JP7565219B2 - がんを予防及び治療するためのｇｒｅｍｌｉｎ－１アンタゴニスト - Google Patents

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Description

本発明は、がんの治療方法における使用のための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストに関する。該がんは、典型的には間質を有する固形がんであり、典型的には間質性ＧＲＥＭ１を過剰発現している。該がんでは、上皮ＧＲＥＭ１を過剰発現している場合もある。本発明は、更に、ＧＲＥＭ１アンタゴニストと追加の抗がん（例えば、化学療法）剤との併用療法、及び関連する組成物に関する。本発明は、また、間質性ＧＲＥＭ１の過剰発現に基づく、がんの検出、予後判定、及び治療の選択に関する。
Ｇｒｅｍｌｉｎ－１（Ｄｒｍ及びＣＫＴＳＦ１Ｂ１及びＧＲＥＭ１としても知られている）は、（特にＣｅｒｂｅｒｕｓ及びＤａｎと共に）シスチンノット分泌タンパク質のＤＡＮファミリーの一部を形成する１８４アミノ酸の糖タンパク質である。ＧＲＥＭ１は、恐らくＶＥＧＦＲ２のアゴニズムを介して血管新生を促進する役割を果たすことが報告されていることに加えて、ＢＭＰ－２、４、及び７に結合し、シグナル伝達能力を阻害する。ＧＲＥＭ１は主に発生中に役割を果たし、腎臓形成中及び肢芽形成中に極めて重要である。これら極めて重要な役割を果たしていることから、マウスにおいてＧＲＥＭ１ホモ欠損は胚性致死になる。
成体期には、ＧＲＥＭ１のレベルの上昇は、ＴＧＦβレベルの関連する上昇と共にＢＭＰ２、４、及び７のシグナル伝達が減少する特発性肺線維症及び肺動脈高血圧症と関連している。糖尿病性腎症と慢性移植腎症の両方において、ＧＲＥＭ１の発現は線維症スコアと相関している。
ＧＲＥＭ１のレベルの上昇は、特に強皮症、糖尿病性腎症、神経膠腫、頭頸部がん、前立腺がん、及び結腸直腸がんにも関連している（Ｓｎｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ）。ＧＲＥＭ１は、インビトロでがん細胞の浸潤及び増殖を活性化することが示されており、子宮がん、子宮頸がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、及び肉腫において役割を果たしていると考えられる。
がんの治療及び予防における使用のための有効な治療法を同定することが必要とされている。
本発明者らは、驚くべきことに、ＧＲＥＭ１アンタゴニストが、結腸直腸がん及び多発性骨髄腫を含む間質及び／又は上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現している新形成に対して有効な治療及び予防剤であることを示した。本発明者らは、これら結果に基づいて、間質でＧＲＥＭ１が過剰発現している他のがんを含むがんの治療及び予防においてＧＲＥＭ１アンタゴニストが汎用的に有用であると予想する。本明細書で提供されるインビボにおける結果は、ＧＲＥＭ１アンタゴニストの投与による様々なマウス腫瘍モデルにおける新形成の誘導の長期的な予防、及びＧＲＥＭ１アンタゴニストの投与による既存の腫瘍に対する顕著な治療的影響を明らかにする。従って、本発明者らの知見は、標準的な化学療法剤に対して抵抗性のあるがんを含むがんの予防及び治療に対する新たなアプローチを提供する。
従って、本発明の第１の態様では、がんを治療又は予防する方法において使用するための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストが提供される。
本発明の更なる態様では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを別々、逐次、又は同時に投与することを含む、がんを治療する方法において使用するための抗がん剤が提供される。
本発明の別の態様では、治療上有効な量の抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを、それを必要としている被験体に投与することを含む、がんを治療する方法が提供される。
本発明の更に別の態様では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニスト及び追加の抗がん剤を含む組成物又はキットが提供される。
本発明の更なる態様では、患者におけるがんを検出する方法であって、該患者における間質でのＧＲＥＭ１の発現を測定することを含み、間質でのＧＲＥＭ１の過剰発現が、該患者ががんを有していることを示す方法が提供される。
本発明の更に別の態様では、患者におけるがんの予後を判定する方法であって、該がんにおいてＧＲＥＭ１が間質で過剰発現しているか否かを判定することを含み、該がんにおける間質でのＧＲＥＭ１の過剰発現が、ＧＲＥＭ１が間質で正常に発現している状況よりも該患者の予後が悪いことを示す方法が提供される。
