JP7407973B2 - 抗体薬物複合体、その調製方法、およびその使用 - Google Patents

抗体薬物複合体、その調製方法、およびその使用 Download PDF

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Description

本出願は、２０２０年５月１５日を出願日とする中国特許出願第２０２０１０４１０６３３．５号に基づき、その優先権を主張し、その開示は、本明細書によりその全体が本出願に組み込まれる。
本発明は、生物医学の技術分野に属し、具体的には、抗クローディン１８．２抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）、および、そのＡＤＣを含む組成物、ならびにそれらの使用に関する。
胃がんの治療では、外科的切除が主流である。切除不能または再発性の胃がんの場合、化学療法が主な治療法であるが、現行の技術水準では、化学療法は症状を緩和し、生存期間を延ばすことしかできない。現在、進行胃がんのための広く認識されている標準的な化学療法レジメンは存在しない。生体高分子薬物に関しては、承認されているトラスツズマブ、ラムシルマブ、ペムブロリズマブなどを除いて、他の胃がん標的薬のほとんどは有効性が不十分であるか、依然として臨床研究の初期段階にある。既存の薬物の主要な弱点としては、非外科的治療の臨床的ニーズが満たされていないこと、進行胃がんまたは再発性胃がんの治療選択肢が非常に限られていること、予後が非常に悪いこと、および高い死亡率が挙げられる。胃がんの発生率は高いため、胃がん薬に対する現在の需要は大きい。
クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）は、クローディンタンパク質ファミリーのメンバーである。クローディンファミリータンパク質は、細胞間のタイトジャンクションを媒介するタンパク質の一種である。異なるクローディンサブタイプが異なる組織で発現され、異なる種類のがんに関連する。胃粘膜細胞において、正常組織におけるクローディン１８．２の発現は制限されている。クローディン１８．２は、原発性胃腺がんおよびその転移の７０％において高度に発現され、他のがん、例えば、膵臓がん、食道がん、および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）においても発現される。腫瘍組織におけるクローディン１８．２の非常に特異的な発現により、クローディン１８．２は、腫瘍免疫療法の非常に良好な標的となっている。
本出願の発明者は、クローディン１８．２に対して高い特異性および高い親和性を有する抗体をＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１２６４９５に記載しており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれ、本出願の一部となる。大規模な創造的研究により、本出願の発明者は、クローディン１８．２抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）をさらに発明し、これは、腫瘍の治療のための安全で効果的な薬物の選択肢を提供する。
具体的には、本発明者らは、クローディン１８．２を標的とする一連のＡＤＣ、およびそのＡＤＣを含む組成物を得るために、クローディン１８．２に特異的に結合する高親和性の抗体をリンカーを介して生物活性分子にコンジュゲートする。このＡＤＣまたは組成物は、クローディン１８．２によって発現されるいくつかの腫瘍細胞に対して高い殺傷活性を有する。動物実験（インビボ）では、ＡＤＣは、クローディン１８．２陽性腫瘍、特に胃がんまたは胃腺がんの増殖を効果的に阻害することができ、使用において非常に安全である。
抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）
一態様では、本発明は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、その構造が式（Ｉ）：
（Ｄ－Ｌ）γ－Ａ
式（Ｉ）
に示される抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を提供し、
式中、Ｄは生物活性分子のフラグメントであり；Ｌはリンカーであり；
γは１～１０の整数であり；好ましくは、γは１～８の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）であり；
Ａは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１３、１４もしくは２３に記載のＶＨ（重鎖可変領域）に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３；ならびに／もしくは
以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号１５もしくは２４に記載のＶＬ（軽鎖可変領域）に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３；
または
（２）以下の３つの重鎖ＣＤＲ：（１）に記載のＣＤＲ－Ｈ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１）に記載のＣＤＲ－Ｈ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１）に記載のＣＤＲ－Ｈ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体；ならびに／もしくは
以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：（１）に記載のＣＤＲ－Ｌ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、（１）に記載のＣＤＲ－Ｌ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１）に記載のＣＤＲ－Ｌ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体
を含み、
ここで、（２）に記載の３つの重鎖ＣＤＲおよび／または３つの軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、（１）の対応するＣＤＲと比較してアミノ酸変異を含み、このアミノ酸変異は、１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加（例えば、１、２または３個のアミノ酸の置換、欠失または付加）であり；上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴまたはＡｂＭナンバリングシステムに従って定義される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む；
（１－１）ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２もしくは２１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３；ならびに／もしくは
ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される、以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３；
もしくは
（１－２）以下の３つの重鎖ＣＤＲ：（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体；ならびに／もしくは
以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（１－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体であって、
ここで、上記３つの重鎖ＣＤＲならびに／もしくは３つの軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、（１－１）における対応するＣＤＲと比較してアミノ酸変異を含み、上記アミノ酸変異は、１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加（例えば、１、２または３個のアミノ酸の置換、欠失または付加）であり；上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である、３つの重鎖ＣＤＲならびに／もしくは３つの軽鎖ＣＤＲ；
または
（２－１）ＡｂＭナンバリングシステムによって定義される、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号７の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８もしくは２２の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３；ならびに／もしくは
ＡｂＭナンバリングシステムによって定義される、以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号１０の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１２の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３；
もしくは
（２－２）以下の３つの重鎖ＣＤＲ：（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｈ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体；ならびに／もしくは
以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ１もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ２もしくはアミノ酸変異を含むその変異体、および（２－１）に記載のＣＤＲ－Ｌ３もしくはアミノ酸変異を含むその変異体であって；
ここで、上記３つの重鎖ＣＤＲならびに／もしくは３つの軽鎖ＣＤＲの少なくとも１つは、（２－１）における対応するＣＤＲと比較してアミノ酸変異を含み、そして、上記アミノ酸変異は、１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加（例えば、１、２または３個のアミノ酸の置換、欠失または付加）であり；上記変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができ、好ましくは、置換は保存的置換である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（１）ＣＤＲがＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される、以下のＶＨならびに／もしくはＶＬ：
（１－１）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２もしくは２１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３；ならびに／もしくは
以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号４の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３；
もしくは
（１－２）：（１－１）に記載のＶＨもしくはＶＬと比較して、少なくとも１つのＣＤＲが、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ）である変異を含み、好ましくは、上記置換は保存的置換であり、上記変異を含む上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる；
または
（２）ＣＤＲがＡｂＭナンバリングシステムに従って定義される、以下のＶＨならびに／もしくはＶＬ：
（２－１）：以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号７の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８もしくは２２の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３；ならびに／もしくは
以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１０の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１２の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３；
もしくは
（２－２）：（２－１）に記載のＶＨもしくはＶＬと比較して、少なくとも１つのＣＤＲが、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ）である変異を含み、好ましくは、上記置換は保存的置換であり、上記変異を含む上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる、
を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨおよび／またはＶＬは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む；
（１）配列番号１３もしくは１４に記載のＶＨ、および／または配列番号１５に記載のＶＬ；
または
（２）（１）に記載のＶＨと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＶＨが、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有し、および／もしくは（１）に記載のＶＬと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＶＬが、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％の同一性を有し、（１）に記載のＶＬもしくはＶＨに対して同一性を有する上記抗体またはその抗原結合フラグメントが、依然としてＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる；
または
（３）（１）に記載のＶＨと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＶＨが、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ）を有し、および／もしくは（１）に記載のＶＬと比較して、上記抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＶＬが、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、またはそれらの任意の組み合わせ）を有し、好ましくは、上記置換は保存的置換である。変異を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてＣＬＤＮ１８．２、好ましくはヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる。
上記態様のいずれにおいても、抗体またはその抗原結合フラグメントは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）免疫グロブリンに由来する定常領域またはその変異体をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、以下を含み得る；
（１）ヒト免疫グロブリンのＣＨ（重鎖定常領域）もしくはその変異体であって、上記変異体が、それが由来する野生型配列と比較して、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、最大２０個、最大１５個、最大１０個、もしくは最大５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を含む、ヒト免疫グロブリンのＣＨもしくはその変異体；および／または
（２）ヒト免疫グロブリンのＣＬ（軽鎖定常領域）もしくはその変異体であって、上記変異体が、それが由来する野生型配列と比較して、１個以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、最大２０個、最大１５個、最大１０個、もしくは最大５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を含む、ヒト免疫グロブリンのＣＬもしくはその変異体。
いくつかの実施形態では、定常領域を変化、例えば変異させて、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の特性を改変する（例えば、以下の特性のうちの１以上を変化させる：Ｆｃ受容体の結合、抗体グリコシル化、システイン残基の量、エフェクター細胞または補体に対する機能）。抗体の定常領域中の少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換して、機能を変化させることができる。例えば、エフェクターリガンド（例えば、ＦｃＲまたは補体Ｃ１ｑ）に対する抗体親和性を変化させることによって、エフェクター機能を変化させる（例えば、強化する）ことができる。いくつかの実施形態では、定常領域を変化させて（例えば、強化して）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を改変する。
いくつかの実施形態では、ＣＨは、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１６に記載のＣＨ、または、配列番号１６と比較して最大２０個のアミノ酸の保存的置換（例えば、最大１５個、１０個もしくは５個のアミノ酸の保存的置換、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の保存的置換）を有するその変異体を含む。変異を含むＣＨは、配列番号１６と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、κまたはλ軽鎖定常領域から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＬは、κ軽鎖定常領域（例えば、ヒトκ軽鎖）である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７に記載のＣＬ、または、配列番号１７と比較して最大２０個のアミノ酸の保存的置換（例えば、最大１５個、１０個もしくは５個のアミノ酸の保存的置換、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の保存的置換）を有するその変異体を含む。変異を含むＣＬは、配列番号１７と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１６に記載のＣＨおよび／または配列番号１７に記載のＣＬを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載の配列のＶＨおよび配列番号１６に記載のＣＨを含む重鎖と、
配列番号１５に記載の配列のＶＬおよび配列番号１７に記載のＣＬを含む軽鎖と
を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１４に記載の配列のＶＨおよび配列番号１６に記載のＣＨを含む重鎖と、
配列番号１５に記載の配列のＶＬおよび配列番号１７に記載のＣＬを含む軽鎖と
を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む；
（１）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖：
（１－１）配列番号１８に記載の配列；
（１－２）配列番号１８に記載の配列と比較して、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列；または
（１－３）配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列；
および
（２）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖：
（２－１）配列番号２０に記載の配列；
（２－２）配列番号２０に記載の配列と比較して、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列；または
（２－３）配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列。
いくつかの実施形態では、上記の（１－２）および（２－２）に記載の置換は、保存的置換である。変異を含むＣＨは、配列番号１６と実質的に同じ機能を保持する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下を含む；
（１）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖：
（１－１）配列番号１９に記載の配列；
（１－２）配列番号１９に記載の配列と比較して、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列；または
（１－３）配列番号１９に記載の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列；
および
（２）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖：
（２－１）配列番号２０に記載の配列；
（２－２）配列番号２０に記載の配列と比較して、１個またはいくつかのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列；または
（２－３）配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列。
いくつかの実施形態では、（１－２）および（２－２）に記載の置換は、保存的置換である。好ましくは、変異もしくは同一性配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントは、依然としてヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、二重特異性抗体、および多重特異性抗体から選択される。
いくつかの実施形態では、（Ｄ－Ｌ）γ－Ａの構造は、式（ＩＩ）：
｛Ｄ－［Ｌ１－（Ｌ２）ｍ１－（Ｌ３）ｍ２－（Ｌ４）ｍ３－Ｅ］｝γ－Ａ
式（ＩＩ）
に示され、
式中、
Ｌ１は
Figure 0007407973000001
 であり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素（例えば、プロチウムもしくは重水素）、ハロゲン、カルボン酸基、スルホン酸基、シアノ、Ｃ１－６アルキル、ハロゲン化Ｃ１－６アルキル、シアノ置換Ｃ１－６アルキル（例えば、－ＣＨ２ＣＮ）、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ２－１０アルケニル、またはＣ２－１０アルキニルであり；Ｚ１は、アミノ酸、または２～１０個のアミノ酸から構成されるペプチドであり；ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５または６であり；Ｌ１は、１位でＤに接続され、２位でＬ２に接続され、
Ｌ２は
Figure 0007407973000002
 であり、ここで、ｙ１は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；Ｌ２は、１位でＬ１に接続され、２位でＬ３に接続され；
Ｌ３は５～１２員芳香族複素環から選択され；
Ｌ４は
Figure 0007407973000003
 であり、ここで、Ｚ２は、Ｃ１－６アルキレン、Ｃ２－１０アルケニレン、Ｃ２－１０アルキニレン、およびＣ３－８シクロアルキレンから選択され；Ｒ３は、水素（例えば、プロチウムまたは重水素）およびＣ１－６アルキルから選択され；Ｚ３は存在しないか、またはＣ１－６アルキレンから選択され；あるいは、Ｒ３およびＺ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって４～８員ヘテロシクリルを形成し；αは、０、１、２、３、４、５または６であり、そして、Ｌ４は、２位でＥに接続され、１位でＬ３に接続され；
Ｅは
Figure 0007407973000004
 であり、ここで、各Ｒ４は、独立して水素（例えば、プロチウムまたは重水素）であり、βは、０、１、２、３、４、５または６であり、そして、Ｅは、２位でＡに接続され、１位でＬ４に接続され；
ｍ１、ｍ２およびｍ３は、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
Ａ、Ｄおよびγは、先に定義した通りである。
いくつかの実施形態では、（Ｄ－Ｌ）γ－Ａの構造は、式（ＩＩＩ）：
｛Ｄ－［（Ｌ１’）ｍ４－Ｌ１－（Ｌ５）ｍ５－（Ｌ３）ｍ２－（Ｌ４）ｍ３－Ｅ］｝γ－Ａ 式（ＩＩＩ）
に示される通りであり、
式中、
Ｌ１’は
Figure 0007407973000005
 であり、ここで、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して水素（例えば、プロチウムもしくは重水素）またはＣ１－６アルキルであり；ｘ３は、１、２、３、４、５または６であり；Ｌ１’は、存在する場合、１位でＤと接続し、２位でＬ１と接続し；
Ｌ１は
Figure 0007407973000006
 であり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素（例えば、プロチウムもしくは重水素）、ハロゲン、カルボン酸基、スルホン酸基、シアノ、Ｃ１－６アルキル、ハロゲン化Ｃ１－６アルキル、シアノ置換Ｃ１－６アルキル（例えば、－ＣＨ２ＣＮ）、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ２－１０アルケニル、またはＣ２－１０アルキニルであり；Ｚ１は、アミノ酸、または２～１０個のアミノ酸から構成されるペプチドであり；ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５または６であり；Ｌ１は、１位でＬ１’に接続され（Ｌ１’が存在する場合）、または１位でＤに接続され（Ｌ１’が存在しない場合）；Ｌ１は、２位でＬ５に接続され；
Ｌ５は
Figure 0007407973000007
 であり、ここで、Ｒ７は水素もしくはＣ１－６アルキルであるか、またはＲ７はそのγ－Ｃ上の原子Ｎに接続されて５～６員ヘテロシクリルを形成し；ｘ４は、１、２、３、４、５または６であり；ｙ１は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；そして、Ｌ５は、１位でＬ１に接続され、２位でＬ３に接続され；
Ｌ３は、５～１２員芳香族複素環から選択され；
Ｌ４は
Figure 0007407973000008
 であり、ここで、Ｚ２は、Ｃ１－６アルキレン、Ｃ２－１０アルケニレン、Ｃ２－１０アルキニレン、およびＣ３－８シクロアルキレンから選択され；Ｒ３は、水素（例えば、プロチウムおよび重水素）ならびにＣ１－６アルキルから選択され；Ｚ３は存在しないか、またはＣ１－６アルキレンから選択され；あるいはＲ３およびＺ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって４～８員複素環ラジカルを形成し；αは、０、１、２、３、４、５または６であり；Ｌ４は、２位でＥに接続され、１位でＬ３に接続され；
Ｅは
Figure 0007407973000009
