JP7445268B2

JP7445268B2 - 未分化維持培地添加剤

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Publication number: JP7445268B2
Application number: JP2022179759A
Authority: JP
Inventors: 琴衣古関; 訓岡元; 周吾遠山; 淳藤田; 恵一福田; 将太染谷
Original assignee: Ajinomoto Co Inc; Keio University
Current assignee: Ajinomoto Co Inc; Keio University
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2024-03-07
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: JP2023011911A; EP3604503A1; EP3604503C0; KR102641031B1; EP3604503B1; US20200040308A1; JPWO2018181342A1; CA3058306A1; CN110494559A; US20250270512A1; CN110494559B; JP7761908B2; JP2024056901A; WO2018181342A1; JP7181534B2; EP3604503A4; KR20190133034A

Description

本発明は、未分化状態を維持しながら多能性幹細胞を効率的に増殖するための培地、及び当該培地を用いた多能性幹細胞の増殖方法等に関する。

ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ：ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）などの多能性幹細胞は、その優れた増殖性や多分化能から、再生医療等での使用が期待されている。特にｉＰＳ細胞は、作製・入手が比較的容易であること、作製に際しての倫理的制約が少ないこと、さらには移植の際の拒絶反応の観点から、非常に優れた再生医療の材料と目されている。

多能性幹細胞を用いて再生医療を行う場合、疾患の治療や治療法の開発研究に、多量の多能性幹細胞が必要となる。このため、多量の多能性幹細胞の供給を可能とするような、多能性幹細胞培養方法を開発及び改良することが重要となる。中でも、要となるのが培地の改良である。多量の細胞を培養するためには、多量の培地が必要となる。例えば、１０^６個のｉＰＳ細胞を培養して１０^１０程度の心筋細胞を作製し、患者一人に移植する場合、一人の患者あたり１００リットルもの培地が必要となり、培地にかかる費用は少なく見積もってもおよそ１００，０００ドルに達する。培地にかかる費用を抑える方法の１つは、単位培地体積あたりの培養することが可能な細胞数を増やすことである。つまり、より高効率かつ低コストの効果的な多能性幹細胞培養用培地のニーズが存在する。

通常、培地には必須アミノ酸が添加されている。例えば、幹細胞培養用培地であるｍＴｅＳＲ１培地（非特許文献１、２、３）やＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地（非特許文献４）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地を基礎培地とし、ｂＦＧＦやインスリン等のいくつかの因子を加えたものである。このＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のアミノ酸の含有量は、血液中の遊離アミノ酸量をもとに設定されており、９．０２００ｍｇ／ＬのＬ‐トリプトファンが含まれている。これまで多くの培地が開発されてきたが、培地中のアミノ酸組成についてはほとんど改良されてこなかった。

特開２００４－１３５６７２号公報特開２００７－２２８８１５号公報ＵＳ２０１０/０３１７１０４Ａ１ＷＯ２０１１/１００２８６Ａ２

ＬｕｄｗｉｇＴＥｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ. Ｍｅｔｈｏｄｓ３（８）：６３７－４６；２００６ＬｕｄｗｉｇＴＥｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２４（２）：１８５－７；２００６Ｍａｓｔｅｒｓｅｔ．ａｌ．ＨｕｍａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：ＳｐｒｉｎｇｅｒＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；２００７ＣｈｅｎＧｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８（５）４２４－９；２０１１

本発明の目的は、多能性幹細胞を効率的に増殖することが可能な培地、及び当該培地を用いて多能性幹細胞を効率的に増殖する方法を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく、多能性幹細胞の培養過程における、培地中のアミノ酸量変化に注目した。その結果、多能性幹細胞の培養過程において培地中のＬ‐トリプトファン量が急速に減少し、培地に含まれる全アミノ酸中でＬ‐トリプトファンが最も早く枯渇することを見出した。ここで、必須アミノ酸であるＬ‐トリプトファンは他のアミノ酸に比べても培地処方濃度が低く（非特許文献１、２、３、４）、多能性幹細胞の大量増殖時にいち早く不足し、細胞増殖を制限する要因となることが予測された。そこで、本発明者らは、培地中のＬ‐トリプトファン量を増加させたり、培養の途中でＬ‐トリプトファンを添加して消費されたＬ‐トリプトファンを補うことにより、多能性幹細胞の増殖を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を１７６μＭ以上の濃度で含む、多能性幹細胞培養用の培地。
［２］培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を１７６μＭ～１４０８μＭの濃度で含む、［１］の培地。
［３］無血清培地である、［１］又は［２］の培地。
［４］多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、［１］～［３］のいずれかの培地。
［５］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１］～［４］のいずれかの培地。
［６］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［５］の培地。
［７］［１］～［６］のいずれかの培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法。
［８］多能性幹細胞を増殖するための方法である、［７］の方法。
［９］［１］～［６］のいずれかの培地及び多能性幹細胞を含む、多能性幹細胞培養調製物。
［１０］以下の工程を含む、多能性幹細胞の培養方法：
（１）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
（２）得られた多能性幹細胞培養物に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加し、（１）で消費された培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の一部又は全部を補うこと；及び
（３）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が添加された多能性幹細胞培養物を、引き続き培養に付すこと。
［１１］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地が、無血清培地である、［１０］の方法。
［１２］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１０］又は［１１］の方法。
［１３］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［１２］の方法。
［１４］Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む、多能性幹細胞の増殖を促進するための培地添加剤。
［１５］トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、［１４］の培地添加剤。
［１６］ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、［１５］の培地添加剤。