本発明の別の態様では、がんを有しているか、又はがんを有している若しくはがんを発症するリスクがあると疑われる患者が、化学療法剤による治療に応答する可能性があるか否かを判定する方法であって、該患者における間質でのＧＲＥＭ１の発現を測定し、それによって、該患者が該化学療法剤による治療に応答する可能性があるか否かを予測することを含む方法が提供される。
本発明の更に別の態様では、がんを有しているか、又はがんを有している若しくはがんを発症するリスクがあると疑われる患者が、ＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療に応答する可能性があるか否かを判定する方法であって、該患者における間質でのＧＲＥＭ１の発現を測定し、それによって、該患者が該ＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療に応答する可能性があるか否かを予測することを含む方法が提供される。
ＨＥＫ－ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイにおける免疫由来抗体のシグナル回復率。 ＨＥＫ－ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイにおけるライブラリ由来抗体のシグナル回復率。 ヒトＧｒｅｍｌｉｎ（図３Ａ）及びマウスＧｒｅｍｌｉｎ（図３Ｂ）の滴定を用いたＨＥＫ－ＩＤ１レポーター遺伝子アッセイの結果、並びにＢＭＰのシグナル伝達の回復における抗体７３２６（抗体ＰＢ３７６として示されている）の効果。 Ｇｒｅｍｌｉｎ－Ｆａｂ複合体の構造モデル。可能性のあるＢＭＰ結合領域及びＦａｂエピトープがハイライトされている。 播種後０日目及び７日目におけるマウス腸陰窩由来のオルガノイド培養物。培地は、組換えタンパク質の補給及び／又は試験抗Ｇｒｅｍ１抗体を含有する。Ｅ＝上皮成長因子、Ｇ＝Ｇｒｅｍ１、Ｒ＝Ｒｓｐｏ１。 Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス上皮から抽出したタンパク質のウェスタンブロット。３０ｍｇ／ｋｇの抗体を６週間投与すると、上皮のｐＳＭＡＤ１、５のシグナル伝達を回復させることができる。 抗Ｇｒｅｍ１抗体で６週間処理した後の、抗体で処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１動物の表現型。抗体処理によって、小腸の表現型が正常化し、重篤なポリポーシスの発症が予防される。抗体処理によって、絨毛異所性陰窩形成が予防され、腸陰窩基部へのＫｉ６７、Ｓｏｘ９、ＥｐｈＢ２、及びリゾチームの染色の適切な制限並びに小腸絨毛の分化細胞における正常ＣＫ２０染色の回復を伴う、細胞運命の決定が正常化される。 長期間抗Ｇｒｅｍ１抗体処理した後のＧｒｅｍ１起始ポリポーシスマウス系統の生存率のカプランマイヤープロット。 Ａｐｃ駆動腫瘍形成における間質Ｇｒｅｍ１。Ａ．野生型、及び急性上皮Ａｐｃ喪失に応答して間質Ｇｒｅｍ１の顕著なアップレギュレーションを示すＶｉｌｌｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ａｐｃ ｆｌ／ｆｌマウスにおけるＧｒｅｍ１ ＩＳＨ。Ｂ．ＡｐｃＭｉｎマウスにおける間質Ｇｒｅｍ１のトランスジェニック欠失は、２８５日目に変異型Ａｐｃ腫瘍負荷を減少させる。Ｃ．抗Ｇｒｅｍ１抗体（３０ｍｇ／ｋｇ／週）で長期間処理すると、ＡｐｃＭｉｎ腫瘍負荷が減少し、動物の寿命が延長される。 骨髄腫患者由来の初代間質培養物ではＧｒｅｍ１の発現が上昇する。年齢と性別を揃えた健常者ドナー及び骨髄腫患者の骨髄トレフィン由来の間質細胞培養物からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりＧｒｅｍ１の発現を解析した。骨髄腫患者コホートでは、健常者ドナーと比較してＧｒｅｍ１の発現が有意に高かった。データは、ＡｃｔＢに対して正規化したｍＲＮＡ発現として示す。（平均±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．００１、Ｔ検定、正常；ｎ＝１７及びＭＭ；ｎ＝１５）。 Ｇｒｅｍ１発現を、（Ａ）健常Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊ．Ｈｓｄマウス及びＢＬＩを介して検出可能な疾患を有する５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを注射したマウスの緻密骨において分析した。（平均±ＳＤ、Ｐ＝０．１１２０、Ｔ検定、正常；ｎ＝１１、担がん；ｎ＝９）。（Ｂ）担がんマウスの後肢から単離したＢＭの間質におけるＧｒｅｍ１の発現は、ＢＬＩによって検出したとき、それぞれの肢における腫瘍負荷と相関していた（ピアソン相関；ｐ＜０．０５、Ｒ２＝０．４１４）。 Ｇｒｅｍ１の発現を、（Ａ）上部３μｍのトランスウェルで共培養した５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１細胞、（Ｂ）接着性間質細胞に直接プレーティングした５ＴＧＭ１．