JP7404537B2

JP7404537B2 - アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びそれを利用したアルロースの製造方法

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Publication number: JP7404537B2
Application number: JP2022534844A
Authority: JP
Inventors: ユン，ヒョンソプ; チェ，ウンソク; イ，ジハ; キム，ソクス; チョ，スンウ; キム，テヨン; キム，ハクジュン
Original assignee: Daesang Corp
Current assignee: Daesang Corp
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2023-12-25
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Description

本発明は、アルロースエピマー化酵素変異体等に関し、さらに詳細には、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来のＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比して果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性が向上したアルロースエピマー化酵素変異体及びこれより派生した多様な発明に関する。

Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であって、Ｄ－プシコース（Ｄ－ｐｓｉｃｏｓｅ）とも呼ばれる。Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、砂糖と比較したとき、７０％の甘味度を有するが（Ｏｓｈｉｍａ２００６）、エネルギーは０．３％しかないので、ダイエット食品の低カロリー甘味料に適用可能な機能性単糖類である（Ｍａｔｓｕｏｅｔａｌ．２００２）。また、Ｄ－アルロース（Ｄ－ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、ブドウ糖吸収及び血糖を抑制する機能があって糖尿病患者用飲食品、修身用飲食品等に応用でき、肝での脂質合成に関与する酵素活性の抑制を通して腹部脂肪の蓄積を抑制できるので、健康食品等、様々な機能性食品等に使用することができる（Ｍａｔｓｕｏｅｔａｌ．２００１；Ｉｉｄａｅｔａｌ．２００８；Ｈａｙａｓｈｉｅｔａｌ．２０１０；Ｈｏｓｓａｉｎｅｔａｌ．２０１１）。

前記のような特徴でアルロースは砂糖を代替できる良いソースであるが、自然界に極めて稀に存在する単糖類である希少糖に属するため、食品産業に適用するためには、アルロースを効率的に生産する方法が必要である。既存のアルロース生産方法としては、主に化学的過程を経て生産された。ビリック（Ｂｉｌｉｋ）等は、モリブデン酸イオンの触媒作用を利用して果糖をアルロースに転換する方法を提案した。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）は、１，２：４，５－ジ－δ－イソプロピリデン－ベータ－Ｄ－フルクトピラノース（１，２：４，５－ｄｉ－δ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）から３ステップの化学的処理過程でアルロースを生産した。また、ドナー（Ｄｏｎｅｒ）は、エタノールとトリメチルアミンと共に果糖を加熱してアルロースを生産した。しかし、これらの化学的生産方法は、コストが多く消耗されるのに対し、その効率は低く、また副産物が相当量で発生するという短所がある。

生物学的アルロース生産方法としては、微生物の細胞反応を利用してガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、Ｄ－タガトースまたはＤ－タリトール等からアルロースを生産する方法が提案された（ＫｅｎＩｚｕｍｏｒｉ）。しかし、この方法は、基質が希少糖に属するため、産業的生産に応用することが難しい。産業化に最も効率的な方法は、Ｄ－ケトース３－エピマー化酵素群のうち果糖をアルロースに転換する酵素を見つける方法である。既存に発表された内容は、クロストリジウムセルロリティカムＨ（１０）（Ｍｕｅｔａｌ．２０１１）、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ｋｉｍｅｔａｌ．２００６）、シュードモナスチコリ（Ｉｔｏｈａｔａｌ．１９９４）、リゾビウムスペロイデス（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２００９）由来のＤ－タガトース３－エピマー化酵素を大腸菌に挿入して形質転換させた後、形質転換された大腸菌で発現されたＤ－タガトース３－エピマー化酵素を使用して果糖からアルロースを生産した。

酵素を使用して果糖からアルロースを生産する技術と関連して、大韓民国登録特許公報第１０－０７４４４７９号には、アグロバクテリウムツメファシエンス由来のアルロースエピマー化酵素によるアルロースの生産方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－０８３２３３９号には、果糖をアルロースに転換する活性を持つシノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ＹＢ－５８ＫＣＴＣ１０９８３ＢＰとこれを利用して果糖をアルロースに転換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１１０６２５３号には、果糖のアルロースへの転換を触媒する活性を有するアグロバクテリウムツメファシエンスＣ５８のアルロース３－エピマー化酵素をコーディングするポリヌクレオチドを含む大腸菌及びこれを利用して果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３３９４４３号には、リゾビウム属（ｇｅｎｕｓＲｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する微生物から由来するケトース３－エピメラーゼ（ｋｅｔｏｓｅ３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）及びこれを利用して果糖をアルロースに転換する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１３１８４２２号には、クロストリジウムシンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｉｍｓｃｉｎｄｅｎｓ）から由来したＤ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを利用して果糖からアルロースを生産する方法が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１４７３９１８号には、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来するＤ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを利用して果糖からアルロースを生産する方法が開示されている。