本発明によれば、多能性幹細胞の細胞増殖を促進させることが可能となるため、多能性幹細胞を効率よく大量に培養することができる。本培地の使用による具体的な効果としては、従来の培地に比べて短期間に目標細胞数を得られること、大量培養に特化した培養設備への変更なしに、既存の設備のままの培養でも目標細胞数を得られることなどが期待できる。従って、多能性幹細胞の培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを大幅に削減することができる。

Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり１３，０００個の２０１Ｂ７細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加したｍＴｅＳＲ１培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり１３，０００個の２０１Ｂ７細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加したＴｅＳＲ２培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり１３，０００個の２０１Ｂ７細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加したｍＴｅＳＲ１培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２５３Ｇ４の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり４０，０００個の２５３Ｇ４細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加したｍＴｅＳＲ１培地中での、ヒト胚性幹細胞Ｈ９の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり１０，０００個のＨ９細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。Ｌ‐トリプトファンを最終濃度４４μＭ、１７６μＭ、３５２μＭ、７０４μＭ、１４０８μＭになるように添加した１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地中での、ヒト胎児腎臓由来細胞２９３Ｔの細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり１０，０００個の２９３Ｔ細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ‐トリプトファンを上記の濃度となるように添加した時間を０時間とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的な増殖促進効果を示す結果は得られなかった。Ｌ‐キヌレニンを最終濃度５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭになるように添加したｍＴｅＳＲ１培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり２０，０００個の２０１Ｂ７細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。Ｌ－キヌレニン添加時を０とし、０、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。Ｌ－キヌレニン５０－５００μＭ添加区において増殖促進効果を示す結果が得られた。キヌレン酸を最終濃度５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭになるように添加したｍＴｅＳＲ１培地中での、ヒト誘導多能性幹細胞２０１Ｂ７の細胞被覆率（％）。６ウェルプレートに、１ウェルあたり２０，０００個の２０１Ｂ７細胞をシングルセルで播種し、６日間培養した。キヌレン酸添加時を０とし、０、２４、４８、７２、９６、１２０時間後に細胞被覆率を計測した。キヌレン酸５０－５００μＭ添加区において増殖促進効果を示す結果が得られた。

本発明は、細胞の細胞増殖を促進する培地（以下、これを本発明の培地ともいう）、細胞の増殖を促進する方法（以下、これを本発明の方法ともいう）、及び細胞増殖促進用の培地添加剤を提供する。

（１）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体
Ｌ‐トリプトファン（２－アミノ－３－（インドリル）プロピオン酸）は、タンパク質を構成する必須アミノ酸の一種である。
本明細書中、Ｌ‐トリプトファンは、Ｌ‐トリプトファンの塩を包含する。Ｌ‐トリプトファンの塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、またはパラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩；アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ‐トリプトファンの塩としては、塩酸塩、ナトリウム塩又はカリウム塩を用いることが好ましい。

Ｌ‐トリプトファンは、自体公知の方法により入手可能である。例えば、Ｌ‐トリプトファンの製造方法としては、特開２０１２－２２３０９２号公報、特開２０１２－１００５３７号公報、特開２０１１－１６７０７１号公報、特開２０１０－２６３７９０号公報、特開２０１０－１１０２１７号公報に記載の方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、Ｌ‐トリプトファンは、商業的に入手可能なものを用いることもできる。商業的に入手可能なＬ‐トリプトファンとしては、和光純薬工業社０３８－２３５８１（型番）、東京化成工業社Ｔ０５４１（型番）、ナカライテスク社１３０４３－９２（型番）、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社ＩＣＮ１０３１５０５（型番）、シグマアルドリッチ社Ｔ８９４１（型番）などが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌ‐トリプトファン誘導体は、培地中にＬ‐トリプトファンを提供する限り特に限定されないが、例えば培地に添加した際に加水分解によりＬ‐トリプトファンを提供する物質などが挙げられる。Ｌ‐トリプトファン誘導体としては、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチド、トリプトファンのＣ１－６アルキルエステル、Ｎアセチルトリプトファンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
トリプトファンとアミノ酸が結合したジペプチドの例としては、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐アルギニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐アスパラギニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐アスパラギン酸‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐システイニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐グルタミニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐グルタミン酸‐Ｌ‐トリプトファン、グリシル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐ヒスチジニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐イソロイシル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐ロイシル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐リシル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐フェニルアラニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐プロリル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐セリル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐トレオニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐チロシル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐バリル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐アラニン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐アスパラギン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐アスパラギン酸、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐システイン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐トリプトファニル‐グリシン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐ヒスチジン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐リシン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐メチオニン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐プロリン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐セリン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐トレオニン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐チロシン、Ｌ‐トリプトファニル‐Ｌ‐バリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
トリプトファンのＣ１－６アルキルエステルとしては、Ｌ‐トリプトファンメチルエステル、Ｌ‐トリプトファンエチルエステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、Ｌ‐トリプトファン誘導体は、Ｌ‐トリプトファン誘導体の塩を包含する。Ｌ‐トリプトファン誘導体の塩としては、Ｌ‐トリプトファンの塩として上述したものを挙げることができる。
多能性幹細胞の培養に用いる場合、Ｌ‐トリプトファン誘導体は、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファン、グリシル‐Ｌ‐トリプトファンが好ましい。
本明細書中、Ｌ‐トリプトファン誘導体は、Ｌ‐トリプトファンの代謝物またはその塩を包含する。Ｌ‐トリプトファン代謝物としては、多能性幹細胞の培養に用いる場合、Ｌ‐キヌレニン、キヌレン酸が好ましい。

