JP7372145B2

JP7372145B2 - 表面に結合されたアミノ基の定量方法

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Publication number: JP7372145B2
Application number: JP2019235712A
Authority: JP
Inventors: 靖弘寺内; 伸渡辺
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: JP2021105528A

Description

本発明は材料表面の官能基の定量方法に関するものである。

ガラスやシリカ表面は様々な効果を与えるために種々の化学結合をすることが一般的に行われている。従来はその材料表面の化学結合によって付加された官能基を定量することは困難であった。そのような手法としては表面の元素分析、赤外分光法などが用いられていたが、これらの手法では定性的に官能基の存在は分かるものの、官能基の定量的な測定は困難であった。また微量窒素分析装置を用いてアミノ基を定量する方法も知られている（特許文献１）が、高価な分析装置を必要とするため、簡便に測定する方法が望まれていた。

ニンヒドリンはアミノ基を有する化合物、たとえばアミノ酸、ペプチド、蛋白質などと鋭敏に反応して発色することから、古くからアミノ酸のようなアミノ基を含有する化合物の検出、定量に用いられてきた（非特許文献１，２）。

一方で、ガラスやシリカ表面に結合されたアミノ基を定量する際にニンヒドリン反応を適用すると、生成した色素が材料表面に吸着してしまうことがある。材料表面に吸着した色素は、そのままでは従来の分光光度計やカラムクロマトグラフィーといった分析装置に導入することは難しく、アミノ基の定量評価は困難であった。

特開２００４－７５４５９号公報

基礎生化学実験法５化学的測定，丸善株式会社，１９７６年，４２頁新生化学実験講座１タンパク質I 分離・精製・性質，日本生化学会編，１９９０年，１０３頁

本発明の目的は、従来技術では困難であった材料表面の官能基を定量的に評価することが可能な方法を提供することにある。

本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ニンヒドリンを用いてアミノ基を色素に変換する際に塩基性化合物を共存させることで、生じた色素を材料表面に吸着されることなく液層に移動させることができ、溶液状態で一般に用いられる分光光度計のような分析装置で定量評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち本発明の構成は以下の通りである。
［１］被検体の表面に結合されたアミノ基を定量する方法であって、アミン系の化合物及び水酸化ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上の塩基性化合物の存在下、上記アミノ基が結合した被検体と有機溶媒に溶解したニンヒドリンとを、ニンヒドリン反応させることにより色素を形成させた後に、上記被検体と上澄みを分離し、分離した上澄み中の上記色素を定量することを特徴とする、アミノ基の定量方法。
［２］上記塩基性化合物は、アミン系の化合物である、上述のアミノ基の定量方法。
［３］上記アミン系の化合物が第三級アミンである、［２］のアミノ基の定量方法。
［４］上記被検体が無機材料、有機材料、または有機無機複合材料である、［１］～［３］のアミノ基の定量方法。
［５］上記被検体がシリカゲルである、［１］～［４］のいずれかに記載のアミノ基の定
量方法。
［６］アミン系の化合物及び水酸化ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上の塩基性化合物およびニンヒドリンを含む、アミノ基の定量用試薬キット。
［７］上記塩基性化合物は、アミン系の化合物である、上述のアミノ基の定量用試薬キット。
［８］上記アミン系の化合物が第三級アミンである、［７］のアミノ基の定量用試薬キット。
［９］さらに有機溶媒を含む、［６］～［８］のいずれかに記載アミノ基の定量用試薬キット。

本発明のアミノ基の定量方法を用いると、従来技術では困難であった材料表面に結合されたアミノ基を、溶液状態で一般に用いられる分光光度計などの分析装置を用いて定量し評価することが可能になる。

以下、本発明の実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を限定するものではない。

本発明の被検体の表面に結合されたアミノ基の定量方法は、塩基性化合物の存在下、上記アミノ基が結合した被検体と有機溶媒に溶解したニンヒドリンとを、ニンヒドリン反応させることにより色素を形成させた後に、上記被検体と上澄みを分離し、分離した上澄み中の上記色素を定量することを含む。本発明のアミノ基の定量方法は、これらの工程を必須の工程として含んでいればよく、その他の工程を任意に含んでいてもよい。

本発明においてアミノ基とは、アンモニア、第一級アミンから水素を除去した一価の官能基であり、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ（ここでＲはアルキル基、又はアリール基を示す）のような構造を示すものである。

