JP7365330B2

JP7365330B2 - 電気伝導性防汚コーティング組成物

Info

Publication number: JP7365330B2
Application number: JP2020503878A
Authority: JP
Inventors: オリビエイブフレデリックヘンリー; ドナルドイー．イングバー; デルリオジョナサンサバテ; パワンジョリー
Original assignee: プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2023-10-19
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: AU2018307822A1; US20200231822A1; WO2019023567A1; JP2020528950A; AU2024220032A1; CA3070447A1; EP3619272A4; AU2018307822B2; CN111225958B; EP3619272A1; CN111225958A

Description

関連出願
本願は2017年7月27日に出願の米国仮特許出願番号第62/537,829号に対する米国特許法第119条(e)項に基づく恩典を主張し、該出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は電気伝導性のコーティングを作製するための組成物および方法ならびにそれらの使用に関する。例えば、電極表面の非特異的結合および汚損を防止する電極用コーティングである。

政府の支援
本発明は国防総省から請け負った契約W911NF-12-2-0036の下で政府の支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
分子診断および分子アッセイは、捕捉物質と、対象とする標的との間の特異的相互作用に基づく。選択性は、捕捉物質のその標的に対する親和性という固有の性質であるが、非特異的相互作用がアッセイの感度を大幅に低下させかつ偽陽性をもたらし得る。

ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、プルロニック酸、およびポリ(エチレングリコール)ポリマー(PEG)などを含む様々な分子量の分子ブロッカーが、表面でおよび/または溶液中で生じることがある非特異的結合相互作用を制限するために用いられてきた。例えば、酵素結合サンドイッチイムノアッセイ(ELISA)において用いられるマイクロタイタープレートの表面は典型的にはBSAでブロックされて、それらの表面でのタンパク質の非特異的な吸着を低減させる。BSAはアッセイ中に用いられる緩衝液にも通常は加えられる。

最終的な光学的読取値(例えば、吸光、蛍光、化学発光または電気化学発光)に基づくアッセイについて、ブロッカーは最終的な測定には干渉しない。これはアッセイケミストリーと測定とが完全に切り離されているからである。アッセイは表面(例えば、プレート、マイクロビーズおよびナノ粒子)に対して行われるが、最終的な測定は外部トランスデューサを用いて実施される。例えば、蛍光に基づいたアッセイでは、捕捉物質を保持した表面に所定の波長の光が照射され、放出された光がフォトダイオードまたはCCDセンサ(即ち、トランスデューサ)によって定量化される。前述の例では、分子相互作用が起こる表面は、受動的な支持体として機能し、測定には寄与しない。

アッセイはトランスデューサ表面に対して行われるので電気化学的な読取値が所望される場合にはより困難な状況が生じる。捕捉物質は、典型的には、その密度および配向を最大化し、非特異的相互作用を防止し、同時に、電気化学的シグナルを高感度で記録する電極の能力を維持する手法を用いて、電極の表面に固定される。分子ブロッカーは非特異的相互作用を防止するために用いられてきたが、電極の不動態化をもたらすことが多く、その結果、感度の劇的な減少に繋がる。電気化学センサの現状の使用は、したがって、困難な最適化が要求される、感度とブロッキングとの継続的なトレードオフを伴う。

最後に、タンパク質および/または生物汚損物質を高濃度に含有する複雑な試料(例えば、血液、血漿)は、それらが電極表面をさらにブロックし、これが電気化学センサの完全かつ不可逆的な不動態化を急速にもたらすので、事前の希釈なしでは分析することができない。重要なことには、これはあらゆるバイオセンサ(電気化学センサだけでなく)で回避しなければならない大きな制約である。

米国特許第8,778,269号(特許文献1)は、様々な様式での生体分子の電気化学的な検出のためのナノ電子電気化学試験装置の製作を記載している。この特許は、伝導性コーティングとしてのロバストであり変性されかつ架橋された複合材料を記載してはおらず、防汚ナノ複合材料としての調製物の使用も記載していない。

したがって、捕捉物質を受け入れ、非特異的相互作用を防止し、電気化学シグナルを高感度に記録する電極の能力を維持し得る、電気伝導性表面に対して用い得るコーティングの必要性がある。本開示はこれらの必要性のいくつかに対処している。

米国特許第8,778,269号

概要
概して、本明細書において記載される発明は、伝導性表面に塗布され、これらの表面をそれらの意図される機能を阻害するかまたは減少させる望ましくない相互作用から保護し得る組成物に関する。例えば、コーティングを電極に塗布して、血液および血漿などの複雑なマトリクス中で利用し得る電極を提供し得る。さらに、本明細書において記載されるいくつかの態様は、面倒な精製および希釈工程を伴わずに複雑なマトリクス中で電気化学的測定を可能にする。加えて、本明細書において記載されるコーティングは滅菌し得、官能化が容易であり、ロバストであり、調製が容易である。

一局面では、本発明は、六角形格子状に配置された原子を有する炭素の同素体と、タンパク質性材料との混合物を含み、該タンパク質性材料は、不可逆的に変性される。例えば、同素体はカーボンナノチューブもしくはグラフェン、またはカルボキシル化カーボンナノチューブ(本明細書においてはCNTsまたはCNTと呼ぶ)、アミノ化カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド(rGO)、カルボキシル化還元グラフェンオキシド(RG-カルボキシレート)、アミノ化還元グラフェンオキシド(RG-アミノ)、およびこれらの混合物などの官能化材料であり得る。任意でタンパク質性材料はBSAであり得、任意でタンパク質性材料は架橋される。組成物は捕捉物質および/または伝導性表面(例えば、電極表面)もさらに含み得る。

別の局面では、本発明は電極のためのものである。電極は金属またはガラス状炭素などの伝導性表面を含む。電極は、六角形格子状に配置された原子を有する炭素の同素体と、不可逆的に変性されたタンパク質性材料との、伝導性表面の少なくとも一部にコーティングされた混合物をさらに含む。タンパク質性材料は架橋されていてもよい。任意で、混合物は、例えば、電極にコーティングされた場合、横方向よりも垂直方向に大きく伝導する。電極はまた任意で多重化されていてもよい。

さらに別の局面では、本発明は、電極コーティング組成物を作製する方法のためのものである。方法は、六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体(例えば、カルボキシル化ナノチューブ、還元グラフェンオキシド)とタンパク質性材料とを溶液(例えば、水溶液)中で混合する工程を含む。さらに、タンパク質性材料は炭素の同素体と混合する前または後に不可逆的に変性される。任意で方法は炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を超音波処理する工程を含む。また、例えば、タンパク質性材料を変性させるために、任意で該材料が加熱される。方法はタンパク質性材料を架橋する工程も含み得る。任意で方法は炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を精製する工程を含む。

最後に、本発明の局面は、コーティングされた電極を作製する方法を含む。方法は、六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体(例えば、CNT、還元グラフェンオキシド)とタンパク質性材料との混合物で伝導性表面の少なくとも一部をコーティングする工程を含み、該タンパク質性材料は、不可逆的に変性されている。任意で方法はタンパク質性材料を架橋する工程をさらに含む。混合物は捕捉物質を含み得る。任意で電極は炭素同素体/タンパク質性材料でコーティングされ、次いで、例えば、捕捉物質で官能化される。