Ｌ‐トリプトファン誘導体は、自体公知の方法により入手可能である。例えば、Ｌ‐トリプトファンジペプチドの製造方法としては、一般的な固相合成法などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、Ｌ‐トリプトファン誘導体は、商業的に入手可能なものを用いることもできる。商業的に入手可能なＬ‐トリプトファン誘導体としては、和光純薬工業社０３８－２３５８１（型番）、東京化成工業社Ｔ０５４１（型番）、ナカライテスク社１３０４３－９２（型番）、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社ＩＣＮ１０３１５０５（型番）、シグマアルドリッチ社Ｔ８９４１（型番）などが挙げられるが、これらに限定されない。

（２）多能性幹細胞
本明細書中、多能性幹細胞とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞であって、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７Ｎｏｖ３０；１３１（５）：８６１－７２）、精子幹細胞（ｍＧＳ細胞）（Ｋａｎａｔｓｕ－ＳｈｉｎｏｈａｒａＭｅｔａｌ．，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ．２００７Ｊａｎ；７６（１）：５５－６２）、胚性生殖細胞（ＭａｔｓｕｉＹｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９２Ｓｅｐ４；７０（５）：８４１－７）などが挙げられる。

多能性幹細胞は自体公知の方法により、入手できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、哺乳動物の胚盤胞中の内部細胞塊を培養する方法（例えばＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＦｏｕｒｔｈＥｄｉｔｉｏｎ２０１４ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載の方法）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Ｗｉｌｍｕｔｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９７Ｆｅｂ２７；３８５（６６１９）：８１０－３、Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８Ｊｕｌ２３；３９４（６６９１）：３６９－７４、ＷａｋａｙａｍａＴｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１Ａｐｒ２７；２９２（５５１７）：７４０－３）などが挙げられるが、これらに限定されない。

さらに胚性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えば、ヒトＥＳ細胞であるＫｈＥＳ－１細胞、ＫｈＥＳ－２細胞およびＫｈＥＳ－３細胞は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。

誘導多能性幹細胞の入手方法の例としては、核初期化物質（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４等）を体細胞へ導入する方法（ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００６Ａｕｇ２５；１２６（４）：６６３－７６、ＷＯ２００７／０６９６６６国際公開公報）が挙げられるが、これに限定されない。また、誘導多能性幹細胞は、ＴａｋａｈａｓｈｉＫｅｔａｌ．，ＮａｔＰｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１－９、Ａｏｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８Ａｕｇ１；３２１（５８８９）：６９９－７０２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７Ｎｏｖ３０；１３１（５）：８６１－７２、Ｙｕ，Ｊｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７Ｄｅｃ２１；３１８（５８５８）：１９１７－２０、Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８Ｊａｎ；２６（１）：１０１－６、などに記載の方法に準じて作製することができるが、これらに限定されない。

さらに誘導多能性幹細胞は所定の機関から入手することもできる。例えばヒトｉＰＳ細胞である２５３Ｇ１細胞、２０１Ｂ７細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から購入することができる。

胚性生殖細胞は、常法に従って始原生殖細胞を単離し、これをＬＩＦ、ｂＦＧＦおよびＳＣＦの存在下で培養することにより誘導することができる。また、ｍＧＳ細胞はＷＯ２００５／１００５４８に記載される方法に準じて、精巣細胞から作製することができる。

本発明において用いられる多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞であり、より好ましくは誘導多能性幹細胞である。

本発明においては、通常、哺乳動物由来の多能性幹細胞が用いられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては、好ましくはマウス等のげっ歯類又はヒト等の霊長類由来の多能性幹細胞、より好ましくは、ヒト由来の多能性幹細胞が用いられる。

本発明においては、最も好ましくは、ヒト誘導多能性幹細胞が用いられる。

（３）多能性幹細胞培養用の培地
本発明の一実施形態として、本発明は、高濃度のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含有する、多能性幹細胞培養用の培地（本明細書中、本発明の培地ともいう）を提供する。本発明の培地を用いることにより、多能性幹細胞を効率的に増殖させることが可能となる。特に、本発明の培地は、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖し、維持するのに有用である。

