JP7555929B2 - Ｂ型肝炎を治療するための薬物製剤、その製造方法及び用途 - Google Patents

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Description

［関連出願の相互参照］
本願は２０１８年１２月２４日に提出された名称が「Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤、その製造方法及び用途」で、出願番号が２０１８１１５８０４７０４である中国発明特許出願の優先権を主張する。
本発明はバイオ医薬品の分野に属し、Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤、その製造方法及び用途に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は世界で深刻な公衆衛生課題の１つである。ＨＢＶ感染は慢性Ｂ型肝炎、肝硬変、肝細胞がんの重要な原因である（Ｆａｔｔｏｖｉｃｈ Ｇ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００８；４８：３３５－３５２）。慢性ＨＢＶ感染の臨床治療によく使用される薬物には主にヌクレオシド類似体、インターフェロンがある。ヌクレオシド類似体は肝細胞内のｃｃｃＤＮＡを完全に除去できず、長期に使用すると薬剤耐性変異体の発生や投与中止後のリバウンドが問題である（Ｋｗｏｎ Ｈ，Ｌｏｋ ＡＳ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１１；８：２７５－２８４）。インターフェロンは無症候性ＨＢＶ保因者に適さず、慢性ＨＢＶ患者で半年の使用後にＨＢｅＡｇ血清変換率が３３％にとどまり、しかもその大きな副作用により使用も制限されている（Ｔａｎｇ ＳＸ，Ｙｕ ＧＬ．Ｌａｎｃｅｔ １９９０；３３５（８６８４）：３０２）。
現在、幅広く使用されるＢ型肝炎ワクチンは体液性免疫を誘導して、防御中和抗体を生じさせることで、予防目的を達成するものである。数多くの研究から分かるように、中和抗体が除去できるのは細胞外のウイルス粒子だけで、細胞内の感染ウイルスの除去は主に特異的な細胞免疫応答や、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞が生じたＩＦＮ－γなどのＴｈ１型サイトカイン、特にウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、略称ＣＴＬ）に頼る（ＣｈｉｎＲ，Ｌａｃａｍｉｎｉ Ｓ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｏｒｌ．２００３：１３（４）：２５５－７２）。細胞性免疫応答の強さが直接的にＢ型肝炎の予後を決定している。したがって、治療用Ｂ型肝炎ワクチンとして理想的なのは特異的な体液性免疫と細胞性免疫を同時に誘導して、Ｂ型肝炎の免疫寛容を突破する必要があるものである。
ＣＮ１０４０４３１２０ＢはＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原（ＨＢｃＡｇ）と、オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）とを含む治療用Ｂ型肝炎ワクチンを提供し、Ｂ型肝炎の免疫寛容を突破できるため、ウイルス性Ｂ型肝炎、とりわけ慢性Ｂ型肝炎の治療に用いられる。
ＣＮ１０４０４３１２０Ｂ
Ｆａｔｔｏｖｉｃｈ Ｇ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００８；４８：３３５－３５２ Ｋｗｏｎ Ｈ，Ｌｏｋ ＡＳ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１１；８：２７５－２８４ Ｔａｎｇ ＳＸ，Ｙｕ ＧＬ．Ｌａｎｃｅｔ １９９０；３３５（８６８４）：３０２ ＣｈｉｎＲ，Ｌａｃａｍｉｎｉ Ｓ．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｏｒｌ．２００３：１３（４）：２５５－７２
従来のＢ型肝炎ワクチンは一般にアジュバントとして水酸化アルミニウムを含み、アルミニウムアジュバントは抗原をその上に吸着させて抗原分子間の相互作用を減らすことで、抗原の安定性を高められる。しかしアルミニウムアジュバントにもいくつかの欠点がある。例えば、アルミニウムアジュバントを含むワクチンの接種には、紅斑、皮下結節、接触過敏症、肉芽腫、筋膜炎などの不良事象が認められる。ＣｐＧアジュバントを用いると水酸化アルミニウムアジュバントの前記不良事象が避けられる。同時に、関連の実験では、スクロースなどの糖類を加えた場合、抗原の保護効果を得られないだけでなく、かえって抗原の安定性が低下するという予想外な事実が判明した。したがって、どのようにワクチンの抗原安定性を一層高めるかは解決すべき課題である。
本発明の目的は従来技術を踏まえて、抗原安定性が向上したＢ型肝炎を治療するための薬物製剤をさらに提供することであり、当該薬物製剤は水酸化アルミニウムなどのアルミニウムアジュバント又は糖類を含まない場合でも、抗原安定性が高く、治療用Ｂ型肝炎ワクチンの大規模な生産及び使用に適する。
本発明は前記目的を達成するために、Ｂ型肝炎を治療するための薬物製剤を提供し、前記薬物製剤はＢ型肝炎ウイルス表面抗原溶液を含み、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液はＢ型肝炎ウイルス表面抗原又はそのフラグメントと、ポリソルベート８０とを含む。
好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液はリン酸塩緩衝剤をさらに含む。
