JP7492730B2 - Method and system for identifying the species, variety and/or quality of silkworm-derived silk - Google Patents
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Description
本発明は、カイコのような絹糸虫由来の絹について、由来種、品種、及び品質を同定するための方法及びシステムに関する。 The present invention relates to a method and system for identifying the species, variety, and quality of silk derived from silkworms such as silkworms.
絹織物は高価なものであるが、材料となる絹が、どの品種のカイコに由来し、どのような精練法を経て織物になったのかを製品になった後で識別することは事実上不可能であった。例えば、繭の価格は、産地、品種等により大きく異なり、特に国産の「小石丸」は、現在のところ、外国産の繭の約１０倍程度高価であると言われるが、実際に生産された絹糸の産地と、製品に表示される絹糸の産地が異なっていても、それを外観等から識別することは困難であった。また、貴重な野蚕絹糸(ヤママユ、エリサン、シンジュサン、ムガサン、サクサン、テンサン、タサールサン、クリキュラ等)に、カイコ絹糸が混入されても、製品の状態から、混入の有無や混合比を確実に割り出す手段はなかった。また、古い絹糸と年内に生産された絹糸とを明確に識別する手段もなかった。さらには、古代絹織物の修復において、可能ならば同じ品種の絹糸を使いたいという要望もあるが、古代絹織物の絹糸の由来種を特定することは困難であった。 Silk fabrics are expensive, but it has been virtually impossible to identify which variety of silkworm the silk used as material came from and what kind of refining method was used to make the fabric after it was made. For example, the price of cocoons varies greatly depending on the place of origin and variety, and domestic "Koishimaru" cocoons are currently said to be about 10 times more expensive than foreign cocoons. However, even if the place of origin of the silk thread actually produced differs from the place of origin of the silk thread indicated on the product, it was difficult to distinguish them from the appearance. Furthermore, even if silkworm silk thread was mixed into valuable wild silkworm silk (Yamamayu, Eri San, Shinju San, Muga San, Saku San, Ten San, Tasar San, Cricula, etc.), there was no way to reliably determine the presence or absence of contamination or the mixture ratio from the state of the product. Furthermore, there was no way to clearly distinguish between old silk thread and silk thread produced within the same year. Furthermore, when restoring ancient silk fabrics, there is a desire to use silk thread of the same variety if possible, but it was difficult to identify the origin of the silk thread of ancient silk fabrics.
カイコ繭の品種識別は、繭の状態であれば、形や色などの外観からある程度は可能だが、確定することは難しい。特に、このような外観からの識別は、熟練した職人以外では非常に困難である。繭内に蛹が残っている場合は、蛹のゲノム解析で識別することが想定されるが、蛹のない状態、特に精練した絹糸となった状態では、識別は事実上不可能であった。 Identifying the variety of silkworm cocoons is possible to some extent from the appearance such as shape and color while still in the cocoon state, but it is difficult to be definitive. In particular, such identification from appearance is extremely difficult for anyone other than a skilled craftsman. If the pupa remains inside the cocoon, it is expected that identification can be done by genomic analysis of the pupa, but when there is no pupa, especially when the silk has become refined silk thread, identification is virtually impossible.
非特許文献１及び２には、絹糸をトリプシン処理した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析することで、絹糸に含まれるタンパク質成分のプロテオーム解析を行い、絹糸の由来種を識別する方法が開示されている。また、非特許文献３では、非天然アミノ酸を導入した家蚕由来の絹糸について、各種の物性試験が行われている。絹糸を臭化リチウム溶液に溶解して、上清に尿素処理、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、トリプシン処理を加えて得られたペプチド断片をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで分析することで、野生型にはないピークの出現を確認したことが開示されている。 Non-Patent Documents 1 and 2 disclose a method for identifying the species of origin of silk thread by treating the silk thread with trypsin, then analyzing it with LC/MS/MS to perform proteome analysis of the protein components contained in the silk thread. Non-Patent Document 3 discloses various physical property tests on silk thread derived from domesticated silkworms into which unnatural amino acids have been introduced. It discloses that silk thread was dissolved in a lithium bromide solution, and the supernatant was treated with urea, subjected to SDS-PAGE, and treated with trypsin. The peptide fragments obtained were analyzed by MALDI-TOF-MS, and the appearance of peaks not present in the wild type was confirmed.
非特許文献１、２に示す方法では、絹糸の由来する絹糸虫の種を識別することは可能であるが、カイコの品種同定までは実現されていない。また、非特許文献３に示す方法は、野生型と特定の遺伝子組み換え体との識別は可能であるが、天然の由来種、品種の同定は実施されていない。そして、いずれの方法も、絹の製造年の同定は不可能である。さらに、これらの方法では、いずれもトリプシン処理を行うために数時間～数日の時間を要し、使用する試薬、手技等にコストや時間がかかる、という問題があった。本発明の目的は、絹の由来種、品種及び品質（製造年等を含む）を、短時間で簡易に同定可能な方法及び試験システムを提供することである。 The methods shown in Non-Patent Documents 1 and 2 are capable of identifying the species of silkworm from which silk thread is derived, but do not identify the silkworm variety. The method shown in Non-Patent Document 3 is capable of distinguishing between wild-type and specific genetically modified organisms, but does not identify the natural species or variety of origin. And neither method is capable of identifying the year of silk production. Furthermore, all of these methods have the problem that trypsin treatment takes several hours to several days, and the reagents and procedures used are costly and time-consuming. The object of the present invention is to provide a method and test system that can easily identify the species, variety, and quality (including the year of production, etc.) of silk in a short period of time.
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ね、絹糸、繭又はこれらの一部からなる試料を酸性化剤、酸化剤又はこれらの混合物で処理し、処理後の試料中のタンパク質及び／又はペプチド成分を分析することで、絹の由来種、品種及び品質を同定可能であることを見出した。本願発明は、当該新規知見に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）絹糸虫由来の絹の由来種、品種及び／又は品質を同定する方法であって、
ａ）絹を含む試料を酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤と接触させる前処理工程；
ｂ）前処理後の試料中に含まれるタンパク質及び／又はペプチド成分の分析を行う工程；及び
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する工程；を含む、方法。
（２）前記前処理剤が、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸、硝酸、塩酸、ジフルオロ酢酸、モノフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、次亜塩素酸塩、過酸化水素、フッ化水素、ブロモ酢酸、オゾン、ハロゲン、二酸化塩素、二酸化マンガン及びこれらの混合物からなる群より選択される、（１）の方法。
（３）工程ｂ）において、前記分析が、ＡＰＣＩ法、ＣＩ法、ＥＩ法、ＥＳＩ法、ＦＡＢ法、ＦＤ法、ＦＩ法、ＬＩＬＢＩＤ法、ＬＳＩＭＳ法、ＭＡＬＤＩ法、ＰＢ法、ＰＤ法、ＳＩＭＳ法、ＴＳＰ法又はこれらの組み合わせからなる群から選択されるイオン化手段を用いた質量分析である、（１）又は（２）の方法。
（４）前記イオン化手段が、ＥＳＩ法又はＭＡＬＤＩ法である、（３）の方法。
（５）工程ｂ）において、前記分析が、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを含む、（４）の方法。
（６）工程ｂ）において、前記分析が、ＬＣ、ＭＰＬＣ、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動法よる分離を含む、（１）～（５）のいずれかの方法。
（７）工程ｃ）が、既知の由来種、品種及び／又は品質を有する複数の絹からなる対照群について得られた分析結果を利用する、（１）～（６）のいずれかの方法。
（８）工程ｃ）が、既知の由来種、品種及び／又は品質を有する複数の絹からなる対照群について得られた分析結果を登録したデータベースを利用する、（７）の方法。
（９）以下を備える、絹糸虫由来の絹の由来種、品種及び／又は品質の同定のためのシステム。
－酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤で処理された、絹を含む試料中に含まれるタンパク質及び／又はペプチド成分の分析を行う、分析部；及び
－前記分析部より出力された分析結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する、解析部。
（１０）－絹を含む試料を、酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤で処理する、処理部；をさらに含む（９）のシステム。
（１１）前記分析部は、質量分析計を備える、（９）又は（１０）のシステム。
（１２）前記質量分析計は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質量分析計である、（１１）に記載のシステム。
（１３）前記解析部はデータベースを備え、前記データベースは、既知の由来種、品種及び／又は品質を有する複数の絹からなる対照群について得られた分析結果を予め登録したデータベースである、（９）～（１２）のいずれかシステム。
In order to solve the above problems, the present inventors have conducted extensive research and found that it is possible to identify the species, variety and quality of silk by treating a sample consisting of silk thread, cocoon or a part thereof with an acidifying agent, an oxidizing agent or a mixture of these and analyzing the protein and/or peptide components in the treated sample. The present invention is based on this novel finding and specifically provides the following inventions.
(1) A method for identifying the species, variety and/or quality of silk derived from silkworms, comprising:
a) a pretreatment step of contacting a silk-containing sample with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof;
b) analyzing the protein and/or peptide components contained in the pre-treated sample; and c) qualitatively and/or quantitatively analyzing the species, variety and/or quality of the silk based on the results of step b).
(2) The method according to (1), wherein the pretreatment agent is selected from the group consisting of trifluoroacetic acid, formic acid, acetic acid, nitric acid, hydrochloric acid, difluoroacetic acid, monofluoroacetic acid, propionic acid, butyric acid, hypochlorite, hydrogen peroxide, hydrogen fluoride, bromoacetic acid, ozone, halogens, chlorine dioxide, manganese dioxide, and mixtures thereof.
(3) The method according to (1) or (2), wherein in step b), the analysis is mass spectrometry using an ionization means selected from the group consisting of APCI, CI, EI, ESI, FAB, FD, FI, LILBID, LSIMS, MALDI, PB, PD, SIMS, TSP, or a combination thereof.
(4) The method according to (3), wherein the ionization means is an ESI method or a MALDI method.
(5) The method of (4), wherein in step b), the analysis comprises MALDI-TOF-MS.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein in step b), the analysis comprises separation by LC, MPLC, HPLC, or capillary electrophoresis.
(7) Any of the methods (1) to (6), wherein step c) utilizes analytical results obtained for a control group consisting of multiple silks having known species of origin, varieties and/or qualities.
(8) The method according to (7), wherein step c) utilizes a database in which analytical results obtained for a control group consisting of multiple silks of known species, varieties and/or qualities are registered.
(9) A system for identifying the species, variety and/or quality of silk derived from silkworms, comprising:
- an analysis unit that analyzes protein and/or peptide components contained in a silk-containing sample that has been treated with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof; and - an analysis unit that qualitatively and/or quantitatively analyzes the species, variety, and/or quality of the silk based on the analysis results output from the analysis unit.
(10)-The system of (9), further comprising a processing unit for treating the silk-containing sample with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof.
(11) The system of (9) or (10), wherein the analysis unit includes a mass spectrometer.
(12) The system according to (11), wherein the mass spectrometer is a MALDI-TOF-MS mass spectrometer.
(13) Any of the systems according to (9) to (12), wherein the analysis unit is equipped with a database, and the database is a database in which analytical results obtained for a control group consisting of multiple silks having known species of origin, varieties and/or qualities are registered in advance.