親細胞と共に２４時間、４８時間、及び７２時間共培養した後、マウス骨髄由来間質ＯＰ９細胞株において分析した。接触培養については、リアルタイムＰＣＲを介したＧｒｅｍ１発現の解析のために、５ＴＧＭ１．親ＭＭ ＰＣからＦＡＣＳによってＯＰ９．ＧＦＰ＋細胞を選別した。７２時間の共培養後にＯＰ９間質細胞においてＧｒｅｍ１発現の有意な増加が観察された。データは、ＡｃｔＢに対するｍＲＮＡ発現として示され、培地のみの対照に対して正規化されている。（３つの反復実験の平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、ｔ検定）。 様々なヒトＭＭ細胞株と共に７２時間共培養した正常ヒト間質において、Ｇｒｅｍｌｉｎ１の発現を分析した。Ｇｒｅｍ１発現を分析するために採取する前に、間質からＭＭ細胞を洗浄した。ＫＭＳ－１１（ｐ＝０．０１５９）及びＵ２６６（ｐ＝０．０３４３）の共培養条件では、Ｇｒｅｍｌｉｎ１発現が有意に増加した（分散分析）。データは、３人の別々の正常間質ドナーとの共培養物からの反復試験として示され、培地のみの対照に対して正規化されている。 ＯＰ９間質細胞におけるＧｒｅｍ１トランスジーンの発現を（Ａ）ＲＴ－ＰＣＲ及び（Ｂ）ウェスタンブロットにより確認した。Ｇｒｅｍ１を過剰発現するように改変されたＯＰ９間質細胞との（Ｃ）細胞接触（Ｄ）トランスウェル共培養において５ＴＧＭ１ ＭＭ ＰＣは、相対ルシフェラーゼ活性によって測定したとき、ＯＰ９ベクターのみの対照との共培養と比較して増殖速度の増大を示した。（３回の反復実験の平均±ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｔ検定）。 （Ａ）５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを注射し、その後、Ｇｒｅｍ１中和抗体で処理したＣ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスは、ＢＬＩによって示したとき、４週間後にＩｇＧ対照で処理したマウスと比較して、全身腫瘍負荷の有意な減少を示した。平均±ＳＥＭ、ｎ＝１３マウス／群＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。（Ｂ）腫瘍細胞注射後４週目に採血したマウスに対してＳＰＥＰを行った。血清アルブミンに対するＭスパイク強度を疾病負荷の尺度として用いた。抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理したマウスは、ＩｇＧ対照処理を受けたマウスと比較してＭスパイク強度が有意に低かった。平均±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．０１、ｔ検定。（Ｃ）ＩｇＧ対照及びＧｒｅｍ１中和抗体で処理したマウスの代表的なＢＬＩ腹腔内スキャン画像。 ５ＴＧＭ１ ＭＭ細胞を、ＯＰ９－Ｇｒｅｍ１過剰発現細胞又はベクターのみの対照の存在下、３μｍトランスウェルにおいて７２時間共培養した。５ＴＧＭ１細胞からの溶解物を、Ｓｍａｄｓ１／５／９のリン酸化についてウェスタンブロットで分析した。５ＴＧＭ１細胞は、Ｇｒｅｍ１過剰発現ＢＭ間質細胞の存在下で培養した場合、ベクターのみの対照と比較して、Ｓｍａｄｓ１／５／９のリン酸化の減少を示す。Ｈｓｐ９０をローディング対照として用いた。２回の反復実験の代表的な画像。 ＢＭ間質細胞株ＯＰ９を、２０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ６で７２時間処理した後、Ｇｒｅｍ１の発現について評価した。ＩＬ６で刺激したＯＰ９細胞では、Ｇｒｅｍ１発現の有意な増加が観察された。（３回の反復実験の平均±ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１）。 （Ａ）５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを接種する前にＧｒｅｍ１中和抗体（Ａｂ７３２６）の処理を受けたＣ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスは、ＢＬＩによって示したとき、ＩｇＧ対照（Ａｂ１０１．４）の処理を受けたマウスと比較して、細胞接種後４週目に全身腫瘍負荷の有意な減少を示した。平均±ＳＥＭ、ｎ＝７～８マウス／群＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析。（Ｂ）腫瘍細胞注射後４週目に採血したマウスに対してＳＰＥＰを行った。血清アルブミンに対するＭスパイク強度を疾病負荷の尺度として用いた。抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理したマウスは、ＩｇＧ対照処理を受けたマウスと比較してＭスパイク強度が有意に低かった。平均±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．０００１、ｔ検定。