JP7541699B2 - 筋萎縮性側索硬化症の治療用医薬組成物 - Google Patents

Description

関連出願
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１９－０４６５７２（２０１９年３月１４日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症を治療するための医薬組成物に関する。より詳細には、間葉系幹細胞を含み、静脈内投与される、筋萎縮性側索硬化症の治療用医薬組成物に関する。

筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、運動神経が選択的に障害される進行性の神経変性疾患で、根本的な治療法のない原因不明の重症疾病である。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳと孤発性ＡＬＳに大別され、全体の約５％を占める家族性ＡＬＳ患者の約２２％ではスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）の遺伝子に変異があることが報告されている。ＳＯＤ１のほかにも、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ／ＴＬＳ、Ｃ９ｏｒｆ７２などがＡＬＳの原因遺伝子として報告されている。

ＡＬＳ患者と動物のＡＬＳモデルに共通したメカニズムの一つとして血管脳関門（ＢＢＢ）及び血液脊髄関門（ＢＳＣＢ）の破綻が知られている。ＡＬＳ発症初期から見られるＢＢＢ／ＢＳＣＢの破綻は、様々な神経障害を引き起こすことから、ＡＬＳの原因の一つとして注目されている（非特許文献１－４）。ＡＬＳは、神経炎症や運動神経の脱落など様々な症状が合併するため、こうした多様な症状に効果のある治療法が望まれている。

間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）には、神経保護作用やＢＢＢ修復作用があることが知られている。発明者らは、脳梗塞患者にＭＳＣを静脈投与することで、運動機能の改善や損傷部位の修復が認められることを報告している（特許文献１－３）。また、脊髄損傷患者にＭＳＣを静脈投与することにより、機能回復、軸索再生の促進、損傷部位の低減が認められることも報告している（特許文献２及び３）。

ＭＳＣは、さまざまな神経栄養因子を分泌することが分かっており、なかでもグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）には運動神経細胞を保護する効果が確認されている（非特許文献５）。発明者らは、脳梗塞モデルラットの脳組織中（梗塞領域）に含まれるＧＤＮＦの量をＥＬＩＳＡで測定し、ＭＳＣ投与群では対照群に比べて有意にＧＤＮＦの量が多いことを確認している（非特許文献６）。Ｇｏｔｈｅｌｆらは、ＭＳＣをｂＦＧＦやＰＤＧＦを含む分化培地で培養して神経栄養因子を分泌する細胞に分化誘導し、これをＡＬＳ患者のくも膜下又は筋肉内に注入することにより、ＡＬＳを治療する方法を開示している（特許文献４）。Ｌａｎｚａらは、血管芽細胞から分化誘導した間葉系間質細胞を含む不必要な免疫応答を治療するための医薬組成物を開示しており、対象疾患のリストにはＡＬＳも記載されているが、具体的な薬理効果は示されていない（特許文献５）。

ＷＯ２００９／０３４７０８号 ＷＯ２０１７／１８８４５７号 ＷＯ２０１８／０３４０２３号 ＷＯ２０１４／０２４１８３号（特表２０１８－１３８０４４号） ＷＯ２０１３／０８２５４３号（特開２０１８－２７９５４号）

Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１１１（１１）：ｐｐＥ１０３５－Ｅ１０４２ Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，Ｖｏｌ．１２５（１）：ｐｐ１１１－１２０ Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１３０１：ｐｐ１５２－１６２ Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５（６）：ｐｐ５１８－５２８ Ｋｏｓｕｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４５４（２）：ｐ１６５－１６９ Ｈｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．Ｖｏ．８４（７）：ｐｐ１４９５－１５０４

本発明の課題は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の様々な症状を治療するための新たな手段を提供することにある。

発明者らは、ＡＬＳモデルラットを用いて、症状の自然経過を運動機能及び組織学的観点から多面的に評価し、中等度及び重症ステージのいずれにおいても、ＭＳＣの静脈内投与により症状の進行や軽減が可能なことを確認した。さらに、より効果の高い投与方法を検討し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の（１）～（６）に関する。
（１）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための医薬組成物であって、間葉系幹細胞を含み、静脈内投与される医薬組成物。
（２）２回以上投与される、（１）に記載の医薬組成物。
（３）１回の投与で、１０^６個以上の間葉系幹細胞が投与される、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記間葉系幹細胞が、骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞である、（１）～（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）前記間葉系幹細胞が、前記患者の骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞である、（１）～（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）前記間葉系幹細胞が、ＣＤ２４陰性である、（１）～（５）のいずれかに記載の医薬組成物。

