JP7499376B2 - 調整可能な光学特性を有するヒドロゲル粒子およびその使用の方法 - Google Patents

調整可能な光学特性を有するヒドロゲル粒子およびその使用の方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年２月９日に出願された米国仮出願第６２／１１４，００４号および２０１５年６月２４日に出願された米国仮出願第６２／１８４，１９２号への優先権を主張し、それぞれの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
フローサイトメトリーは、個々の細胞の急速な分離、計数、および特徴付けを可能にし、臨床および実験の状況において様々な用途に対して常法として使用されている技術である。この技術は、光線を、流体力学的に集束された液体のストリームに方向付けることに依存している。よって、いくつかの検出器は、ストリームが光線を通過するポイントを標的としている：一つは光線と直列（前方散乱またはＦＳＣ）、いくつかは光線と垂直（側方散乱またはＳＳＣ）である。ＦＳＣは細胞容積と相関し、ＳＳＣは粒子内側の複雑性（例えば、核の形状、細胞質顆粒の量およびタイプまたは膜の粗さ）に依存する。これらの相関関係の結果として、異なる特定の細胞型は異なるＦＳＣおよびＳＳＣを示し、フローサイトメトリーで細胞型を区別することが可能となる。
しかし、特定の細胞型を特定する能力は、装置の適切な較正、すなわち、目的の細胞型の精製された細胞の使用を頼りとするプロセスに依存する。これら精製された細胞を入手することは、バッチごとにばらつきが生じやすい高価で面倒な手順が必要となる可能性がある。したがって、フローサイトメーターなどのデバイスにおいて特定の細胞型を模倣できる調整可能な光学特性を有する合成組成物に対する必要性が当技術分野において存在する。
本発明の一態様では、重合モノマーを含み、少なくとも１つの表面を有するヒドロゲル粒子が提供される。ヒドロゲル粒子は、標的細胞の少なくとも１種の光学特性と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有する。一実施形態では、光学特性は、側方散乱プロファイル（ＳＳＣ）、前方散乱プロファイル（ＦＳＣ）、蛍光発光プロファイル、またはこれらの組合せである。標的細胞は、ユーザーが特定する任意の標的細胞であることができる。例えば、一実施形態では、標的細胞は免疫細胞、幹細胞またはがん細胞である。
別の態様では、標的細胞の分析に対してサイトメトリーデバイスを較正するための方法が提供される。一実施形態では、本方法は、標的細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有するヒドロゲル粒子をデバイスに挿入するステップを含み、ヒドロゲル粒子は、重合モノマーを含み、少なくとも１つの表面を有する。本方法は、サイトメトリーデバイスを使用してヒドロゲル粒子の少なくとも１種の光学特性を測定するステップをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１種の光学特性は、試料中の標的細胞を検出するための基準として使用される。
さらに別の態様では、試料中の標的細胞を検出するための方法が提供される。本方法は、標的細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有するヒドロゲル粒子をデバイスに挿入するステップを含み、ヒドロゲル粒子は重合モノマーを含む。本方法は、サイトメトリーデバイスを使用して、ヒドロゲル粒子の少なくとも１種の光学特性を測定するステップをさらに含む。複数の細胞を含む試料がサイトメトリーデバイスに挿入され、複数
の細胞の個々の細胞の少なくとも１種の光学特性が測定される。最後に、光学特性の測定値に基づき、標的細胞またはその複数が試料中に存在するかどうかについての決定がなされる。
本明細書に提供されている方法の一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、生分解性モノマーを含む。さらなる実施形態では、生分解性モノマーは、単糖、二糖、多糖、ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインである。またさらなる実施形態では、生分解性モノマーはアクリルアミドまたはアクリレートで官能化されている。
図１は、開示されたヒドロゲル粒子の光学特性をポリスチレンビーズと比較して図示している。
図２は、本開示の標識したヒドロゲル粒子を生成するプロセスを描いている。
図３は、本開示の標識したヒドロゲル粒子の明視野および蛍光画像を提供している。
図４は、様々な光学的散乱特性を表示する細胞型に対する検量体としての本開示のヒドロゲル粒子の使用を図示している。
図５は、フローサイトメーターに対する液滴間の遅延と、ヒドロゲル粒子直径との相関関係を示す年代決定（ｄａｔｉｎｇ）を提供している。
図６は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（６Ａおよび６Ｂ）および本開示のヒドロゲル粒子（６Ｃおよび６Ｄ）の明視野（６Ａおよび６Ｃ）および蛍光（６Ｂおよび６Ｄ）画像を提供している。
図７は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で測定した場合の、異なる量のＤＮＡを封入したヒト口腔内頬側細胞と、ヒドロゲル粒子との比較を示すデータを提供している。
図８は、前方散乱から独立した側方散乱の調整を実証する、ナノ粒子を異なる濃度で封入したヒドロゲル粒子に対するデータを提供している。
図９は、前方散乱により測定した屈折率の調整を実証する、異なるパーセントのポリマーで生成されたヒドロゲル粒子に対するデータを提供している。
図１０は、所望の細胞集団指標に一致させるおよび／または模倣するためのヒドロゲルパラメーターの調整の一実施形態を示している。
図１１および１２は、ヒドロゲル粒子の前方散乱、側方散乱および表面特性を調節する方法の実施形態を示している図である。 図１１および１２は、ヒドロゲル粒子の前方散乱、側方散乱および表面特性を調節する方法の実施形態を示している図である。
図１３は、様々なヒドロゲル粒子（Ａ）および（Ｂ）ならびに市販の血液試料（Ｃ）に対する散布図である。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、これらが使用されている文脈が明確に他を指示しない限り、単数と複数の両方を含むことを意図する。
「少なくとも１つの」および「１つまたは複数の」は、この冠詞が列挙された要素の１つまたは１つ超を含み得ることを意味するように、交換可能なように使用される。
他に指摘されていない限り、明細書および特許請求の範囲に使用されている、成分、反応条件、およびその他の量、比率、および数値的特性を表現するすべての数は、すべての事例において、「約」という用語で修飾可能であることが想定されると理解されたい。
フローサイトメーターに対するいくつかの重大な較正測定は、正確な時間分解能、例えば、レーザー間でのオフセット時間の設定、ならびに対象の検出とソーティングとの間での遅延時間の算出などを必要とする。装置内の流体状態により、これらのタイミングパラメーターの正確な設定は、分析すべき細胞と同じサイズの較正粒子の使用を必要とする。タイミング較正は通常、励振源の応答を較正し、レーザー間のタイミング遅延およびソーティング遅延を設定するために、様々な蛍光強度を有するポリスチレンビーズを使用して実施される。フローサイトメーターはまた、標的試料のサイズおよび粒度または複雑性の一般的尺度である前方および側方散乱シグナルを使用して較正することができる。これらの較正は、サイトメーターの正確な性能のため、および細胞集団の任意のダウンストリーム分析またはソーティングのために非常に重要である。開示されたヒドロゲル粒子は、調整された散乱特性を示し、一連の哺乳動物または細菌性細胞型に対する較正試薬としての使用に適している。散乱は、臨床、食品安全性、および研究の目的のために、異種混合物内で細胞型を区別するための標準的測定基準である。
レーザー間遅延およびソーティング遅延を設定するために、一部の用途に対してポリスチレン粒子を使用することができるが、多くの真核細胞型は、市販のポリスチレン粒子のサイズ範囲（１～２０μｍ）の外にあるため、これらの標的に対してフローサイトメーターを正確に較正することがほぼ不可能となっている。また、図１に示されているように、ポリスチレン粒子は、細胞の複雑性の一般的な尺度である側方散乱など、保有することができる光学特性が基本的に限定される。したがって、ポリスチレン粒子は、フローサイトメトリーにおいて使用されている２つの最も重要な受動的光学測定：標的のサイズおよび複雑性をそれぞれ測定するＦＳＣ（前方散乱）およびＳＳＣ（側方散乱）に限定される。ポリスチレンのこれらの制限により、ユーザーは、実験に対して蛍光強度、レーザー間の遅延、ソート遅延、サイズおよび細胞の複雑性を較正するために精製された細胞株に依存しなければならない。これは、フローサイトメトリーの検証および研究パイプラインのコストを著しく増加させる長期にわたる労働集約的なプロセスである。さらに重要なことに、これらの較正細胞株は生物学的ばらつきをもたらし、データ解釈の相違点を引き起こす。
さらに、フローサイトメーターが臨床用途に、例えば、ダウンストリーム細胞療法のためにヒトＴ制御性細胞または幹細胞を単離するために使用される場合、これらの装置の較正に対する品質管理（ＱＣ）もまた重大な考慮点である。ＦＤＡは、患者への投与前に細胞療法製品の滅菌性、独自性、純度、および作用強度を実証するように命じている（Rileyら（２００９年）Immunity、３０巻、６５６～６６５頁）。したがって、ポリスチレン
がある特定のがんに関わっていることから、細胞集団へのポリスチレンＱＣ粒子の混入は問題となり得る。さらに、患者への投与後に内部で酵素的に分解または消化されるＱＣ標準物質が混入した細胞集団は、万が一生じた場合に、混入問題を潜在的に克服する。
本発明は、以下に論じられているように、これらおよび他の必要性に取り組んでいる。
一態様では、複数のヒドロゲル粒子を含む組成物が提供され、複数のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子はそれぞれ、標的細胞の１種または複数の光学特性と実質的に同様の１種または複数の光学特性を有する。複数のヒドロゲル粒子の個々のヒドロゲル粒子のそれぞれは、独立して、１つまたは複数のモノマーを重合することによって合成される、すなわち、ホモポリマーまたはコポリマーを形成するために合成されるヒドロゲルを含む。以下にさらに論じられているように、二官能性モノマーの使用は、例えば、蛍光色素、細胞表面マーカーもしくはそのエピトープ結合断片、またはこれらの組合せでのヒドロゲルのさらなる誘導体化を可能にする。所望の細胞亜集団指標を満たす／これに一致させるためのヒドロゲルパラメーター調整の例が図１０に提供されている。ヒドロゲルの特性を調整するための方法は本明細書に記載されている。ヒドロゲルの構成成分およびヒドロゲルの濃度を含めた一連のパラメーターを調節する能力によって、広範囲の細胞、例えば、本明細書に記載されている細胞型の１つを模倣するよう粒子を調整する能力が可能となる。
上記に提供されているように、一態様では、本発明は、標的細胞の１種または複数の光学特性と実質的に同様の１種または複数の光学特性をそれぞれ有する個々のヒドロゲル粒子を提供する。一実施形態では、１種または複数の光学特性は、側方散乱プロファイル、前方散乱プロファイルまたは第２次マーカープロファイル、例えば、蛍光マーカープロファイルなど、例えば、ヒドロゲル粒子の表面に結合する蛍光標識した抗体の蛍光マーカープロファイルである。「実質的に同様の」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも４０％同様、少なくとも５０％同様、少なくとも６０％同様、少なくとも７０％同様、少なくとも８０％同様、少なくとも９０％同様、少なくとも９５％同様、少なくとも９６％同様、少なくとも９７％同様、少なくとも９８％同様または少なくとも９９％同様であることを表す。
本発明は、ヒドロゲル粒子の組成を変化させることによって、例えば、組成物中の最初のモノマー（またはコモノマー）の量を変化させることによって、表面官能化を変化させることによって、重合開始剤の量を変化させることによって、または架橋剤の量を変化させることによって、ヒドロゲル粒子の１種または複数の光学特性を独立してモジュレートすることができるという予期せぬ発見に部分的に基づく。例えば、側方散乱（ＳＳＣ）は、前方散乱（ＦＳＣ）に実質的に影響を与えることなくモジュレートすることができ、逆もまた同様である。さらに、ヒドロゲル粒子の光学特性（例えば屈折率）は、粒子密度に実質的な作用を与えることなく、調整することができる。フローサイトメトリーまたは（蛍光活性化セルソーティング）ＦＡＣＳなどのサイトメトリー法において、細胞の代用としての役目を果たすヒドロゲル粒子がこれらのアッセイにおいて機能するためには、最小密度が必要となるため、これは驚くべき、有用な特徴である。
別の態様では、ヒドロゲル粒子を生成するための方法が提供され、ヒドロゲル粒子は、１種または複数の標的細胞の光学特性と実質的に同様の１種または複数の光学特性を有する。一実施形態では、ヒドロゲル粒子は予め決定された光学特性を有する。一実施形態では、光学特性はＳＳＣ、ＦＳＣ、蛍光発光、またはこれらの組合せである。
さらに別の態様では、標的細胞の分析のためのサイトメトリーデバイスを較正する方法が提供される。一実施形態では、本方法は、（ａ）標的細胞の光学特性と実質的に同様の光学特性を有するヒドロゲル粒子をデバイスに挿入するステップと、ｂ）サイトメトリーデバイスを使用してヒドロゲル粒子の光学特性を測定し、これによって、標的細胞の分析のためのサイトメトリーデバイスを較正するステップとを含む。サイトメトリーデバイスは当技術分野で公知であり、フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳを実施するための市販のデバイスを含む。
上記に提供されているように、本発明の一態様では、複数のヒドロゲル粒子を含む組成物が提供される。ヒドロゲルとは、水の存在下で膨潤し、水の不在下で（または水量の減少により）収縮するが、水に溶解しないことを可能にする巨大分子の三次元ネットワークを含む材料である。膨潤、すなわち、水の吸収は、巨大分子ネットワークに結合している、またはこの中に分散している親水性官能基の存在の結果である。隣接する巨大分子間の架橋が、これらのヒドロゲルの水不溶性をもたらす。架橋は、化学的（すなわち、共有結合の）または物理的（すなわち、ファンデルワールス力、水素結合、イオン力など）結合が原因となり得る。合成的に調製したヒドロゲルは、モノマー材料を重合して、骨格を形成し、架橋剤で骨格を架橋することによって調製することができる。「ヒドロゲル」という用語は、本明細書で言及された場合、脱水状態または水和状態であるかに関わらず、巨大分子材料を指す。特に価値のあるヒドロゲルの特徴とは、脱水または水和されているかに関わらず、この材料は一般的な形状を保持していることである。したがって、ヒドロゲルが脱水状態でほぼ球状の形状を有する場合、水和状態では球状となる。
一実施形態では、本明細書で開示されているヒドロゲル粒子は、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、または約９５％超の水を含む。別の実施形態では、ヒドロゲル粒子は、約１０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約２０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約３０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約４０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約５０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約６０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約７０重量パーセント～約９５重量パーセント、または約８０重量パーセント～約９５重量パーセントの含水量を有する。
本明細書に提供されている、粒子形態のヒドロゲルは、本明細書に提供されているモノマーの１種または複数を重合することによって合成される。個々のヒドロゲル粒子を形成するために合成が行われる。一実施形態では、モノマー材料（モノマー）を重合して、ホモポリマーを形成する。しかし、別の実施形態では、異なるモノマー単位（すなわち、コモノマー）のコポリマーが合成され、本明細書に提供されている方法において使用される。一実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物において使用されるモノマーまたはコモノマーは、二官能性モノマーであるか、または二官能性モノマーを含む（コモノマーが利用されている）。一実施形態では、ヒドロゲルは架橋剤の存在下で合成される。さらなる実施形態では、実施形態、ヒドロゲルは重合開始剤の存在下で合成される。
モノマーの量は、例えば、標的細胞のものと実質的に同様の特定の光学特性を得るために、本発明のユーザーにより変えることができる。一実施形態では、モノマー構成成分（複数可）（すなわち、モノマー、コモノマー、二官能性モノマー、またはこれらの組合せ）、例えば、様々な架橋比のビス／アクリルアミド、第２次標識／コンジュゲーションのための化学的官能基を提供するアリルアミンもしくは他のコモノマー、またはアルギネートがヒドロゲルの約１０重量パーセント～約９５重量パーセントで存在する。さらなる実施形態では，モノマー構成成分（複数）は、ヒドロゲルの約１５重量パーセント～約９０重量パーセント、またはヒドロゲルの約２０重量パーセント～約９０重量パーセントで存在する。
本発明と共に使用するために利用可能な様々なモノマーおよび架橋化学物質の例は、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（その開示がすべての目的のためにその全体において参照により組み込まれている、tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures
/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfにて入手可能）に提供されている。例え
ば、ヒドラジン（例えば、ＮＨＳエステル化合物を用いた）またはＥＤＣカップリング反応（例えば、マレイミド化合物を用いた）を使用して、本発明のヒドロゲルを構築することができる。
一実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲルと共に使用するためのモノマーは、乳酸、グリコール酸、アクリル酸、１－ヒドロキシエチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、プロピレングリコールメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリセロールメタクリレート（ＧＭＡ）、グリコールメタクリレート、エチレングリコール、フマル酸、それらの誘導体化バージョン、またはこれらの組合せである。
一実施形態では、本発明のヒドロゲルを形成するために以下のモノマーの１種または複数が本明細書で使用される：２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエトキシエチルメタクリレート、ヒドロキシジエトキシエチルメタクリレート、メトキシエチルメタクリレート、メトキシエトキシエチルメタクリレート、メトキシジエトキシエチルメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メトキシ－ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレートまたはこれらの組合せ。