捕捉物質を受け入れること、電極の非特異的相互作用および汚損を防止すること、ならびに電気化学シグナルを高感度に記録する電極の能力を維持することに加えて、本明細書において記載される発明は他の有用な特性および用途を有する。例えば、異方性の高い電気伝導性を有するコーティングを作製し得ることが見出された。この異方性を利用して、(例えば、電極表面に対して)垂直方向に伝導するが横方向には伝導しない電極を作製し得、コーティングは電極間では伝導しないので、1つまたは複数の電極にまたがり得る重複したコーティングで、隣接する電極のアレイをコーティングすることが可能になる。これが、コーティングが横方向に伝導性である場合の電気的な接触を避けるための個々の電極への慎重な塗布というのではなくむしろいくつかの電極にわたる大きな領域のコーティングができるため、コーティングの塗布を容易にし、かつ表面全体(例えば、電極、および電極間の絶縁体)を保護し得る。本明細書において記載されるコーティングされた電極は、全組織における長期の受動的な電気的および電気化学的記録がこれまでは困難であった場合にも用い得る。例えば、ニューロンの記録用である。他の用途は、埋め込み型の刺激もしくは記録電極またはバイオセンサを含む。いくつかの態様では、コーティングは透明であり、したがって、太陽電池技術における、およびITOなどの透明な導体用のコーティングとしての用途があり得る。コーティングはロバストでもあり、センサ感度をほとんどまたは全く減少させることなく繰り返し洗浄されかつ再使用され得る。

図1は、BSA/CNT組成物(例えば、「e.ブロック」)でコーティングされ、アミド結合を通じて捕捉抗体(捕捉Ab)で官能化された金電極の極めて概略的な描画である。図は、ストレプトアビジン-ポリHRPにコンジュゲートしたビオチン化検出抗体で検出された、捕捉された抗原IL6も示す。犠牲酸化還元活性剤3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)(上部)が、酸化され(中間)、かつそれが(例えば、還元、またはサイクリックボルタンメトリーで用いられるような還元および酸化サイクルによって)電気化学的に検出され得る電極表面に沈殿する(下部、BSA/CNTの近傍)ものとして示されている。図2は、一連の電極についてのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の5mMフェリ/フェロシアニドの酸化電流密度(棒)およびピーク間電圧差(黒丸マーカー)からの電気化学シグナルを示すグラフである。左から右に：裸金電極；金+1％BSA、30分後；PEG化チオール自己組織化単分子膜(SAM)官能化金電極；SAM官能化電極+1％BSA、30分後；e.ブロックコーティングした金電極；e.ブロック+1％BSA、30分後；e.ブロック+1％BSA、1週間後；e.ブロック+1％BSA、1か月後である。図3は電極をコーティングするために用い得る材料のUVスペクトルを示す。単層カーボンナノチューブ(SWCNT)および変性SWCNTは走査領域においてはほとんど吸着(adsorption)を示さない。BSA、変性BSA、および比較試料PTNTMは230nmおよび280nmで顕著な吸着ピークを示す。一連の変性BSA/CNTは230nmおよび280nmバンドの著しい低下を示す。図4は金センサ6個のアレイの蛍光画像である。画像は上から下に、未修飾の金センサ、e.ブロック+2.5％グルタルアルデヒドと24時間インキュベートした金センサ、および(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド)/ジシクロヘキシルカルボジイミド(EDC/NHS)で処理したセンサを示す。センサは緑色蛍光タンパク質(GFP)またはPBSでスポッティングした。図5は、GFP、e.ブロック+2.5％グルタルアルデヒド(GA)、およびe.ブロック+2.5％GA+EDC/NHSで処理した金センサ表面の相対的な蛍光ピクセル強度のプロットを示す。図6は、BSA含有溶液に浸漬した未処理および処理済みの金電極センサについて、PBS中の5mMフェリ/フェロシアニドの酸化電流密度(棒)およびピーク間電圧差(黒丸マーカー)のプロットを示す。未処理の金は30分以内に不動態化され、e.ブロック処理したものは4日間にわたって電流密度の変化を示さない高い電流密度を示す。一方で、比較処理は2つの時点で有意な電流密度を示さない。図7は、O₂プラズマ滅菌後のPBS緩衝液中の5mMフェリ/フェロシアニドの酸化電流密度(棒)およびピーク間電圧差(黒丸マーカー)からの電気化学シグナルを示すプロットである。測定は、左から右に、裸金電極、e.ブロックで修飾しO₂プラズマ(0.3mbar、50ワット、4分間)で処理した電極、およびe.ブロックコーティングしO₂処理した電極の、1％BSA中で1か月間インキュベートした後のシグナルである。図8は、1％BSAの存在下で様々な濃度のIL6について記録した、沈殿TMBの酸化からの電気化学シグナルを示すプロットである。図9は、捕捉抗IL6で官能化され、1％BSA含有溶液中で1週間保存され、次いで1％BSA含有溶液中で200pg/mLのIL6の検出を行うのに用いられたチップの性能を示す概略図である。図10は、IL6検出アッセイ後の沈殿したTMBの酸化還元ピークを示すボルタモグラムである。図11は、HCl・グリシン(HCL・Gly)を用いて再生された電極のボルタモグラムである。図12は、再生された電極を用いたIL6検出アッセイ後のPBS中の沈殿したTMBの酸化還元ピークを示すボルタモグラムである。図13は、未希釈のヒト血漿に対するアミノ化還元グラフェン(RG-アミノ)/BSAおよびカルボキシル化還元グラフェン(RG-カルボキシレート)/BSAコーティングの酸化還元溶液中で記録されたファラデー酸化ピーク電流を示す棒グラフである。

詳細な説明
本明細書において提供される方法、組成物および構造は、表面に塗布された場合に伝導性および保護性のコーティングを形成するための、タンパク質性材料とのカーボンナノチューブおよび還元グラフェンオキシドの混合物の使用に部分的に基づいている。本発明は、電極表面に塗布された場合に非特異的相互作用を防止し得る電気化学的に活性な表面ブロッカーの形成を可能にする。いくつかの例では、タンパク質性材料は変性されかつ架橋され、血液および血清などの複雑なマトリクス材料中で繰り返し再調整および再使用し得るロバストな表面を形成する。

態様のいくつかでは、本発明は、本明細書において「e.ブロッカー」または「e.ブロック」と呼ばれる、電極表面を活性に保ちつつ非特異的相互作用を防止し得る電気化学的に活性な表面ブロッカーを含む。e.ブロッカーは、変性されたBSAと混合したカーボン同素体(例えば、カーボンナノチューブ、グラフェンおよび/または還元グラフェンオキシド)で構成され、電極表面にコーティングされるBSA/CNTナノコンポジットを形成する。図1は本発明の態様を示す。図は、CNTから作製したe.ブロッカーでコーティングされ、捕捉抗体で官能化された金電極を示す。捕捉された抗原IL6は、ストレプトアビジン-ポリHRPとコンジュゲートしたビオチン化検出抗体で検出される。TMBは、酸化され、それが(例えば、還元、またはサイクリックボルタンメトリーにおいて用いられるような還元および酸化サイクルによって)電気化学的に検出され得る電極表面に沈殿するものとして描かれている。いくつかの態様では、ナノコンポジットであるe.ブロッカーを用いて(i)捕捉物質で既に修飾された電極をブロックするか、またはいくつかの態様では(ii)清浄な電極をコーティングした後に捕捉物質で修飾することができる。図1は例示であり、異なる態様では、他の捕捉物質および他の抗原または標的を用い得る。

図2は本明細書において記載される組成物で清浄な電極をコーティングした結果を示す。図2に示すように、1％BSAに浸漬した裸金電極は、溶液中に存在する電気化学トレーサであるフェリ/フェロシアニドに応答するその能力の喪失に要する時間はわずか30分である。ここでCNTから作製したe.ブロックを塗布した後の金センサの感度は、維持され、低下はわずか10％である。それに対し、SAMでコーティングした電極はその初期感度の80％以上を喪失した。さらに、e.ブロックでコーティングした電極は、1か月間にわたって1％BSAに曝露した後に、活性を85％保持していた。裸電極およびSAMでコーティングした電極はわずか30分間の曝露後に絶縁した。