本発明の培地は、高濃度のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含むことを特徴とする。「高濃度」とは、ヒト血液中の遊離Ｌ‐トリプトファン濃度相当のＬ‐トリプトファン濃度（４４μＭ）を上回ることを意味する。ヒト血液中の遊離Ｌ‐トリプトファン濃度相当のＬ‐トリプトファンを含有する通常の培地を用いて多能性幹細胞の培養を行うと、培地中のＬ‐トリプトファンの早期の枯渇により、多能性幹細胞の増殖が制限されてしまう。本発明の培地は、高濃度のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含有するので、多能性幹細胞培養時にＬ‐トリプトファンの枯渇が生じにくく、多能性幹細胞の高い増殖率、及び長期にわたる多能性幹細胞の増殖を達成することができる。

本発明の培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の濃度は、多能性幹細胞の増殖促進を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、本発明の培地中のＬ‐トリプトファン濃度は１７６μＭ以上、好ましくは３５２μＭ以上、更に好ましくは７０４μＭ以上である。本発明の培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度の上限値は、理論的にはＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の飽和濃度であるが、培地へのＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の溶解性やコストの観点から、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度は、好ましくは１４０８μＭ以下である。

本発明の培地は、多能性幹細胞の増殖を促進させる効果を有する。「多能性幹細胞の増殖を促進させる」とは、本発明の培地中で培養したときに、Ｌ‐トリプトファン濃度がヒト血液中の遊離Ｌ‐トリプトファン濃度相当（４４μＭ）であること以外は本発明の培地と同一の組成を有するコントロール培地中で培養した時と比較して、多能性幹細胞の増殖が促進されていることを意味する。

本発明の培地に含まれる、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体以外の成分については、多能性幹細胞の増殖促進効果を達成し得る限り特に限定されず、通常の多能性幹細胞の維持培養に使用される組成を適宜採用し得る。

本発明の培地は、多能性幹細胞の維持培養が可能な培地にＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を、上記濃度となるように添加することにより作製することができる。培地の作製には、１種類のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を用いてもよく、複数種類のＬ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体を組み合わせて用いてもよい。

本発明の培地は、哺乳動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、多能性幹細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。また、多能性幹細胞培養用として通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。市販の幹細胞培養用の基礎培地としては、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ培地（味の素株式会社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．社）、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｈＥＳＦ－ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ－ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ－７（株式会社細胞科学研究所）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。

本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。本発明の培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、ｂＦＧＦなどの増殖因子）を含む培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。

無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ^ＴＭＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄＬｉｐｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｂ２７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｎ２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられるが、これらに限定されない。

通常、本発明の培地は、Ｌ‐トリプトファンに加えて、Ｌ‐トリプトファン以外の全ての必須アミノ酸（Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐スレオニン、Ｌ‐ヒスチジン、Ｌ‐メチオニン、及びＬ‐バリン）を含む。

本発明の培地は、好ましくは、全ての非必須アミノ酸（Ｌ‐アラニン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐アスパラギン、Ｌ‐アスパラギン酸、グリシン、Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐システイン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐チロシン、Ｌ‐プロリン）を含む。ここで、Ｌ‐グルタミンに代えて、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐グルタミンを用いてもよい。

本発明の培地は、上述の２０種のアミノ酸に加えて、Ｌ‐シスチン等の天然アミノ酸を含んでいてもよい。

本発明の培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、Ｙ－２７６３２などのＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｆｏｒｍｉｎｇｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤、ペニシリン－ストレプトマイシンなどの抗生物質、ビタミン類、Ｌ－アスコルビン酸、リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２－アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。

本発明の培地は、脂肪酸を含んでもよい。本発明の培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１－エイコサジエン酸、５，８，１１－エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。

本発明の培地は、その使用目的に応じて、公知の細胞培養に使用される組成を適宜採用し得る。例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま増殖させることを目的とする場合、本発明の培地は、多能性幹細胞の分化を促進させる効果を有する物質を含まないことが好ましく、多能性幹細胞の分化を抑制する効果を有する物質を含むことが好ましい。多能性幹細胞の分化を抑制する効果を有する物質としては、例えば、ヒト多能性幹細胞については、ＦＧＦ２等を、マウス多能性幹細胞については、白血病阻止因子（ＬＩＦ）等を挙げることができる。

より具体的には、多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま増殖促進させるための培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地にＬ－アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン、ＮａＨＣＯ_３、インスリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を添加した培地（ＣｈｅｎＧｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２０１１Ｍａｙ；８（５）：４２４－４２９）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に非必須アミノ酸、Ｌグルタミン、βメルカプトエタノール、インスリン、トランスフェリン、コレステロール、血清アルブミン、ピペコリン酸、塩化リチウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を添加した培地（ＬｕｄｗｉｇＴＥｅｔａｌ．，ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２００６Ａｕｇ；３（８）：６３７－４６）、白血病抑制因子、ポリビニルアルコール、Ｌ－グルタミン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、２－メルカプトエタノール及び抗生物質を添加したマウス胚性幹細胞維持用の無血清培地（特開２００７－２２８８１５号公報）、パネキシン、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ及びビタミンＣとを混合してなる無血清培地（特開２００８－１４８６４３号公報）、ＴＧＦ－βを含有することを特徴とする間葉系幹細胞の多分化能維持用培地（特開２０１０－０９４０６２号公報）などが挙げられ、これらの組成を参考に本発明の培地を調製することができる。

