JP7428663B2 - いくつかの多重抗原の標的用の逆ユニバーサルキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞ならびにその製造方法ならびに癌、感染症および自己免疫疾患を治療するためのその使用 - Google Patents

Description

本発明は、免疫細胞を基礎とする薬物療法ならびに癌、感染症および自己免疫疾患の治療においてその薬物療法を使用する方法に関する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原特異性および免疫受容体に由来する一つまたは複数のシグナリング鎖を提供する結合部位からなる人工的受容体である（Cartellieri et al., J.Biomed.Biotechnol. doi: 10.1155/2010/956304 (2010)）。これらの二つの主要なＣＡＲドメインは、細胞性形質膜内でＣＡＲを固定する膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖により接続される。免疫細胞、特にＴリンパ球およびＮＫリンパ球は、その形質細胞膜内に挿入されたＣＡＲを発現するために遺伝子改変することができる。このようなＣＡＲ改変免疫細胞は、ＣＡＲ結合部位の適切な標的を発現するかまたはその適切な標的で修飾されている他の細胞または組織構造に遭遇する場合、ＣＡＲ結合部位が標的抗原に結合する際に、ＣＡＲ改変免疫細胞は、この標的に架橋される。架橋は、ＣＡＲシグナリング鎖を介したシグナル経路の誘導を引き起こし、ＣＡＲグラフト免疫細胞の生物学的特性を変化させる。例えば、エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞内でのＣＡＲトリガリングは、溶解性化合物およびサイトカインの分泌のような典型的なエフェクター機能を活性化し、最終的にそれぞれの標的細胞の死滅を引き起こす。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作された免疫細胞の養子移入は、目下のところ、別の方法では不治の悪性疾患、感染性疾患または自己免疫疾患を治療するための極めて有望な治療オプションと見なされている。今までには、二つのＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞由来悪性腫瘍の治療のための販売承認を得ており、このアプローチの臨床的実現可能性が検証されている。

しかしながら、従来のＣＡＲ技術は、この治療様式を広く臨床的治療に適用することができる前に、解決する必要がある多くの重要な問題が伴う。第一に、いくつかの安全性の問題に取り組む必要がある。今までには、従来のＣＡＲで操作されたＴ細胞の免疫応答は、患者に注入した後に制御することが困難である。健康な組織での特に予期しない標的遺伝子発現は、健康な細胞に対する操作されたＴ細胞の急速で苛烈な免疫反応を誘発し、重篤な副作用を引き起こすことがある（Lamers et al. J.Clin.Oncol. 24 e20 - e22 (2006), Morgan et al. Mol.Ther. 18: p.843 - 851 (2010)）。臓器損傷は、ＣＡＲ結合ドメインと健康な組織に発現する抗原との予期しない交差反応により引き起こされることもある。このことは、多くの試験は初期段階にあるため、ＣＡＲ－Ｔ細胞については今までに報告されていないが、組換Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を用いた臨床試験では観察されている（Linette et al, Blood 2013, Morgan et al. J. Immunother. 2013）。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、新しいクラスの自己増殖型細胞薬であるので、注入されたＴ細胞は、腫瘍溶解症候群およびサイトカイン放出症候群を引き起こす重い腫瘍負担の存在で活発な拡大を被ることがある（Brudno and Kochenderfer, Blood 2016; Maude et al. Cancer J. 2014）。従来のＣＡＲ技術の他の欠点は、操作されたＴ細胞の再標的化が単一の抗原に限定されていることである。このような単一療法的アプローチは、治療の間に標的抗原を見失った腫瘍エスケープ変異体の発生についてのリスクを含意する。従来のＣＡＲ Ｔ細胞療法下での数ヶ月後の腫瘍エスケープ変異体の出現は、臨床試験ですでに観察されていた（Grupp et al. N.Engl.J.Med. 368: 1509 - 1518 (2013)）。まとめると、これらの妨害によりＣＡＲ－Ｔ細胞の適用は極めて僅かな適応症に限定される。実際に、臨床効果の例は、これまではＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞に限定されている。

Mardiros等は、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対するＣＤ１２３特異的キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を開示している（Mardiros et al. Blood 122: 3138-3148 (2014)）。インターロイキン３受容体α鎖（ＣＤ１２３）は、正常な造血幹細胞と比較して、ＡＭＬにおいて過剰発現しているため、潜在的な免疫療法の標的として記載されている。

Lee等は、多発性骨髄腫においてＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）と膜貫通アクチベーターとカルシウムモジュレーターとサイクロフィリンリガンド（ＴＡＣＩ）との二重標的化のための「増殖誘導リガンド」（ＡＰＲＩＬ）を基礎とするキメラ抗原受容体（ＡＣＡＲ）を開示している（Lee et al. Blood 131: 746-758 (2018)）。ＣＡＲ構築体内での使用のために、ＡＰＲＩＬの切断形が使用された（残基１１６～２５０）。

国際公開第２０１６１５４６２１号は、スイッチ上に存在するキメラ受容体結合パートナーと相互作用する非抗体細胞外ドメインを有する切替可能なキメラ受容体を開示している。このスイッチは、キメラ受容体結合パートナー、好ましくはタンパク質またはペプチド、さらに好ましくは抗体または抗体フラグメント、および標的部位を有する。

モジュール式の「ユニバーサル」ＣＡＲ－Ｔ（ＵｎｉＣＡＲ）アプローチは、抗原認識とＣＡＲの活性化ドメインとを二つの別々の操作ユニットに分離することにより、これらの制限を克服することができる。Ｔ細胞は、タグを認識するユニバーサル結合ドメインを有するＣＡＲを発現するように操作されている（Cartellieri et al. Blood cancer J. 2016; Rodgers et al. 2016 PNAS）。抗原特異性は、ユニバーサルＣＡＲによって認識されるタグに融合した抗原結合ドメインからなる可溶性アダプタータンパク質により提供される。

国際公開第２０１２０８２８４１号は、ユニバーサル抗タグキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞および細胞関連障害、例えば癌を治療する方法を開示している。

さらに、国際公開第２０１３０４４２２５号は、いくつかの多重項源を標的化するためにＴ細胞により発現されたユニバーサル免疫受容体を開示している。

どちらの方法も、ユニバーサル抗タグ免疫受容体を発現する改変Ｔ細胞の使用を記載している。これらのＴ細胞は、これらの表面抗原に結合し、それぞれのタグを担持するモジュールを付加的に適用することにより、疾患に関連する細胞表面抗原にリダイレクトすることができる。上述の方法から生じる問題は、外来性のタグを使用した遺伝子改変Ｔ細胞のリダイレクトが、免疫原性である可能性があり、これが患者を危険にさらしかつ治療の有効性に不利な影響を及ぼすことである。

国際公開第２０１７１１２７８４号は、Ｔ細胞用のユニバーサル免疫受容体内に、特にユニバーサル免疫受容体をコードする核酸配列内に使用するためのＳｐｙキャッチャーおよびＳｐｙタグ（ここで、このユニバーサル免疫受容体は、細胞外ヒンジ領域に結合したＳｐｙキャッチャーまたはＳｐｙタグ細胞外結合ドメインを有する）、膜貫通ドメインおよびＴ細胞受容体細胞内シグナリングドメイン、この核酸配列を有するベクターおよび細胞ならびにＳｐｙキャッチャーまたはＳｐｙタグを有する単離されたユニバーサル免疫受容体を記載している。

国際公開第２０１６０３０４１４号は、核タンパク質に基づく内因性タグを使用する安全でかつ効果的な方法において、いくつかの障害に対するリダイレクトを可能にする遺伝子改変免疫細胞を提供する。

Mitwasi等は、ジシアロガングリオシドＧＤ２陽性腫瘍細胞に対するＵｎｉＣＡＲ Ｔ細胞の再標的化のための新規標的モジュール（ＴＭ）を開示している（Mitwasi et al. Oncotarget 8: 108584-108603 (2017)）。ＧＤ２特異的ＴＭは、ＵｎｉＣＡＲエピトープＥ５Ｂ９をそれぞれの抗ＧＤ２ｓｃＦｖに融合することにより構築され、ここで、異なる配向（ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ）およびスペーサーペプチドが、インビトロおよびインビボで検査された。ＵｎｉＣＡＲは、抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、シグナリングドメインとを有する。

しかしながら、これらのＵｎｉＣＡＲ Ｔ細胞の結合部位は、依然として一本鎖フラグメント可変部（ｓｃＦｖ）であり、したがって活性結合ドメインである。このような活性結合ドメインは、いくつかの欠点を有する。第一に、これは未だに、ターゲットタグが健康組織に存在する場合に、オンターゲット／オフ腫瘍活性のリスクを有する。第二に、オフ腫瘍活性を引き起こし、深刻な組織損傷を誘導する可能性がある非標的細胞表面タンパク質に対する結合ドメインの交差反応性についての理論的リスクがある。最後に、ｓｃＦｖのコーディング配列はどちらかといえば長く、遺伝子操作細胞の製造のために不利である。

したがって、本発明の目的は、ＣＡＲ改変免疫細胞の交差反応のリスクを最小化し、コーディング配列をかなり短縮して、いくつかのＣＡＲ構築体を有する免疫細胞の遺伝子改変を可能にする、小細胞表面結合部位を用いた安全でかつ効果的な方法で、いくつかの障害に対するリダイレクトを可能にする遺伝子改変免疫細胞を提供することである。本発明の別の主題は、治療の長さおよび強度が、臨床的な要求に応じて簡単な方法で調節可能である、いくつかの細胞に関連する疾患を治療する方法を提供することである。

本発明は、多重抗原に対するＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞の再標的化を可能にする逆ユニバーサル、モジュール式キメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）系を提供する。この系は、多様な抗原を認識可能である免疫細胞を生成するために遺伝子治療プラットホームを使用し、かつ免疫細胞に基づく治療、特にＴ細胞およびＮＫ細胞に基づく治療を使用するために広範囲でかつ価値のある臨床的意味を有する。