本明細書において用いるように、「捕捉物質」とは標的分子に結合する天然または合成の受容体(例えば、分子受容体)である。いくつかの態様では、結合とは非標的物よりも標的に対して選択的であるような特異的な結合である。例えば、捕捉物質と標的の間の解離定数は少なくとも約200nM、または少なくとも約150nM、または少なくとも約100nM、または少なくとも約60nM、または少なくとも約50nM、または少なくとも約40nM、または少なくとも約30nM、または少なくとも約20nM、または少なくとも約10nM、または少なくとも約8nM、または少なくとも約6nM、または少なくとも約4nM、または少なくとも約2nM、または少なくとも約1nM、またはそれ未満である。特定の態様では、特異的結合とは、試料/試験溶液中の任意の他の種に実質的に結合することなく捕捉物質がその標的に結合する結合を指す。

非限定的な例としては、捕捉物質は抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体模倣物および他のタンパク質スキャフォールド、アプタマー、核酸(例えば、RNAまたはDNAアプタマー)、タンパク質、ペプチド、結合パートナー、オリゴ糖、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝産物、細胞、ウイルス、細胞内粒子、ハプテン、薬理活性物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、アビマー、ペプチド模倣物、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、糖または分子インプリントポリマーであり得る。捕捉物質は毒素および生体分子などの特定の標的または特定のクラスの標的に対して選択的である。例えば、標的はイオン、分子、オリゴマー、ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸、毒素、生物学的脅威物質、例としては胞子、ウイルス、細胞およびタンパク質毒素、炭水化物(例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、ポリオール、および多糖類)ならびにこれらの組み合わせ(例えば、これらを含むコポリマー)であり得る。

いくつかの態様では、捕捉物質は抗体である。本明細書において用いるように、「抗体(antibody)」および「抗体(antibodies)」という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖Fv抗体フラグメント、Fabフラグメント、およびF(ab)₂フラグメントを含む。対象となる標的(例えば、抗原)に対して特異的な結合親和性を有する抗体は標準的な方法を通じて生成し得る。本明細書において用いるように、「抗体(antibody)」および「抗体(antibodies)」という用語はインタクトな抗体、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその結合フラグメントを指し、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異性抗体を含む。いくつかの態様では、結合フラグメントは組換えDNA技術によって生成される。さらなる態様では、結合フラグメントはインタクトな抗体の酵素的または化学的な切断によって生成される。結合フラグメントはFab、Fab'、F(ab')₂、Fv、および単鎖抗体を非限定的に含む。

いくつかの態様では、捕捉物質の標的は酸化還元活性であり得(例えば、電気活性捕捉物質)、電極により直接的に検出される。例えば、捕捉物質は、標的分析物が電気化学的手段によって直接的に検出され得る電極の表面近くまたは表面に標的分析物を集中させるため、電極による標的分析物の検出を容易にする。いくつかの別の態様では、標的は電気化学的手段によって間接的に検出される。例えば、標的は、電極表面近傍の酸化還元反応を直接的にまたは間接的に触媒する検出抗体、タンパク質または分子と結合することによって検出され得る。任意で、検出抗体、タンパク質または分子は電極表面に(例えば、電極の金属表面上のコーティングに)犠牲酸化還元活性分子を付着させ、次いでこれが電気化学的に検出される。例えば、検出抗体は酸化還元触媒とコンジュゲートさせ得、犠牲酸化還元活性分子は酸化または還元され電極表面に沈殿し得る。いくつかの態様では、酸化還元活性触媒は西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などのペルオキシダーゼであり、犠牲酸化還元活性分子は3,3'-ジアミノベンジジン(DMB)、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、o-オルトフェニレンジアミン(OPD)、AmplexRed、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、4-クロロ-1-ナフトール(4CN)、AEC、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、ホモバニリン酸、ルミノール、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、ヒドロキノン、ベンゾキノン、これらの混合物、またはこれらの混合物である。態様は、電気化学的に検出可能である公知のイムノアッセイまたはこれらの変法を含む。任意で、犠牲分子も蛍光によって検出し得る。

ここで用いられるように、「伝導性表面」とはバルク伝導性材料の外面である。例えば、金属シート、棒、ワイヤ、電極、接点などの任意の表面である。これは多孔質材料、研磨された材料または任意の表面粗さを有する材料、実質的に平坦であるかまたはある程度湾曲した表面(例えば、凹面または凸面)を含み得る。伝導性表面は、不良導体または良導体である非金属材料、例えば、グラファイト、酸化インジウムスズ(ITO)、半導体、伝導性ポリマー、および電極を製造するために用いられる材料などの表面を含む。例えば、伝導性は半導体(例えば、約1x10³S/m)と金属(例えば、約5x10⁷S/m)の間の範囲であり得る。いくつかの態様では、伝導性表面は、e.ブロッカー、CNT/BSAまたはrGO/BSA組成物などの保護コーティングでコーティングされ、次いで電気化学的応答について調査されている試料と接触する電極の一部である。

ここで用いられるように、「複雑なマトリクス」は生体分子、分子、イオン、細胞、生物、無機材料、液体および組織を含み得る。例えば、複雑なマトリクスは、血液、血清、血漿、尿、唾液、間質液およびサイトゾルなどの生体液、ならびに生検からなどの組織および生体上の組織(例えば、インプラント、診断プローブなど)を含み得る。

本明細書において用いられるように、「ブロッキング剤」または「分子ブロッカー」は非特異的相互作用を防止するために用いられる化合物である。ブロッキング剤は、複雑なマトリクスに接触するか浸漬した場合に表面の非特異的相互作用または汚損を防止する表面上のコーティングであり得る。表面は、例えば、表面に直接的に付加させたかまたはブロッキング剤に付加させた捕捉物質を含み得る。非特異的相互作用は標的分子と表面の間または溶液中の他の成分間の望ましくないあらゆる相互作用を含み得る。ブロッキング剤は、ブロッキングを必要とする表面に受動的に吸収され得るタンパク質、タンパク質の混合物、タンパク質のフラグメント、ペプチドまたは他の化合物であり得る。例えば、タンパク質(例えば、BSAおよびカゼイン)、ポロキサマー(例えば、プルロニック類)、PEG系ポリマーおよびオリゴマー(例えば、ジエチレングリコールジメチルエーテル)、カチオン性界面活性剤(例えば、DOTAP、DOPE、DOTMA)である。いくつかの他の例は、例えば、Rockland Inc.(Limeric, PA)から入手可能である市販のブロッキング剤またはその中の成分、例としては、BBSフィッシュゲルコンセントレート、PBSフィッシュゲルコンセントレート、TBSフィッシュゲルコンセントレート、蛍光ウエスタンブロッティング用ブロッキングバッファー、BLOTTO、ウシ血清アルブミン(BSA)、ELISAマイクロウェルブロッキングバッファー、ヤギ血清、IPTG(イソプロピルベータ-D-チオガラクトシド)インデューサー、正常ヤギ血清(NGS)、正常ウサギ血清、正常ラット血清、正常ウマ血清、正常ヒツジ血清、ニトロフェニルリン酸バッファー(NPP)、およびRevitablot(商標)ウェスタンブロットストリッピングバッファーを含む。

本明細書において用いるように、「電極」とは導体であり、これを通じて非金属の媒体に電流が出入りする。例えば、媒体は複雑なマトリクス(例えば、血液または血清)であり得る。電極は、哺乳類の組織などの組織の内部に/組織上に挿入され、組織とおよび/または組織内部/組織上の液体と接触し得る。電極は大きくてもよく(例えば、1cm²より大きい、10cm²より大きい、100cm²より大きい動作表面領域を有する)、または電極は小さくてもよい(例えば、1cm²未満、1mm²未満、100μm²未満、10μm²未満、1μm²未満の動作表面領域を有する)。動作表面領域とは媒体と接触している、電流が媒体に出入りする領域である。いくつかの態様では、電極は作用電極であり、電気化学セルが対電極および参照電極を含み得る。