好ましくは、前記薬物製剤はＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液をさらに含み、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液はＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原又はそのフラグメントと、リン酸塩緩衝剤と、ポリソルベート８０とを含む。
より好ましくは、前記薬物製剤はオリゴデオキシヌクレオチド溶液をさらに含み、オリゴデオキシヌクレオチド溶液はオリゴデオキシヌクレオチドと、リン酸塩緩衝剤と、ポリソルベート８０とを含む。
好ましくは、前記リン酸塩緩衝剤はＮａ2ＨＰＯ4と、ＮａＨ2ＰＯ4とを含み、より好ましくは、前記リン酸塩緩衝剤はＮａ2ＨＰＯ4と、ＮａＨ2ＰＯ4と、ＮａＣｌとを含み、さらに好ましくは、Ｎａ2ＨＰＯ4とＮａＨ2ＰＯ4とＮａＣｌの重量比は２：２．４：６～１８であり、好ましくは２：２．４：６～９であり、より好ましくは２：２．４：９である。
好ましくは、前記ポリソルベート８０の濃度は０．０３％（０．０３ｇ／１００ｍＬ）～０．１％（０．１ｇ／１００ｍＬ）であり、好ましくは０．０５％（０．０５ｇ／１００ｍＬ）である。
さらに好ましくは、前記薬物製剤はスクロースなどの糖類を含まない。
好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のアミノ酸配列は配列番号１であり、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原のアミノ酸配列は配列番号２であり、好ましくは、前記オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９から選ばれた１つ以上であり、好ましくは配列番号３である。
好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原フラグメントは配列番号２の１４９～１８３個の連続的なアミノ酸から、好ましくは１５２～１８３個の連続的なアミノ酸から構成される。
前記薬物製剤は、注射液、凍結乾燥粉末注射剤又は無菌分注製剤から選ばれた注射剤である。
さらに本発明は、前記Ｂ型肝炎を治療するための薬物製剤の製造方法であって、
１）リン酸塩緩衝剤に水を加えて溶解してリン酸塩緩衝液を得、ｐＨ値を７．０～７．４に、好ましくは７．２に調整するステップと、
２）ステップ１）で調製したリン酸塩緩衝液でポリソルベート８０を希釈して、ポリソルベート８０溶液を調製するステップと、
３）ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液にＢ型肝炎ウイルス表面抗原原液を加えて、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液を調製するステップと、
４）ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液にＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原原液を加えて、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液を調製するステップと、
５）ステップ１）で調製したリン酸塩緩衝液でオリゴデオキシヌクレオチドを溶解しこれを希釈して原液を得、ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液を加えて、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を調製するステップと、
６）ステップ３）で調製したＢ型肝炎ウイルス表面抗原溶液、ステップ４）で調製したＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液及びステップ５）で調製したオリゴデオキシヌクレオチド溶液を混合して前記薬物製剤を得るステップとを含む前記方法を提供する。
さらに本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患の治療薬物を製造するための、前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤の用途であって、
前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる薬物製剤の用途を提供する。
さらに本発明は、対象にＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び細胞性免疫応答を生じさせる薬物を製造するための、前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤の用途を提供する。
さらに本発明は、対象における抗Ｂ型肝炎ウイルスコア抗体にサブタイプ変異を起こす薬物を製造するための、前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤の用途を提供する。
好ましくは、前記薬物は治療用ワクチンである。
さらに本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患の治療方法であって、治療有効量の前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤をこれを必要とする対象に投与することを含み、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる治療方法を提供する。
さらに本発明は、対象にＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び細胞性免疫応答を生じさせる方法であって、治療有効量の前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤をこれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