第一の態様では、本発明は、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸配列を提供し、この受容体は、三つのドメインを有し、第一のドメインは、細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープタグであり、第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖であり、第三のドメインは、シグナル伝達ドメインであり、細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープは、線状または高次構造状のエピトープである。

本発明によるペプチドエピトープタグは、抗体またはリガンドであることができるタグ結合ドメインに非共有結合する。好ましくは、ペプチドエピトープタグは、１０～２０個のアミノ酸を有する。

特に適切な細胞表面ペプチドエピトープタグは、ヒトペプチド配列、特にヒト核タンパク質（つまりＬａタンパク質）に由来するペプチド配列、最も特別に自己免疫患者における自己抗体の標的ではないことが知られているペプチド配列（つまりＬａタンパク質の５Ｂ９エピトープ）であり、したがって、タグは逆ユニバーサルキメラ受容体の関係で免疫原性である見込みはない。

好ましくは、本発明による核酸は、配列番号２４～２７の配列の一つによる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸である。

より好ましくは、本発明による核酸は、配列番号１、８、１０または１２の配列である。

任意の第四のドメインは、ＲｅｖＣＡＲの細胞外部分内の短いペプチドリンカーであり、この第四のドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍａｂ）のための線状エピトープを形成する。この付加的ドメインは、ＲｅｖＣＡＲ系の機能にとって必要ではないが、本発明のための付加的な臨床的利益を付加されてよい。好ましくは、本発明は、本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸配列を提供し、この核酸配列は、人工的キメラ融合タンパク質をコードし、この核酸配列は、ｃＤＮＡとして提供される。

別の態様では、本発明は、特定のヒト細胞表面タンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部位と、本発明によるＲｅｖＣＡＲの細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープタグに特異的な結合部位とから構成されたアダプターモジュール（ＡｄＭｏ）を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明によるアダプターモジュールをコードする核酸を提供する。好ましくは、本発明は、本発明によるアダプターモジュールをコードする単離された核酸配列を提供し、この単離された核酸は、ｃＤＮＡとして提供される。

別の態様では、本発明は、三つのドメインを有する本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸を有する細胞を提供し、第一のドメインは、細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープタグであり、第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖であり、第三のドメインは、シグナル伝達ドメインである。

別の態様では、本発明は、それぞれ三つのドメインを有する本発明による二つまたはそれより多い逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸を有する細胞を提供し、第一のドメインは、細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープタグであり、第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖であり、第三のドメインは、シグナル伝達ドメインである。

別の態様では、本発明は、本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸を有するベクターを提供し、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体は、三つのドメインを有し、第一のドメインは、細胞表面結合ドメインとして機能するペプチドエピトープタグであり、第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインを含む連結ペプチド鎖であり、第三のドメインは、シグナル伝達ドメインである。

別の態様では、本発明は、本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸配列および本発明によるアダプターモジュールを有する本発明によるベクターならびに／または本発明によるアダプターモジュールをコードする単離された核酸配列をコードするベクターを有するキットを提供する。

本発明は、さらに、薬学的に許容される希釈剤または担体との関連で本発明による細胞およびアダプターモジュールを含む医薬組成物を含む。好ましくは、医薬組成物は、静脈内投与のために適した形態で存在する。

好ましくは、組成物は、本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸および本発明によるアダプターモジュールを有する細胞を有する。

本発明による医薬組成物は、多様な投与形態を有する。医薬組成物は、好ましくは、腸管外に、特に好ましくは静脈内に投与される。本発明の一実施形態では、腸管外医薬組成物は、注射のために適した投与形態で存在する。したがって、特に好ましい組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤または担体中に存在する細胞およびアダプターモジュールの溶液、エマルションまたは懸濁液である。

担体として、好ましくは水、緩衝水、０．９％食塩水、グリシン溶液および同様の溶媒が使用される。これらの溶液は滅菌されている。医薬組成物は、従来から周知の技術により滅菌される。組成物は、好ましくは、例えば、ほぼ生理学的条件を提供するためおよび／またはアダプターモジュールの安定性を高めるために必要な薬学的に許容可能な付形剤、例えば、好ましくは酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムおよびヒスチジンから選択されるｐＨ値を調節するための薬剤および緩衝剤を含む。調製物中での本発明によるアダプターモジュールの濃度は、適用に応じて可変である；この濃度は、好ましくは０．０１質量％未満で、好ましくは少なくとも０．１質量％、さらに好ましくは１～５質量％であり、この濃度は、主として、流体体積、粘度などに基づいて、またはそれぞれの投与モードに応じて選択される。

医薬組成物は、滅菌されていて、かつ製造条件および貯蔵条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液として、リポソーム内で、またはこの目的に適していてかつ当業者に公知の他の秩序構造で調製することができる。

本発明による細胞およびアダプターモジュールは、好ましくは腸管外投与のために適した組成物内に導入される。好ましくは、医薬組成物は、ＡｄＭｏ １ｎｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくはアダプターモジュール５ｎｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍｌを、殊に緩衝液１～５００ｍｍｏｌ／ｌ（ｍＭ）、特に好ましくは５～２０ｍＭと一緒に含む注射可能な緩衝溶液である。注射可能な溶液は、液体の形態で存在することができる。緩衝液は、好ましくは、５．０～７．０のｐＨ値で（特に好ましくは６．０のｐＨで）、ヒスチジン（好ましくは１～５０ｍＭ、特に好ましくは５～２０ｍＭ）であることができる。

他の適した緩衝液は、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、塩化ナトリウム０～３００ｍＭ、特に好ましくは１５０ｍＭが、液状の投与形態のために使用される。液状の投与形態内で、安定剤は、好ましくは使用され、好ましくはポリソルベート８０ ０．０００１％（ｗ／ｖ）～１％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）～０．１％（ｗ／ｖ）が使用される。

一日当たりの患者あたりに供給される典型的な用量は、一日または一週間当たり一回以上、または数週間までの期間にわたり連続的に投与される用量で、１ｎｇ～１０００ｍｇ、好ましくは３ｎｇ～３ｍｇである。

別の態様では、本発明は、本発明によるユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸および哺乳類におけるユニバーサルキメラ抗原受容体により媒介される免疫応答を刺激するための本発明によるアダプターモジュールを有する本発明による細胞の使用を提供する。好ましくは、本発明は、薬物として、より好ましくは癌または自己免疫疾患の治療のための薬物としての、本発明による逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸と、本発明によるアダプターモジュールとを有する本発明による細胞の使用を提供する。自己免疫疾患は、通常では体内に存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答（自己免疫）から生じる。

本発明は、さらに、癌または自己免疫疾患の場合の治療的および／または診断的使用のための薬物を調製するための、本発明による細胞およびアダプターモジュールの使用を含む。

本発明は、また、本発明による細胞およびアダプターモジュールの投与による、癌、感染症、炎症または自己免疫疾患を有するヒトの治療方法を含む。

治療的用途のために、本発明による細胞およびアダプターモジュールの薬理学的有効量を含む滅菌医薬組成物が、上述の疾病を治療するために患者に投与される。

逆ユニバーサルキメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）の概略図を示す。 抗原特異的免疫細胞再標的化のための、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）プラットホームの概略図を示す。 白血病で一般的に発現する抗原であるＣＤ１２３にそれぞれ特異的に結合する二つのアダプターモジュールの概略図を示す。 ＣＤ１２３を発現するＯＣＩ－ＡＭＬ３芽球に関する結合アッセイにより決定されるような標的抗原ＣＤ１２３に対しての（Ａ）、およびそれぞれＬａ５Ｂ９タグかＬａ７Ｂ６タグのどちらかである、それらのＲｅｖＣＡＲタグに対しての（Ｂ）二つのＣＤ１２３特異的アダプターモジュールの親和性を示す。 Ｌａ５Ｂ９タグ（Ａ）またはＬａ７Ｂ６タグ（Ｂ）のいずれかを収容するＲｅｖＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたヒト初代Ｔ細胞による、ＣＤ１２３－陽性ＡＭＬ芽球の特異的な溶解を示す。 レンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１の概略マップを示す。 レンチウイルスにパッケージされたプラスミドｐｓＰＡＸ２の概略マップを示す。 エンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇの概略マップを示す。 レンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞の細胞表面上のＲｅｖＣＡＲ構築物１～４についての細胞１つ当たりの分子数を示す。

本発明を、以下の図面および実施態様を用いてより詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。

図１は、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）の概略図を示す。ＬＰは、小胞体内への移動および細胞膜への輸送のためのリーダーペプチド；ＰＥは、ＲｅｖＣＡＲの受動的結合ドメインとしてのペプチドエピトープ；ＰＬは、認識および／または精製のための任意の第四のドメイン；ＥＣＤは、ヒンジドメインとしての細胞外ドメイン；ＴＭは、膜貫通ドメイン；ＩＣＤ１およびＩＣＤ２は、単一のドメインまたは二つまたは多数のドメインからなることができる細胞内シグナリングドメインである。

図２は、抗原特異的免疫細胞再標的化のための、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）プラットホームの概略図を示す。この例では、免疫細胞は、Ｔ細胞（Ｔ）である。ＡｄＭｏは、この例では二つの一本鎖フラグメント変異体から構築されたアダプター分子；ＰＥは、ＲｅｖＣＡＲの受動的結合ドメインとしてのペプチドエピトープ；ＲｅｖＣＡＲは、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体；ＴＣＲは、内因性Ｔ細胞受容体である。