（Ｃ）腫瘍細胞接種４週間後のＩｇＧ対照及びＧｒｅｍ１中和抗体で処理したマウスの代表的なＢＬＩ腹腔内スキャン画像。 Ｇｒｅｍ１ ｍＲＮＡ発現の定量ＲＴ－ＰＣＲ解析。Ｇｒｅｍ１遺伝子の発現を、正常酸素圧及び低酸素条件下で４８時間培養した後の（Ａ）ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ乳がん細胞及び（Ｂ）ヒトＭＦ９乳腺線維芽細胞において分析した（ｎ＝１）。発現レベルはＲＴ－ＰＣＲによって測定し、β－アクチンに対して正規化した。トリプリケートのウェルの平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、スチューデントの独立ｔ検定。 Ｇｒｅｍ１による刺激に応答したヒト乳がん細胞の増殖。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ細胞を様々な濃度のｒｈＧｒｅｍ１で刺激し、正常酸素圧条件下（各対の左側のバー）及び低酸素条件下（各対の右側のバー）で（Ａ）２４時間及び（Ｂ）４８時間培養した。データは、トリプリケートで実施した３つの独立した実験の代表である。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、チューキーの多重比較検定を伴う二元配置分散分析。 間質由来のＧｒｅｍ１に応答したマウス４Ｔ１乳がん細胞の増殖。４Ｔ１細胞を、Ｇｒｅｍ１発現細胞又はベクター対照ＯＰ９間質細胞と共に７２時間共培養した。データは、トリプリケートで実施した３つの独立した実験の代表である。平均±ＳＤ、＊＊＊ｐ＜０．０００５、スチューデントの独立ｔ－検定（両側）。 新規抗Ｇｒｅｍ１抗体（Ａｂ７３２６）は、マウス４Ｔ－１乳がん細胞におけるＳｍａｄ１／５／９リン酸化のＧｒｅｍ１に媒介される阻害を逆転させる。マウス４Ｔ１乳がん細胞を、指定の処理の組み合わせで２時間刺激し、ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｍａｄ１／５／９に対して反応性の抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した（上のパネル）。β－アクチン（下のパネル）はローディング対照として機能した。 ＶＧ／Ｍｉｎマウスにおける単剤療法及び併用療法の効果。 様々な固形腫瘍におけるＧｒｅｍ１の発現。 膀胱がんにおけるＧｒｅｍ１発現と生存率（survival implications）との関係。上の線－Ｇｒｅｍ１低、下の線－Ｇｒｅｍ１高。 膵管腺がんにおけるＧｒｅｍ１発現と生存率との関係。上の線－Ｇｒｅｍ１低、下の線－Ｇｒｅｍ１高。 卵巣腺がんにおけるＧｒｅｍ１発現と生存率との関係。上の線－Ｇｒｅｍ１低、下の線－Ｇｒｅｍ１高。 基底細胞乳がんにおけるＧｒｅｍ１発現と生存率との関係。上の線－Ｇｒｅｍ１低、下の線－Ｇｒｅｍ１高。 肺がんにおけるＧｒｅｍ１発現と生存率との関係。上の線－Ｇｒｅｍ１低、下の線－Ｇｒｅｍ１高。 抗Ｇｒｅｍ１抗体で６週間処理した後の、抗体で処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１腸の表現型。 長期間抗Ｇｒｅｍ１抗体処理した後のＧｒｅｍ１起始ポリポーシスマウス系統の生存率のカプランマイヤープロット。（Ａ）Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス。（Ｂ）Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎマウス。 （Ａ）抗Ｇｒｅｍ１抗体（３０ｍｇ／ｋｇ／週）による長期処理により、ＡｐｃＭｉｎ腫瘍負荷が減少し、動物の寿命が延長されることを示すカプランマイヤープロット。（Ｂ）ＡｐｃＭｉｎ及びＧｒｅｍ１のインサイチュハイブリダイゼーション。 （生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって示したとき）ＩｇＧ対照と比較して、（Ａ）腫瘍細胞接種後及び（Ｂ）腫瘍細胞接種前にマウスをＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６で処理した場合、Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスの腫瘍負荷は後肢の骨において有意に減少する。（Ｃ）腫瘍細胞接種後又は（Ｄ）腫瘍細胞接種前の設定では、処理群間で脾臓腫瘍負荷の減少傾向が観察される。スチューデントのｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 （生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって示したとき）ＩｇＧ対照と比較して、（Ａ）腫瘍細胞接種後及び（Ｂ）腫瘍細胞接種前にマウスをＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６で処理した場合、Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスの腫瘍負荷は後肢の骨において有意に減少する。