JP7520972B2 - 新規抗ｃｄ４７抗体及びその使用 - Google Patents

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関連出願の相互参照
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は一般的に抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＣＤ４７に対するモノクローナル抗体、それを調製するための方法、及びその抗体の使用に関する。
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られる分化クラスター47（ＣＤ４７）は、ほとんどの正常な細胞タイプで発現する遍在する細胞表面糖タンパク質である約５０ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリー膜タンパク質である。ＣＤ４７は、そのリガンドであるマクロファージ上に発現されるシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）と相互作用し、そして次に抗食作用又は「私を食べないで（don’t eat me）」シグナルをマクロファージに送り、そして従って、免疫監視を回避する[１]。さまざまな悪性腫瘍の分析により、ＣＤ４７はＡＭＬ、ＮＨＬ、乳癌、ＮＳＣＣ、及び卵巣細胞で過剰発現されており、そしてＣＤ４７発現の増加は臨床的予後の悪化と相関していることが明らかになっている。これらのデータは、ＣＤ４７がＣＤ４７－ＳＩＲＰαの相互作用をブロックし、そして「私を食べないで」という信号をオフにすることにより、癌治療の新しい免疫チェックポイントとして役立つ可能性があることを示している。
ＣＤ４７は広く発現している細胞表面タンパク質であり、マクロファージ及び樹状細胞などの自然免疫系及び獲得免疫系の細胞を介した食作用のメディエーターとして機能する。ＣＤ４７は、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍など、さまざまな種類の腫瘍で過剰に発現される。ますます多くの研究結果が、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル軸を標的とすることが癌免疫療法の新しい免疫チェックポイントとして役立つ可能性があり、そして単剤療法又は併用療法のいずれかで強力な抗腫瘍能力をゆうし、ＣＤ４７を複数のヒト悪性癌の普遍的な標的にする可能性があることを示している。
いくつかの抗ＣＤ４７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＡＭＬ、ＮＨＬ、乳房細胞、及び卵巣細胞に対する食作用を伴う効果的なマクロファージを達成している。さらに、承認された抗体（抗腫瘍関連抗原）と組み合わされた、又は二重標的二重特異性抗体を使用した抗ＣＤ４７ ｍＡｂは、抗腫瘍活性を効率的に増強した[２－４]。これらの前臨床試験に基づいて、６つ以上の抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及び３つのＳＩＲＰα融合タンパク質が、ヒトの血液悪性腫瘍及び固形腫瘍を対象としたアクティブな第I相又は第II相臨床試験にある。
しかしながら、癌を含むさまざまな疾患の予防又は治療に使用するために、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用をブロックでき、そして腫瘍細胞の強力な食作用を誘導することができる新規抗ＣＤ４７分子を開発する必要がある。
これら及び他の目的は、広い意味で、改善された有効性を有する抗体を提供する化合物、方法、組成物及び製造品に向けられる本開示によって提供される。本開示によって提供される利点は、抗体治療及び診断の分野に広く適用可能であり、そして様々な標的と反応する抗体と組み合わせて使用することができる。
本開示において、完全にヒトの抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が生成された。本開示の抗体は、ヒトＣＤ４７又はカニクイザルＣＤ４７に高い親和性で結合することがで； ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰαの間の相互作用を効果的にブロックし； ヒト赤血球（ＲＢＣ）への弱い結合を示し、そしてヒトＲＢＣの赤血球凝集を誘発せず； 赤血球の食作用を減少させて、腫瘍細胞の強力なマクロファージ媒介食作用を誘発し；そして 強力な腫瘍増殖阻害を示す。
いくつかの側面において、本開示は、ＣＤ４７に対する単離された抗体又はその抗原結合部分を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
Ａ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＨ鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）：
（i）配列番号１に示されるように、ＨＣＤＲ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣＤＲ１;
（ii）配列番号２に示されるように、ＨＣＤＲ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号３に示されるように、ＨＣＤＲ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣＤＲ３；
Ｂ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＬ鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）：
（i）配列番号４に示されるように、ＬＣＤＲ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣＤＲ１;
（ii）配列番号５に示されるように、ＬＣＤＲ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号６に示されるように、ＬＣＤＲ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣＤＲ３；又は
Ｃ）Ａ）の1つ又は複数のＨＣＤＲ及びＢ）の1つ又は複数のＬＣＤＲ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
Ａ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＨ鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）：
（i）配列番号１を含むＨＣＤＲ１、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＨＣＤＲ１とアミノ酸配列が異なるＨＣＤＲ１;
（ii）配列番号２を含むＨＣＤＲ２、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＨＣＤＲ２とアミノ酸配列が異なるＨＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号３を含むＨＣＤＲ３、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＨＣＤＲ３とアミノ酸配列が異なるＨＣＤＲ３；
Ｂ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＬ鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）：
（i）配列番号４を含むＬＣＤＲ１、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＬＣＤＲ１とアミノ酸配列が異なるＬＣＤＲ１;
（ii）配列番号５を含むＬＣＤＲ２、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＬＣＤＲ２とアミノ酸配列が異なるＬＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号６を含むＬＣＤＲ３、又は２つ以下のアミノ酸のアミノ酸の付加、欠失又は置換によりＬＣＤＲ３とアミノ酸配列が異なるＬＣＤＲ３；又は
Ｃ）Ａ）の1つ又は複数のＨＣＤＲ及びＢ）の1つ又は複数のＬＣＤＲ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで
（Ａ）ＶＨは、以下を含み：
（i）配列番号１を含むＨＣＤＲ１;
（ii）配列番号２を含むＨＣＤＲ２; 及び
（iii）配列番号３を含むＨＣＤＲ３;そして/又は
（Ｂ）ＶＬは、以下を含み：
（i）配列番号４を含むＬＣＤＲ１;
（ii）配列番号５を含むＬＣＤＲ２; 及び
（iii）配列番号６を含むＬＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）以下を含むＨ鎖可変領域：
（i）配列番号７のアミノ酸配列;
（ii）配列番号７と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列; 又は
（iii）配列番号７と比較して1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換を伴うアミノ酸配列；及び/又は
（Ｂ）以下を含むＬ鎖可変領域：
（i）配列番号８のアミノ酸配列;
（ii）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列; 又は
（iii）配列番号８と比較して1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換を伴うアミノ酸配列。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単離された抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７に示されるようなＨ鎖可変領域及び配列番号８に示されるようなＬ鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、ＩｇＧ４などのヒトＩｇＧのＦｃ領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＥＵ番号付けによると、Ｓ２２８Ｐの置換を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下の特性のうちの１つ又は複数を有する：
（a）可溶性タンパク質として、又は細胞表面上に発現する、ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７に特異的に結合する性質；
（b）ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を８５％以上の阻害率でブロックする性質；
（c）赤血球（ＲＢＣ）への弱い結合であり、そしてヒトＲＢＣの赤血球凝集を誘発しない性質；
（d）ヒトＲＢＣの食作用が減少した腫瘍細胞のマクロファージ媒介食作用を誘導する性質；
（e）腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性が弱いか、まったくないことを誘発する性質；
（f）良好な熱安定性を有し、ヒト血清中で安定している性質；
（g）動物腫瘍モデルにおいてインビボで腫瘍増殖阻害を有意に誘導する性質;及び（h）他の抗腫瘍分子、特にパニツムマブと組み合わせて投与した場合に相乗効果を示す性質。
特定の実施形態において、本明細書に開示されるような単離された抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を効果的にブロックする。例えば、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の結合の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％は、本明細書の抗体又は抗原結合部分によってブロックすることができる。一方、本明細書の抗体又は抗原結合部分は、ベンチマーク抗ＣＤ４７抗体よりも有意に少ないヒトＲＢＣの赤血球凝集を引き起こす可能性があり、例えば、ベンチマーク抗ＣＤ４７抗体と比較して、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又はそれ以下のヒトＲＢＣの赤血球凝集を引き起こす可能性がある。表２に示すように、例示的なベンチマーク抗体には、ＢＭＫ１、ＢＭＫ２、ＢＭＫ４及びＢＭＫ８抗体が含まれる。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような単離された抗体のＨ鎖可変領域及び／又はＬ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部分、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるように宿主細胞において抗体又はその抗原結合部分を発現し、そして宿主細胞から抗体又はその抗原結合部分を単離することを含む、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合部分を調製するための方法に関する。
いくつかの側面において、本開示は、免疫応答、任意にはＣＤ４７に関連する免疫応答が対象において調節されるように、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法に関する。
いくつかの側面において、本開示は、有効量の抗体又はその抗原結合部分、又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法に関する。
いくつかの側面において、本開示は、有効量の抗体又はその抗原結合部分、又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における増殖性障害（例えば、癌）を含む疾患を治療又は予防するための方法に関する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分は、化学療法剤又はパニツムマブなどの治療用抗体と共に（例えば、連続的又は同時に）投与され得る。
いくつかの側面において、本開示は、増殖性障害（例えば、癌）を含む疾患を治療又は予防するための医薬品の製造への、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分の使用に関する。
いくつかの実施形態において、前記癌は血液癌又は固形腫瘍である可能性がある。前記血液癌は、例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ－ＡＬＬ、Ｂ－ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫; Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＳＬＬ、ＣＮＳリンパ腫、リヒター症候群、多発性骨髄腫、及び免疫芽球性大細胞リンパ腫から選択される。いくつかの実施形態において、治療される癌はバーキットリンパ腫である。固形腫瘍は、例えば肺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、睾丸癌、腎臓癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、結腸/直腸癌、胃腸管癌、皮膚癌、前立腺癌から選択される。いくつかの実施形態において、治療される癌は結腸癌である。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分、並びに癌を含む疾患の治療に有用な本明細書に開示される医薬組成物を使用するキット又は装置及び関連する方法に関する。
上記は要約であり、そして従って、必然的に、簡略化、一般化、及び詳細の省略が含まれ；その結果、当業者は、要約が例示にすぎず、決して限定することを意図していないことを理解するであろう。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の主題の他の態様、特徴、及び利点は、本明細書に記載の教示において明らかになるであろう。要約は、以下の詳細な説明でさらに説明される簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供されている。この要約は、主張された主題の主要な特徴又は本質的な特徴を特定することを意図しておらず、主張された主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図されていない。
図１は、ＥＬＩＳＡで測定される場合、リード抗体Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬ（本明細書では「Ｗ３４５５」と省略する）のヒトＣＤ４７への結合を示している。Ｗ３４５－ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ４ＰＥ．Ｋ、Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰ、及びＷ３４５－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ４．ＳＰＫは、抗ＣＤ４７ベンチマーク抗体である。ＩｇＧ４アイソタイプはアイソタイプコントロールである。「Ｎｅｇ」列は、ブランクコントロールの最大ＯＤである。
図２は、ＦＡＣＳで測定される場合、ヒトＣＤ４７発現細胞へのリード抗体Ｗ３４５５の結合を示している。「Ｎｅｇ」列は、ブランクコントロールの最大ＭＦＩである。
図３は、ＦＡＣＳで測定される場合、カニクイザルＣＤ４７発現細胞へのリード抗体Ｗ３４５５の結合を示している。
図４は、ＦＡＣＳで測定される場合、リード抗体Ｗ３４５５のヒト赤血球への結合を示している。
図５は、ヒトＲＢＣに対するリード抗体Ｗ３４５５の赤血球凝集活性（ＨＡ）を示している。
図６は、リガンド競合アッセイでＥＬＩＳＡによって測定されたリード抗体Ｗ３４５５のＳＩＲＰαブロッキング活性を示している。「Ｍｉｎ ＯＤ」は最小ＯＤ４５０値を示し、そして「リガンド」列はリガンドのみが存在する場合の最小ＯＤ結果を示す。
図７は、リガンド競合アッセイでＦＡＣＳによって測定されたリード抗体Ｗ３４５５のＳＩＲＰαブロッキング活性を示している。「Ｍｉｎ ＭＦＩ」は最小ＭＦＩ値を示し、そして「リガンド」列はリガンドのみが存在する場合の最小ＭＦＩ結果を示す。
図８は、ＳＰＲで測定される場合、リード抗体Ｗ３４５５及びベンチマーク抗体Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰのヒトＣＤ４７への結合速度曲線を示している。
図９は、示差走査熱量測定（ＤＳＦ）で測定される場合、２つの異なる緩衝液でのリード抗体Ｗ３４５５の熱安定性の結果を示している。
図１０は、ＦＡＣＳで試験される場合、ヒト血清中のリード抗体Ｗ３４５５の安定性を示している。
図１１Ａ～１１Ｃは、Raji細胞（Ａ）、Jurkat細胞（Ｂ）、及びヒトＲＢＣ（Ｃ）においてリード抗体Ｗ３４５５によって誘導されるマクロファージを介した食作用を示している。
図１２は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ及びRaji細胞に対するリード抗体Ｗ３４５５及びベンチマーク抗体のＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を示している。
図１３は、リード抗体Ｗ３４５５又はベンチマーク抗体をさまざまな濃度で処理した後のＲａｊｉ－Ｌｕｃリンパ系癌細胞を接種したＢ－ＮＤＧマウスの体重変化を示している。
図１４は、リード抗体Ｗ３４５５又はベンチマーク抗体をさまざまな濃度で処理した後の発光シグナル強度（腫瘍増殖に対応）の変化を示している。
図１５は、グループ化後のＢ－ＮＤＧマウスモデルにおける個々の動物のライブイメージング写真を示している。このグラフの「ＢＭＫ２」は、Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰ（又は「Ｗ３４５－ＢＭＫ２」と省略する）を指す。
図１６は、グループ化後０～３２日のＢ－ＮＤＧマウスモデルにおける動物の生存率を示している。
図１７は、リード抗体Ｗ３４５５を単独で、又はパニツムマブと組み合わせて投与した後、ＨＴ－２９細胞を接種したＮＣＧマウスの腫瘍体積の変化を示している。
図１８は、リード抗体Ｗ３４５５を単独で、又はパニツムマブと組み合わせて投与した後、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）のパーセンテージを示している。
図１９Ａ－１９Ｂは、リード抗体Ｗ３４５５、ＢＭＫ２、又はＢＭＫ８の投与後、Ｒａｊｉ細胞を接種したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスの体重変化（Ａ）と腫瘍体積変化（Ｂ）を示している。
図２０は、カニクイザルのＰＫ研究におけるリード抗体Ｗ３４５５の血清濃度を示している。
図２１Ａ－２１Ｃは、カニクイザルの臨床血液学におけるリード抗体Ｗ３４５５の投与後、赤血球数（Ａ）、ヘモグロビンレベル（Ｂ）、及び網状赤血球数（Ｃ）の変化を示している。