本発明の方法によると、絹の由来種、品種及び品質（年代を含む）を、短時間で簡易に同定することが可能となる。また、本発明のシステムを使用することで、絹の由来種、品種及び品質（製造年等を含む）を、短時間で簡易に同定することが可能となる。 The method of the present invention makes it possible to easily identify the species, variety, and quality (including year) of silk in a short time. In addition, by using the system of the present invention, it makes it possible to easily identify the species, variety, and quality (including year of manufacture, etc.) of silk in a short time.
＜絹糸虫由来の絹の由来種、品種及び／又は品質を同定する方法＞
１．概要
本発明の方法は、絹糸虫由来の絹の由来種、品種及び／又は品質を同定する方法であって、ａ）絹糸虫由来の絹を含む試料を酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤と接触させる前処理工程：ｂ）前処理後の試料中に含まれるタンパク質及び／又はペプチド成分の分析を行う工程；及びｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する工程；を含む、方法である。
Method for identifying the species, variety and/or quality of silkworm-derived silk
1. Overview The method of the present invention is a method for identifying the origin species, variety, and/or quality of silk derived from silkworms, comprising: a) a pretreatment step of contacting a sample containing silk derived from silkworms with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof; b) a step of analyzing protein and/or peptide components contained in the sample after the pretreatment; and c) a step of qualitatively and/or quantitatively analyzing the origin species, variety, and/or quality of the silk based on the results of step b).
絹を構成する繊維の主成分となるフィブロインは堅牢な構造を有する高分子のタンパク質であり、例えば、ＳＤＳ処理等の従来の処理では、例えば、質量分析、電気泳動等に適した状態とすることは困難であった。しかし、絹を含む試料について、酸性化剤及び／又は酸化剤を絹と接触させることで、試料中に含まれるタンパク質の少なくとも一部に小分子化、つまり、タンパク質が断片化されることが見いだされた。なお、通常のタンパク質は、酸性化剤及び／又は酸化剤では、容易には断片化されない。 Fibroin, the main component of the fibers that make up silk, is a polymeric protein with a robust structure, and it has been difficult to prepare it in a state suitable for mass spectrometry, electrophoresis, etc., using conventional treatments such as SDS treatment. However, it has been found that by contacting a sample containing silk with an acidifying agent and/or an oxidizing agent, at least a portion of the proteins contained in the sample are broken down into smaller molecules, that is, the proteins are fragmented. Note that normal proteins are not easily fragmented by acidifying agents and/or oxidizing agents.
前記のタンパク質の断片化のパターンは、絹の由来種、品種、古さ等の品質によって異なることが見いだされた。これにより、所定の条件下で、絹を酸性化及び／又は酸化し、得られたタンパク質断片（タンパク質及び／又はペプチド）を分析することで、その由来種、品種及び品質を特定し得ることが見いだされた。以下、分析対象であるタンパク質及び／又はペプチドを、まとめて単に「タンパク質」と称する。 It was found that the fragmentation pattern of the protein differs depending on the quality of the silk, such as the species of origin, variety, and age. As a result, it was found that by acidifying and/or oxidizing silk under specified conditions and analyzing the resulting protein fragments (proteins and/or peptides), it is possible to identify the species of origin, variety, and quality. Hereinafter, the proteins and/or peptides to be analyzed are collectively referred to simply as "proteins."
本発明において「分析」とは、試料より直接得られる出力データ、いわゆる生データを取得することを示し、「解析」とは、前記出力データに基づいて割り出される出力情報を取得することを示すものとする。 In the present invention, "analysis" refers to obtaining output data obtained directly from a sample, i.e., so-called raw data, and "analysis" refers to obtaining output information calculated based on the output data.
本発明の方法における各工程のフロー図を図１に示す。本発明の方法は、少なくとも、試料の準備、試料の前処理工程（工程ａ））、分析工程（工程ｂ））及び得られた結果の解析工程（工程ｃ））を含む。これらの各工程について、下記に詳説する。なお、本発明の方法は、これらの各工程に加え、他の工程を含んでいてもよい。 Figure 1 shows a flow diagram of each step in the method of the present invention. The method of the present invention includes at least a sample preparation step, a sample pretreatment step (step a)), an analysis step (step b)), and an analysis step of the obtained results (step c). Each of these steps is described in detail below. Note that the method of the present invention may include other steps in addition to these steps.
２．各工程の説明
２－１ 試料の準備
本発明の方の試験対象となる「試料」は、絹糸虫由来の絹である。ここでいう「絹」とは、絹糸虫が吐糸した繊維を含む全てのものを包含し、繭及び繭から得られた絹糸又はその一部を含む。本明細書において、「繭」とは、特に、絹糸虫の蛹を保護するために繊維で構成される蛹室を指し、多くは、絹に含まれる繊維成分（フィブロインタンパク質）の接着成分(セリシンタンパク質等)による接着、交絡等により形成される。試料としての繭は、生繭であっても、加熱処理繭であってもよく、繭の一部を試験片として切り取ったものでも、繭から取り出した繊維であってもよい。本明細書において、「絹糸」とは、絹糸が吐糸した繊維に各種の加工を行ったものを指し、生糸、練糸、及び、これらを染色したもの（織物とした後に染色されたものを含む）をいずれも包含する。試料としての絹糸は、撚糸となる前の繊維であっても、撚糸であってもよく、また、撚糸を再度解した繊維であってもよい。
2. Description of each step 2-1 Preparation of sample The "sample" to be tested in the present invention is silk derived from silkworms. The term "silk" as used herein includes all materials including fibers spun by silkworms, including cocoons and silk threads obtained from cocoons or parts thereof. In this specification, the term "cocoon" refers in particular to a pupal chamber made of fibers to protect the pupa of silkworms, and is often formed by adhesion, entanglement, etc., using adhesive components (sericin proteins, etc.) of fiber components (fibroin proteins) contained in silk. The cocoon as a sample may be a raw cocoon or a heat-treated cocoon, a part of a cocoon cut out as a test piece, or a fiber taken out from a cocoon. In this specification, the term "silk thread" refers to fibers spun by silk threads that have been subjected to various processes, and includes raw silk, degummed silk, and dyed versions of these (including those dyed after being woven). The silk thread sample may be fibers before being made into twisted yarn, twisted yarn, or fibers that have been untwisted again.
本明細書において「絹糸虫」とは、絹糸腺を有し、絹糸を吐糸することのできる昆虫の総称をいう。具体的には、チョウ目、ハチ目、アミメカゲロウ目、トビケラ目、コチョウ目、ハエ目、シロアリモドキ目等のうち主として幼虫期に営巣、営繭又は移動のために吐糸することのできる種類を指す。チョウ目であれば、多量の絹糸を吐糸できるカイコガ科(Bombycidae)、ヤママユガ科（Saturniidae）、イボタガ科(Brahmaeidae)、オビガ科(Eupterotidae)、カレハガ科（Lasiocampidae）、ミノガ科（Psychidae）、ヒトリガ科（Archtiidae）、ヤガ科（Noctuidae）等は本明細書の絹糸虫として好ましい。Bombyx属、Samia属、Antheraea属、Saturnia属、Attacus属、Rhodinia属に属する種、具体的には、カイコ、クワコ（Bombyx mandarina）、シンジュサン（Samia cynthia；エリサンSamia cynthia ricini及びシンジュサンとエリサンの交配種を含む）、ヤママユガ（Antheraea yamamai）、サクサン（Antheraea pernyi）、ヒメヤママユ（Saturnia japonica）、オオミズアオ（Actias gnoma）等が好適な例として挙げられる。 In this specification, "silkworm" refers to a general term for insects that have silk glands and can spin silk threads. Specifically, it refers to species of Lepidoptera, Hymenoptera, Nerionoptera, Trichoptera, Lepidoptera, Diptera, and Termitidae that can spin silk threads mainly in the larval stage for nesting, cocooning, or movement among Lepidoptera. Among Lepidoptera, Bombycidae, Saturniidae, Brahmaeidae, Eupterotidae, Lasiocampidae, Psychidae, Archtiidae, Noctuidae, and other families that can spin large amounts of silk threads are preferred as silkworms in this specification. Suitable examples include species belonging to the genera Bombyx, Samia, Antheraea, Saturnia, Attacus, and Rhodinia, specifically, silkworms, mulberry silkworms (Bombyx mandarina), Samia cynthia (including Samia cynthia ricini and hybrids of Samia cynthia and Samia ricini), Antheraea yamamai, Antheraea pernyi, Saturnia japonica, and Actias gnoma.
「絹糸腺」とは、液状絹を産生し、蓄積し、また分泌する機能を有する唾液腺の変化した管状器官である。カイコにおいては、絹糸腺は、前記絹糸虫の、主として幼虫の消化管に沿って左右一対で存在し、各絹糸腺は、前部、中部及び後部絹糸腺の３領域で構成されている。前述のように、後部絹糸腺は、絹の繊維成分であるフィブロインを産生及び分泌する。また、中部絹糸腺は、被覆成分であるセリシンを産生及び分泌し、後部絹糸腺より移行してきたフィブロインと共にその内腔に蓄積する。 A "silk gland" is a tubular organ that is a modified salivary gland that has the function of producing, accumulating, and secreting liquid silk. In silkworms, silk glands exist in pairs on the left and right sides of the silkworm, mainly along the digestive tract of the larva, and each silk gland is composed of three regions: the anterior, middle, and posterior silk gland. As mentioned above, the posterior silk gland produces and secretes fibroin, a fiber component of silk. The middle silk gland also produces and secretes sericin, a coating component, which accumulates in its lumen together with fibroin that has migrated from the posterior silk gland.
絹の精練方法は、材料として使用する繭の種類、使用目的等により多様であるが、通常、以下の方法で精錬される。カイコ等により生成された繭（生繭）を、６０～１２０℃の条件下で６時間程度熱風乾燥させ、乾燥させた状態で保管する（加熱処理繭）。加熱処理繭は、６０～９８℃の湯で２０分間程度煮て繊維を解しやすくした後（煮繭）、水で冷却し、刷毛等を用いて糸口をひっかけ、繰糸機を用いて絹糸として繰り出される。ここで得られる絹糸は、生糸又は生絹といわれる。生糸には、通常、絹の繊維の主成分であるフィブロインに加えて、セリシン、Ｐ２５、二次代謝物等が含まれ、比較的堅い質感を有する。生糸の状態又はこれを織った布の状態で、炭酸ナトリウム液又はマルセル石鹸による精練を行うことにより、練糸が生成される。前者の炭酸ナトリウム液で精錬された練糸（以下、「炭酸ナトリウム精練絹」と称する）は、セリシンを含み、固さの残る質感であり、後者のマルセル石鹸で精錬された練糸（以下、「マルセル石鹸精練絹」と称する）はセリシンが除かれ、柔らかい質感を有する。本発明の方法は、上記の生繭、加熱処理繭、生糸、炭酸ナトリウム精練絹、マルセル石鹸精練絹のいずれの試験にも使用可能な方法である。表１に、生繭、加熱処理繭、炭酸ナトリウム精練絹、マルセル石鹸精練絹に通常含まれる主要な成分を示す。 Silk is usually refined by the following method, although it varies depending on the type of cocoon used and its purpose, etc. Cocoons produced by silkworms (raw cocoons) are dried with hot air at 60-120°C for about 6 hours and stored in a dried state (heat-treated cocoons). The heat-treated cocoons are boiled in water at 60-98°C for about 20 minutes to make the fibers easier to loosen (boiled cocoons), then cooled in water, the thread ends are hooked with a brush, etc., and silk threads are reeled out using a silk-reeling machine. The silk threads obtained in this way are called raw silk or raw silk. Raw silk usually contains sericin, P25, secondary metabolites, etc. in addition to fibroin, the main component of silk fibers, and has a relatively hard texture. Degummed threads are produced by scouring the raw silk or the cloth woven from it with sodium carbonate solution or Marcel soap. The former degummed yarn refined with sodium carbonate solution (hereinafter referred to as "sodium carbonate degummed silk") contains sericin and has a hard texture, while the latter degummed yarn refined with Marseille soap (hereinafter referred to as "Marseille soap degummed silk") has the sericin removed and has a soft texture. The method of the present invention can be used to test any of the above raw cocoons, heat-treated cocoons, raw silk, sodium carbonate degummed silk, and Marseille soap degummed silk. Table 1 shows the main components typically contained in raw cocoons, heat-treated cocoons, sodium carbonate degummed silk, and Marseille soap degummed silk.