さらに本発明は、対象における抗Ｂ型肝炎ウイルスコア抗体にサブタイプ変異を起こす方法であって、治療有効量の前記Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤又は前記製造方法で製造した薬物製剤をこれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本発明者が研究やスクリーニングを重ねて、リン酸塩緩衝液及びポリソルベート８０を成分とするとＢ型肝炎治療用ワクチン用の薬物製剤における抗原安定性が効果的に保持され、興味深いことに、関連の実験では抗原溶液にスクロースなどの糖類を加えると、糖類がタンパク質に保護効果を果たさないだけでなく、抗原の安定性を低下させることが判明した。したがって、本発明に係る薬物製剤は成分が簡単で、糖類を含まず、アルミニウムアジュバントを使用する必要がなく、抗原安定性が高く、長期安定性試験で良好な保存効果が認められ、ワクチンの生産、保存そして使用上のニーズが満たされ、治療用Ｂ型肝炎ワクチンの大規模な生産及び使用に適する。
次に、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
図１は異なるＮａＣｌ濃度のＰＢＳ緩衝液に、ＨＢｓＡｇ製剤を２～８℃、２５℃及び４０℃で１ヶ月静置した安定性研究の結果を示す。 図２はＨＢｓＡｇ製剤を４０℃で静置した安定性研究の結果を示す。 図３はＨＢｓＡｇ製剤を２～８℃で静置した安定性研究の結果を示す。 図４はＨＢｓＡｇ対照製剤、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０配合製剤を４０℃で静置した後のＨＰＬＣ測定結果を示す。 図５はＨＢｃＡｇ製剤を４０℃で静置した安定性研究の結果を示す。 図６はＨＢｃＡｇ製剤を２～８℃で静置した安定性研究の結果を示す。 図７は各成分が独立して保存された薬物製剤を２５℃で静置した後のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図８は各成分が独立して保存された薬物製剤を２５℃で静置した後のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図９は各成分が独立して保存された薬物製剤を２～８℃で静置した後のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図１０は各成分が独立して保存された薬物製剤を２～８℃で静置した後のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図１１は各成分が混合して保存された薬物製剤を２５℃で静置した後のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図１２は各成分が混合して保存された薬物製剤を２５℃で静置した後のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図１３は各成分が混合して保存された薬物製剤を２～８℃で静置した後のＨＢｓＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。 図１４は各成分が混合して保存された薬物製剤を２～８℃で静置した後のＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを示す。
次に具体的な実施形態を用いて本発明を一層詳細に説明し、示される実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。
実施例１：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤の各成分の調製
１．ＨＢｓＡｇ原液の調製：
ＨＢｓＡｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。
ＨＢｓＡｇタンパク質はＨＢｓＡｇ遺伝子組換え酵母細胞から調製され、酵母細胞の種類はハンセヌラ属酵母、出芽酵母、ピキア酵母を含み、好ましくはハンセヌラ属酵母である。
調製手順の詳細は中国特許出願ＣＮ１０８３３０１４５Ａを参照し、ＨＢｓＡｇ遺伝子組換えハンセヌラ属酵母細胞を発酵培養して、菌体を得た。破砕処理そしてシリカゲル吸着、カラムクロマトグラフィー及びＴＦＦなどのステップで精製することにより、ＨＢｓＡｇ原液を調製した。調製したＨＢｓＡｇ原液は純度が９５％を超え、タンパク質含有量が２００μｇ／ｍＬ以上であることが求められる。宿主ＤＮＡ残留量、宿主タンパク質残留量及びその他の化学物質残留量はいずれも薬局方の規定に適合する。
２．ＨＢｃＡｇ原液の調製：
ＨＢｃＡｇタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示すとおりである。
ＨＢｃＡｇタンパク質はＨＢｃＡｇ遺伝子組換え酵母細胞から調製され、酵母細胞の種類はハンセヌラ属酵母、出芽酵母、ピキア酵母を含み、好ましくはハンセヌラ属酵母である。
調製手順の詳細は中国特許出願ＣＮ１０８０４７３１６Ａを参照し、ＨＢｃＡｇ遺伝子組換えハンセヌラ属酵母細胞を発酵培養して、菌体を得た。破砕処理そして硫酸アンモニウム、カラムクロマトグラフィー及びＴＦＦなどのステップで精製することにより、ＨＢｃＡｇ原液を調製した。調製したＨＢｃＡｇ原液は純度が９５％を超え、タンパク質含有量が２００μｇ／ｍＬ以上であることが求められる。宿主ＤＮＡ残留量、宿主タンパク質残留量及びその他の化学物質残留量はいずれも薬局方の規定に適合する。
３．オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）の調製：