本発明において被検体とは、有機溶媒に溶解しない固体の材料であれば特に制限されるものではなく、シリカゲル、ガラス、金属、金属酸化物、セラミックス、グラファイト・活性炭のような炭素材料などの無機材料や、プラスチック、ゴム、セルロース、天然樹脂、天然繊維、木材、植物、動物性繊維、蛋白質素材、およびこれらの混合物である食品、皮膚、臓器のような有機材料や、繊維強化型プラスチック（ＦＲＰ）、骨、貝殻、甲羅のような有機無機複合材料などが用いられる。これら被検体においては、ニンヒドリン反応で生じた色素がそのまま材料表面に吸着してしまい、生成した色素の量を正確に定量することは困難であった。本発明の方法では色素を材料表面に吸着させることなく、定量することができる点に特徴を有するものである。反応に用いた有機溶媒と容易に分離が可能な点で、シリカゲルが好適である。

一般的に、上述のような材料の表面には機能を付与するためにアミノ基のような官能基を結合させることがある。本発明において、アミノ基は材料に直接結合していてもよく、またアルキル基、アリール基のような有機基を介して結合していてもよい。

本発明において塩基性化合物は、ニンヒドリン反応で生成した色素の液層への移行を円滑に行わせるため、使用する有機溶媒に一部でも溶解するものであれば特に制限されるものではなく、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、アンモニアのような無機塩基や、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、アニリンのような有機塩基などが用いられる。有機塩基であるアミンは、脂肪族アミン、芳香族アミンのいずれも用いることができる。さらに第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンのいずれもが特に制限なく用いることができる。第一級アミン、第二級アミンを用いた場合は、アミン自身がニンヒドリンと反応して色素を生じるが、検体中のアミノ基もニンヒドリンと反応して色素を生じるため測定することは可能である。特に第三級アミンを用いた場合ではニンヒドリン反応を生じないため、分光光度計による測定の際に吸光度のバックグランドが小さくなり測定精度が向上するという点で好適である。

本発明において有機溶媒は、ニンヒドリンや生成した色素を溶解し、かつニンヒドリン反応を行う温度で液体であるものであれば特に制限なく用いることができる。具体的には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、などを用いることができる。ニンヒドリンおよび色素の溶解性の点で、エタノールが好適である。

本発明においてニンヒドリン（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）とは、２，２－ジヒドロキシインダン－１，３－ジオンと呼ばれる、分子量１７８．１５の常温で淡黄色固体の化合物である。本発明において用いられるニンヒドリン反応とは、ニンヒドリンとα－アミノ酸によって起きる呈色反応であり、一般的にはペプチド、蛋白質の検出に用いられている。詳細には下記反応式のように、α－アミノ酸と二分子のニンヒドリンが反応し、共役化合物であるルーヘマン紫（Ｒｕｈｅｍａｎｎ‘ｓＰｕｒｐｌｅ）という青紫色の色素を生成する反応である。アミノ酸以外のアミノ基を有する化合物でもニンヒドリンと反応して発色するが、この場合の反応機構は明らかになっていない。

ニンヒドリン反応を行う温度は、反応効率を上げる点では温度は高い方が良いが、反応によって色素が生成する温度であればよく、室温付近から１００℃付近まで特に限定することなく用いることができる。

添加するニンヒドリンの濃度は、被検体に含まれる全部のアミノ基と反応するのに十分な量が含まれていればよく、一般的にニンヒドリン反応で用いられる濃度である、概ね０．１～５．０％の濃度を用いることができる。

添加する塩基の量は、生成した色素を被検体に再吸着させないために必要十分な量を用いればよい。すなわち、被検体表面の酸性基、シリカの場合ではシリカ表面のシラノール基の量以上の塩基を用いればよい。

反応に用いる溶媒の量は、ニンヒドリン反応で生成した色素を溶解するのに十分な量であり、被検体を分離した後に行う分析装置において精度良く測定可能な色素濃度に相当する量であればよい。

さらに具体的に説明すれば以下のようになる。一般的にシリカ表面のシラノール基の量は、シリカの表面積１００Å^２当たり１０程度とされている（表面科学，第２巻，第３号，１９５頁，１９８１年）。すなわちシリカの表面積１ｍ^２当たりに換算すると約１．６６×１０^－２ｍｍｏｌとなる。比表面積が１００ｍ^２／ｇのシリカの場合にはそのシラノール基の量は約１．６６ｍｍｏｌ／ｇであるので、添加する塩基は１．６６ｍｍｏｌ／ｇよりも多くすれば良い。また、反応に用いる溶媒の量は、シリカを浸漬させた時に、測定するのに十分な量の上澄みを生じる量となるよう適宜調整する。通常は、分析装置として用いられる分光光度計で測定するのに必要となる数ｍｌ程度の上澄みを生じるように調製する。溶媒の量が多い場合には、生成した色素が希釈されるので、分光光度計で測定した時に、その吸光度が０．０１から１の間になるように溶媒量を設定して用いる。