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変更及び修正の影響を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、そのようなすべての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で参照又は示される全ての工程、特徴、組成物及び化合物を、個別にま他派集合的に、及び任意の全ての組み合わせ又は任意の２つ以上の前記工程又は特徴を含む。
本明細書で特別にことわらない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈上特別にことわらない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。より具体的には、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質を含む。「細胞」への言及は、細胞の混合物などを含む。本出願において、「又は」の使用は、特に明記しない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、「含む（comprising）」という用語、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprised）」などの他の形態の使用は限定されない。さらに、明細書及び添付の特許請求の範囲で提供される範囲には、エンドポイント及びエンドポイント間の全てのポイントが含まれる。
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技術は、当技術分野でよく知られており、一般的に使用されるものである。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、特にことわらない限り、本明細書全体で引用及び論じられる様々な一般的且つより具体的な参考文献に記載されるように実施される。例えば、以下を参照のこと：Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 及び Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学に関連して使用される命名法、及び実験手順及び技術は、当技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。さらに、ここで使用されているセクションの見出しは、組織的な目的のみであり、説明されている主題を制限するものとして解釈されるべきではない。
定義
関連する用語又は表現の定義と説明は次の通りである。
本明細書で使用される「抗体」又は「Ａｂ」という用語は、一般的に、共有ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒に保持された２つの重（Ｈ）及び２つの軽（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ字型四量体タンパク質を指す。抗体のＬ鎖は、κＬ鎖とλＬ鎖に分類できる。 Ｈ鎖はμ、δ、γ、α及びεに分類され得、これらは抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして定義する。Ｌ鎖及びＨ鎖において、可変領域は、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、Ｈ鎖は、約３又はそれ以上のアミノ酸以上の「Ｄ」領域をさらに含む。 各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）とＨ鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。Ｈ鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）で構成されている。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）とＬ鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。ＶＨ及びＶＬ領域は、比較的保守的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）によって間隔が空けられた超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに分割できる。各ＶＨ及びＶＬは、Ｎ末端からＣ末端へのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。各Ｈ鎖/Ｌ鎖ペアの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。さまざまな領域又はドメインでのアミノ酸の分布は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)）、又はChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883の定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体のものであり得る。
本出願の文脈において交換可能に使用することができる、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」という用語は、全長抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する能力を保持し、そして/又は同じ抗原に結合するために全長抗体と競合する、完全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。一般的に、参照により本明細書に組み込まれる、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N.Y. (1989)を参照のこと。抗体の抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、又は無傷の抗体の酵素的又は化学的切断によって生成され得る。いくつかの条件下で、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補的決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、及びポリペプチドに特異的な抗原結合能力を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むそのようなポリペプチドを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、当業者に知られている従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技法又は酵素的又は化学的切断方法）によって、所定の抗体（例えば、本出願で提供されるモノクローナル抗ヒトＸ抗体）から得ることができ、そして無傷の抗体がスクリーニングされるのと同じ方法で特異性についてスクリーニングされ得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
本明細書で使用される「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
本明細書で使用される「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を示す抗体を指し、これは、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域の変更は、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、そして定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、そして定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体、例えば他の種の免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物から単離された抗体、 宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、 組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、 又は、免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を指す。
本明細書で使用される「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しており、一方、本明細書で使用される「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。抗体のＫｄ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ ／ Ｋａ）から得られ、そしてモル濃度（Ｍ）として表される、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことを意図している。抗体のＫｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるものであり、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することである。
本明細書で使用される「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、２つの分子間の、例えば、抗体と抗原との間の非ランダム結合反応を指す。
本明細書で使用される「結合を阻害する」又は「結合をブロックする」能力は、２つの分子（例えば、ＣＤ４７及びそのリガンド）間の結合相互作用を任意の検出可能なレベルまで阻害する抗体の能力を指す。特定の実施形態において、２つの分子の結合は、抗体又はその抗原結合フラグメントによって少なくとも５０％阻害され得る。特定の実施形態では、そのような阻害効果は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上の可能性がある。
本明細書で使用されるＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、SPRによって決定される場合、標的抗原に対して、好ましくは１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは５ ｘ １０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１ｘ１０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは５ｘ１０－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは１ｘ１０－１０Ｍ以下、さらにより好ましくは５ｘ１０－１１Ｍ以下、さらに好ましくは４ｘ１０－１１Ｍ以下、さらにより好ましくは３x１０－１１Ｍ以下、さらにより好ましくは２．５ｘ１０－１１Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
本明細書で使用される「最大有効濃度の半分」とも呼ばれる「ＥＣ５０」という用語は、指定された曝露時間後にベースラインと最大の中間の応答を誘発する薬物、抗体又は毒物の濃度を指す。本出願の文派では、ＥＣ５０は「ｎＭ」の単位で表される。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部分を指す。「エピトープ」は「抗原決定基」としても知られている。エピトープ又は抗原決定基は、一般的に、アミノ酸、炭水化物、又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、一般的に、特定の三次元構造及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは一般的に、「線形」又は「立体配座」であり得る、独特の立体配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続又は非連続アミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）の間のすべての相互作用部位が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。配座エピトープでは、相互作用部位は、タンパク質内で互いに分離しているアミノ酸残基にまたがっている。当業者によって知られている従来の技術による同じエピトープへの結合の競合性に応じて、抗体をスクリーニングすることができる。例えば、競合又は交差競合に関する研究を実施して、抗原（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）への結合について互いに競合又は交差競合する抗体を得ることができる。それらの交差競合に基づいて、同じエピトープに結合する抗体を取得するためのハイスループット方法は、国際特許公開ＷＯ０３ ／４８７３１号に記載されている。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、人工的な手段によって自然状態から得られた状態を指す。特定の「隔離された」物質又は成分が自然界に存在する場合、その自然環境が変化するか、物質が自然環境から隔離されるか、又はその両方が原因である可能性がある。例えば、特定の非単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、特定の生存動物の体内に自然に存在し、そのような自然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、混合された人工又は合成された物質、あるいは単離された物質の活性に影響を及ぼさない他の不純な物質を除外しない。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸ビークルを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって、宿主細胞で発現される運ばれた遺伝物質要素を有することができる。プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばλファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウィルス（但し、それらに限定されない）を含むベクターは、当業者によく知られている。ベクターとして使用できる動物ウイルスには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれるが、これらに限定されない。プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含む（これらに限定されない）ベクターは、発現を制御するための複数の要素を含み得る。さらに、ベクターは複製起点を含み得る。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質、タンパク質フラグメント、又はペプチドを生成するように操作することができる細胞系を指す。宿主細胞は、以下を含むが、但しそれらに限定されない：培養細胞、例えば、齧歯動物（ラット、マウス、モルモット、またはハムスター）に由来する哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２/０、ＹＢ２/ ０； 又はヒト組織又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞、並びに遺伝子改変動物又は培養組織内に含まれる細胞。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。突然変異又は環境の影響のいずれかにより、特定の変更が次の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
本明細書で使用される「同一性」という用語は、配列を整列及び比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「パーセント同一性」は、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一の残基のパーセントを意味し、比較される最小の分子のサイズに基づいて計算される。これらの計算では、アラインメントのギャップ（存在する場合）は、特定の数学モデル又はコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処することが好ましい。アラインメントされた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用できる方法は、以下に記載される方法を含む：Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073。
本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、生物における特定の抗体または感作されたリンパ球の形成を刺激する能力を指す。これは、特定の免疫細胞を刺激して活性化、増殖、分化させ、最終的に抗体や感作リンパ球などの免疫エフェクター物質を生成する抗原の特性を指すだけでなく、また抗原で生物を刺激した後、抗体又は感作されたＴリンパ球が生物の免疫系で形成される可能性がある特定の免疫応答も指す。免疫原性は抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主において免疫応答の生成を首尾よく誘導できるかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性、及び免疫化手段の３つの要因に依存する。
本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、核酸が真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションのプロトコル及び技術には、脂質トランスフェクション及びエレクトロポレーションなどの化学的及び物理的方法が含まれますが、これらに限定されない。多くのトランスフェクション技術が当技術分野でよく知られており、そして本明細書に開示されている。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197を参照のこと。
本明細書で使用される「ハイブリドーマ」という用語及び「ハイブリドーマ細胞株」という用語は、交換可能に使用され得る。「ハイブリドーマ」という用語及び「ハイブリドーマ細胞株」という用語が言及される場合、それらはまた、ハイブリドーマのサブクローン及び子孫細胞を含む。
本明細書で使用される「ＳＰＲ」又は「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指し、そして含む。さらなる詳細については、実施例５及びJonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 及び Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照のこと。
本明細書で使用される「蛍光活性化細胞選別」又は「ＦＡＣＳ」という用語は、特殊なタイプのフローサイトメトリーを指す。これは、各細胞の特定の光散乱及び蛍光特性に基づいて、生物学的細胞の不均一な混合物を一度に1つの細胞で２つ以上の容器に分類する方法を提供する(FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. Retrieved 2017-11-09.)。ＦＡＣＳを実施するための機器は、当業者に知られており、一般に市販されている。このような機器の例には、Becton Dickinson（Foster City, Calif.）のＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器、Coulter Epics Division（Hialeah, Fla.）のＥｐｉｃｓ Ｃ、及びCytomation（Colorado Springs, Colo.）のＭｏＦｌｏが含まれる。
本明細書で使用される「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇが、それらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、そして続いて細胞毒素で標的細胞を殺すことができるようにする、細胞毒性の形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、そしてそのような殺害には絶対に必要である。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、ところが単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価され得る。
「補体依存性細胞毒性」又は「ＣＤＣ」という用語は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系（Ｃｌｑ）の最初の成分が、同族の抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)で説明されているようなアッセイが、実施され得る。