 であり、ここで、各Ｒ４は独立して水素（例えば、プロチウムまたは重水素）であり；βは、０、１、２、３、４、５または６であり；Ｅは、２位でＡに接続され、１位でＬ４に接続され；
ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
Ａ、Ｄおよびγは、先に定義した通りである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ１は
Figure 0007407973000010
 であり、ここで、Ｚ１は、アミノ酸、または２～５個のアミノ酸から構成されるペプチドであり、ここで、上記アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｖａｌ、Ｄ－Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｓｎから選択され；好ましくは、Ｚ１は、Ｃｉｔ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ－Ｖａｌ、およびＡｌａ－Ｖａｌから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は
Figure 0007407973000011
 である。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は
Figure 0007407973000012
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ２は
Figure 0007407973000013
 であり、そして、ｍ１は１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ３は５～６員芳香族複素環であり、ｍ２は１である。
いくつかの実施形態では、Ｌ３はトリアゾールであり、ｍ２は１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ４は
Figure 0007407973000014
 であり、ここで、Ｚ２はＣ１－６アルキレンであり、Ｚ３はＣ１－６アルキレンであり、そして、ｍ３は１である。
いくつかの実施形態では、Ｌ４は
Figure 0007407973000015
 であり、そして、ｍ３は１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ１’は、
Figure 0007407973000016
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ５は
Figure 0007407973000017
 であり、ここで、ｘ４は、１、２、３、４、５または６であり；ｙ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＬ５は、
Figure 0007407973000018
 である。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）によって表される抗体－薬物複合体におけるＤは、
Figure 0007407973000019
Figure 0007407973000020
 または
Figure 0007407973000021
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）によって表される抗体－薬物複合体におけるＤは、
Figure 0007407973000022
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおけるＤは、
Figure 0007407973000023
 または
Figure 0007407973000024
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）によって表されるＡＤＣにおける
Ｄ－［Ｌ１－（Ｌ２）ｍ１－（Ｌ３）ｍ２－（Ｌ４）ｍ３－Ｅ］－は、
Figure 0007407973000025
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣにおける
Ｄ－［（Ｌ１’）ｍ４－Ｌ１－（Ｌ５）ｍ５－（Ｌ３）ｍ２－（Ｌ４）ｍ３－Ｅ］－は、
Figure 0007407973000026
 または
Figure 0007407973000027
 である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）によって表されるＡＤＣの構造は、
Figure 0007407973000028
 であり、ここで、γは１～１０の整数から選択され、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）によって表されるＡＤＣは、以下の式：
Figure 0007407973000029
 に示され、ここで、γは１～１０の整数であり、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは２Ｃ６．９－ｈｚ２１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣの構造は、
Figure 0007407973000030
 であり、ここで、γは１～１０の整数から選択され、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣは、以下の式：
Figure 0007407973000031
 で示され、ここで、γは１～１０の整数であり、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは、２Ｃ６．９－ｈｚ２１である。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣの構造は、
Figure 0007407973000032
 であり、ここで、γは１～１０の整数であり、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する上述の抗体またはその抗原結合フラグメントである。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表されるＡＤＣは、以下の式：
Figure 0007407973000033
 によって表され、ここで、γは１～１０の整数であり、例えば、γは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、そして、Ａは、２Ｃ６．９－ｈｚ２１である。
本発明はまた、上記の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）のうちの１以上を含む組成物を提供し、該組成物において、生物活性分子のフラグメント（すなわち、式（Ｉ）におけるＤ）とＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（すなわち、式（Ｉ）におけるＡ）とのモル比（ＤＡＲ値）は、１から１０までの小数または整数（例えば、１から８までの小数または整数、例えば、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．７９、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、６．９５、７．０、７．０３、７．１、７．１２、７．２、７．３、７．４０、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０）である。
ＤＡＲ値は、薬物－抗体比（各抗体に結合した（Ｄ－Ｌ）の平均数を指す）としても公知であり、当該技術分野で公知の方法によって測定し計算することができる。例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＨＩＣなどによって測定した複合体抗体および（Ｄ－Ｌ）の分子量により、異なる数の（Ｄ－Ｌ）とコンジュゲートした軽鎖および重鎖の割合を算出し、そして、式ＤＡＲ（軽鎖ＤＡＲ１＊１＋．．．＋軽鎖ＤＡＲｎ１＊ｎ１）＊２＋（重鎖ＤＡＲ１＊１＋．．．＋ＤＡＲｎ２＊ｎ２）＊２からＤＡＲ値を算出した。式中、ＤＡＲｎ１は、軽鎖に占めるｎ１個の（Ｄ－Ｌ）とコンジュゲートした軽鎖の割合を意味し、ＤＡＲｎ２は、重鎖に占めるｎ２個の（Ｄ－Ｌ）とコンジュゲートした重鎖の割合を意味する。
いくつかの実施形態では、組成物は、上述の抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００１を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００１である。
いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００２を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００２である。
いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００３を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２Ｃ６．９－ＴＬ００３である。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、誘導体化することができ、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般に、抗体またはその抗原結合フラグメントの誘導体化（例えば、標識）は、ＣＬＤＮ１８．２（特にヒトＣＬＤＮ１８．２）へのその結合に悪影響を及ぼさない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、そのような誘導体化形態を含むことが意図される。
ある種の誘導体化抗体（例えば、二重特異性抗体）は、（同じ種類または異なる種類の）２つ以上の抗体を架橋することによって産生される。二重特異性抗体を得るための方法は当該技術分野で周知であり、その例としては、化学的架橋、細胞工学（ハイブリッドハイブリドーマ）または遺伝子工学を含み、これらに限定されない。
別の種類の誘導体化抗体は、標識抗体である。例えば、本発明の本明細書における抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識にライゲーションされる。本発明の検出可能な標識は、蛍光、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。そのような標識は当該技術分野で周知であり、その例としては、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドットまたはシアニン色素誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ７５０）、アクリジニウムエステル、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、熱量測定標識、例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ、および上述の標識修飾したアビジン（例えば、ストレプトアビジン）に結合するためのビオチンを含み、これらに限定されない。そのようなマーカーの使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を含み、これらに限定されない。上記のような検出可能な標識は、当該技術分野で公知の方法によって検出することができる。例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができ、そして、蛍光標識は、発光を検出するための光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は、典型的には、その酵素の基質を用意し、その基質に酵素が作用することにより生じる反応生成物を検出することにより検出され、そして、熱標識は、染色された標識を単純に可視化することにより検出される。特定の実施形態では、そのようなマーカーは、免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイなど）での使用に適合させることができる。いくつかの実施形態では、潜在的な立体障害を低減するために、上記の検出可能な標識を、様々な長さのリンカーによって本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに連結することができる。
特定の実施形態では、本発明の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）に含まれる抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述の誘導体化抗体またはその抗原結合フラグメントのうちの１以上である。
治療方法および医薬組成物
別の態様では、本発明はまた、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、上述の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）または組成物のうちの１以上を含む。
いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。
いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、抗腫瘍活性を有する他の成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣまたは組成物と、抗腫瘍活性を有する他の成分とは、同じ製剤単位または異なる製剤単位に含まれる。したがって、本発明のＡＤＣまたは組成物と抗腫瘍活性を有する他の成分とは、同時に、別々に、または連続的に投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗腫瘍活性を有する他の成分は、生物活性ポリペプチドもしくはその活性フラグメント、または化学療法薬である。いくつかの実施形態では、生物活性ポリペプチドは、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＬＡＧ－３抗体など）またはサイトカイン（インターフェロン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１など）から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルから選択される１以上である。いくつかの実施形態では、抗腫瘍活性を有する他の成分は、エピルビシン、オキサリプラチン、および５－フルオロウラシルの組み合わせ、または、オキサリプラチン、ロイコボリン、および５－フルオロウラシルの組み合わせである。
別の態様では、本発明の医薬組成物中のＡＤＣまたは組成物は、被験体に投与された場合、以下のことを行うのに十分である：
（ａ）腫瘍細胞（特に胃がん細胞、例えば胃腺がん細胞）のアポトーシスを誘発する；
（ｂ）腫瘍細胞（特に胃がん細胞、例えば胃腺がん細胞）の増殖を阻害する；
（ｃ）補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘発および／もしくは増加させる；
（ｄ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発および／もしくは増加させる；
（ｅ）ＣＬＤＮ１８．２の発現および活性化を阻害する；
（ｆ）ＣＬＤＮ１８．２媒介細胞シグナル伝達経路を阻害する；または
（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の組み合わせ。
別の態様では、本発明は、腫瘍の予防および／または治療および／または補助治療のための医薬の調製における、抗体－薬物複合体、組成物、または医薬組成物の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および、がんの転移性、難治性または再発性病変から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、胃腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、すなわちＮＳＣＬＣ）、肝臓がん、胃がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肉腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、および肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はＣＬＤＮ１８．２陽性であり、さらに、腫瘍はＨＥＲ２陰性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はＨＥＲ２陰性である。
別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍を予防および／または治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍進行を遅延させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、被験体において腫瘍再発を低減または阻害する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明の抗体－薬物複合体、組成物、または医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法はまた、第２の療法を被験体に適用する工程を含み、ここで、第２の療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ＲＮＡ療法、ナノ療法、ウイルス療法、補助療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第２の療法は、上記の方法とは別々に、または組み合わせて適用することができ；あるいは、第２の療法は、上記の方法とは別々に、組み合わせて、同時に、または連続的に適用することができる。
いくつかの実施形態では、第２の療法は化学療法である。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、５－フルオロウラシル、フォリン酸、パクリタキセル、およびアルブミン結合パクリタキセルのうちの１以上から選択される。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、エピルビシン、オキサリプラチン、および５－フルオロウラシルの組み合わせ、または、オキサリプラチン、ロイコボリン、および５－フルオロウラシルの組み合わせである。いくつかの実施形態では、オキサリプラチン、ロイコボリン、および５－フルオロウラシルの組み合わせ投与レジメンは、ＦＯＬＦＯＸ４、ＦＯＬＦＯＸ６、またはｍＦＯＬＦＯＸ６から選択される。
いくつかの実施形態では、第２の療法は免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法のための薬物は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、およびＬＡＧ－３抗体）またはサイトカイン（例えば、ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｖｅｇｅｔａｒｉａｎ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＩＬ－２１）から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および、がんの転移性、難治性、または再発性病変から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんは、食道がん、胃腸がん、胃腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、肝臓がん、胃がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肉腫、神経膠芽腫、および白血病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、食道がん、胃腸がん、膵臓がん、および肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）から選択される。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、例えば、胃がん、胃腺がん、または胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がんの局所進行切除不能腫瘍または転移性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はＣＬＤＮ１８．２陽性であり、さらに、腫瘍はＨＥＲ２陰性である。
いくつかの実施形態では、腫瘍はＨＥＲ２陰性である。
本発明のＡＤＣ、組成物、または医薬組成物は、医療分野で公知の任意の医薬製剤、例えば、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤、注射剤（注射剤、注射用滅菌粉末、および注射用濃縮溶液を含む）、吸入剤、スプレー剤などに製剤化することができる。好ましい剤形は、意図される投与様式および治療用途によって決まる。本発明の医薬組成物は、製造および保存条件下で無菌かつ安定でなければならない。好ましい医薬製剤は注射剤である。注射剤は滅菌注射液であり得る。例えば、以下の方法を使用して滅菌注射液を調製することができる：必要な投与量のＡＤＣまたは組成物を、場合により他の所望の成分（ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない）と共に適切な担体に分散させ、続いて濾過滅菌する。さらに、保存および使用を容易にするために、滅菌注射液を使用して（例えば、真空乾燥または凍結乾燥によって）、滅菌凍結乾燥粉末を調製することができる。滅菌凍結乾燥粉末は、使用前に滅菌パイロジェンフリー水などの適切な担体に分散させることができる。
さらに、本発明のＡＤＣは、投与を容易にするために、単位用量の形態で医薬組成物中に存在してもよい。
本発明のＡＤＣ、組成物、または医薬組成物は、経口、口腔内、舌下、眼内、局所的、非経口、直腸、髄腔内、脳槽内、鼠径部、膀胱内、局所（例えば、粉末、軟膏、もしくは滴剤）または経鼻経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の適切な方法によって投与され得る。しかしながら、多くの治療用途について、好ましい投与経路／投与様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。当業者であれば、意図される目的に応じて投与経路および／または投与様式が異なることを理解するであろう。好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、医薬組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。
本発明の医薬組成物は、「治療有効用量」または「予防有効用量」の本発明のＡＤＣまたは組成物を含み得る。「予防有効用量」とは、疾患の発症を予防、阻害、または遅延させるのに十分な量を意味する。「治療有効量」は、すでに疾患に罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒させるか、または少なくとも部分的に阻害するのに十分な量を意味する。本発明のＡＤＣまたは組成物の治療有効用量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な条件、例えば年齢、体重および性別、および薬物の投与、ならびに同時投与のための他の治療などの要素に応じて異なり得る。
本発明において、投与レジメンは、最適な意図した応答（例えば、治療応答または予防応答）が得られるように調整することができる。例えば、それは単回投与で投与されてもよく、ある期間にわたって複数回投与されてもよく、または治療の緊急性に応じて比例的に減少もしくは増加させた投与量で投与されてもよい。
本発明のＡＤＣまたは組成物の典型的な非限定的な治療有効用量または予防有効用量の範囲は、０．０２～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、または１～５０ｍｇ／ｋｇである。投与量は、治療される症状の種類および重症度に応じて異なり得ることに留意されたい。さらに、当業者であれば、任意の特定の患者について、特定の投与レジメンが、患者のニーズおよび医師による専門的評価に従って経時的に調整されるべきであることを理解するであろう。本明細書に示される投与量範囲は、例示のみを目的としており、本発明の医薬組成物の使用または範囲を限定するものではない。
本発明において、被験体は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。
略語
Figure 0007407973000034
本発明において、別段の記載がない限り、本明細書で用いる科学技術用語は、当業者が通常理解している意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学の実験手順は、すべて対応する分野で広く使用されている通常の工程である。同時に、本発明のよりよい理解のために、関連する用語の定義および説明を以下に提供する。
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣ（抗体－薬物複合体）」または「複合体」という用語は交換可能であり、生物活性分子を、リンカーを介して抗体にコンジュゲートすることによって得られる物質を指す。
リンカーは、様々な化学結合を介して抗体に接続することができる。例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、抗体のスルフヒドリル基とチオエーテル結合を形成することによって接続される。いくつかの特定のＡＤＣ分子（例えば、２Ｃ６．９－ＴＬ００１、２Ｃ６．９－ＴＬ００２、または２Ｃ６．９－ＴＬ００３のＡＤＣ分子）の構造式において、－Ｓ－は、リンカーと抗体のスルフヒドリル基とによって形成されるチオエーテル結合を表すにすぎず、－Ｓ－がリンカーの一部であることを意味しない。
本出願におけるＡＤＣの構造式は、（Ｄ－Ｌ）γ－Ａで表すことができ、ここで、Ｄは生物活性分子フラグメントであり；Ｌはリンカーであり；Ａは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；各抗体分子に結合する（Ｄ－Ｌ）の数を指すγは、１～１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される。しかしながら、ＡＤＣ調製の過程において、各抗体分子は、異なる数の（Ｄ－Ｌ）と接続され得る。したがって、ＡＤＣ生成物は、一般に、異なる数の（Ｄ－Ｌ）と結合した抗体の組成物である。実務では、抗体に連結された（Ｄ－Ｌ）の数の平均値を表すために、ＤＡＲがしばしば使用される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、通常は２対のポリペプチド鎖（各対は、軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）とを有する）から構成される免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはε重鎖に分類することができ、したがって、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域とは約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続されており、重鎖はまた、約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。定常ドメインは、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示し、例えば、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する。ＶＨ領域およびＶＬ領域はまた、より保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が間に入った超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。各領域またはドメインにおけるアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９８７および１９９１））もしくはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３、またはＡｂＭ、Ｍａｒｔｉｎの関連研究（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ、Ｃｈｅｅｔｈａｍ ＪＣ、Ｒｅｅｓ ＡＲ（１９８９）Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２）の定義に従い得る。