オリゴデオキシヌクレオチドは合成して調製されたオリゴデオキシヌクレオチド配列フラグメントであり、１つ以上のＣｐＧモチーフを含み、好ましくは１８～２５個のヌクレオチドを含み、完全にチオ化修飾された配列であり、ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号３）、ＧＴＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＧＣ ＧＣＣ ＡＴＧ（配列番号４）、ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ（配列番号５）、ＴＧＡ ＣＴＧ ＴＧＡ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＡＧ ＡＴＧ Ａ（配列番号６）、ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ（配列番号７）、ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ（配列番号８）、ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（配列番号９）などを含み、好ましくはＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ（配列番号３）である。
調製手順の詳細は中国特許ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例１を参照し、合成したＣｐＧ（配列番号３）は凍結乾燥を行って粉末状のＣｐＧ原薬になり、純度が９０％を超え、含水量が１５％未満で、含有量が７０％以上であることが求められる。重金属不純物、微生物限度試験は薬局方の規定に適合する。
実施例２：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤の製造
１．ＰＢＳ緩衝液：２．０ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、２．４ｇのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、９ｇのＮａＣｌに水を加えて溶解し、１０００ｍＬに希釈し、塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨ値を７．２０に調整した。
２．０．５％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液：５．０ｇのＴｗｅｅｎ８０を秤量し、ＰＢＳ緩衝液で１０００ｍＬに希釈した。
３．ＨＢｓＡｇ溶液：実施例１で調製したＨＢｓＡｇ原液に０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
４．ＨＢｃＡｇ溶液：実施例１で調製したＨＢｃＡｇ原液に０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
５．ＣｐＧ溶液：実施例１で調製したＣｐＧをＰＢＳ緩衝液で溶解し希釈してＣｐＧ原液を得、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
６．ステップ３で調製したＨＢｓＡｇ溶液、ステップ４で調製したＨＢｃＡｇ溶液及びステップ５で調製したＣｐＧ溶液を混合して前記薬物製剤を得た。
実施例３：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤配合のスクリーニング試験
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧの３種の成分で、ＨＢｓＡｇが様々な要因から影響を受けやすく、安定性が最も低い。そのため、ＨＢｓＡｇを指標として製剤配合をスクリーニングした。
ＨＢｓＡｇは主にウイルス様粒子（以下、ＶＬＰという）として存在し、ＨＰＬＣ検出で主ピークの面積は製剤中のＶＬＰの数量を示す。そのため、主ピークの面積減少は製剤中のＶＬＰとしてのＨＢｓＡｇの量の減少を示す。
１）緩衝系スクリーニング：
溶液調製：
１．０．５％ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液は実施例２で調製した。
２．ヒスチジン緩衝液：１．５５ｇのヒスチジン、２．０９５ｇの塩酸ヒスチジンに水を加えて溶解し、１０００ｍＬに希釈した。
３．ＨＢｓＡｇ溶液（ＰＢＳ緩衝液）：ＨＢｓＡｇ原液に０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
４．ＨＢｓＡｇ溶液（ヒスチジン緩衝液）：ＨＢｓＡｇ原液を半透膜で一晩透析して、ヒスチジン緩衝液に移し、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
前記２種のＨＢｓＡｇ溶液を４０℃で１ヶ月静置した後、ＨＰＬＣ検出を行い、結果は表１に示すとおりである。
ＨＰＬＣ検出結果に示すように、ヒスチジン緩衝液で調製したＨＢｓＡｇ溶液は４０℃で１ヶ月静置した後、主ピークの面積が３６．４％減少したが、ＰＢＳ緩衝液で調製したＨＢｓＡｇ溶液は４０℃で１ヶ月静置した後、主ピークの面積の減少はわずか６．１％であった。したがって、製剤の緩衝系としてＰＢＳ緩衝液を選択した。
２）ＰＢＳ緩衝液スクリーニング：
製剤配合にはＰＢＳ緩衝液が使用され、塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨ値を７．０～７．４に、好ましくは７．２に調整した。
ＰＢＳ緩衝液で、ＮａＣｌは緩衝液の浸透圧を調整するために使用され、ＨＢｓＡｇタンパク質にも保護効果があり、そのため試験で適切なＮａＣｌ濃度をスクリーニングし、そのなか、ＰＢはリン酸塩緩衝物質の組み合わせで、すなわちＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2ＯとＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏである。