本発明の医薬組成物は、ＢＢＢ／ＢＳＣＢの破綻を抑制するとともに、神経栄養因子の発現を高めることで、神経障害を防止することが期待できる。本発明の医薬組成物は、症状の進行の程度によらず、運動機能の低下を抑制し、生存期間を延長することができるため、ＡＬＳの有効な治療方法となり得る。

図１は、ＡＬＳモデルラット（ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａ変異遺伝子導入ラット）の自然経過を行動評価により示す。縦軸はＢＢＢスコア、横軸は日数。 図２は、ＡＬＳモデルラットの組織像（ＫＢ染色）を示す。紫色：神経細胞及びグリア細胞（小さな細胞）、青色：髄鞘。 図３は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）の行動評価を示す。（Ａ）ＢＢＢスコア（実線：ＭＳＣ投与群、破線：ビヒクル投与群）、（Ｂ）ＢＢＢスコアの変化量（黒：ＭＳＣ投与群、白：ビヒクル投与群）。 図４は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）の生存期間の評価を示す。（Ａ）カプランマイヤー曲線（実線：ＭＳＣ投与群、破線：ビヒクル投与群）、（Ｂ）４０日後の生存率（黒：ＭＳＣ投与群、白：ビヒクル投与群）。 図５は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）の脊髄の運動神経細胞数の評価を示す。投与後１４日目の脊髄（腰髄）前角の組織像（（Ａ）ビヒクル投与群、（Ｂ）ＭＳＣ投与群、矢印は運動神経細胞）、及び（Ｃ）運動神経細胞数のグラフ（黒：ＭＳＣ投与群、白：ビヒクル投与群）。 図６は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）のＢＢＢ／ＢＳＣＢ破綻の評価を示す。脳皮質の染色像（（Ａ）ビヒクル投与群、（Ｂ）ＭＳＣ投与群）、矢印は運動神経細胞）、（Ｃ）エバンスブルー漏出領域の面積（黒：ＭＳＣ投与群、白：ビヒクル投与群、左から脳皮質、脳幹（延髄）、頸髄、腰髄の各部位の漏出領域を示す）。 図７は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＮｒｔｎ発現量（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す（黒：ＭＳＣ投与群、白：ビヒクル投与群）。 図８は、ＡＬＳモデルラット（Ｓｅｖｅｒｅ－ステージ）の行動評価を示す（実線：ＭＳＣ投与群、破線：ビヒクル投与群）。 図９は、ＡＬＳモデルラット（Ｓｅｖｅｒｅ－ステージ）の生存期間の評価を示す（上：ＭＳＣ投与群、下：ビヒクル投与群）。 図１０は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）におけるＭＳＣ複数回投与による行動評価を示す。（Ａ）ＢＢＢスコア（実線：複数回ＭＳＣ投与群、破線：単回ＭＳＣ投与群、点線：ビヒクル投与群）、（Ｂ）ＢＢＢスコアの変化量（白：複数回ＭＳＣ投与群、灰：単回ＭＳＣ投与群、黒：ビヒクル投与群）。 図１１は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）におけるＭＳＣ複数回投与による長期的な運動機能評価を示す（実線：複数回ＭＳＣ投与群、破線：単回ＭＳＣ投与群、点線：ビヒクル投与群）。 図１２は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）におけるＭＳＣ複数回投与による生存期間の評価を示す（実線：複数回ＭＳＣ投与群、破線：単回ＭＳＣ投与群、点線：ビヒクル投与群）。 図１３は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）におけるＭＳＣ投与量の評価を示す（Ｄａｙ３，Ｄａｙ７，Ｄａｙ１４：いずれも、グラフ左から、ビヒクル投与群、低用量ＭＳＣ投与群（１．０×１０^５個，ｎ＝３）、通常量ＭＳＣ投与群（１．０×１０^６個，ｎ＝４）、高用量ＭＳＣ投与群（１．０×１０^７個，ｎ＝３））。 図１４は、ＡＬＳモデルラット（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）におけるＭＳＣ投与方法の評価を示す（Ｄａｙ３，Ｄａｙ７，Ｄａｙ１４：いずれも、グラフ左から、ビヒクル髄腔内投与群、ＭＳＣ髄腔内投与群、ＭＳＣ静脈内投与群）。