いくつかの態様では、電極は多重化アッセイ向けに構成されるよう「多重化」されている。本明細書において用いるように、「多重化」アッセイを用いて2以上(例えば、3以上、5以上、10以上、50以上、100以上、1000以上)の複数の分析物またはシグナルを単回のアッセイまたはアッセイサイクル中に同時に測定し得る。電極は、したがって、電気シグナルをモニタリングするための回路にそれぞれ独立して電気的に接続され得る電極、微小電極または電気化学センサのアレイとして構成し得る。例えば、電極のアレイは、半導体チップ(例えば、センサアレイチップ)などの平坦な表面に配列されたマルチウェルプレート(例えば、マイクロウェルプレート)の底部、側部または上部に配置し得るか、または多電極アレイ(例えば、電子回路へのニューロンの接続のための)の一部を形成し得る。いくつかの態様では、本明細書において記載されるコーティング、例えば、e.ブロックは、コーティングが伝導異方性のためにセンサ間で伝導しないので、1より多いセンサをコーティングし得、したがって、導体、センサまたは電極のアレイをコーティングして多重化電極を形成し得る。

電極は、金属的伝導を持つ材料および半導体を含み得る。例えば、電極は金属、金属合金、半導体、ドープされた材料、伝導性セラミック、伝導性ポリマーを含み得る。非限定的には、電極材料は炭素(例えば、グラファイト、ガラス状炭素、伝導性ポリマー)、銅、チタン、真鍮、水銀、銀、白金、パラジウム、金、ロジウム、亜鉛、鉛、スズ、鉄、酸化インジウムスズ(ITO)、シリコン、ドープされたシリコン、II-VI半導体(例えば、ZnO、ZnS、CdSe)、III-V半導体(例えば、GaAs、InSb)、セラミック(例えば、TiO₂、Fe₃O₄、MgCr₂O₄)、ならびに伝導性ポリマー(例えば、ポリ(アセチレン)、ポリ(p-フェニレンビニレン)、ポリ(フルオレン)、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリアニリン、ポリアゼピン、ポリインドール、ポリカルバゾール、ポリ(ピロール)、ポリ(チオフェン)、およびポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン))、これらの組み合わせ、混合物および合金を含み得る。いくつかの態様では、電極は、上記の材料を含む伝導性表面の少なくとも一部にコーティングされた、CNTとタンパク質性材料との混合物などの、CNTおよびCNTを含む。いくつかの態様では、電極は電気化学センサであり得る。電極は、電極のパーツに剛性および電気的な絶縁性を付与する、電気的および機械的保護用の絶縁体などの絶縁部分も含み得る。

電気化学的方法とは、電位、電荷または電流の変化に応じて分析物の化学的反応性を特性決定する方法である。いくつかの例は電位差測定、定電流クーロメトリー、定電位クーロメトリー、アンペロメトリー、ストリッピングボルタンメトリー、対流ボルタンメトリー、ポーラログラフィー、静止電極ボルタンメトリー、パルスポーラログラフィー、電気化学インピーダンス分光法およびサイクリックボルタンメトリーを含む。シグナルは、シグナルの収集、操作、および分析用の回路およびシステムに繋げた電極または電気化学センサを用いて検出される。

本明細書において用いるように、「タンパク質性」材料はタンパク質およびペプチド、官能化タンパク質、タンパク質を含むコポリマー、これらの天然および合成変異体、ならびにこれらの混合物を含む。例えば、タンパク質性材料はウシ血清アルブミン(BSA)であり得る。

本明細書において用いるように、「架橋する」とはゲルまたはヒドロゲルなどのネットワーク構造を形成するようにポリマー鎖間に1つまたは複数の結合を形成することを意味する。その場合ポリマーは「架橋された」ポリマーである。結合は水素結合、共有結合、または静電結合を通じたものであり得る。「架橋剤」は架橋分子またはイオンであり得るか、または酸、塩基またはラジカル生成剤などの反応種であり得る。

分子架橋剤については、架橋剤は、第一級アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、炭水化物およびカルボン酸を含む多数の基に対して反応性である少なくとも2つの反応性基を含有する。タンパク質およびペプチド分子はこれらの官能基の多くを有しているため、タンパク質およびペプチドはこれらの架橋剤を用いて容易にコンジュゲートされかつ架橋され得る。架橋剤は同一の2つの反応性末端を有するホモ二官能性、または2つの異なる反応性末端を有するヘテロ二官能性であり得る。いくつかの態様では、架橋剤はグルタルアルデヒド、アジプイミド酸ジメチル(DMA)、スベリミド酸ジメチル(DMS)、スベリン酸ビススルホスクシンイミジル、ホルムアルデヒド、p-アジドベンゾイルヒドラジド；n-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド；n-[4-(p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド；p-アジドフェニルグリオキサール一水和物；ビス[b-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド；ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン；1,4-ジ[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン；ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)；スベリン酸ジスクシンイミジル；酒石酸ジスクシンイミジル；3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)；3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオナート)1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド；エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)；N-(E-マレイミドカプロン酸ヒドラジド)；[N-(E-マレイミドカプロイルオキシ)-スクシンイミドエステル]；N-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル；ヒドロキシルアミン.HCl；マレイミド-PEG-スクシンイミジルカルボキシメチル；m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル；N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸；N-(p-マレイミドフェニルイソシアナート)；N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート；スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート；スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチラート；酒石酸スルホジスルホスクシンイミジル；[N-(E-マレイミドカプロイルオキシ)-スルホスクシンイミドエステル；N-マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル；N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾアート；m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル；スルホスクシンイミジル(4-アジドフェニル)-1,3ジチオプロピオナート；スルホスクシンイミジル2-(m-アジド-o-ニトロベンズアミド)-エチル-1,3'-ジチオプロピオナート；スルホスクシンイミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノアート；スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオナート；N-スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート；スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート；スルホスクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチラート；およびこれらの混合物などの分子である。いくつかの態様では、架橋剤はモノ-またはポリ-エチレングリコールジグリシジルエーテルである。いくつかの態様では、架橋剤はグルタルアルデヒドなどのホモ二官能性架橋剤である。

本明細書において用いるように、「変性」とは、タンパク質の四次、三次、および二次分子構造をその天然、元の、または未変性の状態から修飾するプロセスである。例えば、天然の状態のタンパク質の高度に規則的な構造の要因となる弱い結合(例えば、水素結合)を切断することなどである。当該プロセスは、例えば、加熱、超音波処理またはせん断などの物理的手段によって；酸、アルカリ、無機塩および有機溶媒(例えば、アルコール、アセトンまたはクロロホルム)などの化学的手段によって；および放射線によって達成し得る。変性されたタンパク質、例えば酵素は、その元の生物学的活性を失っている。場合によっては、変性プロセスは可逆的であり、タンパク質の元の生物学的機能が少なくとも回復する程度に元の結合相互作用が再形成することによってタンパク質の分子構造が取り戻される。別の場合では、変性プロセスは不可逆的または非可逆的であり、タンパク質の元の生物学的機能は回復しない。架橋、例えば、変性後の架橋は、変性プロセスの可逆性を低減させるかまたは排除することができる。