しかし、微生物から由来した野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、果糖のアルロースへの転換率が高くなく、熱安定性が低くて最適な活性温度で失活する速度が速く産業化に適当でない。従って、微生物から由来した野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）のＤ－アルロース３－エピマー化酵素に比して果糖のアルロースへの転換率または熱安定性が向上した新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の開発が必要である。Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体と関連して、大韓民国公開特許公報第１０－２０１４－００２１９７４号には、遺伝子水準で突然変異を誘導して高い温度での速いアルロース転換速度と安定性を示すトレポネーマプリミティアＺＡＳ－１由来のＤ－アルロース３－エピマー化酵素が開示されており、大韓民国登録特許公報第１０－１２０３８５６号には、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型アルロースエピマー化酵素の変異を通して収得した熱安定性が向上したアルロースエピマー化酵素変異体が開示されている。

本発明は、従来の背景下で導出されたものであって、本発明は、１番目の目的は、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比して果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性が向上した新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を提供することにある。

本発明の２番目の目的は、新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造する方法または新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体を製造するために必要な多様な要素を提供することにある。

本発明の３番目の目的は、果糖からアルロースを製造する方法または果糖からアルロースを製造するために必要な多様な要素を提供することにある。

本発明の出願人は、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素及びこれを利用して果糖からアルロースを製造する発明について特許出願して登録を受けている［大韓民国登録特許第１０－１４７３９１８号（２０１４．１２．１１）］。前記フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素は、約６．５～７．０のｐＨ範囲及び約６２～６６℃の温度条件で果糖のアルロースへの転換に対する最大活性を示すが、最適な温度条件で反応時間が経つにつれて酵素活性が急激に落ちるため、アルロースの大量生産のための産業化段階でその活用度に限界を有する。また、一般に、アルロースの大量生産のための酵素転換反応は、汚染防止のために高温で実施されるため、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素を産業化に適用するためには、熱安定性を大きく向上させる必要がある。本発明の発明者は、プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素が有する内在的問題点を認識し、タンパク質構造予測技術を活用して野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列で化学結合の変化時に転換率及び熱安定性向上と関連するものと予想されるアミノ酸残基位置候補を導出し、このうち特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させる場合、果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性が向上するという点を確認し、本発明を完成した。

前記１番目の目的を解決するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を提供する。

前記２番目の目的を解決するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株を提供する。また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株を培養してアルロースエピマー化酵素変異体を発現させるステップ；及び、前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離するステップを含むアルロースエピマー化酵素変異体の製造方法を提供する。

前記３番目の目的を解決するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含むアルロース生産用組成物を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体または前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させるステップを含むアルロースの製造方法を提供する。また、本発明は、果糖を配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物またはこれらのいずれか一つ以上を含む組成物と反応させるステップを含むアルロースの製造方法を提供する。

本発明に係る新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比して果糖のアルロースへの転換活性が高く、特に、６０℃以上の高温条件で熱安定性に非常に優れるため、アルロースの大量生産のための産業化水準の酵素転換反応時、汚染を防止でき、生産時間を短縮させることができ、生産コストを節減させることができる。