１．筋萎縮性側索硬化症
筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）は、運動神経が選択的に障害される進行性の神経変性疾患である。ＡＬＳは家族性ＡＬＳと孤発性ＡＬＳに大別されるが、大部分は孤発性（９５％）である。ＡＬＳは進行性であり、罹患すると症状が軽くなることはなく、次第に全身の筋肉が動かなくなり、最終的には呼吸不全により死に至る。現在のところ、ＡＬＳの発症原因は不明であり、根本的な治療法も存在しない。

最近、血管脳関門（ＢＢＢ）及び血液脊髄関門（ＢＳＣＢ）の破綻が引き起こす神経障害がＡＬＳの原因の一つとして注目されている。ＭＳＣはさまざまな神経栄養因子を分泌することが知られているが、発明者らはＭＳＣを静脈内投与により、罹患部位においてＧＤＮＦ発現が高まることを確認している。さらに、ＭＳＣの静脈内投与により、ＧＤＮＦファミリーの１つであるＮｅｕｒｔｕｒｉｎ（Ｎｒｔｎ）の発現が患部で増加することを確認している（後掲実施例）。

２．間葉系幹細胞
本発明の医薬組成物で使用される「間葉系幹細胞」とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能及び自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが知られている。

間葉系幹細胞のソースとしては、ＥＳ細胞や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導した細胞であっても、株化された細胞であっても、生体から単離・増殖させた細胞であってもよい。生体の場合、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、脳などが挙げられるが、骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞、とくに骨髄間葉系幹細胞、なかでもヒト骨髄間葉系幹細胞が好ましい。骨髄由来の間葉系幹細胞は、１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能であるので、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなどの利点がある。さらに、骨髄移植療法は既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。

細胞は、他家細胞由来でも自家細胞由来であってもよいが、自家細胞由来（患者自身の細胞に由来する）間葉系幹細胞が好ましい。

本発明で使用される間葉系幹細胞は未分化な状態であることが好ましい。未分化な状態の細胞は増殖率及び生体内導入後の生存率が高いからである。未分化であることは、例えば、分化マーカーであるCD24陰性により確認することができる。発明者らは、そのような細胞の取得方法も開発しており、その詳細はＷＯ２００９／０３４７０８号に記載されている。

発明者らが開発した前記方法では、骨髄液等から抗凝固剤（ヘパリン等）と実質的に接触しない条件で分離した細胞を、同種血清（好ましくは、自家血清；ヒト用医薬組成物ではヒト血清）を含み、かつ、抗凝固剤（ヘパリン等）を含まないかあるいは極めて低濃度で含む培地を用いて増殖させる。「抗凝固剤を含まないかあるいは極めて低濃度で含む」とは、抗凝固剤として有効量の抗凝固剤を含まないことを意味する。具体的には、例えばヘパリンやその誘導体であれば、通常抗凝固剤としての有効量は約２０～４０μ／ｍＬ程度であるが、発明者が開発した方法では、あらかじめ試料採取のための採血管に加える量を最小限とすることで、生体から採取された試料中の量は５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは２Ｕ／ｍＬ未満、さらに好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満となり、細胞を培養する際に培地中に存在する量は、培地の容積に対して０．５Ｕ／ｍＬ未満、好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ未満、さらに好ましくは０．０２Ｕ／ｍＬ未満となる（ＷＯ２００９／０３４７０８号参照）。

培地における細胞の密度は、細胞の性質及び分化の方向性に影響を与える。間葉系幹細胞の場合、培地中の細胞密度が８，５００個／ｃｍ^２を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ^２以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ^２以上になった時点で継代培養させる。