本発明において被検体と上澄みの分離方法は、一般的な方法を用いることができる。例えば、粉状の被検体と上澄みの分離においては、ろ過、遠心分離などの手法を用いることができ、板状の被検体と上澄みの分離においては、被検体表面を適切な溶媒等で洗浄して洗浄液として回収する手法などを用いることができる。

被検体の表面に結合されたアミノ基を定量する本発明の原理は次の通りである。

被検体表面に存在するアミノ基はニンヒドリンと反応することで色素に変換されるが、その際に塩基性化合物を共存させておくことで、生じた色素を材料表面に吸着されることなく液層に移動させることができる。すなわち、被検体中のアミノ基の量と分離して液層へ移動した色素の量は比例関係にある。そのため、液層に存在する色素量を計測することで被検体中のアミノ基の量を知ることができる。一般的には、液相の体積を一定としておき、液相中の色素に起因する吸光度を測定し、その値からアミノ基の量を算出する。

被検体中のアミノ基の量を算出するためには、あらかじめ既知量のアミノ基を含有する物質を使用して検量線を作成した後、アミノ基が未知の被検体を測定した時の測定値を検量線に照らし合わせることで、被検体中のアミノ基の量を算出することができる。

色素の量を測定する機器としては、色素の濃度を計測することができる一般的な分析装置を用いることができる。なかでも紫外分光光度計、可視光分光光度計、赤外分光光度計、ラマン分光光度計のような分光分析装置を用いるのが簡便でよい。

本発明のアミノ基の定量を簡便にするために試薬キットの形態をとることもできる。キットの形態としては、ニンヒドリン、塩基性化合物をそれぞれ容器に小分けしたものを組み合わせる形態が良い。さらに、有機溶媒を組み合わせてもよい。この際、ニンヒドリン、塩基性化合物、有機溶媒が一回の測定に使用する量ずつ小分けされていると、使用者が秤量する手間を省略することができてより好適である。

キットに用いる容器は、一般的なものが特に制限なく用いることができる。材質はガラス、樹脂、セラミックス、金属、紙製容器など、内容物が漏えいしないものであれば特に制限なく用いることができる。

容器の形態についても特に制限されるものではなく、ねじ式容器、バイヤル瓶、点眼容器などを用いることができる。

キットに用いる塩基性化合物は、ニンヒドリン反応で生成した色素の液層への移行を円滑に行わせるため、使用する有機溶媒に一部でも溶解するものであれば特に制限されるものではなく、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、アンモニアのような無機塩基や、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、アニリンのような有機塩基などが用いられる。有機塩基であるアミンは、脂肪族アミン、芳香族アミンのいずれも用いることができる。さらに第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンのいずれもが特に制限なく用いることができる。第一級アミン、第二級アミンを用いた場合は、アミン自身がニンヒドリンと反応して色素を生じるが、検体中のアミノ基もニンヒドリンと反応して色素を生じるため測定することは可能である。特に第三級アミンを用いた場合ではニンヒドリン反応を生じないため、分光光度計による測定の際に吸光度のバックグランドが小さくなり測定精度が向上するという点で好適である。

また、ニンヒドリン、塩基性化合物は測定に必要な濃度に、あらかじめ有機溶媒に溶解させた状態で提供することも可能である。この場合、使用者が試薬を秤量でき、また、ニンヒドリンおよび塩基性化合物を有機溶媒に溶解する手間を省略することができてより好適である。また、ニンヒドリン、塩基性化合物は同じ溶媒に溶解させて、一つの溶液とすることも可能である。

また、上記のようにあらかじめ必要な試薬を小分け、調製しておいたものを複数組まとめて提供することも可能である。この場合、上記のような手間を省略できるだけでなく、試薬調製におけるばらつきを最小限にすることができ、その結果、測定値に対する信頼性が向上することが期待できるので好適である。

キットの構成には、被検体と色素を含んだ上澄みとを分離するための、簡易的な分離器具、例えばロート、ろ過器などを含んでいてもよい。

次に、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
検体であるアミノプロピル基が結合されたシリカゲル粒子（（株）トクヤマ製）１０ｍｇ、エタノール２ｍＬ、２％ニンヒドリン／エタノール溶液０．５ｍＬ、１Ｍトリエタノールアミン／エタノール溶液１ｍＬを混合し、９０℃で３０分間加熱した。得られた混合物の上澄みを分取して濃度測定用のサンプルを得た。濃度測定用サンプルを、紫外可視光分光光度計（島津製作所製ＵＶ－２６００）を用いて波長５７８ｎｍ付近の吸光度を測定した。別途、濃度既知のアミノ化合物（グリシン）のエタノール溶液に、小過剰量の２％ニンヒドリン／エタノール溶液を添加、９０℃で３０分間加熱することで検量線用濃度標準液を調製した。アミノ基濃度が異なる標準液１～３を用いて、上記と同様にして溶液の吸光度を測定した（表１）。

