本発明を実施するための一態様は、形質転換された動物細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO cell）からの細胞培養を通じて発現された標的タンパク質であるアフリベルセプトを高収率かつ高純度で精製する方法である。
工業的な生産規模において、サイズ排除クロマトグラフィーに注入することができる試料の注入量は限られており生産性に否定的な影響を及ぼしうるので、本発明では、サイズ排除クロマトグラフィー工程は除外した。また、有機溶媒などの使用によるタンパク質変性の可能性がある逆相クロマトグラフィー工程や高濃度塩の使用によるタンパク質変性があり得る疎水性クロマトグラフィー工程も除外した。
本発明の好ましい一実施形態によれば、糖鎖構造の末端に存在するシアル酸の含有量の異質性（heterogeneity）によって引き起こされる種々の等電点を有するアフリベルセプト物質から比較的高い等電点類似体形態の不純物を除去し、特定の範囲の等電点値を示す物質のみを高純度で精製するための陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの特定の実施条件が１回以上適用される。
また、本発明の好ましい一実施形態によれば、糖鎖構造の末端に存在するシアル酸の含有量の異質性によって引き起こされる種々の等電点を有するアフリベルセプト物質から比較的高い等電点類似体形態の不純物を除去し、特定の範囲の等電点値を示す物質のみを高純度で精製するための陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーの特定の実施条件が１回以上適用される。
また、本発明の好ましい一実施形態によれば、前記陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの特定の実施条件と、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーの特定の実施条件とを一緒に適用することができる。
１つの具体例において、本発明の精製方法を実施する前に、プロテインＡを固定化したアフィニティクロマトグラフィー工程、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー工程、及び限外濾過（Diafiltration）工程をさらに実施することができる。
本発明の特徴及び利点は、以下のように要約される。
（ａ）本発明は、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプト（またはアフリベルセプトバイオシミラー）のみを効果的に精製することができる新規な精製方法を提供する。
（ｂ）本発明によれば、非常に広い範囲の等電点分布を示すアフリベルセプトの物理化学的性質による、製造における困難性を克服し、工業的規模で大量生産することができる精製方法を提供する。
（ｃ）本発明は、各クロマトグラフィー工程間の歩留まり低下を引き起こしうる緩衝液交換工程である限外濾過工程を実施しなくても、高収率で大量生産することができる精製方法を提供する。
（ｄ）本発明によれば、細胞培養工程を通じて発現されるアフリベルセプト物質から３回または４回のクロマトグラフィー工程を通じて不純蛋白質を効果的に除去することにより、滲出型加齢黄斑変性症、糖尿病性黄斑浮腫などの種々の眼の疾患に罹患している患者の硝子体内投与（intravitreal administration）および眼内投与に好適に適用することができるアフリベルセプトを獲得することができる。
Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いたマルチモーダルクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。装填および洗浄中に得られた画分は、図面の下部に示す。 本発明による精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトを含む画分物を、等電点分析電気泳動のクマシー染色結果を示す図である。 レーン１：ｐＩマーカー（ＳＥＲＶＡ社） レーン２：アフリベルセプト内部標準品 レーン３：陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態１－１） レーン４：陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態１－２） レーン５：陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態１－３） レーン６：陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態１－４） レーン７：陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態１－５） 本発明による精製方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトを含む画分物を等電点分析電気泳動のクマシー染色結果を示す図である。 レーン１：ｐＩマーカー（ＳＥＲＶＡ社） レーン２：アフリベルセプト内部標準品 レーン３：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－１） レーン４：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－２） レーン５：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－３） レーン６：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－４） レーン７：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－５） レーン８：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー分画物（実施形態２－６） 本発明による精製方法において、陽イオン交換クロマトグラフィーの適用後の試料を陰イオン交換クロマトグラフィーに装填し、洗浄過程後に溶出させた画分物を等電点分析電気泳動のクマシー染色結果を示す図である。 レーン１：ｐＩマーカー（ＳＥＲＶＡ社） レーン２：アフリベルセプト内部標準品 レーン３：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーの洗浄画分物 レーン４：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーの溶出液画分物 レーン５：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーの装填試料（陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーの溶出液）
本発明のアフリベルセプトの精製工程を各工程別に、また実施形態と共に詳細に説明すると次の通りである。ただし、これらの工程の説明や実施形態は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
工程１．アフリベルセプト発現動物細胞の培養物から前処理溶液を得る
まず、アフリベルセプト発現動物細胞の培養物から動物細胞を除去し、前処理溶液を得た。アフリベルセプト発現動物細胞は、好ましくは哺乳類、げっ歯類、鳥類または昆虫細胞であり、より好ましくはＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＮＳ０細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ細胞である。