変性の程度は、モルパーセントなどの、変性されたタンパク質分子のパーセントとして表され得る。いくつかの変性方法は他よりも効率的であり得る。例えば、いくつかの条件下では、BSAに適用された超音波処理はタンパク質の約30～40％を変性し得、変性は可逆的である。BSAが変性される場合には、2つの構造段階を経ることになる。第1段階は可逆的である一方で第2段階は不可逆的(例えば、非可逆的)であるが、必ずしも規則的な構造の完全な破壊をもたらすわけではない。例えば、最高で65℃までの加熱を第1段階と見なし、続くそれを超える加熱を第2段階と見なし得る。より高い温度では、さらなる変換が見られる。いくつかの態様では、BSAは約65℃超(例えば、約70℃超、約80℃超、約90℃超、約100℃超、約110℃超、約120℃超)、約200℃未満(約190℃、180℃、170℃、160℃、150℃未満)で、少なくとも約1分(例えば、少なくとも約2、3、4、5、10または20分)間であるが約24時間未満(例えば、約12、10、8、6、4、2 1時間未満)加熱することによって変性される。態様は、本明細書において記載される任意の範囲、例えば、約90℃超であるが約150℃未満で少なくとも2分間であるが1時間未満の加熱を含む。

いくつかの態様では、本明細書において記載される組成物および構造において用いられるタンパク質性材料は少なくとも約20％～約100％(例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％)変性される。いくつかの態様では、変性タンパク質の50％未満(例えば、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、1％未満)がその天然の状態に戻る。したがって、変性の可逆性は、50％可逆性、40％可逆性(60％不可逆性)、30％可逆性(70％不可逆性)、20％可逆性(80％不可逆性)、10％可逆性(90％不可逆性)またはさらには0％可逆性(100％不可逆性)である。

本明細書において用いるように、「カーボンナノチューブ」および「グラフェン」はsp²炭素原子が六角形のハニカム格子状に配置された炭素の同素体である。単層グラフェンは、二次元材料であり、グラファイトの単層である。本明細書において用いるように、1層を超えるグラフェン、例えば、1と200の間の層(例えば、約1～100層、約1～50層、約1～10層)をグラフェンと称し得る。カーボンナノチューブは円柱状に巻かれたグラフェンのシートとして形成された中空の円筒構造である。炭素の同素体は、下に記載するように、酸素、カルボキシレート、エポキシド、アミン、アミドおよびこれらの組み合わせなどの何らかの官能化を含み得る。

グラフェンは、清浄な金属表面に対する化学蒸着を用いることおよび純粋なグラファイトの剥離を通じて高純度で生成し得る。グラファイトの剥離方法は、いくつかまたはただ1つの層が得られるまでグラファイト表面に繰り返し押圧される接着材を用いる工程を含む。これらの方法は、純粋なグラフェン(例えば、炭素が99重量％を超える)を生成し得るが面倒かつ非実用的であり得る。下に記載するように、還元グラフェンオキシド(rGO)は、それが同様の電気的、化学的および機械的特性を有するので、グラフェンが有用である多くの用途で用い得る。還元グラフェンは、さらなる化学変換に利用され得る化学反応性の酸素に基づいた基などのいくつかの利点も有する。さらに、rGOはより効率的に調製され得る。いずれにせよ、純粋なグラフェンおよび還元グラフェンオキシドの両方を、e.ブロッカーおよびコーティングされた電極を作製するための態様において用い得る。

グラフェンオキシドを形成するための効率的なプロセスはグラファイトオキシドの剥離である。本明細書において用いるように、「グラフェンオキシド」とは、グラフェンの酸化またはグラファイトオキシドの剥離から形成し得る材料である。グラフェンオキシドを生成するための最初の工程では、グラファイトが酸化される。酸化のためのいくつかの方法が公知であり、Hummers and Offeman法として公知である1つの一般的な方法では、グラファイトが硫酸、硝酸ナトリウムおよび過マンガン酸カリウム(非常に強力な酸化剤)の混合物で処理される。過マンガン酸カリウムの量を増加して用い、硝酸ナトリウムを加える代わりに、硫酸と組み合わせたリン酸を加えることによって70％の酸化レベルに達する別の方法がより効率的であることが公知である。グラフェンオキシドの剥離はグラファイトオキシドを提供し、いくつかの方法で実施され得る。超音波処理は酸化グラファイトを剥離する非常に時間効率の良い手法であり得、グラフェンの剥離が非常に上手くいく(ほぼ完全な剥離レベルまで)が、グラフェンフレークに大きな損傷も与え、表面サイズをミクロンからナノメートルにまで減少させ、かつ様々な大きさのグラフェン小板も生成してしまう。機械的な撹拌は破損がはるかに少ないアプローチではあるが、達成するのにはるかに長い時間がかかり得る。

グラファイトオキシドおよびグラフェンオキシドは化学的に非常に似ているが、構造的には非常に異なっている。両方とも炭素、酸素、および水素を様々な比率で有する化合物である。最も酸化された状態では、酸素量は約60重量％にもなり得る。水素の量は官能化、例えば、エポキシ架橋、ヒドロキシル基およびカルボキシル基の数に応じて異なる。グラファイトオキシドおよびグラフェンオキシドの主な違いは、水のインターカレーションによって引き起こされる、化合物の個々の原子層間の面間隔である。酸化プロセスによって引き起こされるこの増加した間隔はまたsp²結合ネットワークを破壊し、グラファイトオキシドおよびグラフェンオキシドの両方が電気絶縁体として記載されることが多いことを意味している。

還元グラフェンオキシド(rGO)は熱的、化学的または電気的な処理によるグラフェンオキシドの還元から調製される。例えば、グラフェンオキシドをヒドラジン、水素プラズマ、水中での加熱、高温加熱(例えば、窒素/アルゴン下で)および電気化学的還元で処理する。グラフェンは理想的には炭素のみを含む単一の炭素層であり得る一方で、還元グラフェンオキシドは類似しているが、ある程度の酸素官能化を含有する。酸素の量は、還元の程度に応じて異なり、いくつかの材料では約50重量％～約1重量％(例えば、約30重量％～約5重量％)異なる。

還元グラフェンオキシドは官能化されているかまたは官能基を含み得る。例えば、還元グラフェンオキシドはカルボキシル基およびヒドロキシル基の形態で酸素を含むことが多い。いくつかの形態では、カルボキシルおよびヒドロキシル基がrGOシートの端部に存在する。本明細書において用いるように、カルボニル化還元グラフェンオキシドはカルボキシル基を有する還元グラフェンオキシドを指し得る。いくつかの態様では、カルボキシル基に起因する酸素の量は、約30重量％～約0.1重量％(例えば、約10重量％～約1重量％)である。他の形態の官能化も可能である。例えば、亜硫酸水素ナトリウムなどの触媒を用いてアンモニアとグラフェンオキシドを反応させる変法Buchere反応によってアミン官能化rGOを形成してもよく、またはグラフェンオキシド上のエポキシド基をp-フェニレンジアミンで開環してもよい。いくつかの態様では、窒素の量は約30重量％～0.1重量％(例えば、約10重量％～1重量％)である。

管状カーボンナノチューブは、例えば、約0.2～約20nm、好ましくは約0.5～約10nm、およびなおさらに好ましくは約1～約5nmなどのナノメートル規模の直径を有する。これらは単層カーボンナノチューブ(SWCNT)、多層カーボンナノチューブ(MWCNT)(例えば、直径が連続的に増加する2つ以上の入れ子になったチューブの集合、またはこれらの混合物)であり得る。MWCNTの直径は約1～約100nm(例えば、約1～約50nm、約10～20nm、5～15nm、約30～50nm)などでSWCNTより大きなものであり得る。どのように前駆グラフェンシートを巻き上げてカーボンナノチューブであるシームレスシリンダーを作製するかに応じて、例えば、アームチェア型、カイラル型、ジグザグ型と呼ばれるカーボンナノチューブの様々な異性体を作製し得る。