これに関連して、文脈によってそうでないことが明確に示されない限り、「抗体」という用語に言及する場合、それはインタクトな抗体だけでなく、抗体の抗原結合フラグメントも含む。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変領域内の抗原結合に関与するアミノ酸残基を指す。これらのアミノ酸残基の正確な境界は、当該技術分野で公知の様々なナンバリングシステムに従って、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州、１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３）、ＩＭＧＴナンバリングシステム（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７、２００３）またはＭａｒｔｉｎの関連研究（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣＲ、Ｃｈｅｅｔｈａｍ ＪＣ、Ｒｅｅｓ ＡＲ（１９８９）Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｌｏｏｐｓ：Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２）の定義に従って定義することができ、Ｍａｒｔｉｎの定義方法は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義の一部を統合し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｒｔｉｎ ＡＣ Ｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ［Ｍ］／／Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２０１０：３３－５１）において最初に適用された。所与の抗体について、当業者であれば、各ナンバリングシステムによって定義されるＣＤＲを容易に同定するであろう。さらに、異なるナンバリングシステム間の対応は、当業者に周知である（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７、２００３を参照されたい）。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＣＤＲは、当該技術分野で公知の様々なナンバリングシステムに従って決定することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるＣＤＲは、好ましくは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、またはＡｂＭナンバリングシステムによって決定される。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、抗体の可変領域内の、先に定義したＣＤＲ残基以外のアミノ酸残基を指す。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体フラグメントのポリペプチド、例えば全長抗体のフラグメントのポリペプチドであって、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を保持し、および／または、抗原への特異的結合について全長抗体と競合する能力を保持し、「抗原結合部」とも呼ばれるポリペプチドを指す。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）（これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。組換えＤＮＡ技術、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断を使用して、抗体の抗原結合フラグメントを産生することができる。抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、線状抗体、ナノボディ（その技術はＤｏｍａｎｔｉｓより）、ドメイン抗体（その技術はＡｂｌｙｎｘより）、ならびにポリペプチドであって、特異的抗原結合能を該ポリペプチドに付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むものを含む。改変された抗体変異体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、２００５；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３：１１２６－１１３６に概説されている。
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、２つの「全長重鎖」または「重鎖」と２つの「全長軽鎖」または「軽鎖」とから構成される抗体を指し、ここで、「全長重鎖」または「重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン、および重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなるポリペプチド鎖を指し；そして、全長抗体がＩｇＥアイソタイプのものである場合、それは、重鎖定常領域ＣＨ４ドメインも含んでいてもよい。好ましくは、「全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成されるポリペプチド鎖である。「全長軽鎖」または「軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖である。２対の全長抗体鎖は、ＣＬとＣＨ１との間のジスルフィド結合と、２つの全長重鎖のＨＲ間のジスルフィド結合とによって接続されている。本発明の全長抗体は、単一の種、例えばヒト由来であり得；全長抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。本発明の全長抗体は、ＶＨとＶＬとの対によってそれぞれ形成される２つの抗原結合部位を含み、この２つの抗原結合部位は、同じ抗原を特異的に認識し、それに結合する。
本明細書で使用される場合、「Ｆｄフラグメント」という用語は、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとから構成される抗体フラグメントを指し；「ｄＡｂフラグメント」という用語は、ＶＨドメインから構成される抗体フラグメントを指し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４ ５４６（１９８９））；「Ｆａｂフラグメント」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから構成される抗体フラグメントを指し；「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂフラグメントを含む抗体フラグメントを指し；「Ｆａｂ’フラグメント」という用語は、インタクトな軽鎖と重鎖Ｆｄフラグメント（ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなる）とからなるＦ（ａｂ’）２フラグメント中の２つの重鎖フラグメントを接続するジスルフィド結合を還元することによって得られるフラグメントを指す。
本明細書で使用される場合、「Ｆｖフラグメント」という用語は、抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインとから構成される抗体フラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、一般に、完全な抗原結合部位を形成することができる最小の抗体フラグメントであると考えられている。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合特異性を付与することができると一般に考えられている。しかし、可変領域（例えば、３つの抗原特異的ＣＤＲのみを含むＦｄフラグメント）であっても抗原を認識してそれに結合することができるが、その親和性は完全な結合部位の親和性よりも低くなり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃフラグメント」という用語は、ジスルフィド結合を介して結合した抗体の第１重鎖の第２および第３定常領域と第２重鎖の第２および第３定常領域とで形成された抗体フラグメントを指す。抗体のＦｃフラグメントは多くの異なる機能を有するが、抗原結合には関与しない。
本明細書で使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含む単一のポリペプチド鎖を指し、ＶＬとＶＨとはリンカーを介して接続されている（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３（１９８８）；ならびにＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。先行技術の適切なリンカーは、反復するＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを用いることができるが、その変異体を用いることもできる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８）。本発明で使用され得る他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉら（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４－１０６、Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６、およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記載されている。場合によっては、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にもジスルフィド結合が存在し得る。本明細書で使用される場合、「ジｓｃＦｖ」という用語は、２つのｓｃＦｖを連結することによって形成される抗体フラグメントを指す。
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、そのＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、使用されるリンカーが短すぎて同じ鎖の２つのドメイン間の対形成が可能にならず、その結果、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位を作り出すことを指す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ ＲＪら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照されたい）。
上述の抗体フラグメントのそれぞれは、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を維持し、および／または、抗原への特異的結合について全長抗体と競合する。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、カップリングアームを介して第１の抗体（フラグメント）と第２の抗体（フラグメント）または抗体模倣物とによって形成される複合体を指す。カップリングの様式としては、化学反応、遺伝子融合、タンパク質融合、ポリペプチド融合および酵素反応を含み、これらに限定されない。「多重特異性抗体」は、例えば、三重特異性抗体および四重特異性抗体を含み、ここで、前者は、３つの異なる抗原結合特異性を有する抗体であり、そして、後者は、４つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。
本明細書で使用される場合、「抗体模倣物」は、抗体のように抗原に特異的に結合するが、抗体の構造を有しない物質を指す。それらは、通常、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質、例えばアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）およびフィノマーである。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、中国特許出願公開第１０４３４１５２９号におけるように、ＩｇＧ抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせに連結される。抗ＩＬ－１７ａフィノマーは、国際公開第２０１５１４１８６２号におけるように、抗ＩＬ－６Ｒ抗体に結合する。
これに関連して、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、上記の抗体フラグメント）は、当業者に公知の従来技術（例えば、組換えＤＮＡ技術、または酵素的もしくは化学的フラグメント化法）を使用して所与の抗体（例えば、本発明によって提供される抗体）から得ることができ、インタクトな抗体をスクリーニングするのと同じ様式で特異性についてスクリーニングすることができる。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用され、高度に相同な抗体分子の群、すなわち、自発的に起こり得る自然変異を除いて同一の抗体分子の群に由来する抗体または抗体のフラグメントを指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一エピトープに対して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して言及され、通常、少なくとも２つ以上の異なる抗体を含み、これらの異なる抗体は、通常、抗原上の異なるエピトープを認識する。加えて、修飾語「モノクローナル」は、非常に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すにすぎず、いずれかの特定の方法によって抗体が産生されることを必要とすると解釈されるべきではない。
本発明のモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５を参照されたい）、組換えＤＮＡ技術（例えば、米国特許出願第４，８１６，５６７号を参照されたい）またはファージ抗体ライブラリー技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４－６２８、１９９１、もしくはＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７、１９９１を参照されたい）によって調製することができる。
例えば、モノクローナル抗体は、以下のようにして調製することができる。マウスまたは他の適切な宿主動物を、最初に免疫原で（必要に応じてアジュバントを添加して）免疫する。免疫原またはアジュバントの注射方法は、通常、多点皮下注射または腹腔内注射である。免疫原は、宿主における抗原の免疫原性を高めるために、特定の公知のタンパク質、例えば、血清アルブミンまたは大豆トリプシン阻害剤に予め結合させることができる。アジュバントは、フロイントアジュバントまたはＭＰＬ－ＴＤＭなどであり得る。動物が免疫された後、身体は、免疫原に特異的に結合する抗体を分泌するリンパ球を産生する。また、リンパ球はインビトロ免疫により得ることもできる。目的のリンパ球を回収し、適切な融合剤、例えばＰＥＧを使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐｐ．５９－１０３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）。上記で調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖を阻害することができる１以上の物質を好ましくは含む適切な培養培地に接種され得る。例えば、ヒポキサンチングアニンホスホトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く親骨髄腫細胞の場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミン（ＨＡＴ培地）を培養培地に添加すると、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖が阻害される。好ましい骨髄腫細胞は、高い融合速度、安定した抗体分泌能、およびＨＡＴ培養培地に対する感受性を有するべきである。これらの中でも、マウス骨髄腫、例えばＭＯＰ－２１またはＭＣ－１１マウス腫瘍由来株（ＴＨＥ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）およびＳＰ－２／０またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州、米国）が、骨髄腫細胞に好ましい。さらに、研究により、ヒトモノクローナル抗体を調製するためのヒト骨髄腫およびヒト－マウス異種骨髄腫細胞株の使用も報告された（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ５１－６３、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）。ハイブリドーマ細胞を増殖させるための培養培地を使用して、特異的抗原に対するモノクローナル抗体の産生を検出する。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を測定するための方法としては、例えば、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む。例えば、モノクローナル抗体の親和性は、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄアッセイを使用して測定することができる。ハイブリドーマによって産生された抗体の特異性、親和性、および反応性を測定した後、目的の細胞株を、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ｐｐ．５９－１０３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６に記載された標準的な限界希釈法によってサブクローニングすることができる。適切な培養培地は、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０などであり得る。さらに、ハイブリドーマ細胞は、腹水腫瘍の形態で動物において増殖させることもできる。伝統的な免疫グロブリン精製方法、例えば、プロテインＡアガロースゲル、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーを利用して、サブクローン化細胞によって分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養培地、腹水、または血清から単離することができる。
モノクローナル抗体は、遺伝子工学の組換え技術によっても得ることができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖遺伝子に特異的に結合する核酸プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、ハイブリドーマ細胞から単離することができる。得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入した後、宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、または免疫グロブリンを産生しない他の骨髄腫細胞）にトランスフェクトし、適切な条件で培養することにより、所望の組換え抗体が得られる。
抗体は、周知の技術、例えばプロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。続いてまたは代わりに、特異的抗原（抗体によって認識される標的分子）またはその抗原性エピトープをカラムに固定化し、免疫特異的抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．、フィラデルフィア、ペンシルベニア州より出版、第１４巻、Ｎｏ．８（２０００年４月１７日）、ｐｐ．２５－２８）に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「マウス抗体」という用語は、免疫したマウスのＢ細胞を骨髄腫細胞と融合させ、無限に増殖して抗体を分泌することができるマウスハイブリッド融合細胞を選択し、続いて、スクリーニング、抗体調製および抗体精製を行うことによって調製される抗体、または、抗原がマウスの体内に侵入した後に、Ｂ細胞の分化および増殖によって形成される形質細胞によって分泌される抗体を指す。特定の抗原の刺激下で産生された抗体の場合、抗体の産生は、抗原が人体に侵入することによって引き起こされる様々な免疫細胞の相互作用によるものであり、これはＢ細胞の形質細胞への分化および増殖をもたらし、これにより抗体が産生され分泌され得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、その軽鎖または／および重鎖の一部が１つの抗体（特定の種に由来し得るか、またはある種の特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）に由来し、軽鎖または／および重鎖の別の一部が別の抗体（同じもしくは異なる種に由来し得るか、または同じもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属し得る）に由来するが、それにもかかわらず依然として目的の抗原に対する結合活性を保持している抗体を指す（Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１ ６８５５（１９８４））。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ抗体）を含むことができ、ここで、この抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、第１の抗体（例えば、マウス抗体）に由来し、一方で、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、第２の抗体（例えば、ヒト抗体）に由来する。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の配列との相同性を増加させるようにアミノ酸配列が改変されている遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部または一部は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲおよび／または定常領域）の全部または一部は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は、典型的には、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増加させる能力、免疫応答を増強する能力などを含むがこれらに限定されない、ドナー抗体の所望の特性を保持する。ドナー抗体は、望ましい特性（例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増加させるおよび／または免疫応答を増強する能力）を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）由来の抗体であり得る。
ヒト化抗体は、非ヒトドナー抗体（例えば、マウス抗体）の予想される特性を保持することが可能なだけでなく、ヒト被験体において非ヒトドナー抗体（例えば、マウス抗体）の免疫原性を効果的に低下させることができ、したがって特に有利である。しかしながら、ドナー抗体のＣＤＲと受容体抗体のＦＲとの間の適合問題のために、ヒト化抗体の予想される特性（例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を改善する能力、および／または免疫応答を増強する能力）は、一般に、非ヒトドナー抗体（例えば、マウス抗体）の特性よりも低い。
したがって、当該分野における研究者らは、抗体のヒト化に関して徹底的な研究を行い、ある程度の進歩を遂げてきたが（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２ ５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３ ３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３ ５９６（１９９２）；およびＣｌａｒｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３９７ ４０２（２０００）を参照されたい）、先行技術は、産生されたヒト化抗体が、最も高いヒト化度を有するだけでなく、ドナー抗体の予想される特性を可能な限り保持するようにドナー抗体を完全にヒト化する方法について詳細な助言を提供していない。技術者らは、特定のドナー抗体の探索、調査および改変を行い、高いヒト化度（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％のヒト化度）を有するだけでなく、特定のドナー抗体の予想される特性も保持するヒト化抗体を得るために、多くの創造的な研究を行う必要がある。
本発明において、ヒト化抗体がドナー抗体の特性（例えば、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を改善する能力および／または免疫応答を増強する能力を含む）を可能な限り保持することができるように、本発明のヒト化抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト受容体抗体のアミノ酸残基と、対応する非ヒトドナー抗体のアミノ酸残基の両方を含み得る。
本発明のヒト化抗体は、上記で調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを、標的マウスハイブリドーマから得て、標準的な分子生物学の技術を使用して非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。