「ＥＵ番号付け」という用語は、ＫａｂａｔらのようにＥＵ番号付けを指す。Kabat番号付けシステムは、一般的に、可変ドメインの残基（Ｌ鎖の残基1～107及びＨ鎖の残基1～113）(例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))を参照する場合に使用される。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリンＨ鎖定常領域の残基を指すときに一般的に使用される（例えば、上記のKabatetalなどで報告されたＥＵインデックス）。本明細書で特に明記しない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。特定の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、Ｆｃ修飾、例えば、ＥＵ番号付けによる、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸配列の位置２２８におけるプロリン（「Ｐ」）へのセリン（「Ｓ」）の突然変異を含む。
「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物、好ましくはヒトを含む。
本明細書で使用される「癌」という用語は、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖または転移を介した固形腫瘍および白血病などの非固形腫瘍を指し、そしてそれらは病状を開始する。
状態を治療する文脈で本明細書で使用される「治療」、「治療する」又は「治療される」という用語は、一般的に、何らかの所望の治療効果が達成される、ヒト又は動物のいずれであれ、治療（treatment）及び治療（therapy）に関係し、そして 例えば、状態の進行の抑制、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の退行、状態の改善、及び状態の治癒を含む。予防措置としての治療（すなわち、予防、防止）も含まれる。癌の場合、「治療」とは、腫瘍又は悪性細胞の成長、増殖、又は転移、あるいはそれらの何らかの組み合わせを弱めるか又は遅らせることを意味する場合がある。腫瘍の場合、「治療」には、腫瘍の全部又は一部の除去、腫瘍の成長と転移の抑制又は遅延、腫瘍の発生の予防又は遅延、又はそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、望ましい治療レジメンに従って投与された場合、合理的な利益/リスク比に見合った、いくつかの望ましい治療効果を生み出すのに効果的である、活性化合物の量、又は活性化合物を含むことからの材料、組成物又は投与量に関係する。例えば、「有効量」は、標的抗原関連疾患又は状態の治療に関連して使用される場合、前記疾患又は状態を治療するのに有効な量又は濃度の抗体又はその抗原結合部分を指す。
本明細書で使用される「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」又は「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、哺乳動物の特定の病状に関連して、疾患の発症を予防又は遅延させること、あるいはその臨床的又は無症状の症状の発現を予防することを指す。
本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、ビークル、希釈剤、賦形剤及び／又はそれらの塩が、製剤中の他の成分と化学的及び／又は物理的に適合性であり、受容体と生理学的に適合性であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤」という用語は、対象及び活性剤と薬理学的及び／又は生理学的に適合性のある担体及び／又は賦形剤を指し、これは当技術分野でよく知られており（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照のこと）、そしてｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度増強剤を含むが、但しそれらだけには限定されない。例えば、ｐＨ調整剤は、リン酸緩衝液を含むが、これに限定されず；界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０を含むが、これらに限定されず；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、非特異的免疫増強剤を指し、これは、抗原と一緒に生物に送達されるか、又は事前に生物に送達される場合、抗原に対する免疫応答を増強するか、又は生物の免疫応答のタイプを変えることができる。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、コリンバクテリウムパルバム、リポ多糖、サイトカインなどを含む様々なアジュバントが存在するが、これらだけには限定されない。フロイントアジュバントは、現在動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験でより一般的に使用される。
I. 抗ＣＤ４７抗体
いくつかの側面において、本開示は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合部分を含む。
本出願の文脈では、「抗体」は以下を含み得る：ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、イントラボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、ムテイン及びその変異体を含む;及びＦｃ融合及び他の修飾を含むそれらの誘導体、並びにＣＤ４７との優先的な結合または結合を示す限り、他の免疫反応性分子。さらに、文脈上の制約によって別段の指示がない限り、この用語は、すべてのクラスの抗体（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）及び全てのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）をさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。より好ましい実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、XenoMouse（登録商標））又はそれらのいくつかの組み合わせを含む、当技術分野で知られている多種多様な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ及び、以下でより詳細に説明されているような技術的に認められた生化学的及び遺伝子工学的技術を使用して産生することができる：An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1st ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1st ed. 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)（それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。選択された結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその産生を改善するため、インビボでのその免疫原性を低下させるため、多重特異性を作製するためにさらに変更され得る、そして改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示の抗体であることを理解されるべきである。いくつかの実施形態において、抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用することによって調製される。ハイブリドーマの生成は当技術分野でよく知られている。例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと。
抗ＣＤ４７抗体の特性
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性のうちの１つ又は複数を有する：
（a）可溶性タンパク質として、又は細胞表面上に発現する、ヒトＣＤ４７及びカニクイザルＣＤ４７に特異的に結合する性質；
（b）ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を８５％以上の阻害率でブロックする性質；
（c）赤血球（ＲＢＣ）への弱い結合であり、そしてヒトＲＢＣの赤血球凝集を誘発しない性質；
（d）ヒトＲＢＣの食作用が減少した腫瘍細胞のマクロファージ媒介食作用を誘導する性質；
（e）腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性が弱いか、まったくないことを誘発する性質；
（f）良好な熱安定性を有し、ヒト血清中で安定している性質；
（g）動物腫瘍モデルにおいてインビボで強力な腫瘍増殖阻害を誘導する性質;及び（h）他の抗腫瘍分子、特にパニツムマブと組み合わせて投与した場合に相乗効果を示す性質。
ＣＤ４７への特異的結合
本開示の抗体は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ４７の両方に高い親和性で結合する。本開示の抗体のＣＤ４７への結合は、当技術分野で十分に確立された１つ又は複数の技術、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して評価され得る。本開示の抗体の結合特異性はまた、CD47タンパク質を発現する細胞への抗体の結合をモニターすることによって、例えば、フローサイトメトリーによって決定され得る。例えば、抗体は、抗体が、細胞表面にＣＤ４７を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ又はＣＨＯＫ１細胞などのヒトＣＤ４７を発現する細胞株と反応するフローサイトメトリーアッセイによって試験され得る。さらに、又は代わりに、結合速度論（例えば、Ｋｄ値）を含む抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験され得る。さらに他の適切な結合アッセイには、例えば組換えＣＤ４７タンパク質を使用するＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定される場合、０．１ｎＭ以下、０．０９ｎＭ以下、０．０８ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０５ ｎＭ以下、又はより好ましくは０．０４ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＣＤ４７に結合する。特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＳＰＲによって決定される場合、１ｘ１０－９Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合し、５ｘ１０－１０Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合し、１ｘ１０－１０Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合し、５ｘ１０－１１Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合し、４ｘ１０－１１Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合し、又はより好ましくは、３ｘ１０－１１Ｍ又はそれ以下のＫＤでヒトＣＤ４７に結合する。
ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合のブロック
主にマクロファージの表面に発現するシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα、ＣＤ１７２aとしても知られる）は、ＣＤ４７の受容体である。本開示の抗体は、例えば、ＣＤ４７のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）への結合を、調節、例えば、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、又はその他の方法で妨害することができる。ＣＤ４７はＳＩＲＰαと相互作用することが知られているため、免疫監視から逃れることができる。ＣD47-SIRPα相互作用の遮断、例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ４７抗体を使用することは、免疫回避を改善又は克服する可能性がある。
実施例に示されているように、本明細書に記載の抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を効果的に遮断し得る。本開示では、阻害率は、抗ＣＤ４７抗体を含むブロッキングサンプルとリガンドのみのサンプルのＯＤ４５０値を比較することによって得ることができる。阻害率が高いほど、ブロッキング能力が高くなる。例えば、阻害率は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％であり得る、すなわち、抗ＣＤ４７抗体は、本明細書に開示されるような抗ＣＤ４７抗体の非存在下で、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％を遮断し得る。
ヒト赤血球（ＲＢＣ）への弱い結合、及びＲＢＣの赤血球凝集の回避
特にＲＢＣでのＣＤ４７の遍在的な発現は、抗ＣＤ４７抗体療法の使用を制限する。多くの抗ＣＤ４７抗体がヒト赤血球の赤血球凝集を引き起こすことが報告されている。前臨床試験では、一過性溶血性貧血は、ＲＢＣクリアランスの上昇による抗ＣＤ４７療法と関連していた。
驚くべきことに、本開示の抗体は、ヒト赤血球に弱く結合するだけであり、赤血球凝集の望ましくない影響を回避する。実施例のＦＡＣＳアッセイに示されるように、本明細書に開示される抗体のＩＣ ５０値及び最大ＭＦＩ値は、ベンチマーク抗ＣＤ４７抗体と比較して、赤血球への有意に低い結合を示した。さらに、本明細書の抗体または抗原結合部分は、ベンチマーク抗ＣＤ４７抗体よりも有意に少ないヒトＲＢＣの赤血球凝集を引き起こす可能性があり、例えば、ベンチマークの抗ＣＤ４７抗体と比較して、ヒトＲＢＣの赤血球凝集反応を９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下引き起こす。表２に示されるように、例示的なベンチマーク抗体には、ＢＭＫ１、ＢＭＫ２及びＢＭＫ４抗体が含まれる。
さらに、実施例に示されるように、本明細書のカニクイザルへの抗体の投与は、軽度かつ一過性の用量依存性貧血のみを引き起こし、これは、短期間に正常なベースラインレベルに自発的に回復する可能性がある。
腫瘍細胞の強力なマクロファージ媒介食作用の誘導
ＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合する場合、ＳＩＲＰαの細胞内免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）がリン酸化され、ＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２などのチロシンホスファターゼが動員されて活性化される。次に、リンタンパク質基質が脱リン酸化され、下流のシグナル伝達経路に影響を及ぼし、「私を食べないで（don’t eat me）」というシグナルを伝達して、マクロファージの食作用能力を阻害する。蓄積された証拠は、ＣＤ４７が免疫攻撃を回避するために多くの悪性腫瘍でアップレギュレーションされたことを示しており、その過剰発現は予後不良と相関していた。さらに、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの連結を中断すると、腫瘍細胞がさまざまな悪性腫瘍のマクロファージによって貪食されるようになる。
本開示の抗体は、腫瘍細胞の強力な食作用を誘導することができる。本明細書に開示されるように、腫瘍細胞は、血液癌又は固形腫瘍からの腫瘍細胞を含む、多種多様な腫瘍細胞を包含する。血液癌は以下から選択され得る：例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ－ＡＬＬ、Ｂ－ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫; Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＳＬＬ、ＣＮＳリンパ腫、リヒター症候群、多発性骨髄腫、及び免疫芽球性大細胞リンパ腫。固形腫瘍は、例えば、以下から選択され得る：肺、膵臓、乳房、肝臓、卵巣、睾丸、腎臓、膀胱、脳、子宮頸部、結腸/直腸、胃腸管、皮膚、前立腺、及び胃などの癌。
ＤＣＣ又はＣＤＣ活性の仲介
上記のように、「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞毒性細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージなど）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇがこれらの細胞毒性エフェクター細胞の抗原担持標的細胞への特異的結合を可能にし、そして続いて細胞毒素で標的細胞を殺す、細胞毒性の形態を指す。「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。
本開示の抗体は、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（急性リンパ芽球性白血病）細胞又はＲａｊｉ細胞などの腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を媒介しないことが本発明者らによって見出されている。
血清における安定性
安定性は、特に治療に使用される場合、抗体の重要な特性でもある。本開示の抗体は、ヒト血清中で少なくとも１４日間安定であることが本発明者らによって見出されている。
強力な腫瘍増殖阻害の誘導
腫瘍増殖阻害の評価は、いくつかのパラメータ、例えば体重の変化、腫瘍の体積、腫瘍の成長と相関するライブイメージング値、動物の生存時間などを測定することによって実施され得る。実施例に示されるように、本明細書に開示される抗体は、異なる腫瘍モデルにおいて有意な腫瘍増殖阻害を達成することができた。
相乗効果
驚くべきことに、本開示の抗体は、他の抗腫瘍分子、特にパニツムマブと組み合わせて投与された場合に相乗効果を示す。本開示は、ＮＣＧのＨＴ－２９結腸直腸腺癌モデルにおいて、リード抗体Ｗ３４５５とパニツムマブの組み合わせの投与が、Ｗ３４５５又はパニツムマブ単独と比較して有意に優れた腫瘍増殖阻害を達成したことを示した（図１８及び１９に示されるように）。
抗ＣＤ４７抗体のＣＤＲ
いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
Ａ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＨ鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）：
（i）配列番号１を含むＨＣＤＲ１;
（ii）配列番号２を含むＨＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号３を含むＨＣＤＲ３；
Ｂ）以下から成る群から選択された１つ又は複数のＬ鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）：
（i）配列番号４を含むＬＣＤＲ１;
（ii）配列番号５を含むＬＣＤＲ２;及び
（iii）配列番号６を含むＬＣＤＲ３；又は
Ｃ）Ａ）の1つ又は複数のＨＣＤＲ及びＢ）の1つ又は複数のＬＣＤＲ。
抗体配列中の可変領域及びＣＤＲは、当技術分野で開発された一般的な規則（例えば、Ｋａｂａｔ番号ずけシステムなど）に従って、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることによって同定され得る。これらの領域を同定する方法は以下に記載される：Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 及びDinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000。抗体配列の例示的なデータベースは、Retter et al., Nucl. Acids Res., 33 (Database issue): D671 -D674 (2005)に記載されるように、「Abysis」ウェブサイト（www.bioinf.org.uk/abs）(the Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, EnglandのA.C. Martinにより維持されている)及びVBASE2ウェブサイト（www.vbase2.org）に記載されており、そしてこれらからアクセスすることができる。配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合するＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して分析することが好ましい。Dr. Andrew C. R. Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547, the website bioinforg.uk/abs上でも入手可能)を参照のこと。ＡｂｙｓｉｓデータベースのＷｅｂサイトには、ここでの説明に従って使用できるＣＤＲを識別するために開発された一般的なルールがさらに含まれている。特に明記されていない限り、ここに記載されているすべてのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って導出されている。