アフリベルセプト発現動物細胞は、当業界に公知の多様な方法で培養することができる。例えば、当業界に公知のＣＨＯ細胞培養方法のうちの一つである回分培養法（batch culture）、流加培養法（fed-batch culture）、繰り返し流加培養法（repeated fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）または潅流培養法（perfusion culture）からなる群から選択されたいずれか１つ以上の方法を実施することができる。
動物細胞の培養液には、一般的に、タンパク質、糖類、脂肪など多様な不純物が混入しているので、本発明による精製方法において、精製効率を高めるためにカラムクロマトグラフィーを行う前に不純物を除去する前処理工程が必要である。
好ましくは、前処理工程は、デプスフィルター及びメンブレンフィルター法のような当該技術分野で公知の多様な方法によって実施することができる。
工程２．前処理された培養液からアフリベルセプトを精製する
上記の前処理された培養液は、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトのみを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、アフィニティクロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される少なくとも一つ以上の方法により精製することができるが、これに限定されるものではない。
モノクローナル抗体及びＦｃ－融合タンパク質の場合、精製工程用の業界標準は、典型的にいくつかの工程を含む精製工程を含む。本発明の一実施形態では、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを用いて前処理した培養液を１次精製した。これは、抗体またはＦｃ－融合タンパク質のＦｃ－領域に結合するプロテインＡと呼ばれるリガンド親和性を適用する精製工程であり、前培養液をプロテインＡカラムに装填し、洗浄し、次いで約ｐＨ３内外の酢酸またはクエン酸緩衝液で溶出させることによって一次的に精製されたアフリベルセプト画分を得ることができた。
タンパク質凝集体または高分子量タンパク質種は、Ｆｃ－融合タンパク質または抗体分子を含む生物学的調製物から除去する必要がある主要汚染物質の１つである。例えば、タンパク質凝集体および他の汚染物質は、製品が、診断、治療または他の用途に使用される前に、生物学的物質から除去しなければならない。本発明の一実施形態では、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィーを使用したが、プロテインＡクロマトグラフィーを介して１次精製された画分物を何ら限外濾過工程なしにミックスモードまたはマルチモーダル樹脂に装填することにより実施した。
互いに異なるが機能する２以上の部位が標的タンパク質と相互作用するマルチモーダルクロマトグラフィーが有用に適用することができ、溶出されたプールは、タンパク質凝集体および他の培養液中の不純物が除去されることにより、より高純度のアフリベルセプト物質を得ることができる。
本発明において、アフリベルセプトの精製に使用されるミックスモードまたはマルチモーダル樹脂は、市中で入手可能であり、例えば、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＭＢＩ ＨｙｐｅｒＣｅｌＴＭ（Ｐａｌｌ）などがある。Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅＴＭは、従来のイオン交換体に対して別の選択性を付与するマルチモーダル官能基を有するリガンドを含有し、標的分子と相互作用するための多用な官能基を示すが、イオン性相互作用、水素結合相互作用、および疎水性相互作用を提供する。本発明の一実施形態において用いられたマルチモーダル樹脂は、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅＴＭであるが、これに限定されるものではないことは当業者には自明であろう。
ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィーは、通常、カラム平衡化工程、装填工程および溶出工程によって行われるが、装填後、溶出の前に１つ以上の洗浄工程を含むことができる。高純度アフリベルセプト収得物は、装填および洗浄工程中に、樹脂に結合しない方法で得ることができるか、或いは一旦樹脂に結合した後に溶出工程で得られるように実施条件を調整することができる。本発明の一例では、Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂１０ｍｌを充填したカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ１６／２０）に２０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）で平衡化した樹脂を用いて、図１のカラムクロマトグラフィーグラフに示す、装填工程及び洗浄工程（平衡化緩衝液と同じ）中に、樹脂に結合することなく流出する溶液を得ることにより効果的にタンパク質凝集体およびその他の不純物を除去することができ、次の工程であるイオン交換クロマトグラフィー工程で装填試料を装填するために、装填試料の緩衝液を交換する限外濾過工程を行わないことがさらに可能であった。
工程３．特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトを精製する
上記の前処理された培養液は、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプトのみを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、アフィニティクロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法により精製することができるが、これに限定されるものではない。
等電点パターンを解析する方法としては、等電点電気泳動法（Isoelectric focusing）を採用したが、２０μｇの標準液と検液を用意したのち、Ｎｏｖｅｘ ｐＨ３～１０ ＩＥＦ Ｇｅｌ １．０ｍｍ、１０ｗｅｌｌ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に装填し、１００Ｖ、２００Ｖ、５００Ｖの電圧でそれぞれ１時間、１時間、３０分間電気泳動させた。１２％トリクロロ酢酸で３０分間ゲルを固定し、超純水で１０分間ずつ３回洗浄し、クマシー染色液で染色した後、観察した。
以下、陽イオン交換クロマトグラフィー（実施形態１）を行い、陰イオン交換クロマトグラフィー（実施形態２）を行い、陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを併用して行う（実施形態３）ことについて、別に説明する。
＜実施形態1：陽イオン交換クロマトグラフィーを実施＞
（１）陽イオン交換クロマトグラフィーの実施方法