本発明の発明者らがフラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性を向上させるために置換候補に選定した７個のアミノ酸残基位置を示したものである。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明の一側面は、果糖をアルロースに転換させることができる新規なＤ－アルロース３－エピマー化酵素変異体（以下、「アルロースエピマー化酵素変異体」という）に関する。本発明の一例に係るアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋは、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換されたものである。また、本発明の好ましい一例に係るアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものである。また、本発明のさらに好ましい一例に係るアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）がリシン（Ｌｙｓ）に置換され、２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、同時に２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）がイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換されたものである。本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ、Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉ及びＷ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素に比して果糖のアルロースへの転換活性が高く、特に、６０℃以上の高温条件で熱安定性に非常に優れる。前記アルロースエピマー化酵素変異体は、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）に由来した野生型Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号１４の塩基配列からなる）を鋳型とし、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを遂行し、以後、増幅された変異体断片の対を鋳型とし、制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｔｅｎｔｉｏｎＰＣＲを遂行し、アルロースエピマー化酵素変異体のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを製造した後、前記組換え発現ベクターで宿主菌株を形質転換させて組換え菌株を製造した後、前記組換え菌株を培養して発現させる方法で得られ得る。本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるが、本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲が必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、果糖をアルロースに転換する活性及び６０℃以上の高温で熱安定性が維持される限り、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列のうち一部のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されたものであってよい。前記アミノ酸の置換は、好ましくは、タンパク質の特性が変わらない保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によりなされることが好ましい。また、前記アミノ酸の変形は、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等によりなされ得る。また、本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、アミノ酸配列上の変異または修飾によって熱、ｐＨ等に対する構造的安定性が増加するか果糖のアルロースへの転換に対する活性が増加したタンパク質を含むことができる。また、本発明に係るアルロースエピマー化酵素変異体の均等範囲は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってよい。

本発明の他の側面は、新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造する方法または新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造するために必要な多様な要素に関する。前記新規なアルロースエピマー化酵素変異体を製造するために必要な多様な要素としては、ポリヌクレオチド、プライマー対、組換えベクター、組換え菌株等がある。

前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号１５の塩基配列、配列番号２４の塩基配列または配列番号２６の塩基配列から選択されたいずれか一つの塩基配列からなる。本発明において使用する用語「ポリヌクレオチド」は、非変形（ｎｏｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または変形された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）全てのポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味する。前記ポリヌクレオチドは、単一－または二重－鎖ＤＮＡ、単一－及び二重－鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単一－及び二重－鎖ＲＮＡ、単一－及び二重－鎖領域の混合物であるＲＮＡまたはこれらのハイブリッド分子を含むが、これに制限されるものではない。また、前記アルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドの均等範囲は、配列番号１５の塩基配列、配列番号２４の塩基配列または配列番号２６の塩基配列から選択されたいずれか一つの塩基配列に対して実質的同一性を有する配列を含む。前記の実質的な同一性は、配列番号１５の塩基配列、配列番号２４の塩基配列または配列番号２６の塩基配列から選択されたいずれか一つの塩基配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列し、その配列を分析して、前記任意の他の配列が配列番号１５の塩基配列、配列番号２４の塩基配列または配列番号２６の塩基配列から選択されたいずれか一つの塩基配列と７０％以上、９０％以上、または９８％以上の配列相同性を有することを意味する。当該分野における通常の知識を有する技術者は、当該分野に公知になった遺伝子組換え技術等を利用して前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうち一つまたはそれ以上の塩基を置換、付加または欠失させることで前記実質的相同性を有する範囲で同じ活性を有するアルロースエピマー化酵素変異体を暗号化するポリヌクレオチドを製造できることが容易に理解できるだろう。このような相同性の比較は、市販のコンピュータプログラムを利用して２個以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算して遂行され得る。

また、前記プライマー対は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを合成するためのものであって、好ましくは、アミノ酸残基置換位置及び種類によって次のような塩基配列を有する順方向プライマーと逆方向プライマーで構成される。

Ｗ２９Ｋ
＊順方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＡ
＊逆方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＴＣＧＣＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＧ

Ｇ２１６Ｓ
＊順方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣ
＊逆方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＧＣＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣ

Ｍ２３４Ｉ
＊順方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＴ
＊逆方向プライマー塩基配列（５’→３’）
ＡＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴ

また、前記組換えベクターは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを含む。前記組換えベクターは、アルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドを公知の標準方法を使用してクローニングベクターや発現ベクター内に挿入した形態で提供され得る。本発明において使用する用語「クローニングベクター」は、宿主細胞内にＤＮＡ断片を運搬し、これを再生産できる物質と定義される。本発明において、クローニングベクターは、ポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）、転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び多重クローニング位置（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）をさらに含むことができる。このとき、前記多重クローニング位置（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）は、少なくとも一つのエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）制限酵素切断位置（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ）を含む。また、クローニングベクターは、プロモーターをさらに含むことができる。一例として、本発明において、アルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドは、ポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）及び転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置し得る。また、本発明において使用する用語「発現ベクター」は、適切な宿主の中でクローニングされたＤＮＡの転写と翻訳のために必要なＤＮＡ配列と定義される。また、本発明において使用する用語「発現ベクター」は、個体の細胞内に存在する場合、挿入物が発現されるように挿入物に作動可能に連結された必須な調節要素を含む遺伝子作製物を意味する。前記発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して製造及び精製され得る。前記発現ベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の各種の宿主細胞で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しながら自然状態と類似した形態の外来タンパク質を大量に生産できるベクターが好ましい。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子及び終結コドンターミネーターを含んでいることが好ましい。その他にシグナルペプチドをコーディングするＤＮＡ、追加的発現調節配列、所望の遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、または複製可能単位等を適切に含むこともできる。「プロモーター」は、転写を指示するに十分な最小配列を意味する。また、前記プロモーターには、細胞類型特異的または外部の信号または製剤により誘導される調節可能なプロモーター依存的遺伝子を発現するようにするのに十分なプロモーター構成が含まれ得、このような構成は、遺伝子の５’または３’部分に位置し得る。前記プロモーターには、保存的プロモーター及び誘導的プロモーターの両方とも含まれる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物またはウイルスから由来し得る。本発明において使用する用語「作動可能に連結された」は、単一ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチド配列関連性で一つの機能が他のものにより調節されるということを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を制御できる場合（即ち、コーディング配列がプロモーターの転写調節下にある場合）、プロモーターは、コーディング配列と連結されて作動されるか、リボソーム結合部位が翻訳を促進させることができるように位置していれば、リボソーム結合部位は、コーディング配列に連結されて作動されるのである。コーディング配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に連結されて作動され得る。本発明に係る組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。

また、前記組換え菌株は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドにより形質転換されるか前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換されたものである。本発明において使用する用語、「組換え菌株」は、一つ以上の目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドまたはこれを有する発現ベクターが宿主細胞に導入されて形質転換された細胞を意味する。前記発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造するための方法としては、一時的な形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質感染（ｌｉｐｏｓｅｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン－媒介された形質感染（ＤＥＡＥＤｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン－媒介された形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧ等の化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅｇｕｎ）等を利用する方法、熱衝撃（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ）方法等があるが、ここに限定されるものではない。本発明において発現ベクターで形質転換され得る宿主細胞としては、原核細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等、当業界に公知になったものであればその種類が大きく制限されず、好ましくは、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率の高い宿主が通常使用される。例えば、前記宿主細胞は、大腸菌であってよい。前記大腸菌として、ＢＬ２１、ＪＭ１０９、Ｋ－１２、ＬＥ３９２、ＲＲ１、ＤＨ５αまたはＷ３１１０等があるが、これに制限されるものではない。この他にも、前記宿主細胞として、バチルスサブチルス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、コリネバクテリウムグルタミカムのようなコリネバクテリア属菌株、サルモネラティフィムリウム等のサルモネラ属菌株、その他のセラチアマルセッセンス及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株等からなる群から選択された菌株を使用しても構わない。

また、前記アルロースエピマー化酵素変異体の製造方法は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドにより形質転換されるか前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株を培養してアルロースエピマー化酵素変異体を発現させるステップ；及び、前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からプシコースエピマー化酵素を分離するステップを含む。宿主細胞によるタンパク質の発現は、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、誘導因子であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）等を使用して発現を誘導でき、誘導時間は、タンパク質の量を最大化されるように調節できる。本発明において、アルロースエピマー化酵素変異体は、組換え菌株の破砕物から回収され得る。タンパク質発現に使用された細胞は、凍結－解凍繰り返し、超音波処理、機械的破壊または細胞分解剤のような多様な物質的または化学的手段により破壊され得、通常の生化学的分離技術によって分離または精製が可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｒｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）。例えば、宿主細胞により発現されたタンパク質の分離または精製方法としては、電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈殿、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、免疫吸着親和力クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）、等電性フォーカス及びその多様な変化または複合方法を含むが、これに限定されない。一方、本発明において組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離するステップは、好ましくは、ペプチドタグを利用した親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により遂行され得る。前記ペプチドタグとしては、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎｃａｒｂｏｘｙｌｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ）、ｃ－ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）等のように公知の多様なタグを使用することができ、この中でＨｉｓタグであることが好ましい。Ｈｉｓ－タギングされたタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸）樹脂のカラム上に特異的にトラッピングされ、ＥＤＴＡまたはイミダゾールにより溶出され得る。