いくつかの特定の実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そしてここで、
（a）ＶＨは以下を含む：配列番号１に記載のＨＣＤＲ１; 配列番号２に記載のＨＣＤＲ２；及び 配列番号３に記載のＨＣＤＲ３;及び
（b）ＶＬは以下を含む：配列番号４に記載のＬＣＤＲ１; 配列番号５に記載のＬＣＤＲ２;及び 配列番号６に記載のＬＣＤＲ３。
抗ＣＤ４７抗体の可変領域
いくつかの実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、以下を含む：
（Ａ）以下を含むＨ鎖可変領域：
（i）配列番号７のアミノ酸配列;
（ii）配列番号７と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列; 又は
（iii）配列番号７と比較して1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換を伴うアミノ酸配列；及び/又は
（Ｂ）以下を含むＬ鎖可変領域：
（i）配列番号８のアミノ酸配列;
（ii）配列番号８と少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列; 又は
（iii）配列番号８と比較して1つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失及び/又は置換を伴うアミノ酸配列。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残差表、 １２のギャップ長ペナルティ及び ４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップの重み、及び１、２、３、４、５、又は６の長さの重みを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムによって決定され得る。
さらに又は一方では、本開示のタンパク質配列は、例えば、関連する配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実行するための「query配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝ ５０、語長＝ ３を用いて実行されて、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較のためにギャップのあるアライメントを取得するには、ギャップのあるＢＬＡＳＴを、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように利用できる。ＢＬＡＳＴ及びギャップのあるＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
いくつかの特定の実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分のＨ鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列から成り、そして単離された抗体又はその抗原結合部分のＬ鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列から成る。
他の実施形態において、Ｈ鎖可変領域及び／又はＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
いくつかのさらなる実施形態において、単離された抗体又はその抗原結合部分は、Ｈ鎖及び／又はＬ鎖の可変領域におけるアミノ酸の保存的置換又は修飾を含み得る。当技術分野では、抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾を行うことができることが理解されている。例えば、以下を参照のこと：Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864- 26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O’ Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 及び Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43。
上記のように、本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利に影響を与えたり変更したりしないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ介在変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に対して、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的又は機能的に類似の残基（例えば、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む、類似するサイズ、形状、電荷、化学的性質などを有する）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換を含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。それらのファミリーは、以下を含む：アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（スレオニンなど、 バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を同定するための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれる以下を参照のこと：Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)）。
Fc領域
好ましくは、本明細書に開示される抗体のＦｃ領域は、野生型ヒトＦｃ領域又はその変異体などのヒトＦｃ領域である。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４を含むが、それらに限定されない任意のアイソタイプであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４アイソタイプのものである。
Ｆｃ領域変異体は、所望の機能を変更することなく、野生型Ｆｃ領域と比較して、１つ又は複数のアミノ酸変更（例えば、挿入、欠失、又は置換）を含み得る。例えば、本開示は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の改変された結合相互作用（例えば、増強又は減少）を有し得る改変されたＦｃ領域をもたらすＦｃ領域における１つ又は複数の改変を含む抗体を含む。Ｆｃ修飾の非限定的な例には、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸配列の２２８位でのセリン（「Ｓ」）からプロリン（「Ｐ」）への突然変異も含まれる。 Ｓ２２８Ｐ変異は、ＩｇＧ４分子のコアヒンジのジスルフィドを安定化することによってＦａｂアーム交換を低減し、従って、半抗体形成の防止に役立つＩｇＧ４安定化変異に属する。
II． 抗ＣＤ４７抗体をコードする核酸分子
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような単離された抗体のＨ鎖可変領域及び／又はＬ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマによって発現される抗体（例えば、以下でさらに説明するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）について、ハイブリドーマによって作製された抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体の場合、そのような抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。
ＶＨ領域をコードする単離された核酸は、ＶＨをコードする核酸を、Ｈ鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能的に連結することによって、全長Ｈ鎖遺伝子に変換することができる。ヒトＨ鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、上記のKabat et al. (1991)を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。Ｈ鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、より好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。
ＶＬ領域をコードする単離された核酸は、ＶＬをコードするＤＮＡをＬ鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能的に連結することにより、全長Ｌ鎖遺伝子（及びＦａｂＬ鎖遺伝子）に変換することができる。ヒトＬ鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、上記のKabat et al.を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態において、Ｌ鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得る。
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが取得されると、これらのＤＮＡフラグメントは、標準の組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子に変換できる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域や柔軟なリンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに機能的に連結される。この文脈で使用される「作動可能的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にあるように２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することを意図する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような単離された抗体のＨ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。
いくつかの特定の実施形態において、単離された核酸分子は、単離された抗体のＨ鎖可変領域をコードし、そして以下からなる群から選択される核酸配列を含む：
（Ａ）配列番号７に記載のＨ鎖可変領域をコードする核酸配列;
（Ｂ）配列番号９に記載の核酸配列; 又は
（Ｃ）高緊縮条件下で（Ａ）又は（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるような単離された抗体のＬ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子に関する。
いくつかの特定の実施形態において、単離された核酸分子は、単離された抗体のＬ鎖可変領域をコードし、そして以下からなる群から選択される核酸配列を含む：
（Ａ）配列番号８に記載のＬ鎖可変領域をコードする核酸配列;
（Ｂ）配列番号１０に記載の核酸配列; 又は
（Ｃ）高緊縮条件下で（Ａ）又は（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列。
例えば、核酸分子は、配列番号９又は１０から成る。あるいは、核酸分子は、配列番号９又は１０に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６ ％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を共有する。いくつかの特定の実施形態では、同一性のパーセンテージは、遺伝コードの縮退に由来し、コードされたタンパク質配列は変化しないままである。
例示的な高緊縮性条件には、５Ｘ ＳＳＰＥ及び４５％ホルムアミド中での４５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１ＸＳＳＣ中での６５℃での最終洗浄が含まれる。当技術分野では、同等の緊縮性条件は、温度及び緩衝液の変化、又は以下に記載されている塩濃度によって達成できることが理解されている：Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10。ハイブリダイゼーション条件の変更は、プローブの長さ及びグアノシン/シトシン（ＧＣ）塩基対のパーセンテージに基づいて、経験的に決定又は正確に計算できる。ハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, et al, (Eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51に記載されるようにして、計算され得る。
III． 宿主細胞
本開示で開示される宿主細胞は、本開示の抗体を発現するのに適した任意の細胞、例えば、哺乳動物細胞であり得る。本開示の抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、以下を含む：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220に記載されるｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用するための別の発現システムは、国際公開第８７/０４４６２号、国際公開第８９/０１０３６号及び欧州特許第３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現システムである。抗体をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又は宿主細胞が増殖する培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収できる。
ＩＶ． 医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示されるような少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
組成物の成分
医薬組成物は、任意には、別の抗体又は薬物などの１つ又は複数の追加の医薬活性成分を含み得る。本開示の医薬組成物はまた、例えば、別の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、又はワクチンとの併用療法で投与することができ、その結果、抗ＣＤ４７抗体がワクチンに対する免疫応答を増強する。医薬的に許容される担体は、医薬上許容される液体、ゲル又は固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁/分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤 又は無毒の補助物質、他の当技術分野で知られている成分又はそれ以上の様々な組み合わせを含む。
適切な成分には、例えば、抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、防腐剤、潤滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤、又は糖及びシクロデキストリンなどの安定剤が含まれ得る。適切な抗酸化剤には、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及び/又はプロピルガラクテが含まれ得る。本開示に開示されるように、本開示の抗体又は抗原結合フラグメントを含む溶媒において、組成物は、メチオニンなどの１つ又は複数の抗酸化剤を含み、還元抗体又はその抗原結合フラグメントは酸化され得る。酸化還元は、結合親和性の低下を防止又は低減し、それによって抗体の安定性を高め、貯蔵寿命を延ばすことができる。従って、いくつかの実施形態において、本開示は、１つ又は複数の抗体又はその抗原結合フラグメントと、メチオニンなどの１つ又は複数の抗酸化剤とを含む組成物を提供する。本開示はさらに、抗体又はその抗原結合フラグメントをメチオニンなどの１つ又は複数の抗酸化剤と混合して、抗体又はその抗原結合フラグメントの酸化を防止して、それらの貯蔵寿命を伸長させそして/又は活性の増加させることができる、様々な方法を提供する。
さらに説明するために、医薬的に許容される担体は、以下を含む：例えば水性ビークル、例えば塩化ナトリウム注射、リンガー注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、又はデキストロース及び乳酸リンガー注射、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、又はピーナッツ油などの非水性ビークル、静菌又は静真菌濃度の抗菌剤、等張剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース、緩衝液、例えばリン酸塩またはクエン酸塩緩衝液、抗酸化剤、例えば硫酸水素ナトリウム、局所麻酔薬、例えばプロカイン塩酸塩、懸濁剤及び分散剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はポリビニルピロリドン、乳化剤、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）、金属イオン封鎖剤又はキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む複数回投与容器内の医薬組成物に添加され得る。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールが含まれ得る。適切な非毒性補助物質には、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増強剤、又は酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、又はシクロデキストリンなどの薬剤が含まれ得る。
投与、製剤および投与量
本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、皮下、及び髄腔内を含むがこれらに限定されない様々な経路によって、又は移植又は吸入によって、それを必要とする対象にインビボで投与され得る。対象組成物は、以下の調製物に処方することができる：固体、半固体、液体、又は気体の形態；錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、浣腸、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルを含みますが、これらに限定されない。適切な製剤及び投与経路は、意図される用途及び治療レジメンに従って選択することができる。
経腸投与に適した製剤は、ハード又はソフトゼラチンカプセル、ピル、錠剤（コーティング錠、エリキシル剤、懸濁液、シロップ又は吸入剤を含む）、及びそれらの制御された放出形態を含む。
非経口投与（例えば、注射による）に適した製剤は、活性成分が溶解、懸濁、又は他の方法で提供される（例えば、リポソーム又は他の微粒子中）、水性又は非水性、等張性、発熱物質を含まない、滅菌液体（例えば、溶液、懸濁液）を含む。そのような液体は、他の医薬的に許容される成分、例えば抗酸化剤、緩衝液、防腐剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、及び目的のレシピエントの血液（又は他の関連する体液）と製剤を等張にする溶質をさらに含み得る。賦形剤の例には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが含まれる。このような製剤に使用するのに適した等張担体の例には、塩化ナトリウム注射、リンゲル液、又は乳酸リンガー注射が含まれる。同様に、用量、タイミング、及び反復を含む特定の投与計画は、特定の個人及びその個人の病歴、並びに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス率など）などの経験的考慮事項に依存する。
投与の頻度は、治療の過程で決定及び調整することができ、そして増殖性又は腫瘍形成性細胞の数の減少、そのような腫瘍性細胞の減少の維持、腫瘍性細胞の増殖の減少、又は転移の発生の遅延に基づく。いくつかの実施形態において、投与される投薬量は、潜在的な副作用及び／又は毒性を管理するために調整又は減弱され得る。あるいは、対象の治療用組成物の徐放性製剤が適切であり得る。