別の実施形態では、調整可能なヒドロゲルを形成するために以下のモノマーの１種または複数が本明細書で使用される：すべての目的のため、その全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，６５７，０３０号に記載されているような、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、２－フェニルエチルアクリレート、２－フェニルエチルメタクリレート、２－フェノキシエチルアクリレート、２－フェノキシエチルメタクリレート、フェニルチオエチルアクリレート、フェニルチオエチルメタクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルアクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルメタクリレート、ペンタブロモフェニルアクリレート、ペンタブロモフェニルメタクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２，３－ジブロモプロピルアクリレート、２，３－ジブロモプロピルメタクリレート、２－ナフチルアクリレート、２－ナフチルメタクリレート、４－メトキシベンジルアクリレート、４－メトキシベンジルメタクリレート、２－ベンジルオキシエチルアクリレート、２－ベンジルオキシエチルメタクリレート、４－クロロフェノキシエチルアクリレート、４－クロロフェノキシエチルメタクリレート、２－フェノキシエトキシエチルアクリレート、２－フェノキシエトキシエチルメタクリレート、Ｎ－フェニルアクリルアミド、Ｎ－フェニルメタクリルアミド、Ｎ－ベンジルアクリルアミド、Ｎ－ベンジルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルメタクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルアクリルアミド Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルアクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルアクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルアクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）アクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルアクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－フェニルフェニルエチルアクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルメタクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルメタクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルメタクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）メタクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－フェニルフェニルエチルメタクリルアミド、Ｎ－ビニルカルバゾール、４－ビニルピリジン、２－ビニルピリジン。
合成ヒドロゲル、バイオヒドロゲル、または合成構成成分とバイオ構成成分（例えば、生体分子上に存在するペプチド、タンパク質、単糖、二糖、多糖、第一級アミンスルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、カルボン酸）を含むハイブリッドヒドロゲルを形成するために、合成モノマーとバイオモノマーの両方を本明細書に提供されているヒドロゲルに使用することができる。例えば、タンパク質、ペプチドまたは炭水化物は、合成モノマー（またはポリマー）を含むまたは含まないヒドロゲルを、化学的適合性のあるコモノマーおよび架橋化学物質（その開示がすべての目的のためにその全体において参照により組み込まれている、例えば、tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能な、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbookを参照されたい）と組み合わせて形成するための個々のモノマーとして使用することができる。適合性のある架橋化学物質として、これらに限定されないが、アミン、カルボキシル、および他の反応性の化学的側基が挙げられる。本明細書に記載されているヒドロゲルおよびモノマーにおける使用に適した代表的な反応性基は、以下の表１に提供されている。
Figure 0007499376000001
一般的に、当業者に一般的に公知の任意の形態の重合化学／方法を、ポリマーを形成するために利用することができる。一部の実施形態では、重合は、紫外線光により誘発させたラジカル形成および反応進行により触媒することができる。他の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子は、アクリルアミドの重合またはアクリレートの重合により生成される。例えば、一実施形態では、アクリルアミドは、その開示がすべての目的のためにその全体において参照により組み込まれている、米国特許第６，１０７，３６５号に記載されているような重合可能な炭水化物誘導体化したアクリルアミドである。その中に記載され、当業者に公知であるように、アクリルアミド基の糖への特定の結合は、一連の単糖およびより高次の多糖に、例えば、合成多糖または天然源由来の多糖、例えば、血清または組織
中に見出される糖タンパク質などに容易に適合している。
一実施形態では、アクリレート官能化ポリ（エチレン）グリコールモノマーをヒドロゲルモノマーとして使用する。例えば、一実施形態では、ＰＥＧはアクリレートまたはアクリルアミド官能化ＰＥＧである。
一部の実施形態では、ヒドロゲル粒子は、少なくとも１つの二官能性モノマーで重合した単官能性モノマーを含む。１つの例として、これに限定されないが、アクリルアミドおよびビス－アクリルアミド（二官能性モノマー）を使用したポリ－アクリルアミドポリマーの形成が挙げられる。別の実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子は、第２の二官能性モノマーで重合した二官能性モノマーを含む。１つの例として、これに限定されないが、適合性のある化学物質、例えば、アクリルアミド、ビス－アクリルアミド、およびビス－アクリルアミドの構造的同族体を含有する、広範囲の追加の化学物質を含有する混合組成物を用いたポリマーの形成が挙げられる。化学的に適合性のあるモノマー、二官能性モノマー、および混合組成物の範囲は、当業者に明白であり、当業者に公知の化学的反応性の原理に従う。（参考文献、Thermo handbook and acrylamide polymerization handbook）。例えば、それぞれの開示がすべての目的のためにその全体にお
いて参照により組み込まれている「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）およびthe Polyacrylamide Emulsions Handbook（SNF Floerger、snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdfで入手可能）を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子は、重合可能な単官能性モノマーを含み、単官能性アクリルモノマーである。本明細書での使用のための単官能性アクリルモノマーの非限定的例は、アクリルアミド；メタクリルアミド；Ｎ－アルキルアクリルアミド、例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドまたはＮ－ｔｅｒｔブチルアクリルアミドなど；Ｎ－アルキルメタクリルアミド、例えば、Ｎ－エチルメタクリルアミドまたはＮイソプロピルメタクリルアミドなど；Ｎ，Ｎ－ジアルキルアクリルアミド、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ－ジエチル－アクリルアミドなど；Ｎ－［（ジアルキルアミノ）アルキル］アクリルアミド、例えば、Ｎ－［３ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドまたはＮ－［３－（ジエチルアミノ）プロピル］アクリルアミドなど；Ｎ－［（ジアルキルアミノ）アルキル］メタクリルアミド、例えば、Ｎ－［３－ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドまたはＮ－［３－（ジエチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドなど；（ジアルキルアミノ）アクリル酸アルキル、例えば、２－（ジメチルアミノ）アクリル酸エチル、２－（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート、または２－（ジエチルアミノ）アクリル酸エチルなど；および（ジアルキルアミノ）アルキルメタクリレート、例えば、２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートなどである。
二官能性モノマーは、本開示の単官能性モノマーと重合して、第２の反応、例えば、蛍光体または細胞表面受容体（またはそのドメイン）のコンジュゲーションに参加できる第２の官能基をさらに含有する、本明細書中に記載されているようなヒドロゲルを形成することができる任意のモノマーである。
一部の実施形態では、二官能性モノマーは、アリルアミン、アリルアルコール、アリルイソチオシアネート、アリルクロリド、およびアリルマレイミドからなる群から選択される。
二官能性モノマーは二官能性アクリルモノマーであることができる。二官能性アクリル
モノマーの非限定的例は、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’プロピレンビスアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’－（１，２－ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドである。
より高次の分枝鎖および直鎖コモノマーは、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第６，６５７，０３０号に記載されているように、ポリマー密度を維持しながら、屈折率を調節するためにポリマーミックス内で置換することができる。
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲルの光学特性をモジュレートする分子を含む。ヒドロゲルの光学特性を変化させることが可能な分子は以下でさらに論じられている。
一実施形態では、個々のヒドロゲル粒子またはその複数は、ヒドロゲルモノマーとして生分解性ポリマーを含む。一実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコライド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、およびこれらのコポリマーをベースとするポリ（エステル）である。一実施形態では、生分解性ポリマーは、炭水化物またはタンパク質、またはこれらの組合せである。例えば、一実施形態では、単糖、二糖または多糖、（例えば、グルコース、スクロース、またはマルトデキストリン）ペプチド、タンパク質（またはそのドメイン）をヒドロゲルモノマーとして使用する。他の生分解性ポリマーとして、ＰＨＢ－ＰＨＶクラスのポリ（ヒドロキシアルカノエート）、追加のポリ（エステル）、および天然ポリマー、例えば、修飾されたポリ（サッカライド）、例えば、デンプン、セルロース、およびキトサンが挙げられる。別の実施形態では、生体適合性ポリマーは、接着タンパク質、セルロース、炭水化物、デンプン（例えば、マルトデキストリン、２－ヒドロキシエチルデンプン、アルギン酸）、デキストラン、リグニン、ポリアミノ酸、アミノ酸、またはキチンである。このような生分解性ポリマーは、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。
一実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸のみを含む。しかし、本発明は、これに限定されない。例えば、自己集合する人工タンパク質および非天然アミノ酸を有するタンパク質（例えば、非リボソームペプチドに組み込まれているもの、または合成的アプローチを介して合成的に導入されたもの、例えば、その開示がすべての目的のためにその全体において参照により組み込まれている、Zhangら（２０１３年）Current Opinion in Structural Biology ２３巻、５８１～５８７頁を参照されたい）、またはそのタンパク質ドメインもまたヒドロゲルモノマーとして使用することができる。このような組成物に組み込むことができる非天然（天然でない）アミノ酸の範囲は、当業者には周知である（すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれているZhangら（２０１３年）Current Opinion in Structural Biology、２３巻、５８１～５８７頁）。一実施形態では、生分解性ポリマーはコモノマーとして、すなわち、モノマー混合物で使用される。一実施形態では、生分解性ポリマーは二官能性モノマーである。
一実施形態では、バイオモノマーは、アクリルアミドまたはアクリレートで官能化される。例えば、一実施形態では、重合可能なアクリルアミドで官能化した生体分子は、アクリルアミドもしくはアクリレート官能化タンパク質（例えば、アクリルアミド官能化コラーゲンまたは官能化コラーゲンドメイン）、アクリルアミドもしくはアクリレート官能化ペプチド、またはアクリルアミドもしくはアクリレート官能化単糖、二糖もしくは多糖である。
任意の単糖、二糖または多糖（官能化したまたは他の）をヒドロゲルモノマーとして使
用することができる。一実施形態では、アクリルアミドまたはアクリレート官能化単糖、二糖または多糖を重合可能なヒドロゲルモノマーとして使用する。一実施形態では、構造的多糖を重合可能なヒドロゲルモノマーとして使用する。さらなる実施形態では、構造的多糖は、アラビノキシラン、セルロース、キチンまたはペクチンである。別の実施形態では、アルギン酸（アルギネート）を重合可能なヒドロゲルモノマーとして使用する。さらに別の実施形態では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を本明細書に提供されているヒドロゲルにおいて重合可能なモノマーとして使用する。さらなる実施形態では、ＧＡＧは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸またはヒアルロン酸（当技術分野ではヒアルロンまたはヒアルロン酸塩とも呼ばれる）であり、重合可能なヒドロゲルモノマーとして使用する。適合性のあるバイオモノマーおよびこれらの反応性化学物質の追加の範囲は、当業者に公知であり、一般的な化学的反応性の原理に従う。
組み込むことができる生体適合性モノマーの追加の範囲は当技術分野で公知であり、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているShastri
（２００３年）Current Pharmaceutical Biotechnology ４巻、３３１～３３７頁で開示された非分解性の生体適合性モノマーを参照されたい。他のモノマーは、それぞれの開示がこれらの全体において参照により本明細書に組み込まれているde Moraes Porto（
２０１２年）Polymer Biocompatibility、Polymerization、Dr. Ailton De Souza Gomes（編）、ＩＳＢＮ：９７８－９５３－５１－０７４５－３；InTech、ＤＯＩ：１０．５７７２／４７７８６；Hellerら、（２０１０年）Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry ４９巻、６５０～６６１頁；Final Report for Biocompatible Materials（２００４年）、The Board of the Biocompatible Materials and the Molecular Engineering in Polymer Science programmes、ＩＳＢＮ９１－６３１－４９８５－０において提供されている。
一実施形態では、本明細書に記載されているヒドロゲルと共に使用するための生体適合性モノマーとして、エチレングリコール（ethyleglycol）ジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、メチルメタクリレート（methylmethacrylte）（ＭＭＡ）、メタクリルオキシメチルトリメチルシラン（ＴＭＳ－ＭＡ）
、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン（Ｎ－ＶＰ）、スチレン、またはこれらの組合せが挙げられる。
本発明において有用な天然に存在するヒドロゲルとして、植物、藻、真菌、酵母、海洋性無脊椎動物および節足動物などの天然源から入手可能な様々な多糖が挙げられる。非限定的例として、アガロース、デキストラン、キチン、セルロースベース化合物、デンプン、誘導体化デンプンなどが挙げられる。これらは一般的に、多糖骨格の主要部分としてグルコース繰返し単位を有する。このような多糖に対する架橋化学物質は当技術分野で公知であり、例えば、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbookを参照されたい（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）。
一実施形態では、ヒアルロナンをヒドロゲルモノマーとして使用する（単一モノマーとしてまたはコモノマーとしてのいずれか）。一実施形態では、ヒアルロナンは、例えば、アクリレートまたはアクリルアミドで官能化する。ヒアルロナンは、交互のβ－１，４およびβ－１，３グリコシド結合を介して一緒に連結されているＮ－アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の二糖繰返し単位で構成される高分子量ＧＡＧである。ヒト体内では、ヒアルロン酸塩は、皮膚、臍帯、滑液、および硝子体液を含めた、いくつかの軟質の結合組織中に見出される。したがって、一実施形態では、皮膚細胞、臍帯細胞または硝子体
液細胞の１種または複数の光学特性を模倣することが望まれる場合、一実施形態では、ヒアルロナンをヒドロゲルモノマーとして使用する。ヒドロゲル粒子を製作するための方法は、その開示がすべての目的のためにその全体において本明細書に組み込まれている、Xuら（２０１２年）Soft Matter.８巻、３２８０～３２９４頁に記載されている。その中
に記載されているように、ヒアルロナンは、所望の架橋化学物質およびヒドロゲル粒子を形成するために使用される他のモノマーに応じて、様々な反応性ハンドルを用いて誘導体化することができる。