工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより得られたアフリベルセプトの試料溶液、またはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーを併用して、採取されたアフリベルセプト試料溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィーに適用して、特定の範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
本発明で用いられる陽イオン交換樹脂で帯電した官能基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）などが可能であり、陽イオン交換樹脂の支持体としては、ポリスチレン（polystyrene）、ポリスチレン／ジビニルベンゼン（polystyrene/divinyl benzene）、セルロース（cellulose）、デキストラン（dextran）、アガロース（agarose）およびトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）等が挙げられる。本発明では一実施形態として用いられた陽イオン交換体としては、特にカルボキシメチル（ＣＭ）リガンドが挙げられる。
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー工程に用いられる緩衝液としては、緩衝能を有する種々の緩衝液も使用可能であり、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびグリシン－ＨＣｌが挙げられる。
平衡溶液としては、各種の緩衝液、特に酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム緩衝液を用いることができ、ｐＨが４．５～６．６である。洗浄溶液としては、各種の緩衝液、特に酢酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム緩衝液を用いることができ、ｐＨが４．５～６．６であり、低濃度（すなわち、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有していない場合は０～４０ｍＭ濃度範囲であり、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有する場合は０超４０以下の濃度範囲であることを意味する）の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことができる。溶出溶液としては、種々の緩衝液、特に酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いることができ、ｐＨは４．５～６．６であり、塩化ナトリウムあるいは塩化カリウム塩の濃度が増加するにつれて、ｐＩ値が低いタンパク質から順に溶出されることが確認された。等電点が８．３以下の物質を精製するためには、約１２０ｍＭ未満の塩濃度で溶出することが好ましい。
本発明者らは、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うに際に、平衡化、洗浄及び溶出工程でｐＨ４．５～６．６の範囲の溶液を使用したが、これは、ｐＨが４．５未満の条件ではシアル酸含有量の低いアフリベルセプト物質が採取されるという短所があり、ｐＨ６．６超の条件では採取しようとする特定範囲（ｐＨ６．０～８．３）の等電点値を有するアフリベルセプト物質が焼失してしまい、精製の収率が低下する短所があるからである。
本発明の具体的な一実施形態を参照して、上記工程を説明すると、次の通りである。
弱酸性陽イオン交換樹脂の一種であるＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂２ｍｌを充填したＴｒｉｃｏｎカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、直径０．５ｃｍ、高さ１０ｃｍ）を用いて、ｐＩ ｃｕｔｔｉｎｇを適正なｐＨ、塩濃度を見出すための予備実験として、１）ＮａＣｌ塩濃度勾配溶出法と、２）ｐＨ勾配溶離法を実施した。
まず、ＮａＣｌ塩濃度勾配法（Salt gradient method）試験は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１０カラムボリューム（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを平衡化し、前述した工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたアフリベルセプト試料溶液をそれぞれの平衡化緩衝液で希釈し、ｐＨを平衡化緩衝液のｐＨと同じになるように調整した後、上記のカラムに０．３ｍＬ／分の流速で装填した。カラムを５ＣＶの同じ平衡緩衝液で洗浄した後に、３０ＣＶの溶出緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）を０％～１００％になるように流して、塩濃度の増加によりタンパク質が溶出されるようにしながら、自動分画器で１６分画を採取した。採取した画分を等電点電気泳動分析法で分析した結果、塩化ナトリウム塩の濃度が増加するにつれて、ｐＩ値が低いタンパク質から順に溶出されることが確認され、等電点が８．３以下の物質を精製するためには、約１２０ｍＭ未満の塩濃度で溶出することが好ましい。
ｐＨグラジェント溶出法（pH gradient method）試験では、１０ＣＶの平衡緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）でカラムを平衡化し、アフリベルセプト試料溶液を、前記塩濃度勾配法と同様の方法で処理した後、５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した後に、３０ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５）を０％～１００％となるように流し、ｐＨを上昇させることによりタンパク質を溶出され、自動分画器で２０分画を採取した。採取した画分を、等電点電気泳動で分析し、その結果、ｐＨが上昇するにつれて、ｐＩ値が低いタンパク質から順に溶出されることを確認した。より詳細なｐＨ条件を探索するために、段階的ｐＨ溶出（stepwise pH elution）条件の試験を行ったところ、ｐＨが６．６以下の条件で陽イオン交換クロマトグラフィーの平衡および洗浄工程を実施することが好ましいことを見出し、将来のスケールアップの再現性のために、ｐＨ溶出法よりはより安定した工程を実現することが可能な塩濃度増加溶出法を選択し、表１のようなより精密な溶出条件を完成するに至った。
表１の各実施形態の条件により、平衡緩衝液を１５０ｃｍ／時の流速で樹脂を平衡化させる。次いで、前述した工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたアフリベルセプト試料溶液を、各種の平衡化緩衝液で希釈した後、ｐＨを平衡化緩衝液のｐＨと同一に調整した後に、ＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂を充填した上記のカラムに１５０ｃｍ／時間の流速で装填した。それから、表１の各実施形態の条件に応じて洗浄緩衝液で洗浄工程を１５０ｃｍ／時の流速で実施し、等電点値が相対的に高いアフリベルセプト物質を除去した後に、溶出緩衝液を１５０ｃｍ／時の流速で流してあげ、特定の範囲（ｐＨ６．０～８．３）の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを採取することができた。試験に用いられた樹脂は、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で再生した後に、各種の平衡緩衝液で再平衡化した後、再利用した。