発明者らが開発した前記方法ではヒト血清含有培地を使用するため、血清ドナーの負担を考慮して、培地交換はなるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、少なくとも週１回、より好ましくは週１～２回の培地交換を行う。

培養は、細胞の総数が１０^８個以上になるまで継代培養を繰り返し行う。必要とされる細胞数は、使用目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞などの虚血性脳疾患の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は１０^７個以上、本発明では１０^６個以上と考えられる。発明者らが開発した方法によれば、１２日間程度で１０^７個の間葉系幹細胞を得ることができる。

増殖した間葉系幹細胞は、必要に応じて、使用されるまで凍結保存などの手法で（例えば、－１５２℃のディープフリーザーにて）保存してもよい。凍結保存には、血清（好ましくはヒト血清、より好ましくは自家血清）、デキストラン、ＤＭＳＯを含む培地（ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞用の培地）を凍結保存液として使用する。例えば、通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ５ｍＬを含む凍結保存液に細胞を懸濁して－１５０℃で凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯとしては、ニプロ株式会社製のクライオザーブ、デキストランは大塚製薬製の低分子デキストランＬ注を使用できるが、これらに限定されない。

上記のようにして調製した間葉系幹細胞は、ａ）間葉系幹細胞を含む培養物にサイトカインを添加し、間葉系幹細胞がＣＸ３ＣＬ１を発現していることを確認し、あるいは、ｂ）間葉系幹細胞がＥＧＦＲ及び／又はＩＴＧＡ４を発現していることを確認することにより、当該間葉系幹細胞の品質・機能を確認してもよい。

使用する「炎症性サイトカイン」としては、ＴＮＦ－α、ＩＮＦγ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８が挙げられ、なかでもＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、及びＩＬ－６を含むことが好ましく、ＴＮＦ－α、ＩＮＦγ、及びＩＬ－６の混合物を使用することがより好ましい。

前記方法は、（サイトカイン未添加）培養物中におけるＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、及びＨＧＦから選ばれるいずれか１以上の存在を確認する工程をさらに含んでいてもよい。とくに、ＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦの存在を確認することが重要であり、ＢＤＮＦの存在を確認することが最も重要である。

炎症性サイトカインの添加により間葉系幹細胞がＣＸ３ＣＬ１を発現すれば、当該間葉系幹細胞は炎症調整作用（免疫調整作用）に優れることが期待でき、間葉系幹細胞の９０％以上がＥＧＦＲ及び／又はＩＴＧＡ４を発現していれば、当該間葉系幹細胞は損傷部位への集積能に優れることが期待できる。また、培地中にＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、及びＨＧＦなどの栄養因子のいずれかが存在すれば神経保護作用の高い間葉系幹細胞を含むことが期待でき、なかでもＢＤＮＦ及び／又はＶＥＧＦの存在、とくにＢＤＮＦの存在は神経保護作用の高いＭＳＣの重要な指標であり得る。間葉系幹細胞は未刺激でもＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ及び／又はＨＧＦを分泌するが、分泌能の確認は、未刺激の細胞からの分泌を評価してもよいし、炎症性サイトカイン刺激後の細胞からの分泌を評価してもよい。

上記ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦＲ、ＩＴＧＡ４、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦの発現は、遺伝子レベルよりも、タンパクレベルでの発現を指標とすることが好ましく、ＥＧＦＲやＩＴＧＡ４などの細胞表面タンパクの場合は、簡便さと感受性の点からフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて測定することが好ましく、ＣＸ３ＣＬ１、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦなどの分泌タンパクの場合は、簡便さと感受性の点からビーズアッセイを用いることが好ましい。

３．本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ＡＬＳを治療するための医薬組成物であって、間葉系幹細胞を含み、静脈内投与されることを特徴とする。

本発明の医薬組成物に含まれる間葉系幹細胞の細胞数は多い程好ましいが、患者への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。したがって、本発明の医薬組成物の好ましい態様において、１回の投与に含まれる間葉系幹細胞の細胞数は、１０^６個以上、好ましくは５×１０^６個以上、より好ましくは１０^７個以上、より好ましくは５×１０^７個以上、より好ましくは１０^８個以上、さらに好ましくは５×１０^８個以上である。