キメラ抗体を調製するために、マウス免疫グロブリンの可変領域を、当該技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を使用してヒト免疫グロブリンの定常領域に連結することができる。例えば、ＶＨをコードするＤＮＡは、全長重鎖遺伝子を得るために、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，ＥＡら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であり得るが、一般に、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。例えば、ＶＬをコードするＤＮＡは、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）を得るために、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，ＥＡら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得るが、一般に、好ましくはκ定常領域である。
ヒト化抗体を調製するために、マウスＣＤＲ領域を、当該技術分野で公知の任意の方法（Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号；Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号；ならびにＬｏ，Ｂｅｎｎｙ，ＫＣ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２４８巻、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州、２００４を参照されたい）を使用してヒトフレームワーク配列に移植することができる。あるいは、免疫後に内因性免疫グロブリンを産生することなく完全なヒト抗体ライブラリーを産生することができるトランスジェニック動物を使用することもできる。例えば、キメラ変異マウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらし、そのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすことが報告されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７：３３；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ３５５：２５８を参照されたい）。上記のトランスジェニック動物の非限定的な例としては、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座と、内因性のμおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異とを有するＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６－８５９を参照されたい）；または、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有する「ＫＭマウス（商標）」（特許出願国際公開第０２／４３４７８号を参照されたい）を含む。抗体をヒト化する他の方法としては、ファージディスプレイ技術（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１、２２２：５８１－５９７；Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４：３０９）を含む。
本明細書で使用される場合、「ヒト化度」という用語は、ヒト化抗体中の非ヒトアミノ酸残基の数を評価するために使用される指標を指す。ヒト化抗体のヒト化度は、例えば、ＩＭＧＴウェブサイトのＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎにより、ヒトＶドメインに対する可変領域配列の相同性を予測することによって評価することができる。
本明細書で使用される場合、「相同抗体」という用語は、抗体の変異体を指し、該変異体に含まれる重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列と相同であり、そして、該変異体は、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の所望の機能的特性を保持する。
比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。様々な手順およびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ ＴＦおよびＷａｔｅｒｍａｎ ＭＳ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２、１９８１；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧおよびＳｈａｒｐ ＰＭ、ＣＡＢＩＯＳ５：１５１、１９８９に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、６：１１９、１９９４は、配列アラインメントおよび相同性計算のための詳細な構想を提供している。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、２つの分子間の非無作為結合反応、例えば、抗体と該抗体が向けられる抗原との間の反応を指す。特異的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）または最大半値有効濃度（ＥＣ５０）で表すことができる。
２つの分子間の特異的結合特性は、当該技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。１つの方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを含む。「結合速度定数」（ｋａまたはｋｏｎ）および「解離速度定数」（ｋｄｉｓまたはｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに実際の会合および解離速度から計算することができる（Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ Ｍ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３、３６１：１８６－１８７を参照されたい）。ｋｄｉｓ／ｋｏｎの比は、解離定数ＫＤに等しい（Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９０；５９：４３９－４７３を参照されたい）。ＫＤ、ｋｏｎおよびｋｄｉｓ値は、任意の有効な方法で測定することができる。特定の実施形態では、解離定数は、生物発光干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ法）を使用して測定することができる。また、解離定数は、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）またはＫｉｎｅｘａにより測定することができる。
本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列が、特定の部位に塩基またはアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子がそれぞれ特定の部位にアデニンを有するか、または２つのポリペプチドがそれぞれ特定の部位にリジンを有する）場合、これらの２つの分子は、その部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較のための部位の総数に対する、２つの配列によって共有される同一の部位の数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうち６個が一致する場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６個の部位のうち３個が一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性をもたらすように行われる。このようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３、１９７０）に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１－１７（１９８８））を使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの予想される特性に悪影響を及ぼさないか、または予想される特性を変化させないアミノ酸置換を意味し、保存的置換によって得られた抗体変異体は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するような、その元の配列の生物学的活性を保持する。例えば、保存的置換は、当該技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発によって導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基と物理的または機能的に類似する（例えば、共有結合または水素結合を形成する能力などを含めて、同様のサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する）残基で置換される置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下を有するアミノ酸を含む：塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。したがって、対応するアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる））。
本明細書に含まれる２０個の従来のアミノ酸は、通常の様式で発現される。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、サンダーランド、マサチューセッツ州（１９９１））を参照されたい。本開示において、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用される。本開示においても、アミノ酸は、一般に、当該技術分野で知られているように一文字および三文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａで表され得る。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、被験体および活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、これは当該技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版、ペンシルベニア：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照されたい）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧を維持する薬剤、吸収を遅延させる薬剤、防腐剤を含み、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としては、リン酸緩衝液を含み、これらに限定されない。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、またはＴｗｅｅｎ－８０などの非イオン性界面活性剤を含み、これらに限定されない。イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムを含み、これに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。浸透圧を維持する薬剤としては、糖類、ＮａＣｌなどを含み、これらに限定されない。吸収を遅延させる薬剤としては、モノステアレートおよびゼラチンを含み、これらに限定されない。希釈剤としては、水、水性緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセリン）などを含み、これらに限定されない。防腐剤としては、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばチメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含み、これらに限定されない。安定剤は、当業者によって一般に理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性を安定化することができ、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストランもしくはグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥ホエイ、アルブミンもしくはカゼイン）、またはそれらの分解産物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）を含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、被験体において疾患または障害または症状（例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患）の発生を予防または遅延させるために行われる方法を指す。本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を得るために行われる方法を指す。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能であれ検出不能であれ、症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化（すなわち、それ以上悪化させないこと）、疾患の発症の遅延または引き延ばし、疾患の状態の改善または緩和、および（部分的または完全な）症状の緩和を含み、これらに限定されない。さらに、「治療」という用語は、（治療を受けていない場合の）予測生存期間と比較して生存期間を延長することも指し得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類哺乳動物、例えばヒトを指す。特定の実施形態では、被験体（例えば、ヒト）は、腫瘍、感染症もしくは自己免疫疾患に罹患しているか、または上述の疾患に罹患するリスクがある。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を得るか、または少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患）を予防するための有効量は、疾患（例えば、腫瘍、感染症、または自己免疫疾患）の発生を予防し、防止し、または遅延させるのに十分な量を指し、疾患を治療するための有効量は、疾患にすでに罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒させるか、または少なくとも部分的に予防するのに十分な量を指す。そのような有効量を決定することは、完全に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療用途のための有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な条件、例えば年齢、体重および性別、薬物の投与様式、ならびに同時に投与される他の治療法などに依存する。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、造血起源を有し、免疫応答において役割を果たす細胞、例えばリンパ球、例えばＢ細胞およびＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球を含む。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、免疫細胞（例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、または顆粒球）、および免疫細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の影響を指し、これは、自己免疫または病理学的炎症に関連して、侵襲性病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん細胞、もしくは正常なヒト細胞もしくは組織の選択的損傷もしくは破壊、またはそれらの身体からの除去をもたらす。本発明において、「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、Ｔ細胞がＴ細胞特異的抗原により刺激された場合に起こる、Ｔ細胞によって生じる免疫応答を指す。抗原特異的刺激時にＴ細胞によって生じる応答の非限定的な例としては、Ｔ細胞の増殖、およびＩＬ－２などのサイトカインの産生を含む。
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」という用語は、抗体のアイソタイプとともに変化する抗体のＦｃ領域（天然配列またはアミノ酸配列変異体のＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｆｃ受容体結合親和性、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、Ｂ細胞活性化、サイトカイン分泌、抗体および抗原－抗体複合体の半減期／クリアランスなどを含み、これらに限定されない。抗体のエフェクター機能を変化させるための方法は、当該技術分野で公知であり、例えばＦｃ領域に突然変異を導入することによる。
「がん」および「腫瘍」という用語は互換的に使用され、体内の異常細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患の大きな群を指す。調節されない細胞分裂は、隣接組織に浸潤する悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得、リンパ系または血流を介して身体の遠位部分に転移し得る。がんには、良性および悪性のがん、ならびに休眠腫瘍または微小転移が含まれる。がんには、血液がん、特に血液悪性腫瘍も含まれる。
「血液悪性腫瘍」または「血液腫瘍」という用語は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性腫瘍、ならびに、脾臓がんおよびリンパ節腫瘍を含む。例示的なリンパ腫としては、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫を含む。Ｂ細胞リンパ腫としては、例えば、ホジキンリンパ腫を含む。Ｔ細胞リンパ腫としては、例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液悪性腫瘍としては、白血病、例えば二次性白血病または急性リンパ性白血病をも含む。血液悪性腫瘍としては、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、ならびに他の血液および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連がんも含む。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、分子自体、分子フラグメント、または組成物が動物またはヒトに適切に投与された場合、有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさないことを意味する。薬学的に許容される担体またはその成分として使用され得るいくつかの物質の具体例としては、ラクトース、デンプン、セルロースおよびそれらの誘導体などの糖類、植物油、ゼラチン、プロピレングリコールなどのポリオール、アルギン酸などを含む。
これに関連して、併用療法は、本発明によって包含されるＡＤＣまたは組成物または医薬組成物と、第２の療法の１つもしくは複数の治療剤（例えば、化学療法剤）または他の予防もしくは治療様式（例えば、放射線療法）との組み合わせの使用を含む。
第２の療法のための例示的な治療剤としては、化学療法剤（例えば、有糸分裂阻害剤）、アルキル化剤（例えば、窒素マスタード）、代謝拮抗物質（例えば、葉酸類似体）、天然産物（例えば、ビンカアルカロイド）、様々な薬剤（例えば、白金配位錯体）、ホルモンおよびアンタゴニスト（例えば、副腎コルチコステロイド）、免疫調節剤（例えば、ブロピリミン、Ｕｐｊｏｈｎ）などを含む。他の抗がん治療としては、がん細胞を特異的に標的化する他の抗体を含む。
この種の併用療法では、様々な治療剤が異なる相補的な作用機序を有することが多く、そして、併用療法は相乗効果をもたらし得る。併用療法には、免疫応答に影響を及ぼす（例えば、応答を増強または活性化する）治療剤、および腫瘍／がん細胞に影響を及ぼす（例えば、阻害または殺傷する）治療剤が含まれる。併用療法は、薬剤耐性がん細胞の発生可能性を低減することができる。併用療法は、薬剤のうち１つ以上に関連する有害作用を低減または排除するために、薬剤のうち１つ以上の投与量を低減することを可能にし得る。このような併用療法は、潜在的な疾患、障害、または症状に対して相乗的な治療効果または予防効果を有し得る。
これに関連して、「組み合わせ」には、別々に投与され得る治療法、例えば別々に投与するために別々に製剤化される（例えば、キットで提供され得る）治療法、および単一製剤として一緒に投与され得る治療法（すなわち、「共製剤」）が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のＡＤＣ、組成物または医薬組成物は、連続的に投与され得る。他の実施形態では、それらは同時に投与され得る。本発明のＡＤＣは、少なくとも１つの他の（活性）薬剤との任意の組み合わせで使用され得る。
ＨＥＲ２陰性とは、ＩＨＣ１＋またはＩＨＣ２＋／ＦＩＳＨ陰性、ならびにＩＨＣ０～１＋およびＩＨＣ１＋～２＋の範囲を含めて、細胞表面上に有意な量のＨＥＲ２タンパク質が存在しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含む。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１－６アルキル」という用語は、１～６個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルキル（基）を指し、例えば、「Ｃ１－４アルキル」および「Ｃ１－３アルキル」を含む。具体例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、２－メチルブチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、２－エチルブチル、および１，２－ジメチルプロピルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１－６アルキレン」という用語は、１～６個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルカンの２個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「Ｃ１－４アルキレン」および「Ｃ１－３アルキレン」を含む。具体例としては、メチレン、エチレン、プロパ－１，３－イレン、ブタ－１，４－イレン、ペンタ－１，５－イレン、およびヘキサ－１，６－イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ２－１０アルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合および２～１０の炭素数を有する直鎖または分岐鎖アルケニルを指し、例えば、「Ｃ２－６アルケニル」および「Ｃ２－４アルケニル」を含む。例としては、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、１，３－ブタジエニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、１，３－ペンタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１，４－ヘキサジエニル、シクロペンテニル、１，３－シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、および１，４－シクロヘキサジエニルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ２－１０アルケニレン」という用語は、２～１０個の炭素原子を含むオレフィンの２個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「Ｃ２－８アルケニレン」および「Ｃ４－６アルケニレン」を含む。例としては、ペンテン－１，５－イレン、２－ペンテン－１，５－イレン、およびヘキセン－１，６－イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ２－１０アルキニル」という用語は、少なくとも１つの三重結合および２～１０の炭素数を有する直鎖または分岐鎖アルキニルを指し、例えば、「Ｃ２－６アルキニル」および「Ｃ２－４アルキニル」を含む。例としては、エチニル、プロピニル、２－ブチニル、２－ペンチニル、３－ペンチニル、４－メチル－２－ペンチニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、および５－メチル－２－ヘキシニルを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ２－１０アルキニレン」という用語は、２～１０個の炭素原子を含むアルキンの２個の水素原子を失うことによって得られる二価基を指し、例えば、「Ｃ２－８アルキニレン」および「Ｃ４－６アルキニレン」を含む。例としては、ペンチン－１，５－イレン、２－ペンチン－１，５－イレン、およびヘキシン－１，６－イレンを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１－６アルコキシ」という用語は、Ｃ１－６アルキル－Ｏ－の構造を有する基を指し、ここで、Ｃ１－６アルキルは先に定義した通りである。具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペントキシ、およびヘキソキシを含み、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「５～１２員ヘテロアリール」という用語は、５～１２個の環員を含む芳香族環式基を指し、環員の１つは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくともヘテロ原子である。具体例としては、５～１０員のヘテロアリール、５～１０員の窒素含有ヘテロアリール、ならびに５～６員の酸素含有ヘテロアリール、例えば、フリル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、イソチアゾール、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、１，２，３－トリアジニル、１，３，５－トリアジニル、および１，２，４，５－テトラジニルを含み、これらに限定されない。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター／担体、または試薬に限定されず、それらは異なり得る。さらに、本明細書で使用される用語は、本発明の範囲を限定するためではなく、特定の実施形態を記載する目的にのみ使用される。
本書（明細書および特許請求の範囲）において、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、文脈上別段の明確な指定がない限り、それらの複数形を含む。例えば、「宿主細胞」は、複数の宿主細胞を含む。加えて、中国語には対応する英語の単数形および複数形の文法規則はなく、名詞の単数形および複数形は文脈または実際の状況に応じて判断されなければならない。したがって、英語への翻訳では、名詞に対する接頭辞「１つ以上」が正しいものと思われる。
フローサイトメトリーによるＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２のモノクローナル安定細胞株の検出を示す。 フローサイトメトリーによるＬ９２９－クローディン１８．２のモノクローナル安定細胞株の検出を示す。 フローサイトメトリーによるＫＡＴＯＩＩＩ－クローディン１８．２のモノクローナル安定細胞株の検出を示す。 フローサイトメトリーによるＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２のモノクローナル安定細胞株の検出を示す。 ウエスタンブロットによるＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１のモノクローナル安定細胞株の検出を示す。 フローサイトメトリーによる２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２の親和性の測定を示す。 Ｌ９２９－クローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２の結合の親和性の測定を示す。 フローサイトメトリーによる２Ｃ６．９－ｈｚ２１の特異性の測定を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２のＣＤＣ殺傷活性の測定を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２のＡＤＣＣ活性の測定を示す。 ２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示す。 ２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示す。 細胞膜表面上でのクローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の親和性の試験結果を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＮＵＧＣ－４細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＮＵＧＣ－４細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）の細胞傷害効果の試験結果を示す。 ＮＵＧＣ－４細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の細胞傷害効果の試験結果を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスでの皮下移植されたＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２細胞腫瘍モデルにおける各群のマウスの腫瘍体積変化を示す（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスでの皮下移植されたＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２細胞腫瘍モデルにおける各群のマウスの体重変化を示す。 ＣＤＸモデルにおける２Ｃ６．９－ＴＬ００１および２Ｃ６．９ｍＡｂ＋化学療法の１１日間のインビボ有効性の比較を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 ＣＤＸモデルにおける２Ｃ６．９－ＴＬ００１および２Ｃ６．９モノクローナル抗体＋化学療法の２１日間のインビボ有効性の比較を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 ＣＤＸ（ＮＵＧＣ－４）モデルにおいて異なるＤＡＲ値を有する２Ｃ６．９－ＴＬ００１で治療した各群のマウスの２１日以内の腫瘍体積変化を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。 ＣＤＸ（ＮＵＧＣ－４）モデルにおいて異なるＤＡＲ値を有する２Ｃ６．９－ＴＬ００１で治療した各群のマウスの２１日以内の体重変化を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がんＧＡ０００６ ＰＤＸモデルにおける各群のマウスの１７日以内の腫瘍体積変化を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がんＧＡ０００６ ＰＤＸモデルにおける各群のマウスの１７日以内の体重変化を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がんＧＡ０００６ ＰＤＸモデルにおける各群のマウスの２４日以内の腫瘍体積変化を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がんＧＡ０００６ ＰＤＸモデルにおける各群のマウスの２４日以内の体重変化を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの腫瘍体積変化を示す（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの体重変化を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの腫瘍体積変化を示す（＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの体重変化を示す。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＮＵＧＣ－４細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの腫瘍体積変化を示す（＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。 Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの皮下ＮＵＧＣ－４細胞移植腫瘍モデルにおける各群のマウスの体重変化を示す。 ２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示す。
以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を詳細に説明するが、当業者であれば、以下の実施例が本発明を例示するために使用されるにすぎず、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解するであろう。実施例に示されていない具体的な条件は、従来の条件または製造業者によって提案された条件に従う。製造業者を示さずに使用される試薬または機器は、すべて市販の従来の製品である。
［実施例１］
生物活性分子（ＴＯＸＩＮ－１）の合成
Figure 0007407973000035
 ベロテカン塩酸塩（３ｇ、６．３８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．５８ｇ、２５．５４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液に、塩化メタンスルホニル（４６２ｍｇ、１２．７７ｍｍｏｌ、純度約７０％）を滴加し、得られた混合物を室温で２時間反応させた。吸引濾過後、濾過ケーキをジクロロメタン（３ｍＬ）で３回洗浄して、（Ｓ）－Ｎ－（２－（４－エチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオン－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－１１－イル）エチル）－Ｎ－イソプロピルメタンスルホンアミド（ＴＯＸＩＮ－１）２．２ｇを得た。
構造特性評価データは以下の通りである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ８．３２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９３－７．８４（ｍ，１Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），６．５６（ｓ，１Ｈ），５．４４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，４Ｈ），３．９８（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．５０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４２－３．３５（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，３Ｈ），１．９３－１．８２（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１２．２［Ｍ＋Ｈ］＋．
［α］Ｄ ２０は＋２８．１９°（ｃ＝０．１０１ｇ／１００ｍＬ、ＣＨ３ＣＮ）である。
［実施例２］
６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）－５－ヘキシン酸（化合物３－４）の合成
Figure 0007407973000036
工程１：６－（２－（メチルチオ）ピリミジン－５－イル）－５－ヘキシン酸メチルエステル（化合物３－２）の合成
室温で、メチル５－ヘキシノエート（５００ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ）および５－ブロモ－２－メチルチオピリミジンをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３ｍＬ）、ヨウ化第一銅（７５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびパラジウム（ＩＩ）ビス（トリフェニルホスフィン）ジクロリド（２７９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。次いで、窒素保護下で混合物を９５℃に加熱し、撹拌しながら６時間反応させた。反応を水でクエンチした。反応物を酢酸エチルで抽出した（２０ｍＬ×３回）。有機相を合わせ、飽和ブラインで洗浄し（２０ｍＬ×２回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、真空中で濃縮し、分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物３００ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５１．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程２：６－（２－（メチルチオ）ピリミジン－５－イル）－５－ヘキシン酸（化合物３－３）の合成
室温で、化合物３－２（２００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランと水との混合溶液（４ｍＬ／４ｍＬ）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（２３５ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で撹拌しながら４時間反応させた後、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２０ｍＬ×２回）。水相を１Ｎ塩酸でｐＨ＝３に調整し、酢酸エチルで抽出した（２０ｍＬ×３回）。有機相を合わせ、飽和ブラインで洗浄し（２０ｍＬ×２回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、真空中で濃縮して、１２０ｍｇの標記化合物を得た。
工程３：６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）－５－ヘキシン酸（化合物３－４）の合成
室温で、化合物３－３（２０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、ｍ－クロロ過安息香酸（２２ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で撹拌しながら一晩反応させ、そして、分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物２０ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
［実施例３］
（４－（（Ｓ）－２－（４－アミノブチル）－３５－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－４，８－ジオキソ－６，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ノナオキサ－３，９－ジアザペンタトリアコンタンアミド）ベンジル）（（Ｓ）－４－エチル－１１－（２－（Ｎ－イソプロピルメチルスルホンアミド）エチル）－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）カーボネート（化合物ＴＬ００１）
Figure 0007407973000037
工程１：６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）－Ｎ－プロパルギル－ヘキサ－５－インアミド（化合物３－５）の合成
プロピニルアミン（１８９ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）および化合物３－４（８００ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を２５℃でジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７３８ｍｇ、５．６７ｍｍｏｌ）およびＯ－（７－アザ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート（１．６３ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。得られた混合物を、撹拌しながら２時間反応させた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルカラム（酢酸エチル／石油エーテル＝３／１）で精製して、標記化合物７００ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０６．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程２：（４－（（Ｓ）－３５－アジド－２－（４－（（（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル）アミノ）ブチル）－４，８－ジオキソ－６，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ノナオキサ－３，９－ジアザペンタトリアコンタンアミド）ベンジル）（（Ｓ）－４－エチル－１１－（２－（Ｎ－イソプロピルメチルスルホンアミド）エチル）－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）カーボネート（化合物３３－１）の合成
ＴＯＸＩＮ－１（２５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を、窒素保護下で２５℃でジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、４－ジメチルアミノピリジン（４７８ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍＬ）溶液を加え、続いてトリホスゲン（７２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液をゆっくり滴加した。添加後、得られた混合物を、０℃で２０分間撹拌しながら反応させ、窒素で２０分間パージした。次いで、（Ｓ）－２－（３２－アジド－５－オキソ－３，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０－ノナオキサ－６－アザ－ドトリアコンタンアミド）－Ｎ－（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）－６－（（（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル）アミノ）ヘキサンアミド（５１８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（７ｍＬ）溶液を加え、０℃で１時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣を分取液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物５００ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５９７．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程３：（（Ｓ）－４－エチル－１１－（２－（Ｎ－イソプロピルメチルスルホンアミド）エチル）－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）（４－（（Ｓ）－２－（４－（（（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル）アミノ）ブチル）－３５－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－４，８－ジオキソ－６，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ノノキシ－３，９－ジアザペンタトリアコンタンアミド）ベンジル）カーボネート（化合物３３－２）の合成
室温で、化合物３３－１（８０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびフラグメント３－５（２３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシドと水との溶液（２．０ｍＬ：０．５ｍＬ）に溶解し、臭化第一銅（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を１時間撹拌し、分取高速液体クロマトグラフィーで精製して、標記化合物３０ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：８１５．９［（Ｍ－２７３）／２＋Ｈ］＋。
工程４：４－（（Ｓ）－２－（４－アミノブチル）－３５－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－４，８－ジオキソ－６，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ノナオキサ－３，９－ジアザペンタトリアコンタンアミド）ベンジル）（（Ｓ）－４－エチル－１１－（２－（Ｎ－イソプロピルメチルスルホンアミド）エチル）－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－４－イル）カーボネート（化合物ＴＬ００１）の合成
化合物３３－２（３０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、続いてトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加えた。得られた混合物を、室温で３０分間反応させ、分取ＨＰＬＣで精製して、標記化合物のトリフルオロ酢酸塩２０．０ｍｇを得た。この構造は以下のように特徴付けられる。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １０．１８（ｓ，１Ｈ），９．１０（ｓ，２Ｈ），８．３８（ｔ，Ｊ＝５．５６Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ，１Ｈ），８．２２－８．２０（ｍ，２Ｈ），８．０９（ｔ，Ｊ＝５．６８Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．８７（ｍ，２Ｈ），７．８２－７．７８（ｍ，１Ｈ），７．６９（ｂｒｓ，３Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，２Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝１６．９６Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄ，Ｊ＝１６．９６Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄ，Ｊ＝１９．２８Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｄ，Ｊ＝１９．２８Ｈｚ，１Ｈ），５．１４（ｄ，Ｊ＝１２．２０Ｈｚ，１Ｈ），５．０７（ｄ，Ｊ＝１２．１６Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝５．２４Ｈｚ，２Ｈ），４．４６－４．４３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝５．６０Ｈｚ，２Ｈ），４．０８－３．９５（ｍ，５Ｈ），３．７９（ｔ，Ｊ＝５．２８Ｈｚ，２Ｈ），３．５１－３．４３（ｍ，３２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．３９－３．３５（ｍ，２Ｈ），３．３０－３．２６（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，３Ｈ），２．８２－２．７４（ｍ，２Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝７．０８Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．３６Ｈｚ，２Ｈ），２．２３－２．１３（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｐ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ，２Ｈ），１．７８－１．６３（ｍ，２Ｈ），１．６１－１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４２－１．２７（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｄ，Ｊ＝６．８０Ｈｚ，３Ｈ），１．１３（ｄ，Ｊ＝６．７６Ｈｚ，３Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，３Ｈ）．
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：８１６．０［Ｍ／２＋Ｈ］＋．
［α］Ｄ ２０は、－１９．５５°（ｃ＝１．０００ｇ／１００ｍＬ、ＣＨ３ＣＮ）である。
［実施例４］
（（Ｓ）－４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（４－（１－（２６－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）ブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）トリフルオロアセテート（ＴＬ００２）の合成
Figure 0007407973000038
工程１：（Ｓ）－（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル（４－ニトロフェニル）カーボネートの合成
（Ｓ）－４，１１－ジエチル－４，９－ジヒドロキシ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）－ジオン（１５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（９６．８１ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を加え、続いてビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（１２７．９２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液を加え、得られた混合物を、２５℃で３時間反応させた。反応溶液を濃縮して標記化合物２０７ｍｇを得、これを次の反応に直接使用した。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：５５８．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程２：（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）の合成
（Ｓ）－（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）（４－ニトロフェニル）カーボネート（２０７ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１３０．８７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチルＮ－メチル－Ｎ－［２－（メチルアミノ）エチル］カルバメート（７１．３４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、２５℃で１２時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝９／１）で精製して、標記化合物２０７ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：６０７．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程３：（Ｓ）－Ｎ－メチル－（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）（２－（メチルアミノ）エチル）カルバメートトリフルオロアセテートの合成
（Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）（２０７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加え、得られた混合物を２５℃で２時間反応させた。反応溶液を濃縮して標記化合物２００ｍｇを得、これを次の反応に直接使用した。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：５０７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程４：４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（（Ｓ）－４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）の合成