Figure 0007320121000001
（２）陽イオン交換クロマトグラフィーの実施結果
弱陽イオン交換樹脂の一種であるＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂を用いて種々の平衡化、洗浄条件、及び溶出条件を試験したが、平衡溶液としては、主に酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いており、ｐＨが４．５～６．６である。洗浄溶液としては、主に酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いており、ｐＨが４．５～６．６であり、低濃度（すなわち、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有しない場合は０～４０ｍＭ濃度範囲であり、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含有する場合は、０超４０以下の範囲であることを意味する）の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことが好ましい。酢酸ナトリウムとリン酸ナトリウム緩衝液を用いた溶出溶液で用いられるｐＨは４．５～６．６であり、より高い濃度（４０～１２０ｍＭ濃度範囲）の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが含まれた。より好ましい溶出溶液の塩化ナトリウム塩濃度は４０～１００ｍＭであり、表１に示すそれぞれの平衡化工程、装填工程、洗浄工程、溶出工程を実施し、標準品アフリベルセプトとほぼ同等の等電点値の範囲（ｐＨ６．０～８．３）を有するアフリベルセプト物質を効果的に精製することができた。
表２と図２に示す等電点の分析結果によれば、アフリベルセプト標準品との比較を考慮し、表１におけるクロマトグラフィーを実施するための詳細条件に従って、ＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂を用いたクロマトグラフィー精製方法を有効に利用することができることを確認した。
一方、本発明者らは、洗浄工程および溶出工程中に、自動分画器を用いて洗浄液および溶出液から１カラムボリユーム（ＣＶ）に相当する容積単位の画分を得、これらの分画をそれぞれ等電点分析で分析し、標準品アフリベルセプトと最も類似する等電点範囲を有するように特定の洗浄液および溶出液画分を回収したときに、等電点プロファイルの類似性を確保することがより容易であることを見出し、このような分画化の方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー工程で選択的に利用することができる。
Figure 0007320121000002
＜実施形態２：陰イオン交換クロマトグラフィーの実施＞
（１）陰イオン交換クロマトグラフィーの実施方法
工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを通じて採取したアフリベルセプト試料溶液またはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーを併用して採取されたアフリベルセプト試料溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーに適用し、特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
本発明で用いられる陰イオン交換樹脂が帯電した官能基は、アミンまたはアミノ基、より好ましくは一級アミン、二級アミン、三級アミンまたは四級アミン、最も好ましくは三級アミン、四級アミンであり、陰イオン交換樹脂の支持体はポリスチレン、ポリスチレン／ジビニルベンゼン、セルロース、デキストラン、アガロースおよびトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ)などがある。本発明において一実施形態として用いられた陰イオン交換体には、特にジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アンモニウム（Ｑ）リガンドを有する。
本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーの工程で用いられる緩衝液としては、緩衝能を有する各種の緩衝液も用いることができ、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＨＣｌおよびトリス（Ｔｒｉｓ）を含む。
平衡溶液としては、種々の緩衝液、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、ｐＨは７．５～９．０の範囲で行うことができる。洗浄溶液としては、種々の緩衝液、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、ｐＨは７．５～９．０の範囲であり、低濃度（すなわち、０～２０ｍｍ濃度範囲は、塩化ナトルムまたは塩化カリウムを含有しないもの、またはもしあれば０以上２０ｍＭ以下の濃度範囲で塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを含有することを意味する）の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことができる。溶出溶液としては、各種の緩衝液、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムの塩濃度が増加するにつれて、ｐＩ値の高いタンパク質から順に溶出されることが確認されており、等電点が８．３以下の物質を精製するためには、約１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出することが好ましかった。
本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィーを行う際に、平衡化、洗浄および溶出工程中、ｐＨ７．５～９．０の範囲の溶液を用いた。これはｐＨ７．５未満の条件では、採取しようとする特定範囲（ｐＨ６．０～８．３）で等電点値を有するアフリベルセプト物質が焼失してしまうことがあるので、精製収率が減少するという短所があり、ｐＨ９．０超の条件ではシアル酸含量が低いアフリベルセプト物質を採取するからである。
以下、具体例を参照して、本発明の一実施形態について説明する。強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂２ｍｌを充填したＴｒｉｃｏｎカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、直径０．５ｃｍ、高さ１０ｃｍ）を用いて、ｐＩ ｃｕｔｔｉｎｇをする適正なｐＨ、塩濃度を求めるための予備実験として、１）ＮａＣｌ塩勾配溶出法と２）ｐＨ勾配溶離法を実験した。