２－２ ａ）前処理工程
本発明の方法において、「前処理」とは、試料である絹糸虫由来の絹の同定において、試料を分析可能な状態とするために前処理剤で処理することを指す。「前処理剤」とは、具体的には酸性化剤及び／又は酸化剤である。前処理剤は、１液で使用してもよく、また、２液以上を同時又は連続的に使用してもよい。
2-2 a) Pretreatment step In the method of the present invention, "pretreatment" refers to treating a sample with a pretreatment agent to make the sample analyzable in identifying the sample derived from silkworms. Specifically, the "pretreatment agent" is an acidifying agent and/or an oxidizing agent. The pretreatment agent may be used in one solution, or two or more solutions may be used simultaneously or consecutively.
本明細書において、「酸性化剤」とは、試料をｐＨ７．０未満、特にｐＨ５．０以下、さらにｐＨ１．０～３．０、すなわち酸性条件下におくための薬剤であり、試料を酸性化できれば、その種類は特に限定されない。好適には、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸、モノフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸、硝酸、塩酸、プロピオン酸、酪酸、フッ化水素、ブロモ酢酸等、又はこれらの組み合わせを使用できる。また、これらの酸のうち複数を連続的に使用することもできる。前処理剤として使用する場合、酸性化剤は、０．０１～１０．０Ｎ（規定）、特に０．１～２．０Ｎ、さらに０．２～１．０Ｎのものを使用することが好ましい。 In this specification, the term "acidifying agent" refers to an agent for placing a sample under an acidic condition, i.e., a pH of less than 7.0, particularly a pH of 5.0 or less, and furthermore a pH of 1.0 to 3.0. The type of agent is not particularly limited as long as it can acidify the sample. Preferably, trifluoroacetic acid, difluoroacetic acid, monofluoroacetic acid, formic acid, acetic acid, nitric acid, hydrochloric acid, propionic acid, butyric acid, hydrogen fluoride, bromoacetic acid, etc., or a combination of these, can be used. Also, a plurality of these acids can be used consecutively. When used as a pretreatment agent, it is preferable to use an acidifying agent of 0.01 to 10.0 N (normal), particularly 0.1 to 2.0 N, and furthermore 0.2 to 1.0 N.
本明細書において、「酸化剤」とは、試料、特にタンパク質を酸化させることが可能な薬剤であれば、その種類は特に限定されない。好適には、過酸化水素、オゾン、次亜塩素酸塩、ハロゲン単体、二酸化塩素、二酸化マンガン等、又はこれらの組み合わせを使用できる。酸化剤として過酸化水素水を用いる場合、０．０１～１０．０Ｍ、特に０．１～２．０Ｍ、さらに０．２～１．０Ｍの濃度で使用することが好ましい。 In this specification, the term "oxidizing agent" refers to any agent capable of oxidizing a sample, particularly proteins, and is not particularly limited in type. Preferably, hydrogen peroxide, ozone, hypochlorite, a halogen alone, chlorine dioxide, manganese dioxide, etc., or a combination of these can be used. When using hydrogen peroxide water as the oxidizing agent, it is preferable to use it at a concentration of 0.01 to 10.0 M, particularly 0.1 to 2.0 M, and further preferably 0.2 to 1.0 M.
前処理剤を試料に接触させる手段は、試料に万遍なく前処理剤が接触していれば特に限定されるものではないが、例えば、浸漬、塗布、噴霧、気化物との固相－気相接触等の手段を用いることができる。前処理剤と試料とを接触させる時間（反応時間）は、試料に含まれるタンパク質を断片化するのに十分な時間であれば、０．５～６０分間、特に１～１０分間とすることが好ましい。６０分を超える長時間の反応時間とすると、さらに小分子化が進むことで、各試料に特徴的なシグナルが得られなくなることも想定される。したがって、反応時間を例えば、２時間、３時間又は４時間以上の長時間とする必要はない。 The means for contacting the sample with the pretreatment agent is not particularly limited as long as the pretreatment agent is in contact with the sample evenly, and may be, for example, immersion, application, spraying, solid-gas contact with a vaporized substance, or other means. The time for contacting the sample with the pretreatment agent (reaction time) is preferably 0.5 to 60 minutes, particularly 1 to 10 minutes, as long as it is sufficient to fragment the proteins contained in the sample. If the reaction time is longer than 60 minutes, it is expected that the molecules will be further broken down into smaller molecules, making it impossible to obtain a signal characteristic of each sample. Therefore, it is not necessary to make the reaction time longer than, for example, 2, 3, or 4 hours or more.
前処理後の試料は、繊維若しくは繊維塊が残存した状態で使用してもよく、又は、反応後の前処理剤を遠心分離、ろ過等により得た上清を使用してもよい。また、後段の分析工程で質量分析を行う場合は、微量分析に適した系であるため、使用する試料は、０．０１～１００ｍｇ程度、特に０．０５～５．０ｍｇとすることが好ましい。 The pretreated sample may be used with fibers or fiber clumps remaining, or the supernatant obtained by subjecting the pretreated agent after the reaction to centrifugation, filtration, etc. may be used. In addition, when mass spectrometry is performed in the subsequent analysis step, it is preferable to use about 0.01 to 100 mg of sample, especially 0.05 to 5.0 mg, since this is a system suitable for microanalysis.
前処理剤の成分、反応時間等の前処理条件は、試料の種類と、同定の目的によって適宜選択可能である。前処理条件によって、後述する分析工程で得られるシグナルが異なることが見いだされた。既知の結果等を参照して、より目的とする試験を容易とする条件を選択することができる。例えば、試験の目的が品種の同定である場合、得られるシグナルの品種間差が大きくなる前処理条件を選択できる。また、同じ試料について、並行して複数の条件下で前処理を行い、それぞれ分析することもできる。 Pretreatment conditions such as the components of the pretreatment agent and reaction time can be selected appropriately depending on the type of sample and the purpose of identification. It has been found that the signals obtained in the analysis process described below differ depending on the pretreatment conditions. By referring to known results, etc., conditions that make it easier to perform the desired test can be selected. For example, if the purpose of the test is to identify the variety, pretreatment conditions that increase the difference in the signals obtained between varieties can be selected. In addition, the same sample can be pretreated under multiple conditions in parallel and analyzed separately.
試料を酸性化剤及び／又は酸化剤による処理の前又は後に、必要に応じて還元剤による処理を行ってもよい。還元剤としては、ジチオスレイトール、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル（ホスフィン）塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン、システイン塩酸塩、ハイドロキシサルファイト等、通常タンパク質の分析において使用される還元剤をいずれも使用可能である。 Before or after the treatment of the sample with the acidifying agent and/or oxidizing agent, the sample may be treated with a reducing agent as necessary. The reducing agent may be any of the reducing agents normally used in protein analysis, such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, tris(2-carboxyethyl(phosphine) hydrochloride (TCEP), tributylphosphine, cysteine hydrochloride, and hydroxysulfite.
本発明の方法における前処理工程には、酵素反応を用いないことが好ましい。従来、絹の分析においては、トリプシン等のプロテアーゼによるタンパク質の断片化が行われてきた。酵素の使用は、タンパク質の断片化の効果を奏するものの、酸化剤/還元剤と比較して使用する試薬が高価であり、また、反応に多大な時間を要する（例えば６時間程度）、という問題があった。 In the pretreatment step of the method of the present invention, it is preferable not to use an enzymatic reaction. Conventionally, in the analysis of silk, protein fragmentation has been performed using proteases such as trypsin. Although the use of enzymes is effective in fragmenting proteins, there are problems in that the reagents used are expensive compared to oxidizing/reducing agents, and the reaction takes a long time (e.g., about 6 hours).
本発明の方法で使用される前処理剤は、絹糸又は繭に含まれるフィブロイン等のタンパク質を、短時間かつ低コストで断片化することが可能である。 The pretreatment agent used in the method of the present invention is capable of fragmenting proteins such as fibroin contained in silk threads or cocoons in a short time and at low cost.
２－３ ｂ）分析工程
前処理工程で処理された試料は、分析工程に付される。分析工程では、前処理工程により断片化されたタンパク質の分析を行う。タンパク質の分析手段は、電気泳動、アミノ酸シークエンス、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析、アミノ酸組成分析、Ｘ線回折、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外線吸収スペクトル（ＦＴＩＲ）等公知の手段をいずれも使用できるが、特に、高分子物質の特性を容易に分析可能な質量分析を好適に使用できる。質量分析は、微量の化合物を高真空チャンバーでイオン化し、生成したイオンを質量によって分離し、検出する方法である。
2-3 b) Analysis Step The sample treated in the pretreatment step is subjected to the analysis step. In the analysis step, the protein fragmented in the pretreatment step is analyzed. Any known means such as electrophoresis, amino acid sequence, liquid chromatography (LC), mass spectrometry, amino acid composition analysis, X-ray diffraction, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) can be used as a means of analyzing proteins, but mass spectrometry, which can easily analyze the characteristics of polymeric substances, is particularly suitable. Mass spectrometry is a method in which a trace amount of a compound is ionized in a high vacuum chamber, and the generated ions are separated and detected by mass.