本発明のまた他の側面は、果糖からアルロースを製造する方法または果糖からアルロースを製造するために必要な多様な要素に関する。前記果糖からアルロースを製造するために必要な多様な要素としては、アルロース生産用組成物がある。

前記アルロース生産用組成物の一例は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体を含む。また、前記アルロース生産用組成物の他の例は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドで形質転換されるか前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含む。このとき、前記アルロース生産用組成物は、好ましくは、マンガンイオン、ニッケルイオン及びコバルトイオンからなる群から選択される１種以上をさらに含むことができ、さらに好ましくは、ニッケルイオンまたはコバルトイオンをさらに含むことができる。本発明に係る新規なアルロースエピマー化酵素変異体は、金属イオンにより活性化が調節される金属酵素（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ）特性を示し、前記酵素による反応をニッケルイオンまたはコバルトイオンのような特定金属イオンの存在下で遂行することでアルロースの生産収率を増加させることができる。

また、前記果糖からアルロースを製造する方法の一例は、果糖を配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチドにより形質転換されるか前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物またはこれらのいずれか一つ以上を含む組成物と反応させるステップを含む。また、前記果糖からアルロースを製造する方法は、金属イオンを添加するステップをさらに含むことができ、金属イオンの種類は、前述したとおりである。一例として、前記金属イオンは、基質である果糖に添加されるか、酵素変異体と果糖の混合物に添加され得る。また、他の例として、前記金属イオンは、酵素変異体が固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記酵素変異体が固定化された担体と果糖の混合物に添加されるか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態で添加され得る。組換え菌株を使用する場合、前記金属イオンが培養物に添加されるか金属イオンが添加された培養培地で培養が遂行されてもよい。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、前記アルロースエピマー化酵素変異体または前記組換え菌株は、好ましくは担体に固定化される。前記担体は、固定された酵素の活性が長期間維持され得る環境を造成できるものであり、酵素固定化用途に使用できる公知になった全ての担体から選択され得る。例えば、前記担体として、アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍａｌｇｉｎａｔｅ）を使用することができる。アルギン酸ナトリウムは、海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であり、マンヌロン酸（β－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）とグルロン酸（α－Ｌ－ｇｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）が組成されており、含量面では無作為にベータ－１，４結合をなして形成され、菌株または酵素を安定して固定させることができ、アルロースの収率の側面で有利であり得る。一例として、アルロースの収率をより増進させるために、１．５～４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、好ましくは、約２．５％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を組換え菌株の固定化に使用することができる。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、反応温度は、６０～７０℃、好ましくは６０～６７℃、酵素変異体の安定性及び最大活性を考慮するとき、さらに好ましくは６２～６５℃の範囲であり、反応ｐＨは、６．５～８、好ましくは６．５～７．５、さらに好ましくは６．５～７の範囲である。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において、果糖の濃度は特に制限されないが、生産性乃至経済性を考慮するとき、全体反応物を基準に１～７５％（ｗ／ｗ）であることが好ましく、４～３５％（ｗ／ｗ）であることがさらに好ましい。また、前記果糖からアルロースを製造する方法において使用される酵素変異体の濃度は、全体反応物を基準に０．００１～０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．０２～０．０５ｍｇ／ｍｌであってよい。また、組換え菌株を利用して果糖からアルロースを製造する場合、前記組換え菌株の宿主菌株は、食品学的に安全な菌株であることが好ましい。前記食品学的に安全な菌株は、一般に安全なものと認められるＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙａｃｃｅｐｔｅｄａｓｓａｆｅ）級菌株を意味し、例えば、サッカロマイセス属菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｐ．）、バチルス属菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）、コリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）等から選択され得る。前記菌株は、飼料、医薬品及び食品等の分野で多様な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。このような菌株は、遺伝子操作及び大量培養に容易であるか、多様な工程条件で高い安定性を有する菌株である。また、このような菌株は、他の細菌に比して相対的に硬い細胞膜構造を保有しているため、高い糖濃度等による浸透圧の影響下でも菌体が安定した状態で存在する生物学的特性を示す。前記ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙａｃｃｅｐｔｅｄａｓｓａｆｅ）級菌株の具体的な例としては、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バチルスサブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等がある。

以下、本発明を実施例を通してより具体的に説明する。ただし、下記実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものであるだけで、本発明の保護範囲を制限するものではない。