例えば、本発明の培地は、Ｌ－アスコルビン酸、セレン、トランスフェリン、インスリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβ１を含む基礎培地に、終濃度１７６μＭ以上となるようにＬ－トリプトファン又はＬ－トリプトファン誘導体を添加して調製することができるがこれに限定されない。

本発明の培地のｐＨは、約６．０～約８．５であることが好ましく、より好ましくは約７．０～約７．５に調整される。培地は、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行うことが好ましい。

本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養方法にも用いることができる。
また、本発明の培地の形態は、本発明の所望の効果が得られる限り特に限定されず、例えば、液体培地、半流動培地、及び固形培地の形態として調製することができる。また、本発明の培地を、粉末状の形態において調製してもよい。粉末状の形態に調製することにより、輸送や保存が極めて容易となり得る。また、使用時に滅菌水及び／又は寒天等を添加することにより、容易に液体状、半液体状、又は固形状の培地を調製することができる。

（４）多能性幹細胞の培養方法１
本発明は、上記本発明の培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞の培養方法（本明細書中、本発明の方法１ともいう）を提供する。

本発明の培地を用いることにより、多能性幹細胞を効率的に増殖させることが可能となる。特に、本発明の培地は、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖し、維持するのに有用である。従って、本発明の方法１は、好ましくは多能性幹細胞を増殖するための方法であり、より好ましくは、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖又は維持するための方法である。

本発明の方法１における、培地中の多能性幹細胞の濃度は、所望の効果を有する限り特に制限されないが、通常１０^０～１０^７個／ｃｍ^３、好ましくは、１０^１～１０^６個／ｃｍ^３、より好ましくは１０^２～１０^５個／ｃｍ^３である。

多能性幹細胞の培養は、あらかじめＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度を所望の濃度に調整した上記本発明の培地中に、多能性幹細胞を播種することにより行ってもよく、細胞培養開始後に、培地中にＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加し、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度を、本発明の培地が要する濃度に調整後、さらに培養を続けることにより行ってもよい。
細胞培養開始後に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加する場合、下記に詳述する本発明の培地添加物を用いてもよい。

本発明の方法１における培養条件は、本発明の培地が用いられることを除いては、多能性幹細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、培養の目的に応じて通常の多能性幹細胞の培養に用いられる培養条件を適宜採用し得る。

例えば、多能性幹細胞の未分化性を維持させたまま培養する方法としては、実験医学別冊目的別で選べる細胞培養プロトコール（羊土社）などに記載の方法が挙げられる。多能性幹細胞の培養はマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）やマウス繊維芽細胞株（ＳＴＯ）などのフィーダー細胞を用いてもよく、フィーダーフリー環境下で行ってもよい。

本発明の方法１において、細胞の培養に用いられる培養器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルなどが挙げられる。

細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。
細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。

その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％である。酸素濃度は、通常１～４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。

本発明の方法１において、多能性幹細胞は、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。

細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、本発明の方法１における多能性幹細胞の培養する期間は、通常２日間以上、好ましくは４日間以上、より好ましくは７日間以上であり、理論的には無限に培養を継続することができる。本発明の培地中で培養した多能性幹細胞を回収し、その一部又は全部を新鮮な本発明の培地中に継代し、引き続き培養を続けることにより、長期間に亘り、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖又は維持することができる。

（５）多能性幹細胞培養調製物
本発明は、上記本発明の培地及び多能性幹細胞を含む、多能性幹細胞培養調製物（本発明の培養調製物）を提供する。

本発明の培養調製物における多能性幹細胞は、生存し、増殖している細胞である。

本発明の培養調製物における多能性幹細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された多能性幹細胞」の純度（全細胞数に占める多能性幹細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

本発明の培養調製物において、多能性幹細胞は、例えば、液体状、又は半流動状の本発明の培地中に存在する。一態様において、本発明の培養調製物は、多能性幹細胞の、本発明の培地中の懸濁液である。本発明の培養調製物は、適切な容器中に封入されていてもよい。

本発明の培養調製物は、上記本発明の方法１の実施に有用である。

（６）多能性幹細胞の培養方法２
以下の工程を含む、多能性幹細胞の培養方法（本発明の培養方法２）：
（１）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地中で、多能性幹細胞を培養すること；
（２）得られた多能性幹細胞培養物に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加し、（１）で消費された培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の一部又は全部を補うこと；及び
（３）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が添加された多能性幹細胞培養物を、引き続き培養に付すこと。