化合物をイオン化する手段としては、例えば、大気圧化学イオン化法（atmospheric pressure chemical ionization、ＡＰＣＩ）、化学イオン化（chemical ionization、ＣＩ）、電子イオン化法（electron ionization、ＥＩ）、電子スプレーイオン化法（electrospray ionization、ＥＳＩ）、高速原子衝撃法（fast atom bombardment、ＦＡＢ）、電界脱離イオン化法（field desorption、ＦＤ）、電界イオン化法（field ionization、ＦＩ）レーザー誘起液ビームイオン脱離法（liquid secondary ion mass spectrometry、ＬＩＬＢＩＤ）、液体二次イオン質量分析（liquid secondary ion mass spectrometry、ＬＳＩＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（matrix assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）、粒子線法（particle beam、ＰＢ)、プラズマ脱離法（plasma desorption、ＰＤ)、二次イオン質量分析（secondary ion mass spectrometry、ＳＩＭＳ）又はサーモスプレー法（thermospray、ＴＳＰ）又はこれらのイオン化法の組み合わせが挙げられる。特に、高分子、特にタンパク質の分析に広く使用される、ＭＡＬＤＩ法又はＥＳＩ法を好適に使用できる。前処理後の絹のタンパク質の質量分析スペクトル（以下、「マススペクトル」と記載）は、イオン化手段によって異なるパターンを生じることが見いだされたことから、既知試料の分析結果等を参照して、より試験目的を達成しやすい条件を選択することもできる。例えば、試験の目的が品種の同定である場合、得られるマススペクトルパターンの品種間差が大きくなるイオン化手段を選択できる。また、同じ前処理済みの試料について、並行して複数のイオン化手段を用いて分析を行い、それぞれのマススペクトルを取得してもよい。 Methods for ionizing compounds include, for example, atmospheric pressure chemical ionization (APCI), chemical ionization (CI), electron ionization (EI), electrospray ionization (ESI), fast atom bombardment (FAB), field desorption ionization (FD), field ionization (FI), laser induced liquid beam ion desorption (LILBID), liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS), matrix assisted laser desorption ionization (MALDI), particle beam (PB), plasma desorption (PD), and secondary ion mass spectrometry (SIMMS). Examples of ionization methods include SIMS (simulation ionization mass spectrometry) or TSP (thermospray), or a combination of these ionization methods. In particular, the MALDI or ESI methods, which are widely used for the analysis of polymers, especially proteins, can be preferably used. Since it has been found that the mass spectrometry spectrum (hereinafter referred to as "mass spectrum") of silk protein after pretreatment produces different patterns depending on the ionization means, it is also possible to select conditions that are easier to achieve the test purpose by referring to the analysis results of known samples. For example, if the purpose of the test is to identify the variety, an ionization method that produces a large difference between the varieties in the mass spectrum pattern obtained can be selected. In addition, the same pretreated sample may be analyzed in parallel using multiple ionization means to obtain the mass spectrum of each.
イオン化した分子の質量による分離手段としては、公知の方法をいずれも使用できるが、特に高分子の分離に適した飛行時間型質量分析法（time of flight mass spectrometry、ＴＯＦ－ＭＳ）を好適に使用できる。本発明におけるタンパク質成分の分析には、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳが好適に含まれる。 Any known method can be used to separate ionized molecules based on their mass, but time of flight mass spectrometry (TOF-MS), which is particularly suitable for separating polymers, is preferably used. MALDI-TOF-MS is preferably used for the analysis of protein components in the present invention.
分析手段として、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを使用する場合、前処理後の試料は、前処理剤ごと、又は上清をキュベット等にいれて分析に供してもよい。一方、電導性カーボン両面テープ上に前処理剤中に残存する繊維を貼り付け、乾燥させた状態で分析に方法をとることもできる。電導性カーボン両面テープは、通常、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用として入手可能なものを使用できる（例えば、日新ＥＭ株式会社製）。 When MALDI-TOF-MS is used as the analytical method, the pretreated sample may be subjected to analysis together with the pretreatment agent or the supernatant may be placed in a cuvette or the like. Alternatively, the fibers remaining in the pretreatment agent may be attached to conductive double-sided carbon tape and dried before analysis. The conductive double-sided carbon tape that can be used is usually one that is available for use with scanning electron microscopes (SEM) (for example, manufactured by Nissin EM Co., Ltd.).
質量分析の前に、又は質量分析に代えて、液体クロマトグラフィー（liquid chromatography、ＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィー（middle pressure liquid chromatography、ＭＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動等による分離を行ってもよい。 Separation may be performed prior to or in place of mass spectrometry using liquid chromatography (LC), middle pressure liquid chromatography (MPLC), high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis, etc.
２－４ ｃ）解析工程
ｂ）分析工程で得られた結果（生データ）に基づいて、試料の絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する工程である。好適には、解析工程は、既知の由来種、品種及び／又は品質を有する複数の絹糸又は繭からなる対照群について、得られた分析結果を利用して実施される。
2-4 c) Analysis step: This is a step of qualitatively and/or quantitatively analyzing the species, variety and/or quality of the sample silk based on the results (raw data) obtained in the analysis step b). Preferably, the analysis step is performed using the analysis results obtained for a control group consisting of multiple silk threads or cocoons of known species, variety and/or quality.
前処理を行った絹を含む試料について、分析工程で得られるデータ、特にマススペクトルのパターンは、少なくとも、表２に示す試料由来のパラメータ並びに前処理及び分析条件由来のパラメータにより変動することが判明した。そのため、例えば、由来種、品種、精練条件、製造年等が既知の多数の絹糸又は繭からなる対照群について、多様な前処理及び分析条件下で多数のマススペクトルを取得し、得られたスペクトルのパターンを各対照のフィンガープリントとして蓄積することで、未知の試料の解析に有用なデータベースを構築することが可能である。あるいは、前記データベースは、多数の対照について、所定の前処理及び分析条件下でマススペクトルを取得することで構築されてもよい。ただし、このデータベースを使用する場合、未知の試料の前処理工程及び分析工程は、前記所定の前処理及び分析条件に限定され得る。データベースに蓄積されるマススペクトルのデータは、マススペクトルの画像データであっても、検出された各ピークのｍ／ｚと信号強度の数値データの集合であってもよい。なお、データベース構築用のパラメータは、表２に列挙されたものに限定されない。 It has been found that the data obtained in the analysis process for samples containing pretreated silk, particularly the mass spectrum pattern, varies depending on at least the parameters derived from the sample and the parameters derived from the pretreatment and analysis conditions shown in Table 2. Therefore, for example, a database useful for analyzing unknown samples can be constructed by acquiring a large number of mass spectra under various pretreatment and analysis conditions for a control group consisting of a large number of silk threads or cocoons whose origin species, variety, degumming conditions, production year, etc. are known, and accumulating the obtained spectral patterns as fingerprints for each control. Alternatively, the database may be constructed by acquiring mass spectra for a large number of controls under specified pretreatment and analysis conditions. However, when using this database, the pretreatment and analysis processes for unknown samples may be limited to the specified pretreatment and analysis conditions. The mass spectrum data accumulated in the database may be image data of the mass spectrum or a collection of numerical data on the m/z and signal intensity of each detected peak. Note that the parameters for constructing the database are not limited to those listed in Table 2.
本発明の方法において、解析工程は、目的とする未知の試料より得られる分析結果、特にマススペクトルを、構築されたデータベースと照合させることにより行われ得る。必要に応じて、その分析結果を取得するために用いた前処理及び分析条件について照合してもよい。また、照合対象となる試料の分析結果は、１つの未知の試料から１つである必要はなく、例えば、前処理及び分析条件を変えて複数の分析結果、例えば複数のマススペクトルを取得し、これらを複合的に前記データベースと照合させてもよい。 In the method of the present invention, the analysis step can be performed by comparing the analysis results, particularly the mass spectrum, obtained from the unknown sample of interest with the constructed database. If necessary, the pretreatment and analysis conditions used to obtain the analysis results may also be compared. Furthermore, the analysis result of the sample to be compared does not have to be one from one unknown sample; for example, multiple analysis results, such as multiple mass spectra, may be obtained by changing the pretreatment and analysis conditions, and these may be compared in a composite manner with the database.
あるいは、本発明の方法において、解析工程は、目的とする試料と同条件でほぼ同時（例えば、同日）に分析された標品のマススペクトルと照合させることにより行われ得る。使用される標品は、同定の目的に合わせて適宜選択可能である。例えば、試料の絹の製造年を同定する場合、単一又は複数の製造年の同種の絹を標品として使用し、試料のマススペクトルと各標品のマススペクトルとを照合することができる。 Alternatively, in the method of the present invention, the analysis step can be performed by comparing the mass spectrum of a standard analyzed at approximately the same time (e.g., on the same day) under the same conditions as the target sample. The standard used can be appropriately selected according to the purpose of identification. For example, when identifying the year of manufacture of the sample silk, the same type of silk with a single or multiple manufacturing years can be used as a standard, and the mass spectrum of the sample can be compared with the mass spectrum of each standard.
照合は、手作業で行われてもよいが、好適にはコンピューターを用いて行われる。照合は、例えば、目的とする試料の分析結果等のデータを入力し、データベース中で入力したデータと最も近いデータを抽出し、抽出された当該データ及びそのバックグラウンド情報（試料の由来種、品種、製造年等）を出力することでなされる。また、照合は、人工知能（ＡＩ）を用いて行われてもよい。ＡＩを用いる場合、前記のデータベースを教師データとして、既知のニューラルネットワークを用いた機械学習を経て学習済みモデルを構築することができ、これを用いて、未知の試料から入力されたデータから、当該試料の由来種、品種、製造年等の所望の情報を出力することができる。図２に、本発明の方法にＡＩを用いる態様の一例のフロー図を示す。図２に示す例では、既知試料の分析結果の蓄積したデータベースを教師データとして構築されたＡＩが使用される。当該ＡＩに、目的とする未知試料の分析結果、並びに当該分析の前処理及び分析条件が入力され、ＡＩによって割り出された当該試料の由来種、品種、製造年等の情報が出力される。なお、ＡＩを用いる態様は、図２に示す例に限定されない。 The matching may be performed manually, but is preferably performed using a computer. For example, the matching is performed by inputting data such as the analysis results of the target sample, extracting data in the database that is closest to the input data, and outputting the extracted data and its background information (such as the origin species, variety, and year of manufacture of the sample). The matching may also be performed using artificial intelligence (AI). When using AI, a trained model can be constructed through machine learning using a known neural network using the database as training data, and desired information such as the origin species, variety, and year of manufacture of the sample can be output from data input from an unknown sample using this. FIG. 2 shows a flow diagram of an example of an embodiment in which AI is used in the method of the present invention. In the example shown in FIG. 2, an AI constructed using a database that accumulates the analysis results of known samples as training data is used. The analysis results of the target unknown sample, as well as the pretreatment and analysis conditions of the analysis, are input to the AI, and information such as the origin species, variety, and year of manufacture of the sample determined by the AI is output. Note that the embodiment in which AI is used is not limited to the example shown in FIG. 2.
２－５ その他の工程
目的となる試料の種類や、所望の情報によっては、上記の工程に加えて他の工程を追加してもよい。例えば、染色済みの絹織物や、天然でフラボノイド等による着色がある繭について試験を行う場合、分析結果、特にマススペクトルに染料やフラボノイドに由来するシグナルが現れ、目的とする断片化したタンパク質由来のシグナルとの区別が困難となり得る。このような試料を用いる場合は、前処理工程の前に脱色工程を加えることが好ましい。脱色工程の具体的な手段としては、例えば、試料をアセトニトリル、アセトン、エタノール、メタノール等の有機溶媒又はこれらの水溶液に浸漬する手段、アンモニア水、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液に浸漬する手段、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、マルセル石鹸等の界面活性剤で洗浄する手段、二酸化チオ尿素等の漂白剤を用いて洗浄する手段等、ハイドロキシサルファイト等の還元剤溶液に浸漬する手段等が挙げられる。上記の手段は単独で使用してもよく、また、組み合わされて使用してもよい。また、副反応等の影響がなければ、例えば、有機溶媒と界面活性剤を混合するなど、適宜混合して使用してもよい。
2-5 Other Steps Depending on the type of target sample and the desired information, other steps may be added in addition to the above steps. For example, when dyed silk fabric or cocoons naturally colored by flavonoids are tested, signals derived from dyes or flavonoids may appear in the analysis results, particularly in the mass spectrum, and it may be difficult to distinguish them from signals derived from the target fragmented protein. When using such samples, it is preferable to add a decolorization step before the pretreatment step. Specific means for the decolorization step include, for example, a means of immersing the sample in an organic solvent such as acetonitrile, acetone, ethanol, or methanol or an aqueous solution of these, a means of immersing in an alkaline solution such as aqueous ammonia or a sodium hydroxide solution, a means of washing with a surfactant such as SDS, CTAB, or Marcel soap, a means of washing with a bleaching agent such as thiourea dioxide, and a means of immersing in a reducing agent solution such as hydroxysulfite. The above means may be used alone or in combination. In addition, as long as there is no influence of side reactions, for example, they may be mixed appropriately and used, for example, by mixing an organic solvent and a surfactant.