まず、ＮａＣｌ塩勾配法試験では、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）１０カラムボリユーム（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを平衡化し、前述した工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたアフリベルセプト試料溶液を各種の平衡化緩衝液で希釈した後、ｐＨを平衡化緩衝液のｐＨと同一に調整した後に、上記のカラムに０．３ｍＬ／分の流速で装填した。同じ５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した後に、３０ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．５）を０％～１００％になるように流してあげて、塩濃度の増加によりタンパク質が溶出されるようにしながら、自動分画器で１３分画を採取した。採取した分画を、等電点電気泳動によって分析した結果、塩化ナトリウムの塩濃度が増加するにつれて、ｐＩ値の高いタンパク質から順次溶出されることが確認されており、等電点が８．３以下の物質を精製するためには、約１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出することが好ましい。
ｐＨグラジェント溶出法のための試験は、１０ＣＶの平衡緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）でカラムを平衡化し、アフリベルセプト試料溶液を、前記塩濃度勾配法と同様の方法で行った後、５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した後、３０ＣＶの溶出緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ５．５）を０％～１００％となるように流してあげ、ｐＨの減少によってタンパク質が溶出されるようにしながら、自動分画器で２５分画を採取した。採取した分画を、等電点電気泳動法で分析した結果、ｐＨが減少するにつれて、ｐＩ値が高いタンパク質から順次溶出されることが確認されており、ｐＨ７．５以下の平衡および洗浄条件では、等電点が比較的に低いアフリベルセプトタンパク質もカラムに吸着しないので、ｐＨ７．５以上の条件でクロマトグラフィーを行うことが好ましいことを見出し、将来のスケールアップの再現性のために、ｐＨ溶出法よりより安定した工程を実現することができる塩濃度増加溶出法を選択し、表３に示すようにより精密なクロマトグラフィー条件を完成するに至った。
表３の各実施形態の条件により平衡緩衝液を１５０ｃｍ／時の流速で樹脂を平衡化させた。次いで、前記工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたアフリベルセプト試料溶液を各種の平衡化緩衝液で希釈した後、ｐＨを平衡緩衝液のｐＨと同一に調整した後に、Ｑ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂を充填した上記のカラムに１５０ｃｍ／時の流速で装填した。それから、表３の各実施形態の条件に従って洗浄緩衝液で洗浄工程を１５０ｃｍ／時の流速で行い、比較的に高い等電点値を有するアフリベルセプト物質を除去した後に、溶出緩衝液を１５０ｃｍ／時の流速で流してあげ、特定範囲（ｐＨ６．０～８．３）の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを採取することができた。試験に用いられた樹脂は、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で再生した後に各種の平衡緩衝液で再平衡化した後、再利用した。
Figure 0007320121000003
（２）陰イオン交換クロマトグラフィーの実施結果
強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂を用いて種々の平衡化及び洗浄条件、溶出条件を試験したが、平衡溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、ｐＨは７．５～９．０の範囲で行うことができ、洗浄溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、ｐＨは７．５～９．０の範囲であり、低濃度（０～２０ｍＭ濃度範囲）の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むことが好ましい。溶出溶液としては、特にリン酸ナトリウムとトリス緩衝液を用いることができ、等電点が８．３以下の物質を精製するためには、洗浄工程の塩濃度よりも高い２０ｍＭ以上、かつ約１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出することが好ましく、より好ましくは溶出溶液の塩化ナトリウム塩濃度は、ｐＨ＝７．５～８．５のｐＨの条件で２０ｍＭ～９０ｍＭ条件である。しかし、９０ｍＭ以上の塩濃度であっても標的とする等電点範囲のアフリベルセプトを精製することが可能であるが、溶出ピークの形状が比較的シャープでありながら、採取される分画間の等電点値の差が小さくなる傾向があった。
表３に示す各種の平衡化工程、装填工程、洗浄工程、溶出工程を実施し、標準品アフリベルセプトとほぼ同様の等電点値範囲（ｐＨ６．０～８．３）を有するアフリベルセプト物質を効果的に精製することができ、表４と図３に示す等電点分析結果によれば、アフリベルセプト標準品との比較を考慮し、表３のクロマトグラフィーの詳細な実施条件に従って、Ｑ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂を用いたクロマトグラフィー精製方法を有効に利用することができることを確認した。
一方、本発明者らは、洗浄工程および溶出工程中に１カラムボリユーム（ＣＶ）に相当する容積単位で洗浄液および溶離液を自動分画器を用いて分画を得、これらの分画のそれぞれを等電点分析法で分析した後、標準品アフリベルセプトと最も類似する等電点範囲を有するように特定の洗浄液および溶出液分画を収取したときに等電点プロファイルの類似性は確保しやすいことを見出し、このような分画化方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程で選択的に用いることができる。
Figure 0007320121000004
＜実施形態３：陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオンクロマトグラフィーとｗ併用して実施＞
前記工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを通じて採取したアフリベルセプト試料溶液またはプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとマルチモーダルクロマトグラフィーが一緒に採取されたアフリベルセプト試料溶液に対して陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーを併用して、特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを精製する。
すなわち、前記実施形態１の実施方法に従って、最初に陽イオン交換樹脂であるＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを行った後、陰イオン交換樹脂であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを順次実施するか、または最初に陰イオン交換樹脂であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを行った後、陽イオン交換樹脂であるＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを順次行えば、ｐＨ６．０～８．３の特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみをより容易に精製することができ、精製収率もまた単独でイオン交換クロマトグラフィーを実施した時より増加することができるという長所がある。