本発明の培地を、工程（１）において用いてもよい。しかしながら、工程（１）において用いられる培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度は、多能性幹細胞を増殖させることが可能な濃度（好ましくは、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖し、維持することが可能な濃度）であれば足り、本発明の培地の様な「高濃度」であることを要しない。工程（１）において用いられる培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度は、例えば、培養開始時点において１０μＭ以上、好ましくは１５μＭ以上、より好ましくは４４μＭ以上である。

工程（１）において用いられる培地の組成は、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、「高濃度」であることを要しない点を除き、本発明の培地と同一である。

工程（１）における培養条件は、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、「高濃度」であることを要しない点を除き、上記本発明の方法１と同一である。

工程（１）の培養の結果、多能性幹細胞は増殖し（好ましくは、未分化状態を維持したまま増殖し）、これに伴い、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が消費され、その培地中の濃度が低下する。

工程（２）において、工程（１）で得られた多能性幹細胞培養物にＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加するタイミングは、多能性幹細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されず、任意のタイミングで添加することができる。例えば、工程（１）において、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、１０μＭ未満、好ましくは１５μＭ未満、より好ましくは４４μＭ未満にまで減少した段階で、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加する。或いは、工程（１）において、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、培養開始時を１００％として、５０％以下、好ましくは２５％以下にまで減少した段階で、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加する。例えば、工程（１）の培養開始から、２～５日後、好ましくは３～５日後、より好ましくは４～５日後に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加することができる。

培地に添加するＬ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体は、１種類のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を用いてもよく、複数種類のＬ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体を組み合わせて用いてもよい。

培地に添加されるＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の量は、多能性幹細胞の増殖促進等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の濃度が、多能性幹細胞を増殖させることが可能な濃度（好ましくは、未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞を増殖し、維持することが可能な濃度）となるように添加する。例えば、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、１７６μＭ以上、好ましくは３５２μＭ以上となるように、添加を行う。培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、本発明の培地の様な「高濃度」となるように添加を行ってもよい。一態様において、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度が、１７６μＭ以上、好ましくは３５２μＭ以上、更に好ましくは７０４μＭ以上となるように添加を行う。添加後の培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度の上限値は、理論的にはＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の飽和濃度であるが、培地へのＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の溶解性やコストの観点から、培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体濃度は、好ましくは１４０８μＭ以下である。
なお、本明細書における「（１）で消費された培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の一部又は全部を補うこと」には、工程（１）において培養当初に添加されていたＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の量の一部又は全量を補うことに加えて、培養当初に添加されていた量以上のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を培地へ添加することも含まれる。

ここで、本発明の方法２の特徴は、多能性幹細胞の培養において、培地中に含有されるアミノ酸のうち、最も早く消費され、枯渇するＬ‐トリプトファンの一部又は全部を、外からのＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の添加により補う点にあるので、Ｌ‐トリプトファン以外のアミノ酸については、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体と併せて添加してもよいし、添加しなくてもよい。

一態様において、工程（２）においては、アミノ酸としては、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体のみを添加し、他のアミノ酸は添加しない。

別の態様において、工程（２）において、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体と併せて、Ｌ‐トリプトファン以外のアミノ酸（Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐スレオニン、Ｌ‐ヒスチジン、Ｌ‐メチオニン、Ｌ‐バリン、Ｌ‐アラニン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐アスパラギン、Ｌ‐アスパラギン酸、グリシン、Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐システイン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐チロシン、Ｌ‐プロリン）又はその誘導体を、添加してもよく、添加しなくてもよい。添加するアミノ酸は、１種類であってもよく、複数種類であってもよい。

そして、工程（３）において、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が添加された多能性幹細胞培養物を、引き続き培養に付す。工程（３）における培養条件は、工程（１）と同様であってもよいし、本発明の所望の効果が得られる限り、変更されてもよい。本発明の好ましい一態様において、工程（３）における培養条件は、工程（１）と同様である。Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の添加によりＬ‐トリプトファンの枯渇が回避されるので、多能性幹細胞は、引き続き、（好ましくは、未分化状態を維持しながら）増殖を続けることができる。

本発明の方法２においては、培地全体の交換を要することなく、アミノ酸としてＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体のみ、或いはＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む一部のアミノ酸のみの添加によって、多能性幹細胞の増殖を維持することができるので、低コスト、且つ効率的に、多能性幹細胞を増殖させることができる。

（７）培地添加剤
本発明は、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を含む培地添加剤（本明細書中、本発明の培地添加剤ともいう）を提供する。本発明の培地添加剤は、上記本発明の方法１または２においてＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加する際に使用することができる。

本発明の培地添加剤に含まれるＬ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体は、１種類のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を用いてもよく、複数種類のＬ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体を組み合わせて用いてもよい。

本発明の培地添加剤を、多能性幹細胞の培養用培地に添加することにより、多能性幹細胞の増殖を促進させる効果を有する。本発明の培地添加剤は、好ましくは多能性幹細胞増殖促進用である。

本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、Ｌ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体に加え、使用の目的に応じて、血清代替物、培地添加物、脂肪酸をさらに含み得る。これらの血清代替物、培地添加物、脂肪酸は上記に記載のとおりであり、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、Ｌ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体に加え、従来から細胞の培養に用いられてきた添加物などを適宜含むことができる。