（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（４－ニトロフェニル）カーボネート（１５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３４．０３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４８．８２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、続いて（Ｓ）－Ｎ－メチル－（４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）（２－（メチルアミノ）エチル）カルバメートトリフルオロアセテート（１０２．１１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、２５℃で１６時間反応させた。反応溶液を分取ＨＰＬＣで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物４４ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１４００．７［Ｍ＋Ｈ］＋。
クロマトグラフィーカラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ １９ｍｍ×１５０ｍｍ×５．０μｍ
移動相Ａ：アセトニトリル；移動相Ｂ：水（０．０５％ギ酸）
Figure 0007407973000039
工程５：（（Ｓ）－４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（４－（１－（２６－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）ブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）トリフルオロアセテートの合成
４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（（Ｓ）－４，１１－ジエチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－９－イル）エタン－１，２－ジイルビス（メチルカルバメート）（４４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）および６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）－Ｎ－プロピル）ヘキサミド（１４．０９ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド（３ｍＬ）と水（０．７５ｍＬ）との溶液に溶解し、臭化第一銅（８．６５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２５℃で１時間反応させた。反応溶液を、分取ＨＰＬＣで精製し、集めた画分を凍結乾燥し、次いでこれをジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加え、２５℃で０．５時間撹拌し、分取ＨＰＬＣで精製し、そして、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物１６ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：８５３．６［Ｍ／２＋Ｈ］＋。
クロマトグラフィーカラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＤＳ ５μｍ １９×５０ｍｍ
移動相Ａ：アセトニトリル；移動相Ｂ：水（０．０５％トリフルオロ酢酸）
Figure 0007407973000040
［実施例５］
（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（４－（１－（２６－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）ブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（２－（（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－１１－イル）Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルカルバメートトリフルオロアセテート（ＴＬ００３）の合成
Figure 0007407973000041
工程１：（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチルブチルアミドの合成
室温で、（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）（（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタ－２－イル）カルバメート（２．００ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１２ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（３ｍＬ）を加え、得られた混合物を２５℃で２時間反応させた。次いで、反応溶液を、水に注ぎ入れて固体を沈殿させ、固体を濾過し、分取ＨＰＬＣで精製した。集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物８１０ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９４．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
クロマトグラフィーカラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＤＳ ８μｍ ４５×４５０ｍｍ
移動相Ａ：アセトニトリル；移動相Ｂ：水
Figure 0007407973000042
工程２：ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）アミノ－３－メチル－１－オキソブタ－２－イル）アミノ－４－オキソブチル）ピペリジン－１－カルボキシレートの合成
室温で、（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチルブチルアミド（８１０ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、４－（１－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）ピペリジン－４－イル）酪酸、および２－エトキシ－１－エトキシカルボ－１，２－ジヒドロキノリンを、ジクロロメタン（８ｍＬ）およびメタノール（８ｍＬ）に溶解し、４５℃で２時間反応させた。反応溶液を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーカラム（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝１５／１）で精製して、標記化合物１．３１ｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：５４６．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程３：（Ｓ）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチル－２－（４－（ピペリジン－４－イル）ブチリルアミド）ブチルアミドトリフルオロアセテートの合成
室温で、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－（（Ｓ）－１－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）アミノ－３－メチル－１－オキソブタ－２－イル）アミノ－４－オキソブチル）ピペリジン－１－ホルメート（１．３ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加え、２５℃で２時間反応させた。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（１．２２ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２時間反応させた。反応混合物を吸引濾過し、濾過ケーキをアセトニトリルで洗浄し、濾液を回収し、減圧下で濃縮して、標記化合物９００ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：４４６．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程４：（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチルブチルアミドの合成
室温で、（Ｓ）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチル－２－（４－（ピペリジン－４－イル）ブチリルアミド）ブチルアミドトリフルオロアセテート（４８７ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）および２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニルｐ－トルエンスルホネート（６１９ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（６５５ｍｇ、４．６９ｍｍｏｌ）を加え、１６℃で６時間反応させた。反応溶液を、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーカラム（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝８／１）で精製して、標記化合物５８６ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：８６８．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程５：（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（４－ニトロフェニル）カーボネートの合成
室温で、（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソプロパ－２－イル）－３－メチルブチルアミド（５８５ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３４．３１ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を加え、続いて、ジ（ｐ－ニトロベンゼン）カーボネート（６０２．３５ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液を滴加し、得られた混合物を２５℃で６時間反応させた。反応溶液を減圧下で濃縮し、残渣にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加え、混合物を濾過して、標記化合物７６０ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０３３．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程６：（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（Ｎ－（２－（（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－１１－イル）エチル）－Ｎ－イソプロピル）カルバメートの合成
室温で、（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（４－ニトロフェニル）カーボネート（１５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（３４．０３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４８．８２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、続いて、（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－１１－（２－（イソプロピルアミノ）エチル）－１，１２－ジヒドロ－１４Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－３，１４（４Ｈ）－ジオン塩酸塩（５９．７９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応溶液を室温で一晩撹拌し、次いで、分取ＨＰＬＣで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物６４ｍｇを得た。
ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３２７．６［Ｍ＋Ｈ］＋。
工程７：（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（４－（１－（２６－（４－（（６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）ヘキサ－５－インアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）ブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（２－（（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－１１－イル）Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピルカルバメートトリフルオロアセテートの合成
室温で、（４－（（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－（４－（１－（２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサニル）ピペリジン－４－イル）ブチルアミド）－３－メチルブチルアミド）プロピオンアミド）ベンジル）（Ｎ－（２－（（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシ－３，１４－ジオキソ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’，４’：６，７］インドジノ［１，２－ｂ］キノリン－１１－イル）エチル）－Ｎ－イソプロピル）カルバメート（６４ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）および６－（２－（メチルスルホニル）ピリミジン－５－イル）－Ｎ－（プロパ－２－イニル）ヘキサミド（２１．６３ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド（４ｍＬ）および水（１ｍＬ）に溶解し、臭化第一銅（１３．２７ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、２５℃で１時間反応させた。反応溶液を分取ＨＰＬＣで精製し、集めた画分を凍結乾燥して、標記化合物３５ｍｇを得た。ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６３２．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
クロマトグラフィーカラム：Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ ５μｍ １９×１５０ｍｍ
移動相Ａ：アセトニトリル；
移動相Ｂ：水（０．０５％トリフルオロ酢酸）
Figure 0007407973000043
［実施例６］
ヒトクローディン１８．２を標的とするモノクローナル抗体の調製
本発明におけるヒトクローディン１８．２を標的とするモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり、２Ｃ６．９－ｈｚ１１および２Ｃ６．９－ｈｚ２１を含み、それらのＣＤＲ、可変領域配列、および定常領域配列を表１に示す。
Figure 0007407973000044
６．１ ヒトクローディン１８．２およびヒトクローディン１８．１過剰発現細胞株の構築および同定
６．１．１ ヒトクローディン１８．２およびヒトクローディン１８．１過剰発現細胞株の構築
抗ヒトクローディン１８．２抗体の特異性および機能を測定するために、ヒトクローディン１８．２（遺伝子受託番号：ＮＭ＿００１００２０２６．２、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより合成）およびヒトクローディン１８．１（遺伝子受託番号：ＮＭ＿０１６３６９．３、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより合成）の完全なコード配列をレンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏにクローニングし、公開された方法（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ Ｚら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年９月；５７（９）：７９３－８００）に従ってレンチウイルスパッケージングシステムによってウイルスを調製した。得られたウイルスを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｌ９２９、ＫＡＴＯＩＩＩ、およびＮＣＩ－Ｎ８７細胞を感染させた。ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２、Ｌ９２９－クローディン１８．２、ＫＡＴＯＩＩＩ－クローディン１８．２、およびＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２のモノクローナル安定細胞株を、ピューロマイシンスクリーニングおよび単一クローンの選択によって得た。ＢａＦ／３細胞（ＤＳＭＺ、カタログ番号ＡＣＣ３００）を、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘトランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＣ－３０１２）を使用して、ヒトクローディン１８．２またはヒトクローディン１８．１をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、１．２５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．カタログ番号１０６８７０１０）の添加によって細胞をスクリーニングした。１２日間のスクリーニング後に単一クローンを選択し、それによってモノクローナル細胞株ＢａＦ／３－Ｃｌａｕｄ１８．１およびＢａＦ／３－Ｃｌａｕｄ１８．２を得た。
６．１．２ ヒトクローディン１８．２およびヒトクローディン１８．１過剰発現細胞株の検出
ウエスタンブロットを使用してＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１を検出し（検出抗体：Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６１６７－１－Ｉｇ）、ＦＡＣＳを使用して他の細胞株を検出した（フローサイトメーター：Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦｌｅｘ；検出抗体：ＩＭＡＢ３６２、その配列は中国特許出願公告第１０１３１２９８９号からのものである）。図１Ａ～図１Ｄに示すように、ＦＡＣＳの結果から、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２、Ｌ９２９－クローディン１８．２、ＫＡＴＯＩＩＩ－クローディン１８．２、およびＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２モノクローナル細胞株が高い陽性率（１００％に近い）および良好な均一性で得られたことが実証され、以下の実験で使用された。ウエスタンブロットの結果（図１Ｅ）から、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１の３つの安定な細胞株のすべてがヒトクローディン１８．１を過剰発現したことが実証され、ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１－１Ｃ２の単一クローンは、他のものよりも高い発現レベルを示し、以下の実験で使用された。
６．２ マウス抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体の調製
ＤＮＡ／細胞免疫を野生型マウスで実施して、マウス抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を作製した。各Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ヒトクローディン１８．２の完全なコード配列を含むプラスミド１００μｇを尾静脈を介して注射した。４回目および６回目の免疫後、血清力価をＦＡＣＳによって測定した。高い血清力価を有するマウスを、融合の３～５日前にＢａＦ／３－クローディン１８．２過剰発現細胞株で追加免疫した。マウス脾細胞およびマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５８１）のＰＥＧ媒介融合を、標準的な融合プロトコルで行い、続いてＨＡＴ加圧選択を行った。融合の１０～１４日後にＦＡＣＳスクリーニングを行った。
約６０００個のハイブリドーマの上清を、フローサイトメトリー（ＳａｒｔｏｒｉｕｓからＭｏｄｅｌ ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓとして入手可能）を使用してスクリーニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞株に結合した４３個の陽性ハイブリドーマを得て、サブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２およびＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１細胞株を使用したＦＡＣＳによって、ヒトクローディン１８．２に特異的に結合したがヒトクローディン１８．１には結合しなかった１４個のハイブリドーマを選択した。限界希釈およびサブクローン選択によって単一クローンを得た。
ヒト胃がん細胞株ＮＵＧＣ４（日本のＪＣＲＢ細胞バンクより購入、カタログ番号：ＪＣＲＢ０８３４）は、クローディン１８．２を内因的に発現し、抗体と内因性クローディン１８．２との間の結合を評価し、機能アッセイを開発するために広く使用されている。ＮＵＧＣ４細胞を使用して候補クローンを評価し、最終的に７つのサブクローンを選択した。さらなる親和性検出の後、可変領域の増幅およびヒト化のために２Ｃ６．９Ｍを選択した。
候補ハイブリドーマクローンの抗体サブタイプを検出するために、Ｐｉｅｒｃｅ Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩ．カタログ番号２６１７９）を使用して２Ｃ６．９Ｍを同定した。同定結果から、重鎖がＩｇＧ１サブタイプであり、軽鎖がカッパサブタイプであることが示された。
ハイブリドーマ細胞を増殖させ、約８０００個の細胞を採取し、溶解した。最初のｃＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．カタログ番号１８０８０－２００）によって合成した。ＶＨおよびＶＫ（ＶＬカッパ）遺伝子を、プライマーを使用してｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）で精製し、ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．カタログ番号Ｋ４５７５４０）にライゲーションした。各ライゲーション反応物から約１２個のクローンを採取し、配列決定した。次いで、配列をＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ１１．５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）およびＳｅｑｕｅｎｃｅｒ５．４．６（Ｇｅｎｅｃｏｄｅｓ）によって分析した。得られたマウス抗体２Ｃ６．９Ｍの可変領域配列およびＣＤＲ配列を表２に示した。
Figure 0007407973000045
６．３ ２Ｃ６．９Ｍマウス抗体のヒト化
ＣＤＲ移植法を使用して、マウス抗体２Ｃ６．９Ｍをヒト化した。簡潔に言えば、ヒト化プロセスは以下の工程に含まれた：マウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系抗体のアミノ酸配列とアラインメントして、高い相同性および良好な物理化学的特性を有するヒト生殖細胞系フレームワークを同定した；ＨＬＡ－ＤＲに対する親和性を測定し、次いで、ＨＬＡ－ＤＲに対する親和性が低いヒト生殖細胞系フレームワークを選択した；次いで、マウス抗体の６つのＣＤＲ領域を、選択された重鎖および軽鎖フレームワークに移植した。
具体的には、マウス抗体２Ｃ６．９Ｍの重鎖および軽鎖ＣＤＲを、対応するヒト化の鋳型のフレームワーク（ＦＲ）に移植した。２Ｃ６．９Ｍの重鎖および軽鎖のヒト化の鋳型は、それぞれヒト生殖細胞系配列ＩＧＨＶ４－５９＊０１（ＩＭＧＴ参照番号ＡＢ０１９４３８）およびＩＧＫＶ４－１＊０１（ＩＭＧＴ参照番号Ｚ０００２３）である。
さらに、コンピュータシミュレーションにより、分子ドッキングを行って可変領域およびその周囲のフレームワークのアミノ酸配列を分析し、抗体の空間立体結合形態を決定した。静電気力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、およびエントロピーを計算することによって、マウス抗体のアミノ酸配列においてクローディン１８．２と相互作用し得るか、または空間構造を維持し得る重要なアミノ酸残基を同定し、これらのマウスアミノ酸を移植後に維持した。換言すれば、マウス抗体の親和性をヒト化抗体において最大限に保つことができるように、一連の復帰突然変異をヒト化の鋳型のＦＲ領域残基に取り込んだ。
マウス抗体２Ｃ６．９Ｍの可変領域配列を配列番号２３および配列番号２４に示し、そのＣＤＲ配列を配列番号１～配列番号１２に示す。親和性に影響を与えることなく異性化の発生を回避するために、２Ｃ６．９ ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列を本発明において改変した。改変された配列を配列番号２１および配列番号２２に示す。最後に、２つのヒト化抗体を構築し、それぞれ２Ｃ６．９－ｈｚ１１および２Ｃ６．９－ｈｚ２１と命名した。各抗体の重鎖定常領域はヒト野生型ＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１６）であり、そして、抗体の軽鎖定常領域はヒト野生型ＩｇＧ１κ軽鎖定常領域（配列番号１７）である。
各２Ｃ６．９抗体の可変領域、定常領域、および重鎖／軽鎖アミノ酸配列を表１に示す。
２Ｃ６．９ヒト化抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列のコドン最適化されたｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐｃＤＮＡ３．４（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより受託）にライゲーションした。重鎖および軽鎖に対応するｐｃＤＮＡ３．４をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社より購入）に同時にトランスフェクトし、細胞上清をプロテインＡアフィニティーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ）により精製して、２Ｃ６．９ヒト化モノクローナル抗体を得た。