（Ｃ）腫瘍細胞接種後又は（Ｄ）腫瘍細胞接種前の設定では、処理群間で脾臓腫瘍負荷の減少傾向が観察される。スチューデントのｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 （Ａ）Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス及び（Ｂ）ＡｐｃＭｉｎマウスにおける確立されたポリポーシスの治療についてのカプランマイヤー生存プロット。中央生存期間：ＡｐｃＭｉｎビヒクル：１９２日（ｎ＝１５）；ＡｐｃＭｉｎ抗Ｇｒｅｍ１：２６４．５日（ｎ＝１０）；Ｖｉｌ－Ｇｒｅｍ１ビヒクル：２４２日（ｎ＝１３）；及びＶｉｌ－Ｇｒｅｍ１抗Ｇｒｅｍ１：４７７日（ｎ＝８）、いずれの場合もログランクｐ＜０．０１。矢印は、処理群における処理開始を示す。 ４つの処理群、すなわち、（ｉ）未処理のＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ＶＧ＋無処理）；（ｉｉ）アゾキシメタンのみで処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ＶＧ＋ＡＯＭ＋無処理）；（ｉｉｉ）抗Ｇｒｅｍ１抗体のみで処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ＶＧ＋α－Ｇｒｅｍ１）；並びに（ｉｖ）アゾキシメタン及び抗Ｇｒｅｍ１抗体の両方で処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ＶＧ＋ＡＯＭ＋α－Ｇｒｅｍ１）における生存率及び結腸ポリープ負荷を示すプロット。（Ａ）マウスの生存率を示すカプランマイヤー曲線。（Ｂ）結腸ポリープ負荷を示すプロット。（Ｃ）結腸ポリープの大きさを示すプロット。 ＷＴ、未処理のＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１、及び抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス由来の絨毛におけるＦｏｘｌ１発現の間質レベル（＊：ｐ値＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１）。 Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス小腸におけるＦｏｘｌ１（緑）及びＷｎｔ５ａ（赤）のマルチプレックス蛍光ＩＳＨ。ＤＡＰＩを用いて切片を対比染色した。Ｆｏｘｌ１及びＷｎｔ５ａの複合発現が観察された（黄色の領域）。 野生型、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１及び処理モデルにおけるＷｎｔリガンド及びテロサイト細胞マーカーの組織発現。野生型及びＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおけるＩＳＨを用いた（Ａ）Ｗｎｔ５Ａ；（Ｂ）Ｗｎｔ２Ｂ；及び（Ｃ）Ｆｏｘｌ１テロサイトマーカーの発現、抗体処理後に定量した。 対照ビヒクル（線Ｄ、中央生存期間４５日、ｎ＝１３）、並びに週１５ｍｇ／ｋｇ（線Ａ、中央生存期間７６．５日、ｎ＝６）、週週３０ｍｇ／ｋｇ（線Ｂ、中央生存期間１０８日、ｎ＝１５、進行中の実験：２頭のマウスが未だ生存している）及び週６０ｍｇ／ｋｇ（線Ｃ、中央生存期間１１１日、ｎ＝７、進行中の実験：５頭のマウスが未だ生存している）の抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理したＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎマウスモデルのカプランマイヤー生存曲線。 確立されたポリポーシスの予防的療法及び治療についてのカプランマイヤー生存曲線。矢印は、処理群における処理開始時点を示す。（Ａ）Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス。ビヒクル（実線）：中央生存期間２４２日（ｎ＝１３）；抗Ｇｒｅｍ１療法後期処理（点線）。５１９日、ｎ＝７；抗Ｇｒｅｍ１早期処理（破線）：５４０日、（ｎ＝１１）いずれの群についてもログランクｐ＜０．０１。（Ｂ）ＡｐｃＭｉｎマウス。ビヒクル（実線）：中央生存期間：１９２日（ｎ＝１５）；抗Ｇｒｅｍ１後期処理（点線）：２６１日（ｎ＝１１）；抗Ｇｒｅｍ１早期処理（破線）：４２４．５日、（ｎ＝１０）、いずれの群についてもログランクｐ＜０．０１。 全身ＣＡ注射によりＰｙＭＴ－Ｂ０１乳がん細胞を接種し、Ｇｒｅｍ１中和抗体（Ａｂ７３２６）で処理したＣ５７ＢＬ６マウスは、アイソタイプ対照抗体（Ａｂ１０１．４）で処理したマウスと比較して、腫瘍負荷が有意に減少した。（Ａ）試験終了時（１３日目）のマウスのＩＶＩＳ ＢＬＩイメージングは、Ａｂ１０１．４処理したマウスと比較して、Ａｂ７３２６処理したマウスの腫瘍負荷が有意に低いことを示した。