一態様において、本発明の培地添加剤は、アミノ酸としては、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体のみを含有し、他のアミノ酸は含有しない。

一態様において、本発明の培地添加剤は、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体に加えて、Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐システイン、Ｌ‐アスパラギン酸、Ｌ‐セリン及びＬ‐メチオニンからなる群から選択される１、２、３、４、５又は６種のアミノ酸を含有する。この場合、本発明の培地添加剤に含有されるアミノ酸として前記されたアミノ酸以外のアミノ酸については、本発明の培地添加剤に含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。

本発明の培地添加剤は、所望の効果を損なわない限り、Ｌ‐トリプトファン及び／又はＬ‐トリプトファン誘導体に加え、さらに、任意の添加剤、例えば、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を適当量含有していてもよい。

本発明の培地添加剤は、所望の効果が得られる限り、いかなる剤形であってもよく、例えば、溶液、固形、粉末状等が挙げられる。固形または粉末状である場合は、適切な緩衝液等を使用して所望の濃度になるように溶解し、使用することができる。
培地添加剤が溶液である場合、該溶液のｐＨは、約５．０～約８．５であることが好ましく、より好ましくは約６．０～約８．０に調整される。培地添加剤が溶液である場合、該溶液は、好ましくは、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行う。

以下に参考例及び実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

（参考例）
培地中の各アミノ酸量を予め定量した培地を用いて、多能性幹細胞２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパン社）を５日間培養し、培地中の各アミノ酸量を測定した。多能性幹細胞の培養は、マトリゲル（３５４２７７、コーニング社）をコーティングした１００ｍｍ組織培養用ディッシュ（３５３００３、日本ベクトンディッキンソン社）中に、１,０００，０００個の細胞を播種し、５％ＣＯ_２／３７℃で培養した。また、培地中に残存するアミノ酸量の測定は、以下の方法により行った。アミノ酸の定量分析は、新保ら（ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００９Ｊｕｌ１；８１（１３）：５１７２－９．Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｒｅｃｏｌｕｍｎｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＳｈｉｍｂｏＫ，ＹａｈａｓｈｉＡ，ＨｉｒａｙａｍａＫ，ＮａｋａｚａｗａＭ，ＭｉｙａｎｏＨ．）に報告されているＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで実施した。細胞培養後上清は１．５ｍＬチューブにとり、測定時までマイナス８０℃で保存した。サンプルは蛋白除去処理を実施後、ＡＰＤＳ試薬で誘導体化を実施して分析装置にかけた。各サンプル中のアミノ酸濃度は検量線を用いて算出した。その結果、培養開始時に４４μＭの濃度で含まれていたＬ－トリプトファンは培養４日目に枯渇した。一方で、その他のアミノ酸は、培養５日後であっても培地中に残存しており、最も少ないものでも約２０％程度の残存が確認された。従って、多能性幹細胞の培養においては、Ｌ－トリプトファンが全アミノ酸中で最も早く枯渇することが分かった。

実施例１：Ｌ‐トリプトファンの市販培地３種における増殖促進効果
最初に、Ｌ‐トリプトファンによる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の増殖促進効果を３種類の市販培地を用いて評価した。ヒトｉＰＳ細胞は、ｉＰＳアカデミアジャパン社より購入した２０１Ｂ７株を用い、５％ＣＯ_２／３７℃の条件で行った。
Ｌ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８（ライフテクノロジーズ社：Ａ１５１７００１）、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社：０５８５０）、ＴｅＳＲ２（ステムセルテクノロジーズ社：０５８６０）の培地に所定の濃度になるように添加し、培養に用いることによりその効果を検討した。

Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－８、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２の培地にＬ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）を最終濃度４４、１７６、３５２、７０４、１４０８μＭになるように添加した培地を調製し、Ｌ‐トリプトファンの増殖促進効果を検討した。基底膜マトリックスとしてマトリゲル（日本ベクトンディッキンソン社）をコートした６ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり１３，０００個の細胞をシングルセルで播種した。細胞を播種した翌日に上記にて調製した培地を用いて評価を行った。培養期間は６日間とし、Ｌ‐トリプトファン添加時を０とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて細胞被覆率を計測した。播種時に使用する培地には、最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を添加していない培地で培養した。
各々の培地ごとに実験を１連にて行った結果を図１、２、３に示す。Ｌ‐トリプトファン濃度依存的に増殖促進効果を示す結果が得られた。また未分化マーカー（ＯＣＴ、Ｎａｎｏｇ、アルカリフォスファターゼ）の発現は高濃度のＬ－トリプトファン添加による影響は見られなかった（データ示さず）。

実施例２：Ｌ‐トリプトファンの増殖促進効果－別のヒト誘導多能性幹細胞株を使用した培養結果
次に、Ｌ‐トリプトファンによる増殖促進効果をヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の別株２５３Ｇ４及びヒト胚性幹細胞Ｈ９株を用いて評価した。培地はｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社：０５８５０）を用い、５％ＣＯ_２／３７℃の条件で培養を行った。
Ｌ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）は、ｍＴｅＳＲ１（ステムセルテクノロジーズ社：０５８５０）培地に所定の濃度になるように添加し、培養に用いることによりその効果を検討した。