本発明の医薬組成物は、静脈内投与製剤である。静脈内投与製剤は、水性又は非水性の等張性無菌溶液又は懸濁液の形態であり、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、培地（とくに、ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞の培養に用いられる培地）、ＰＢＳなどの生理緩衝液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等とを適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化される。

注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールや非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等と併用してもよい。

本発明の医薬組成物の投与対象となるＡＬＳは、家族性か孤発性かを問わず、軽症か重症かも問わない。軽症のＡＬＳの場合には、本発明の医薬組成物の投与により症状の改善と進行抑制が期待でき、中等度から重症のＡＬＳの場合には進行抑制が期待できる。

本発明の医薬組成物の投与回数や投与間隔は、特に限定されない。例えば、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、治療効果が期待できる限り、複数回繰り返して投与することができる。初回投与の後、症状が進行する毎に投与してもよいし、定期的に投与してもよい。したがって、投与間隔は、症状に応じて、１ヶ月から１０数年、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、６カ月、１年、２年、３年～１０数年であり得る。投与を繰り返すことで、症状を良い状態に保て、生存期間も伸ばすことができる。

本発明の医薬組成物は、公知のＡＬＳ治療薬、例えば、リソゾール、エダラボン、ペニシリン、βラクタム系抗生物質などと併用することもできる。

本発明の医薬組成物は、ＢＢＢ／ＢＳＣＢの破綻を抑制するとともに、神経栄養因子の発現を促し、神経障害を抑制することができる。本発明の医薬組成物は、症状の進行程度によらず、運動機能の低下を抑え、生存期間を延長することができる。

以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

参考例１：ラット骨髄由来間葉系幹細胞の調製
以下の実施例で使用するＭＳＣは、既報にしたがい、以下の手順で調製した。
実験は、札幌医科大学の動物実験管理規定にしたがって実施した。既報に従い、成熟ＳＤラットの大腿骨から得た骨髄をダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２５ｍｌに希釈し、加熱不活化した１０％ＦＢＳ，２ｍＭ １－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン，０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加し、５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃で３日間インキュベートした（Ｋｉｍ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００６；１１２３：２７－３３．Ｕｋａｉ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２００７；２４：５０８－５２０．）。コンフルエントになるまで培養し、接着細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで剥離し、１ｘ１０^４個／ｍｌの密度で３回継代培養して間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得た。

実施例１：ＡＬＳモデルラットの自然経過
１．行動評価
方法
ＡＬＳモデルラット（ＳＯＤ１ラット（ＳＤ Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）Ｌ２６Ｈ））は、タコニックバイオサイエンスより購入し、行動評価を行った。ＳＯＤ１ラットは、ＳＯＤ１遺伝子変異（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）を有し、ヒトＡＬＳの病態を非常によく再現することが知られている
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔａｃｏｎｉｃ．ｃｏｍ／ｒａｔ－ｍｏｄｅｌ／ｓｏｄ１－ｒａｔ）。

結果
発症はテールダウン、又は後肢異常歩行として現れ、急速に（約１０日間）後肢麻痺へと進行した。中等度（Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ：ＢＢＢスコア１５～１１）では、ラットは典型的には片肢に最初の麻痺が現れた。重度（Ｓｅｖｅｒｅ－ステージ：ＢＢＢスコア１０～８）では、両足が麻痺するが、前肢を使って歩くことができた。末期（Ｅｎｄ－ステージ）では、ラットは立ち直り反射ができなくなった（図１）。

２．組織学的評価
方法
ＡＬＳモデルラットの自然経過を組織学的に評価するため、後肢運動機能評価の指標であるＢＢＢスコアが２１点、１１点、０点のラットの脊髄を、Ｋｌｕｖｅｒ－Ｂａｒｒｅｒａ染色（以下ＫＢ染色）により神経細胞と髄鞘を染色し、運動神経細胞数の変化を観察した。ＢＢＢスコアはオープンフィールドにラットを入れて５分間自由に動き回らせ、後肢の運動機能を評価する方法である（正常２１点、症状悪化により点数が下がり１１点で歩行困難、０点がもっとも悪く歩行不可）。