平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定、Ａｂ１０１．４；ｎ＝１２、Ａｂ７３２６；ｎ＝１３、＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）１３日目の代表的なＢＬＩ画像。 Ｇｒｅｍ１中和抗体（Ａｂ７３２６）で処理したＰｙＭＴ－Ｂ０１担がんＣ５７ＢＬ６マウスは、アイソタイプ対照（Ａｂ１０１．４）で処理したマウスと比較して、肺及び肝臓への転移が減少した。（Ａ）ＡＢ１０１．４で処理したマウスと比較した、ＡＢ７３２６で処理したマウスの肺における腫瘍負荷についてのエクスビボＢＬＩイメージングの結果を示すプロット。（Ｂ）Ａｂ７３２６処理群及びＡｂ１０１．４処理群における肝腫瘍負荷についてのＢＬＩイメージングの結果を示すプロット。平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定、Ａｂ１０１．４；ｎ＝６、Ａｂ７３２６；ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５。 アイソタイプ対照抗体（ＡｂＡ３３）及びＧｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１担がんＮＳＧマウスのＩＶＩＳ ＢＬＩイメージングの結果を示すプロット。平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８、ｐ＞０．０５ 腫瘍細胞接種後２２日目にアイソタイプ対照（ＡｂＡ３３）又はＧｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１担がんマウスの代表的なＩＶＩＳ ＢＬＩ画像。 アイソタイプ対照抗体（ＡｂＡ３３）又はＧｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１担がんＮＳＧマウスの肺のエクスビボＩＶＩＳ ＢＬＩイメージングの結果を示すプロット。平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定、ｎ＝８、ｐ＞０．０５。 全身ＣＡ注射によりＰＣ－３前立腺がん細胞を接種し、Ｇｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）又はアイソタイプ対照抗体（ＡｂＡ３３）で処理したＮＳＧマウスのＢＬＩイメージングの結果を示すプロット。（Ａ）全身、（Ｂ）エクスビボ肝臓ＢＬＩ、（Ｃ）エクスビボ後肢、及び（Ｄ）エクスビボ肺に対してＢＬＩイメージングを実施した。平均±ＳＥＭ、スチューデントのｔ検定、ｎ＝５～７、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 試験終了時（２５日目）に、アイソタイプ対照抗体（ＡｂＡ３３）又はＧｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）のいずれかで処理した全身ＰＣ－３腫瘍負荷を有するＮＳＧマウスの代表的なＢＬＩ画像。最後の全身スキャンの直後に肝臓、後肢、及び肺を解剖し、エクスビボで画像化した。
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに合わせて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「阻害剤（ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」への言及は、２つ以上のこのような阻害剤を含む、又は「オリゴヌクレオチド（ａｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のこのようなオリゴヌクレオチドを含む等である。
上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
がんの治療及び予防
本発明は、がんの予防又は治療方法において使用するための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを提供する。該がんは、典型的には間質（例えば、線維形成性間質）を有し、典型的には間質でＧＲＥＭ１が過剰発現している。該がんは、更に又はあるいは、上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現していてもよく、又はＧＲＥＭ１起始性であってもよい。
がん
がんは、間質、典型的には線維形成性間質を有する任意のがん又は腫瘍であってよい。がんは、ＧＲＥＭ１起始性の任意のがん又は腫瘍であってよい。がんは、間質及び／又は上皮においてＧＲＥＭ１の過剰発現が観察される任意のがんであってよい。がん又は腫瘍は、間質でＧＲＥＭ１が過剰発現しているが、上皮ではＧＲＥＭ１が過剰発現していなくてもよい。がん又は腫瘍は、上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現しているが、間質ではＧＲＥＭ１が過剰発現していなくてもよい。好ましい実施形態では、がん又は腫瘍は、線維形成性間質でＧＲＥＭ１が過剰発現している。