図３は、白血病で一般的に発現する抗原であるＣＤ１２３にそれぞれ特異的に結合する二つのアダプターモジュールの概略図を示す。これらのアダプター分子は、Ｌａ５Ｂ９エピトープタグ（ＡｄＭｏＣＤ１２３－Ｌａ５Ｂ９）を収容するかまたはＬａ７Ｂ６タグ（ＡｄＭｏＣＤ１２３－Ｌａ７Ｂ６）を収容するＲｅｖＣＡＲを補充することができるように構築されている。

図４は、ＣＤ１２３を発現するＯＣＩ－ＡＭＬ３芽球に関する結合アッセイにより決定されるような標的抗原ＣＤ１２３に対しての（Ａ）、およびそれぞれＬａ５Ｂ９タグかＬａ７Ｂ６タグのどちらかである、それらのＲｅｖＣＡＲタグに対しての（Ｂ）二つのＣＤ１２３特異的アダプターモジュールの親和性を示す。

図５は、Ｌａ５Ｂ９タグ（Ａ）またはＬａ７Ｂ６タグ（Ｂ）のいずれかを収容するＲｅｖＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたヒト初代Ｔ細胞による、ＣＤ１２３－陽性ＡＭＬ芽球の特異的な溶解を示す。特異的溶解は、Ｌａ５Ｂ９タグ（ＡｄＭｏＣＤ１２３－Ｌａ５Ｂ９）またはＬａ７Ｂ６タグ（ＡｄＭｏＣＤ１２３－Ｌａ７Ｂ６）のいずれかを認識する、対応するＣＤ１２３特異的アダプターモジュールの存在での濃度依存法で誘導される。

図６は、レンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１の概略マップを示す。

図７は、レンチウイルスにパッケージされたプラスミドｐｓＰＡＸ２の概略マップを示す。

図８は、エンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇの概略マップを示す。

図９は、レンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞の細胞表面上のＲｅｖＣＡＲ構築物１～４についての細胞１つ当たりの分子数をまとめたものである。分子数は、モノクローナル抗Ｌａ抗体５Ｂ９または７Ｂ６をそれぞれ用いるＱＩＦＩＫＩＴ（Agilent, Santa Clara, CA, USA）を使用して定量化された。

エフェクター細胞
本発明の方法で使用されるエフェクター細胞は、治療される疾患および治療を行うために有効な方法に依存した選択で、自己由来、同系または異系であってよい。この方法で使用することができるエレクター細胞の適切な集団は、細胞溶解活性、食細胞活性または免疫抑制活性を有する任意の免疫細胞、例えば制御性Ｔ細胞を含むＴ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージを含む。一形態では、エフェクター細胞は、特定のＨＬＡバッググラウンドに由来し、自己または同種系内で利用される。エフェクター細胞は、治療される被験者の腫瘍外植体または治療される被験者の腫瘍内細胞を含めた任意の供給源から単離することができる。一実施態様では、エフェクター細胞は、ＲｅｖＣＡＲを発現するためのそれぞれの細胞の遺伝子操作の前または後に、多能性または多分化能性の幹細胞または原始細胞からのインビトロ分化により生成されてよい。以後、「エフェクター細胞」という用語は、その細胞表面上にＲｅｖＣＡＲを発現するように遺伝子改変された任意の種類の上述の免疫細胞を指す。

逆ユニバーサルキメラ抗原受容体（ＲｅｖＣＡＲ）
本発明の方法で使用されるエフェクター細部により発現されるＲｅｖＣＡＲは、抗原特異的な方法で、ＲｅｖＣＡＲを発現する免疫細胞の、モジュール式で、極めてフレキシブルでかつ厳密に制御可能な再標的化を可能にする。この方法で使用されるＲｅｖＣＡＲのための唯一の要件は、（ｉ）その細胞表面ペプチドエピトープタグを介してＲｅｖＣＡＲが、アダプターモジュールに接合することができる特別なタグ結合部位に対して結合特異性を有し、標的細胞の細胞表面タンパク質または細胞外構造に次々に結合すること、および（ｉｉ）免疫細胞がＲｅｖＣＡＲを発現するように操作することができることである。

ＲｅｖＣＡＲは、図１の三つのドメインを有する。第一のドメインは、細胞表面ペプチドエピトープタグである。この細胞表面ペプチドエピトープタグは、典型的には、ＲｅｖＣＡＲを有するポリペプチドのアミノ末端に存在する。細胞表面ペプチドエピトープタグがアミノ末端に配置されることにより、細胞表面ペプチドエピトープタグは、標的細胞と結合するアダプターモジュールに妨げなくアクセスすることが許容される。細胞表面ペプチドエピトープタグは、典型的には、線状ペプチドエピトープである。

好ましい実施態様では、細胞表面ペプチドエピトープタグは、ヒトタンパク質に由来する短い線状ペプチドエピトープである。

より好ましい実施態様では、細胞表面ペプチドエピトープタグは、ヒト核タンパク質に由来する短い線状ペプチドエピトープである。

好ましくは、ペプチドエピトープタグをコードする核酸は、配列番号２８または２９の配列によるペプチドエピトープタグをコードする核酸であり、より好ましくは、ペプチドエピトープタグをコードする核酸は、配列番号３または１１の配列による核酸である。

最も好ましい実施態様では、細胞表面ペプチドエピトープタグは、ヒト核Ｌａタンパク質に由来する短い線状ペプチドエピトープである。好ましくは、このタグは、ヒトＬａエピトープＥ５Ｂ９またはＥ７Ｂ６から選択される。ＲｅｖＣＡＲ系内でのＥ５Ｂ９およびＥ７Ｂ６Ｌａエピトープの使用は、抗Ｅ５Ｂ９および抗Ｅ７Ｂ６ｓｃＦｖｓが、通常の生理学的条件下で細胞の表面に結合した天然Ｌａタンパク質と相互作用せず、かつこれらのエピトープに対する自己抗体は、しばしばＬａタンパク質に対する自己抗体を有することが報告されている自己免疫患者で観察されていないという事実のために有利である。

ＲｅｖＣＡＲの第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通（ＴＭ）ドメインである。ヒンジドメインは、ＲｅｖＣＡＲが、その対応するｓｃＦｖと最適に結合するために、エフェクター細胞の表面から突出することを可能にする。ＴＭドメインは、ＲｅｖＣＡＲをエフェクター細胞の細胞膜に固定する。例示的なヒンジおよびＴＭドメインは、ヒトＣＤ２８分子のヒンジおよび膜貫通領域、ＣＤ８ａ鎖、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）のようなＮＫ細胞受容体、ＤＡＰ１２または抗体の定常領域の一部、ならびに多様なヒンジとＴＭドメインとの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。

別の実施態様では、ヒンジおよび膜貫通領域は、ヒトＣＤ２８分子のヒンジおよび膜貫通領域、ＣＤ８ａ鎖、ＮＫ細胞受容体、好ましくはナチュラルキラーグループＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体または抗体の定常領域の一部、ならびにそれらの異なるヒンジと膜貫通ドメインとの組合せから選択され、ヒンジ領域は、細胞外領域の一部である。

第三のドメインは、存在する場合、シグナル伝達ドメインである。このドメインは、エフェクター細胞が、細胞または細胞外構造に架橋する際に、細胞シグナルを、ＲｅｖＣＡＲを担持するエフェクター細胞内に伝達する。エフェクター細胞と標的細胞との間の架橋は、（ｉ）標的細胞または標的細胞外構造上の特別な結合部位に結合しかつＲｅｖＣＡＲ結合部位を担持するアダプターモジュール、ならびに（ｉｉ）アダプターモジュールにより認識および結合されることができるペプチドエピトープタグを提示するエフェクター細胞の表面上に発現したＲｅｖＣＡＲの存在に依存してかつこれらにより媒介される。エフェクター細胞の活性化は、サイトカインまたはケモカインの誘導ならびにエフェクター細胞の細胞溶解活性、食細胞活性または抑制活性の活性化を含む。例示的なエフェクター細胞シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の生存および増殖を高めるＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７の細胞質領域；プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）および細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）のような抑制受容体、ならびにＴ細胞およびＮＫ細胞活性化を誘導するＣＤ３鎖（例えばＣＤ３ゼータ）、ＤＡＰ１２およびＦｃ受容体の細胞質領域を含むが、これらに限定されるものではない。二つ、三つ、四つまたはそれより多くの免疫細胞活性化ドメインまたは同時刺激ドメインのような、一つまたは一つより多くのシグナル伝達ドメインがＲｅｖＣＡＲ内に含まれていてよい。

別の実施態様では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７の細胞質領域、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）ならびにＣＤ３鎖、ＤＡＰ１２およびＴ細胞活性化を誘導するＦｃ受容体の細胞質領域から選択され、シグナル伝達ドメインおよび細胞質領域は、シグナリングドメインである。

別の実施態様では、ＲｅｖＣＡＲは、ＲｅｖＣＡＲの細胞外部分内の短いペプチドリンカーである第四のドメインを有する（図１）。この機能性のためには、この第四のドメインが線状エピトープを形成し、それが適正な親和性を有する特定のモノクローナル抗体の結合を可能にすることが必要である。一つまたは一つより多くの線状エピトープは、第四のドメイン内に含まれていてよく、これらは、タグ結合ドメイン内のリンカーとして、タグ結合ドメインと細胞外リンカーとの間に位置していてよいかまたは細胞外ヒンジドメインの不可欠部分であってよい。任意の第四のドメインの補助により、ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞を特異的に刺激することができるので、ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞は、優先的に増殖し、インビボまたはインビトロのいずれかで非グラフト免疫細胞と比べて長く持続する。第四のドメインは、混合された細胞集団からＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞を精製するために使用されてもよい。これは、ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞が媒介する免疫応答を弱めかつインビボでＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞を排除するために使用されてもよい。