適切な投与量は患者ごとに異なり得ることが当業者によって理解されるであろう。最適な投与量を決定することは、一般的に、リスク又は有害な副作用に対する治療効果のレベルのバランスをとることを含む。選択される投与量レベルは、以下を含むがこれらに限定されない様々な要因に依存する：特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び/又は材料、状態の重症度、及び患者の種、性別、年齢、体重、状態、一般的な健康状態、及び以前の病歴。化合物の量及び投与経路は、最終的には医師、獣医、または臨床医の裁量に委ねられるが、一般的に、投与量は、実質的な有害又は有害な副作用を引き起こすことなく、所望の効果を達成する作用部位での局所濃度を達成するように選択されるであろう。
一般的に、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、様々な範囲で投与することができる。これらは、以下を含む：１用量当たり約５μｇ/ｋｇ体重～約１００ｍｇ/ｋｇ体重；１用量当たり約５０μｇ/ｋｇ体重～約５ｍｇ/ｋｇ体重；１用量当たり約１００μｇ/ｋｇ体重～約１０ｍｇ/ｋｇ体重。他の範囲は、１用量当たり約１００μｇ/ｋｇ体重～約２０ｍｇ/ｋｇ体重、及び１用量当たり約０．５ｍｇ/ｋｇ体重～約２００ｍｇ/ｋｇ体重を含む。特定の実施形態では、投与量は、少なくとも約１００μｇ/ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ/ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ/ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ/ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ/ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ/ｋｇ体重である。
いずれにせよ、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは、それを必要とする対象に必要に応じて投与される。投与頻度の決定は、治療されている状態、治療されている対象の年齢、治療されている状態の重症度、治療されている対象の一般的な健康状態などの考慮に基基づいて、主治医などの当業者によって行うことができる。
特定の好ましい実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合部分を含む治療の過程は、数週間又は数ヶ月の期間にわたって選択された医薬品の複数回投与を含むであろう。より具体的には、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、１日１回、２日ごと、４日ごと、毎週、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、毎月、 ６週間ごと、２か月ごと、１０週間ごと、又は３か月ごとに投与され得る。これに関して、投与量を変更するか、又は間隔を患者の反応及び臨床診療に基づいて調整することができることが理解されるであろう。
投薬量及びレジメンはまた、１回又は複数回の投与を受けた個体における開示された治療用組成物について経験的に決定され得る。例えば、個人は、本明細書に記載されるように生成された治療用組成物の漸増投与量を与えられ得る。選択された実施形態において、投薬量は、経験的に決定又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加又は減少又は減弱され得る。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを前述のように追跡することができる。癌の場合、それらは、以下を含む：触診または視覚的観察による腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線又は他の画像技術による腫瘍サイズの間接測定；直接腫瘍生検及び腫瘍サンプルの顕微鏡検査によって評価される改善；接腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌のPSA）又は本明細書に記載の方法に従って同定された腫瘍形成性抗原の測定、疼痛または麻痺の減少；腫瘍に関連する発話、視力、呼吸又はその他の障害の改善; 食欲増進;又は受け入れられたテストまたは生存期間の延長によって測定される生活の質の向上。投与量は、個人、腫瘍性状態のタイプ、腫瘍性状態の段階、腫瘍性状態が個人の他の場所に転移し始めたかどうか、及び使用されている過去および同時治療によって異なることは、当業者に明らかになるであろう。
非経口投与（例えば、静脈内注射）のための適合性のある製剤は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分を、約１０μｇ/ｍｌ～約１００ｍｇ/ｍｌの濃度で含む。特定の選択された実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の濃度は、以下を含むであろう：２０μｇ/ｍｌ、４０μｇ/ｍｌ、６０μｇ/ｍｌ、８０μｇ/ｍｌ、１００μｇ/ｍｌ、２００μｇ/ｍｌ、３００μｇ/ｍｌ、４００μｇ/ｍｌ、５００μｇ/ｍｌ、６００μｇ/ｍｌ、７００μｇ/ｍｌ、８００μｇ/ｍｌ、９００μｇ/ｍｌ又は１ｍｇ/ｍｌ。他の好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合部分の濃度は、以下を含むであろう：２ｍｇ/ｍｌ、３ ｍｇ/ｍｌ、４ ｍｇ/ｍｌ、５ｍｇ/ｍｌ、６ｍｇ/ｍｌ、８ ｍｇ/ｍｌ、１０ ｍｇ/ｍｌ、１２ ｍｇ/ｍｌ、１４ ｍｇ/ｍｌ、１６ ｍｇ/ｍｌ、 １８ ｍｇ/ｍｌ、２０ ｍｇ/ｍｌ、２５ ｍｇ/ｍｌ、３０ ｍｇ/ｍｌ、３５ ｍｇ/ｍｌ、４０ ｍｇ/ｍｌ、４５ ｍｇ/ｍｌ、５０ ｍｇ/ｍｌ、６０ ｍｇ/ｍｌ、７０ ｍｇ/ｍｌ、 ８０ ｍｇ/ｍｌ、９０ ｍｇ/ｍｌ又は１００ｍｇ/ｍｌ。
Ｖ. 用途/適応症
本開示の抗体、抗体組成物及び方法は、例えば、ＣＤ４７の検出又は免疫応答の増強を含む多数のインビトロ及びインビボでの有用性を有する。例えば、それらの分子は、インビトロ又はエクスビボでの培養中の細胞、又は例えば、インビボでのヒト対象に投与して、様々な状況で免疫を増強することができる。免疫応答は、例えば、増強、刺激、又はアップレギュレーションすることができる。
例えば、対象には、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が含まれる。この方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫応答）を増強することによって治療することができる障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。特定の実施形態では、この方法は、インビボでの癌の治療に特に適している。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＣＤ４７抗体を目的の抗原と一緒に投与することができるか、又は抗原が治療される対象（例えば、腫瘍を有する又はウイルスを有する対象）にすでに存在し得る。ＣＤ４７に対する抗体を別の薬剤と一緒に投与する場合、２つは順番に又は同時に投与することができる。
本開示はさらに、サンプル中のヒトＣＤ４７抗原の存在を検出するための方法、又はサンプル及び対照サンプルを、抗体又はその一部とヒトＣＤ４７との間の複合体の形成を可能にする条件下で、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含む、ヒトＣＤ４７抗原の量を測定するための方法を提供する。次に、複合体の形成が検出され、対照サンプルと比較したサンプル間の複合体形成の違いは、サンプル中のヒトＣＤ４７抗原の存在を示している。さらに、本開示の抗ＣＤ４７抗体を使用して、免疫親和性精製を介してヒトＣＤ４７を精製することができる。
癌を含む障害の治療
いくつかの側面において、本開示は、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に治療有効量の本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、哺乳動物の障害又は疾患を治療する方法を提供する。障害又は疾患は、増殖性障害（癌など）を含むがこれに限定されない。例えば、障害は癌である可能性がある。
悪性であろうと良性であろうと、原発性であろうと続発性であろうと、様々な癌は、本開示によって提供される方法で治療又は予防され得る。癌は固形癌又は血液悪性腫瘍である可能性がある。そのような癌の例は、以下を含む：気管支原性癌などの肺癌（例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、および腺癌）、肺胞細胞癌、気管支腺腫、軟骨腫性過誤腫（非癌性）、および肉腫（癌性）; 粘液腫、線維腫、横紋筋腫などの心臓癌；骨軟骨腫、コンドロマ、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、骨様骨腫、巨細胞腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、及び網状細胞肉腫などの骨癌; 神経膠腫（例：多形性膠芽腫）、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、髄芽細胞腫、脊索腫、神経鞘腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、生殖腺腫、類皮腫、松果体腫瘍、骨腫、血管芽細胞腫、頭蓋腫、頭蓋腫、 及び血管腫などの脳癌; 膀胱がん；結腸癌、平滑筋肉腫、類表皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、胃腺癌、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸のポリープ、及び結腸直腸癌などの消化器系の癌；肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞癌、線維層状癌、胆管癌、肝芽腫、及び血管肉腫などの肝癌; 腎腺癌、腎細胞癌、高腎腫、および腎骨盤の移行上皮癌などの腎癌; 膀胱癌; 急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性（骨髄球性、骨髄性、骨髄芽球、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例：セザリー症候群及び有毛細胞白血病）、 慢性骨髄性（骨髄性、骨髄性、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、真菌性真菌症、及び骨髄増殖性疾患（多発性赤血球血症、骨髄線維症、血栓性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患を含む）などの血液癌；基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、及びパジェット病などの皮膚癌；頭頸部癌; 網膜芽細胞腫及び眼内黒色腫などの眼関連の癌; 良性前立腺過形成、前立腺癌、及び精巣癌（例えば、セミノーマ、奇形腫、胚性癌、及び絨毛癌）などの男性生殖器系癌; 乳癌; 子宮癌（子宮内膜癌）、子宮頸癌（子宮頸癌）、卵巣癌（卵巣癌）、外陰部癌、膣癌、ファロピウス管癌、及び包虫様ほくろなどの女性生殖器癌；甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌、退形成癌、又は髄様癌を含む）; 褐色細胞腫（副腎）; 副甲状腺の非癌性増殖; 膵臓癌;及び白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、及びホジキンリンパ腫などの血液癌。いくつかの特定の実施形態では、癌は結腸癌である。
いくつかの実施形態では、癌の例は、以下を含むが、これらに限定されない：Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）; 小さなリンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ; 中等度/濾胞性NHL; 中級のびまん性ＮＨＬ; 高品位免疫芽細胞ＮＨＬ; 高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ; 高品位の小さな非切断細胞ＮＨＬ;巨大病変ＮＨＬ; マントル細胞リンパ腫; エイズ関連リンパ腫; ワルデンストレームマクログロブリン血症; 慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）; 急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）; 有毛細胞白血病; 慢性骨髄芽球性白血病; 及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに食作用、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、Ｂ細胞増殖性疾患、及びメグズ症候群に関連する異常な血管増殖。より具体的な例は、以下を含むが、それらだけには限定されない：再発又は難治性ＮＨＬ、最前線の低悪性度NHL、ステージＩＩＩ / ＩＶ ＮＨＬ、化学療法抵抗性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病及び/又はリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び/又は前リンパ球性白血病及び/又は小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫及び/又はリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、節外辺縁帯－ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞腫及び/又は形質細胞骨髄腫、低悪性度/濾胞性リンパ腫、中等度/濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中等度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、侵襲性ＮＨＬ（積極的な最前線ＮＨＬ及び積極的な再発ＮＨＬを含む）、自家幹細胞移植後に再発又は難治性のＮＨＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度の小さな非切断細胞ＮＨＬ、かさばる疾患ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（末梢）大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び/又はセザリー症候群、皮膚（皮膚）リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫。
いくつかの実施形態では、癌の例は、さらに以下を含むが、これらに限定されない：Ｂ細胞増殖性障害、例えばリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））及びリンパ性白血病。そのようなリンパ腫及びリンパ性白血病は、以下を含む：例えば、a）濾胞性リンパ腫、b）小非劈開細胞リンパ腫/バーキットリンパ腫（風土病バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫を含む）、c）辺縁帯リンパ腫（節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫および脾辺縁帯リンパ腫を含む）、d）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、e）大細胞リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫-肺Ｂ細胞リンパ腫を含む）、f）毛状細胞白血病、g ）リンパ球性リンパ腫、ウォルデンストロムのマクログロブリン血症、h）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）/小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、i）形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、及び/又はj）ホジキン病 。
他のいくつかの実施形態では、障害は自己免疫疾患である。抗体又はその抗原結合部分で治療することができる自己免疫疾患の例は、自己免疫性脳脊髄炎、エリテマトーデス、及び関節リウマチを含む。抗体又はその抗原結合部分はまた、感染症、炎症性疾患（アレルギー性喘息など）、及び慢性移植片対宿主病を治療又は予防するために使用され得る。
免疫応答の刺激
いくつかの側面において、本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合部分を、対象の免疫応答が強化されるように対象に投与することを含む、対象における免疫応答を増強する（例えば、刺激する）方法を提供する。例えば、対象は哺乳類である。いくつかの特定の実施形態では、対象はヒトである。
「免疫応答を強化する」という用語又はその文法上のバリエーションは、哺乳類の免疫系の応答を刺激、誘発、増加、改善、又は増強することを意味する。免疫応答は、細胞性応答（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介などの細胞媒介性）又は体液性応答（すなわち、抗体媒介性応答）であり得、一次又は二次免疫応答であり得る。免疫応答の増強の例には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性の増加及び細胞溶解性T細胞の生成が含まれる。免疫応答の増強は、それらに限定されないが、当業者に知られている以下の多くのインビトロ又はインビボ測定を使用して評価され得る：細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えば、ＩＬ－２産生またはＩＦＮ－γ産生）、腫瘍の退縮、担癌動物の生存、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞毒性。典型的には、本開示の方法は、未処理の哺乳動物又は本明細書に開示される方法を使用して処理されていない哺乳動物による免疫応答と比較した場合、哺乳動物による免疫応答を増強する。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、微生物病原体（ウイルスなど）に対するヒトの免疫応答を増強するために使用される。別の実施形態において、抗体又はその抗原結合部分は、ワクチンに対するヒトの免疫応答を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞性免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞応答を増強する。別の実施形態において、細胞性免疫応答は、Ｔヘルパー細胞応答である。さらに別の実施形態では、免疫応答は、サイトカイン産生、特にＩＦＮ－γ産生又はＩＬ－２産生である。抗体又はその抗原結合部分は、微生物病原体（ウイルスなど）又はワクチンに対するヒトの免疫応答を増強するために使用することができる。
抗体又はその抗原結合部分は、単剤療法として単独で使用することができ、又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて使用することができる。
化学療法との併用
抗体又はその抗原結合部分は、抗癌剤、細胞毒性剤又は化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
「抗癌剤」又は「抗増殖剤」という用語は、癌などの細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を意味し、そして以下を含むが、それらに限定されない：細胞毒性薬、細胞静止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的抗癌剤、ＢＲＭ、治療用抗体、癌ワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤、及び免疫療法剤。上記のように選択された実施形態において、そのような抗癌剤は、コンジュゲートを含み得、そして投与前に開示された部位特異的抗体と結合され得ることが理解されるであろう。より具体的には、特定の実施形態において、選択された抗癌剤は、操作された抗体の対になっていないシステインに連結されて、本明細書に記載されるように操作されたコンジュゲートを提供する。従って、そのような操作されたコンジュゲートは、本開示の範囲内にあると明確に企図される。他の実施形態において、開示された抗癌剤は、上記のような異なる治療薬を含む部位特異的コンジュゲートと組み合わせて与えられるであろう。