ｍＴｅＳＲ１の培地にＬ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）を最終濃度４４、１７６、３５２、７０４、１４０８μＭになるように添加した培地を調製し、Ｌ‐トリプトファンの増殖促進効果を検討した。基底膜マトリックスとしてマトリゲル（日本ベクトンディッキンソン社）をコートした６ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり２５３Ｇ４は４０，０００個、Ｈ９は１０，０００個の細胞をシングルセルで播種した。細胞を播種した翌日に上記にて調製した培地に置換して評価を行った。培養期間は６日間とし、Ｌ‐トリプトファン添加時を０とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて細胞被覆率を計測した。播種時に使用する培地には、最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を添加していない培地で培養した。
各々の細胞ごとに実験を５連にて行った結果を図４、５に示す。Ｌ‐トリプトファンの濃度依存的増殖促進効果は別のヒト多能性幹細胞でも確認された。

実施例３：Ｌ‐トリプトファンの増殖促進効果－ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを使用した培養結果
次に、Ｌ‐トリプトファンによる増殖促進効果をヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で評価した。培地はウシ胎児血清を１０％添加したＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社：１１９６５）を用い、５％ＣＯ_２／３７℃の条件で培養を行った。
Ｌ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）は、１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社：１１９６５）に所定の濃度になるように添加し、培養に用いることによりその効果を検討した。

ウシ胎児血清を１０％添加したＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社：１１９６５）にＬ‐トリプトファン（シグマアルドリッチ社：Ｔ８９４１）を最終濃度４４、１７６、３５２、７０４、１４０８μＭになるように添加した培地を調製し、Ｌ‐トリプトファンの増殖促進効果を検討した。６ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり１０，０００個の細胞をシングルセルで播種した。細胞を播種した翌日に上記にて調製した培地に置換して評価を行った。培養期間は６日間とし、Ｌ‐トリプトファン添加時を０とし、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて細胞被覆率を計測した。
実験を５連にて行った結果を図６に示す。Ｌ‐トリプトファンの濃度依存的増殖促進効果はヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞では確認されなかった。

実施例４：Ｌ－キヌレニンの市販培地における増殖促進効果
ｍＴｅＳＲ１培地にL-キヌレニン（シグマアルドリッチ社：Ｋ８６２５）を最終濃度５０、１００、２００、５００、１０００μＭになるように添加した培地を調製し、増殖促進効果を検討した。播種時から２日間は最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を添加した。基底膜マトリックスとしてマトリゲル（日本ベクトンディッキンソン社）をコートした６ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり２０，０００個の細胞をシングルセルで播種した。細胞を播種した翌々日にＹ－２７６３２を含まない上記の通り調製した培地を用いて評価を行った。Ｌ－キヌレニン添加時を０とし、０、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて細胞被覆率を計測した。結果を図７に示す。図７に示す通り、Ｌ－キヌレニン５０－５００μＭ添加区において細胞増殖促進効果を示す結果が得られた。

実施例５：キヌレン酸の市販培地における増殖促進効果
ｍＴｅＳＲ１培地にキヌレン酸（シグマアルドリッチ社：Ｋ３３７５）を最終濃度５０、１００、２００、５００、１０００μＭになるように添加した培地を調製し、増殖促進効果を検討した。播種時から2日間は最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を添加した。基底膜マトリックスとしてマトリゲル（日本ベクトンディッキンソン社）をコートした６ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり２０，０００個の細胞をシングルセルで播種した。細胞を播種した翌々日にＹ－２７６３２を含まない上記の通り調製した培地を用いて評価を行った。キヌレン酸添加時を０とし、０、２４、４８、７２、９６、１２０時間後にＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて細胞被覆率を計測した。結果を図８に示す。図８に示す通り、キヌレン酸５０－５００μＭ添加区において細胞増殖促進効果を示す結果が得られた。

本発明によれば、多能性幹細胞の細胞増殖を促進させることが可能となり、多能性幹細胞の培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを削減することができる。

本出願は、日本で出願された特願２０１７－０６３８４２（出願日：２０１７年３月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

以下の工程を含む、多能性幹細胞の培養方法：
（１）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐キヌレニン、キヌレン酸又はトリプトファン及びアミノ酸がペプチド結合したジペプチドから選択されるＬ‐トリプトファン誘導体、並びに多能性幹細胞の分化を抑制する効果を有する物質を含む無血清培地中で、ヒト多能性幹細胞を未分化状態を維持したまま培養すること；
（２）得られたヒト多能性幹細胞培養物に、Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体を添加し、（１）で消費された培地中のＬ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体の一部又は全部を補うこと；及び
（３）Ｌ‐トリプトファン又はＬ‐トリプトファン誘導体が添加されたヒト多能性幹細胞培養物を、引き続き培養に付すこと。
トリプトファン誘導体が、トリプトファンとアミノ酸がペプチド結合したジペプチドである、請求項１記載の方法。
ジペプチドが、Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐トリプトファンである、請求項２記載の方法。