本発明の方法における分析工程及び解析工程は、必ずしも試料のタンパク質及び／又はペプチド成分のみで行う必要はなく、例えば、前記の脱色工程でフラボノイド成分を別途サンプリングし、これを分析した結果を併せて解析してもよい。また、前記前処理剤を用いた試料の分析結果に限らず、例えば、別途、還元剤、塩基性化剤を用いて同試料の処理を行った場合の分析結果を併せて解析してもよい。 The analysis and characterization steps in the method of the present invention do not necessarily have to be performed on only the protein and/or peptide components of the sample. For example, the flavonoid components may be separately sampled in the decolorization step and the results of the analysis may be analyzed together. In addition, the analysis is not limited to the analysis results of the sample using the pretreatment agent, and for example, the analysis results of the same sample treated separately using a reducing agent or a basifying agent may also be analyzed together.
３．試験方法の適用例
以下、本発明の方法が適用される絹の同定を例示的に列挙するが、本発明の方法は、以下の例に限定されることなく、多様な同定に適用可能である。
3. Examples of Application of the Test Method Below, examples of silk identification to which the method of the present invention can be applied are listed, but the method of the present invention is not limited to the following examples and can be applied to a variety of identifications.
３－１ 絹糸及び繭の製造・精錬方法の差異の同定
本発明の方法では、１つの生繭から得られた切片と、これを加熱処理した加熱処理絹、さらに炭酸ナトリウム、マルセル石鹸でそれぞれ精練した炭酸ナトリウム精練絹、マルセル石鹸精練絹試料について、特にマススペクトルについて、異なるパターンを得ることができる。したがって、絹糸の同定においては、目的とする絹糸試料の分析結果を、予め同種の繭から得られた生絹、炭酸ナトリウム精練絹及びマルセル石鹸精絹の同条件での分析結果と照合することにより、これまで、手触りや質感等で感覚的に区別されてきた各糸の精練方法について、客観的に同定することができる。また、繭の同定においても、目的とする繭試料の分析結果を、予め同種の繭の生繭及び加熱処理繭から得られた同条件での分析結果と照合することにより、客観的に同定することができる。
3-1 Identification of differences in the manufacturing and degumming methods of silk threads and cocoons In the method of the present invention, different patterns can be obtained, particularly in mass spectra, for a section obtained from one raw cocoon, heat-treated silk obtained by heat-treating the section, and further refined with sodium carbonate and Marseille soap to obtain sodium carbonate-degummed silk and Marseille soap-degummed silk samples. Therefore, in identifying silk threads, the analysis results of the target silk thread sample can be collated with the analysis results of raw silk, sodium carbonate-degummed silk, and Marseille soap-degummed silk obtained in advance from the same type of cocoon under the same conditions, thereby making it possible to objectively identify the degumming methods of each thread, which have been distinguished sensorily by touch, texture, etc., until now. In addition, in identifying cocoons, the analysis results of the target cocoon sample can be collated with the analysis results of raw cocoons and heat-treated cocoons obtained in advance from the same type of cocoon under the same conditions, thereby making it possible to objectively identify the cocoons.
３－２ 由来種の同定
本発明の方法では、絹の由来種によって、特にマススペクトルについて、異なるパターンを得ることができる。したがって、目的とする試料の分析結果を、予め各由来種の絹の同条件での分析結果をフィンガープリントとして保有するデータベースと照合することにより、試料の由来種を同定することができる。また、試料が絹糸である場合、複数の種から得られた繊維が混在している場合も、その種類と混在比率を割り出すことができる。
3-2 Identification of the species of origin In the method of the present invention, different patterns, particularly mass spectra, can be obtained depending on the species of origin of the silk. Therefore, the species of origin of the sample can be identified by comparing the analysis results of the target sample with a database that holds the analysis results of each species of silk under the same conditions as fingerprints. In addition, when the sample is silk thread, even if fibers obtained from multiple species are mixed, the types and the mixture ratios can be determined.
３－３ 品種の同定
本発明の方法では、絹の品種によって、特にマススペクトルについて、異なるパターンを得ることができる。したがって、目的とする試料の分析結果を、予め各品種の絹の同条件での分析結果をフィンガープリントとして保有するデータベースと照合することにより、試料の品種を同定することができる。また、絹糸について、複数の品種から得られた繊維が混在している場合も、その品種と混在比率を割り出すことができる。これにより、例えば、小石丸等の高価な品種を標榜する絹製品について、その真贋を客観的に判定することも可能である。
3-3 Identification of variety In the method of the present invention, different patterns, particularly mass spectra, can be obtained depending on the variety of silk. Therefore, the variety of the sample can be identified by comparing the analysis results of the target sample with a database that holds the analysis results of each variety of silk under the same conditions as fingerprints. Furthermore, even if fibers obtained from multiple varieties are mixed in a silk thread, the varieties and the mixture ratio can be determined. This makes it possible to objectively determine the authenticity of silk products that claim to be expensive varieties such as Koishimaru.
３－４ 品質の同定
本発明の方法では、絹の品質、中でも製造されてからの経過時間によって、特にマススペクトルについて異なるパターンが得られる。より具体的には、製造されてから長期間経過した絹糸又は繭は、新しい繭と比較して、マススペクトルの各ピークが高分子側にシフトする、ピークシフトが観察される。絹の繊維は、時間経過とともに酸化しやすい。このピークシフトは、タンパク質の酸化に由来するものと推察される。したがって、予め、各製造年の同種の絹糸又は繭について、同条件での分析結果をデータベースとして保有するものを、目的とする試料の分析結果と照合することにより、試料の製造年を同定することができる。繊維の酸化は、質感及び強度等の品質に影響するものであるため、絹の製造年の同定は、その品質を推定するために有用である。
3-4 Identification of quality In the method of the present invention, different patterns are obtained, particularly in the mass spectrum, depending on the quality of the silk, particularly the time since production. More specifically, a peak shift is observed in the mass spectrum of silk threads or cocoons that have been produced for a long time, in which each peak shifts to the high molecular weight side, compared to new cocoons. Silk fibers are prone to oxidation over time. This peak shift is presumed to be due to oxidation of proteins. Therefore, the production year of a sample can be identified by comparing the analysis results of the target sample with a database that contains analysis results under the same conditions for the same type of silk thread or cocoon produced in each production year. Since oxidation of fibers affects the quality of the silk, such as texture and strength, identifying the production year of silk is useful for estimating its quality.
＜絹糸虫由来の絹の由来種、品種及び／又は品質の同定のためのシステム＞
本発明のシステムは、以下を備える、絹糸虫由来の絹の試験のためのシステムである。
－酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤で処理された絹を含む試料中に含まれるタンパク質成分の分析を行う、分析部；及び
－前記分析部より出力された分析結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する、解析部。
System for identifying species, variety and/or quality of silkworm-derived silk
The system of the present invention is a system for testing silk from silkworms, comprising:
- an analysis unit that analyzes protein components contained in a sample containing silk that has been treated with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof; and - an analysis unit that qualitatively and/or quantitatively analyzes the species, variety, and/or quality of the silk based on the analysis results output from the analysis unit.
本発明のシステムは、特に記載のない限り、本発明の方法を実施するためのシステムであり、前述の＜絹糸虫由来の絹糸又は繭を試験する方法＞の項に記載した特徴と共通の特徴を有する。 Unless otherwise specified, the system of the present invention is a system for carrying out the method of the present invention, and has features in common with those described in the above section <Method for testing silk thread or cocoons derived from silkworms>.
本発明のシステムは、前記分析部及び前記解析部に加えて、
－絹を含む試料を、酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも１種の前処理剤で処理する、処理部；をさらに含んでもよい。
The system of the present invention includes, in addition to the analysis unit and the analysis unit,
- a treatment section in which the silk-containing sample is treated with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and mixtures thereof;
本発明のシステムの概略を図３に例示する。（Ａ）は、本発明のシステムの第１態様を示す。本発明のシステムの第１態様においては、試験システム１は、分析部３と解析部４を備える。また、試料情報や分析条件等を入力するための入力部５、解析結果を出力するための出力部６及び試験システム１内の各装置を制御するための制御部７を備える。好適には、制御部７はコンピューターであり、入力部５及び出力部６は、ユーザーインターフェースである。外部より「前処理剤」で処理された前処理済試料Ｓ１が試験システム１内の所定位置にセットされた後、試験システム１は、当該試料中のタンパク質成分の分析と、分析結果の解析を行う。 An outline of the system of the present invention is illustrated in FIG. 3. (A) shows a first embodiment of the system of the present invention. In the first embodiment of the system of the present invention, the test system 1 comprises an analysis unit 3 and an analysis unit 4. It also comprises an input unit 5 for inputting sample information and analysis conditions, an output unit 6 for outputting the analysis results, and a control unit 7 for controlling each device in the test system 1. Preferably, the control unit 7 is a computer, and the input unit 5 and the output unit 6 are user interfaces. After a pretreated sample S1 treated with a "pretreatment agent" from the outside is set at a predetermined position in the test system 1, the test system 1 analyzes the protein components in the sample and analyzes the analysis results.
図３の（Ｂ）は、本発明のシステムの第２態様を示す。本発明のシステムの第２態様において、試験システム１は、処理部２、分析部３及び解析部４を備える。また、試料情報や分析条件等を入力するための入力部５、解析結果を出力するための出力部６及び試験システム１内の各装置を制御するための制御部７を備える。好適には、制御部７はコンピューターであり、入力部５及び出力部６は、ユーザーインターフェースである。外部より、未処理の試料Ｓ２が試験システム１内の所定位置にセットされた後、試料Ｓ２は、処理部２内に取り込まれ、前処理が実施される。処理部は、ロボットアーム、試薬分注機構等を備え、自動的に試料の前処理を行い、処理済みの検体を分析部３に渡すことが可能である。 (B) of FIG. 3 shows a second embodiment of the system of the present invention. In the second embodiment of the system of the present invention, the test system 1 includes a processing unit 2, an analysis unit 3, and an analysis unit 4. The test system 1 also includes an input unit 5 for inputting sample information and analysis conditions, an output unit 6 for outputting analysis results, and a control unit 7 for controlling each device in the test system 1. Preferably, the control unit 7 is a computer, and the input unit 5 and the output unit 6 are user interfaces. After an unprocessed sample S2 is set in a predetermined position in the test system 1 from the outside, the sample S2 is taken into the processing unit 2 and pre-processed. The processing unit includes a robot arm, a reagent dispensing mechanism, etc., and can automatically perform pre-processing of the sample and transfer the processed specimen to the analysis unit 3.