カーボンナノチューブおよび還元グラフェンオキシドは、イオンおよび分子などのインターカレートされた材料を含み得る。いくつかの態様では、カーボンナノチューブは、例えば、酸化によって官能化されて表面にカルボン酸基を形成して、CNTを提供し得る。さらに、いくつかの態様では、カーボンナノチューブおよびrGOは、CNTまたはrGO上に存在するカルボン酸基との縮合反応(例えば、アルコールおよびアミンとの)、カルボン酸基との静電相互作用(例えば、カルシウム媒介カップリング、またはカチオン性ポリマーもしくは界面活性剤を通じた第四級アミン、プロトン化アミン-カルボキシレート相互作用)またはカルボン酸基を通じた水素結合(例えば、脂肪酸、および他の水素結合分子との)を通じてさらに修飾され得る。官能化は、部分的(例えば、利用可能なカルボン酸基の90％未満、80％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、10％超、20％超、30％超、40％超、50％超、60％超、70％超、80％超が官能化される)であっても、または完全なもの、例えば、実質的にすべてのカルボン酸を官能化するものであってもよい(例えば、利用可能なカルボン酸基の90％超、95％超、99％超)。いくつかの態様では、官能化は、酸化還元活性化合物またはフラグメント(例えば、メタロセン、ビオロゲン)、抗体、DNA鎖、RNA鎖、ペプチド、抗体、酵素、分子受容体、これらのうちの1つのフラグメントまたはこれらの組み合わせによるものであり得る。

CNTおよびrGOなどの炭素原子の六角形格子を有する炭素の同素体は本明細書において記載される組成物および構造に電気活性(例えば、伝導性)を付与し得る。純粋なグラフェン、フラーレン、伝導性および半伝導性粒子、ロッド、繊維およびナノ粒子(例えば、金)、ならびに伝導性ポリマー(例えば、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリアニリン)などの他の伝導性要素も、CNTおよびrGOの代わりに用いることができ、または伝導性を調節する(例えば、向上する)、安定性を向上する、かつ/もしくはコーティングの安定性を向上するためにCNTとブレンドする/組み合わせることができる。

興味深いことに、本明細書において記載される態様のいくつかは伝導性に異方性を示す。いくつかの態様では、コーティングは、本明細書においては「横方向」に相当する、電極表面に対して平行または接線方向よりも、本明細書においては「垂直方向」に相当する、電極表面と直角を成す方向に大きく伝導する。デカルト座標では、これはxおよびy方向(例えば、xおよびyポインティング・ベクトルの組み合わせ)よりもz方向(電極表面と直角を成す)への高い伝導に相当し得る。例えば、垂直方向の伝導性は横方向の伝導性よりも少なくとも2倍(例えば、少なくとも3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1000倍)高い。

本明細書において用いるように、「含むこと」または「含む」という用語は、特許請求される発明に必須である組成物、方法、およびそれらの各構成要素に関して用いられるが、特定していない構成要素も必須かどうかにかかわらず含まれることがある。

本明細書において用いるように、「から本質的になる」という用語は所与の態様に必要な構成要素を指す。該用語は、特許請求される発明のその態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を与えない構成要素の存在を許容する。

「からなる」という用語は本明細書において記載される組成物、方法、およびそれらの各構成要素を指し、態様のその説明に記載されていないあらゆる構成要素が除外される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いるように、単数形を表す「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈からそうでないことが明らかである場合を除いて、言及したものの複数形を包含する。よって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書において記載されかつ/または本開示などを読んだ際に当業者には明らかになるであろう種類の1つまたは複数の方法および/または工程を含む。同様に、「または」という語は、文脈がそうでないことを明らかに示している場合を除いて、「および」を含むことを意図している。

実施例以外では、またはそうでないことが示されている場合を除いて、本明細書において用いられる、成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての事例において「約」という用語によって修飾されていると解釈されたい。パーセンテージに関連して用いられた場合の「約」という用語は言及された値の±5％(例えば、±4％、±3％、±2％、±1％)を意味することがある。

値の範囲が提供されている場合は、範囲の上限と下限の間の各数値が本明細書においては意図されかつ開示されている。

本明細書おいて別途規定されている場合を除いて、本出願に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に解釈される意味を有する。さらに、文脈によって必要な場合を除いて、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、それらが異なってもよいと理解されたい。本明細書において用いられる用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図していない。

特定したすべての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明に関連して用いられ得るそのような刊行物に記載された方法論を説明しかつ開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に関してのみ提供されている。この点に関して、先発明によりまたは他のどのような理由であっても、発明者がそのような開示に先行する資格がないと認めていると解釈されるべきではない。日付に関するすべての記載またはこれらの文書の内容に関する表示は出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容が正確であると認めるものではない。

本明細書おいて記載される様々な局面の態様は、番号を付した以下のパラグラフによって示され得る。
1. 六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体と、タンパク質性材料との混合物を含む、組成物であって、
該タンパク質性材料が不可逆的に変性されている、
組成物。
2. 炭素の同素体が、官能化された材料である、パラグラフ1の組成物。
3. 炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、パラグラフ1または2の組成物。
4. カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、パラグラフ3の組成物。
5. 還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、パラグラフ3の組成物。
6. タンパク質性材料が架橋されている、パラグラフ1～5のいずれか1つの組成物。
7. タンパク質性材料がウシ血清アルブミン(BSA)である、パラグラフ1～6のいずれか1つの組成物。
8. 前記混合物が捕捉物質をさらに含む、パラグラフ1～7のいずれか1つの組成物。
9. 伝導性表面をさらに含む、パラグラフ1～8のいずれか1つの組成物。
10. 伝導性表面、および
六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体と、タンパク質性材料との、該伝導性表面の少なくとも一部にコーティングされた混合物
を含む、電極であって、
該タンパク質性材料が不可逆的に変性されている、
電極。
11. 炭素の同素体が、官能化された材料である、パラグラフ10の電極。
12. 炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、パラグラフ10の電極。
13. カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、パラグラフ12の電極。
14. 還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、パラグラフ12の電極。
15. タンパク質性材料が架橋されている、パラグラフ10～14のいずれか1つの電極。
16. タンパク質性材料がBSAである、パラグラフ10～15のいずれか1つの電極。
17. 前記混合物が捕捉物質をさらに含む、パラグラフ10～16のいずれか1つの電極。
18. 前記混合物が横方向よりも垂直方向に大きく伝導する、パラグラフ10～17のいずれか1つの電極。
19. 多重化されている、パラグラフ10～18のいずれか1つの電極。
20. 六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体と、タンパク質性材料とを溶液中で混合する工程
を含む、電極コーティング組成物を作製する方法であって、
該タンパク質性材料が、該炭素同素体との混合前にまたは後に不可逆的に変性される、
方法。
21. 炭素の同素体が、官能化された材料である、パラグラフ20の方法。
22. 炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、パラグラフ20の方法。
23. カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、パラグラフ22の方法。
24. 還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、パラグラフ22の方法。
25. 炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を超音波処理する工程をさらに含む、パラグラフ20～24のいずれか1つの方法。
26. タンパク質性材料が、熱を加えることによって変性される、パラグラフ20～25のいずれか1つの方法。
27. タンパク質性材料を架橋する工程をさらに含む、パラグラフ20～26のいずれか1つの方法。
28. タンパク質性材料がBSAである、パラグラフ20～27のいずれか1つの方法。
29. 炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を精製する工程をさらに含む、パラグラフ20～28のいずれか1つの方法。
30. 溶液が水溶液である、パラグラフ20～29のいずれか1つの方法。
31. 六角形格子状に配置された原子を有する炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物で伝導性表面の少なくとも一部をコーティングする工程
を含む、コーティングされた電極を作製する方法であって、
該タンパク質性材料が、不可逆的に変性されている、
方法。
32. 炭素の同素体が、官能化された材料である、パラグラフ31の方法。
33. 炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、パラグラフ31の方法。
34. カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、パラグラフ33の方法。
35. 還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、パラグラフ33の方法。
36. タンパク質性材料を架橋する工程をさらに含む、パラグラフ31～35のいずれか1つの方法。
37. タンパク質性材料がBSAである、パラグラフ31～36のいずれか1つの方法。
38. 前記混合物が捕捉物質をさらに含む、パラグラフ31～36のいずれか1つの方法。