本明細書で使用される場合、「細胞毒性剤」という用語は、細胞に対して毒性があり、細胞の機能を低下または阻害する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。特定の実施形態では、前記物質は、生物に由来する天然に存在する分子である。細胞毒性剤の例は、以下を含むが、それらに限定されない：以下の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素：細菌（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌（例えば、α－サルシン、リストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、大麦毒素、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolacca mericanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、 モモルディカチャランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン）、又は動物（例えば、細胞毒性ＲＮａｓｅ、例えば細胞外膵臓ＲＮａｓｅ; ＤＮａｓｅ Ｉ、それらの断片及び/又は変異体を含む）。
本開示の目的のために、「化学療法剤」は、癌細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に減少又は阻害する化合物（例えば、細胞毒性剤又は細胞静止剤）を含む。このような化学薬品は、細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスに向けられることが多く、従って、一般に急速に成長及び分裂する癌性細胞に対して特に効果的である。例えば、ビンクリスチンは微小管を解重合し、細胞が有糸分裂に入るのを抑制する。一般的に、化学療法剤は、癌性細胞又は癌性になるか又は腫瘍形成性子孫（例えば、ＴＩＣ）を生成する可能性のある細胞を阻害するか、又は阻害するように設計された任意の化学剤を含むことができる。そのような薬剤は、しばしば投与され、多くの場合、組み合わせて、例えば、ＣＨＯＰ又はＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで最も効果的である。
本開示の部位特異的構築物と組み合わせて（部位特異的コンジュゲートの成分として又は非コンジュゲート状態のいずれかとして）使用され得る抗癌剤の例は、以下を含むが、それらに限定されない：アルキル化剤、アルキルスルホン酸塩、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、ロイテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンジスタチン、 ナイトロジェンマスタード、 抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、 ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン; 代謝拮抗剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎、フロリン酸などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、 エニルラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシッド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体 ）、ラゾキサン; リゾキシン; シゾフィラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジクオン; ２，２‘,２“－トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）;ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン;マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン; アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）; シクロホスファミド; チオテパ; タキソイド、クロランブシル; ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン; ６－チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; プラチナ類似体、ビンブラスチン; 白金; エトポシド（ＶＰ－１６）; イホスファミド; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン; ノバントロン; テニポシド; エダトレキサート; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロン酸; イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００; ジフルオロメチルヒロニチン; レチノイド; カペシタビン; コンブレタスタチン; ロイコボリン; オキサリプラチン; 細胞増殖を低下させるＰＫＣ－ａｌｐｈａ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する以下の抗ホルモン剤も含まれる：抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、及び抗アンドロゲン；並びにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）; アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２; ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤; ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ; ビノレルビン及びエスペラマイシン、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体。
放射線療法との併用
本開示はまた、抗体又はその抗原結合部分と放射線療法（すなわち、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子排出などの腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘発するための任意のメカニズム）との組み合わせを提供する。腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達を使用する併用療法も企図されており、開示されたコンジュゲートは、標的化された抗癌剤又は他の標的化手段と関連して使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１週間～約２週間の期間にわたってパルスで投与される。放射線療法は、頭頸部癌を患っている被験者に約６～７週間投与することができる。必要に応じて、放射線療法は、単回投与又は複数回の連続投与として投与することができる。
ＶＩ． 医薬品パック及びキット
抗体又はその抗原結合部分の1つ又は複数の用量を含む、1つ又は複数の容器を含む医薬品パック及びキットも提供される。特定の実施形態において、単位投与量は、1つ又は複数の追加の薬剤を伴うか、又は伴わない、例えば、抗体又はその抗原結合部分を含む所定量の組成物を含む単位投与量が提供される。他の実施形態では、そのような単位投与量は、注射用の使い捨てプレフィルドシリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位投与量に含まれる組成物は、生理食塩水、スクロース、リン酸塩などの緩衝液などを含み得； そして/又は安定した有効なｐＨ範囲内で処方される。あるいは、特定の実施形態では、組成物は、適切な液体、例えば、滅菌水又は生理食塩水を添加すると再構成され得る凍結乾燥粉末として提供され得る。特定の好ましい実施形態では、組成物は、スクロース及びアルギニンを含むがこれらに限定されない、タンパク質凝集を阻害する１つ又は複数の物質を含む。容器上の、又は容器に関連する任意のラベルは、封入されたコンジュゲート組成物が、選択された腫瘍性疾患状態を治療するために使用されることを示す。
本開示はまた、抗体の単回投与又は複数回投与投与単位、及び任意には、１つ又は複数の抗癌剤を製造するためのキットを提供する。キットは、容器と、容器上又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書で構成される。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得、薬学的に有効な量の開示された抗体又はその抗原結合部分を含む。他の好ましい実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを含む（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。そのようなキットは、一般的に、適切な容器内に、抗体の薬学的に許容される製剤、及び任意には、同じか、又は異なる容器内の１つ又は複数の抗癌剤を含む。キットには、診断又は併用療法のいずれかのために、他の製薬上許容される製剤も含まれている場合がある。例えば、本開示の抗体又はその抗原結合部分に加えて、そのようなキットは、広範囲の抗癌剤のいずれか1つ又は複数の剤、例えば化学療法薬又は放射線療法薬; 抗血管新生剤; 抗転移剤; 標的抗癌剤; 細胞毒性剤; 及び/又は他の抗癌剤を含み得る。
より具体的には、キットは、追加の成分の有無にかかわらず、開示された抗体又はその抗原結合部分を含む単一の容器を有し得るか、又はそれらは、各所望の薬剤のための別個の容器を有し得る。あるいは、キットの抗体及び任意の抗癌剤は、患者に投与する前に、別個の容器内で別々に維持することができる。キットはまた、無菌の医薬的に許容される緩衝液又は注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液及びデキストロース溶液などの他の希釈剤を含むための第２／第３の容器手段を含み得る。
キットの構成要素が１つ又は複数の液体溶液で提供される場合、液体溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液又は生理食塩水が特に好ましい。但し、キットの構成成分は乾燥粉末として提供される場合がある。試薬又は成分が乾燥粉末として提供される場合、適切な溶媒を添加することによって粉末を再構成することができる。溶媒はまた別の容器で提供され得ることが想定される。
上に簡単に示したように、キットはまた、抗体又はその抗原結合部分及び任意の、構成要素を患者に投与するための手段、例えば、１つ又は複数の針、Ｉ．Ｖ． バッグ又は注射器、あるいはスポイト、ピペット、又は他の同様の装置を含むことができ、そこから、製剤を動物に注射又は導入するか、又は体の患部に適用することができる。本開示のキットはまた、典型的には、バイアルなど、及び商業販売のために緊密に閉じ込められた他の構成要素を含むための手段、例えば、所望のバイアル及び他の 装置が配置され、保持されている、射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器も含むであろう。
配列表の概要
本出願に添付されるのは、リード抗体Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬ（「Ｗ３４５５抗体」とも略される）の核酸及びアミノ酸配列を含む配列リストである。次の表Ａ、Ｂ、及びＣは、含まれている配列の要約を提供している。
このように一般的に説明される本開示は、例示として提供され、本開示を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。実施例は、以下の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。
実施例1
材料、ベンチマーク抗体及び細胞株の調製
１．１ 材料の準備
実施例で使用されている市販の材料および材料コードに関する情報は、それぞれ表１及び２に示されている。
１．２ 抗原の産生
Ｆｃタグを有するヒトＣＤ４７（ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＣＢＩ）及びカニクイザルＣＤ４７（ＸＰ＿００５５４８２８９．１、ＮＣＢＩ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）遺伝子を発現ベクターにクローニングした。次に、製造元の指示（Expi293Fトランスフェクションキット、Invitrogen）に従って、プラスミドをＥＸｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターで培養し、５日間の培養後に上清を回収した。プロテインＡカラムとＳＥＣカラムを使用して抗原タンパク質を精製した。
１． ３ ベンチマーク抗体の産生
抗ＣＤ４７抗体ＢＭＫ１、ＢＭＫ２、ＢＭＫ４及びＢＭＫ８の可変領域をコードするＤＮＡ配列（参考文献［５］～［９］に開示されている表２を参照、それらは参照により本明細書全体に組み込まれる）を、別々に、ヒトＩｇＧ４の定常領域を有する発現ベクターにクローン化した。次に、製造元の指示（Expi293Fトランスフェクションキット、Invitrogen）に従って、プラスミドをＥＸｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞を３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターで培養し、５日間の培養後に上清を回収した。プロテインＡカラムとＳＥＣカラムを使用してタンパク質を精製した。
以下の例では、ベンチマーク抗体「Ｗ３４５－ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ４ＰＥ．Ｋ」、「Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰ」、「Ｗ３４５－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ４．ＳＰＫ」、及びＷ３４５－ＢＭＫ８を生成し対照として適用した。それらは、本明細書では、それぞれ、Ｗ３４５－ＢＭＫ１、Ｗ３４５－ＢＭＫ２、Ｗ３４５－ＢＭＫ４及びＢＭＫ８とも呼ばれた。
１．４ 細胞プール/ライン生成
ヒト（ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＣＢＩ）又はカニクイザルＣＤ４７（ＸＰ＿００５５４８２８９．１、ＮＣＢＩ）の全長遺伝子を、細胞株の開発のために発現ベクターにクローニングした。簡単に説明すると、７０～９０％のコンフルエントのＣＨＯ－Ｋ１細胞に、リポフェクタミン２０００試薬を使用してヒト又はサルのＣＤ４７全長プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。トランスフェクションの２４時間後、最終濃度２～１０μｇ/ｍＬのブラストサイジンを使用して安定したプールを選択した。次に、陽性プール細胞を限定希釈によりサブクローン化した。単一のクローンを選び、抗ＣＤ４７抗体を使用してＦＡＣＳで試験した。
実施例２
抗体ハイブリドーマの生成
２． １ 動物の免疫化と血清力価の検出
4匹のトランスジェニックラットをＬｉｇａｎｄから購入し、そしてＩＡＣＵＣ承認の動物施設に収容した。ヒトＣＤ４７（ＮＰ＿９４２０８８）又はマウスＣＤ４７（Ｑ６１７３５）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質及びＣＤ４７全長発現プラスミドを、毎回３０～１００μｇ/ラットで動物免疫化するための免疫原として使用した。免疫化の前後に動物から血清サンプルを収集し、標的タンパク質に対する血清力価を、一般的なＥＬＩＳＡ手順に従ってＥＬＩＳＡによって試験した。
血清力価の結果を表３に示した。電気細胞融合のために、はるかに高い血清力価を有する１＃及び２＃ラットを選択した。
２．２ ハイブリドーマの生成
動物を犠牲にし、脾臓及びリンパ節からのＢ細胞を、一般的な電気融合手順に従った電気融合によってＳＰ２/０骨髄腫細胞と融合させた。細胞融合後、細胞を、２０％ＦＢＳ及び１％ＨＡＴ選択試薬を添加したＤＭＥＭ培地を含む９６ウェルプレートに播種した。プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で１４日間培養し、７日目と１０日目に２回培地を交換した後、さまざまなスクリーニングを行った。
２．３ ハイブリドーマのスクリーニング及びサブクローニング
ハイブリドーマ細胞を、ヒトＣＤ４７又はカニクイザルＣＤ４７タンパク質に対してＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってスクリーニングした。 ＣＤ４７タンパク質へのＳＩＲＰαリガンド結合をめぐって競合するＣＤ４７抗体の能力をＦＡＣＳによって評価した。抗体産生ハイブリドーマ細胞を半固体培地アプローチを使用してサブクローン化し、サブクローン化したハイブリドーマ細胞を上記の方法を使用して再スクリーニングした。一連のスクリーニングの後、陽性クローンＷＢＰ３４５５－４．９．９をリードハイブリドーマクローンとして同定し、さらに完全に特徴づけた。
２．４ ハイブリドーマ配列決定
リードクローンＷＢＰ３４５５－４．９．９を特定し、配列を決定した。ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを抽出し、５'－ＲＡＣＥキットを使用してｃＤＮＡを増幅した後、３'変性プライマーと３'アダプタープライマーを使用してＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲフラグメントをｐＭＤ１８－Ｔベクターにクローニングして配列決定を行った。
ＷＢＰ３４５５－４．９．９の詳細な可変ドメインアミノ酸配列を表４に示した。
実施例３
リード抗体Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬの生成
最終的なリード抗体を、元のクローンＷＢＰ３４５５－４．９．９のＨ鎖及びＬ鎖の可変領域をＳ２２８Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４バックボーン形式に変換することによって構築し、そして製造元の指示（Expi293F Transfection Kit, Invitrogen）に従ってＥＸｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。一過性細胞の上清を収集してろ過した後、プロテインＡカラム（GE Healthcare、175438）又はプロテインＧカラム（GE Healthcare、170618）のいずれかを使用して精製プロセスを行った。
得られた抗体を「Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬ」（「ＷＢＰ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬ」又は「Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ」と同じ）と名付けた。精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度によって決定された。抗体の分子量及び純度を、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣで試験した。その後、使用するまで－８０℃で保管した。
リード抗体の分子量及び精製情報を表５にまとめた。見てわかるように、リード抗体の純度は９５％を超えていた。
実施例４
リード抗体W３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬのインビトロ特性評価
４．１ ヒトＣＤ４７タンパク質への抗体の結合（ＥＬＩＳＡ）
ＣＤ４７タンパク質へのリード抗体の結合はＥＬＩＳＡによって決定された。９６ウェルプレートを１μｇ/ｍＬのヒトＣＤ４７ＥＣＤタンパク質で４℃で一晩コーティングし、２％ＢＳＡ－ＰＢＳで１時間ブロックした。次に、さまざまな濃度のリード抗体を添加し、２時間インキュベートした。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体を添加し、１時間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を添加し、１２分後に２ＭのＨＣｌを使用して反応を停止させた。全てのインキュベーション工程は室温で実施し、プレートを工程間でｐＨ７．４のＰＢＳＴで５回洗浄した。試験サンプルの吸光度は、マルチウォールプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅ）を使用して４５０ｎｍで測定された。結合ＥＣ５０は、以下のGraphPad Prismソフトウェア等式を使用して分析した：非線形回帰（カーブ適合）－Log（アゴニスト）対 応答－可変勾配。
図１に示すように、結果は、リードｍＡｂがヒトＣＤ４７ＥＣＤタンパク質に高い親和性で結合できることを示している。結合ＥＣ５０及び最大ＯＤは、リードｍＡｂと３つのベンチマーク対照間で同等であった。
４．２ ヒト又はカニクイザルＣＤ４７発現細胞に結合する抗体（ＦＡＣＳ）