実施例１：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の転換率及び熱安定性向上のためのアミノ酸置換位置の探索
フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）から由来したＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性向上のためにタンパク質構造予測を基盤にアミノ酸置換位置を選定した。前記フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）から由来したＤ－アルロース３－エピマー化酵素（またはＤ－プシコース３－エピマー化酵素）は、本願発明の出願人が以前に出願して登録を受けた大韓民国登録特許第１０－１４７３９１８号（２０１４．１２．１１）に開示されている。前記フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）から由来したＤ－アルロース３－エピマー化酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、中性以下のｐＨ条件で果糖のアルロースへの転換に対して最大活性を有し、短い時間に高い収率で果糖からアルロースの大量生産が可能であるが、汚染防止等のために高温条件で酵素反応を進行する場合、活性が急激に減少する問題がある。本発明の発明者らは、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）から由来したＤ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性を向上させるために、フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素のアミノ酸配列を基盤にホモロジーモデリング技法を利用してタンパク質構造を予測し、アミノ酸置換位置を探索した。前記ホモロジーモデリングは、Ｒｏｂｅｔｔａサーバを利用して遂行され、タンパク質構造予測及び分析は、Ｃｏｏｔ、ＰｙＭｏｌ、ＵＣＳＦＣｈｉｍｅｒａのようなソフトウェアプログラムを利用して遂行された。Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の３次元構造モデル分析を通して、化学結合の変化時、転換率及び熱安定性向上と関連するものと予想される計７個のアミノ酸残基位置及び前記位置に置換されるアミノ酸残基を選定した。図１は、本発明の発明者らがフラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性を向上させるために置換候補に選定した計７個のアミノ酸残基位置を示したものである。図１において、「Ｗ２９」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）を示し、「Ｃ３５」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち３５番目の位置に存在するシステイン（Ｃｙｓ）を示し、「Ｄ７９」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち７９番目の位置に存在するアスパラギン酸（Ａｓｐ）を示し、「Ｖ１０９」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち１０９番目の位置に存在するバリン（Ｖａｌ）を示し、「Ｍ１９９」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち１９９番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）を示し、「Ｎ２１８」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１８番目の位置に存在するアスパラギン（Ａｓｎ）を示し、「Ｍ２３４」は、配列番号１のアミノ酸配列のうち２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）を示す。また、図１に示されてはいないが、先行研究の結果から配列番号１のアミノ酸配列のうち２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）を「Ｇ２１６」と命名し、置換候補に選定した。また、後述するように、配列番号１のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）をリシン（Ｌｙｓ）に置換して配列番号２のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち３５番目の位置に存在するシステイン（Ｃｙｓ）をロイシン（Ｌｅｕ）に置換して配列番号３のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｃ３５Ｌを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち７９番目の位置に存在するアスパラギン酸（Ａｓｐ）をプロリン（Ｐｒｏ）に置換して配列番号４のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｄ７９Ｐを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち１０９番目の位置に存在するバリン（Ｖａｌ）をアラニン（Ａｌａ）に置換して配列番号５のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｖ１０９Ａを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち１９９番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換して配列番号６のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｍ１９９Ｆを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換して配列番号７のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｇ２１６Ｓを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１８番目の位置に存在するアスパラギン（Ａｓｎ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換して配列番号８のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｎ２１８Ｃを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換して配列番号９のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｍ２３４Ｉを作製した。また、配列番号１のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）をリシン（Ｌｙｓ）に置換し、同時に配列番号１のアミノ酸配列のうち２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換して配列番号１０のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）をリシン（Ｌｙｓ）に置換し、同時に配列番号１のアミノ酸配列のうち２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換して配列番号１１のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉを作製し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換し、同時に配列番号１のアミノ酸配列のうち２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換して配列番号１２のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉを作製した。また、配列番号１のアミノ酸配列のうち２９番目の位置に存在するトリプトファン（Ｔｒｐ）をリシン（Ｌｙｓ）に置換し、配列番号１のアミノ酸配列のうち２１６番目の位置に存在するグリシン（Ｇｌｙ）をセリン（Ｓｅｒ）に置換し、同時に配列番号１のアミノ酸配列のうち２３４番目の位置に存在するメチオニン（Ｍｅｔ）をイソロイシン（Ｉｌｅ）に置換して配列番号１３のアミノ酸配列からなる酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６／Ｍ２３４Ｉを作製した。