カーボンナノチューブによるe.ブロック
カーボンナノチューブによるe.ブロックの調製
カルボキシル化カーボンナノチューブ(1.7mg)および5mgのBSAを1mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で混合した。次に室温で30分間50％の振幅でプローブソニケーター(125ワットおよび20KHz)で超音波処理することによって溶液を均質化した。105℃で5分間の熱変性工程に続き、次に、混合物をさらに均質化するために超音波処理工程を繰り返した。CNT凝集物は15分間16.1gの相対遠心力での遠心分離によって分離した。e.ブロッカーを含有する上清を分離し、さらなる使用のために保管した一方で、沈殿したCNTは廃棄した。

いくつかの任意の態様では、例えば、上に記載のように加熱することによって、BSAを第1工程で変性させ得る。次に、CNTを溶液に加えて均質化し得る。

これらの任意の態様の両方では、CNTに共有結合する化学基または分子受容体(例えば、抗体、DNA鎖)でCNTを官能化し得る。

変性の効果を試験するために、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,778,269号に記載の条件を用いてブロッキング剤を作製した。この目的のため、PBS中でBSA(5mg/ml)とカルボキシル官能化単層カーボンナノチューブ(0.1mg/ml)との混合物を作製し、50％の振幅でプローブソニケーター(125ワットおよび20KHz)において室温で30分間超音波処理した。したがって、e.ブロッカーの調製のために用いた熱変性工程はこの実施例では用いなかった。次に、混合物を16.1gの相対遠心力で15分間遠心分離した。上清を収集し(「PTNTM」と呼ぶ)さらなる使用のために保管した一方で、沈殿物は廃棄した。

UV光の領域におけるe.ブロックの吸収は異なるバッチ間で再現可能なスペクトルを示す。図3は230nmおよび280nmでバンドのわずかな低下があることを示し(0日目に変性したBSA/CNTは点線、5日目のBSA/CNTは三角線、9日目に変性したBSA/CNTは二点短鎖線)、これはBSAの変性を表している。タンパク質のランダムコイル分布を示唆するこの特異的な変換は元のBSA(黒実線)、変性BSA(四角マーカー線)またはPTNTM(丸印線)では観察されず、これらはすべて230および280nm付近にピークを示す。これらの結果は、CNTの寄与および変性工程の両方がe.ブロックを調製するための調合にとって非常に有益であることを表している。SWCNT(菱形マーカー線)および変性SWCNT(破線)は走査領域ではほとんど吸着を示さない。

e.ブロックによるセンサのコーティング
電極表面のコーティング前に、e.ブロックを2.5％の最終濃度までグルタルアルデヒド(GA)と混合し、混合物を直ちに電気化学センサにドロップキャストした。次いで、この組み合わせを水飽和雰囲気中で24時間インキュベートした後に、PBSを用いて十分にすすいだ。これは、安定で化学的に不活性でありかつ必要に応じて生体受容体で官能化し得るコーティングを提供する。図4は金センサ6個のアレイの蛍光画像である。画像は上から下に、未修飾の金センサ、e.ブロック+2.5％グルタルアルデヒド(GA)と24時間インキュベートした金センサ、ならびにe.ブロック、2.5％GAおよびカルボジイミドカップリングを介した分子受容体の固定化を可能にするための(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド)/ジシクロヘキシルカルボジイミド(EDC/NHS)で処理したセンサを示す。「GFP」ラベルの下に示されているセンサは0.46mg/mlの緑色蛍光タンパク質(GFP)が滴下され、4℃で一晩インキュベートされている。「PBS」ラベルの下に示されているセンサは陰性対照としてPBSが滴下されている。図5はPBS対照と比較した各センサの表面の相対的な蛍光ピクセル強度を示す。e.ブロックおよび2.5％GAで修飾したセンサは金電極と比較して蛍光の有意な増強を示さず、GAで処理したe.ブロックの反応性は無視できることを表している。これとは対照的に、滴下前にEDC/NHSで活性化した表面は強い蛍光シグナルを示し、カルボジイミドカップリングを介してe.ブロッカー上に分子受容体を共有結合的に固定化する能力を実証した。

比較試料であるPTNTMも金センサで試験した。金センサの表面にPTNTMをドロップキャストし、水飽和雰囲気中で24時間インキュベートした後にPBSを用いて十分にすすいだ。GAとの架橋は省略した。この処理に続いて、コーティングを電気化学的に特性決定し、試験した4つの電極のうちの1つのみが電流を示した。1％BSAを含有する溶液における未処理、e.ブロック処理およびPTNTM処理した5mMフェリ/フェロシアニド結果の酸化電流密度(棒)およびピーク間距離(黒丸マーカー)の比較を図6に示す。示されているように、未処理の金は迅速に不動態化され(30分までに)、e.ブロックは4日間にわたって有意な変化のない高電流密度を示した一方で、PTNTMは5時間にわたって変化しない低初期電流を示す。

滅菌
e.ブロックでコーティングされたセンサは酸素プラズマ(0.3mbar、50ワット、4分間)で処理し、少なくとも1か月間それらの活性を維持し得る。図7は、裸金電極、e.ブロックで修飾しかつO₂プラズマ(0.3mbar、50ワット、4分間)で処理した電極にて測定されたPBS緩衝液中の5mMフェリ/フェロシアニドの酸化電流密度およびピーク間距離からの電気化学シグナル、ならびに該電極の、1％BSA中で1か月間インキュベートした後のシグナルを示す。これは、例えば、細胞播種前の表面の滅菌に有用となり得る。

官能化
e.ブロックでコーティングされた電極はコーティングの安定性を損なうことなくEDC/NHSカップリングケミストリーを介して官能化し得る。e.ブロックでコーティングされたセンサは抗IL6捕捉物質で官能化され(図1)、1％BSA含有マトリクス中のIL6の存在を高感度で定量化することが可能であった。図8は、1％BSAの存在下で様々な濃度のIL6について記録した、沈殿TMBの酸化からの電気化学シグナルを示すプロットである。検出範囲は少なくとも10pg/mL～1000pg/mLまでの少なくとも3桁に及ぶ。

e.ブロックがなければ、特定の電極から電気化学的に活性な化合物が拡散して、隣接する制御電極に蓄積するであろう。e.ブロックの防汚特性が制御センサにおけるシグナルの低減、ひいては検出限界の改善した低減を可能にする。良好な防汚特性により、抗体で官能化されe.ブロックで修飾されたセンサは簡便に調製されかつ1％BSA中で保存し得、電気化学的活性および感度を少なくとも1週間維持する。これはまた、固定された受容体を安定化しかつ、電気活性を保持しつつセンサの保存寿命を延ばすことに特に関連性がある。また、下に記載するように、電極を10mMのHCl・グリシンでフラッシングするだけで、抗体で官能化されたe.ブロック表面の完全な再生が可能である。