さらに他の実施形態では、ランダムに分配したβ－（１－４）連結Ｄ－グルコサミン（脱アセチル化単位）およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（アセチル化単位）で構成される直鎖多糖であるキトサンをヒドロゲルモノマーとして使用する（単一モノマーとしてまたはコモノマーとしてのいずれか）。
ヒドロゲルモノマーまたはコモノマーとして使用するための他の多糖として、これらに限定されないが、寒天、アガロース、アルギン酸、アルグロン酸、アルファグルカン、アミロペクチン、アミロース、アラビノキシラン、ベータ－グルカン、カロース、カプスラン（capsullan）、カラギーナン多糖（例えば、カッパ、イオタまたはラムダのクラス）
、セロデキストリン、セルリン、セルロース、キチン、キトサン、クリソラミナリン、カードラン、シクロデキストリン、アルファ－シクロデキストリン、デキストリン、フィコール、フルクタン、フコイダン、ガラクトグルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトサミノガラクタン（galactosaminoogalactan）、ジェランガム、グルカン、グルコマンナン、グルクロノキシラン（glucorunoxylan）、グリコカリックス、グリコーゲン、ヘミセルロース、ホモ多糖、ヒプロメロース、イコデキストリン、イヌリン、ケフィラン、ラミナリン、レンチナン、レバン多糖、リケニン、マンナン、混合結合グルカン、パラミロン、ペクチン酸、ペクチン、ペンタスターチ、フィトグリコーゲン、プルーラン（ｐｌｅｕｒａｎ）、ポリデキストロース、多糖ペプチド、ポルフィラン、プルラン、シゾフィラン、シニストリン、シゾフィラン、ウェランガム、キサンタンガム、キシラン、キシログルカン、ザイモサン、またはこれらの組合せが挙げられる。全体にわたり記載されているように、所望の架橋化学物質および／またはヒドロゲルに利用されている追加のコモノマーに応じて、多糖はさらに官能化できる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載されている多糖の１種または複数は、アクリレートまたはアクリルアミドで官能化される。
一実施形態では、個々のヒドロゲル粒子またはその複数は、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはこれらの組合せを、ヒドロゲルモノマーまたはその複数として含む。さらなる実施形態では、タンパク質は、構造的タンパク質、またはそのドメイン、例えば、絹、エラスチン、チチンもしくはコラーゲン、またはそれらのドメインなどである。一実施形態では、タンパク質は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）構成成分（例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン）である。またさらなる実施形態では、構造的タンパク質はコラーゲンである。またさらなる実施形態では、コラーゲンはＩ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲンもしくはＩＩＩ型コラーゲンまたはこれらの組合せである。別の実施形態では、ヒドロゲルモノマーはプロテオグリカンを含む。さらなる実施形態では、プロテオグリカンはデコリン、ビグリカン、テスチカン、ビクニン、フィブロモジュリン、ルミカン、またはそれらのドメインである。
別の実施形態では、アクリレート官能化した構造的タンパク質ヒドロゲルモノマーは、本明細書に提供されているヒドロゲルの構成成分（例えば、アクリレート官能化タンパク質またはタンパク質ドメイン、例えば、絹、エラスチン、チチン、コラーゲン、プロテオグリカン、またはそれらの官能化ドメイン）として使用される。さらなる実施形態では、アクリレート官能化した構造的タンパク質ヒドロゲルモノマーは、プロテオグリカン、例えば、デコリン、ビグリカン、テスチカン、ビクニン、フィブロモジュリン、ルミカン、
またはそれらのドメインを含む。
一実施形態では、細胞外マトリクスタンパク質を模倣できるＰＥＧモノマーおよびオリゴペプチドは、例えば、すべての目的のため、その全体が参照により組み込まれているLutolfら（２００３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １００巻、５４１３～５４
１８頁により記載されているような、ビニルスルホン官能化マルチアームＰＥＧ、インテグリン結合ペプチドおよびビス－システインマトリクスメタロプロテイナーゼペプチドと共に本明細書に提供されているヒドロゲルにおいて使用される。この特定の実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＥＧ上のジチオール化オリゴペプチドとビニルスルホン基の間のマイケル－タイプ付加反応により形成される。ここに組み込むことができる追加の適合性のある化学物質の範囲は、当業者に明白であり、一般的な化学的反応性の原理に従うものであり、例えば「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）を参照されたい。
天然タンパク質の中の他の生理活性ドメインもまた、ヒドロゲルモノマーまたはその部分として使用することができる。例えば、細胞接着性インテグリン結合ドメイン、制御放出の親和性結合ドメインまたはトランスグルタミナーゼ架橋ドメインを本明細書に提供されているヒドロゲルに使用することができる。このようなヒドロゲルを生成するための詳細は、すべての目的のため、それぞれがその全体において参照により組み込まれている、Martinoら（２００９年）Biomaterials ３０巻、１０８９頁；Martinoら（２０１１年）Sci. Trans. Med.３巻、１００ｒａ８９；HuおよびMessersmith（２００３年）J. Am.
Chem. Soc. １２５巻、１４２９８頁に見出すことができる。
一実施形態では、例えば、すべての目的のため、その全体が参照により組み込まれている、Petkaら、（１９９８年）Science、２８１巻、３８９～３９２頁により記載されている方法により、ｐＨまたは温度の変更に応答してゲル化するように設計されているタンパク質を作り出すために組換えＤＮＡ法が使用される。簡潔に言うと、タンパク質は、水溶性高分子電解質セグメントに隣接する末端ロイシンジッパードメインからなる。ほぼ中性の水溶液において、末端ドメインのコイル状のコイル凝集物は、三次元のヒドロゲルポリマーネットワークを形成する。
本明細書に提供されているヒドロゲルを架橋するために使用することができる一般的な架橋剤として、これらに限定されないがエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）、テトラエチレングリコールジメタクリレート、およびＮ，Ｎ’－１５メチレンビスアクリルアミドが挙げられる。使用することができる追加の架橋化学物質の範囲は、当業者に明白であり、一般的な化学的反応性の原理に従うものであり、例えば、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）を参照されたい。
一実施形態では、ヒドロゲルの重合は、過硫酸塩またはラジカル形成を触媒する同等の開始剤により開始される。適合性のある開始剤の範囲は、当業者に公知であり、一般的な化学的反応性の原理に従うものであり、例えば、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）を参照されたい。過硫酸塩は任意の水溶性過硫酸塩であることができる。水溶性過硫酸塩の非限定的例は過硫酸アンモニウムおよびアルカリ金属過硫酸塩である。アルカリ金属として、リチウム、ナトリウムおよびカリウムが挙げられる
。一部の実施形態では、過硫酸塩は過硫酸アンモニウムまたは過硫酸カリウムである。さらなる実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲルの重合は過硫酸アンモニウムにより開始される。
ヒドロゲルの重合は、重合不安定な化学的側基の形成を触媒することができる促進剤により加速することができる。可能な促進剤の範囲は当業者に公知であり、一般的な化学的反応性の原理に従うものであり、例えば、「Easy molecular bonding crosslinking technology」という表題のThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook（tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslinking-Reagents-Handbook.pdfで入手可能）を参照されたい。一実施形態では、促進剤は第三級アミンである。第三級アミンは、任意の水溶性第三級アミンであることができる。一実施形態では、促進剤は重合反応に使用され、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミン、３－ジメチルアミノ）プロピオニトリル、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）である。別の実施形態では、促進剤は重合反応に使用され、アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）である。
上で論じたように、本明細書に記載されている組成物および方法において使用するためのヒドロゲルは、本明細書に記載されているようなモノマー単位および架橋剤のいずれかを含むことができ、一態様では、液滴を重合することによってヒドロゲル粒子として生成される（例えば、図２を参照されたい）。流体液滴および剛体化液滴を含む複数の液滴を生成する微小流体の方法は当業者に公知であり、それぞれがすべての目的のためそれらの全体において本明細書に参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２０１１／０２１８１２３号および米国特許第７，２９４，５０３号に記載されている。このような方法は、第１の流体を含有し、第２の流体に実質的に取り囲まれた複数の液滴を提供し、第１の流体および第２の流体は実質的に不混和性である（例えば、水性ベースの液体を含有する液滴が油ベースの液体に実質的に取り囲まれている）。
複数の流体液滴（例えば、微小流体デバイスを使用して調製される）は多分散であってもよいし（例えば、一連の異なるサイズを有する）、またはある場合には、流体液滴は、例えば、液滴の約１０％、約５％、約３％、約１％、約０．０３％、または約０．０１％以下が平均直径の約１０％、約５％、約３％、約１％、約０．０３％、または約０．０１％超の平均直径を有するような、例えば均質の直径分布を有する、単分散、または実質的には単分散であってもよい。液滴の集団の平均直径とは、本明細書で使用される場合、液滴の直径の算術的平均を指す。粒子の平均直径は、例えば、光散乱技術により測定することができる。一実施形態では、ヒドロゲル粒子の平均直径は、例えば、微小流体のデバイスの流路（複数可）内の第１および第２の流体の流体ストリームの流量を変えることによって、または微小流体デバイスの流路（複数可）の容積を変えることによって適応させる。
したがって、本開示は、複数のヒドロゲル粒子を含むヒドロゲル粒子の集団を提供し、ヒドロゲル粒子の集団は実質的に単分散である。
微小流体という用語は、１ｍｍ未満の断面寸法、および少なくとも約３：１の長さと、流路に対して垂直の最も大きな断面寸法との比を有する少なくとも１つの流体流路を含むデバイス、器具またはシステムを指す。微小流体流路を含む微小流体デバイスは、複数の単分散液滴を調製するのに特によく適している。
本発明と共に使用することができる微小流体システムの非限定的例は、それぞれが、すべての目的のため、その全体において本明細書に参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２００６／０１６３３８５号；米国特許出願公開第２００５／０１７２４７６
号；米国特許出願公開第２００７／０００３４２号；国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０９６５７１号；米国特許出願公開第２００７／００５４１１９号；米国特許第７，７７６，９２７号；および国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０７８８４１号に開示されている。
液滴サイズは微小流体流路サイズに関係している。微小流体流路は、例えば、約５ｍｍもしくは２ｍｍ未満、または約１ｍｍ未満、または約５００μｍ未満、約２００μｍ未満、約１００μｍ未満、約６０μｍ未満、約５０μｍ未満、約４０μｍ未満、約３０μｍ未満、約２５μｍ未満、約１０μｍ未満、約３μｍ未満、約１μｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満の流体流に対して垂直の最も大きな寸法を有する任意のサイズであってよい。
液滴サイズは、相対的流量を調節することによって調整することができる。一部の実施形態では、液滴直径は、流路の幅と等しいか、または流路の幅の約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％以内である。
本開示のヒドロゲル粒子の寸法は、粒子が形成された液滴と実質的に同様である。したがって、一部の実施形態では、ヒドロゲル粒子は約１μｍ、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、８００未満の直径、または１０００μｍ未満の直径を有する。一部の実施形態では、ヒドロゲル粒子は、約１μｍ、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、８００超の直径、または１０００μｍ超の直径を有する。一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、５μｍ～１００μｍの範囲の直径を有する。
一部の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子は形状が球状である。
一部の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子はアガロースを含まない。
一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、懸濁重合により運ばれ、この懸濁重合はまた当技術分野でパール、ビーズまたは粒状重合とも呼ばれる（すべての目的のため、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Elbert（２０１１年）Acta Biomater、７巻、３１～５６頁を参照されたい）。懸濁重合において、モノマーは連続相内で不溶性であり、例えば、連続油相中の水性モノマー溶液である。懸濁重合において、重合開始はモノマーを多く含む液滴内で、およびいつでも１滴当たり１つ超のラジカルと共に生じる。一実施形態では、モノマー相は、二官能性モノマーまたは複数のモノマー種（コモノマー、複数の二官能性モノマーであることができるもの）であってよいモノマーを含む。一実施形態では、モノマー相は、開始剤および／または架橋剤を含む。
乳化重合もまた、本明細書に記載されているヒドロゲル粒子を形成するために使用することができる。乳化重合において、モノマーは、懸濁重合と同様に、連続相内で難溶性を有する、しかし、重合開始は、モノマー液滴の外側で生じる（すべての目的のため、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Elbert（２０１１年）Acta Biomater、７巻、３１～５６頁を参照されたい）。乳化重合の実施形態では、開始剤は、連続相中に溶解されたモノマー（またはコモノマー）、または界面活性剤が存在する場合、ミセル中に含有されているモノマーの連鎖成長を引き起こす。
別の実施形態では、ヒドロゲル粒子は、例えば、すべての目的のため、その全体が本明
細書に参照により組み込まれている、Elbert（２０１１年）Acta Biomater、７巻、３１～５６頁に記載されているような、沈殿重合により形成される。沈殿重合は、マイクロ粒子を生成するためにモノマーとポリマーの溶解度における差異を活用する技術である。具体的には、より大きなポリマー鎖がより小さなポリマー鎖より低い溶解度を一般的に有することは公知である。したがって、特定の分子量より上では、相分離が好まれることもある。沈殿重合は最初に、均一系である単相内で溶液重合として開始される。一実施形態では、重合の開始直後、核形成による相分離を好む比較的高濃度のポリマー鎖が存在する。重合が進行するにつれて、ポリマー鎖の濃度は低くなり、既存の粒子は、新規粒子の核形成が生じ得る前に鎖を獲得する。したがって、粒子の核形成は、反応開始直後の短い期間のみ生じ、これは、一実施形態では、狭い粒子サイズ分布をもたらす。追加の方法として、これらに限定されないが、リソグラフィック粒子形成（すべての目的のため、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Helgesonら（２０１１年）Curr. Opin. Colloid. Interface Sci.１６巻、１０６～１１７頁）膜乳化（例えば、Nanomi B.V.（Netherlands）により記載されているマイクロシーブ乳化技術の技法）およびマイクロチャネル乳化（その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Sugiuraら（２００２年
）Languimir、１８巻、５７０８～５７１２頁）およびバルク乳化（ＳＮＦ Ｆｌｏｅｒ
ｇｅｒ、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、snf.com.au/downloads/Emulsion_Handbook_E.pdfで入手可能）が挙げられる。
一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、水性モノマー溶液の中心ストリームに集束する２つの油流路を有する微小流体デバイス内で形成される。本実施形態では、液滴が２つの流路と中心ストリームの境界面で形成されて、油中水型乳濁液中の液滴を壊す。一実施形態では、液滴が一度形成されると、例えば、油相に界面活性剤を加えることによって、重合前にこれらを安定化させる。しかし、別の実施形態では、液滴は重合前に安定化されない。一実施形態では、最初の液滴が形成された後で、油流路の１つまたは両方に促進剤（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミン）を加えることによって、モノマーの重合を誘発する。
上記で提供されたような水性モノマー溶液は、単一のモノマー種または複数のモノマー種を含むことができる。水性モノマー溶液は、コモノマー、二官能性モノマーまたはこれらの組合せを含むことができる。一実施形態では、モノマーまたは複数のモノマーは、二官能性モノマー、例えば、上に記載されているモノマーのうちの１種を含むことができる。以下に記載されているように、コモノマーを使用して、例えば、ヒドロゲル粒子の屈折率を調節することによって、前方散乱または側方散乱をモジュレートすることができる。
一実施形態では、水性モノマー溶液の中心ストリームは、架橋剤、例えば、Ｎ，Ｎ’－ビスアクリルアミドを含む。さらなる実施形態では、水性のモノマー溶液の中心ストリームは、モノマーに加えて、架橋剤および促進剤を含む。またさらなる実施形態では、水性モノマー溶液は、開始剤、例えば、過硫酸アンモニウムなどの酸化剤を含む。