エフェクター細胞の細胞表面での発現を可能にするために、シグナルペプチド（しばしば、シグナル配列、ターゲッティングシグナル、またはリーダーペプチドとも言われる）は、細胞外結合ドメインとして機能するペプチドエピトープの前方で、そのＮ末端をコードするＲｅｖＣＡＲ核酸配列の５′末端に置かれる。シグナルペプチドは、同時翻訳または翻訳後のいずれかで分泌経路にタンパク質を標的とする。この目的のために、多様な種類のタンパク質に由来するシグナルペプチドを利用することができるが、好ましくは、ＣＤ２８、ＣＤ８アルファ、ＩＬ－２またはヒト由来の抗体の重鎖または軽鎖のようなタンパク質に由来するリーダーペプチドが、免疫原性反応を避けるために使用される。

アダプターモジュール
アダプターモジュールは、特定のヒト表面タンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部位と、本発明によるＲｅｖＣＡＲ受容体の細胞表面ペプチドエピトープに結合する結合部位とから構築される。アダプターモジュールは、ＲｅｖＣＡＲ発現エフェクター細胞の投与前、投与と同時、または投与後に被験者に投与される。あるいは、ＲｅｖＣＡＲ発現エフェクター細胞は、レシピエントに注入する前に、アダプターモジュールで装飾されていてよい。アダプターモジュールの潜在的結合部位は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２３、ＣＤ２６９（Ｂ細胞成熟抗原、ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９およびＣＤ３６６のような表面抗原に結合する抗体またはその抗体のフラグメント、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバー（ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４およびそれらの変異体）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、エフリン受容体ファミリーのメンバー（ＥｐｈＡ１－１０、ＥｐｈＢ１－６）、いわゆる前立腺特異的抗原（例えば前立腺幹細胞抗原ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原ＰＳＭＡ）、胚性抗原（例えば癌胚性抗原ＣＥＡ、胎児アセチルコリン受容体）、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバー（ＶＥＧＦＲ１－３）、上皮細胞接着分子ＥｐＣＡＭ、アルファフェトプロテインＡＦＰ、ムチンタンパク質ファミリーのメンバー（例えばＭＵＣ１、ＭＵＣ１６）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、葉酸結合タンパク質ＦＢＰ、ａ－葉酸受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、サイトカイン受容体［例えばＩＬ－８Ｒα（ＣＸＣＲ１）、ＩＬ－８Ｒβ（ＣＸＣＲ２）、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１１Ｒβ、ＩＬ－１３Ｒα１および２、ＣＸＣＲ４］、上皮糖タンパク質ファミリーのメンバー（例えばＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４）、ジアシアロガングリオシド（例えばＧＤ２、ＧＤ３）、炭酸脱水酵素ファミリーのメンバー（例えばＣＡＩＸ）、炭水化物抗原ファミリーのメンバー（例えばＬｅｙ）、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばデルタ様１および４）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、糖タンパク質Ａ３３、および腫瘍特異的グリカン［例えばセリンまたはスレオニン連結Ｎアセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはシアリル－Ｔｎのような誘導体］（上述のタンパク質およびタンパク質ファミリーの変異体を含む）を含むが、これらに限定されるものではない。さらに、アダプターモジュールの結合部位は、Ｌａ／ＳＳＢ抗原のような細胞質抗原または核抗原、ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのメンバー、高移動度タンパク質のメンバーなどに結合する抗体またはその抗体のフラグメントを含むが、これらに限定されるものではない。同様に、アダプターモジュールの結合部位は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖またはガンマ鎖およびデルタ鎖またはそれらのフラグメントから構成されていることができる。このようなＴＣＲ由来の結合部位は、ヒト白血球抗原クラス（ＨＬＡ）ＩおよびＩＩタンパク質複合体により提示されるペプチドを認識しかつそのペプチドに結合する。例は、ＥＧＦＲファミリー、サバイビン、ｓｒｙ様高移動度ｂｏｘ（ＳＯＸ）タンパク質ファミリー、メラノーマ関連抗原（例えば自己免疫原性癌／精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１）、メラノーマ抗原ファミリーＡのメンバー（ＭＡＧＥＡ）、メラノーマにおいて優先的に発現する抗原（ＰＲＡＭＥ）、および白血病関連抗原（例えばウィルムス腫瘍遺伝子１ＷＴ１）のようなタンパク質に由来するペプチドに特異的なＴＣＲであるが、これらに限定されるものではない。アダプターモジュールの結合部位は、タンパク質およびタンパク質複合体に対するリガンド、さらに受容体、またはその受容体のフラグメントとも言われるものを含むこともできる。このようなリガンドは、サイトカイン受容体（例えばＩＬ－１３受容体）、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、ＥＧＦＲファミリーメンバーに対するリガンド、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）またはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）のようなチェックポイント分子のリガンド、または自己反応性ＴＣＲに結合してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、標的結合部位は、化学反応（つまりクリックケミストリー）を介してタグ結合部位に融合される化学合成されたペプチド誘導体であることもできる。好ましい実施態様では、膜受容体に対する結合特異性を有するペプチドは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２３、ＣＤ２６９、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９およびＣＤ３６６、インターロイキン受容体、特に好ましくはＩＬ－８Ｒα（ＣＸＣＲ１）、ＩＬ－８Ｒβ（ＣＸＣＲ２）、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１１Ｒβ、ＩＬ－１３Ｒα１および２、ＣＸＣＲ４；ｃ－Ｍｅｔ、形質転換成長因子β受容体、ｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４およびこれらの変異体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、エフリン受容体、特に好ましくはＥｐｈＡ１－１０、ＥｐｈＡ５またはＥｐｈＢ１－６；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、胎児アセチルコリン受容体、腫瘍胎児抗原、腫瘍特異的グリカン［例えばセリンまたはスレオニン連結Ｎアセチルガラクトサミン（Ｔｎ）またはシアリル－Ｔｎのような誘導体］；ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３、ニューロピリン－１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ムチン、特に好ましくはＭＵＣ１、ＭＵＣ１６またはＭＵＣ１８；卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、葉酸受容体、ＮＫＧ２Ｄ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子、特に好ましくはＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子Ａ（ＭＩＣＡ）またはＢ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＰＢ）１、ＵＬＰＢ２、ＵＬＰＢ３、リボ核酸搬出１（Ｒａｅ－１）ファミリーメンバーまたは組織適合性６０（Ｈ－６０）；シャペロンおよびヒートショックタンパク質、特に好ましくはヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）９０または７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）；ＥＧＰ－２またはＥＧＰ－４、ジアシアロガングリオシド２（ＧＤ２）またはＧＤ３、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸ）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体、アポトーシス抗原１（ＡＰＯ－１、Ｆａｓ、ＣＤ９５）、ケラチンファミリーまたはインテグリンのメンバー、特に好ましくはａｖβ３またはａｖβ５、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮまたは神経／グリア抗原２（ＮＧ２）から選択される膜受容体に対する結合特異性を有する。

アダプターモジュールの結合部位は、単一抗原特異性（単一特異的）、二つ、三つまたはそれより多くの抗原特異性（二重および多重特異的）を有してよい。二重および多重特異的抗原特異性の例は、ＰＳＣＡとＰＳＭＡ抗原、ＣＤ１９とＣＤ２０抗原、ＣＤ１９とＣＤ２０とＣＤ２２抗原、ＣＤ３３とＣＤ１２３抗原、ＣＤ３３とＣＤ９９、ＣＤ３３とＴＩＭ－３、ＥｒｂＢ－１と－２、ＰＳＣＡとＥｒｂＢ－２、ならびに他の組合せと結合するアダプターモジュールを含むが、これらに限定されるものではない。二重および多重特異的抗原特異性の好ましい例は、ＰＳＣＡとＰＳＭＡ、ＣＤ１９とＣＤ２０、ＣＤ１９とＣＤ２２、ＣＤ１９とＣＤ２０とＣＤ２２、ＣＤ１９とＣＤ１２３、ＣＤ３３とＣＤ１２３、ＣＤ３３とＣＤ９９、ＣＤ３３とＴＩＭ－３、ＥｒｂＢ－１と－２、ＰＳＣＡとＥｒｂＢ－２、ＩＬ－１３Ｒα２とＥｒｂＢ－２、ＣＤ３８とＣＤ２６９とに結合するアダプターモジュールを含む。アダプターモジュールの結合部位は、一価結合ならびに二価または多価結合サイトを含んでいてもよい。二価または多価標的化ストラテジーの例は、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、ＣＤ１９およびＣＤ３３の異なるエピトープを認識する二つのｓｃＦｖ、およびＥｒｂＢ１受容体の異なるエピトープを認識するリガンドｓｃＦｖの組合せを組み込んだアダプターモジュールを含むが、これらに限定されるものではない。

アダプターモジュールは、付加的に、さらにペイロードとも言われる標的抗原結合に関与しないリガンドを担持していてもよい。このようなペイロードは、アダプターモジュールのＮ末端またはＣ末端に融合された同時刺激リガンドまたはサイトカイン、特にＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、およびＣＤ２７の細胞外ドメイン、ならびに全てが異なる種類の免疫細胞を刺激するＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、およびＩＬ－２１を含んでよいが、これらに限定されるものではない。他のペイロードは、標的のおよび隣接する細胞内で細胞死を誘導する放射性核種または化合物であってよい。

本発明の実施態様では、ＲｅｖＣＡＲ受容体の細胞表面ペプチドエピトープタグは、定義されたタグである。タグの同一性は、対応するアダプターモジュールの結合ドメインの同一性によってのみ制限される。タグは、抗体または他の結合ドメインが利用可能な任意の構造に由来することができる。タグに特異的な抗体は、任意の種類の動物から、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌまたはネコのような哺乳類から得られてよい。好ましくは、抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む、使用することができる抗体の特別なクラスに関する制限はない。抗体フラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生産されたフラグメントを含むが、抗体フラグメントが、選択されたタグに結合する能力を保持することが唯一の制限である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であってもよく、例えば、非ヒト抗体の抗原結合領域（例えばＦ（ａｂ′）２または超過変性領域）は、実質的にヒト分子を生産するために、組換ＤＮＡ技術によりヒト抗体のフレームワーク内に形質導入されるようなものであってよい。ｓｃＦｖのような抗原結合フラグメントは、それらから生産されてよい。選択されたタグに対する抗体は、特定のタンパク質、またはこのタンパク質の免疫原性特性を保持する任意の部分、フラグメントまたはオリゴペプチドの注入によるヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトを含む多様なホストの免疫化により生産されてよいが、これらに制限されるものではない。