リード抗体のヒトＣＤ４７又はカニクイザルＣＤ４７発現細胞への結合はＦＡＣＳによって決定された。簡単に説明すると、操作されたＣＤ４７発現細胞を１ｘ１０５細胞/ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートにコーティングし、１５００ｒｐｍ、４℃で４分間遠心分離した後、上清を除去した。次に、さまざまな濃度のリード抗体を添加して細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を１８０μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦｃＰＥを添加して細胞を再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした後、１８０μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、蛍光強度をＦＡＣＳ（BD Canto II）で測定し、FlowJoバージョンソフトウェアで分析しました。結合ＥＣ５０は、以下のGraphPad Prismソフトウェア等式を使用して計算した：非線形回帰（カーブ適合）－Log（アゴニスト）対 応答－可変勾配。
図２及び３に示すように、結果は、リードｍＡｂがヒトＣＤ４７発現細胞及びカニクイザルＣＤ４７発現細胞に高い同等の親和性で結合できることを示した。
４．３ ヒトＲＢＣに結合する抗体（ＦＡＣＳ）
ＣＤ４７はヒト赤血球（ＲＢＣ）で発現していたため、ヒトＲＢＣに対するＷ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬの結合活性をＦＡＣＳで評価した。ヒト赤血球は、クエン酸三ナトリウムで処理された新鮮なヒト血液から、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を廃棄することによって分離された。ヒトＲＢＣ細胞を１ｘ１０５細胞/ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートにコーティングし、１５００ｒｐｍ、４℃で４分間遠心分離した後、上清を除去した。次に、さまざまな濃度のリード抗体を添加して細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を１８０μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦｃＰＥを添加して細胞を再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした後、１８０μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、蛍光強度をＦＡＣＳ（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で測定し、ＦｌｏｗＪｏバージョンソフトウェアで分析した。結合ＥＣ５０は、以下のGraphPad Prismソフトウェア等式を使用して計算した：非線形回帰（カーブ適合）－Log（アゴニスト）対 応答－可変勾配。
図４に示すように、結果は、リードｍＡｂがベンチマーク抗体と比較してはるかに低い親和性でヒトＲＢＣに結合できることを示しており、これは臨床試験で貧血を改善するのに大きな利点がある可能性がある。
４．４ ヒトＲＢＣ赤血球凝集アッセイ（ＨＡ）
ＲＢＣに対するＷ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬの赤血球凝集活性（ＨＡ）を評価するために、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）を使用してＨＡを実施した。ヒトＲＢＣを、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を廃棄することにより、クエン酸三ナトリウムで処理した新鮮なヒト血液から分離した。ＤＰＢＳで希釈した２５μＬのｈＲＢＣ懸濁液をＵ底９６ウェルプレートに加え（約４ｘ１０６ ＲＢＣ /ウェル）、続いて２５μＬのリード抗体を添加し（希釈範囲は６６７ｎＭ～０．６６７ｎＭ、１００ μｇ / ｍｌ～０．１μｇ / ｍｌに相当）、次に穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ＲＢＣをＤＰＢＳに再懸濁し、顕微鏡で検査した。
図５（Ｗ３４５－ＢＭＫ２）に示すように、ＲＢＣクラスターの形成はＨＡ陽性と定義されたが、無傷で解離状態にあるＲＢＣはＨＡ陰性（アイソタイプコントロール）と定義された。図５に示すように、結果は、リードｍＡｂを添加したＲＢＣが、ＲＢＣクラスターを形成せずに無傷で解離状態のままであり、従ってＨＡ陰性と定義されたのに対し、Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰは赤血球凝集陽性を示す有意なＲＢＣクラスターを誘発したことを示した。
４．５ ヒトリガンド競合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬのリガンド（ＳＩＲＰα）ブロッキング活性を評価するために、タンパク質ベースの競合アッセイをＥＬＩＳＡで実施した。 ９６ウェルプレートを１μｇ/ｍＬのヒトＣＤ４７ＥＣＤで４℃で一晩コーティングし、２％ＢＳＡ－ＰＢＳで１時間ブロックした。さまざまな濃度のリード抗体とヒトＳＩＲＰα（１ μｇ/ｍｌ）の混合物を添加し、２時間インキュベートした。二次抗体マウス抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰを添加し、１時間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を加え、１２分後に２ＭのＨＣｌを使用して反応を停止させた。すべてのインキュベーション工程は室温で実施し、工程間でプレートをＰＢＳＴで洗浄した。試験サンプルの吸光度は、多層プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。競合結合IＣ５０は、以下のGraphPad Prismソフトウェア等式を使用して計算した：非線形回帰（カーブ適合）－Log（アゴニスト）対 応答－可変勾配。
図６に示すように、データは、リードｍＡｂがＣＤ４７とＳＩＲＰα（リガンド）間の結合相互作用を８５％を超える阻害率で競合的にブロックできることを示している。阻害率は、次の式を使用して計算された：[（ＯＤ４５０リガンドのみ－ＯＤ４５０ブロッキングサンプル）/ ＯＤ４５０リガンドのみｘ１００％]。
４．６ ヒトリガンド競合アッセイ（ＦＡＣＳ）
Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬのリガンド（ＳＩＲＰα）ブロッキング活性を評価するために、ヒトＣＤ４７を発現する安定細胞を使用して細胞ベースの競合アッセイを実施した。簡単に説明すると、ヒトＣＤ４７を発現する操作された細胞を１ｘ１０５細胞/ウェルで９６ウェルＵ底プレートにコーティングし、１５００ｒｐｍ、４℃で４分間遠心分離した後、上清を除去した。さまざまな濃度のリードｍＡｂとヒトＳＩＲＰαタンパク質（１ μｇ / ｍｌ）の混合物を添加し、２時間インキュベートした。細胞を２００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した。二次抗体であるマウス抗Ｈｉｓタグ－ビオチンを添加して細胞を再懸濁し、暗所で４℃で１時間インキュベートした後、２００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで洗浄した。３番目の抗体である抗Ｓｔｒｅｐｔａｄｖｉｔｉｎ－ＰＥを添加して細胞を再懸濁し、暗所で4℃で３０分間インキュベートした後、２００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで洗浄した。最後に、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、蛍光強度をＦＡＣＳ（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で測定し、ＦｌｏｗＪｏバージョンソフトウェアで分析した。競合結合IＣ５０は、以下のGraphPad Prismソフトウェア等式を使用して計算した：非線形回帰（カーブ適合）－Log（アゴニスト）対 応答－可変勾配。
図７に示すように、結果は、リードｍＡｂがそのリガンドＳＩＲＰαへのヒトＣＤ４７の結合を競合的にブロックできることを示した。
４．７ ヒトＣＤ４７親和性（ＳＰＲ）
Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬのヒトＣＤ４７結合親和性を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用したＳＰＲアッセイによって実行した。各抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体固定化ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）に捕捉された。さまざまな濃度のヒトＣＤ４７タンパク質を、センサーチップ上に３０μＬ / 分の流速で、１８０秒間の会合段階で注入し、続いて３６００秒間解離させた。チップは、各結合サイクルの後に１０ ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）によって再生された。ブランク表面とバッファーチャネルのセンサーグラムは、テストセンサーグラムから差し引かれた。実験データは、Ｌａｎｇｍｉｕｒ分析を使用して１：１モデルで適合された。５５ｋＤａの分子量を使用して、分析物抗原のモル濃度を計算した。
親和性ＫＤ値を表６に、結合速度曲線を図８に示した。どちらも、リードｍＡｂがベンチマーク抗体Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰよりもわずかに優れた高い親和性でヒトＣＤ４７に結合できることを示している。
４．８ 熱安定性
示差走査熱量測定（ＤＳＦ）を使用して、リードｍＡｂの熱安定性を評価した。簡単に説明すると、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）７ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して抗体のＴｍを調査した。１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５ Ｘ ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。プレートを２６℃から９５℃まで０．９℃/分の速度で加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の導関数が計算され、最大値は融解温度Ｔｍとして定義された。タンパク質に複数のアンフォールディング遷移がある場合、Ｔｍ１及びＴｍ２という名前の最初の２つのＴｍが報告された。データ収集とＴｍ計算は、操作ソフトウェアによって自動的に実行された。
以下の図９及び表７に示すように、結果は、リードｍＡｂが２つの異なる緩衝液で良好な熱安定性を示したことを示している。
４．９ 血清安定性
リードｍＡｂの血清安定性アッセイは、ヒト血清で実施された。採取したばかりのヒト血液を、抗凝固剤を含まないポリスチレンチューブ内で室温で３０分間、静的にインキュベートした。血液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、血清を収集した。抗体を血清と穏やかに混合し、血清－抗体混合物を３７℃でインキュベートした。サンプルは、それぞれ０日、１日、４日、７日、１４日に収集され、使用するまで－８０℃で指定の時間に急速凍結された。サンプルを使用して、ヒトＣＤ４７発現細胞への結合能力を評価した。簡単に説明すると、抗体の段階希釈液をＣＤ４７発現細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を１％ＢＳＡを含む２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液で１：１５０に希釈したＰＥ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。追加の洗浄工程を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回行い、続いて１５００ｒｐｍで４分間４℃で遠心分離した。最後に、細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、蛍光値をＦＡＣＳで測定し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
図１０に示すように、結果は、血清培養がヒトＣＤ４７へのリードｍＡｂの結合能力に影響を及ぼさないことを示した。リードｍＡｂは３７℃のヒト血清中で少なくとも１４日間安定していたため、リードｍＡｂの結合は経時的に変化しなかった。
４．１０ 非特異的タンパク質結合（ＥＬＩＳＡ）
１４種類のタンパク質に対するリードｍＡｂの非特異的結合をＥＬＩＳＡで試験した。９６ウェル高結合プレートを1μｇ/ｍＬの１４種類のタンパク質で４℃で一晩コーティングし、２％ＢＳＡ－ＰＢＳで１時間ブロックした。１０μｇ/ｍＬのリード抗体を加え、２時間インキュベートした。次に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体を添加し、１時間インキュベートした。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を加え、１２分後に２ＭのＨＣｌを使用して反応を停止させた。全てのインキュベーション工程は室温で実施し、プレートを工程間でｐＨ７．４のＰＢＳＴで５回洗浄した。試験サンプルの吸光度は、マルチウォールプレートリーダー（SpectraMax（登録商標）M5e）を使用して４５０ｎｍで測定した。
ＯＤ４５０値は、以下の表８に要約されている。データは、リード抗体が１４の試験されたタンパク質への非特異的結合を示さなかったことを示した。
４．１１ 非特異的細胞結合（ＦＡＣＳ）
１４の異なるヒト起源腫瘍細胞及びラット由来のＣＨＯ－Ｋ１細胞に対するリードｍＡｂの非特異的結合を、ＦＡＣＳによって実施した。 １４個の異なる細胞を１ｘ１０５細胞/ウェルの９６ウェルＵ底プレートに移し、１５００ｒｐｍで４分間、４℃で遠心分離してから上清を除去した。 １０μｇ/ｍｌのリード抗体を細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞を１８０μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃＰＥ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１５－０９８）を添加して細胞を再懸濁し、暗所で４℃で３０分間インキュベートした。追加の洗浄工程は、１８０μＬの１％ＢＳＡ/１ＸＰＢＳで２回実行した後、１５００ｒｐｍで４分間、４℃で遠心分離した。最後に、細胞を１００μＬの１％ＢＳＡ－ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で蛍光強度を測定し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。
ＭＦＩ値は、以下の表に要約されている。データは、リードｍＡｂが試験した１４のヒト由来腫瘍細胞全てに結合できることを示しましたが、ハムスター由来のＣＨＯ－Ｋ１細胞には結合せず、ＣＤ４７がヒト腫瘍細胞で広く発現していることを示している。
４．１２ 食作用アッセイ（ＦＡＣＳ）
リードｍＡｂの食作用活性は、ヒトＰＢＭＣ由来マクロファージ及び、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、及びヒトＲＢＣの２つの腫瘍細胞株を標的細胞として使用して評価した。
ヒトＰＢＭＣを新鮮なヒト血液から分離し、ＣＤ１４陽性単球をｈＣＤ１４マイクロビーズによってＰＢＭＣから分離した。ＣＤ１４陽性単球は、１００ｎｇ /ｍｌの ｒｈＭ－ＣＳＦを含む１０％ＦＢＳ ＲＰＩＭ１６４０培地で７日間培養することにより、マクロファージに分化した。これらの単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は付着性になり、他の細胞を洗い流すことができた。ＭＤＭをこすり取り、９６ウェルプレートに播種した。いくつかのヒト腫瘍細胞株叉はヒトＲＢＣは、ＣＤ４７の発現が高いため、標的細胞型として選択された。標的細胞を１μＭのＣＦＳＥで３７℃で３０分間標識した後、洗浄し、食細胞当たり１：１の腫瘍細胞の比率でＭＤＭに添加し、ＣＤ４７抗体をさまざまな濃度で添加した。標的細胞の食作用を２時間放置した後、ＡＰＣに結合したマクロファージマーカーＣＤ１４に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。食作用は、ＦＬ４陽性（ＣＤ１４＋）の生細胞をゲーティングし、ＦＬ１（ＣＦＳＥ＋）陽性細胞の割合を評価することで測定した。
腫瘍細胞を摂取したマクロファージをカウントし、インデックスとして計算した：食作用インデックス％＝パーセンテージＣＦＳＥ＋/ＣＤ１４－ＡＰＣ＋ /（パーセンテージＣＦＳＥ ＋/ＣＤ１４－ＡＰＣ＋＋パーセンテージＣＦＳＥ－／ＣＤ１４－ＡＰＣ＋）ｘ １００％。
図１１に示すように、リードｍＡｂは腫瘍細胞の強力な食作用を誘発し、これはベンチマーク抗体に匹敵し、Ｗ３４５－ＢＭＫ１．ｕＩｇＧ４ＰＥ．Ｋ及びＷ３４５－ＢＭＫ４．ｕＩｇＧ４．ＳＰＫよりもわずかに優れている（図１１Ａ－Ｂ）。驚くべきことに、リードｍＡｂのヒト赤血球に対する食作用は、Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰよりも比較的低かった（図１１Ｃ）。
４．１３ ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ
リードｍＡｂは、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ及びＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性について評価された。ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ又はＲａｊｉを標的細胞として使用した。
ＡＤＣＣアッセイ：ヒトＰＢＭＣは新鮮なヒト血液から分離された。 １％ＦＢＳを含む４０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地中の２ｘ１０４標的細胞を、９６ウェルＵ底プレートのウェルごとに添加した。次に、１％ＦＢＳを含む２０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地で段階希釈した抗体を各ウェルに添加した。３７℃で１５分間インキュベートした後、１％ＦＢＳを含む４０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地中の４ ｘ １０５ ＰＢＭＣを各ウェルに添加して、Ｅ/Ｔ比を２０：１にした。３７℃で４時間インキュベートした後、混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、７０μＬの上清を検出のために移した。細胞死は、ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示に従って使用して評価した。
ＣＤＣアッセイ：１％ＦＢＳを含む４０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地中の２ｘ１０４標的細胞を、９６ウェルＵ底プレートのウェルごとに添加した。次に、１％ＦＢＳを含む２０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地で段階希釈した抗体を各ウェルに添加した。３７℃で１５分間インキュベートした後、１％ＦＢＳを含む４０μＬのＲＰＭＩ１６４０（フェノールなし）培地中の通常のヒト補体を各ウェルに添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、７０μＬの上清を検出のために移した。細胞死は、ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示に従って使用して評価した。
図１２に示すように、結果は、リードｍＡｂ及びその他のベンチマーク抗体がＣＣＲＦ－ＣＥＭ及びＲａｊｉ腫瘍細胞の両方でＡＤＣＣ及びCDC活性を弱いか、まったく誘導しないことを示した。
実施例５
リード抗体Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬのインビボ特性評価
５．１ Ｂ－ＮＤＧマウスモデル（Ｒａｊｉ細胞）における抗腫瘍効果
リードｍＡｂの有効性研究を、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ、Ｌｔｄ．によるＢ－ＮＤＧマウスのＲａｊｉ－Ｌｕｃリンパ腫モデルを使用して実施した。細胞は、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養された。腫瘍細胞は、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理で週に２回日常的に継代培養された。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のためにカウントした。