前方散乱は、コモノマーアリルアクリレートおよびアリルメタクリレートを加えて、ゲルの屈折率を調節することによってモジュレートした（また図１１および１２を参照されたい）。前方散乱はまた、これに限定されないが、シリカおよび／またはＰＭＭＡ粒子の高密度コロイドの懸濁液を含めた、十分な光学分割／サイズ／密度を含有する側方散乱ナノ粒子でモジュレートすることもできる。液滴の側方散乱は、シリカナノ粒子および／またはＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））粒子（約１００ｎｍ）のコロイド懸濁液を、重合前に中心の水相に加えることによって調整した（図１１および１２）。
一実施形態では、ビーズ、複数のビーズ、生体分子、または複数の生体分子がヒドロゲル粒子内に埋め込まれている（封入される）。一実施形態では、封入されたビーズまたは
生体分子を利用して、それが粒子を巻き込んだ後で、標的細胞の１種または複数の細胞内の細胞器官、または細胞を模倣する。一実施形態では、ビーズまたは生体分子の封入または埋込みは、ヒドロゲル粒子の形成の時点で達成される。例えば、ビーズは適当な濃度で懸濁させることによって、単一のヒドロゲル粒子内に平均１つのビーズを埋め込む／封入することを可能にすることができる。ビーズ懸濁液は、例えば、モノマー水溶液内に含まれていてもよい。同様に、生体分子または生体分子の混合物をモノマー水溶液に組み込むことによって、生体分子（複数可）を封入することができる。
代わりに、一実施形態では、ヒドロゲル粒子が、例えば上に記載されている方法により一度形成されると、ヒドロゲル粒子は、例えば、ヒドロゲル粒子内にビーズ、複数のビーズ、生体分子または複数の生体分子を埋め込むことによって、さらに操作することができる。
したがって、本発明の一態様では、埋め込まれた物質を含むヒドロゲルが提供される。
一実施形態では、埋め込まれた物質は、埋め込まれた分子、例えば、生体分子である。生体分子は、単一種または複数の異なる種であることができる。例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸またはこれらの組合せを本発明のヒドロゲル粒子内に封入することができる。さらに、異なる核酸分子（例えば、異なる配列または核酸タイプ、例えば、ゲノムのＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドなど）を本発明のヒドロゲル粒子で封入することができる。これらは任意のタンパク質または核酸で構成されることが可能であるが、これは両方の形態の生物学的材料が不安定な化学的側基を含有するからである（または例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの化学的側基修飾など、商業的販売元によって修飾されることが可能である）。このような側基はコモノマー組成物に一般的に見出される反応化学物質と適合性がある（例えば、アクリレート化学物質、ＮＨＳ－エステル、第一級アミン、銅触媒によるクリックケミストリー（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ））。適合性のある化学物質を含有する可能な埋め込まれた分子の範囲は当業者により理解されている。
一実施形態では、それぞれ異なる濃度の生体分子を有するヒドロゲル粒子の異なる亜集団が製作されている。さらなる実施形態では、生体分子は、核酸、タンパク質、細胞内イオン、例えば、カルシウム酸（またはユーザーが選ぶ他の生体分子、例えば、カルシウム）である。別の実施形態では、それぞれ異なる濃度の薬物物質を有するヒドロゲル粒子の異なる亜集団が製作されている。一実施形態では、薬物物質は生体分子（すなわち、生物的、抗体、抗体薬物コンジュゲート、タンパク質／酵素、ペプチド、非リボソームペプチド、または関連する分子）または小分子合成薬物（例えば、Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型ポリケチド、生理活性特性を有する非リボソームペプチド、または当業者により一般的に分類されているような他の小分子単位）である。
この関連で、本発明は、細胞がこれらのそれぞれの核酸またはタンパク質含有量に対して着色されるアッセイ分解能を決定するのに特に有用である。一実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子の異なる集団は、公知の、異なる量の細胞内物質、例えば、核酸またはタンパク質が封入されている。個々のヒドロゲル粒子は細胞内物質対して着色され、様々な集団の個々のヒドロゲルに対してサイトメトリーデバイスを介して蛍光が測定される。これにより、細胞内アッセイの感受性およびダイナミックレンジを確立するための検量線の作成が可能となる。一度確立されたら、試料は、サイトメーターを通過させることによって、存在する場合、標的細胞（複数可）を検出し、それぞれの標的細胞（複数可）内の細胞内物質の量を定量化することができる。一実施形態では、埋め込まれた物質は、感染性疾患バイオマーカー、例えば、感染性疾患バイオマーカーデータベース（ＩＤＢＤ、すべての目的のため、その全体が参照により組み込まれている、Yangら（２
００８年）IDBD:Infectious Disease Biomarker Database. Nucleic Acid Res.３
６巻、Ｄ４５５～Ｄ４６０頁を参照されたい）の中の感染性疾患バイオマーカーの１つである。さらなる実施形態では、感染性疾患バイオマーカーは、胃腸感染症、呼吸器感染症、神経系感染症、尿生殖器感染症、ウイルス感染症、出血性発熱、動物原性感染症、アルボウイルス、抗生剤耐性または生物兵器テロのバイオマーカーである。さらなる実施形態では、ウイルス感染症はエボラ感染症である。
一実施形態では、本明細書に提供されている方法を使用して、細胞核酸の定量化アッセイの感受性および／またはダイナミックレンジを決定する。本実施形態では、試料は、試料内の細胞型（存在する場合）、および細胞内の細胞核酸の量について調べる。
別の実施形態では、本発明は、細胞内タンパク質定量化アッセイの分解能および／または感受性を決定するための手段を提供する。一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、公知の量のタンパク質を様々な濃度で封入し、続いて適当なタンパク質抗体で着色する。様々な粒子に対して蛍光を測定することによって、アッセイの感受性および／またはダイナミックレンジを決定する。次いで、蛍光値を試料中の細胞から得た値と比較して、標的細胞が存在するかどうか、および試料が細胞内タンパク質を含有するかどうか、ならびにタンパク質の量を決定することができる。
一実施形態では、循環している腫瘍細胞または母体の血液中に存在する胎児細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学的特性を有するように個々のヒドロゲル粒子を調整する。個々の粒子には、目的の生体分子の既知の量が埋め込まれている。粒子を使用して、特定の細胞型に対して、生体分子検出アッセイ用の検量線を作成する。
上記に提供されている通り、本発明の一態様では、埋め込まれた物質を含むヒドロゲルが提供される。一実施形態では、埋め込まれる物質はビーズまたは複数のビーズである。一実施形態では、ヒドロゲル粒子には単一のビーズが埋め込まれている。別の実施形態では、個々のヒドロゲル、複数のヒドロゲル粒子中に埋め込まれたビーズの平均数は１個である。
一実施形態では、ビーズまたは複数のビーズがヒドロゲル粒子内に埋め込まれる場合、ビーズまたは複数のビーズの光学特性は、フローサイトメトリーアッセイの品質管理のために、ヒドロゲル粒子のＦＳＣおよびＳＳＣ特性と組み合わせて使用される。例えば、一実施形態では、埋め込まれたビーズをコントロールとして使用して、レーザー供給源、光学機器、およびストリーム流を含むフローサイトメーターシステムを較正する。別の実施形態では、埋め込まれたビーズは、試料、例えば、特定の細胞中の蛍光量を定量化するための手段として使用する。この関連で、様々な強度の埋め込まれたビーズを使用して、細胞がある特定のマーカーを発現しているか、およびどの発現レベルで発現しているかを決定するための蛍光検量線を作成することができる。
一実施形態では、約１μｍ～約３μｍ、約２μｍ～約４μｍまたは約３μｍ～約７μｍの直径を有するビーズが本明細書に提供されているヒドロゲル内に埋め込まれる。例えば、一実施形態では、ビーズは約３μｍ～約３．５μｍの直径を有する。さらなる実施形態では、ビーズは蛍光ビーズである。別の実施形態では、ビーズは、約１μｍ～約２．５μｍまたは約１．５μｍ～約３μｍの直径を有する。さらなる実施形態では、ビーズは蛍光ビーズであり、内部またはその表面のいずれかを着色することができる。またさらなる実施形態では、蛍光ビーズは内部が着色されている。理論に制約されることを望むことなく、内部の着色は、蛍光出力を変動させる可能性のある環境相互作用から蛍光体を隔離すると考えられている。
上記に提供されているように、一実施形態では、埋め込まれたビーズは蛍光ビーズであり、さらなる実施形態では、蛍光のビーズは内部が着色されている。埋め込んだビーズと併せて使用するための適当な蛍光体を選択することは当技術分野のスキルの範囲内である。一実施形態では、ビーズは、以下の蛍光色素の１種または複数を用いて誘導体化する：６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシエオシン；５－カルボキシフルオレセイン；６カルボキシフルオレセイン；５－（および－６）－カルボキシフルオレセイン；Ｓ－カルボキシフルオレセイン－ビス－（５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル）エーテル、－アラニン－カルボキサミド、またはスクシンイミジルエステル；５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（４，６－ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン；エオシン－５－イソチオシアネート；エリスロシン５－イソチオシアネート；６－（フルオレセイン－５－カルボキサミド）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；６－（フルオレセイン－５－（および－６）－カルボキサミド）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－Ｓ－ＥＸスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－イソチオシアネート；フルオレセイン－６－イソチオシアネート；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８カルボン酸、またはスクシンイミジルエステル；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８イソチオシアネート；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８－Ｘスクシンイミジルエステル；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００カルボン酸；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００カルボン酸、スクシンイミジルエステルまたはトリエチルアンモニウム塩；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４カルボン酸；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステルまたは塩酸塩；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、トリフルオロアセトアミドまたはスクシンイミジルエステル；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）－Ｘスクシンイミジルエステルまたは塩酸塩；ＲｈｏｄｏｌＧｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、Ｎ，Ｏ－ビス－（トリフルオロアセチル）またはスクシンイミジルエステル；ビス－（４－カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンまたはジ（スクシンイミジルエステル）；５－（および－６）カルボキシナフトフルオレセイン、５－（および－６）カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩；６－カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、５－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；６－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステルまたはビス－（ジイソプロピルエチルアンモニウム）塩；５－カルボキシテトラメチルローダミン；６－カルボキシテトラメチルローダミン；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン；５－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン；５－カルボキシ－Ｘ－ローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－Ｘローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシ－Ｘローダミンスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－Ｘ－ローダミントリエチルアンモニウム塩；Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ塩化スルホニル；マラカイトグリーン；イソチオシアネート；ＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）モノ（スルホスクシンイミジルエステル）；ＱＳＹ（登録商標）２１カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ（登録商標）７カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ（商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；６－（テトラメチルローダミン－５－（および－６）－カルボキサミド）ヘキサン酸；スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン－５－イソチオシアネート
；テトラメチルローダミン－６－イソチオシアネート；テトラメチルローダミン－５－（および－６）－イソチオシアネート；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）スルホニル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）塩化スルホニル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ ＳＴＰエステルまたはナトリウム塩；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；およびＸ－ローダミン－５－（および－６）イソチオシアネート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＢＯＤＩＰＹ（登録商標）染料であり、これらに限定されないがＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－Ｘ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０－Ｘ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５－Ｘ ＳＴＰエステルを含む；６－ジブロモ－４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３，５－ジプロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－ペンタン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－ペンタン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル（dimefhyl）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオン酸；スルホスクシンイミジルエステルまたはナトリウム塩；６－（（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸；６－（（４，４－ジフルオロ－５，７ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；Ｎ－（４，４－ジフルオロ５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）システイン酸、スクシンイミジルエステルまたはトリエチルアンモニウム塩；６－４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－５－（４－メトキシフェニル）－４－ボラ３ａ，４ａ４，４－ジフルオロ－５，７－ジフェニル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジフェニル－４－ボラ３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－フェニル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸；スクシンイミジルエステル；６－（（４，４－ジフルオロ－５－フェニル－４ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（４－フェニル－１，３ブタジエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（２－ピロリル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；６－（（（４，４－ジフルオロ－５－（２－ピロリル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－スチリル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５－スチリル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸；スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－１，３，５，７－テトラメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－ｓ－インダセン－８－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－１，３，５，７－テトラメチル－４ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－８－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；６－（（（４－（４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａジアザｓ－インダセン－３－イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；および６－（（（４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ
－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ染料、これらに限定されないが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０カルボン酸；およびＡｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０カルボン酸を含む、Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから市販されているシアニン染料、これらに限定されないが、Ｃｙ３ ＮＨＳエステル；Ｃｙ５ ＮＨＳエステル；Ｃｙ５．５ ＮＨＳエステル；およびＣｙ７ ＮＨＳエステルを含む。
本発明と共に使用するのに適している他の蛍光体は、以下の表２に提供されている。
Figure 0007499376000002
Figure 0007499376000003
Figure 0007499376000004
Figure 0007499376000005
Figure 0007499376000006
Figure 0007499376000007
Figure 0007499376000008
Figure 0007499376000009
Figure 0007499376000010
Figure 0007499376000011
Figure 0007499376000012
Figure 0007499376000013
Figure 0007499376000014
Figure 0007499376000015
これらに限定されないが、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｓｐｅｒｈｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．および同等の
供給元により販売されているものを含めた市販のビーズを、本明細書に記載されているヒドロゲル粒子と組み合わせて使用することができる。アッセイに応じて、適切なビーズ直径、蛍光発光および／または励起スペクトルおよび／または蛍光強度を有するビーズを選択することは当技術分野の普通のスキルの範囲内である。例えば、青色、赤色またはＵＶレーザーと併せて使用する品質管理ビーズは、本明細書に提供されている１つまたは複数ヒドロゲル粒子に埋め込むことができる。例えば、青色レーザー（カタログ番号Ａ－１６５００（２．５μｍ）、Ａ－１６５０３（６．０μｍ））、赤色レーザー（カタログ番号Ａ－１６５０１（２．５μｍ）、Ａ－１６５０４（６．０μｍ））またはＵＶレーザー（カタログ番号Ａ－１６５０２（２．５μｍ）、Ａ－１６５０５（６．０μｍ））に対するＡｌｉｇｎｆｌｏｗ（商標）フローサイトメトリーアライメントビーズを、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子の１つまたは複数に埋め込むことができる。
一実施形態では、３６５ｎｍ～６５０ｎｍの任意の波長で励起することができる蛍光ビーズをヒドロゲル粒子に埋め込む。一実施形態では、ビーズは、例えば、４つの蛍光体、５つの蛍光体、６つの蛍光体、７つの蛍光体または８つの蛍光体など、蛍光体の混合物を含有する「虹色粒子」である。この関連で、ユーザーは、調べる蛍光体に応じて、粒子を励起させる波長を選択する。虹色粒子は、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号５５６２９８（ミッドレンジＦＬ１ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、５５６２８６（６色、３．０～３．４μｍ）、５５６２８８（６色、６．０～６．４μｍ）、５５９１２３（８色））およびＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ（例えば、カタログ番号ＲＣＰ２０－５（４色）、ＲＣＰ－３０－５（６ピーク）、ＲＣＰ－３０－５Ａ（８ピーク）から様々な直径で市販されている。
セルソーティングセットアップビーズを、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子の１つまたは複数に埋め込むことができる。一実施形態では、セルソーティングセットアップビーズは、生物学的試料のサイズ、発光波長、および強度に近似させ、レーザー供給源、光学系、およびストリーム流を含めた、フローサイトメーターのセルソーティングシステムを較正するために使用することができる。一実施形態では、セルソーティングセットアップビーズを１つまたは複数のヒドロゲル粒子に埋め込むが、これは、ＵＶ、青色、緑色／黄色または赤色レーザーでの使用に適している。緑色レーザーが使用される場合、一実施形態では、埋め込まれたビーズは５７５ｎｍの発光で、５７０ｎｍで励起するが、また４８８ｎｍにおいても励起し得る。市販のセルソーティングセットアップビーズは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である（カタログ番号Ｃ－１６５０６（ＵＶレーザー）、Ｃ－１６５０８（青色レーザー）、Ｃ－１６５０９（緑色－黄色レーザー）、Ｃ－１６５０７（赤色レーザー））。
補正コントロールビーズを本明細書に提供されているヒドロゲル粒子の１つまたは複数に埋め込むこともできる。正確な補正は、フローサイトメトリーにおける有効なマルチカラー分析に対する重要なパラメーターである。しかし、細胞ベースの補正コントロールは、多くの抗原が高度に発現されず、かすかに着色された細胞は不正確な補正環境をもたらす可能性があるので、完全に有効ではない。
一実施形態では、補正コントロールビーズは、蛍光抗体コンジュゲート捕捉能力（ポジティブ補正ビーズ）を含むか、または不活性である（ネガティブ補正ビーズ）。補正ビーズは、蛍光体とコンジュゲートしたヒト、マウス、ラット、ハムスター、またはウサギ抗体と混合されている。これら２つの構成成分は、適当なネガティブ集団と共に、明確な高シグナルのポジティブコントロールを提供し、次いで、これは実際の実験における細胞の強度に関わらず、補正を適切に設定するために使用することができる。抗体は一度ビーズと混合されると、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子の１つまたは複数に埋め込まれる。市販の補正ビーズは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番
号Ａ－１０３４４、Ａ－１０３８９、Ａ１０４９７、Ａ１０５１３）およびＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号ＣＭＩｇ－Ｐ－０８－２Ｋ、ＣＭＩｇ－Ｐ－３０－２Ｋ、ＣＭＩｇ－Ｐ－５０－３Ｋ、ＣＭＩｇ－Ｐ－７０－３Ｋ）から入手可能である。
一実施形態では、ビーズが埋め込まれた／封入されたヒドロゲル粒子は、細胞アッセイ、例えば、ファゴサイトーシスアッセイ細胞毒性アッセイ、運動性アッセイ、生存率アッセイなどに対する基準として使用される。ファゴサイトーシスは、細胞が固体粒子を巻き込んで、ファゴソームとして公知の内小胞を形成するプロセスである。この関連で、ヒドロゲル粒子は、食細胞が粒子を巻き込む前および後に、食細胞と実質的に同様の１種または複数の光学特性を有するように調整することができる。したがって、一実施形態では、本明細書に提供されているヒドロゲル粒子は、ファゴサイトーシスアッセイに対するコントロール粒子として使用される。さらなる実施形態では、（ｉ）ヒドロゲル粒子の光学特性の１種または複数は粒子の取り込み前の食細胞と実質的に同様であり、（ｉｉ）第２のヒドロゲル粒子の光学特性の１種または複数は粒子の取り込み後の食細胞と実質的に同様である。この関連で、食細胞による粒子の取り込みを測定するために、コントロールが生成される。
一実施形態では、食細胞は専門食細胞である。別の実施形態では、食細胞は非専門食細胞（すなわち、死んでゆく細胞および外来生物を消費する細胞）である。さらなる実施形態では、非専門食細胞は上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞または間葉細胞である。一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、以下の表３に示された専門食細胞と実質的に同様の１種または複数の光学特性を有するように調整する（粒子の取り込み前および／または後）。
Figure 0007499376000016
一実施形態では、核酸またはビーズなどの物質を埋め込んだ本発明の複数のヒドロゲル粒子を、ゲノムの細胞数測定アッセイに対するコントロール試薬として使用する。この関連で、特定の染色体、ＲＮＡ配列および／またはＤＮＡ配列の特定数のコピーを、埋め込
んだ物質により模倣することができる。よって、ヒドロゲル粒子は、遺伝情報、例えば、染色体のコピー数、ＲＮＡ配列のコピー数および／またはＲＮＡ配列のコピー数などについて調査している試料に対するコントロールとして使用することができる。
フローサイトメトリーに対するデコンボリューションの３つの主要モードは、粒子の２種の受動的光学特性（屈折率に対応する前方散乱、ＦＳＣ、またはＲＩ、および側方散乱、ＳＳＣ）および所与の細胞型の表面上に存在するバイオマーカーである。したがって、本開示のヒドロゲル粒子がこれら３つのモードに関して特定の細胞型を模倣することを可能にする組成物は、フローサイトメトリーに対して、合成による、強力な検量体を提供するのに有用である。
一実施形態では、開示されたヒドロゲル粒子の屈折率（ＲＩ）は、約１．１０超、約１．１５超、約１．２０超、約１．２５超、約１．３０超、約１．３５超、約１．４０超、約１．４５超、約１．５０超、約１．５５超、約１．６０超、約１．６５超、約１．７０超、約１．７５超、約１．８０超、約１．８５超、約１．９０超、約１．９５超、約２．００超、約２．１０超、約２．２０超、約２．３０超、約２．４０超、約２．５０超、約２．６０超、約２．７０超、約２．８０超、または約２．９０超である。
別の実施形態では、開示されたヒドロゲル粒子の屈折率（ＲＩ）は、約１．１０～約３．０、または約１．１５～約３．０、または約１．２０～約３．０、または約１．２５～約３．０、または約１．３０～約３．０、または約１．３５～約３．０、または約１．４～約３．０、または約１．４５～約３．０、または約１．５０～約３．０、または約１．６～約３．０、または約１．７～約３．０、または約１．８～約３．０、または約１．９～約３．０、または約２．０～約３．０である。
一部の実施形態では、開示されたヒドロゲル粒子の屈折率（ＲＩ）は、約１．１０未満、約１．１５未満、約１．２０未満、約１．２５未満、約１．３０未満、約１．３５未満、約１．４０未満、約１．４５未満、約１．５０未満、約１．５５未満、約１．６０未満、約１．６５未満、約１．７０未満、約１．７５未満、約１．８０未満、約１．８５未満、約１．９０未満、約１．９５未満、約２．００未満、約２．１０未満、約２．２０未満、約２．３０未満、約２．４０未満、約２．５０未満、約２．６０未満、約２．７０未満、約２．８０未満、または約２．９０未満である。
開示されたヒドロゲル粒子のＳＳＣは、標的細胞のものと比較して最も有意義に測定される。一部の実施形態では、開示されたヒドロゲル粒子は、サイトメトリーデバイスで測定した場合、標的細胞のＳＳＣの３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１％以内のＳＳＣを有する。
一実施形態では、ヒドロゲル粒子のＳＳＣは、ヒドロゲル中に高屈折率分子（またはその複数）を組み込むことによってモジュレートされる。一実施形態では、高屈折率分子はヒドロゲル粒子中に提供され、さらなる実施形態では、高屈折率分子はコロイドシリカ、アクリル酸アルキル、メタクリル酸アルキルまたはこれらの組合せである。したがって一部の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子は、アクリル酸アルキルおよび／またはメタクリル酸アルキルを含む。一実施形態ではモノマー濃度を調節し、ヒドロゲル粒子の屈折率をさらに調節する。
アクリル酸アルキルまたはメタクリル酸アルキルは、アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチルまたはｔｅｒｔブチル、２－エチルヘキシル、ヘプチルまたはオクチル基などに１～１８個、１～８個、または２～８個の炭素原子を含有することができる。アルキル基は分枝または直鎖であってよい。
高屈折率分子はまた、芳香族環上でアルキル基、例えば、メチル、エチルもしくはｔｅｒｔ－ブチルなどで、またはハロゲン、例えば、クロロスチレンなどで、任意選択で置換されているビニルアレーン、例えば、スチレンおよびメチルスチレンなどを含むことができる。
一部の実施形態では、ＦＳＣは、組成物中に存在するモノマーのパーセントを調節し、これによって、ヒドロゲル形成中に存在する含水量を変化させることによってモジュレートする。一実施形態では、モノマーおよびコモノマーが利用された場合、モノマーとコモノマーとの比を調節して、ヒドロゲル粒子の前方散乱特性を変更する。これは、図１１と図１２の両方に示されている。
開示されたヒドロゲル粒子のＦＳＣは、標的細胞のものと比較して最も有意義に測定される。一部の実施形態では、開示されたヒドロゲル粒子は、サイトメトリーデバイスで測定した場合、標的細胞のＦＳＣの３０％以内、２５％以内、２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１％以内のＦＳＣを有する。
ＦＳＣは粒子容積に関係しており、したがって、本明細書中に記載されているように粒子直径を変化させることによってモジュレートすることができる。一般的に、大きな対象は、小さな対象より多くの光を屈折させて、高い前方散乱シグナルをもたらすことが観察されている（および逆もまた同様である）。したがって、一実施形態では、粒子直径を変化させて、ヒドロゲル粒子のＦＳＣ特性をモジュレートする。例えば、一実施形態においてヒドロゲル粒子直径を増加させ、粒子形成中により大きな微小流体の流路を利用することによって変化させる。
ＳＳＣは、ヒドロゲル内にナノ粒子を封入することによって、標的細胞内の細胞器官を模倣するように操作することができる。一部の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ナノ粒子、ポリスチレン（ＰＳ）ナノ粒子、およびシリカナノ粒子からなる群から選択される、ナノ粒子の１つまたは複数のタイプを含む。また、様々な濃度のナノ粒子の添加が、粒子の側方散乱の調節を可能にすることを示している図１１および１２を参照されたい。理論に制約されることを望むことなく、本明細書中に記載されているようなヒドロゲルの前方散乱と側方散乱の両方を選択的に調整する能力は、極めて多数の細胞型を模倣する強力なプラットフォームを可能にする。
本発明は光学特性の修飾に関して主に記載しているが、本発明はこれに限定されない。例えば、ヒドロゲル粒子は、例えば、コールターカウンターを較正するために、粒子の容量を調整するよう製作および調節することができる。一実施形態では、組成物中のヒドロゲルモノマーの量を変化させることによって、ヒドロゲル粒子の容量を調節する。例えば、ポリアナリン、ポリアセチレン；ポリフェニレンビニレン；ポリピロール（Ｘ＝ＮＨ）およびポリチオフェン（Ｘ＝Ｓ）コモノマー；ならびにポリアニリン（Ｘ＝ＮＨ／Ｎ）およびポリフェニレンスルフィド（Ｘ＝Ｓ）コモノマーの濃度はすべて、容量を変化させるために調節することができる。一実施形態では、これらのモノマーの１つまたは複数の濃度を増加させて、ヒドロゲル粒子の容量を増加させる。
一部の実施形態では、本開示のヒドロゲル粒子は、材料の弾性率特性（例えば、弾性）が、同じ直径のポリスチレンビーズと比較して、標的細胞の弾性率特性とより密接に類似している。
ヒドロゲル粒子が形成された後、粒子の表面の１つまたは複数を官能化させて、例えば、標的細胞または標識した標的細胞の１種または複数の光学特性を模倣することができる
。官能化したヒドロゲル粒子はまた、前述のような埋め込んだビーズまたは生体分子などの物質を含むこともできる。一実施形態では、１つまたは複数のヒドロゲル粒子は、１つもしくは複数の蛍光色素、１つもしくは複数の細胞表面マーカー（またはそのエピトープ結合領域）、またはこれらの組合せで官能化する。一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、少なくとも１種の二官能性モノマーを重合することによって形成され、形成後、ヒドロゲル粒子は、細胞表面マーカーのさらなる結合、細胞表面マーカーのエピトープ結合領域、蛍光色素、またはこれらの組合せのために使用することができる１つまたは複数の官能基を含む。一実施形態では、遊離官能基はアミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基またはこれらの組合せである。所望の官能化に応じて、例えば、異なる化学物質を使用して、および異なる分子を用いて、粒子を官能化するために複数の二官能性モノマーを使用することができることを理解されたい。
ヒドロゲル粒子は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれている、The MolecularProbes（登録商標）Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesに列挙された蛍光色素を含めた、当技術分野で公知の
任意の蛍光色素で官能化することができる。官能化は、遊離アミン基を含む化合物、例えば、アリルアミンで媒介することができ、この化合物は、上で論じたように、ヒドロゲルを形成するために使用される二官能性モノマーに組み込むことができる。