溶液調製：次の各リン酸塩緩衝剤の組み合わせ（表２）にそれぞれ水を加えて溶解し、１０００ｍＬに希釈して、ＰＢＳ緩衝液を調製した。ＨＢｓＡｇ原液を半透膜で一晩透析して、次の各ＰＢＳ緩衝液に移した。
前記５種のＨＢｓＡｇ溶液を２～８℃、２５℃及び４０℃で１ヶ月静置した後、ＨＰＬＣ検出を行い、結果は図１に示すとおりである。
ＨＰＬＣ検出結果に示すように、緩衝液でＮａＣｌ濃度が０～１８ｇ／Ｌである時、ＮａＣｌ濃度の増加に伴い、１ヶ月静置後のＨＢｓＡｇ溶液の主ピークの面積の減少幅は漸次低減した。２～８℃で１ヶ月静置した場合、５種のＨＢｓＡｇ溶液の主ピークの面積にいずれも明らかな減少は認められなかった。４０℃で１ヶ月静置した場合、５種のＨＢｓＡｇ溶液の主ピークの面積にいずれも明らかな減少が認められ、減少幅は１３．９％～２５．４％であり、ＮａＣｌ濃度の増加に伴い、主ピークの面積の減少幅は漸次低減した。２５℃で１ヶ月静置した場合、ＮａＣｌ濃度が０ｇ／Ｌ及び３ｇ／Ｌである時、主ピークの面積に明らかな減少が認められ、減少幅はそれぞれ１４．８％、１８．２％であり、ＮａＣｌ濃度が６～１８ｇ／Ｌである時、主ピークの面積の減少幅は３．７％以下であった。したがって、製剤の緩衝液としてＰＢ＋６～１８ｇ／ＬのＮａＣｌを選択し、好ましくは６～９ｇ／Ｌであり、より好ましくは９ｇ／Ｌである。
３）賦形剤スクリーニング
溶液調製：
１． ５０％スクロース溶液：５０ｇのスクロースを秤量し、ＰＢＳ緩衝液で１００ｍＬに希釈した。
２．ＨＢｓＡｇ溶液（Ｔｗｅｅｎ８０）：ＨＢｓＡｇ原液に０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でＴｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
３．ＨＢｓＡｇ溶液（スクロース＋Ｔｗｅｅｎ８０）：ＨＢｓＡｇ原液に５０％スクロース溶液及び０．５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え、ＰＢＳ緩衝液でスクロース溶液の濃度を５％に、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度を０．０５％に希釈した。
前記２種のＨＢｓＡｇ溶液を４０℃で１ヶ月静置した後、ＨＰＬＣ検出を行い、結果は表３に示すとおりである。
ＨＰＬＣ検出結果に示すように、スクロース＋Ｔｗｅｅｎ８０で調製したＨＢｓＡｇ製剤は４０℃で１ヶ月静置した後、主ピークの面積は３１．６％減少したが、賦形剤としてのＴｗｅｅｎ８０単独で調製したＨＢｓＡｇ製剤は４０℃で１ヶ月静置した後、主ピークの面積の減少はわずか６．１％であった。つまり、スクロースが抗原に保護効果を果たさず、かえって抗原の安定性を低下させた。したがって製剤の賦形剤としてＴｗｅｅｎ８０を選択すると、抗原安定性が良好であるだけでなく、複雑な成分の潜在的な不良事象があるというリスクは低減された。
実施例４：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤の安定性試験
１．試験群は表４、表５、表６のとおり設定し、製造方法は実施例２と同じであった。
２．安定性試験の設計
各安定性研究サンプルに所定のサンプリング時点でサンプリングし、ＨＰＬＣ検出を行った。
３．試験結果：
１）ＨＢｓＡｇ製剤安定性結果分析：
異なる配合のＨＢｓＡｇ溶液及びＨＢｓＡｇ対照製剤を４０℃で一緒に静置し、それぞれ７、１５そして３０日目にサンプリングして検出を行った。図２及び図３の結果に示すように、Ｔｗｅｅｎ８０なしのＨＢｓＡｇ対照製剤のほうはＨＰＬＣで主ピークの面積減少は最も速く、４０℃で３０日静置すると、主ピークの面積が２３．５％減少した。次は０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０配合の溶液で、１５．９％減少した。０．０３％～０．１％Ｔｗｅｅｎ８０配合の溶液は、三者の減少幅がほぼ同じで、約６％減少した。
異なる配合のＨＢｓＡｇ溶液及びＨＢｓＡｇ対照製剤を２～８℃で一緒に６ヶ月静置した安定性データは４０℃で静置した結果と一致した。６ヶ月後のサンプルは最初のサンプルと比べ、対照製剤（配合にＴｗｅｅｎ８０なし）と、０．０１％、０．０３％、０．０５％及び０．１％Ｔｗｅｅｎ８０配合の溶液の主ピークの面積はそれぞれ１５．４％、１５．８％、１２．２％、６．５％、４．８％減少した。Ｔｗｅｅｎ８０がＨＢｓＡｇ ＶＬＰに保護効果を果たしたことを示す。
図４に示すように、ＨＢｓＡｇ対照製剤を４０℃で７日静置しただけで明らかな凝集ピークが認められ、静置時間の増加につれて、その凝集ピークの面積が漸次増えた。それに対し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０配合の製剤は４０℃で３０日静置した後も明らかな凝集ピークが認められなかった。これはＴｗｅｅｎ８０がＨＢｓＡｇ ＶＬＰを保護し、いずれも単一のＶＬＰとして保持させることで、凝集を避けた。また、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０配合と０．１％Ｔｗｅｅｎ８０配合は効果が同等で、賦形剤の添加量を減らしても潜在的な不良事象を低減できる。
２）ＨＢｃＡｇ製剤安定性結果分析：
ＨＢｃＡｇは同様に主にＶＬＰとして存在し、ＨＰＬＣ検出で主ピークの面積は製剤中のＶＬＰの数量を示す。そのため、主ピークの面積減少は製剤中のＶＬＰとしてのＨＢｃＡｇの量の減少を示す。
図５及び図６のＨＰＬＣ結果に示すように、ＨＢｃＡｇ ＶＬＰが比較的安定的で、２～８℃で６ヶ月静置した場合も４０℃で３０日静置した場合も、ＨＰＬＣで主ピークの面積に明らかな変化は認められなかった。