ホストの種類に応じて、多様なアジュバントは、免疫応答を高めるために使用することができる。このようなアジュバントは、Ｅ．コリ（E.coli）からの無毒化された非耐熱トキシン、フロイント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、およびリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質を含むが、これらに限定されるものではない。ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウムパルブムも、潜在的に有用なアジュバントである。抗体およびその抗体のフラグメントは、モノクローナル抗体産生のための培養内の連続細胞系によるような、抗体分子の生産を提供する任意の技術を使用して作製することができる。このような技術は、KoehlerおよびMilsteinにより最初に記載されたハイブリドーマ技術（Nature 256:495-497 (1975)）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et al., Proc Natl. Acad. Sci 80:2026-2030 (1983)）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96 (1985)）を含むが、これらに限定されるものではない。「キメラ抗体」の産生のために開発された技術、つまり適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るための、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングも使用することができる（Morrison et al., Proc Natl. Acad. Sci 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)）。あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された技術を、タグ特異的一本鎖抗体の産生に適合させることができる。

一態様では、タグ結合ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、典型的には５～約２５個のアミノ酸の短いペプチドを介して連結される抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域を有する。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆に接続することができる。

好ましい実施態様では、ＲｅｖＣＡＲ受容体の細胞表面ペプチドエピトープタグ（タグ）は、ヒト核Ｌａタンパク質に由来する短い線状エピトープである。アダプターモジュールのタグ結合ドメインは、抗体または抗体由来の抗原結合フラグメント、例えばそれぞれのＬａエピトープに結合する一本鎖フラグメント可変部（ｓｃＦｖ）を構成してよい。

好ましくは、タグは、ヒトＬａエピトープＥ５Ｂ９またはＥ７Ｂ６から選択される。

哺乳類における逆ユニバーサルキメラ抗原受容体により媒介される免疫応答を刺激するための方法は、以下の工程を有する：
－ 一つまたはより多くの逆ユニバーサルキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたエフェクター細胞の有効量を哺乳類に投与し、ここで、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体は、三つのドメインを有し、第一のドメインは、ペプチドエピトープタグであり、第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインであり、第三のドメインは、シグナル伝達ドメインであり、タグは、可溶性アダプターモジュールを作製するために適した結合ドメインにより認識される（図２）。

－ 特定のヒト細胞表面タンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部位および結合ドメインを有する一つまたはより多くのアダプターモジュールを投与し、ここで、後者の結合ドメインは、ＲｅｖＣＡＲの細胞表面ペプチドエピトープタグを認識する（図２）。
ここで、アダプターモジュールは、逆ユニバーサルキメラ抗原受容体発現エフェクター細胞の投与前、投与と同時、または投与後に被験者に投与される。

好ましい実施態様では、エフェクター細胞およびアダプターモジュールは、ヒトに投与される。

ＲｅｖＣＡＲエフェクター細胞生産
本発明の実施態様では、免疫細胞は、多様な方法によりＲｅｖＣＡＲを発現するように遺伝子操作されてよい。一般に、ＲｅｖＣＡＲをコードするポリヌクレオチドベクターおよび遺伝子操作された免疫細胞内でのその発現を確実にするために必要な全ての要素が、細胞内に移入される。ベクターの移入は、以下に限定されるものではないが、核酸のエレクトロポレーションもしくはトランスフェクションによるか、または以下に限定されるものではないが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、フォーミーウイルスまたはレンチウイルスのウイルス遺伝子移入のようなウイルスベクター系の補助により行うことができる。

別の実施態様では、レンチウイルス遺伝子移入は、選択されたＲｅｖＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを最初に構築することにより、免疫細胞内でのＲｅｖＣＡＲの安定した発現のために適用されてよい。例示的なレンチウイルスベクターは、以下に限定されるものではないが、図６に示されたようなｐＬＶＸ－ＥＦ１アルファＲｅｖＣＡＲ２８／ζベクターを含み、この場合、ベクターのレンチウイルス部分は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する。

記載された適用では、ＭＳＣ／ＩＲＥＳ／ＺｘＧｒｅｅｎ１部分は、ＲｅｖＣＡＲ構築物により置き換えられた。図６に関して、略語は次のように使用される：
５′ＬＴＲ：５′長末端反復、ＰＢＳ：プライマー結合サイト、Ψ：パッケージングシグナル、ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答エレメント、ｃＰＰＴ／ＣＴＳ：（中央ポリプリン域／中央終止配列、ＰＥＦ１α：ヒト伸長因子１アルファプロモーター、ＭＣＳ：マルチクローニングサイト、ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入サイト、ＺｓＧｒｅｅｎ１：ヒトコドン最適化部位、ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、３′ＬＴＲ：３′長末端反復、ｐＵＣ：複製の起点、Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子；β－ラクタマーゼ。

レンチウイルス粒子は、典型的には、ＲｅｖＣＡＲをコードするレンチウイルスベクタープラスミドを有するヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＣＣ６３５）細胞の一時的トランスフェクションならびに図７に描写されたような群特異性抗原（ｇａｇ）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）をコードするプラスミド（例えばｐｓＰＡＸ２、ａｄｄｇｅｎプラスミド１２２６０）および図８に示されたようなエンベロープをコードするプラスミド（例えばｐＭＤ２．Ｇ、ａｄｄｇｅｎｅプラスミド１２２５９）による同時トランスフェクションにより生産される。トランスフェクション後に、パッケージングプラスミドは、ＨＩＶ－１のＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を発現する。略語は、図７において次のように使用される：ＣＭＶｅｎｈ：ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ＳＤ：スプライスドナー、ＳＡ：スプライスアクセプター、Ｇａｇ：群特異的抗原、Ｐｒｏ：プロテアーゼタンパク質をコードする前駆体タンパク質、Ｐｏｌ：逆転写酵素およびインテグラーゼをコードするタンパク質、ＲＲＥ：ｒｅｖ応答エレメント、Ａｍｐ：アンピシリン。プラスミドＭＤ２．Ｇ（図８）は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）の糖タンパク質をコードする。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、広範囲の哺乳類細胞に形質導入するためにレンチウイルスベクターに使用される。略語は、図８において次のように使用される：ＣＭＶ：ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｉｎｔｒｏｒ：ベータグロビンイントロン、ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｐＡ：ベータグロビンポリアデノシンテール。

多様なウイルス種由来の多様なエンベロープを、この目的のために使用することができる。レンチウイルスベクターは、アンホトロピックマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）のＧタンパク質、原型フォーミーウイルス（ＰＦＶ）の改質エンベロープまたはテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）およびＭＬＶに由来するキメラエンベロープ糖タンパク質変異体を用いて、うまく仮型にすることができるが、これらに限定されるものではない。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上澄液は、トランスフェクションの２４ｈ～９６ｈ後に収穫することができ、ウイルス粒子は、必ずしも必要ではないが、遠心分離または他の方法によって上澄液から濃縮されてよい。免疫細胞のレンチウイルス形質導入のために、多様な確立されたプロトコルを適用することができる。一態様では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または単離されたＴ細胞は、ＣＤ３複合体、例えばクローンＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１に特異的なｍａｂにより活性化することができ、溶液の形にされるかまたはプラスチック細胞培養皿もしくは磁気ビーズに被覆される。ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞の活性化は、以下に限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７に特異的なｍａｂまたはリガンドを単独でまたは多様な組合せで用いた同時刺激経路の刺激、ならびにこれらに限定されるものではないが、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のような外因性組換サイトカインの供給によりさらに増強することができる。濃縮されたまたは濃縮されていないウイルス粒子は、活性化ＣＤ３抗体および／または組換サイトカインの最初の投与の２４ｈ～９６ｈ後に、ＰＢＭＣまたはＴ細胞培養に一回量または数回量で添加される。Ｔ細胞の安定した形質導入は、ウイルス上澄液の最後の投与の三日後から、ＲｅｖＣＡＲの表面発現に対する抗タグ抗体またはＲｅｖＣＡＲの第四のドメインに対して指向するｍａｂを用いた染色後に、フローサイトメトリーによって決定されてよい。ＲｅｖＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、組換サイトカインの供給および抗ＣＤ３ｍａｂの活性化の下で培養することによりインビトロで増殖させることができる。

別の実施態様では、ＲｅｖＣＡＲをコードする配列を宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込み、ＲｅｖＣＡＲ表面発現を促進するために、免疫細胞を、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化された、規則的に空間を空けた短い回帰性反復（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）のような遺伝子編集技術を用いて遺伝子操作することができる。

ＲｅｖＣＡＲが任意の第四のドメイン、ｍａｂのための線形エピトープを形成するペプチド配列を有する場合、ＲｅｖＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫細胞は、ＲｅｖＣＡＲタグまたは任意の第四のＲｅｖＣＡＲドメインに結合するｍａｂまたはその抗体フラグメントを、培養皿または任意の種類のビーズの表面に被覆することによりインビトロで特に増殖させることができ、これらのビーズは、１～４のＲｅｖＣＡＲグラフトエフェクター細胞に対して１つのビーズの定義された比率で細胞培養に添加されるが、これに限定されるものではない。表面被覆されたｍａｂのＲｅｖＣＡＲタグまたは第四のドメインへの結合は、細胞表面発現したＲｅｖＣＡＲの架橋および免疫シナプスの形成を誘導し、ＲｅｖＣＡＲのシグナルドメインによる特異的にトリガーされるシグナル経路の活性化を引き起こす。誘導されたシグナル経路に依存して、これは、ＲｅｖＣＡＲ担持免疫細胞の増殖および活性化誘導細胞死に対する持続的な耐性を高め、それにより混合集団内でのＲｅｖＣＡＲ遺伝子改変免疫細胞の集積を引き起こすことができる。