本明細書に記載されているヒドロゲル粒子の表面を官能化するために使用することができる公知の蛍光色素の非限定的例として、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシエオシン；５－カルボキシフルオレセイン；６カルボキシフルオレセイン；５－（および－６）－カルボキシフルオレセイン；Ｓ－カルボキシフルオレセイン－ビス－（５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル）エーテル、－アラニン－カルボキサミド、またはスクシンイミジルエステル；５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（４，６－ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン；エオシン－５－イソチオシアネート；エリスロシン５－イソチオシアネート；６－（フルオレセイン－５－カルボキサミド）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；６－（フルオレセイン－５－（および－６）－カルボキサミド）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－Ｓ－ＥＸスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－イソチオシアネート；フルオレセイン－６－イソチオシアネート；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８カルボン酸、またはスクシンイミジルエステル；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８イソチオシアネート；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８－Ｘスクシンイミジルエステル；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００カルボン酸；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５００カルボン酸、スクシンイミジルエステルまたはトリエチルアンモニウム塩；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４カルボン酸；Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）５１４カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステルまたは塩酸塩；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、トリフルオロアセトアミドまたはスクシンイミジルエステル；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）－Ｘスクシンイミジルエステルまたは塩酸塩；ＲｈｏｄｏｌＧｒｅｅｎ（商標）カルボン酸、Ｎ，Ｏ－ビス－（トリフルオロアセチル）またはスクシンイミジルエステル；ビス－（４－カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンまたはジ（スクシンイミジルエステル）；５－（および－６）カルボキシナフトフルオレセイン、５－（および－６）カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩；６－カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、５－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；６－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；５－（
および－６）－カルボキシローダミン６Ｇスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステルまたはビス－（ジイソプロピルエチルアンモニウム）塩；５－カルボキシテトラメチルローダミン；６－カルボキシテトラメチルローダミン；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン；５－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン；５－カルボキシ－Ｘ－ローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－Ｘローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシ－Ｘローダミンスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－Ｘ－ローダミントリエチルアンモニウム塩；Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ塩化スルホニル；マラカイトグリーン；イソチオシアネート；ＮＡＮＯＧＯＬＤ（登録商標）モノ（スルホスクシンイミジルエステル）；ＱＳＹ（登録商標）２１カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ（登録商標）７カルボン酸またはスクシンイミジルエステル；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
Ｒｅｄ（商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；６－（テトラメチルローダミン－５－（および－６）－カルボキサミド）ヘキサン酸；スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン－５－イソチオシアネート；テトラメチルローダミン－６－イソチオシアネート；テトラメチルローダミン－５－（および－６）－イソチオシアネート；Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄ（登録商標）スルホニル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）塩化スルホニル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－ＸＳＴＰエステルまたはナトリウム塩；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘスクシンイミジルエステル；およびＸ－ローダミン－５－（および－６）イソチオシアネートが挙げられる。
本明細書に記載されているヒドロゲル粒子と共に使用するための蛍光色素の他の例として、これらに限定されないが、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ－Ｘ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０－Ｘ ＳＴＰエステル；ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５－Ｘ ＳＴＰエステルを含むＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているＢＯＤＩＰＹ（登録商標）染料；６－ジブロモ－４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３，５－ジプロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－ペンタン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－ペンタン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオン酸；スルホスクシンイミジルエステルまたはナトリウム塩；６－（（４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸；６－（（４，４－ジフルオロ－５，７ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；Ｎ－（４，４－ジフルオロ５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）システイン酸、スクシンイミジルエステルまたはトリエチルアンモニウム塩；６－４，４－ジフルオロ－１，３－ジメチル－５－（４－メトキシフェニル）－４－ボラ３ａ，４ａ４，４－ジフルオロ－５，７－ジフェニル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５，７－ジフェニル－４－ボラ３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－フェニル－４－ボラ－３ａ
，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸；スクシンイミジルエステル；６－（（４，４－ジフルオロ－５－フェニル－４ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（４－フェニル－１，３ブタジエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（２－ピロリル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；６－（（（４，４－ジフルオロ－５－（２－ピロリル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－スチリル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－５－スチリル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸；スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－１，３，５，７－テトラメチル－４－ボラ－３ａ，４ａジアザ－ｓ－インダセン－８－プロピオン酸；４，４－ジフルオロ－１，３，５，７－テトラメチル－４ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－８－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓインダセン－３－プロピオン酸スクシンイミジルエステル；６－（（（４－（４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａジアザｓ－インダセン－３－イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサン酸またはスクシンイミジルエステル；および６－（（（４，４－ジフルオロ－５－（２－チエニル）－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキサン酸またはスクシンイミジルエステルを含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、１つまたは複数のヒドロゲル粒子の表面の誘導体化のための蛍光色素として、これに限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販のＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ染料が挙げられ、これは、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８カルボン酸；Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０カルボン酸；およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０カルボン酸を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に記載されているヒドロゲル粒子および方法と共に使用するための蛍光色素として、Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから市販のシアニン染料が挙げられ、これは、Ｃｙ３ ＮＨＳエステル；Ｃｙ５ ＮＨＳエステル；Ｃｙ５．５ ＮＨＳエステル；およびＣｙ７ ＮＨＳエステルを含むが、これらに限定されない。
ヒドロゲル粒子の所望のスペクトル励起および発光特性に基づき、適切な染料（複数可）を選択するのは当技術分野の普通のスキルの範囲内である。
一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、１種もしくは複数の細胞表面マーカー（例えば、表４および７～８を参照されたい）、またはその断片、例えば、膜貫通タンパク質の場合にはその細胞外部分を用いて、例えば、ヒドロゲル粒子の表面上に存在する遊離アミン、遊離カルボキシルおよび／または遊離ヒドロキシル基を介して、１種または複数の細胞表面マーカー、細胞外部分またはそのリガンド結合領域を粒子に結合させることによって官能化する。染料または細胞表面分子でのヒドロゲル粒子の官能化はまた、リンカー、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンコンジュゲートを介しても生じ得る。
標的細胞に応じて、個々のヒドロゲル粒子を、１種もしくは複数の細胞表面マーカー、またはその断片、例えば、膜貫通タンパク質の場合にはその細胞外部分を用いて誘導体化することによって、標的細胞の構造的特性をさらに模倣することができる。以下に提供されている表４および７～８は、標的細胞に応じて、ヒドロゲル粒子を誘導体化するために使用することができる細胞表面マーカーの非限定的なリストを記載している。細胞表面マーカーが提供されているが、細胞表面マーカーの一部分、例えば、マーカーの受容体結合部分、リガンド結合部分、または細胞外部分を使用して、ヒドロゲル粒子を誘導体化することができる（前述のように遊離官能基において）ことは理解されている。例えば、細胞表面受容体を用いたヒドロゲル表面の修飾が、ＦＳＣおよび／またはＳＳＣの選択的調整と一緒に、所望の特徴（複数可）を有するヒドロゲル粒子の製作を可能にすることを示している図１１および１２も参照されたい。
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細胞型として、これらに限定されないが、様々な細胞株、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ－２９３、ＢＨＫ－２１、ＮＳ０、ＭＤＣＫ、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ－Ｓ、Ｗ１－３８およびＳｐ２／０マウス骨髄腫（ハイブリドーマ）などが挙げられる。表５および表６はそれぞれ、本明細書に記載されているヒドロゲル粒子と共に使用するための他の細胞型を提供する。
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一実施形態では、複数のヒドロゲル粒子を使用して、標的細胞の集団上の特定の細胞表面マーカーまたはこれらの組合せのダイナミックレンジおよび／または検出の感受性を決定する。例えば、ヒドロゲル粒子の集団は、標的細胞のＳＳＣおよび／またはＦＳＣプロファイルを有するように調整することができ、ヒドロゲル粒子の亜集団は、特定のコピー数の細胞表面マーカー、例えば、細胞表面受容体、またはそのドメイン、例えば、そのエピトープ結合領域で誘導体化する。例えば、ヒドロゲル粒子の個々の亜集団は、独特なコピー数を有するようにそれぞれ誘導体化することができ、例えば、１つの亜集団は細胞表面マーカーの１００コピーを含有し、第２の亜集団は同じ細胞表面マーカーの１，０００コピーを含有し、第３の亜集団は同じ細胞表面マーカーの１０，０００コピーを含有する。ヒドロゲル粒子の集団はそれぞれの細胞表面マーカーに対して蛍光着色され、蛍光は各亜集団内のヒドロゲル粒子に対して検出される。この関連で、ヒドロゲル粒子の亜集団を使用して、それぞれの細胞マーカーを用いて、標的細胞に対する蛍光発光の検量線を作成することができる。細胞表面マーカーは、本明細書に提供された細胞表面マーカーもしくはその結合領域、または当業者に公知の細胞表面マーカーのいずれであってもよい。
本開示のヒドロゲル粒子は、着色およびフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによる分析などの手順において、標的細胞と同様に挙動する。例えば、一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、表１、表２または表３に示された細胞型の１つと実質的に同様の１種または複数の光学特性を有する。
一部の実施形態では、標的細胞は免疫細胞である。免疫細胞の非限定的例として、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤性（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含めた、遺伝子修飾された免疫細胞、薬物修飾された免疫細胞、および本明細書で列挙された細胞型のいずれかの誘導体、先駆体または前駆体が挙げられる。
一部の実施形態では、標的細胞は、共有された特性を有する特定のクラスの細胞のすべての細胞を包含する。例えば、標的細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含むリンパ球であることができる。標的細胞は活性化したリンパ球であることができる。
一部の実施形態では、標的細胞は初代細胞、培養細胞、樹立細胞、正常細胞、形質転換細胞、感染細胞、安定的にトランスフェクトされた細胞、一時的にトランスフェクトされた細胞、増殖性細胞、または最終的に分化した細胞である。
一実施形態では、標的細胞は初代ニューロン細胞である。様々なニューロンが標的細胞となり得る。非限定的な例として、標的細胞は、初代ニューロン；樹立ニューロン；形質転換ニューロン；安定的にトランスフェクトされたニューロン；または運動もしくは感覚ニューロンであることができる。
他の実施形態では、標的細胞は、初代リンパ球、単球、および顆粒球からなる群から選択される。
標的細胞は、原核および真核細胞を含めた、実質的にあらゆるタイプの細胞であることができる。
適切な原核標的細胞として、これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、各種Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、および好極限性細菌、例えば、好熱菌などの細菌が挙げられる。
適切な真核標的細胞として、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａの種を含めた、酵母および糸状菌などの真菌；トウモロコシ、ソルガム、タバコ、アブラナ、ダイズ、コットン、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、ヒマワリなどの細胞を含む植物細胞；ならびに魚、鳥および哺乳動物を含む動物細胞が挙げられる。適切な魚細胞として、これらに限定されないが、サケ、マス、ティラピア、マグロ、コイ、ヒラメ、ハリバット、メカジキ、タラおよびゼブラフィッシュの種由来のものが挙げられる。適切な鳥細胞として、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジおよびシチメンチョウ、および他の野鶏または猟鳥のものが挙げられる。適切な哺乳動物細胞として、これらに限定されないが、ウマ、雌ウシ、バッファロー、シカ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなど、ヤギ、ブタ、霊長類、イルカおよびクジラを含む海洋性哺乳動物由来の細胞、ならびに細胞株、例えば、任意の組織または幹細胞型の、および、多能性および非多能性を含む幹細胞のヒト細胞株、ならびにヒト以外の受精卵が挙げられる。
また適切な細胞には、多種多様な疾患状態に関わる細胞型が含まれ、罹患していない状態の細胞型さえも含まれる。したがって、適切な真核細胞型として、これらに限定されないが、すべての型の腫瘍細胞（例えば、黒色腫、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣の癌腫）、心筋細胞、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管系内膜細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、赤血球、肝細胞、単核白血球を含む白血球、幹細胞、例えば、造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞など（分化および脱分化因子に対するスクリーニングでの使用のため）、破骨細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラニン形成細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、および含脂肪細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は原発性疾患状態の細胞、例えば、原発性腫瘍細胞などである。適切な細胞としてまた、これらに限定されないが、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳなどを含めた公知の研究細胞も挙げられる。ここに参照により明示的に組み込まれているATCC cell line catalogを参照されたい。