６．４ ヒト化モノクローナル抗体２Ｃ６．９の親和性検出
細胞膜上でのヒトクローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１の親和性を、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を用いて検出した。具体的な手順は以下の通りであった：ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を剥離し、遠心分離した後、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁し、９６ウェルの先端底プレートに、合計２０ウェルについて５０μｌの体積に１ウェルあたり３０００００個の細胞を播種した。次いで、５０μｌの２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２抗体を、別々に１０００ｎＭから開始して３倍希釈して、１１個の濃度で各ウェルに添加した。ヒトＩｇＧを陰性対照として用いた。反応物をよく混合し、暗所で４℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３２２）を添加し、暗所で４℃で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）で検出を行った。
図２および表３に示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１の結合親和性のＥＣ５０値は、ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値よりも低く、また、２Ｃ６．９－ｈｚ２１の最大蛍光値は、ＩＭＡＢ３６２の最大蛍光値よりも高く、このことは、細胞膜上でのクローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１の親和性がＩＭＡＢ３６２の親和性よりも強かったことを示している。
Figure 0007407973000046
６．５ ヒト化抗体２Ｃ６．９の親和性および特異性の測定
ヒトクローディン１８．２は、テトラスパニンファミリーに属し、複雑な構造を有する。したがって、クローディン１８．２の構造を維持するために細胞ＥＬＩＳＡを行った。６．１で構築された安定な細胞株Ｌ９２９－クローディン１８．２を検出に使用した。具体的には、Ｌ９２９－クローディン１８．２接着細胞を、２ｍＭのＥＤＴＡ処理によって剥離した。細胞を再懸濁し、２×１０５／ｍＬに調整し、再懸濁液１００μＬを９６ウェルプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、プレートをＰＢＳで１回洗浄した。１００μＬ／ウェルの４％ホルムアルデヒドをプレートに添加した。室温で３０分間インキュベートした後、ホルムアルデヒドを除去し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した後、１００μＬ／ウェルの連続希釈抗体（１μＭから開始して４倍希釈して、合計１１個の濃度）を対応するウェルに添加し、その後３７℃で２時間インキュベートした。プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄し、毎回２分間静置した。ＰＢＳ（２％ＢＳＡを含有）で１：１００００に希釈した１００μＬ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０３５－００３）をプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、２５０μＬのＰＢＳＴで６回洗浄し、ここで、プレートは毎回２分間静置した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、３４０２９）を添加した。反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、５０μＬの２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０ｎｍ吸光度値をプレートリーダー（ＭＤ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２）で得て、結果をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによるカーブフィッティングに供した。
結果を図３および表４に示し、これらは、ヒト化抗体２Ｃ６．９－ｈｚ２１のヒトクローディン１８．２に対する親和性が、ＩＭＡＢ３６２の親和性よりも有意に高いことを示している。同じ実験において、ヒト化抗体２Ｃ６．９－ｈｚ１１の親和性は、抗体２Ｃ６．９－ｈｚ２１の親和性に近かった（結果は省略した）。
Figure 0007407973000047
候補抗体の特異性をＦＡＣＳによって検出した。具体的な手順は以下の通りであった：ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ヒトクローディン１８．１、およびＨＥＫ２９３Ｔ－ヒトクローディン１８．２細胞を剥離し、次いで遠心分離した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁した。各細胞株の３０００００個の細胞に１０００ｎＭの最終濃度で候補抗体を添加し、よく混合し、４℃で１時間インキュベートし、光から保護した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４０９３２２）を添加し、続いて暗所で４℃で０．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）で検出を行った。
図４に示すように、２Ｃ６．９－ｈｚ２１は、ヒトクローディン１８．２に特異的に結合することができるが、ヒトクローディン１８．１には特異的に結合することができない。
６．６ ヒト化抗体２Ｃ６．９の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の測定
２Ｃ６．９はＩｇＧ１サブタイプに属し、これは古典的補体経路を効果的に活性化し、そして、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を誘発し得る。本発明者らの研究では、２Ｃ６．９のＣＤＣ活性を測定するために、補体を多く含むモルモット血清（Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｂａｉｊｉより購入、カタログ番号Ｓ０００１）を使用した。具体的な手順は以下の通りである：ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を採取し、遠心分離した後、細胞密度を調整した。５×１０４個／ウェルの細胞をプレートに播種し、一晩インキュベートした。２０％のモルモット血清を含有するＤＭＥＭを翌日調製し、そして、２Ｃ６．９およびＩＭＡＢ３６２を希釈するために使用した。２０μｇ／ｍＬから開始して、２倍希釈して１０個の濃度を調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞の元の細胞培養培地を除去し、そして、抗体希釈物を１００μＬ／ウェルで対応するウェルに添加した。１０μＬ／ウェルの溶解緩衝液を陽性対照として提供した。反応物を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に静置し、そして、３時間インキュベートした。その後、染色のためにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（ＣＴＧ、Ｐｒｏｍｅｇａより購入、品番：Ｇ７５７３）を５０μｌ／ウェルで添加し、続いて３０秒間混合し、室温で１分間静置した。次いで、蛍光シグナル値をマイクロプレートリーダー（ＭＤ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２）によって測定し、その結果をカーブフィッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートした。
図５および表６に示すように、２Ｃ６．９－ｈｚ２１のＣＤＣ活性は、対照抗体ＩＭＡＢ３６２のＣＤＣ活性よりも強かった。
Figure 0007407973000048
６．７ ヒト化抗体２Ｃ６．９の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の測定
２Ｃ６．９はＩｇＧ１サブタイプに属し、比較的強い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有する。ＮＫ細胞媒介殺傷アッセイを使用して、２Ｃ６．９のＡＤＣＣ活性を測定した。具体的な手順は以下の通りであった：ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を採取し、遠心分離した後、細胞密度を調整した。１×１０４個／ウェルの細胞をプレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、培地を除去した。ＮＫ９２ＭＩ－ＣＤ１６ａ細胞（Ｈｕａｂｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍ）を遠心分離し、ＭＥＭＡ培地に再懸濁し、そして、１×１０６／ｍＬに調整し、次いで、５０μＬ／ウェルの細胞を対応するウェルに添加した。２Ｃ６．９－ｈｚ２１およびＩＭＡＢ３６２抗体をＭＥＭＡ培地で希釈した。ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞について、４０μｇ／ｍＬから開始して５倍希釈して、１０個の抗体濃度を試験した。ＮＵＧＣ－４細胞について、２ｍｇ／ｍＬから開始して５倍希釈して、１１個の抗体濃度を試験した。５０μＬ／ウェルの希釈抗体を対応するウェルに添加し、そして、反応物を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に静置し、５．５時間インキュベートした。次いで、溶解緩衝液を陽性対照ウェルに添加し、さらに０．５時間インキュベートした。５０μＬ／ウェルの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）検出剤（ＤＯＪＩＮＤＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＳＥ、ＣＫ１２）をウェルに添加し、４９０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＤ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２）によって１０分ごとに得た。結果をカーブフィッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートした。
図６および表７に示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１のＡＤＣＣ活性は、ＩＭＡＢ３６２の活性よりも強い。
Figure 0007407973000049
［実施例７］
クローディン１８．２を標的とするＡＤＣ（２Ｃ６．９－ＡＤＣ）の調製
２Ｃ６．９－ＴＬ００１は、実施例３で得られたＴＬ００１をヒト化モノクローナル抗体２Ｃ６．９とコンジュゲートすることによって調製される。調製方法は以下の通りである。
（１）コンジュゲーション：３０ｍｇの２Ｃ６．９－ｈｚ２１抗体に２０ｍＭ ＰＢ＋１０５ｍＭ ＮａＣｌ＋１００ｍＭ エデト酸二ナトリウム溶液（ｐＨ７．７）を加え、２Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨを７．７に調整し、混合物を２０ｍＭ ＰＢ＋１０５ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．７溶液で希釈し（エデト酸二ナトリウムの最終濃度は５ｍＭであり、抗体の最終濃度は１５ｍｇ／ｍＬであった）、均一に混合し、１０ｍＭ ＴＣＥＰ溶液を加えてよく混合し、得られた混合物を室温でしばらく（３０または９０分間）静置した；その後、ジメチルスルホキシド（抗体に対するモル比：５：１または９：１）に溶解したＴＬ００１を添加し、よく混合し、室温で２時間静置して複合体試料を得て、これを２Ｃ６．９－ＴＬ００１と命名した。
（２）緩衝液置換：３０ＫＤａの５０ｍｌ限外濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２Ｃ６．９－ＴＬ００１の緩衝液交換に使用し、置換溶液は、１０ｍＭヒスチジン－塩酸ヒスチジン＋８％スクロース（ｐＨ６．０）緩衝液であり、置換倍数は１５であった。試料を回収し、１０％ Ｔｗｅｅｎ－２０を添加し、ここで、試料中のＴｗｅｅｎ－２０の最終濃度は０．０２％（Ｍ／Ｖ）であった。
（３）試験：
置換後、以下の条件で２Ｃ６．９－ＴＬ００１をＬＣ－ＭＳ分子量分析に供した。
クロマトグラフィー測定条件：
液体クロマトグラフィーカラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＭＡｂＰａｃ ＲＰ ３．０＊１００ｍｍ；
移動相Ａ：０．１％ ＦＡ／９８％ Ｈ２Ｏ／２％ ＡＣＮ；
移動相Ｂ：０．１％ ＦＡ／２％ Ｈ２Ｏ／９８％ ＡＣＮ；
流速：０．２５ｍＬ／分；
試料室温度：８℃；カラム温度：６０℃；試料サイズ：１μＬ；
Figure 0007407973000050
切換弁：０～３分 排液、３～２２分 ＭＳ、２２～３０分 排液
質量分析条件：
質量スペクトルモデル：ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００＋；
パラメータ：ＧＳ１ ３５；ＧＳ２ ３５；ＣＵＲ ３０；ＴＥＭ ３５０；ＩＳＶＦ ５５００；ＤＰ ２００；ＣＥ １０；ｍ／ｚ ６００～４０００；Ｔｉｍｅ ｂｉｎｓ ｔｏ ｓｕｍ値４０。
ＴＬ００１と２Ｃ６．９－ｈｚ２１とのコンジュゲーションによって得られた２Ｃ６．９－ＴＬ００１の軽鎖および重鎖の理論分子量および測定分子量（重鎖は主要グリコフォームＧ０Ｆによって計算される）を、以下の表に示す。
Figure 0007407973000051
ＴＬ００１と２Ｃ６．９－ｈｚ２１との間のコンジュゲーションの供給比が５：１である場合、抗体２Ｃ６．９－ＴＬ００１の軽鎖（ＬＣ）は、０～１つの毒素とコンジュゲートされ（ＬＣおよびＤＡＲ１の割合はそれぞれ５７．８％および４２．２％である）、そして、重鎖（ＨＣ）は、０～４つの毒素とコンジュゲートされる（ＨＣ、ＤＡＲ１、ＤＡＲ２、ＤＡＲ３、およびＤＡＲ４の割合はそれぞれ２２．５％、３０．３％、２５．０％、２１．９％、および０．３％である）。したがって、毒素抗体比（ＤＡＲ）は３．７９であり、計算式は、ＤＡＲ＝軽鎖ＤＡＲ１＊２＋重鎖（ＤＡＲ１＊１＋ＤＡＲ２＊２＋ＤＡＲ３＊３＋ＤＡＲ４＊４）＊２である。
ＴＬ００１と２Ｃ６．９－ｈｚ２１との間のコンジュゲーションの供給比が９：１である場合、２Ｃ６．９－ＴＬ００１の抗体軽鎖（ＬＣ）は、０～１つの毒素とコンジュゲートされ（ＬＣおよびＤＡＲ１の割合はそれぞれ７．５％および９２．５％である）、そして、重鎖（ＨＣ）は、０～４つの毒素とコンジュゲートされる（ＨＣ、ＤＡＲ１、ＤＡＲ２、ＤＡＲ３、およびＤＡＲ４の割合はそれぞれ２．５％、１０．２％、９．８％、７６．４％、および１．１％である）。したがって、毒素抗体比（ＤＡＲ）は、７．１２である。
ＴＬ００１と２Ｃ６．９－ｈｚ２１との間のコンジュゲーションの供給比が９：１である場合、コンジュゲーションおよびカチオンクロマトグラフィーの後、２Ｃ６．９－ＴＬ００１の軽鎖は、０～１つの毒素とコンジュゲートされ（ＬＣおよびＤＡＲ１の比率はそれぞれ１．５％および２４．０％であった）、そして、重鎖は、０～４つの毒素とコンジュゲートされる（ＨＣ、ＤＡＲ１、ＤＡＲ２、ＤＡＲ３、およびＤＡＲ４の比率はそれぞれ０．７％、２．１％、１４．３％、５４．５％、および２．８％であった）。得られた薬物抗体比（ＤＡＲ）は、７．４０と算出された。
２Ｃ６．９－ＴＬ００１のＡＤＣ分子構造を以下に示す：
Figure 0007407973000052
 式中、γは１～１０の整数であり、Ａは、２Ｃ６．９－ｈｚ２１である。
複合体をＳＥＣ－ＨＰＬＣによるＳＥＣ検出に供した。
クロマトグラフィー条件：
液体クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ、３００＊７．８ｍｍ、５μｍ；
移動相：９０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭのＮａＣｌ、５％アセトニトリル；
流速：０．８ｍＬ／分；検出波長：２８０ｎｍ；カラム温度：室温；試料室温度：８℃；
試料サイズ：４０μＬ；アイソクラティック操作：３０分。
２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）および２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）のＳＥＣクロマトグラムを図７～図８に示し、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）のＳＥＣクロマトグラムを図１３に示す。ＳＥＣの保持時間およびピーク面積比によると、主要なコンジュゲート生成物の分子量は約１５０ｋｄであり、すなわち、ＴＬ００１と２Ｃ６．９－ｈｚ２１とのコンジュゲーションによって得られた２Ｃ６．９－ＴＬ００１が、依然として抗体の全体構造を維持していることが確認される。
同じ調製方法を用いて、実施例４および５で調製したＴＬ００２およびＴＬ００３をヒト化モノクローナル抗体２Ｃ６．９とコンジュゲートして、２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３を調製した。調製および検出方法は上記の通りである。得られた２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３のＤＡＲ値は、それぞれ６．９５および７．０３である。
２Ｃ６．９－ＴＬ００２のＡＤＣ分子構造を以下に示す：
Figure 0007407973000053
 式中、γは１～１０の整数であり、Ａは２Ｃ６．９－ｈｚ２１である。
２Ｃ６．９－ＴＬ００３の分子構造を以下に示す：
Figure 0007407973000054
 式中、γは１～１０の整数であり、Ａは、２Ｃ６．９抗体である。
［実施例８］
２Ｃ６．９－ＴＬ００１の親和性の測定
細胞ベースのＥＬＩＳＡ法を実施して、細胞膜の表面上でのクローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の親和性を測定した。具体的な手順は以下の通りであった：Ｌ９２９－クローディン１８．２接着細胞株を２ｍＭのＥＤＴＡによって剥離し、２×１０５細胞／ｍＬまで再懸濁し、再懸濁液１００μＬを９６ウェルプレートに入れ、３７℃で一晩インキュベートした；翌日、培地を除去し、プレートをＰＢＳで１回洗浄した。１００μＬ／ウェルの４％ホルムアルデヒドを、室温で３０分間プレートに添加した；次いで、ホルムアルデヒドを除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳ（２％ＢＳＡを含有）を添加し、２時間インキュベートした；ブロッキング溶液を除去し、試験する２Ｃ６．９－ＴＬ００１を、ＰＢＳ（２％ＢＳＡを含有）で９．３７５μｇ／ｍＬから開始して４倍希釈して、合計９個の濃度に希釈し、次いで１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした；プレートを２５０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄し、毎回２分間静置した；ＰＢＳ（２％ＢＳＡ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＨＲＰ－抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：１００００の比で希釈し、希釈物を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした；２５０μＬのＰＢＳＴで６回洗浄した後、細胞を毎回２分間静置した；１００μＬのＴＭＢ発色性溶液（Ｔｈｅｒｍｏ）を対応するウェルに添加して、３７℃で２０分間発色させた；５０μＬの２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を添加して終了させ、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度値をマイクロプレートリーダー（ＭＤ）によって得て、その値をカーブフィッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートした。実験結果を図９に示し、細胞膜表面上でのクローディン１８．２に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の親和性のＥＣ５０値は３９．９４ｎｇ／ｍＬであった。抗体２Ｃ６．９－ｈｚ２１は、ＴＬ００１とコンジュゲートした後、依然として優れたクローディン１８．２親和性を有する。
［実施例９］
クローディン１８．２高発現腫瘍細胞株に対する２Ｃ６．９－ＡＤＣの殺傷活性の検出
クローディン１８．２高発現細胞株に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１の殺傷活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２およびＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１細胞を使用して検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった：実験の前日、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで希釈し、懸濁液を１００μＬ／ウェルで１×１０４細胞／ウェルでプレートに入れて一晩静置した；翌日、ＡＤＣ分子を、１５０μｇ／ｍＬ（ＤＡＲ：７．１２）または２６２．５μｇ／ｍＬ（ＤＡＲ：３．７９）から開始してＤＭＥＭ塩基性培地で４倍希釈して合計１１個の濃度とし、最終血清濃度が５％になるまで、希釈物を１ウェルあたり１００μＬで対応するウェルに添加した；細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４８時間インキュベートした；次いで、ＣＣＫ８（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ）を添加し（２０μＬ／ウェル）、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内に３７℃で０．５～２．５時間入れ、ＯＤ４５０ｎｍ吸光度値をマイクロプレートリーダー（ＭＤ）によって３０分ごとに得て、そして、値をカーブフィッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートした。
図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃに示すように、２Ｃ６．９－ＴＬ００１は、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を効果的に殺傷することができる。ＤＡＲ値が７．１２の場合、そのＥＣ５０値は４７３ｎｇ／ｍＬであり；ＤＡＲ値が３．７９の場合、そのＥＣ５０値は７９４．１ｎｇ／ｍＬである。一方、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８を殺傷するための２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）のＥＣ５０は３９００ｎｇ／ｍＬであり、そして、クローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）の殺傷活性は、クローディン１８．１細胞の場合の殺傷活性よりも有意に強く（約８倍差）、このことは、２Ｃ６．９－ＴＬ００１の殺傷効果がクローディン１８．２に特異的であることを示している。
ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２およびＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の殺傷活性を、上記と同じ実験方法によって検出した。図１０Ｄおよび図１０Ｅの実験結果は、２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３がＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を効果的に殺傷することができ、ＥＣ５０値がそれぞれ６２８．９ｎｇ／ｍＬおよび５４０．２ｎｇ／ｍＬであったこと；そして、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．１を殺傷するための２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３のＥＣ５０値が、それぞれ３０５９０ｎｇ／ｍＬおよび８２５８ｎｇ／ｍＬであったことを示している。ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の殺傷活性は、クローディン１８．１に対する殺傷活性よりも有意に強く、このことは、殺傷効果がクローディン１８．２特異的であることを示している。
［実施例１０］
内因的に発現されたクローディン１８．２細胞株に対する２Ｃ６．９－ＡＤＣの殺傷活性の検出
胃がん細胞株ＮＵＧＣ－４を選択して、内因的に発現されたクローディン１８．２細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００１の殺傷活性を検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった：実験の前日、細胞をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳで希釈し、懸濁液を１００μＬ／ウェルで１×１０４細胞／ウェルでプレートに入れて一晩静置した；翌日、２Ｃ６．９－ＴＬ００１を、１０００μｇ／ｍＬ（ＤＡＲ ７．１２）または１７５０μｇ／ｍＬ（ＤＡＲ：３．７９）から開始してＲＰＭＩ １６４０培地で３倍希釈して合計１１個の濃度とし、希釈物を１ウェルあたり１００μＬで対応するウェルに添加し、最終血清濃度は５％に達した；細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７２時間インキュベートした；次いで、ＣＣＫ８（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ）を２０μＬ／ウェルで添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で０．５～２．５時間インキュベートし、ＯＤ４５０ｎｍ吸光度値をマイクロプレートリーダー（ＭＤ）によって３０分ごとに得て、値をカーブフィッティングのためにＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにインポートした。実験結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示し；２Ｃ６．９－ＴＬ００１は、ＮＵＧＣ－４細胞を効果的に殺傷することができる；ＤＡＲ値が７．１２である場合、そのＥＣ５０値は２．３８３μｇ／ｍＬであり；ＤＡＲ値が３．７９である場合、そのＥＣ５０値は１０．０１μｇ／ｍＬである。
ＮＵＧＣ－４細胞に対する２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３の殺傷活性を、上記の方法と同様の実験方法によって検出した。ＡＤＣの初期濃度は５００μｇ／ｍＬであり、４倍希釈して、合計１１個の濃度である。図１１Ｃに示すように、２Ｃ６．９－ＴＬ００２および２Ｃ６．９－ＴＬ００３は、ＮＵＧＣ－４細胞を効果的に殺傷することができ、そして、ＥＣ５０値は、それぞれ５４．９２μｇ／ｍＬおよび１２３．９４μｇ／ｍＬである。