治療モデルでは、各マウスにＲａｊｉ－Ｌｕｃリンパ癌細胞（５．０×１０５）を静脈内接種した。腫瘍の成長は、動物のライブイメージャーによって週に２回ライブイメージング値として監視された。腫瘍のライブイメージング信号値が約１．０５×１０６ｐ/秒 / ｃｍ２ / ｓｒに達した場合、動物をランダムに５つのグループにグループ化し、３ ｍｇ/ｋｇと０．５ｍｇ/ｋｇの２つの用量レベルで研究した。動物実験のデザインを表１０に示した。グループ化の日を０日目と見なし、グループ化後０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目及び１８日目にそれぞれ合計６回、週に２回腹腔内注射した。全ての癌担持マウスについて、腫瘍のライブイメージング値とマウスの体重を週に２回測定した。研究における動物の取り扱い、世話及び治療に関連する全ての手順は、実験動物管理の評価と認定のための協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従って、上海バイオモデルの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実施された。
腫瘍の成長は、動物のライブイメージャーによって週に２回又は３回、ライブ発光シグナル強度（ｐ/秒/ｃｍ２/ｓｒで表されるイメージング値）としてモニターされた。結果は平均と標準誤差（平均±ＳＥＭ）で表された。プリズムを使用した二元配置分散分析ボンフェローニ事後検定を使用してデータを分析し、Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると見なされた。
図１３及び表１１に示すように、グループ化後１８日目に、Ｇ１（ＩｇＧ４アイソタイプコントロール、３ ｍｇ / ｋｇ）ビークルグループと比較して、Ｇ２グループからＧ５グループの動物の平均体重は有意な減少を示さず、これは、 Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ及びＷ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰは毒性がないことを示唆した。図１３の黒い矢印は、投与時間を示している。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝７として表された。
図１４、図１５、及び表１２に示すように、グループ化後２１日目では、Ｇ１（ＩｇＧ４アイソタイプコントロール、３ ｍｇ / ｋｇ）ビークルグループと比較して、Ｇ２グループからＧ５グループへの腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）は、それぞれ、１００．０％、９３．２％、１００．０％、及び８７．５％であった。ＴＧＩ（％）＝ ［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％、ここで、Ｔｉ及びＶｉは、それぞれ、特定の日、処理及びビークルグループにおける平均画像シグナル値（すなわち、発光シグナル強度）を指す。Ｔ０及びＶ０は、それぞれ、グループ化日の治療グループとビークルグループの平均画像シグナル値を示す。さらに、データは統計的有意差（Ｐ ＜０．０５）を示し、これはＷ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ及びＷ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰの明らかな抗腫瘍効果を示している。図１４の黒い矢印は、投与時間を示している。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝７として表された。
さらに、グループ化後０～２５日の動物の生存率を図１６に示した。３及び０．５ ｍｇ／ｋｇの２つのＷＢＰ３４５５グループ、及び３ｍｇ／ｋｇのＷ３４５－ＢＭＫ２グループでは、動物は死亡しなかった。結果は、Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰがＷ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰよりも優れた有効性を示し、腫瘍担持マウスの生存期間を大幅に延長したことを示した。
結論として、リード抗体Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰの治療は、有意な抗腫瘍効果を示し、Ｗ３４５－ＢＭＫ２．ｕＩｇＧ４．ＳＰと同等か又はわずかに優れた結果を示した。さらに、ＷＢＰ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰは、腫瘍担持マウスの生存期間を大幅に延長した。
５．２ ＮＣＧマウスモデル（ＨＴ－２９細胞）における抗腫瘍効果
リードｍＡｂの有効性研究は、ＮＣＧマウスのＨＴ－２９結腸直腸腺癌モデルで試験された。７～８週齢の雌ＮＣＧマウス（Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co.、LTD）を研究に使用した。親ＨＴ－２９細胞株はＡＴＣＣから購入した。細胞は、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。腫瘍細胞は、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理で週に２～３回日常的に継代培養された。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のためにカウントした。
治療モデルでは、ＨＴ-29細胞（ＰＢＳ中５．０×１０６細胞/１００μＬ）をＮＣＧマウスの皮下に接種した。全ての腫瘍研究について、マウスの体重を測定し、ノギスを使用して腫瘍増殖を週に２回測定した。研究における動物の取り扱い、世話及び治療に関連する全ての手順が、実験動物管理の評価および認定協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従い、上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ実験動物株式会社の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインにより実行された。腫瘍体積は、式１／２（長さ×幅２）で計算された。結果は平均と標準誤差（平均±ＳＥＭ）で表された。データは、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ６．０を使用した双方向ＲＭ ＡＮＯＶＡ ＴＵＫＥＹの多重比較検定を使用して分析され、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。
図１７に示すように、最終的なリード抗体は、腫瘍細胞がパニツムマブに耐性を示すＮＣＧマウスで強力な抗ＨＴ２９腫瘍細胞の有効性を示した。さらに、図１８に示すように、相乗的な抗腫瘍効果がコンボグループ（ＷＢＰ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ＋パニツムマブ）で観察され、そして１５日目、１７日目、２２日目に統計的に有意（ＴＧＩ約５０％）であった。
５．３ ＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスモデル（Ｒａｊｉ細胞）における抗腫瘍効果
リードｍＡｂ抗腫瘍効果試験を、ＣＢ－１７ＳＣＩＤマウスのＲａｊｉＢリンパ腫モデルで試験した。研究には、７～８週齢の雌のＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．、ＬＴＤ）を使用した。細胞は、空気中５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。腫瘍細胞は通常、週に３回継代培養された。指数増殖期に増殖している細胞を採取し、腫瘍接種のためにカウントした。
治療モデルでは、Ｒａｊｉ細胞（マトリゲル/ ＰＢＳ混合物中１．０×１０６細胞/２００μＬ）をＣＢ－１７ＳＣＩＤマウスの皮下に接種した。体重を量り、キャリパーを使用して腫瘍増殖を測定した。腫瘍体積が約１１０ｍｍ３に達した場合、動物をランダムに以下の５つのグループにグループ化し：Ｇ１（アイソタイプコントロール、５ｍｇ / ｋｇ）グループ、Ｇ２（Ｗ３４５－ＢＭＫ２、１ｍｇ/ｋｇ）グループ、Ｇ３（Ｗ３４５－ＢＭＫ８、１ｍｇ/ｋｇ）グループ、Ｇ４（Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ、５ｍｇ/ｋｇ）グループ及びＧ５（Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ、１ｍｇ/ｋｇ）グループ、そしてグループ化の日は０日目と見なされた。次に、それらを週に２回腹腔内注射し、グループ分け後０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目にそれぞれ合計６回注射した。すべての腫瘍担持マウスについて、体重を量り、ノギスを使用して腫瘍増殖を週に２回測定した。研究における動物の取り扱い、世話及び治療に関連する全ての手順は、実験動物管理の評価と認定のための協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従い、上海モデル生物動物株式会社の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実施された。
腫瘍体積は、式１/２（長さ×幅２）で計算された。結果は平均と標準誤差（平均±ＳＥＭ）で表された。データは、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを使用したＴｗｏｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して分析され、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。
図１９Ａ及び表１３に示すように、グループ化後２１日目で、Ｇ１グループからＧ５グループの動物の平均体重は有意な減少を示さず、 これは、Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ、Ｗ３４５－ＢＭＫ２、及びＷ３４５－ＢＭＫ８が毒性ではないことを示している。
図１９Ｂ及び表１４に示すように、グループ化後２１日目では、Ｇ１（アイソタイプコントロール、５ｍｇ/ｋｇ）ビークルグループと比較して、Ｇ２グループからＧ５グループへの腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％）は、それぞれ、９４．７０％、６７．４８％、１０３．３２％、及び９４．７０％であった。さらに、データは統計的に有意な差（Ｐ ＜０．０５）を示し、これはＷ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰ、Ｗ３４５－ＢＭＫ２、及びＷ３４５－ＢＭＫ８の明らかな抗腫瘍効果を示している。さらに、Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４Ｌ．ＳＰは、１ｍｇ/ｋｇの投与量でＷ３４５－ＢＭＫ２と同様の有効性を示し、Ｗ３４５－ＢＭＫ８よりもはるかに優れた有効性を示した。
５．４ カニクイザルの薬物動態及び毒物学の研究
５．４．１ 薬物動態パラメーター
リードｍＡｂは、ナイーブでないカニクイザルの薬物動態（ＰＫ）について評価された。 ４匹の雄サル（２匹/グループ）を２つのグループに分けた：低用量グループと高用量グループ（１５及び５０ｍｇ/ｋｇ）。動物は単回投与で静脈内投与された（表１５を参照）。抗体は、ｐＨ５．０の２０ｍＭヒスチジン、５％スクロース溶液で処方された。血液サンプルは、ＥＬＩＳＡ法により、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで分析された抗体濃度について、投与前（１日目）、０．２５時間、０．５時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、３日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に収集された。血液学（ＣＢＣ）及び血清化学の全血サンプル分析は、それぞれ血液学分析装置（ＡＤＶＩＡ２１２０）及び化学（ＨＩＴＡＣＨＩ ７１８０）によって決定された。一般的な健康状態、外観、特に皮膚刺激性についてのケージ側の観察が定期的に行われた。
Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬの平均半減期（Ｔ１/２）は、図２０及び表１６に示すように、１５ｍｇ/ｋｇ及び５０ｍｇ/ｋｇでそれぞれ４８時間及び８６時間である。データは、ｎ＝２の平均値として表された。
Ｃｍａｘの全身曝露は、投与量が１５から５０ｍｇ/ ｋｇに増加するにつれて、Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬで２．３倍に増加し、そして 投与量が１５から５０ｍｇ/ ｋｇに増加すると、ＡＵＣ０－ｔはＷ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬで８．７倍に増加した。要約すると、全身曝露は、投与量が１５から５０ｍｇ/ｋｇに増加するにつれて、投与量に比例して増加した。
５．４．２ 毒性試験
リードｍＡｂの血液学的効果は、ＰＫ研究中にカニクイザルで評価された。赤血球（ＲＢＣ）と網状赤血球の数を数え、ヘモグロビンのレベルを定量化した。結果を図２１に示し、データはｎ＝２の平均値として表された。
Ｗ３４５５－４．９．９－ｕＩｇＧ４．ＳＰＬの投与は、軽度の一過性の用量依存性貧血を引き起こした。図２１Ａ－Ｂに示すように、赤血球数とヘモグロビン（ＨＧＢ）の最下点は、約７日目に発生し、１～２週間で自然に正常範囲に戻った。一過性貧血は、網状赤血球（ＲＥＴ）数が早くも３日目に有意に増加し、血中の古い老化したＲＢＣの喪失を補ったため、若いRBCに置き換えることで解決した（図２１Ｃ）。
従って、貧血は一過性であり、一般的に忍容性が良好であると結論付けた。一過性貧血は、投与された投与計画では軽度であり、約２週間後にベースラインレベルに自然に回復した。４匹のサルは全て、２８日間の研究期間中に正常な行動を示した。
当業者は、本開示が、その精神又は中心的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得ることをさらに理解するであろう。本開示の前述の説明は、その例示的な実施形態のみを開示するという点で、他の変形が本開示の範囲内にあると企図されることが理解されるべきである。従って、本発明は、本明細書で詳細に説明されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲及び内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
参考文献
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Claims (22)

  1. ＣＤ４７と結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、
    配列番号１のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１;
    配列番号２のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ２;
    配列番号３のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ３；
    配列番号４のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ１;
    配列番号５のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ２；及び
    配列番号６のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ３；
    を含む単離された抗体又はその抗原結合部分。
  2. 前記単離された抗体又はその抗原結合部分が、以下：
    （Ａ）以下を含むＨ鎖可変領域：
    （i）配列番号７のアミノ酸配列;又は
    （ii）配列番号７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列;及び
    （Ｂ）以下を含むＬ鎖可変領域：
    （i）配列番号８のアミノ酸配列;又は
    （ii）配列番号８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列;
    を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  3. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ４のＦｃ領域をさらに含む、請求項１又は２のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  4. 前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ４のものである、請求項３に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  5. ＥＵの番号付けによると、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域がＳ２２８Ｐの置換を含む、請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  6. 前記抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  7. 前記単離された抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１１を含むＨ鎖及び配列番号１２を含むＬ鎖を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗体のＨ鎖可変領域及び／又はＬ鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項８に記載の単離された核酸分子又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
  12. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、下記工程：
    －適切な条件下で前記抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子を含有する宿主細胞を培養する工程; 及び
    －抗体又はその抗原結合部分を宿主細胞培養物から単離する工程、
    を含む方法。
  13. 任意でＣＤ４７に関連する免疫応答である、対象中の免疫応答を調整するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  14. 対象中の腫瘍細胞の増殖を阻害するための、及び／又は腫瘍細胞のマクロファージ媒介食作用を誘導するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  15. 治療又は予防を必要とする対象において、癌、感染性疾患又は炎症性疾患を治療又は予防するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  16. 前記癌が血液癌又は固形腫瘍である、請求項１５に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  17. 前記血液癌が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（例えばバーキットリンパ腫）、Ｂリンパ芽球性白血病/リンパ腫；Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、リヒター症候群、多発性骨髄腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、 前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫から選択される、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  18. 前記固形腫瘍が、肺癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、睾丸癌、腎臓癌、膀胱癌、脳癌、子宮頸癌、結腸/直腸癌、胃腸管癌、皮膚癌及び前立腺癌から選択される、請求項１６に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  19. 前記抗体又はその抗原結合部分が、化学療法剤又は治療用抗体と共に投与される、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  20. 前記治療用抗体がパニツムマブである、請求項１９に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  21. ＣＤ４７関連の癌の診断、治療、又は予防のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  22. 請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む、癌の治療又は診断のためのキット。
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