一部の実施形態では、標的細胞は腫瘍マイクロベシクルまたは腫瘍マクロベシクルである。腫瘍により分泌されたマイクロベシクルまたは腫瘍により分泌されたエクソソームとしても公知の腫瘍マイクロベシクルは循環血液中に見出すことができ、免疫抑制活性を有し得る。腫瘍マイクロベシクルは、典型的には、直径３０～２００ｎｍのサイズの範囲である。より大きな腫瘍マイクロベシクルは、腫瘍マクロベシクルと呼ぶことができ、直径３～１０μｍのサイズの範囲であることができる。
本明細書に記載されているヒドロゲル粒子は、当業者に公知の任意のフローサイトメーターで利用することができる。例えば、以下の表９に提供されているフローサイトメーターの１種または複数は、本明細書に記載されているヒドロゲルおよびアッセイと共に使用するのに適している。
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本発明は以下の実施例を参照してさらに例示される。しかし、これらの実施例は、上に記載されている実施形態のように例示的であり、本発明の範囲を制限するものと決して解釈されるものではないことに注意すべきである。
（実施例１）
ヒドロゲル粒子の生成
ＵＶリソグラフィー用フォトマスクはＣＡＤａｒｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．から供給され、ＡｕｔｏＣａｄ（ＡｕｔｏＤｅｓｋ，Ｉｎｃ．）を使用して設計された。平行ＵＶ光源（ＯＡＩ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＳＵ－８フォトレジスト（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）を４”ケイ素ウエハー上にフォトクロスリンクすることによって、微小流体デバイス製作のためのマスターを作り出した。ソフトリソグラフィーおよび微小流体デバイス製作に対して公開された標準的な方法を使用して、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）を調製および形成した（McDonald JCら、２０００年、Electrophoresis、２１巻：２７～４０頁を参照されたい）。
油中水型乳濁液中の液滴を壊すように、２つの油流路が水性モノマー溶液の中心ストリームを集束する流れ集束幾何形状を使用して液滴が形成された。液滴形成のために、フルオロカーボン油（Ｎｏｖｅｃ ７５００ ３Ｍ，Ｉｎｃ．）を外側の、連続相液体として使用した。重合前に液滴を安定化させるため、界面活性剤を油相に０．５％ｗ／ｗで加えた（Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＨ、Ｄｕｐｏｎｔのカルボン酸アンモニウム塩）。塩基性ポリアクリルアミドゲル粒子を作製するために、Ｎ－アクリルアミド（１～２０％ｗ／ｖ）、クロスリンカー（Ｎ，Ｎ’－ビスアクリルアミド、０．０５～１％ｗ／ｖ）、促進剤、および過硫酸アンモニウム（１％ｗ／ｖ）を含有する水性モノマー溶液の中心相を使用した。液滴形成後、ヒドロゲル粒子重合を引き起こすため、促進剤（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミン（２％容量％）を油相に加えた。
いくつかのコモノマーを塩基性ゲル配合物に加えて、官能性を加えた。アリル－アミンは、ゲル形成後の第２次標識のために、第一級アミン基を提供した。コモノマー、アリルアクリレートおよびアリルメタクリレートを加えて、ゲルの屈折率を調節することによって、前方散乱をモジュレートした。重合前、シリカナノ粒子および／またはＰＭＭＡ（ポリ（メチルメタクリレート））粒子（約１００ｎｍ）のコロイド懸濁液を中心水相に加えることによって液滴の側方散乱を調整した。
第２次標識のために、化学的に直交の側基を含有するコモノマー（アミン、カルボキシル、マレイミド、エポキシド、アルキンなど）を利用することによって、ヒドロゲル粒子の化学量論的多重化を達成した。
液滴を５ｋＨｚの平均速度で形成し、フルオロカーボン油相内で収集した。５０℃で、３０分間の重合を完了し、生成したヒドロゲル粒子を油から水溶液へと洗浄した。
（実施例２）
１２ １１ｍヒドロゲル粒子の生成および視覚化
５％アクリルアミド、０．２５％ビスアクリルアミド、０．０５％アリルアミン、および０．１％過硫酸アンモニウムを含有する水を中心流路に流し、１０ミクロンノズルを介して０．１％ＴＥＭＥＤを含有する油で集束し、図３Ａに示されているような１０μｍヒドロゲル粒子を生成した。重合後、図３Ｂに示されているように粒子を水中で洗浄し、目的の染料にコンジュゲートした。図３Ｃに示されているように、蛍光ヒドロゲル粒子を蛍光顕微鏡法で視覚化した。
（実施例３）
ヒドロゲル粒子光学特性の多次元調整
図４に描かれているように、ポリスチレンビーズとは異なり、ヒドロゲル粒子は、特定の細胞型と一致させるよう複数の寸法で調整する。光学的パラメーター、例えば、ＦＳＣとＳＳＣ（図４Ａ）の組合せまたは第２次マーカーを使用して、細胞をデコンボルブする。サイズ（ＦＳＣ）および側方散乱が限定されたポリスチレンビーズ（褐色）とは異なり、ヒドロゲル粒子は、特定の細胞型のＳＳＣおよびＦＳＣと一致させるように調整する（図４Ｂ）。ヒドロゲル粒子は、特定の化学的側基と、第２次標識との化学量論的に調整された比でさらに官能化することで、固定された細胞株が受けるような生物学的ノイズを受けることなく細胞型との正確なマッチングが可能となる（図４Ｃ）。
（実施例４）
ヒドロゲル粒子直径の関数としてのフローサイトメーターの遅延時間
図５に示されているように、フローサイトメーターに対する液滴間の遅延は、ヒドロゲル粒子直径とはっきり相関し得る。データは、７０および１００μｍノズルサイズのフローサイトメーターを使用して、直径３、６、１０、３２、および５０μｍのヒドロゲル粒子に対して示されている。
（実施例５）
ＤＮＡを封入したヒドロゲル粒子と細胞との比較
ＤＮＡを封入したヒドロゲル粒子を形成するために、４０μｇ／ｍＬ～１０００）μｇ／ｍＬの再構成した子牛胸腺ＤＮＡを２０％の１９：１（アクリルアミド：ビス－アクリルアミド）および０．１％アリルアミンを水中に含有するポリマーミックスに加えた。０．４％過硫酸アンモニウムを液滴形成前にミックスに加えた。実施例１に記載されているようにヒドロゲル粒子が形成された。２００μｇ／ｍＬの子牛胸腺ＤＮＡが封入されたヒドロゲル粒子は、商業用のイメージングサイトメーターを使用して視覚化した場合、ヨウ化プロピジウムを使用して細胞のような着色性を示し、同じ手順を使用して着色したチャ
イニーズハムスター卵巣細胞と比較した。画像は、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）を使用して得た（図６）。
口腔内頬側スワブから得た細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ヨウ化プロピジウムで着色した。並行して、一連のＤＮＡ濃度を含有するヒドロゲル粒子集団も同じ方式で着色した。細胞と粒子懸濁液の両方をフローサイトメーター（４８８／５９０ｎｍ励起／発光）で分析した。頬部細胞および同じ範囲の封入されたＤＮＡ粒子のフローサイトメトリー分析は、粒子が一連の細胞様蛍光特性を示すことを示した（図７、左パネル）。着色性の強度は、フローサイトメトリーで測定したメジアン強度と直線的相関関係を示している（図７、右パネル）。
（実施例６）
ヒドロゲル粒子側方散乱の調整
コロイドシリカを、ポリマーミックスの水性画分に対して１２．５％、６．２５％、３．１２５％および０％で加え、実施例１に記載されているようにヒドロゲル粒子を形成した。フローサイトメーターを使用して、前方および側方散乱データを得た。結果は、封入されたナノ粒子のパーセントが高くなるにつれて側方散乱シグナル（図８、左パネル）が増加し、前方散乱（図８、右パネル）は一般的に変化しないままであったことを示し、側方散乱および前方散乱の独立した調整を実証した。
（実施例７）
ヒドロゲル粒子前方散乱の調整
この実験では、ヒドロゲル組成物中のアクリルアミド：ビス－アクリルアミドのパーセントを１０～４０％の間で変化させて、フローサイトメーターにおいて前方散乱により測定されるヒドロゲル粒子の屈折率を調整した。図９に示されているように、アクリルアミド：ビスアクリルアミドのパーセントが水の比として増加するにつれて、前方散乱は増加した。
（実施例８）
ヒドロゲル粒子の光学特性の調整
ヒドロゲル粒子を、所望の細胞サブタイプの光学特性と一致させるために調整する例。コモノマー／モノマーをナノ粒子と組み合わせて、フローサイトメーターの受動的光学的測定を使用して、ヒドロゲルの前方散乱と側方散乱の両特性を調整することができる。これらの特性を化学的に不安定なコモノマー（例えばアリルアミン、アクリル酸）と組み合わせることによって、（所望する場合）散乱特性に加えて、細胞亜集団の着色性を一致させるために追加の蛍光体／タンパク質／生物学的側基を加え、標識することができる。これらは、フローサイトメトリーを使用して細胞が特定される３つの主要な計量である。追加の側基、例えば、重金属を含有するものなどを、例えば、Ｃｙ－ＴＯＦ（細胞数測定、フライト質量分析の時間）較正に対して使用することができる。最後に、生体適合性材料を封入して、細胞内の細胞器官着色性を模倣することができる。
（実施例９）
ヒドロゲル粒子の光学特性の調整
５０ｎｍナノ粒子コロイドの懸濁液をヒドロゲルマトリクスに組み込んで、リンパ球および単球の光学特性を模倣した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。懸濁液のパーセント組成を変化させて、血液試料コントロール（Ｓｔｒｅｃｋ）からの血液細胞亜集団と一致させた（図１３Ｃ）。
具体的には、血液細胞亜集団と一致させるために、ヒドロゲル粒子のアクリルアミドモノマー（０．７～０．８Ｍ）の濃度を調節して、粒子の前方散乱を増加させた。前方散乱
に影響を及ぼす（１～５％）ように、ビスアクリルアミドクロスリンカーのパーセントを変更することもできる。シリカナノ粒子を組成物中５％または１０％で使用して、側方散乱を調節した。この実験の結果は図１３に示されている。
本出願全体にわたり引用されているすべての文献、特許、特許出願、刊行物、製品の記載、およびプロトコールは、すべての目的のため、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれている。
本明細書で例示されおよび論じられた実施形態は、本発明を作製および使用するために、本発明者らに公知の最も良い方式を当業者に教示することのみを意図する。上記教示を考慮して当業者により理解されているように、上に記載された本発明の実施形態の修正および変化形は、本発明から逸脱することなく可能である。したがって、特許請求の範囲およびこれらの同等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載されているものとは別の方法で実施され得ることが理解されている。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
標的細胞の分析のためにサイトメトリーデバイスを較正するための方法であって、
標的細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有するヒドロゲル粒子を前記デバイスに挿入するステップであって、前記ヒドロゲル粒子が重合モノマーを含み、少なくとも１つの表面を有するステップと、
前記サイトメトリーデバイスを使用して前記ヒドロゲル粒子の前記少なくとも１種の光学特性を測定するステップと
を含む方法。
（項目２）
試料中の標的細胞を検出するための方法であって、
標的細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有するヒドロゲル粒子をデバイスに挿入するステップであって、前記ヒドロゲル粒子が重合モノマーを含むステップと、
サイトメトリーデバイスを使用して、前記ヒドロゲル粒子の前記少なくとも１種の光学特性を測定するステップと、
複数の細胞を含む試料を前記サイトメトリーデバイスに挿入するステップと、
前記複数の細胞の個々の細胞の前記少なくとも１種の光学特性を測定するステップと、
光学特性測定値に基づき、前記標的細胞またはその複数が前記試料中に存在するかどうかを決定するステップと
を含む方法。
（項目３）
前記試料中に存在する場合、前記標的細胞または複数の標的細胞を別の容器にソーティングするステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
複数のヒドロゲル粒子を前記サイトメトリーデバイスに挿入するステップであって、前記ヒドロゲル粒子のそれぞれが、標的細胞と実質的に同様の少なくとも１種の光学特性を有するステップをさらに含む、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１種の光学特性が、前記複数のヒドロゲル粒子のそれぞれに対して同じである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１種の光学特性が側方散乱（ＳＳＣ）である、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１種の光学特性が前方散乱（ＦＳＣ）である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１種の光学特性が蛍光発光である、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記少なくとも１種の光学特性がＦＳＣおよびＳＳＣである、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記モノマーが、ヒドロキシエチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、プロピレングリコールメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリセロールメタクリレート（ＧＭＡ）、グリコールメタクリレート、エチレングリコール、フマル酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエトキシエチルメタクリレート、ヒドロキシジエトキシエチルメタクリレート、メトキシエチルメタクリレート、メトキシエトキシエチルメタクリレート、メトキシジエトキシエチルメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メトキシ－ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、２－フェニルエチルアクリレート、２－フェニルエチルメタクリレート、２－フェノキシエチルアクリレート、２－フェノキシエチルメタクリレート、フェニルチオエチルアクリレート、フェニルチオエチルメタクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルアクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルメタクリレート、ペンタブロモフェニルアクリレート、ペンタブロモフェニルメタクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２，３－ジブロモプロピルアクリレート、２，３－ジブロモプロピルメタクリレート、２－ナフチルアクリレート、２－ナフチルメタクリレート、４－メトキシベンジルアクリレート、４－メトキシベンジルメタクリレート、２－ベンジルオキシエチルアクリレート、２－ベンジルオキシエチルメタクリレート、４－クロロフェノキシエチルアクリレート、４－クロロフェノキシエチルメタクリレート、２－フェノキシエトキシエチルアクリレート、２－フェノキシエトキシエチルメタクリレート、Ｎ－フェニルアクリルアミド、Ｎ－フェニルメタクリルアミド、Ｎ－ベンジルアクリルアミド、Ｎ－ベンジルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルメタクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルアクリルアミド Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルアクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルアクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルアクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）アクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルアクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－フェニルフェニルエチルアクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルメタクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルメタクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルメタクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）メタクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－フェニルフェニルエチルメタクリルアミド、Ｎ－ビニルカルバゾール、４－ビニルピリジン、２－ビニルピリジン、またはこれらの組合せから選択される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記モノマーが生分解性モノマーである、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。（項目１２）
前記生分解性モノマーが、単糖、二糖、多糖、ペプチド、タンパク質、またはタンパク質ドメインである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記生分解性モノマーが、少なくとも１種の非天然アミノ酸を含むタンパク質またはタ
ンパク質ドメインである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記生分解性モノマーが、構造的多糖である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記生分解性モノマーが、寒天、アガロース、アルギン酸、アルグロン酸、アルファグルカン、アミロペクチン、アミロース、アラビノキシラン、ベータ－グルカン、カロース、カプスラン、カラギーナン多糖、セロデキストリン、セルリン、セルロース、キチン、キトサン、クリソラミナリン、カードラン、シクロデキストリン、アルファ－シクロデキストリン、デキストリン、デキストラン、フィコール、フルクタン、フコイダン、ガラクトグルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトサミノガラクタン、ジェランガム、グルカン、グルコマンナン、グルクロノキシラン、グリコカリックス、グリコーゲン、ヘミセルロース、ホモ多糖、ヒプロメロース、イコデキストリン、イヌリン、ケフィラン、ラミナリン、レンチナン、レバン多糖、リケニン、マンナン、混合結合グルカン、パラミロン、ペクチン酸、ペクチン、ペンタスターチ、フィトグリコーゲン、プルーラン、ポリデキストロース、多糖ペプチド、ポルフィラン、プルラン、シゾフィラン、シニストリン、シゾフィラン、ウェランガム、キサンタンガム、キシラン、キシログルカン、ザイモサン、またはこれらの組合せである、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記生分解性モノマーがキトサンまたはヒアルロナンである、項目１１に記載の方法。（項目１７）