がん又は腫瘍は、固形腫瘍であってよい。固形腫瘍は、線維形成性間質を有していてよい。
特に好ましい治療可能ながんとしては、結腸直腸がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、十二指腸がん、食道がん、前立腺がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、肝臓がん、脾臓がん、骨常在がん、及び骨肉腫が挙げられる。治療可能ながんは、腸がん、結腸がん、又は直腸がんであってよい。治療されるがんは、播種性がん、例えば転移性がんであってよい。播種性がんは、体内の最初の発生部位から広がったがんであると理解すべきである。例えば、播種性がんは、患者の骨髄、結腸、前立腺、又は乳房の組織で発生したが、例えば患者の肝臓又は肺に広がったがんであってよい。
また、ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、がんの播種を予防するために使用することもできる。
ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、がんに関連するポリポーシスを予防するために使用することができる。
グレード分類システムは、細胞分化の欠如に関してがん細胞を分類するためにがん生物学及び医学において使用されている。これは、がん細胞が、そのがん細胞が発生した組織にみられる健常細胞と形態がどの程度異なるかを反映している。グレード分類システムは、特定のがんがどれくらいの速さで成長すると予想され得るかの指標を提供するために使用することができる。典型的に使用されるがんのグレードは、グレード（Ｇ）Ｘ及び１～４である。ＧＸは、がんのグレードを評価できないことを示す。Ｇ１（低グレード）がん細胞は、正常で健康な細胞と類似の形態を有しており（すなわち、十分に分化している）、ゆっくり成長すると予想され、広がる可能性は低い。Ｇ２（中間グレード）のがん細胞は、中等度に分化している、すなわち、より異常に見え、Ｇ１細胞よりもわずかに速く成長すると予想される。Ｇ３（高グレード）がん細胞は、正常細胞と比較して非常に異なる形態を有しており（すなわち、それほど分化していない）、Ｇ１及びＧ２の細胞よりも速く成長すると予想される。Ｇ４（高グレード）がん細胞は、未分化（低分化とも呼ばれる）であり、増殖能力が最も高いと予想される。
がんのグレード分類は、がんがどのように広がる可能性があるかの指標を与えるがんの病期分類とは異なる。一般的ながん病期分類システムは５つのステージを有する、すなわち、ステージ０：がん細胞がその場にとどまっている（すなわち、正常な組織に位置する）、ステージＩ：がんが体の一部に限局している、ステージＩＩ：がんが局所的に進行している、ステージＩＩＩ：同様にがんが局所的に進行している（がんがステージＩＩと指定されるか又はステージＩＩＩと指定されるかは、具体的ながんの種類に依存し得る）、及びステージＩＶ：がんが多くの場合転移しているか、又は他の臓器若しくは全身に広がっている。
当業者は、がんのグレード及び／又はステージを判定する方法について理解している。一実施形態では、本発明は、確立されたがんを治療及び／又は予防するための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストの使用に関する。一実施形態では、がんは、確立されたがんである。確立されたがんは、高グレードのがん、例えば、Ｇ３又はＧ４のがんであってよい。確立されたがんは、ステージＩＩ以上のがんであり得る。確立されたがんは、ステージＩＩＩ又はステージＩＶのがんであり得る。一実施形態では、確立されたがんは、転移しているステージＩＶのがんである。
結腸直腸がん
本発明は、好ましい一態様では、結腸直腸がんの予防又は治療に関する。背景として、腸粘膜は複雑な生態系であり、上皮はその微小環境、特にその下層にある間質と相互に依存した関係を有している。間葉－上皮クロストークは、ホメオスタシスの調節に密接に関与しており、腸再生及びがんにおいてダイナミックに変化する。細胞シグナル伝達ネットワークは、コンパートメント間クロストークのエフェクター経路であり、上皮細胞の運命決定を制御するが、結腸直腸がんでは腫瘍微小環境によって利用され、破壊されることがある。
結腸直腸がんの現在の化学療法的管理は、過去２０年間実質的に変化しておらず、増殖している腫瘍上皮に対する細胞傷害性剤の組み合わせの使用（ＦＯＬＦＯＸレジメン及びＦＯＬＦＩＲＩレジメン等 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ／ａｂｏｕｔ－ｃａｎｃｅｒ／ｃａｎｃｅｒ－ｉｎ－ｇｅｎｅｒａｌ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｃａｎｃｅｒ－ｄｒｕｇｓ／ｄｒｕｇｓ）に主に基づいており、これら上皮を標的とする剤に対する抵抗性が生じる可能性がある。現在、結腸直腸がんで使用するための新規治療法を同定することがこれまで以上に重要になっている。