以下の構成は、第１態様（図３（Ａ））及び第２態様（図３（Ｂ））に共通する構成である。分析部３は、前処理済試料Ｓ１のタンパク質成分を分析する装置を備える。前処理済試料のタンパク質成分の分析が可能であれば、いずれの装置を用いてもよく、電気泳動槽、アミノ酸シークエンサー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置、質量分析計等公知の手段をいずれも使用できるが、高分子物質の特性を容易に分析可能な質量分析計を好適に使用できる。特に、高分子、特にタンパク質の分析に広く使用される、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質量分析計法を好適に使用できる。分析部は、複数種の分析装置を備えていてもよい。 The following configuration is common to the first embodiment (FIG. 3(A)) and the second embodiment (FIG. 3(B)). The analysis unit 3 includes a device for analyzing the protein components of the pretreated sample S1. Any device may be used as long as it is capable of analyzing the protein components of the pretreated sample, and any known means such as an electrophoresis tank, an amino acid sequencer, a liquid chromatography (LC) device, or a mass spectrometer may be used, but a mass spectrometer that can easily analyze the characteristics of polymeric substances is preferably used. In particular, the MALDI-TOF-MS mass spectrometry method, which is widely used for analyzing polymers, especially proteins, is preferably used. The analysis unit may include multiple types of analysis devices.
解析部４は、分析部３で取得された分析結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する。解析部４は、入力部５からの入力情報及び分析部３からの分析結果を集約するデータ収集部４１、照合部４２及びデータベース４３を備える。データベース４３は、既知の由来種、品種及び／又は品質を有する複数の絹糸又は繭からなる対照群について、得られた分析結果を予め登録したデータベースであり、照合部４２は、データ収集部４１に集約されたデータとデータベース４３内のデータの照合を行うソフトウェアを備える。ソフトウェアとしては、既存のものでは、例えばMALDI biotyper（Bruker Daltonics社製）を使用することができる。照合部は、例えば、分析部から収集したデータとデータベースを照合し、データベース中の最も近いデータを抽出し、抽出された当該データ及びそのバックグラウンド情報（試料の由来種、品種、精練状態、製造年等）を出力する。照合部４２は、ＡＩを備えていてもよい。ここでいうＡＩは、前記データベースを教師データとして機械学習させた学習済みモデルを好適に使用でき、収集されたデータを当該ＡＩに入力することで、当該試料の由来種、品種及び／又は品質についての定性的及び／又は定量的な情報を結果として出力する。 The analysis unit 4 qualitatively and/or quantitatively analyzes the species of origin, variety, and/or quality of silk based on the analysis results obtained by the analysis unit 3. The analysis unit 4 includes a data collection unit 41, a collation unit 42, and a database 43 that collect input information from the input unit 5 and analysis results from the analysis unit 3. The database 43 is a database in which analysis results obtained for a control group consisting of multiple silk threads or cocoons with known species of origin, variety, and/or quality are registered in advance, and the collation unit 42 includes software that compares the data collected in the data collection unit 41 with the data in the database 43. As the software, for example, MALDI biotyper (manufactured by Bruker Daltonics) can be used as an existing software. The collation unit, for example, compares the data collected from the analysis unit with the database, extracts the closest data in the database, and outputs the extracted data and its background information (such as the species of origin, variety, refining state, and year of manufacture of the sample). The collation unit 42 may be equipped with AI. The AI referred to here can suitably use a trained model that has been trained using machine learning with the database as training data, and by inputting collected data into the AI, it outputs qualitative and/or quantitative information about the species, variety and/or quality of the sample.
あるいは、解析部４は、データベース４３を使用せず、目的とする試料と同条件でほぼ同時（例えば、同日）に分析された標品のマススペクトルデータを直接使用して、照合部４２において、データ収集部４１に集約されたデータの照合を行ってもよい。 Alternatively, the analysis unit 4 may not use the database 43, but may directly use mass spectrum data of a standard that was analyzed at approximately the same time (e.g., on the same day) under the same conditions as the target sample, and use the comparison unit 42 to compare the data collected in the data collection unit 41.
本発明のシステムは、分析部と解析部を備え、前述の本発明の方法の実施に適用可能なシステムであればよく、上記第１態様及び第２態様に限定して解釈されるべきではない。 The system of the present invention may be any system that includes an analysis unit and an analysis section and is applicable to carrying out the above-mentioned method of the present invention, and should not be interpreted as being limited to the above-mentioned first and second aspects.
＜参考例１ 繭の前処理及びＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析＞
１．絹の精練
日１３７×支１４６繭について、以下の方法で加熱処理絹（未精練絹）、炭酸ナトリウム精練絹、マルセル石鹸精練絹を調製した。生繭から切り出した繊維片１２０ｍｇを５０ｍＬビーカーに入れ、１２０℃で１０分間、次いで６０℃で６時間、加熱乾燥させ、加熱処理絹を調製した。続いて、３０～４０℃の水で１０分間攪拌洗浄した後、５０ｍＬビーカー中で炭酸ナトリウム１２０ｍｇ又はマルセル石鹸（ミヨシ油脂株式会社製）１２０ｍｇを含む９８～１００℃の水に浸漬し、４０分間攪拌した。この間、蒸発した分の水を補いながら、全体の水量が変わらないように維持した。処理後、繊維片を取り出し、３０～４０℃の水で５分間攪拌洗浄した。次に、繊維片を、ハイドロキシサルファイトナトリウム１２０ｍｇを含む３０～４０℃の水に浸漬し、５分間攪拌した。処理後、繊維片を取り出し、３０～４０℃の水５分間で攪拌洗浄した後、繊維片を室温で乾燥させ、精練絹を得た。上記精練操作において、炭酸ナトリウムを使用したものが炭酸ナトリウム精練絹、マルセル石鹸を使用したものがマルセル石鹸精練絹である。
<Reference Example 1: Pretreatment of cocoons and analysis by SDS-PAGE>
1. Silk degumming For 137 days x 146 days cocoons, heat-treated silk (undegummed silk), sodium carbonate degummed silk, and Marcel soap degummed silk were prepared by the following method. 120 mg of fiber pieces cut from raw cocoons were placed in a 50 mL beaker and heated and dried at 120 ° C for 10 minutes and then at 60 ° C for 6 hours to prepare heat-treated silk. Next, after stirring and washing with water at 30 to 40 ° C for 10 minutes, the pieces were immersed in water at 98 to 100 ° C containing 120 mg of sodium carbonate or 120 mg of Marcel soap (manufactured by Miyoshi Oil Co., Ltd.) in a 50 mL beaker and stirred for 40 minutes. During this time, the total amount of water was maintained constant while replenishing the water that had evaporated. After the treatment, the fiber pieces were taken out and washed with water at 30 to 40 ° C for 5 minutes with stirring. Next, the fiber pieces were immersed in water at 30 to 40 ° C containing 120 mg of sodium hydroxysulfite and stirred for 5 minutes. After the treatment, the fiber pieces were taken out and washed with water at 30 to 40°C for 5 minutes by stirring, and then dried at room temperature to obtain degummed silk. In the above degumming operation, the silk degummed with sodium carbonate is the silk degummed with sodium carbonate, and the silk degummed with Marseille soap is the silk degummed with Marseille soap.
２．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
加熱処理絹、炭酸ナトリウム精練絹、及びマルセル石鹸精練絹各２ｍｇを、１×ＳＤＳサンプルバッファー５０μＬに懸濁し、１００℃で１０分間加熱した。得られた試料を１８．７５％アクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した結果を、図４に示す。レーン１は加熱処理絹、レーン２は炭酸ナトリウム精練絹、レーン３はマルセル石鹸精練絹の電気泳動結果を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは絹のタンパク質は分解されることなく、精練絹においてはバンドが観察されなかった。
2. SDS-PAGE
2 mg each of heat-treated silk, sodium carbonate-degummed silk, and Marcel soap-degummed silk was suspended in 50 μL of 1×SDS sample buffer and heated at 100° C. for 10 minutes. The obtained samples were loaded onto an 18.75% acrylamide gel. The gel after electrophoresis was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) and the results are shown in Fig. 4. Lane 1 shows heat-treated silk, lane 2 shows silk degummed with sodium carbonate, and lane 3 shows silk degummed with Marcel soap. The results of silk electrophoresis are shown below. Silk proteins were not decomposed in SDS-PAGE, and no bands were observed in the degummed silk.
３．試料の蟻酸処理による断片化及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ
大造Ｐ５０繭及び錦秋鐘和繭について、上記１．と同様の方法で、加熱処理絹、炭酸ナトリウム精練絹及びマルセル石鹸精練絹を調製した。各絹試料２ｍｇを７０％蟻酸に懸濁して１０分間攪拌した後、アセトニトリルを加えて溶出し、乾燥させた。乾燥した各試料について、上記２．と同様の方法でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。結果を図５に示す。レーン１は大造Ｐ５０加熱処理絹の内側、レーン２は大造Ｐ５０加熱処理絹の外側、レーン３は錦秋鐘和繭のマルセル石鹸精練絹、レーン４は錦秋鐘和繭の炭酸ナトリウム精練絹、レーン５は大造Ｐ５０繭内側のマルセル石鹸精練絹、レーン６は大造Ｐ５０繭内側の炭酸ナトリウム精練絹、レーン７は大造Ｐ５０繭外側のマルセル石鹸精練絹、レーン８は大造Ｐ５０繭外側の炭酸ナトリウム精練絹の結果を示す。低分子領域にスメアなバンドが観察されたことから、蟻酸処理により絹のタンパク質が断片化されたことが示された。
3. Fragmentation of samples by formic acid treatment and SDS-PAGE
Heat-treated silk, sodium carbonate-degummed silk, and Marcel soap-degummed silk were prepared for Daizo P50 cocoons and Kinshukouwa cocoons in the same manner as in 1. above. 2 mg of each silk sample was suspended in 70% formic acid and stirred for 10 minutes, then acetonitrile was added for elution and dried. SDS-PAGE was performed for each dried sample in the same manner as in 2. above. The results are shown in Figure 5. Lane 1 shows the inside of Daizo P50 heat-treated silk, lane 2 shows the outside of Daizo P50 heat-treated silk, lane 3 shows Marcel soap-degummed silk from Kinshukouwa cocoons, lane 4 shows sodium carbonate-degummed silk from Kinshukouwa cocoons, lane 5 shows Marcel soap-degummed silk from the inside of Daizo P50 cocoons, lane 6 shows sodium carbonate-degummed silk from the inside of Daizo P50 cocoons, lane 7 shows Marcel soap-degummed silk from the outside of Daizo P50 cocoons, and lane 8 shows sodium carbonate-degummed silk from the outside of Daizo P50 cocoons. The observation of smear bands in the low molecular weight region indicated that the silk proteins were fragmented by the formic acid treatment.