前記タンパク質が構造的タンパク質、そのドメイン、またはこれらの組合せである、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記タンパク質が、プロテオグリカン、そのドメイン、またはこれらの組合せである、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質が細胞外マトリクス構成成分である、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記プロテオグリカンが、デコリン、ビグリカン、テスチカン、ビクニン、フィブロモジュリン、ルミカン、それらのドメイン、またはこれらの組合せである、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記タンパク質が、コラーゲン、エラスチンまたはプロテオグリカンである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記タンパク質がコラーゲンである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、それらのドメインまたはこれらの組合せである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記モノマーが官能化されている、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記モノマーがアクリレートまたはアクリルアミドで官能化されている、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記モノマーが二官能性である、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ヒドロゲル粒子が、前記少なくとも１つの表面上で官能化されている、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ヒドロゲル粒子が、抗体またはその断片で官能化されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ヒドロゲルが少なくとも１種の細胞表面マーカーで官能化されている、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞表面マーカーが、表２に示された細胞表面マーカーの１種、またはこれらの組合せである、項目２９に記載の方法。
（項目３０）
前記ヒドロゲル粒子が、前記少なくとも１つの表面上で蛍光体により官能化されている、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
物質が前記ヒドロゲル粒子で封入されている、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記物質がビーズである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ビーズが蛍光ビーズである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記蛍光ビーズが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つの波長で蛍光を発光する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ビーズが、約５００ｎｍ～約１０μｍの直径を有する、項目３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記物質が生体分子である、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
前記生体分子が核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物またはこれらの組合せである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記サイトメトリーデバイスの１種または複数の特性を、前記ヒドロゲル粒子で較正するステップをさらに含む、項目３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記サイトメトリーデバイスの前記１種または複数の特性が、セルソーティングシステム、レーザー供給源、光学機器、ストリーム流、またはこれらの組合せである、項目３８に記載の方法。

Claims (39)

  1. ヒドロゲル粒子の集団であって、各ヒドロゲル粒子が、
    （ｉ）重合モノマーおよびコモノマーを含むポリマー；および
    （ｉｉ）（ａ）細胞表面マーカー、（ｂ）核酸配列、（ｃ）ポリペプチド、（ｄ）抗体またはそのエピトープ結合領域、または（ｅ）これらの組合せを含む１つ以上の生体分子
    を含み、
    該ヒドロゲル粒子の集団が、標的細胞の対応する特性と実質的に同様の前方散乱（ＦＳＣ）および／または側方散乱（ＳＳＣ）から選択される光学特性を有する、
    ヒドロゲル粒子の集団。
  2. 前記ヒドロゲル内に封入されたナノ粒子を含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  3. 前記光学特性が、前記コモノマー、コモノマーに対するモノマーの比、または前記ヒドロゲル内に封入されたナノ粒子によって提供される、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  4. 前記重合モノマーが、乳酸、グリコール酸、アクリル酸、１－ヒドロキシエチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、プロピレングリコールメタクリレート、アクリルアミド、Ｎ－ビニルピロリドン（ＮＶＰ）、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリセロールメタクリレート（ＧＭＡ）、グリコールメタクリレート、エチレングリコール、フマル酸、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエトキシエチルメタクリレート、ヒドロキシジエトキシエチルメタクリレート、メトキシエチルメタクリレート、メトキシエトキシエチルメタクリレート、メトキシジエトキシエチルメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メトキシ－ポリ（エチレングリコール）メタクリレート、メタクリル酸、メタクリル酸ナトリウム、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシブチルメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、２－フェニルエチルアクリレート、２－フェニルエチルメタクリレート、２－フェノキシエチルアクリレート、２－フェノキシエチルメタクリレート、フェニルチオエチルアクリレート、フェニルチオエチルメタクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルアクリレート、２，４，６－トリブロモフェニルメタクリレート、ペンタブロモフェニルアクリレート、ペンタブロモフェニルメタクリレート、ペンタクロロフェニルアクリレート、ペンタクロロフェニルメタクリレート、２，３－ジブロモプロピルアクリレート、２，３－ジブロモプロピルメタクリレート、２－ナフチルアクリレート、２－ナフチルメタクリレート、４－メトキシベンジルアクリレート、４－メトキシベンジルメタクリレート、２－ベンジルオキシエチルアクリレート、２－ベンジルオキシエチルメタクリレート、４－クロロフェノキシエチルアクリレート、４－クロロフェノキシエチルメタクリレート、２－フェノキシエトキシエチルアクリレート、２－フェノキシエトキシエチルメタクリレート、Ｎ－フェニルアクリルアミド、Ｎ－フェニルメタクリルアミド、Ｎ－ベンジルアクリルアミド、Ｎ－ベンジルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジベンジルメタクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルアクリルアミド、Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルアクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルアクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルアクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）アクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルアクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－フェニルフェニルエチルアクリルアミド、Ｎ－ジフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－メチルフェニル）メチルメタクリルアミド、Ｎ－１－ナフチルメタクリルアミド、Ｎ－４－ニトロフェニルメタクリルアミド、Ｎ－（２－フェニルエチル）メタクリルアミド、Ｎ－トリフェニルメチルメタクリルアミド、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－メチルフェニルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－フェニルフェニルエチルメタクリルアミド、Ｎ－ビニルカルバゾール、４－ビニルピリジン、２－ビニルピリジン、メタクリルアミド、Ｎ－アルキルアクリルアミド、Ｎ－アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアクリルアミド、Ｎ－［（ジアルキルアミノ）アルキル］アクリルアミド、Ｎ－［（ジアルキルアミノ）アルキル］メタクリルアミド、（ジアルキルアミノ）アルキルアクリレート、または（ジアルキルアミノ）アルキルメタクリレートである、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  5. 前記重合モノマーが、アクリルアミドである、請求項４に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  6. 前記コモノマーが、色素分子と反応し得る１つ以上の化学的側基を含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  7. 前記コモノマーが、アリルアミン、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、アリルアルコール、アリルイソチオシアネート、アリルクロリド、アリルマレイミド、またはビス－アクリルアミドである、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  8. 前記ビス－アクリルアミドが、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－エチレンビス－メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－プロピレンビスアクリルアミド、またはＮ，Ｎ’－（１，２－ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドである、請求項７に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  9. 前記ポリマーが、重合されたアクリルアミドおよびビス－アクリルアミドを含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  10. 前記光学特性が、ビス－アクリルアミドに対するアクリルアミドの比によって与えられる、請求項９に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  11. 前記封入されたナノ粒子が、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、またはシリカである、請求項２に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  12. 前記封入されたナノ粒子がＰＭＭＡである、請求項２に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  13. 前記封入されたナノ粒子がＰＳである、請求項２に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  14. 前記封入されたナノ粒子がシリカである、請求項２に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  15. 単一種の生体分子を含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  16. 複数の異なる種の生体分子を含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  17. 各ヒドロゲル粒子が、表面を含み、そして該表面が、１つ以上の生体分子で官能化されている、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  18. 前記表面が、単一種の生体分子で官能化されている、請求項１７に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  19. 前記表面が、複数の異なる種の生体分子で官能化されている、請求項１７に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  20. 前記ヒドロゲル粒子の集団中の各ヒドロゲル粒子が、既知の濃度の前記１つ以上の生体分子を含む、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  21. 各ヒドロゲル粒子が表面を含み、そして該表面が、１つ以上の：（ａ）細胞表面マーカー、（ｂ）核酸配列、（ｃ）ポリペプチド、（ｄ）抗体またはそのエピトープ結合領域、または（ｅ）これらの組合せで官能化されている、請求項２０に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  22. 前記表面が、１つ以上の細胞表面マーカーで官能化されている、請求項２１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  23. 前記表面が、１つ以上の抗体またはそのエピトープ結合領域で官能化されている、請求項２１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  24. 前記１つ以上の生体分子が、前記ヒドロゲル粒子内に封入されている、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  25. 前記１つ以上の封入された生体分子が、核酸またはペプチドである、請求項２４に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  26. 前記１つ以上の封入された生体分子が、核酸である、請求項２４に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  27. 前記１つ以上の生体分子が、前記ヒドロゲル粒子内に封入されており、そして前記ヒドロゲル粒子の表面が、１つ以上の生体分子で官能化されている、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  28. 前記ヒドロゲル粒子内に封入された前記１つ以上の生体分子および前記ヒドロゲル粒子の前記表面上の前記１つ以上の生体分子が、異なる種類の生体分子である、請求項２７に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  29. 前記細胞表面マーカーが、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＣＤ１３７、またはこれらの組合せである、請求項２１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  30. 前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１９、またはこれらの組合せである、請求項２１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  31. 前記標的細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＢ細胞である、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  32. 前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ヘモグロビンである、請求項２１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  33. 前記ヘモグロビンが、ヒトヘモグロビンである、請求項３２に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  34. 前記標的細胞が、赤血球または単球である、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  35. 前記標的細胞に実質的に同様な平均粒子容積、平均粒子直径、またはその両方を有する、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  36. 前記標的細胞に実質的に同様な平均粒子容積、平均粒子直径、またはその両方を有する、請求項３５に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  37. 前記ヒドロゲル粒子の集団中の各ヒドロゲル粒子が、実質的に同じ濃度の前記１つ以上の生体分子を有する、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  38. 前記ヒドロゲル粒子が、標的細胞の弾性と実質的に同様な弾性を有する、請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団。
  39. 水性懸濁液であって、該水性懸濁液中に懸濁した請求項１に記載のヒドロゲル粒子の集団を含む、水性懸濁液。
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