３）ＣｐＧ製剤安定性結果分析：
各安定性研究サンプルに所定のサンプリング時点でサンプリングし、純度及び相対活性の検出を行った。
純度はＲＰ－ＵＰＬＣ法で検出し、相対活性はセルアッセイで検出し、ＣｐＧ溶液とヒトＴＬＲ９受容体の結合活性を表現し、結果は参照品（発明者が調製したＣｐＧ原液に構造表現及び含有量較正を充分に行ったものを参照品とし、その相対活性値を１００％と定義する）の活性に対するパーセンテージの値で示した。
表８及び表９の純度結果及び相対活性結果に示すように、ＣｐＧ溶液は比較的安定的で、２～８℃で６ヶ月静置した場合も４０℃で３０日静置した場合も、純度及び相対活性に明らかな変化は認められなかった。
実施例５：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤の各成分の独立保存に関する薬力学的検証
１．実験動物：雌で５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス８０匹で、８匹／群であり、提供元は上海霊暢生物科技有限公司であった。
２．試験群の設定：実施例２のステップ１～５に記載の製造方法でそれぞれＨＢｓＡｇ溶液、ＨＢｃＡｇ溶液及びＣｐＧ溶液を調製し、３種の成分を独立的に保存して静置し、表１０に示すとおり所定のサンプリング時点にサンプリングし、サンプリング後、実施例２のステップ６に従ってＨＢｓＡｇ溶液、ＨＢｃＡｇ溶液及びＣｐＧ溶液の３種の成分を混合して、前記薬物製剤を得、それはそれぞれ５０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ、２５μｇ／ｍＬのＨＢｃＡｇ及び２５μｇ／ｍＬのＣｐＧを含み、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が０．０５％であった。当該薬物製剤に薬力学的検証を行った。
３．動物免疫：０日目に脚からの筋肉注射でマウスの免疫接種を行い、免疫は１回であり、接種体積は２００μＬ／匹であり、免疫後７日目に細胞性免疫レベルを評価し、免疫後２８日目に体液性免疫レベルを評価した。
４．細胞性免疫：
１）検出手順：免疫後７日目に脾臓を摘出し、従来の方法で脾臓リンパ細胞を調製し、手順は次のとおりである。滅菌鉗子とはさみを使って無菌操作で脾臓を摘出し、７０μｍセルストレーナーに入れて、２ｍＬの予冷処理後の２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社より購入）－ＰＢＳを含むシャーレに置いた。すりこぎで脾臓を研磨して、脾臓細胞が篩目からシャーレに入ると、細胞懸濁液を得、パスツールピペットで懸濁液を４０μｍセルストレーナー（ＢＤ社より購入）から加えて濾過し、５０ｍＬ滅菌遠心管で５００ｇと４℃で５分間遠心分離した。上清を捨て、２ｍＬの１×赤血球破壊剤（ＢＤ社より購入）を加えて細胞を再懸濁させ、４℃の暗所で５分間静置して、赤血球を破砕させた。１０ｍＬの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて赤血球破壊反応を停止した。５００ｇと４℃で５分間遠心分離した。上清を捨て、５ｍＬの２％ＦＢＳ－ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁させて使用に備えた。刺激物質としてそれぞれＨＢｓＡｇ特異的ペプチドライブラリーＰＳ４及びＨＢｃＡｇ特異的ペプチドライブラリーＰＣＰで脾臓細胞を刺激した。キットの取扱説明書に従い、ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＢＤ社）でＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩＦＮ－γの分泌レベルを検出した。ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ Ｓｅｒｉｅｓ ３酵素結合スポットアナライザーを用いてＥＬＩＳＰＯＴキットで検出したスポット数を読み取った（操作手順の詳細は中国特許出願ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例７を参照した）。
ＨＢｓＡｇ特異的ペプチドライブラリーＰＳ４は中国特許出願ＣＮ１０４０４３１２０Ｂの実施例７に、ＨＢｃＡｇ特異的ペプチドライブラリーＰＣＰ配列は配列番号１０～２４に示した。
２）評価指標：無血清培地ウェルのスポット数≦５ＳＦＣ、サンプルウェルのスポット数≧１０ＳＦＣである場合、陽性と判定する。５ＳＦＣ＜無血清培地ウェルのスポット数≦１０ＳＦＣ、サンプルウェルのスポット数／無血清培地ウェルのスポット数≧２である場合、陽性と判定する。無血清培地ウェルのスポット数＞１０ＳＦＣ、サンプルウェルのスポット数／無血清培地ウェルのスポット数≧３である場合、陽性と判定する。
５．体液性免疫：
１）検出手順：免疫後２８日目に採血し、血清を分離し（全血を３７℃恒温インキュベーターに４０分間静置し、１２０００ｒｐｍと４℃で１０分間遠心分離し、上清を吸って、－２０℃で冷凍保存して使用に備えた）、キットの取扱説明書に従い、ＥＬＩＳＡキット（上海科華）で生じたＨＢｓＡｂ及びＨＢｃＡｂ抗体陽性変換率（抗体陽転率）を検出した。検出にブランク対照、陰性対照及び被験サンプルを設け、各ウェルは２回繰り返し測定し、陰性対照は陰性マウス血清であった。ブランク対照の他に、各ウェルにそれぞれ陰性対照又は被験サンプルを加え、さらに酵素コンジュゲートを加え、均一に混合してカバーした後３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で各ウェルを洗浄し、各ウェルに顕色剤のＡ剤及び顕色剤のＢ剤を加え、均一に混合してカバーした後３７℃で１５分間インキュベートした。各ウェルに停止液を加えて均一に混合した。マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍ箇所の各ウェルのＯＤ値を読み取った。