＜実施例１ 複種由来種の絹のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析＞
カイコ、エリサン及びウスタビガ（野生蛾）の繭について、参考例１と同様に加熱処理絹、炭酸ナトリウム精練絹及びマルセル石鹸精練絹を調製した。各絹試料について、約１ｍｍ２の繊維片を電導性カーボン両面テープ（日新ＥＭ株式会社製）に貼り付け、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ-ＭＳ質量分析計（Autoflex III又はMicroflex、Bruker Daltonics）のサンプル台にセットした。２．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と５０％アセトニトリルを含む、飽和4-クロロ-α-シアノケイ皮酸１μＬを試料に滴下し、乾燥させた。リニアポジティブモードでm/z 1,000～20,000のマススペクトルを取得した。
Example 1: Analysis of silk from multiple species by MALDI-TOF-MS
Heat-treated silk, sodium carbonate-degummed silk, and Marcel soap-degummed silk were prepared from cocoons of Bombyx mori, Eri silkworm, and Usutabiga moth (wild moth) in the same manner as in Reference Example 1. For each silk sample, a fiber piece of approximately 1 mm2 was attached to conductive carbon double-sided tape (manufactured by Nissin EM Co., Ltd.) and set on the sample stage of a MALDI-TOF-MS mass spectrometer (Autoflex III or Microflex, Bruker Daltonics). 1 μL of saturated 4-chloro-α-cyanocinnamic acid containing 2.5% trifluoroacetic acid (TFA) and 50% acetonitrile was dropped onto the sample and allowed to dry. Mass spectra were acquired from m/z 1,000 to 20,000 in linear positive mode.
得られたマススペクトルを図６～８に示す。図６は、カイコ由来試料のマススペクトルであって、（Ａ）が生繭、(Ｂ)が加熱処理絹、（Ｃ）が炭酸ナトリウム精練絹、（Ｄ）がマルセル石鹸精練絹のマススペクトルを示す。図７は、エリサン由来試料のマススペクトルであって、(Ａ)が加熱処理絹、（Ｂ）が炭酸ナトリウム精練絹、（Ｃ）がマルセル石鹸精練絹のマススペクトルを示す。図８は、ウスタビガ由来試料のマススペクトルであって、(Ａ)が加熱処理絹、（Ｂ）が炭酸ナトリウム精練絹、（Ｃ）がマルセル石鹸精練絹のマススペクトルを示す。同種の繭であっても、精練状態の異なる試料では、マススペクトルのパターンが異なることが示された。また、図６～８の相互比較より、絹試料の由来種によって、得られるマススペクトルのパターンが大きく異なることが示された。なお、同種のカイコ繭５個からそれぞれ調製した炭酸ナトリウム精練絹について、同様の条件で前処理及び質量分析を行ったところ、マススペクトルのパターンはほぼ一致したことから、当該条件で得られるマススペクトルには個体間差がなく（データ示さず）、種（由来種、品種）特異的なフィンガープリントとして利用し得ることが示唆された。 The mass spectra obtained are shown in Figures 6 to 8. Figure 6 shows the mass spectra of samples derived from silkworms, where (A) is the mass spectrum of raw cocoons, (B) is the mass spectrum of heat-treated silk, (C) is the mass spectrum of silk refined with sodium carbonate, and (D) is the mass spectrum of silk refined with Marseille soap. Figure 7 shows the mass spectra of samples derived from Samia seri, where (A) is the mass spectrum of heat-treated silk, (B) is the mass spectrum of silk refined with sodium carbonate, and (C) is the mass spectrum of silk refined with Marseille soap. Figure 8 shows the mass spectrum of samples derived from Usutabiga, where (A) is the mass spectrum of heat-treated silk, (B) is the mass spectrum of silk refined with sodium carbonate, and (C) is the mass spectrum of silk refined with Marseille soap. It was shown that even for cocoons of the same species, samples with different degumming conditions have different mass spectrum patterns. Furthermore, a comparison of Figures 6 to 8 shows that the mass spectrum patterns obtained vary greatly depending on the species from which the silk samples are derived. Furthermore, when sodium carbonate-degummed silk prepared from five cocoons of the same species was pretreated and analyzed by mass spectrometry under similar conditions, the mass spectrum patterns were nearly identical, suggesting that there is no individual difference in the mass spectra obtained under these conditions (data not shown) and that they can be used as a species (origin, variety)-specific fingerprint.
図６～８に示す各マススペクトルのピークリストを表３～５に示す。ピーク検出条件は、以下の通りとした。
ピーク検出アルゴリズム：ｃｅｎｔｒｏｉｄ
シグナル／ノイズ比閾値：０％
相対強度閾値：０％
ピーク幅：０．２ｍ／ｚ
高さ：５０％
ベースライン除去：ＴｏｐＨａｔ
検出されたピークが２０を超える場合は、表中にはピーク面積の大きな２０ピークについて表記した。
The peak lists of the mass spectra shown in Figures 6 to 8 are shown in Tables 3 to 5. The peak detection conditions were as follows.
Peak detection algorithm: centroid
Signal/noise ratio threshold: 0%
Relative Intensity Threshold: 0%
Peak width: 0.2 m/z
Height: 50%
Baseline removal: TopHat
When more than 20 peaks were detected, the table lists only the 20 peaks with the largest peak areas.
＜実施例２ 繭の製造年の同定＞
２００５年、２０１７年、２０１８年、２０１９年産の白銀繭について、それぞれ参考例１と同様の方法で加熱処理絹を調製し、実施例１と同様の方法で前処理及び質量分析を行った。図９は、各製造年の白銀繭から得られたマススペクトルのm/z 4700～4950の範囲の拡大図である。（Ａ）が２００５年産、（Ｂ）が２０１７年産、（Ｃ）が２０１８年産、（Ｄ）が２０１９年産の繭由来のマススペクトルを示す。また、図９に示すマススペクトルのピークリストを表６に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。年代が古くなるにしたがって、ピークが高分子側にシフトしていた。
<Example 2: Identification of the year of cocoon production>
Heat-treated silk was prepared from the Shirogane cocoons produced in 2005, 2017, 2018, and 2019 in the same manner as in Reference Example 1, and pretreatment and mass analysis were performed in the same manner as in Example 1. FIG. 9 is an enlarged view of the range of m/z 4700 to 4950 of the mass spectrum obtained from the Shirogane cocoons produced in each production year. (A) shows the mass spectrum derived from the cocoons produced in 2005, (B) the cocoons produced in 2017, (C) the cocoons produced in 2018, and (D) the cocoons produced in 2019. Table 6 shows the peak list of the mass spectrum shown in FIG. 9. The peak detection conditions were the same as in Example 1. As the years increased, the peaks shifted toward the polymer side.
＜実施例３ 絹の酸化実験＞
酸素９５％以上の高酸素雰囲気下で７日間及び１４日間静置した日１３７×支１４６絹（マルセル精練絹）について、２．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に代えて３．０％過酸化水素を含む前処理液を使用した以外は、実施例１と同様の方法で前処理及び質量分析を行った。コントロールとして、高酸素雰囲気下に置かなかった同種の絹についても同様に前処理及び質量分析を行った。図１０は、高酸素雰囲気下で静置した絹試料のマススペクトルを示す。（Ａ）はコントロール、（Ｂ）は高酸素雰囲気下で７日間静置した試料、（Ｃ）は高酸素雰囲気下で１４日静置した試料のマススペクトルを示す。また、図１０に示すマススペクトルのピークリストを表７に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）におけるm/Z 6797～6802のピーク強度を１としたときのm/ｚ 5395、6554～6560及び6753～6755のピーク強度比が、5.12：0.04：3.39、0.82：0.10：0.62、0：0.22：0となり、高酸素雰囲気下に置いた絹において、マススペクトルのピークが高分子側にシフトすることが示された。これは、絹のタンパク質の酸化によるものと推測された。実施例２において、製造年の古い繭において、マススペクトルのピークの高分子側へのシフトがみられたことについても、同様に酸化の影響によるものと推測された。
Example 3: Silk oxidation experiment
For the silk (Marcel degummed silk) that had been left in an oxygen-rich atmosphere of 95% or more for 7 and 14 days, pretreatment and mass analysis were performed in the same manner as in Example 1, except that a pretreatment solution containing 3.0% hydrogen peroxide was used instead of 2.5% trifluoroacetic acid (TFA). As a control, the same pretreatment and mass analysis were performed on the same type of silk that had not been placed in an oxygen-rich atmosphere. Figure 10 shows the mass spectrum of a silk sample that had been left in an oxygen-rich atmosphere. (A) shows the mass spectrum of the control, (B) shows the mass spectrum of a sample that had been left in an oxygen-rich atmosphere for 7 days, and (C) shows the mass spectrum of a sample that had been left in an oxygen-rich atmosphere for 14 days. Table 7 shows the peak list of the mass spectrum shown in Figure 10. The peak detection conditions were the same as in Example 1. The peak intensity ratios of m/z 5395, 6554-6560, and 6753-6755 in (A), (B), and (C) were 5.12:0.04:3.39, 0.82:0.10:0.62, and 0:0.22:0, respectively, when the peak intensity of m/z 6797-6802 was set to 1. This indicated that the mass spectrum peaks shifted toward higher molecular weights in silk placed in a high-oxygen atmosphere. This was presumed to be due to oxidation of silk proteins. The shift of the mass spectrum peaks toward higher molecular weights in cocoons produced in old years in Example 2 was also presumed to be due to the effects of oxidation.
＜実施例４ 各種前処理剤を使用したマススペクトルの比較＞
Ｗ１－ｐｎｄ生繭の繊維片について、実施例１と同様の条件で質量分析を行った。同時に、同種の繊維片について、ＴＦＡを同濃度の蟻酸に代えた以外は、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。図１１に各前処理剤で処理した試料のマススペクトルを示す。また、図１１に示すマススペクトルのピークリストを表８に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。（Ａ）は蟻酸、（Ｂ）はＴＦＡを前処理剤として使用した試料のマススペクトルを示す。蟻酸と比較してＴＦＡを使用した場合には、タンパク質がより低分子化することが示された。
Example 4 Comparison of mass spectra using various pretreatment agents
Mass spectrometry was performed on fiber pieces from W1-pnd raw cocoons under the same conditions as in Example 1. At the same time, pretreatment and mass spectrometry were performed on the same type of fiber pieces under the same conditions as in Example 1, except that TFA was replaced with formic acid of the same concentration. Figure 11 shows the mass spectra of samples treated with each pretreatment agent. Table 8 shows a peak list of the mass spectrum shown in Figure 11. The peak detection conditions were the same as in Example 1. (A) shows the mass spectrum of a sample using formic acid and (B) shows the mass spectrum of a sample using TFA as a pretreatment agent. It was shown that proteins were broken down into smaller molecules when TFA was used compared to formic acid.
日１３７×支１４６絹（生繭）について、ＴＦＡを、２．５％蟻酸、３％過酸化水素又は３％硝酸に代えた以外は、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。図１２に、各種前処理剤で処理した試料のマススペクトルを示す。（Ａ）は蟻酸、（Ｂ）は過酸化水素、（Ｃ）は硝酸を前処理剤として使用した試料のマススペクトルを示す。また、図１２に示すマススペクトルのピークリストを表９に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。過酸化水素水、硝酸を用いた場合も断片化が生じることが示された。前処理液の差異によるピーク位置の大きな差異は見られなかったが、ピーク強度比には差異が見られた。 Pretreatment and mass analysis were performed on Japanese 137 x Japanese 146 silk (raw cocoons) under the same conditions as in Example 1, except that TFA was replaced with 2.5% formic acid, 3% hydrogen peroxide, or 3% nitric acid. Figure 12 shows the mass spectra of samples treated with various pretreatment agents. (A) shows the mass spectrum of a sample using formic acid, (B) hydrogen peroxide, and (C) nitric acid as the pretreatment agent. Table 9 shows the peak list of the mass spectrum shown in Figure 12. The peak detection conditions were the same as in Example 1. It was shown that fragmentation also occurred when hydrogen peroxide and nitric acid were used. There was no significant difference in peak position due to the difference in pretreatment solution, but differences were observed in the peak intensity ratio.