ＡＬＳモデルラットを麻酔薬（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ、キシラジン２０ｍｇ／ｋｇ）で深く麻酔をかけ、ＰＢＳ及び４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅを含む０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（４％ＰＦＡ）で灌流固定を行なった。脊髄を取り出しそれぞれＣ１，Ｔ６，Ｌ４領域に切り分け４％ＰＦＡで一晩固定した。固定後パラフィン包埋を行い、１０μｍ厚の切片を切り出しスライドガラスに貼り付けた。その後、ＫＢ染色を行い蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ９０００）で撮影を行なった。

結果
図２に染色像を示す。Ｎｏｒｍａｌ（ＢＢＢスコア２１）から、Ｍｏｄｅｒａｔｅ（ＢＢＢスコア１１）へと症状が進行すると頚髄（Ｃ１）、胸髄（Ｔ６）、腰髄（Ｌ４）のいずれにおいても運動神経細胞（７００μｍ^２以上の大きな細胞）の数が少なくなった。さらに末期症状（ＢＢＢスコア０）になったラットの頚髄、胸髄には神経細胞の残存が確認できたが、腰髄では神経細胞がほぼ完全に失われていた。

実施例２：ＡＬＳモデルラットにおけるＭＳＣ静脈投与の効果（Ｓｔｕｄｙ １：Ｍｏｄｅｒａｔｅ－ステージ）
１．行動評価
方法
ＢＢＢスコアが１５点に低下したＡＬＳモデルラットを、ＭＳＣ投与群（ｎ＝６）とビヒクル投与群（ｎ＝１３）の２群に分け、ＭＳＣ投与群には１ｍＬのビヒクル（ｆｒｅｓｈ ＤＭＥＭ）にＭＳＣを（１．０×１０^６個）溶解させた溶液を、経静脈的に大腿静脈から投与した。ビヒクル投与群には１ｍＬのＤＭＥＭを経静脈的に投与した。免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日からＥｎｄ－ステージになるまで毎日腹腔内投与した。
行動評価はＢＢＢスコアを用いて行い、週に２回以上、オープンフィールドにラットを入れて５分間自由に動き回らせ後肢の運動機能を評価した。評価者はラットがどの治療群に属するか分からないようにした。

結果
ＢＢＢスコアの低下はＭＳＣ投与群で有意に抑制された（図３（Ａ））。特に投与３日目の評価ではＭＳＣ投与群で症状の改善が観察された。ＢＢＢスコアの変化量を示す。ＢＢＢスコアの変化量は、ＭＳＣ投与群ではビヒクル投与群よりも小さかった（図３（Ｂ））。

２．生存期間
方法
行動評価を実施したラットについて、ＭＳＣあるいはビヒクル投与後４０日間の生存率をカプランマイヤー曲線を用いて評価した。

結果
４０日後にビヒクル投与群では半数以上が死亡したが、ＭＳＣ投与群では８０％以上が生き残った（図４）。

３．脊髄運動神経細胞数
方法
ＢＢＢスコアが１５点に低下したＡＬＳモデルラットを、ＭＳＣ投与群（ｎ＝３）とビヒクル投与群（ｎ＝６）の２群に分け、上記と同様にＭＳＣあるいはビヒクルを投与し、投与後１４日目に脊髄（腰髄）前角運動神経細胞を比較した。免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日から投与１４日後の最終評価日まで毎日腹腔内投与した。運動神経細胞の定義は面積が７００μｍ^２以上の細胞とした。