［実施例１１］
２Ｃ６．９－ｈｚ２１抗体内在化の検出
ＮＵＧＣ－４を選択して、抗体２Ｃ６．９の内在化活性を検出した。具体的な実験工程は以下の通りであった：ＮＵＧＣ－４細胞をトリプシンで消化し、計数し、ＰＢＳ（１％ＢＳＡを含有）に再懸濁し、細胞密度を３×１０６／ｍＬに調整した；１００μｇ／ｍＬの最終濃度で２Ｃ６．９－ｈｚ２１抗体を再懸濁した細胞１００μＬに添加し、アイソタイプのヒトＩｇＧを陰性対照として設定し、氷上で１時間インキュベートした；インキュベーション後、細胞を予冷ＰＢＳで３回洗浄し、ＮＵＧＣ－４細胞培養培地（１６４０＋１０％ ＦＢＳ）に再懸濁し、２つの部分に分けた：一方の部分を細胞インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートし（エンドサイトーシス群）、他方の部分を、氷上で４時間インキュベートした（親和性群）；インキュベーション後、細胞を予冷ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＰＢＳ（１％ＢＳＡを含有）に再懸濁し、抗ヒト蛍光二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした；インキュベーション後、細胞を予冷ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって検出を行い、抗体内在化比を以下の式に従って計算した：エンドサイトーシス（％）＝［１－（ＭＦＩ３７℃抗体群－ＭＦＩ３７℃対照群）／（ＭＦＩ氷上の抗体群－ＭＦＩ氷上の対照群）］×１００％。この実験結果は、ＮＵＧＣ－４細胞に対する２Ｃ６．９－ｈｚ２１の４時間の内在化比が３７．７９％であったことを示し、このことは、２Ｃ６．９－ｈｚ２１複合体が、細胞内に薬物を内在化し、腫瘍細胞を殺傷する可能性を有することを示している。
［実施例１２］
２Ｃ６．９－ＡＤＣのインビボ有効性の検出
がん細胞株由来異種移植片（ＣＤＸ）モデルおよび患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルを使用して、ＡＤＣ分子の抗腫瘍効果を評価する。
１２．１ ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２＋Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスＣＤＸモデル
ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁し、その後、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に５×１０６細胞／マウスの量（０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁）で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が７０～１００ｍｍ３に達したとき、マウスを、腫瘍体積によって無作為に群分けした（７匹のマウス／群）。群分けの日を０日目として記録し、そして、群を、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（略してＩｇＧ１）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）１ｍｇ／ｋｇ群および３ｍｇ／ｋｇ群、ならびに２Ｃ６．９－ＴＬ００２（ＤＡＲ：６．９５）１ｍｇ／ｋｇ群および３ｍｇ／ｋｇ群とした。すべての試料を週に２回、合計６回、尾静脈を介して注射した。
投与後、腫瘍径を週２回ノギスで測定し、腫瘍体積を以下の式に従って計算した：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａは腫瘍の長径、ｂは腫瘍の短径を示す）。死亡を観察し、毎日記録した。
下記式により腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）を算出し、抗腫瘍効果を評価した。
ＴＧＩ（％）＝［１－（ＶＴｅｎｄ－ＶＴｓｔａｒｔ）／（ＶＣｅｎｄ－ＶＣｓｔａｒｔ）］＊１００％
ここで、
ＶＴｅｎｄ：治療群における実験終了時の平均腫瘍体積
ＶＴｓｔａｒｔ：治療群における投与開始時の平均腫瘍体積
ＶＣｅｎｄ：陰性対照群における実験終了時の平均腫瘍体積
ＶＣｓｔａｒｔ：陰性対照群における投与開始時の平均腫瘍体積、である。
下記式により相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を算出し、抗腫瘍効果を評価した。
Ｔ／Ｃ（％）（腫瘍体積）＝（Ｔｔ／Ｔ０）／（Ｃｔ／Ｃ０）×１００％
ここで、
Ｔ０：初期（すなわち、Ｐ０）の治療群の平均腫瘍体積
Ｔｔ：各測定時の治療群の平均腫瘍体積
Ｃ０：初期（すなわち、Ｐ０）の陰性対照群の平均腫瘍体積
Ｃｔ：各測定時の陰性対照群の平均腫瘍体積、である。
実験結果を表８ならびに図１２Ａおよび図１２Ｂに示し、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）は、ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２胃がん移植腫瘍モデルの腫瘍増殖に対して用量依存的に有意な阻害効果を示した。陰性対照群と比較して、６回投与後（２１日目）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１ １ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は最大９６．０３％であり、そして、４匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示していた；一方、３ｍｇ／ｋｇ群では、ＴＧＩは１３３．５０％に達し、そして、３匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示し、４匹のマウスが完全な腫瘍退縮を示した。２Ｃ６．９－ＴＬ００２ ３ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩは４０．１１％であり、そして、１ｍｇ／ｋｇ群では明らかな抗腫瘍効果はなかった。観察期間中、すべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
Figure 0007407973000055
１２．２ ＣＤＸモデルにおける２Ｃ６．９－ＴＬ００１および２Ｃ６．９モノクローナル抗体＋化学療法のインビボ有効性の比較
ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２皮下移植腫瘍モデルを実施例１２．１に従って確立し、群分けした。群分けした日を０日目として記録した。各群は、それぞれヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（略してＩｇＧ１）、パクリタキセル群（アルブミン結合型）、パクリタキセルと組み合わせた２Ｃ６．９ｍＡｂ群、および２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）群であった。すべての試料を、週に２回、合計３週間、尾静脈を介して注射した。投与量を表９に示す。
実験結果を表９および図１２Ｃに示す。陰性対照群と比較して、３つの投与群のすべて、特に２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）群は、１１日間の薬物投与後に腫瘍増殖を有意に阻害することができる。２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は最大１２１．６８％であり、そして、７匹のマウスのうち６匹が部分的な腫瘍退縮を示す。
Figure 0007407973000056
２１日間の投与の後、陰性対照群と比較して、３つの投与群のすべてが腫瘍増殖を有意に阻害することができ、そして、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）群が最も有意であった。２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は最大１２５．７３％であり、そして、７匹のマウスのうち５匹が完全な腫瘍退縮を示し、２匹のマウスが部分的な腫瘍退縮を示した。実験結果を表１０および図１２Ｄに示す。
Figure 0007407973000057
１２．３ ＣＤＸモデルにおける異なるＤＡＲ値を有する２Ｃ６．９－ＴＬ００１のインビボ有効性の比較
ＮＵＧＣ－４細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培養培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁し、そして、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に５×１０６／マウスの細胞体積（０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁）で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約７０～１００ｍｍ３に達しとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした（７匹のマウス／群）。群分けの日を０日目として記録し、群をそれぞれヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（略してＩｇＧ１）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）５．２５ｍｇ／ｋｇ群、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：３．７９）１７．５ｍｇ／ｋｇ群、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）３ｍｇ／ｋｇ群、および２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．１２）１０ｍｇ／ｋｇ群とした（ＤＡＲ値が異なるＡＤＣ薬物を同じ毒素負荷量で設計投与量で投与した）。すべての試料を、週に２回、合計３週間、尾静脈を介して注射した。投与量を表１１に示した。
実験結果を表１１ならびに図１２Ｅおよび図１２Ｆに示す。同じ毒素負荷量では、高いＤＡＲ値（７．１２）を有する２Ｃ６．９－ＴＬ００１の有効性は、２１日間の薬物投与後に低いＤＡＲ値（３．７９）を有する２Ｃ６．９－ＴＬ００１の有効性と基本的に同等である。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
Figure 0007407973000058
１２．４ ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がんＧＡ０００６＋Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスＰＤＸモデル
ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）胃がん異種移植モデルＧＡ０００６（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔａｉｃａｎｇ）Ｉｎｃ．；５７歳の女性患者由来の高発現クローディン１８．２胃腫瘍）において、腫瘍担持マウスから腫瘍組織を採取し、それを３×３×３ｍｍの直径の小片に切断し、そして、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右前肩甲骨の皮下に接種した。平均腫瘍体積が約１５０～２５０ｍｍ３となったとき、マウスを腫瘍サイズによって３つの群（７匹のマウス／群）に無作為に分け、群分けの日を０日目として記録した。３つの群：ヒトＩｇＧ１ホモタイプ対照抗体（陰性対照）群（ＩｇＧ１ １０ｍｇ／ｋｇ）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１－ＤＡＲ７．１２ ３ｍｇ／ｋｇ群、および１０ｍｇ／ｋｇ群が存在した。すべての試料を週に２回、合計５回、尾静脈に注射した。薬物投与後、マウスの腫瘍体積および体重を観察し、実施例１２．１に記載の方法で定期的に測定した。
表１２ならびに図１２Ｇおよび図１２Ｈの実験結果は、２Ｃ６．９－ＴＬ００１－ＤＡＲ７．１２が、ＧＡ０００６胃がんＰＤＸモデルの腫瘍増殖に対して用量依存的に有意な阻害効果を有することを示している。陰性対照群と比較して、３ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は、５回投与後（１７日目）に最大９４．７２％であり、４匹のマウスの腫瘍は部分的に消失した；１０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩは１２４．４９％と高く、そして、７匹のマウスの腫瘍はすべて消失し、このことは、２Ｃ６．９－ＴＬ００１が腫瘍増殖を効果的に阻害できることを示している。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
Figure 0007407973000059
実験結果を表１３ならびに図１２Ｉおよび図１２Ｊに示す。投与後２４日目に、２Ｃ６．９－ＴＬ００１－ＤＡＲ７．１２は、ＧＡ０００６胃がんのＰＤＸモデルにおいて腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。陰性対照群と比較して、３ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は最大１０３．７６％であり、そして、６匹のマウスの腫瘍は部分的に退縮した。１０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩは１１３．７０％に達し、そして、７匹のマウスの腫瘍はすべて退縮した；このことは、２Ｃ６．９－ＴＬ００１が腫瘍増殖を効率的に阻害できることを示している。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
Figure 0007407973000060
１２．５ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスＣＤＸモデルにおけるＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２に対するインビボ有効性の評価
ＮＣＩ－Ｎ８７－クローディン１８．２皮下移植腫瘍モデルを、実施例１２．１の方法に従って確立した。平均腫瘍体積が約１４０ｍｍ３に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした（８匹のマウス／群）。群分けの日を０日目として記録し、各群をそれぞれヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（略してＩｇＧ１）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）０．３ｍｇ／ｋｇ群、１ｍｇ／ｋｇ群、および３ｍｇ／ｋｇ群とした。すべての試料を、週に２回、合計６回、尾静脈に注射し、投与量を表１４に示した。
結果を表１４ならびに図１２Ｋおよび図１２Ｌに示す。観察を休薬後３１日目まで延長すると、陰性対照群と比較して、２Ｃ６．９－ＴＬ００１ ０．３ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は３４．０４％であったが、１ｍｇ／ｋｇ群および３ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩはそれぞれ最大１２２．５７％（腫瘍の部分的退縮がすべてのマウスで観察された）、および、１８４．２２％（腫瘍の完全退縮が４匹のマウスで観察され、腫瘍の部分的退縮が４匹のマウスで観察された）であった。観察期間中にすべての治療群で有意な体重減少は見られず、動物に対する忍容性は高かった。
Figure 0007407973000061
１２．６ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスＣＤＸモデルにおけるＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２に対するインビボ有効性の評価
ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞（ヒト胎児腎臓細胞）を、３μｇ／ｍＬのピューロマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁し、そして、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に１×１０７／マウスの細胞体積（０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁）で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約１２０～１４０ｍｍ３に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした（８匹のマウス／群）。群分けの日を０日目として記録し、そして、各群をそれぞれヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（ＩｇＧ１と呼ぶ）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）０．３ｍｇ／ｋｇ群、１ｍｇ／ｋｇ群、および３ｍｇ／ｋｇ群とした。すべての試料を、週に２回、合計６回、尾静脈に注射し、投与量を表１５に示した。
結果を表１５ならびに図１２Ｍおよび図１２Ｎに示す。陰性対照群と比較して、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）は、ＨＥＫ２９３Ｔ－クローディン１８．２ヒト胎児腎臓細胞移植腫瘍モデルにおいて、６回の投与後（初回投与後２１日目）に腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。２Ｃ６．９－ＴＬ００１ ０．３ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）は７０．９９％（完全な腫瘍退縮が１匹のマウスで観察された）であったが、一方、１ｍｇ／ｋｇ群および３ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩはそれぞれ９４．９８％（部分的な腫瘍退縮が２匹のマウスで観察された）、および、１８２．８１％（部分的な腫瘍退縮が２匹のマウスで観察され、完全な腫瘍退縮が６匹のマウスで観察された）であった。
Figure 0007407973000062
１２．７ Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスＣＤＸモデルにおけるＮＵＧＣ－４に対するインビボ有効性の評価
ＮＵＧＣ－４細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。対数増殖期の細胞を回収し、ＰＢＳに再懸濁し、そして、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に５×１０６／マウスの細胞体積（０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁）で皮下接種し、皮下移植腫瘍モデルを確立した。平均腫瘍体積が約８０ｍｍ３に達したとき、マウスを腫瘍体積によって無作為に群分けした（８匹のマウス／群）。群分けの日を０日目として記録し、各群をそれぞれヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（陰性対照）群（ＩｇＧ１と呼ぶ）、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）３ｍｇ／ｋｇ群、および１０ｍｇ／ｋｇ群とした。すべての試料を、週に２回、合計６回、尾静脈に注射し、投与量を表１６に示した。
結果を表１６ならびに図１２Ｏおよび図１２Ｐに示す。陰性対照群と比較して、２Ｃ６．９－ＴＬ００１（ＤＡＲ：７．４０）は、ＮＵＧＣ－４胃がん移植腫瘍モデルにおいて、６回の投与後（初回投与後２１日目）に腫瘍増殖の有意かつ用量依存的な阻害を示した。２Ｃ６．９－ＴＬ００１ ３ｍｇ／ｋｇ群は５６．６２％の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）を示したが、一方、１０ｍｇ／ｋｇ群のＴＧＩは、９０．２８％であった（２匹のマウスで部分的な腫瘍退縮が観察された）。
Figure 0007407973000063
結論として、２Ｃ６．９－ＴＬ００１は、ＣＤＸモデルまたはＰＤＸモデルのいずれかにおいてクローディン１８．２陽性腫瘍の増殖を用量依存的に効果的に阻害することができ、使用するのに安全である。
本発明の実施形態を詳細に説明したが、当業者であれば、すべての開示の教示による助言に従って、詳細に対する修正および変更を行うことができ、これらのすべての変更点が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲およびその均等物によって与えられる。

Claims (24)

  1. 抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
    該複合体は、
    ここで、Ａは、ＶＨ（重鎖可変領域）及びＶＬ（軽鎖可変領域）を含む抗体であり、ここで、
    （ｉ）ＶＨは、配列番号１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２もしくは２１の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３を含み；そして、ＶＬは、配列番号４の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含み、または、
    （ｉｉ）ＶＨは、配列番号７の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８もしくは２２の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号９の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３を含み；そして、ＶＬは：配列番号１０の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１１の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１２の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含み、ここで、
    Ａは、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に特異的に結合する抗体であり；
    ここで、γは、１～１０の整数であり、そしてここで、
    （ｉ）が、ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義付けられる規定であり、そして、
    （ｉｉ）が、ＡｂＭナンバリングシステムにより定義付けられる規定である、
    ＡＤＣ。
  2. γが、１～８の整数である、請求項１に記載のＡＤＣ。
  3. Ａが、配列番号１４の配列を有するＶＨ、および、配列番号１５の配列を有するＶＬを含み、ここで、γが、１～１０の整数である、請求項１に記載のＡＤＣ。
  4. γが、１～８の整数である、請求項３に記載のＡＤＣ。
  5. 抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）であって、
    該複合体は、
    であり、
    ここで、Ａは、配列番号１９の重鎖配列、および、配列番号２０の軽鎖配列を含み、
    ここで、Ａは、１以上のチオール基を介して結合されて複合体を形成し、そして、γは、１～１０の整数であり；そしてここで、
    Ａは、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に特異的に結合する抗体である、
    ＡＤＣ。
  6. γが、１～８の整数である、請求項５に記載のＡＤＣ。
  7. Ａの各軽鎖が０～１で複合体化され、そして、Ａの各重鎖が０～４で複合体化され、そして次式で表される、
    （式中、＊は、Ａのシステインのチオール基との接合点である）
    請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＤＣ、及び、１以上の薬学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物。
  9. 薬物－抗体比（ＤＡＲ）が、３から８の値である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. ＤＡＲが、３．８の値である、請求項８に記載の医薬組成物。
  11. ＤＡＲが、７．１の値である、請求項８に記載の医薬組成物。
  12. ＤＡＲが、７．１２の値である、請求項８に記載の医薬組成物。
  13. ＤＡＲが、７．４の値である、請求項８に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を含む、がんを治療するための医薬組成物。
  15. がんを治療するための、請求項８～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  16. がんが固形がんである、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  17. がんが、食道がん、胃腸がん、胃腺がん、膵臓がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がん、頭頸部がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、胚細胞腫瘍、骨がん、皮膚がん、胸腺がん、胆管がん、胆嚢がん、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、神経膠芽腫、または白血病である、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  18. がんが、胃がんである、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  19. 胃がんが、胃食道接合部（ＧＥＪ）腺がんである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 胃がんが、食道がんである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. がんが、膵臓がんである、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
  22. 抗腫瘍活性を有する他の成分をさらに含む、１７～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 抗腫瘍活性を有する他の成分が、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン及びロイコボリンから選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 抗腫瘍活性を有する他の成分が、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン及びロイコボリンの組み合わせである、請求項２３に記載の医薬組成物。
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