陽イオン交換樹脂であるＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを行った後に陰イオン交換樹脂であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂クロマトグラフィーを並行して実施する方法を詳細に説明すれば次の通りである。順次クロマトグラフィー法を適用するためには、表１の洗浄緩衝液と溶出緩衝液の塩濃度をそれぞれ０～３０ｍＭ程度下げるのが有利である。ＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂１０ｍｌを充填したカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ１６／２０）に平衡緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）を１ｍＬ／分の流速で樹脂を平衡化させる。次いで、前記工程２のプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅマルチモーダルクロマトグラフィーを行って得られたアフリベルセプト試料溶液を平衡緩衝液で希釈した後にｐＨを平衡緩衝液のｐＨと同一に調整した後に、ＣＭ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂を充填した上記のカラムに１ｍＬ／分の流速で装填した。３カラムボリューム（ＣＶ）の平衡緩衝液を流した後に２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）の洗浄緩衝液で洗浄工程を１ｍＬ／分の流速で行い、比較的高い等電点値を有するアフリベルセプト物質を除去した後に、溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５）を１ｍＬ／分の流速で流してあげながら自動分画に分画される。特定範囲（ｐＨ６．０～９．０）の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを採取した後に、この試料を以降のＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程の平衡緩衝液で１０倍に希釈し、ｐＨを８．５に調整して用意した。強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるＱ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ樹脂１０ｍｌを充填したカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ１６／２０）に平衡緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）を１ｍＬ／分の流速で樹脂を平衡化させる。次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーの実施後、用意されたアフリベルセプト試料溶液をカラムに１ｍＬ／分の流速で装填した。その後に２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）の洗浄緩衝液で洗浄工程を、１ｍＬ／分の流速で行い、比較的高い等電点値を有するアフリベルセプト物質を除去した後に、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス、１２０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．５）を１ｍＬ／分の流速で流してあげ、特定範囲（ｐＨ６．０～８．３）の等電点値を有するアフリベルセプト物質のみを採取することができた。
実施形態３の陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーの併用的な実行方法による、特定範囲の等電点値の範囲を有するアフリベルセプトの精製収率は、単独で行われた陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーの実施方法に比べて約１５～３０％高い値を示し、図４に示す等電点分析結果から分かるように、標準品に比べて非常に類似した等電点分布を有するアフリベルセプト物質を製造することができる。
工程４．配合過程を通じた最終原液の調製
前記の陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン／陰イオン交換樹脂を併用して精製する工程により採取したｐＨ６．０～８．３の等電点を有するアフリベルセプト溶液を最終的に剤形化して原液を溶液を調製するために、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ）を用いて濃縮した後に、配合緩衝液を繰り返し添加する方法で配合緩衝液で置換し、ポリソルベート２０の場合は、最終的に０．０３％の含有量になるように添加し、約４０ｍｇ／ｍｌの含有量を有するアフリベルセプトを含む最終原液を調製した。このとき選択される配合緩衝液の組成は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、７％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成を選択してもよく、長期安定性をより改善するために塩の濃度を高めた１０ｍＭ酢酸ナトリウム、６．５％スクロース、１５ｍＭ塩化ナトリウム、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成を選択してもよく、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、６％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０、ｐＨ５．５の組成を選択してもよく、除菌ろ過工程は、０．２２ｕｍＰＥＳ膜を用いて実施した。
以上のように、本発明は陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーまたは陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いて、それぞれの工程を特定の条件下で行い、特定範囲の等電点値を有するアフリベルセプトを精製する方法であって、最終的には、前記工程１～４までの製造工程を通じてより経済的で、高純度の眼科用タンパク質医薬品を製造することができる利点を提供する。
本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができることを理解することができる。これに関連して、以上で記述した実施形態はすべての面で例示として解釈されるべきであり、本発明を限定するものではないと解釈されるべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明より後述する特許請求範囲の定義及び範囲に由来する全ての変更または修正およびそれらの等価物は、本発明の範囲内にあることも理解されるべきである。