ＲｅｖＣＡＲタグまたは任意の第四のドメインは、さらに、混合集団からＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を集積および精製するために利用することができる。集積および精製は、細胞選別のためにＲｅｖＣＡＲ発現細胞を標識するか、または細胞単離のために利用することができる小さな粒子に、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を一時的に連結するために、ＲｅｖＣＡＲタグまたは第四のＲｅｖＣＡＲドメインに結合するｍａｂまたはそのｍａｂの抗体フラグメントの補助で行うことができる。一態様では、ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞を、ＲｅｖＣＡＲタグまたは第四のドメインを認識するｍａｂと一緒にインキュベートする。次に、任意の第四のドメインに結合するｍａｂの種特異的およびアイソタイプ特異的重鎖および軽鎖に対して指向する抗体またはその抗体のフラグメントと接合する磁気ビーズを添加する。このように、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞と磁気ビーズとは連結され、磁場内で捕捉して、他の免疫細胞から分離することができる。

本発明の別の実施態様では、ＲｅｖＣＡＲタグまたは任意の第四ドメインは、ＵｎｉＣＡＲ表面発現の検出のために使用することができる（表６）。表６は、ＲｅｖＣＡＲ表面発現が、ＲｅｖＣＡＲタグに対して指向するモノクローナル抗体を使用し、引き続き蛍光色素接合抗種二次抗体で染色することにより検出することができることを描写している。

ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、当業者に公知の技術を用いて、被験者に投与するために調製されていてよい。

ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団を有する調製物は、製剤学的に許容される付形剤を含んでよい。調製物中に含まれる付形剤は、例えばＲｅｖＣＡＲを有するタグの性質、使用される免疫細胞の集団、および投与の様式に依存して異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、感染用水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、張性剤、増量剤、および滑剤を含むが、これらに限定されるものではない。ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団を有する調製物は、典型的に、動物血清（例えばウシ血清アルブミン）のような任意の非ヒト成分の不在で製造および培養される。

調製物は、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の一つの集団または一つより多くの集団、例えば二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたはそれより多くの集団を含んでよい。ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞の異なる集団は、タグドメインの同一性、シグナル伝達ドメインの同一性、部分母集団の同一性、生成および培養の様式またはこれらの組合せに基づいて変えることができる。例えば、調製物は、一つ、または一つより多くの、例えば二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたはそれより多くの異なるアダプターモジュールを認識しかつ結合するＲｅｖＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＮＫ細胞の集団を含んでよい。

ＲｅｖＣＡＲ免疫細胞の集団を有する調製物は、当業者に公知の様式および技術を用いて被験者に投与されてよい。例示的な様式は、静脈内注射を含むが、これに限定されるものではない。他の様式は、腫瘍内、皮内、皮下（ｓ．ｃ、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ－Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹膜内（ｉ．ｐ．）、動脈内、骨髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液包内（関節液領域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（髄液）を含むが、これらに限定されるものではない。調製物の腸管外注射または注入のために有用な任意の装置を、このような投与を行うために用いることができる。注射は、バルク注射または連続フロー注射として行うことができる。

被験者に投与されるＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団を有する調製物は、特別な適応症または疾患の治療および／または予防のために有効である数のＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を有する。したがって、本発明の方法が実施される場合、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の治療的に有効な集団が、被験者に投与される。被験者に投与されるＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の数は、疾患の場所、起源、同一性、程度および重症度、治療される個体の年齢および状態などに依存して、広い範囲内で変化する。一般に、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を約１×１０⁴～約１×１０¹⁰で有する調製物が投与される。ほとんどの場合に、調製物は、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を約１×１０⁵～約１×１０⁹で、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を約５×１０⁵～約５×１０⁸で、またはＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を約１×１０⁶～約１×１０⁹で有する。内科医が、最終的に使用するための適切な用量を決定する。有害事象の場合に、ＲｅｖＣＡＲグラフト免疫細胞は、ＲｅｖＣＡＲタグまたは存在する場合に第四のドメインに対して指向するｍａｂの投与により個体から枯渇させることができる。

アダプターモジュールの製造
アダプターモジュールは、特定のヒト細胞表面タンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部位およびＲｅｖＣＡＲの細胞表面ペプチドエピトープタグに対して指向するタグ結合ドメインの、二つのドメインを有する。アダプターモジュールは、当業者に公知の技術により生産することができる。これらの技術は、原核細胞または真核細胞内での組換発現、ポリペプチド鎖の人工合成または化学合成を含むが、これらに限定されるものではない。

一態様では、アダプターモジュールは、生物学的に活性な形態で大量の組換タンパク質を合成するために適したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ、ＡＣＣ－１１０）細胞内で発現されてよい。アダプターモジュールをコードする核酸配列は、裸の核酸トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはウイルス遺伝子導入のような確立された遺伝子工学技術によりＣＨＯ細胞内に導入することができるが、これらに限定されるものではない。高生産性単一細胞クローンは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）選択系を用いて、親系統から選択されてよい。この系内では、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞変異体（例えば、ＣＨＯサブラインＤＸＢ１１またはＤＧ４４）は、一般的に、アダプターモジュールをコードする核酸配列に加えて、ＤＨＦＲ遺伝子の機能的コピーの同時トランスフェクションにより遺伝子改変される。次いで、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン欠損培地内での生長によりクローン選択を行う。さらに、高生産性クローンは、高濃度の、ＤＨＦＲ活性を遮断する葉酸類似体であるメトトレキサート（ＭＴＸ）中で細胞を培養することにより選択することができる。遺伝子改変細胞は、ＤＨＦＲの単一コピーの存在だけでは救済することができないＤＨＦＲ活性の低下に対処しなければならないので、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅コピーを有するクローンは、このような条件下で有利である。ＤＨＦＲと目的の遺伝子の間の遺伝子連結は、導入遺伝子も同時増幅されることを保証するので、高生産性細胞クローンの確保の見込みを高める。選択された細胞クローンは、優良製造条件下で、任意の動物血清の不在で優先的に成長する。アダプターモジュールは、沈殿または遠心分離のような予備的ステップを含む確立された分取タンパク質精製法および以下に限定されるものではないが、サイズ排除、アフィニティまたはイオン交換クロマトグラフィーのような多様な精製技術により細胞培養上澄液から単離されてよい。一態様では、アダプターモジュールの核酸配列は、ポリヒスチジンタグを形成する六～十の連続するヒスチジンアミノ酸をコードする配列を担持する。ポリヒスチジンは、ニッケルおよびコバルトのような二価金属イオンに強く結合する。細胞培養上澄液は、ポリヒスチジンタグに結合する固定化されたニッケルイオンを含むカラムを通過させることができ、タグのない全てのタンパク質はカラムを通過する。アダプターモジュールは、カラムに結合するポリヒスチジンタグと競合するイミダゾールを用いるか、または樹脂に対するタグの親和性を低下させるｐＨの低下により溶出させることができる。一態様では、アダプターモジュールは、タンパク質Ｌに基づくアフィニティクロマトグラフィー（例えばＣａｐｔｏ Ｌ）に適している。他の態様では、アダプター分子は、ブドウ球菌タンパク質Ａの特別なドメインを含むカラム樹脂（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ）による精製を可能にする重鎖３ファミリーの可変領域を有していてよい。

アダプターモジュールの投与
一つのアダプターモジュールまたは一つより多い、例えば二つ、三つ、四つまたはそれより多いアダプターモジュールは、当業者に公知の技術を用いて被験者に投与するために調製されてよい。

一つまたはそれ一つより多くのアダプターモジュールを含む調製物は、薬学的に許容可能な付形剤を含んでよい。調製物内に含まれる付形剤は、例えばアダプターモジュールの性質および投与の形態に依存して異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、感染用水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、張性剤、増量剤、および滑剤を含むが、これらに限定されるものではない。アダプターモジュールを有する調製物は、典型的に、動物血清（例えばウシ血清アルブミン）のような任意の非ヒト成分の不在で製造および培養される。

調製物は、一つのアダプターモジュールまたは一つより多くの、例えば二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたはより多くのアダプターモジュールを含んでよい。アダプターモジュールは、結合部位の同一性、タグの同一性、生成の様式、またはこれらの組合せに基づいて変えることができる。例えば、調製物は、一つ、または一つより多くの、例えば二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたはそれより多くの異なるヒト細胞表面タンパク質、タンパク質複合体または細胞外マトリックス構造を認識しかつそれらに結合するアダプターモジュールを含んでよい。

ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団を含む調製物は、被験者に投与する前に、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞をアダプターモジュールで装飾するために、一つまたはそれより多くのアダプターモジュールを含む調製物と一緒にエクスビボでインキュベートされてよい。あるいは、一つまたはそれより多くのアダプターモジュールを含む調製物は、被験者に直接投与することができるか、または両方のストラテジーの組合せを選択することができる。経路および用量は、疾患の場所、起源、同一性、程度および重症度、治療される個体の年齢および状態などに依存して、広い範囲で変化する。内科医が、最終的に適用の適切な経路および使用するための用量を決定する。

アダプターモジュールを有する調製物は、特定の適応症または症状の治療および／または予防のために有効な量で、被験者に投与される。一日当たりのｍ²あたりに供給される典型的な用量は、一日または一週間当たり一回以上、または数週間の期間にわたり連続的に投与される用量で、１ｎｇ～１０００ｍｇ、好ましくは５ｎｇ～１ｍｇである。しかしながら、被験者に投与される調製物中のアダプターモジュールの量は、癌の場所、起源、同一性、程度および重症度、治療される個体の年齢および状態などに依存して、広い範囲内で変化する。内科医が、最終的に使用される適切な用量を決定する。