２）評価指標：ＨＢｓＡｂの参照値であるカットオフ値（ＣＯＶ）＝陰性対照の平均ＯＤ値×２．１。サンプルのＯＤ値がＣＯＶ値より小さい場合、検出結果は陰性である。サンプルのＯＤ値がＣＯＶ値より大きく又は等しい場合、検出結果は陽性である。
ＨＢｃＡｂの参照値であるカットオフ値（ＣＯＶ）＝陰性対照の平均ＯＤ値×０．３。サンプルのＯＤ値がＣＯＶ値より小さい場合、検出結果は陽性である。サンプルのＯＤ値がＣＯＶ値より大きく又は等しい場合、検出結果は陰性である。
６．試験結果：
１）２５℃安定性試験条件：
結果分析：
細胞性免疫レベル検出結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図７及び図８であり、結果を分析して分かるように、０～６ヶ月のＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％で、ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％であり、いずれも７０％を超えたから、細胞性免疫の検出が合格であった。体液性免疫レベルの検出結果に示すように、ＨＢｓＡｂ陽転率及びＨＢｃＡｂ陽転率はいずれも６２．５％以上で、いずれも５０％を超えたから、体液性免疫の検出結果が合格であった。
２）２～８℃安定性試験条件：
結果分析：
細胞性免疫レベル検出結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図９及び図１０であり、結果を分析して分かるように、０～１２ヶ月のＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％で、ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率は８７．５％を超えており、いずれも７０％を超えたから、細胞性免疫の検出が合格であった。体液性免疫レベルの検出結果に示すように、ＨＢｓＡｂ陽転率及びＨＢｃＡｂ陽転率はいずれも６２．５％以上で、いずれも５０％を超えたから、体液性免疫の検出結果が合格であった。
実施例６：治療用Ｂ型肝炎ワクチン製剤の各成分の混合保存に関する薬力学的検証
１．実験動物：雌で５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス６４匹で、８匹／群であり、提供元は上海霊暢生物科技有限公司であった。
２．試験群の設定：実施例２の製造方法で前記薬物製剤を製造し、それはそれぞれ５０μｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇ、２５μｇ／ｍＬのＨＢｃＡｇ溶液及び２００μｇ／ｍＬのＣｐＧ溶液を含み、Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が０．０５％であった。静置保存後、表１３のとおり所定のサンプリング時点にサンプリングして、薬力学的検証を行った。
３．動物免疫：０日目に脚からの筋肉注射でマウスの免疫接種を行い、免疫は１回であり、接種体積は２００μＬ／匹であり、免疫後７日目に細胞性免疫レベルを評価し、免疫後２８日目に体液性免疫レベルを評価した。
４．細胞性免疫：検出手順と評価指標は実施例５と同じであった。
５．体液性免疫：検出手順と評価指標は実施例５と同じであった。
６．実験結果：
１）２５℃安定性試験条件：
結果分析：
細胞性免疫レベル検出結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図１１及び図１２であり、結果を分析して分かるように、０～３ヶ月のＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％で、ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率は７５％を超えており、いずれも７０％を超えたから、細胞性免疫の検出が合格であった。体液性免疫レベルの検出結果に示すように、ＨＢｓＡｂ陽転率及びＨＢｃＡｂ陽転率はいずれも６２．５％以上で、いずれも５０％を超えたから、体液性免疫の検出結果が合格であった。
２）２～８℃安定性試験条件：
結果分析：
細胞性免疫レベル検出結果：ＥＬＩＳＰＯＴスポット結果は図１３及び図１４であり、結果を分析して分かるように、０～６ヶ月のＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％で、ＨＢｃＡｇ特異的ＩＦＮ－γ陽転率はいずれも１００％であり、いずれも７０％を超えたから、細胞性免疫の検出が合格であった。体液性免疫レベルの検出結果に示すように、ＨＢｓＡｂ陽転率及びＨＢｃＡｂ陽転率はいずれも６２．５％以上で、いずれも５０％を超えたから、体液性免疫の検出結果が合格であった。
上述したように、本発明に係るＢ型肝炎を治療するための薬物製剤は糖類を含まず、ＣｐＧアジュバントを使用して水酸化アルミニウムアジュバントの不良事象を避けたと同時に、適量のポリソルベート８０及びリン酸塩緩衝剤を加えることで、配合の成分が簡単で、抗原安定性が高く、長期安定性試験で良好な保存効果が認められ、ワクチンの生産、保存と使用上のニーズが満たされ、治療用Ｂ型肝炎ワクチンの大規模な生産及び使用に適し、市場に明るい将来性が見込まれる。
上記の内容で本発明を詳細に説明したが、当業者であれば理解したように、本発明の趣旨と範囲を逸脱せず本発明に様々な修正や変更を行うことができる。本発明の特許請求の範囲は上記の詳細な説明に限定されず、前記修正や変更も特許請求の範囲に含まれる。

Claims (14)