Claims (9)

  1. 陽イオン交換クロマトグラフィー法の後に陰イオン交換クロマトグラフィー法を行うことによる、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトの精製方法であって、
    前記陽イオン交換クロマトグラフィー法の工程が下記の工程：
    （ａ－１）ｐＨ４．５～６．６の緩衝液で平衡化された陽イオン交換樹脂に、アフリベルセプト混合物を装填する工程；
    （ａ－２）ｐＨ４．５～６．６の条件で０～４０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；および
    （ａ－３）ｐＨ４．５～６．６の条件で工程（ａ－２）よりも高い濃度で、かつ４０～１２０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程
    を含み、かつ、
    前記陰イオン交換クロマトグラフィー法の工程が下記の工程：
    （ｂ－１）ｐＨ７．５～９．０の緩衝液で平衡化された陰イオン交換樹脂に工程（ａ－３）におけるｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを装填する工程；
    （ｂ－２）ｐＨ７．５～９．０の条件で０～２０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；および
    （ｂ－３）ｐＨ７．５～９．０の条件で工程（ｂ－２）よりも高い濃度であり、かつ２０～１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程
    を含む、方法。
  2. 陰イオン交換クロマトグラフィー法の後に陽イオン交換クロマトグラフィー法を行うことによる、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）の精製方法であって、
    前記陰イオン交換クロマトグラフィー法の工程が下記の工程：
    （ｂ－１）ｐＨ７．５～９．０の緩衝液で平衡化された陰イオン交換樹脂にアフリベルセプト混合物を装填する工程；
    （ｂ－２）ｐＨ７．５～９．０の条件で０～２０ｍＭ濃度の塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；および
    （ｂ－３）ｐＨ７．５～９．０の条件で工程（ｂ－２）よりも高い濃度であり、かつ２０ｍＭ～１５０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程
    を含み、かつ、
    前記陽イオン交換クロマトグラフィー法の工程が下記の工程：
    （ａ－１）ｐＨ４．５～６．６の緩衝液で平衡化された陽イオン交換樹脂に工程（ｂ－３）におけるｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを装填する工程；
    （ａ－２）ｐＨ４．５～６．６の条件で０～４０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で洗浄する工程；および
    （ａ－３）ｐＨ４．５～６．６の条件で工程（ａ－２）よりも高い濃度であり、かつ４０～１２０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む緩衝液で溶出し、ｐＨ６．０～８．３の範囲の等電点を有するアフリベルセプトを採取する工程
    を含む、方法。
  3. 前記工程（ａ－１）、（ａ－２）および（ａ－３）における緩衝液が、酢酸ナトリウム緩衝液およびリン酸ナトリウム緩衝液からなる群から選択される少なくとも１種であり、かつ、
    前記工程（ｂ－１）、（ｂ－２）および（ｂ－３）における緩衝液が、リン酸ナトリウム緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記陽イオン交換樹脂のリガンドが、カルボキシメチル（ＣＭ）基である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 陰イオン交換樹脂のリガンドは、第四級アンモニウム（Ｑ）基である、請求項１または２に記載の方法。
  6. アフリベルセプト混合物に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、プロテインＡ アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモード（ｍｉｘｅｄ－ｍｏｄｅ）またはマルチモーダル（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）クロマトグラフィー、脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法を適用する、請求項１または２に記載の方法。
  7. アフリベルセプト混合物に対して陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、プロテインＡ アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードまたはマルチモーダルクロマトグラフィー、および脱塩限外濾過工程からなる群から選択される一つ以上の方法を適用する、請求項１または２に記載の方法。
  8. 前記工程（ｂ－３）における緩衝液が２０～９０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含む、請求項１または２に記載の方法。
  9. 前記工程（ｂ－３）における緩衝液が２０～９０ｍＭの塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含み、ｐＨが７．５～８．５である、請求項１または２に記載の方法。
JP2022501046A 2019-07-08 2019-09-09 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ） Active JP7320121B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023118537A JP2023139142A (ja) 2019-07-08 2023-07-20 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190082061A KR102286892B1 (ko) 2019-07-08 2019-07-08 안과용 단백질 제제의 정제방법
KR10-2019-0082061 2019-07-08
PCT/KR2019/011642 WO2021006419A1 (en) 2019-07-08 2019-09-09 Refining method of ophthalmic protein pharmaceutical