結果
ＭＳＣ投与群はビヒクル投与群に比較して有意に多くの運動神経細胞が保存されていた（図５）。

４．血液脳関門／血液脳脊髄関門（ＢＢＢ／ＢＳＣＢ）の破綻
方法
ＢＢＢスコアが１５点に低下したＡＬＳモデルラットを、ＭＳＣ投与群（ｎ＝４）とビヒクル投与群（ｎ＝４）の２群に分け、上記と同様にＭＳＣあるいはビヒクルを投与し、投与後１４日目に、血液脳関門／血液脳脊髄関門（ＢＢＢ／ＢＳＣＢ）の破綻を評価するため、それぞれのラットに４％エバンスブルー（ＥｖＢ，Ｓｉｇｍａ，４ｍｌ／ｋｇ）を尾静脈から投与した。１時間後に麻酔薬（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇ、キシラジン２０ｍｇ／ｋｇ）で深く麻酔をかけて、ＰＢＳ及び４％ＰＦＡで灌流固定した。脳及び脊髄を取り出した後、脳、脳幹（延髄）、頸髄、腰髄の４部位に分けてそれぞれＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し－８０℃に冷却したアセトン中で凍結させた。Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて２０μｍ切片を１００μｍ間隔で９枚切り出しスライドガラスに貼り付けた。ＤＡＰＩで対比染色を行いＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてカバースライドをかけた。切片は共焦点顕微鏡を用いて観察し、血管外に漏出したエバンスブルーの面積をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて測定した。Ｅｘ／Ｅｍ（４０５ｎｍ ｆｏｒ ＤＡＰＩ，４８８ｎｍ ｆｏｒ ＦＩＴＣ－ｌｅｃｔｉｎ，ａｎｄ ５６１ｎｍ ｆｏｒ ＥｖＢ；ＬＳＭ７８０ ＥＬＹＲＡ Ｓ．１ ｓｙｓｔｅｍ，Ｚｅｉｓｓ）。

結果
脳皮質、脳幹（延髄）、頚髄、腰髄いずれにおいても、ＭＳＣ投与群では有意にエバンスブルーの漏出が少ないことが確認され、ＢＢＢ／ＢＳＣＢの破綻が抑制又は修復されていることが確認できた（図７）。

５．Ｎｒｔｎの発現解析（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）
方法
ＢＢＢスコアが１５点に低下したＡＬＳモデルラットを、ＭＳＣ投与群（ｎ＝４）とビヒクル投与群（ｎ＝４）の２群に分け、上記と同様にＭＳＣあるいはビヒクルを投与し、２４時間後に麻酔薬で深く麻酔をかけた後、脊髄（腰髄）を取り出し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖｅｎｌｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの品質はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ ６０００ｎａｎｏ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＲＩＮ ｎｕｍｂｅｒを確認し、ＲＩＮ＞８．０のサンプルのみを用いた。定量はｑＲＴ－ＰＣＲ法で行い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（Ｇａｐｄｈ，Ｒｎ０１７７５７６３＿ｇ１；Ｎｒｔｎ）、ＰＲＩＳＭ７５００ ｗｉｔｈ ７５００ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用した。ΔΔＣｔ法を用いて、内因性コントロールはＧａｐｄｈとし、ビヒクル投与群に対するＭＳＣ投与群の遺伝子発現比を比較した（ｎ＝４）。サーマルサイクラーのプロトコルは以下の通り。
５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル。

結果
ＭＳＣ投与群で有意にＮｒｔｎの発現量が高かった（図７）。ＮｒｔｎはＧＤＮＦファミリーの１つであり、そのｍＲＮＡ発現が有意にＭＳＣ投与群で増加することが確認された。この結果から、ＭＳＣ移植により、脊髄前角の運動神経細胞に対する神経栄養作用が発揮され、組織学的には残存神経細胞数が多くなり、それにより神経症状での治療効果に結びついたと考えられる。

実施例３：ＡＬＳモデルラットにおけるＭＳＣ静脈投与の効果（Ｓｔｕｄｙ ２：Ｓｅｖｅｒｅ－ステージ）
方法
ＢＢＢ ｓｃｏｒｅが１１点に低下した重度運動機能障害を呈したＡＬＳモデルラットを２群に分け、ＭＳＣ投与群（ｎ＝６）には１ｍＬのビヒクル（ｆｒｅｓｈ ＤＭＥＭ）にＭＳＣ（１．０×１０^６個）を溶解させ、経静脈的に大腿静脈から投与した。ビヒクル投与群（ｎ＝７）には１ｍＬのビヒクル（ｆｒｅｓｈ ＤＭＥＭ）を経静脈的に投与し、運動機能及び生存期間を評価した。免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日からＥｎｄ－ｓｔａｇｅになるまで毎日腹腔内投与した。