表１の結果をもとに濃度と吸光度の関係を示す検量線を作成して下記の関係式を得た。

アミノ基濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）＝０．１８０２ × 吸光度（ａｂｓ）＋０．００１２
濃度測定用サンプルの吸光度測定結果を上記関係式に代入して、検体中のアミノ基の濃度を算出した（表２）。

＜実施例２＞
検体であるアミノプロピル基が結合されたシリカゲル粒子（（株）トクヤマ製）１０ｍｇ、エタノール２ｍＬ、２％ニンヒドリン／エタノール溶液０．５ｍＬ、１Ｍトリエチルアミン／エタノール溶液１ｍＬを混合し、９０℃で３０分間加熱した。得られた混合物の上澄みを分取して濃度測定用のサンプルを得た。濃度測定用サンプルを、紫外可視光分光光度計（島津製作所製ＵＶ－２６００）を用いて波長５７８ｎｍ付近の吸光度を測定した。別途、濃度既知のアミノ化合物（グリシン）のエタノール溶液に、小過剰量の２％ニンヒドリン／エタノール溶液を添加、９０℃で３０分間加熱することで検量線用濃度標準液を調製した。アミノ基濃度が異なる標準液１～３を用いて、上記と同様にして溶液の吸光度を測定した（表１）。表１の結果をもとに濃度と吸光度の関係を示す検量線を作成して実施例１と同等の関係式を得た。濃度測定用サンプルの吸光度測定結果を上記関係式に代入して、検体中のアミノ基の濃度を算出した（表２）。

＜実施例３＞
検体であるアミノプロピル基が結合されたシリカゲル粒子（（株）トクヤマ製）１０ｍｇ、エタノール２ｍＬ、２％ニンヒドリン／エタノール溶液０．５ｍＬ、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを混合し、９０℃で３０分間加熱した。得られた混合物の上澄みを分取して濃度測定用のサンプルを得た。濃度測定用サンプルを、紫外可視光分光光度計（島津製作所製ＵＶ－２６００）を用いて波長５７８ｎｍ付近の吸光度を測定した。別途、濃度既知のアミノ化合物（グリシン）のエタノール溶液に、小過剰量の２％ニンヒドリン／エタノール溶液を添加、９０℃で３０分間加熱することで検量線用濃度標準液を調製した。アミノ基濃度が異なる標準液１～３を用いて、上記と同様にして溶液の吸光度を測定した（表１）。表１の結果をもとに濃度と吸光度の関係を示す検量線を作成して実施例１と同等の関係式を得た。濃度測定用サンプルの吸光度測定結果を上記関係式に代入して、検体中のアミノ基の濃度を算出した（表２）。

＜実施例４＞
２％ニンヒドリン／エタノール溶液、１Ｍトリエタノールアミン／エタノール溶液、エタノールを調製または準備し、あらかじめ５ｍＬサンプル管に小分け分注した。小分け分注された試薬を用いた以外は実施例１と同様に操作して、検体中のアミノ基の濃度を算出した（表２）。

＜比較例１＞
検体であるアミノプロピル基が結合されたシリカゲル粒子（（株）トクヤマ製）１０ｍｇ、エタノール２ｍＬ、２％ニンヒドリン／エタノール溶液０．５ｍＬを混合し、９０℃で３０分間加熱した。この場合は、被検体であるシリカ粒子に色素が吸着したままで、液層に色素は移動しなかった。

Claims

被検体の表面に結合されたアミノ基を定量する方法であって、アミン系の化合物及び水酸化ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上の塩基性化合物の存在下、前記アミノ基が結合した被検体と有機溶媒に溶解したニンヒドリンとを、ニンヒドリン反応させることにより色素を形成させた後に、前記被検体と上澄みを分離し、分離した上澄み中の前記色素を定量することを特徴とする、アミノ基の定量方法。
前記塩基性化合物は、アミン系の化合物である、請求項１に記載のアミノ基の定量方法。
前記アミン系の化合物が第三級アミンである、請求項２に記載のアミノ基の定量方法。
前記被検体が無機材料、有機材料、または有機無機複合材料である、請求項１～３のいずれか一項に記載のアミノ基の定量方法。
前記被検体がシリカゲルである、請求項１～４のいずれか一項に記載のアミノ基の定量方法。
アミン系の化合物及び水酸化ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つ以上の塩基性化合物およびニンヒドリンを含む、アミノ基の定量用試薬キット。
前記塩基性化合物は、アミン系の化合物である、請求項６に記載のアミノ基の定量用試薬キット。
前記アミン系の化合物が第三級アミンである、請求項７記載のアミノ基の定量用試薬キット。
さらに有機溶媒を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のアミノ基の定量用試薬キット。