本発明は、アダプターモジュールの一つまたはそれより多くの調製物を、治療を必要とする被験者に投与することを有する、癌、感染症または自己免疫疾患を有する被験者の治療方法に関し、アダプターモジュールは、癌細胞に結合し、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の一つまたはより多くの治療的に有効な集団を投与し、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞は、アダプターモジュールと結合し、細胞死に誘導する。

「癌」という用語は、広く解釈されることを意図し、かつ異常細胞増殖および／または細胞分裂の全ての態様を包含する。例は、以下に限定されるものではないが、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌を含む癌、および皮膚、乳房、前立腺、膀胱、膣、子宮頸、子宮、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、肺、気管、気管支、結腸、小腸、胃、食道、胆嚢の癌；以下に限定されるものではないが、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経節腫、骨肉腫、軟部組織肉腫を含む肉腫、および骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管および造血組織の癌；以下に限定されるものではないが、成熟Ｂ細胞新生物、例えば慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ性白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫を含む形質細胞新生物、成熟Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞新生物、例えばＴ細胞前リンパ性白血病、Ｔ細胞大粒径リンパ性白血病、攻撃性ＮＫ細胞白血病、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ホジキンリンパ腫、および免疫不全関連リンパ増殖性疾患を含むリンパ腫および白血病；以下に限定されるものではないが、精巣または卵巣癌を含む生殖細胞腫瘍；以下に限定されるものではないが、肝芽細胞腫、髄芽細胞腫、腎芽細胞腫、神経細胞腫、膵芽細胞腫、胸膜肺芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含む芽細胞腫を含む。この用語は、良性腫瘍も含まれる。

ここで使用されるような「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」および「治療（treatment）」という用語は、それらの通常のおよび慣例的な意味を有し、以下：被験者内の癌の症状の重症度および／または頻度を遮断、改善または減少すること、および／または癌細胞の生長、分裂、伝播、または増殖、または被験者内の癌の進行（例えば新たな腫瘍の発生）の抑制の一つ以上を含む。治療とは、本発明の方法が実施されていない被験者に対して約１％～約１００％の遮断、改善、減少、または抑制を意味する。好ましくは、遮断、改善、減少、または抑制は、本発明の方法が実施されていない被験者に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％である。

ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団を有する調製物およびアダプターモジュールの調製物の両方の投与頻度は、治療される疾患、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞およびアダプターモジュールを有するエレメント、ならびに投与の様式を含む要因に依存して変化する。各々の調製物は、独立して、一日４回、３回、２回または一回、隔日、三日おき、四日おき、五日おき、六日おき、週一回、八日おき、九日おき、十日おき、隔週、月一回および隔月で投与されてよい。

治療期間は、治療する症状に基づき、主治医により最適に決定される。しかしながら、治療の継続は、数日、数週間、または数ヶ月続くことが予想される。

本発明は、治療方法において柔軟性を提供し、その結果、アダプターモジュールの調製物およびＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団は、任意の順序で被験者に投与してよい。したがって、アダプターモジュールの調製物は、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団の前、その後またはそれと同時に、被験者に投与されてよい。あるいは、アダプターモジュールの一つより多くの調製物および／またはＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の一つより多くの集団が被験者に投与される場合、投与をずらすことができる。例えば、アダプターモジュールの第一の調製物を投与し、引き続き、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の第一の集団を投与し、次にタグ付けられたタンパク質の第二の調製物を投与し、次いでＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の第二の集団を投与することができる。

本発明は、被験者にＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞を投与する前に、ＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞の集団をアダプターモジュールで被覆する方法も含む。

本発明の実施態様の各々において、治療を受ける被験者は、ヒトまたはヒトを除く動物、例えばヒトを除く霊長類、鳥、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、例えばイヌ、ネコまたは齧歯類、または他の哺乳類である。

一実施態様では、ＲｅｖＣＡＲ遺伝子操作されたＴ細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の＞８０％および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のほぼ１００％においてしばしば検出される表面マーカーであるＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞に対して特異的にリダイレクトすることができる。この目的のために、二つのＣＤ１２３特異的アダプターモジュールを図３に示すように設計し、ｃＤＮＡを合成し、レンチウイルスベクター内にクローニングし、安定したＣＨＯ産生細胞系をレンチウイルス遺伝子導入によって作製した。アダプターモジュールは、標準の固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介して細胞上澄液から精製した。一方のアダプターモジュール変異体は、Ｌａ５Ｂ９エピトープを認識する活性ｓｃＦｖ結合ドメインを収容していた；あるいは、他方のアダプターモジュールは、Ｌａ７Ｂ６エピトープを認識するｓｃＦｖを有していた（図３）。両方のモジュールは、それぞれ、１５ｐＭおよび１１ｐＭの同等の親和性でＣＤ１２３発現ＡＭＬ細胞に結合した（図４Ａ）。ＲｅｖＣＡＲタグに対する結合は、ＲｅｖＣＡＲ発現標的細胞に対する結合試験によって確認することもできた（図４Ｂ）。特異的ＲｅｖＣＡＲタグに対する両方のアダプターモジュールの親和性は、Ｌａ５Ｂ９ＲｅｖＣＡＲタグについては１２ｐＭ、Ｌａ７Ｂ６ＲｅｖＣＡＲタグについては１４ｐＭのＫ_Dで同等であった（図４Ｂ）。

ＣＤ１２３特異性アダプターモジュールを有する免疫細胞のリダイレクトのためにＲｅｖＣＡＲタグとしてＬａ５Ｂ９またはＬａ７Ｂ６エピトープのいずれかを収容する二つのＲｅｖＣＡＲを構築した。ヒトネイティブＴ細胞は、レンチウイルス遺伝子導入を用いて、二つのＲｅｖＣＡＲのいずれかを発現する様に遺伝子操作された。ＣＤ１２３発現ＡＭＬ芽球と一緒にインキュベートする際に、初代ヒトＲｅｖＣＡＲ Ｔ細胞は、対応するアダプター分子の存在下で、濃度依存する形で、ＡＭＬ芽球の特異的溶解を媒介した（図５）。

別の実施態様では、配列番号１によるＲｅｖＣＡＲ１と言われる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ－２ｍリーダーペプチド、配列番号３によるヒトＬａ５Ｂ９エピトープ、配列番号４による突然変異結合モチーフを有するヒトＣＤ２８細胞外部分、配列番号５によるＣＤ２８膜貫通ドメインおよび配列番号６による突然変異した内在化モチーフを含むヒトＣＤ２８細胞内部分を含む配列番号４～６によるヒトＣＤ２８タンパク質、ならびに配列番号７によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。

配列番号１による核酸のタンパク質発現の産物は、配列番号２４内に得ることができる。

配列番号３によるヒトＬａ５Ｂ９エピトープの核酸配列は、配列番号２８によるタンパク質ドメインをコードする。

別の実施態様では、配列番号８によるＲｅｖＣＡＲ２と言われる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸配列が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ－２ｍリーダーペプチド、配列番号３によるヒトＬａ５Ｂ９エピトープ、配列番号４および５によるヒトＣＤ２８鎖の細胞外ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号９によるヒトＣＤ１３７細胞内シグナリンドメイン、および配列番号７によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。

配列番号８による単離された核酸配列を発現するタンパク質の産物は、配列番号２５内に得ることができる。

別の実施態様では、配列番号１０によるＲｅｖＣＡＲ３と言われる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸配列が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ－２ｍリーダーペプチド、配列番号１１によるヒトＬａ７Ｂ６エピトープ、配列番号４による突然変異結合モチーフを有するヒトＣＤ２８細胞外部分、配列番号５によるＣＤ２８膜貫通ドメインおよび配列番号６による突然変異した内在化モチーフを含むヒトＣＤ２８細胞内部分を含む配列番号４～６によるヒトＣＤ２８タンパク質、ならびに配列番号７によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。

配列番号１０による単離された核酸配列を発現するタンパク質の産物は、配列番号２６内に得ることができる。

配列番号１１によるヒトＬａ７Ｂ６エピトープの核酸配列は、配列番号２９によるタンパク質ドメインをコードする。

別の実施態様では、配列番号１２によるＲｅｖＣＡＲ４と言われる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸配列が提供される。この核酸配列は、配列番号２によるヒトＩＬ－２ｍリーダーペプチド、配列番号１１によるヒトＬａ７Ｂ６エピトープ、配列番号４および５によるヒトＣＤ２８鎖の細胞外ヒンジおよび膜貫通領域、配列番号９によるヒトＣＤ１３７細胞内シグナリングドメイン、および配列番号７によるヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする。

配列番号１２による単離された核酸配列を発現するタンパク質の産物は、配列番号２７内に得ることができる。

本発明の別の実施態様では、アダプターモジュールをコードする核酸配列が提供され、アダプターモジュールのタグ結合部位は、好ましくは配列番号１４および１５または１８および１９によるＬａ／ＳＳＢ抗原の５Ｂ９または７Ｂ６エピトープに結合する抗体またはその抗体のフラグメントを含む。

本発明の別の実施態様では、アダプターモジュールをコードする核酸配列が提供され、アダプターモジュールのタグ結合部位は、好ましくは配列番号２０および２１または２２および２３によるＰＳＭＡまたはＣＤ１２３に結合する抗体またはその抗体のフラグメントを含む。

本発明の別の実施態様では、前立腺特異的膜抗原ＰＳＭＡのための結合部位を有するアダプターモジュールが提供される。このアダプターモジュールをコードする核酸は、配列番号１３によるＩｇＧカッパリーダーペプチドをコードする配列、配列番号１４による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１５による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号２０による抗ＰＳＭＡｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号２１による抗ＰＳＭＡｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１６によるｍｙｃタグおよび配列番号１７によるｈｉｓタグを有する。