  1. Ｂ型肝炎を治療する薬物製剤であって、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液を含み、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液はＢ型肝炎ウイルス表面抗原又はその抗原性フラグメントと、ポリソルベート８０と、リン酸塩緩衝剤と、水とからなり、前記ポリソルベート８０の濃度は０．０３ｇ／１００ｍＬ～０．１ｇ／１００ｍＬであり、
    前記リン酸塩緩衝剤は、Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 と、ＮａＨ 2 ＰＯ 4 と、ＮａＣｌとを含み、Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 とＮａＨ 2 ＰＯ 4 とＮａＣｌの重量比は２：２．４：６～１８である薬物製剤。
  2. 前記薬物製剤はＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液をさらに含み、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液はＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原又はその抗原性フラグメントと、リン酸塩緩衝剤と、ポリソルベート８０とを含む請求項１に記載の薬物製剤。
  3. 前記薬物製剤はオリゴデオキシヌクレオチド溶液をさらに含み、オリゴデオキシヌクレオチド溶液はオリゴデオキシヌクレオチドと、リン酸塩緩衝剤と、ポリソルベート８０とを含む請求項１又は２に記載の薬物製剤。
  4. Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 とＮａＨ2ＰＯ4とＮａＣｌの重量比が２：２．４：６～９であり、より好ましくは２：２．４：９である請求項１～３のいずれか１項に記載の薬物製剤。
  5. 前記ポリソルベート８０の濃度は０．０５ｇ／１００ｍＬである請求項１～３のいずれか１項に記載の薬物製剤。
  6. 前記薬物製剤はスクロースなどの糖類を含まない請求項１～３のいずれか１項に記載の薬物製剤。
  7. 前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のアミノ酸配列は配列番号１であり、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原のアミノ酸配列は配列番号２であり、好ましくは、前記オリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９から選ばれた１つ以上であり、好ましくは配列番号３である請求項１～６のいずれか１項に記載の薬物製剤。
  8. 前記Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原フラグメントは配列番号２の１４９～１８３個の連続的なアミノ酸から、好ましくは１５２～１８３個の連続的なアミノ酸から構成される請求項７に記載の薬物製剤。
  9. 注射液、凍結乾燥粉末注射剤又は無菌分注製剤から選ばれた注射剤である請求項１～８のいずれか１項に記載の薬物製剤。
  10. １）リン酸塩緩衝剤に水を加えて溶解してリン酸塩緩衝液を得、ｐＨ値を７．０～７．４に、好ましくは７．２に調整するステップと、
    ２）ステップ１）で調製したリン酸塩緩衝液でポリソルベート８０を希釈して、ポリソルベート８０溶液を調製するステップと、
    ３）ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液にＢ型肝炎ウイルス表面抗原原液を加えて、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原溶液を調製するステップと、
    ４）ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液にＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原原液を加えて、Ｂ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液を調製するステップと、
    ５）ステップ１）で調製したリン酸塩緩衝液でオリゴデオキシヌクレオチドを溶解しこれを希釈して原液を得、ステップ２）で調製したポリソルベート８０溶液を加えて、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を調製するステップと、
    ６）ステップ３）で調製したＢ型肝炎ウイルス表面抗原溶液、ステップ４）で調製したＢ型肝炎ウイルスコア関連抗原溶液及びステップ５）で調製したオリゴデオキシヌクレオチド溶液を混合して前記薬物製剤を得るステップとを含む請求項１～９のいずれか１項に記載の薬物製剤の製造方法。
  11. Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患の治療薬物を製造するための、請求項１～９のいずれか１項に記載のＢ型肝炎を治療する薬物製剤の使用であって、好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎ウイルス媒介性疾患はＢ型肝炎、肝硬変、肝がんから選ばれる薬物製剤の使用。
  12. 対象にＢ型肝炎ウイルスに対する体液性免疫及び細胞性免疫応答を生じさせるための薬物を製造するための、請求項１～９のいずれか１項に記載のＢ型肝炎を治療する薬物製剤の使用。
  13. 対象におけるＢ型肝炎ウイルスコア抗体にサブタイプ変異を起こすための薬物を製造するための、請求項１～９のいずれか１項に記載のＢ型肝炎を治療する薬物製剤の使用。
  14. 前記薬物は治療用ワクチンである請求項１１～１３のいずれか１項に記載の使用。
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