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023118537A Division JP2023139142A (ja) 2019-07-08 2023-07-20 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022540838A JP2022540838A (ja) 2022-09-20
JP7320121B2 true JP7320121B2 (ja) 2023-08-02

Family

ID=74115047

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022501046A Active JP7320121B2 (ja) 2019-07-08 2019-09-09 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
JP2023118537A Pending JP2023139142A (ja) 2019-07-08 2023-07-20 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023118537A Pending JP2023139142A (ja) 2019-07-08 2023-07-20 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）

Country Status (7)

Country Link
US (1) US12545715B2 (ja)
EP (1) EP3997123B1 (ja)
JP (2) JP7320121B2 (ja)
KR (2) KR102286892B1 (ja)
CN (1) CN114206923B (ja)
TW (1) TWI754898B (ja)
WO (1) WO2021006419A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202110968VA (en) * 2019-12-06 2021-10-28 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
CN118414350A (zh) * 2021-10-19 2024-07-30 阿特根公司 纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法
EP4704996A2 (en) * 2023-05-05 2026-03-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multimodal chromatography resins with anionic and cationic ligands

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017505780A (ja) 2014-02-04 2017-02-23 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 翻訳後修飾を濃縮するための、フロースルーモードにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの使用
JP2017521389A (ja) 2014-06-13 2017-08-03 ルピン・リミテッド ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の精製方法
WO2017168296A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Navya Biologicals Pvt. Ltd A process for purification of fc-fusion proteins
WO2018018011A2 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Amgen Inc. Methods of purifying fc-containing proteins
WO2018116198A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Serum Institute Of India Private Limited Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof
JP2019517513A (ja) 2017-04-26 2019-06-24 サム チュン ダン ファーム．カンパニー，リミテッド 眼科用医薬組成物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2654510C (en) * 2006-06-16 2015-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
CN112126634A (zh) * 2013-01-09 2020-12-25 夏尔人类遗传性治疗公司 含用于纯化芳基硫酸酯酶a的方法
CN105175548B (zh) 2015-08-13 2019-02-05 齐鲁制药有限公司 重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法
CN109929027B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法
CN109929038B (zh) 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017505780A (ja) 2014-02-04 2017-02-23 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 翻訳後修飾を濃縮するための、フロースルーモードにおける陽イオン交換クロマトグラフィーの使用
JP2017521389A (ja) 2014-06-13 2017-08-03 ルピン・リミテッド ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の精製方法
WO2017168296A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Navya Biologicals Pvt. Ltd A process for purification of fc-fusion proteins
WO2018018011A2 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Amgen Inc. Methods of purifying fc-containing proteins
WO2018116198A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Serum Institute Of India Private Limited Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof
JP2019517513A (ja) 2017-04-26 2019-06-24 サム チュン ダン ファーム．カンパニー，リミテッド 眼科用医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021006419A1 (en) 2021-01-14
TW202112798A (zh) 2021-04-01
EP3997123B1 (en) 2026-05-06
KR102286892B1 (ko) 2021-08-06
EP3997123A1 (en) 2022-05-18
TWI754898B (zh) 2022-02-11
CN114206923A (zh) 2022-03-18
US20220267411A1 (en) 2022-08-25
EP3997123A4 (en) 2023-08-30
KR102530098B1 (ko) 2023-05-08
JP2023139142A (ja) 2023-10-03
KR20210097094A (ko) 2021-08-06
JP2022540838A (ja) 2022-09-20
US12545715B2 (en) 2026-02-10
KR20210006147A (ko) 2021-01-18
CN114206923B (zh) 2025-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2791176T3 (en) PROCEDURE FOR CLEANING ANTIBODIES
JP6280499B2 (ja) Ｆｃ融合タンパク質の精製方法
JP5567691B2 (ja) Ｆｃ含有タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法
JP4198751B2 (ja) 抗体の精製
JP2023139142A (ja) 眼科用タンパク質医薬品の精製方法（Ｒｅｆｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）
DK3040346T3 (en) PROCEDURE FOR CLEANING THE GRANULOCYT COLONY STIMULATING FACTOR, G-CSF
JP5448825B2 (ja) 非凝集抗体Ｆｃドメインの製造方法
US20140288278A1 (en) Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates
US20130338344A1 (en) Protein purification methods to reduce acidic species
WO2015070069A1 (en) Isolation and purification of dvd-igs
KR20150118120A (ko) 단백질 제제들로부터 엔도톡신들을 제거하기 위한 물질들 및 방법들
EP4720085A1 (en) Method for the purification of immunoglobulins
CN118414350A (zh) 纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法
CN114729003A (zh) 提高离子交换色谱过程中抗体产率的方法
JP2023549938A (ja) タンパク質を精製するための緩衝液と方法
CN117362442A (zh) 一种非对称双特异性抗体阴离子交换层析的洗脱方法
CN114539417A (zh) 一种有效去除双特异性抗体同源二聚体的层析纯化工艺
CN115975046A (zh) 一种纯化融合蛋白的方法
CN116063564A (zh) 一种纯化融合蛋白的方法
KR20200136411A (ko) 분리 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220114

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220114

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221223

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230315

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230623

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230721

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7320121

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150