本発明の別の実施態様では、前立腺特異的膜抗原ＰＳＭＡのための結合部位を有するアダプターモジュールが提供される。このアダプターモジュールをコードする核酸は、配列番号１３によるＩｇＧカッパリーダーペプチドをコードする配列、配列番号１８による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１９による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号２０による抗ＰＳＭＡｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号２１による抗ＰＳＭＡｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１６によるｍｙｃタグおよび配列番号１７によるｈｉｓタグを有する。

本発明の別の実施態様では、白血病抗原ＣＤ１２３のための結合部位を有するアダプターモジュールが提供される。このアダプターモジュールをコードする核酸は、配列番号１３によるＩｇＧカッパリーダーペプチドをコードする配列、配列番号１４による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１５による抗Ｌａ５Ｂ９ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号２２による抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号２３による抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１６によるｍｙｃタグおよび配列番号１７によるｈｉｓタグを有する。

本発明の別の実施態様では、白血病抗原ＣＤ１２３のための結合部位を有するアダプターモジュールが提供される。このアダプターモジュールをコードする核酸は、配列番号１３によるＩｇＧカッパリーダーペプチドをコードする配列、配列番号１８による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号１９による抗Ｌａ７Ｂ６ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号２２による抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖのヒト化重鎖、配列番号２３による抗ＣＤ１２３ｓｃＦｖのヒト化軽鎖、配列番号１６によるｍｙｃタグおよび配列番号１７によるｈｉｓタグを有する。

配列番号１４によるヒト化抗Ｌａ５Ｂ９可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号３０によるタンパク質をコードし、配列番号１５によるヒト化抗Ｌａ５Ｂ９可変領域軽鎖は、配列番号３１によるタンパク質をコードする。

配列番号１６によるｍｙｃタグの核酸配列は、配列番号３２によるタンパク質をコードし、配列番号１７によるｈｉｓタグは、配列番号３３によるタンパク質をコードする。

配列番号１８によるヒト化抗７Ｂ６可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号３４によるタンパク質をコードし、配列番号１９によるヒト化抗７Ｂ６可変領域軽鎖は、配列番号３５によるタンパク質をコードする。

配列番号２０によるヒト化抗ＰＳＭＡ可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号３６によるタンパク質をコードし、配列番号２１によるヒト化抗ＰＳＭＡ可変領域軽鎖は、配列番号３７によるタンパク質をコードする。

配列番号２２によるヒト化抗ＣＤ１２３可変領域重鎖の核酸配列は、配列番号３８によるタンパク質をコードし、配列番号２３によるヒト化抗ＣＤ１２３可変領域軽鎖は、配列番号３９によるタンパク質をコードする。

Claims (20)

1. 逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸において、前記受容体は、三つのドメインを有し、
   － 第一のドメインは、ペプチドエピトープタグであり、前記ペプチドエピトープタグは、配列番号２８または２９によるヒト核タンパク質由来の短い線状エピトープであり、
   － 第二のドメインは、細胞外ヒンジおよび膜貫通ドメインであり、かつ
   － 第三のドメインは、シグナル伝達ドメインである、
   逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする核酸。
2. 配列番号３または１１によるペプチドエピトープタグをコードする核酸を含む、請求項１に記載の核酸。
3. 前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８分子のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ８ａ鎖、ＮＫ細胞受容体、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体または抗体の定常領域の一部、ならびにそれらのヒンジと膜貫通ドメインとの種々の組合せから選択され、前記ヒンジ領域は、細胞外領域の一部である、請求項１または２に記載の核酸。
4. 前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤＡＰ１０およびＣＤ２７の細胞質領域、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）ならびにＣＤ３鎖、ＤＡＰ１２およびＴ細胞活性化を誘導するＦｃ受容体の細胞質領域から選択され、前記シグナル伝達ドメインおよび前記細胞質領域は、シグナリングドメインである、請求項１から３までのいずれかに記載の核酸。
5. 配列番号２４から２７までの配列の一つによる逆ユニバーサルキメラ抗原受容体をコードする、請求項１から４までのいずれかに記載の核酸。
6. 前記受容体は、第四のドメインを有し、前記第四のドメインは、前記受容体の細胞外部分内の短いペプチドリンカーである、請求項１から４までのいずれかに記載の核酸。
7. 配列番号１、８、１０または１２の配列の一つによる、請求項１から５までのいずれかに記載の核酸。
8. 特定のヒト細胞表面タンパク質またはタンパク質複合体に特異的な結合部位と、請求項１から７までのいずれか一項に記載の逆ユニバーサルキメラ抗原受容体のペプチドエピトープタグに対して指向するタグ結合ドメインとから構成されるアダプターモジュールであって、前記ペプチドエピトープタグは、配列番号２８または２９によるヒト核タンパク質由来の短い線状エピトープである、アダプターモジュール。
9. 前記アダブターモジュールの結合部位は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ９０、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８４、ＣＤ２２３、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２７９およびＣＤ３６６の表面抗原に結合する抗体または前記抗体のフラグメント、インターロイキン受容体、ＣＸＣＲ４、上皮成長因子受容体ファミリーのメンバー、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、エフリン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、胚性抗原、癌胚性抗原（ＣＥＡ）および胎児アセチルコリン受容体、血管内皮増殖因子ファミリーのメンバー、上皮細胞接着分子ＥｐＣＡＭ、アルファフェトプロテインＡＦＰ、ムチンタンパク質ファミリーのメンバー、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、葉酸結合タンパク質ＦＢＰ、α－葉酸受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、サイトカイン受容体、上皮糖タンパク質ファミリーのメンバー、ジアシアロガングリオシド、炭酸脱水酵素ファミリーのメンバー、炭化水素抗原ファミリーのメンバー、Ｎｏｔｃｈリガンド、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、糖タンパク質Ａ３３、および腫瘍特異的グリカン（上述のタンパク質およびタンパク質ファミリーの変異体を含む）、又はＬａ／ＳＳＢ抗原のような細胞質抗原または核抗原、ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのメンバー、高移動度タンパク質のメンバーなどに結合する抗体または前記抗体のフラグメントを含む、請求項８に記載のアダプターモジュール。
10. 前記アダプターモジュールの前記結合部位は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または前記Ｔ細胞受容体のフラグメントのアルファ鎖およびベータ鎖またはガンマ鎖およびデルタ鎖から構成されており、ＴＣＲ由来の結合部位は、ヒト白血球抗原クラス（ＨＬＡ）ＩおよびＩＩタンパク質複合体により提示されるペプチドを認識しかつ前記ペプチドに結合し、ＥＧＦＲファミリー、サバイビン、ｓｒｙ様高移動度ｂｏｘ（ＳＯＸ）タンパク質ファミリー、メラノーマ関連抗原および白血病関連抗原のようなタンパク質に由来するペプチドに特異的なＴＣＲである、請求項８に記載のアダプターモジュール。
11. 前記アダプターモジュールの前記結合部位は、タンパク質またはタンパク質複合体に対するリガンド（さらに受容体と言われる）またはそのフラグメントを有し、前記リガンドは、サイトカイン受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、ＥＧＦＲファミリーメンバーのリガンド、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）またはＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）のようなチェックポイント分子のリガンド、または自己反応性ＴＣＲに結合する、請求項８に記載のアダプターモジュール。
12. 前記アダプターモジュールの結合部位は、化学反応（つまりクイックケミストリー）を介したタグ結合部位に融合される化学合成されたペプチド誘導体を有する、請求項８に記載のアダプターモジュール。
13. アダプターモジュールの前記結合部位は、ＰＳＣＡとＰＳＭＡ、ＣＤ１９とＣＤ２０、ＣＤ１９とＣＤ２２、ＣＤ１９とＣＤ２０とＣＤ２２、ＣＤ１９とＣＤ１２３、ＣＤ３３とＣＤ１２３、ＣＤ３３とＣＤ９９、ＣＤ３３とＴＩＭ－３、ＥｒｂＢ－１と－２、ＰＳＣＡとＥｒｂＢ－２、ＩＬ－１３Ｒα２とＥｒｂＢ－２、ＣＤ３８とＣＤ２６９とへの結合を含む二重および多重特異的抗原特異性を有する、請求項８から１２までのいずれかに記載のアダプターモジュール。
14. アダプターモジュールの前記タグ結合部位は、配列番号１４および１５または１８および１９によるＬａ／ＳＳＢ抗原の５Ｂ９または７Ｂ６エピトープに結合する抗体または前記抗体のフラグメントを含む、請求項８から１３までのいずれかに記載のアダプターモジュールをコードする核酸。
15. アダプターモジュールの前記標的結合部位は、配列番号２０および２１または２２および２３によるＰＳＭＡまたはＣＤ１２３に結合する抗体または前記抗体のフラグメントを含む、請求項８から１３までのいずれかに記載のアダプターモジュールをコードする核酸。
16. 請求項１から７までのいずれかに記載の核酸を有する細胞またはベクター。
17. 前記細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、細胞障害性Ｔリンパ球、および制御性Ｔ細胞を含む免疫細胞の群から選択される、請求項１６に記載の細胞。
18. － 請求項１６に記載のベクターと、
    － 請求項８から１３のいずれかに記載のアダプターモジュールおよび／または請求項１４または１５に記載の核酸をコードするベクターと
    を有するキット。
19. 被験者に投与するための、請求項１６または１７に記載の細胞および／または請求項８から１３までのいずれかに記載のアダプターモジュールを有する調製物であって、前記細胞がＲｅｖＣＡＲ発現免疫細胞である、調製物。
20. 哺乳類において逆ユニバーサルキメラ抗原レセプターにより媒介される免疫応答の刺激において使用するための、請求項１６または１７に記載の細胞および請求項８から１３までのいずれかに記載のアダプターモジュール。

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