図9は、抗IL6捕捉物質で官能化され、1％BSA中で1週間保存され、次いで1％BSAを含有するマトリクス中の200pg/mLのIL6の検出を行うために用いられた金電極表面の性能を示す概略図である。図は4つの異なる状態の電極を示している。状態10は捕捉されたIL6および検出抗体を有する電極を示し、状態20はTMBを沈殿させかつ電気化学的に検出する電極を示し、状態30は10mM HCl・Glyで洗浄した後の電極を示し(捕捉抗体、TMBおよびIL6が流去された)、状態40は検出抗体およびTMBを用いてIL6を検出するために再び用いられた電極を示す。図10、11、および12は図9に描かれた状態の電極を用いて作成したボルタモグラムである。図10に描かれたボルタモグラムは、ピーク電流が258nAである、20(図9)に描かれたIL6検出アッセイ後の沈殿したTMBの酸化還元ピークを示す。純粋なTMBは非常に明確な可逆的酸化還元ピークを2つ示す。表面の再生は、図11に描かれた、電極状態30(図9)に対応するボルタモグラムを生じ、酸化還元ピークを有さない(ベースラインよりも0nM高い)。電極状態40(図9)に対応するリピートアッセイを図12に描かれたボルタモグラムに示す。2つの非常に明確な酸化還元ピークが再びTMBに対応し、電極が再生されたことを示す。190nAのピーク電流は元のシグナルの74％に相当する。これらの実験はセンサを再生させかつ再使用して、感度の喪失を最小限に抑えながら溶液中のIL-6を検出し得ることを示している。

還元グラフェンオキシドによるe.ブロック
還元グラフェンオキシドによるe.ブロックの調製
アミン修飾還元グラフェンオキシドRG-Amino(製品番号805432)およびカルボキシル化還元グラフェンオキシドRG-Carboxylated(製品番号805424)をSigma-Aldrich(Milwaukee, WI)から購入した。1.7mgのカルボキシル化またはアミノ化還元グラフェンオキシドのいずれかと5mgのBSAとを1mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で混合した。次に室温で30分間50％の振幅でプローブソニケーター(125ワットおよび20KHz)で超音波処理することによって溶液を均質化した。続いて105℃で5分間の熱変性工程を行った。還元グラフェン凝集物は15分間16.1gの相対遠心力での遠心分離によって分離した。e.ブロックを含有する上清を分離し、さらなる使用のために保管した一方で、沈殿した還元グラフェンは廃棄した。

電極表面のコーティング
CNTを用いて作製したe.ブロックでコーティングするために用いたのと同じ方法を、還元グラフェンを用いて作製したe.ブロックで電極をコーティングするために用い得る。したがって、電極表面のコーティング前にe.ブロックを2.5％の最終濃度までグルタルアルデヒド(GA)と混合し、混合物を直ちに電気化学センサにドロップキャストした。この組み合わせを24時間インキュベートした後に、PBSを用いて十分にすすいだ。

還元グラフェンe.ブロックによる結果
還元グラフェンはe.ブロックの調製のためのCNTに対する代替物を提供する。2つの異なる種類の還元グラフェン、即ちアミノ化還元グラフェンおよびカルボキシル化還元グラフェンで作製したe.ブロックを例示した。e.ブロッカーで修飾した電気化学表面を未希釈のヒト血漿とともに60分間インキュベートした。PBS中の5mMフェリ/フェロシアニドの酸化ピーク電流をインキュベーションの前後でモニタリングした。図13は、還元グラフェンで作製した両方の種類のe.ブロッカーがヒト血漿とのインキュベーション後のセンサ感度の低下が限定的であり、したがって、電極の伝導性をほぼ保持していることを実証している。

Claims

六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体および／または他の伝導性要素と、タンパク質性材料との混合物を含む、組成物であって、
該タンパク質性材料が不可逆的に変性されており、かつ該タンパク質性材料が架橋されている、
組成物。
炭素の同素体が、官能化された材料である、請求項1記載の組成物。
炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、請求項1記載の組成物。
カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、請求項3記載の組成物。
還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、請求項3記載の組成物。
前記伝導性要素が、伝導性粒子もしくは半伝導性粒子、ロッド、繊維およびナノ粒子、または伝導性ポリマーを含む、請求項1記載の組成物。
前記伝導性要素が、金を含む、請求項1記載の組成物。
タンパク質性材料がウシ血清アルブミン(BSA)である、請求項1記載の組成物。
前記混合物が捕捉物質をさらに含む、請求項1記載の組成物。
前記組成物が、伝導性表面上に存在する、請求項1記載の組成物。
伝導性表面、および
六角形格子状に配置された原子を有する炭素の同素体および／または他の伝導性要素と、タンパク質性材料との、該伝導性表面の少なくとも一部にコーティングされた混合物
を含む、電極であって、
該タンパク質性材料が不可逆的に変性されており、かつ該タンパク質性材料が架橋されている、
電極。
炭素の同素体が、官能化された材料である、請求項11記載の電極。
炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、請求項11記載の電極。
カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブまたはアミノ化カーボンナノチューブである、請求項13記載の電極。
還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、請求項13記載の電極。
前記伝導性要素が、伝導性粒子もしくは半伝導性粒子、ロッド、繊維およびナノ粒子、または伝導性ポリマーを含む、請求項11記載の組成物。
前記伝導性要素が、金を含む、請求項11記載の組成物。
タンパク質性材料がBSAである、請求項11記載の電極。
前記混合物が捕捉物質をさらに含む、請求項11記載の電極。
前記混合物が横方向よりも垂直方向に大きく伝導する、請求項11記載の電極。
多重化されている、請求項11記載の電極。
六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体および／または他の伝導性要素と、タンパク質性材料とを溶液中で混合する工程
を含む、電極コーティング組成物を作製する方法であって、
該方法は、該タンパク質性材料を架橋する工程をさらに含み、かつ、該タンパク質性材料が、該炭素同素体との混合前にまたは後に不可逆的に変性される、
方法。
炭素の同素体が、官能化された材料である、請求項22記載の方法。
炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、請求項22記載の方法。
カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、請求項24記載の方法。
還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、請求項24記載の方法。
炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を超音波処理する工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
タンパク質性材料が、熱を加えることによって変性される、請求項22記載の方法。
前記伝導性要素が、伝導性粒子もしくは半伝導性粒子、ロッド、繊維およびナノ粒子、または伝導性ポリマーを含む、請求項22記載の方法。
前記伝導性要素が、金を含む、請求項22記載の方法。
タンパク質性材料がBSAである、請求項22記載の方法。
炭素の同素体とタンパク質性材料との混合物を精製する工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
溶液が水溶液である、請求項22記載の方法。
六角形格子状に配置された炭素原子を有する炭素の同素体および／または他の伝導性要素と、タンパク質性材料との混合物で伝導性表面の少なくとも一部をコーティングする工程
を含む、コーティングされた電極を作製する方法であって、
該方法は、該タンパク質性材料を架橋する工程をさらに含み、かつ、該タンパク質性材料が、不可逆的に変性されている、
方法。
炭素の同素体が、官能化された材料である、請求項34記載の方法。
炭素の同素体が、カーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物である、請求項34記載の方法。
カーボンナノチューブがカルボキシル化カーボンナノチューブ(CNT)またはアミノ化カーボンナノチューブである、請求項36記載の方法。
還元グラフェンオキシドがカルボキシル化還元グラフェンオキシドまたはアミノ化還元グラフェンオキシドである、請求項36記載の方法。
前記伝導性要素が、伝導性粒子もしくは半伝導性粒子、ロッド、繊維およびナノ粒子、または伝導性ポリマーを含む、請求項34記載の方法。
前記伝導性要素が、金を含む、請求項34記載の方法。
タンパク質性材料がBSAである、請求項34記載の方法。
前記混合物が捕捉物質をさらに含む、請求項34記載の方法。
前記炭素の同素体がカーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物であり、他の伝導性要素が金を含み、前記タンパク質性材料がＢＳＡである、請求項1記載の組成物。
前記炭素の同素体がカーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物であり、他の伝導性要素が金を含み、前記タンパク質性材料がＢＳＡである、請求項11記載の電極。
前記炭素の同素体がカーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物であり、他の伝導性要素が金を含み、前記タンパク質性材料がＢＳＡである、請求項22記載の方法。
前記炭素の同素体がカーボンナノチューブ、還元グラフェンオキシド、またはそれらの混合物であり、他の伝導性要素が金を含み、前記タンパク質性材料がＢＳＡである、請求項34記載の方法。