＜実施例５ 繭の品種の同定＞
４品種（日１３７×支１４６、Ｗ１－ｐｎｄ、輪月６０６号、大造）の繭について、参考例１と同様の条件で加熱処理絹を調製した。前処理剤のＴＦＡを同濃度の蟻酸に代えた以外は、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。図１３に各品種から得られたマススペクトルを示す。（Ａ）は日１３７×支１４６、（Ｂ）はＷ１－ｐｎｄ、（Ｃ）は輪月６０６号、（Ｄ）は大造のマススペクトルを示す。また、図１３に示すマススペクトルのピークリストを表１０に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。繭の品種によって得られるマススペクトルのパターンが異なることが示された。
<Example 5: Identification of cocoon varieties>
Heat-treated silk was prepared from four varieties of cocoons (Ni137 x Shi146, W1-pnd, Ringetsu 606, and Daizo) under the same conditions as in Reference Example 1. Pretreatment and mass analysis were performed under the same conditions as in Example 1, except that the pretreatment agent TFA was replaced with formic acid of the same concentration. Figure 13 shows the mass spectra obtained from each variety. (A) shows the mass spectrum of Ni137 x Shi146, (B) shows the mass spectrum of W1-pnd, (C) shows the mass spectrum of Ringetsu 606, and (D) shows the mass spectrum of Daizo. Table 10 shows the peak list of the mass spectrum shown in Figure 13. The peak detection conditions were the same as in Example 1. It was shown that the mass spectrum patterns obtained differ depending on the cocoon variety.
上記４種の加熱処理絹について、各繭由来の繊維片１ｍｇを、電導性カーボン両面テープには張り付けず、それぞれ２．５％の蟻酸と５０％のアセトニトリルを含む水溶液１００μＬに浸漬し、５分間ボルテックスにかけた。得られた懸濁液の上清について、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで分析した。その結果、電導性カーボン両面テープを使用したときと同様に、マススペクトルのピークが検出された（データ示さず）。 For the four types of heat-treated silk described above, 1 mg of fiber pieces from each cocoon was immersed in 100 μL of an aqueous solution containing 2.5% formic acid and 50% acetonitrile without being attached to conductive double-sided carbon tape, and vortexed for 5 minutes. The supernatant of the resulting suspension was analyzed by MALDI-TOF-MS. As a result, mass spectrum peaks were detected, similar to when conductive double-sided carbon tape was used (data not shown).
＜実施例６ 染色された絹織物の分析＞
染色された絹織物の状態となっても、絹の品質等の試験が可能か否かを検討した。染色されたちりめん生地を解して絹繊維を取り出した。繊維２ｍｇを５０％アセトニトリル及び０．５％マルセル石鹸を含む水溶液１ｍＬで６回洗浄した（浸漬時間：１０分間×５回、一晩×１回）。次いで、５０％アセトニトリル水溶液１ｍＬで３回洗浄し(浸漬時間、いずれも１０分間)、脱色した。繊維にほとんど色が残っていないことを確認した後、ＴＦＡを同濃度の蟻酸に変更した以外は、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。併せて、脱色処理を行っていない同種の繊維についても、同様に前処理及び質量分析を行った。図１４に、絹織物の繊維及び脱色した繊維のマススペクトルを示す。（Ａ）が脱色なしの絹織物の繊維、（Ｂ）が脱色後の絹織物の繊維のマススペクトルを示す。また、図１４に示すマススペクトルのピークリストを表１１に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。（Ａ）のマススペクトルには染料由来と推測されるノイズが多数現れ、タンパク質のピーク判別が困難であったが、（Ｂ）ではノイズの多くが消失し、タンパク質のピーク判別が可能となることが示された。
Example 6: Analysis of dyed silk fabrics
It was examined whether it was possible to test the quality of silk even in the dyed silk fabric state. The dyed crepe fabric was unraveled to take out silk fibers. 2 mg of the fibers were washed six times with 1 mL of an aqueous solution containing 50% acetonitrile and 0.5% Marcel soap (immersion time: 10 minutes x 5 times, overnight x 1 time). Then, the fibers were washed three times with 1 mL of 50% acetonitrile aqueous solution (immersion time, each for 10 minutes) and decolorized. After confirming that almost no color remained in the fibers, pretreatment and mass analysis were performed under the same conditions as in Example 1, except that TFA was replaced with formic acid of the same concentration. In addition, pretreatment and mass analysis were performed similarly for the same type of fibers that were not subjected to the decolorization treatment. Figure 14 shows the mass spectrum of the silk fabric fiber and the decolorized fiber. (A) shows the mass spectrum of the silk fabric fiber without decolorization, and (B) shows the mass spectrum of the silk fabric fiber after decolorization. Table 11 shows the peak list of the mass spectrum shown in Figure 14. The peak detection conditions were the same as in Example 1. The mass spectrum of (A) contained a large amount of noise presumably derived from the dye, making it difficult to distinguish the protein peaks. However, in (B), most of the noise disappeared, making it possible to distinguish the protein peaks.
＜実施例７ ＥＳＩ－ＭＳによる品種の同定＞
２品種（錦秋鐘和、日１３７×支１４６）の繭について、参考例１と同様の方法で炭酸ナトリウム処理絹を調製した。ＴＦＡを同濃度の蟻酸に変更した以外は、実施例１と同様の条件で前処理を行った。前処理後の試料について、ＥＳＩ－ＭＳ質量分析器（機器名：micrOTOF-Q II ブルカーダルトニクス）を用いてマススペクトルを取得した。図１５に、各品種のＥＳＩ－ＭＳのマススペクトルを示す。（Ａ）が錦秋鐘和、（Ｂ）が日１３７×支１４６のマススペクトルを示す。また、図１５に示すマススペクトルのピークリストを表１２に示す。ピーク検出条件は、実施例１と同様である。（Ａ）と（Ｂ）で現れるピーク位置、ピーク強度に明確な差異が見られた。これにより、ＥＳＩ－ＭＳによっても絹の品種同定が可能であることが示された。
Example 7: Identification of species by ESI-MS
Sodium carbonate-treated silk was prepared from two varieties of cocoons (Kinshu Kanewa and Ni137 x Shi146) in the same manner as in Reference Example 1. Pretreatment was performed under the same conditions as in Example 1, except that TFA was replaced with formic acid of the same concentration. Mass spectra were obtained from the pretreated samples using an ESI-MS mass spectrometer (instrument name: micrOTOF-Q II Bruker Daltonics). Figure 15 shows the ESI-MS mass spectra of each variety. (A) shows the mass spectrum of Kinshu Kanewa, and (B) shows the mass spectrum of Ni137 x Shi146. Table 12 shows the peak list of the mass spectrum shown in Figure 15. The peak detection conditions were the same as in Example 1. Clear differences were observed in the peak positions and peak intensities appearing in (A) and (B). This demonstrated that silk varieties can also be identified by ESI-MS.
＜参考例２ 絹糸虫以外の生物由来の繊維の分析＞
絹糸虫以外の生物に由来する、羊毛及びクモ糸について、同様にマススペクトルによる分析が可能か検討した。羊毛及びクモ糸をそれぞれ２ｍｇ用意し、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。併せて、羊毛２ｍｇについて、ＴＦＡを同濃度の蟻酸に変更した以外は、実施例１と同様の条件で前処理及び質量分析を行った。図１６に絹糸虫以来の生物由来の繊維の質量分析の結果を示す。（Ａ）が前処理に蟻酸を使用した羊毛の質量分析の結果、（Ｂ）が前処理にＴＦＡを使用した羊毛の質量分析の結果、（Ｃ）が前処理にＴＦＡを使用したクモ糸の質量分析の結果を示す。いずれにおいても明確なピークが見られなかった。
<Reference Example 2: Analysis of fibers derived from organisms other than silkworms>
We investigated whether wool and spider silk derived from organisms other than silkworms could be analyzed by mass spectrometry. 2 mg each of wool and spider silk was prepared, and pretreatment and mass analysis were performed under the same conditions as in Example 1. In addition, pretreatment and mass analysis were performed under the same conditions as in Example 1 for 2 mg of wool, except that TFA was replaced with formic acid of the same concentration. Figure 16 shows the results of mass analysis of fibers derived from organisms after silkworms. (A) shows the results of mass analysis of wool pretreated with formic acid, (B) shows the results of mass analysis of wool pretreated with TFA, and (C) shows the results of mass analysis of spider silk pretreated with TFA. No clear peaks were observed in any of them.
本発明の方法及びシステムは、絹製品の品質試験等に適用可能であり、養蚕業、繊維業、アパレル産業等の多様な産業分野で利用可能である。 The method and system of the present invention can be applied to quality testing of silk products, and can be used in a variety of industrial fields, including sericulture, textiles, and apparel.
１…試験システム
２…処理部
３…分析部
４…解析部
４１…データ収集部
４２…照合部
４３…データベース
５…入力部
６…出力部
７…制御部
Reference Signs List 1 Test system 2 Processing section 3 Analysis section 4 Analysis section 41 Data collection section 42 Collation section 43 Database 5 Input section 6 Output section 7 Control section
Claims (7)
ａ）絹を含む試料を酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤と接触させる前処理工程；
ｂ）前処理後の試料中に含まれるタンパク質及び／又はペプチド成分の分析を行う工程；及び
ｃ）工程ｂ）の結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する工程；を含み、
工程ｂ）において、前記分析が、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを含む、方法。 A method for identifying the species, variety and/or quality of silk from silkworms, comprising:
a) a pretreatment step of contacting a silk-containing sample with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof;
b) analyzing the protein and/or peptide components contained in the sample after pretreatment; and c) qualitatively and/or quantitatively analyzing the species, variety and/or quality of the silk based on the results of step b) .
The method according to claim 1, wherein in step b), said analysis comprises MALDI-TOF-MS .
－酸性化剤、酸化剤、及びこれらの混合物からなる群より選択された少なくとも1種の前処理剤で処理された、絹を含む試料中に含まれるタンパク質及び／又はペプチド成分の分析を行う、分析部；及び
－前記分析部より出力された分析結果に基づいて、絹の由来種、品種及び／又は品質を定性的及び／又は定量的に解析する、解析部；を備え
前記分析部は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ質量分析計を備える、システム。 A system for identifying the species, variety and/or quality of silk from silkworms , comprising:
- an analysis unit that performs analysis of protein and/or peptide components contained in a sample containing silk that has been treated with at least one pretreatment agent selected from the group consisting of an acidifying agent, an oxidizing agent, and a mixture thereof; and - an analysis unit that qualitatively and/or quantitatively analyzes the species, variety, and/or quality of the silk based on the analysis results output from the analysis unit .
The system, wherein the analysis portion comprises a MALDI-TOF-MS mass spectrometer .
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| CHEN, Ruru et al.，Comparative analysis of proteins from Bombyx and mori and Antheraea pernyi coccons for the purpose of silk identification，Journal of Proteomics，2019年10月30日，Vol.209,103510，pp.1-10 |
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