実施例２：フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の過発現のための組換えベクター及び組換え菌株の作製
フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素の野生型ポリヌクレオチドを基盤にｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ方法を利用して酵素変異体１２種（Ｗ２９Ｋ、Ｃ３５Ｌ、Ｄ７９Ｐ、Ｖ１０９Ａ、Ｍ１９９Ｆ、Ｇ２１６Ｓ、Ｎ２１８Ｃ、Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ、Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉ、Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。

まず、フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素変異体をコーディングする遺伝子を作製するために、下記表１に示すプライマーを利用してＰＣＲ反応を遂行した。具体的に、１００μＭのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が添加された反応液に表１のプライマーであるオリゴヌクレオチド１ｐＭ、テンプレート（鋳型）として利用されるフラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素の野生型ポリヌクレオチド（配列番号１４）１００ｎｇを混合し、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩｎｃ．，ＪＡＰＡＮ）を利用してｐｆｕ－ＸＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｂｉｏｎｅｅｒ）１ユニットの存在下に２５～３０周期でＰＣＲ反応を遂行した。

［表１］

プライマー組み合わせを通して変異体断片を増幅した後、それぞれの対を鋳型とし、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素認識部位の配列が導入されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｔｅｎｔｉｏｎＰＣＲを通して最終的に酵素変異体１２種（Ｗ２９Ｋ、Ｃ３５Ｌ、Ｄ７９Ｐ、Ｖ１０９Ａ、Ｍ１９９Ｆ、Ｇ２１６Ｓ、Ｎ２１８Ｃ、Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ、Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉ、Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ、Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉ）のアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を作製した。下記表２に制限酵素認識部位の配列を導入するために使用されたプライマーの塩基配列を示した。

［表２］

配列番号１５の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１６の塩基配列は、酵素変異体Ｃ３５Ｌのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１７の塩基配列は、酵素変異体Ｄ７９Ｐのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１８の塩基配列は、酵素変異体Ｖ１０９Ａのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号１９の塩基配列は、酵素変異体Ｍ１９９Ｆのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２０の塩基配列は、酵素変異体Ｇ２１６Ｓのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２１の塩基配列は、酵素変異体Ｎ２１８Ｃのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２２の塩基配列は、酵素変異体Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２３の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２４の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２５の塩基配列は、酵素変異体Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示し、配列番号２６の塩基配列は、酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド断片を示す。配列番号１５乃至２６の塩基配列は、酵素変異体のアミノ酸配列に直接対応する塩基配列で構成されており、便宜上、制限酵素認識部位の配列を省略した。

以後、作製されたポリヌクレオチド断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを使用して発現ベクターであるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同じ制限酵素部位に挿入して組換え発現ベクター１２種を作製した。また、熱衝撃（ｈｅａｔｓｈｏｃｋ）方法（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．参照）を使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組換え発現ベクターを導入させて形質転換し、組換え大腸菌１２種を作製した。作製した組換え大腸菌に６０％グリセリン溶液を添加し、酵素発現のための培養を実施する前に－７０℃で冷凍保管した。

実施例３：フラボニフラクタープラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒｐｌａｕｔｉｉ）由来Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の発現及び精製
下記表３の組成（培地１Ｌ基準）を有するタンパク質発現用培地１５０ｍｌが収容された１Ｌ容量のフラスコに実施例２で作製した組換え大腸菌１ｍｌを接種し、振とう培養機で３２℃の温度条件及び１４０ｒｐｍの振とう条件を維持しながら２４ｈｒの間培養した。培地に含まれた１％ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）でアルロースエピマー化酵素変異体の過発現を誘導した。

［表３］

以後、過発現されたアルロースエピマー化酵素変異体を次のような方法で分離した。まず、組換え大腸菌の培養液を４１００×ｇ及び４℃の条件で約１５分間遠心分離して上清液を除去し、組換え大腸菌の菌体を回収した。以後、回収された組換え大腸菌の菌体をｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ第１リン酸カリウム、３００ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭイミダゾール含有）に懸濁させた後、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で処理して細胞を破砕した。以後、細胞破砕液を１５，８１４×ｇ及び４℃の条件で約１０分間遠心分離して細胞ペレットを除去し、上清液だけを回収した。以後、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）親和クロマトグラフィーカラム及び脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）カラムを利用して回収した上清液からアルロースエピマー化酵素変異体を含有した精製酵素液を分離した。