結果
運動機能の低下はビヒクル投与群（ｎ＝７）に比べてＭＳＣ投与群（ｎ＝６）で有意に抑制され（図８）、生存期間も有意に延長された（図９）。

実施例４：ＡＬＳモデルラットにおけるＭＳＣ複数回投与の効果
１．行動評価
方法
ＢＢＢスコアが１５点に低下した中程度の運動機能障害を呈したＡＬＳモデルラットに対して、ＭＳＣ（１．０×１０^６個）を１週間おきに１回ずつ、複数回静脈内投与を行なった。複数回投与群（ｎ＝９）の運動機能をＢＢＢスコアで評価し、単回投与群（ｎ＝５）及び、ビヒクル投与群（ｎ＝６）と比較した。免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日から最終評価日まで毎日腹腔内投与した。

結果
ＭＳＣの複数回投与群では１回目だけでなく２回目の投与でも運動機能の改善が見られた（図１０）。投与７日目、１４日目いずれもビヒクル投与群に比べて有意に運動機能を抑制した。

２．長期的運動機能
方法
ＭＳＣ複数回投与群（ｎ＝７）の長期的な運動機能の変化をＭＳＣ単回投与群（ｎ＝６）及びビヒクル投与群（ｎ＝１３）と比較した。免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日からＥｎｄ－ステージになるまで毎日腹腔内投与した。

結果
複数回投与群では単回投与群、ビヒクル投与群よりも長期間運動機能を維持することができた（図１１）。

３．生存期間
方法
ＭＳＣ複数回投与群（ｎ＝７）の生存期間をＭＳＣ単回投与群（ｎ＝６）及びビヒクル投与群（ｎ＝１３）と比較した。

結果
複数回投与群では単回投与群、ビヒクル投与群よりも有意に生存期間が延長された（図１２）。

実施例５：ＡＬＳモデルラットにおけるＭＳＣ投与量による効果の違い
方法
ＭＳＣ投与量を低用量群（１．０×１０^５個，ｎ＝３）、通常量（１．０×１０^６個，ｎ＝４）、高用量（１．０×１０^７個，ｎ＝３）の３群に分け、ＢＢＢスコアが１５点に低下したＡＬＳモデルラットに経静脈内投与し、ＢＢＢスコアの変化量をビヒクル投与群（ｎ＝６）と比較した。
免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日から最終評価日まで毎日腹腔内投与した。

結果
通常量及び高用量投与群で有意に運動機能低下が抑制された（図１３）。

実施例６：ＡＬＳモデルラットにおけるＭＳＣ投与方法による効果の違い
方法
ＭＳＣの投与方法を静脈内投与（ｎ＝３）と髄腔内投与（ｎ＝３）の２群に分け、後肢運動機能の変化をビヒクル髄腔内投与群（ｎ＝３）と比較した。静脈内投与群は１ｍＬのＤＭＥＭに溶解したＭＳＣ １．０×１０^６個を大腿静脈から投与し、髄腔内投与群は１．０×１０^５個のＭＳＣをハミルトンシリンジ（ＨＡＭＩＬＴＯＮ）を用いて大槽内に投与した。免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を全てのラットに対してＭＳＣ及びビヒクル投与の前日から最終評価日まで毎日腹腔内投与した。

結果
投与１４日目の評価では静脈内投与群で有意に運動機能低下が抑制された。また、投与３日目には静脈内投与群で症状の改善が確認された（図１４）。

本発明の医薬組成物は、ＢＢＢ／ＢＳＣＢの破綻を防ぐとともに、神経栄養因子の分泌を促し、神経障害を抑制することで、ＡＬＳの進行を抑え、生存期間を延長することができる。本発明によれば、これまで有効な治療手段がなかったＡＬＳの治療が可能になる。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (5)

1. 筋萎縮性側索硬化症（ALS）を治療するための医薬組成物であって、骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞を含み、中等度から重症のALSを有する対象に２回以上静脈内投与され、１回の投与で10 ⁶ 個以上の間葉系幹細胞が投与される医薬組成物。
2. １回の投与で、10 ⁷ 個以上の間葉系幹細胞が投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記間葉系幹細胞が、前記患者の骨髄又は血液由来の間葉系幹細胞である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記間葉系幹細胞が、CD24陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 凍結保存液を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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