実施例４：Ｄ－アルロース３－エピマー化酵素変異体の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性の確認
フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素の野生型及び変異体の果糖のアルロースへの転換率及び熱安定性を確認するために、酵素を高温に一定時間の間露出させた後、果糖のアルロースへの転換活性が減少する程度を分析した。具体的に実施例３で収得した精製酵素液（酵素濃度１ｍｇ／ｍｌ）を６２℃の恒温水槽で０ｈｒ、１ｈｒ及び２ｈｒの間保管して熱処理した。以後、４％（ｗ／ｗ）果糖及び１ｍＭ硫酸ニッケル（ＮｉＳＯ_４）の金属イオンが含まれた５０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に熱処理された精製酵素液を酵素濃度が２５μｇ／ｍｌになるように添加し、振とう恒温水槽（ＶＳ－１２０５ＳＷ１、ビジョン科学）を利用して６５℃の温度条件及び１２０ｒｐｍの振とう条件で２５分間反応させた。以後、反応生成液の温度を４℃に下げて反応を停止させ、１６，６００×ｇ及び４℃の条件で遠心分離して上清液を回収した。以後、糖分析カラム（Ｂｅｎｓｏｎ、米国）が取り付けられた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ＳＰ９３０Ｄｐｕｍｐ、ＹＯＵＮＧＬＩＮ機器；ＭＩＤＡＳ自動試料注入器、ＳｐａｒｋＨｏｌｌａｎｄ社）及び屈折指数検出器（２４１４ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ社）を利用して上清液内のアルロース濃度及び果糖濃度を測定し、測定された結果から果糖のアルロースへの転換率を計算した後、転換率を酵素活性の指標で使用した。

下記表４及び表５にフラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素の野生型及び変異体を熱処理した時の熱処理条件別の果糖のアルロースへの転換率を示した。

［表４］

［表５］

前記表４から見られるように、フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素野生型のアミノ酸残基１個を他のアミノ酸残基に置換したアルロースエピマー化酵素変異体のうちＷ２９Ｋ、Ｇ２１６Ｓ、Ｍ２３４Ｉは、アルロースエピマー化酵素野生型（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）と比較したとき、熱処理と関係なく果糖のアルロースへの転換活性が野生型とほとんど同一であるかさらに高く、特に、顕著に向上した熱安定性を示した。また、フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素野生型のアミノ酸残基２個を他のアミノ酸残基に置換したアルロースエピマー化酵素変異体のうちＷ２９Ｋ／Ｍ２３４Ｉは、熱処理と関係なく果糖のアルロースへの転換活性及び熱安定性に非常に優れていた。また、フラボニフラクタープラウティ由来アルロースエピマー化酵素野生型のアミノ酸残基３個を他のアミノ酸残基に置換したアルロースエピマー化酵素変異体Ｗ２９Ｋ／Ｇ２１６Ｓ／Ｍ２３４Ｉは、熱処理と関係なく果糖のアルロースへの転換活性及び熱安定性に最も優れていた。

以上のように本発明を前記の実施例を通して説明したが、本発明が必ずしもここにのみ限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を外れない範囲内で多様な変形実施が可能であることはもちろんである。従って、本発明の保護範囲は、本発明に添付の特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むものと解釈されるべきである。

Claims

配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列から選択されたいずれか一つのアミノ酸配列からなるアルロースエピマー化酵素変異体。
請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体をコーディングするポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１５の塩基配列、配列番号２４の塩基配列または配列番号２６の塩基配列から選択されたいずれか一つの塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
請求項４に記載の組換えベクターのいずれか一つにより形質転換された組換え菌株。
請求項５に記載の組換え菌株を培養してアルロースエピマー化酵素変異体を発現させるステップ；及び
前記アルロースエピマー化酵素変異体が発現された組換え菌株の破砕物からアルロースエピマー化酵素変異体を分離するステップを含むアルロースエピマー化酵素変異体の製造方法。
請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体を含むアルロース生産用組成物。
請求項５に記載の組換え菌株、前記組換え菌株の培養物または前記組換え菌株の破砕物を含むアルロース生産用組成物。
果糖を請求項１に記載のアルロースエピマー化酵素変異体または前記アルロースエピマー化酵素変異体を含む組成物と反応させるステップを含むアルロースの製造方法。
果糖を請求項５に記載の組換え菌株、前記組換え菌株の培養物、前記組換え菌株の破砕物またはこれらのいずれか一つ以上を含む組成物と反応させるステップを含むアルロースの製造方法。