従って、治療のための特に好ましいがん又は腫瘍は、結腸直腸がん又は結腸直腸腫瘍である。治療のための結腸直腸がんの特に好ましい形態は、間質細胞においてＧＲＥＭ１が過剰発現している、すなわち間質におけるＧＲＥＭ１の過剰発現を特徴とする結腸直腸がんである。間質細胞は、がん関連線維芽細胞であってよい。間質でＧＲＥＭ１が過剰発現している結腸直腸がんは、上皮におけるＧＲＥＭ１の過剰発現を示さなくてもよい。間質でＧＲＥＭ１が過剰発現している結腸直腸がんは、間質でＦｏｘｌ１が過剰発現していてもよい。治療のための結腸直腸がんの特に好適な形態は、間葉系サブタイプの結腸直腸がんであり、ＣＭＳ４とも記載される（Ｇｕｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１５）結腸直腸がんである。Ｇｕｉｎｎｅｙら、上記に記載されているように、ＣＭＳ１、ＣＭＳ２、及びＣＭＳ３のいずれかを含む任意の他のサブタイプの結腸直腸がんも治療することができる。本明細書に記載の結腸直腸がんは、近位結腸直腸がん（又は近位結腸直腸腫瘍）であってよい。近位結腸とは、左結腸曲の上流にある大腸の領域であり、盲腸、上行結腸、及び横行結腸を意味する。この領域のがん及び腫瘍は、右側のがん又は腫瘍とも呼ばれる。本発明は、右側結腸直腸がん又は右側結腸直腸腫瘍の治療に関し得る。
結腸直腸がんは、遠位結腸直腸がん（又は遠位結腸直腸腫瘍）であってもよい。遠位結腸とは、左結腸曲の下流にある大腸の領域であり、下行結腸、Ｓ字結腸、及び直腸を意味する。この領域のがん及び腫瘍は、左側のがん又は腫瘍とも呼ばれる。本発明は、左側結腸直腸がん又は左側結腸直腸腫瘍の治療に関し得る。ＧＲＥＭ１が間質で過剰発現しているがんは、好ましくは、散発性がんであってよい。散発性がんは、体細胞突然変異によって引き起こされ得る。散発性がんは、発がん物質によって引き起こされる場合もある。散発性がんは、遺伝性の遺伝子突然変異に起因するものではない。散発性がんは、間質においてＧＲＥＭ１を過剰発現させ得る。散発性がんの増殖は、がんにおける間質でのＧＲＥＭ１の過剰発現に依存し得る。
ＧＲＥＭ１に近接する少なくとも３つの一塩基多型（ＳＮＰ）は、独立して、白人の北欧人、そして恐らく他の民族においても、結腸直腸がん（ＣＲＣ）のリスクと関連している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏｓ Ｇｅｎｅｔ，２０１１）。ＧＲＥＭ１発現と直接的な関連があり、他のＳＮＰも同様の効果を有する可能性がある。更に、ＢＭＰ２付近の２つの共通のＳＮＰ、ＢＭＰ４付近の２つのＳＮＰ、及びＢＭＰ７付近の１つのＳＮＰは、ＢＭＰリガンドの発現に影響を与え、ＣＲＣリスクに影響を与える。従って、がんは、上記のＳＮＰのうちの１つ以上のＳＮＰを含んでいる可能性がある。
本発明に係る治療のためのがん又は腫瘍の更なる種類は、上皮細胞においてＧＲＥＭ１の過剰発現を示すものである。上皮細胞におけるＧＲＥＭ１の過剰発現は、がんを引き起こし得る。がんの増殖は、ＧＲＥＭ１の上皮における過剰発現に依存し得る。従って、がんは上皮で発生したものであってもよい。がんは、典型的には、結腸直腸がん又は十二指腸がんである。好ましくは、がんは、結腸直腸がんである。がんは、ＧＲＥＭ１起始性であり得る。ＧＲＥＭ１起始性とは、ＧＲＥＭ１の活性又は発現を増強する変異原性事象ががんの原因となることを意味する。このようながんは、遺伝性の遺伝子突然変異に起因するものである場合がある。従って、がんは、家族性がん（下記参照）であってもよい。
治療のための結腸直腸がんの好ましい種類は、以下に更に記載される通り、１つ以上の公知の抗がん剤（例えば、化学療法剤）に対して抵抗性であり得る。
結腸直腸がんは、播種性結腸直腸がんであってよい。結腸直腸がんは、転移性結腸直腸がんであってもよい。結腸直腸がんは、肺の転移性結腸直腸がんであってもよい。結腸直腸がんは、肝臓の転移性結腸直腸がんであってもよい。結腸直腸がんは、骨の転移性結腸直腸がんであってもよい。
結腸直腸がんは、間質におけるＦｏｘｌ１の過剰発現を特徴とし得る。結腸直腸がんは、間質における１つ以上のＷｎｔリガンドの過剰発現を特徴とし得る。例えば、結腸直腸がんは、間質におけるＷｎｔ５Ａ及び／又はＷｎｔ２Ｂの過剰発現を特徴とし得る。結腸直腸がんは、該結腸直腸がんにおいてＦｏｘｌ１及び／又はＷｎｔリガンド、例えば、Ｗｎｔ５Ａ又はＷｎｔ２Ｂが間質で過剰発現している場合、ＧＲＥＭ１アンタゴニストを用いる予防又は治療に特に好適であり得る。
家族性がん
家族性がんは、ＧＲＥＭ１をコードしている遺伝子における突然変異（複数可）又はＧＲＥＭ１遺伝子の発現に影響を及ぼす任意の他の突然変異に起因するがんを含む。常染色体優性疾患である遺伝性混合ポリポーシス症候群（ＨＭＰＳ）は、ＧＲＥＭ１の上流にある４０ｋｂの重複によって引き起こされ、その結果、限局している間葉系の勾配から上皮全体にわたる異所性のＧＲＥＭ１遺伝子発現へと病理学的コンパートメント発現が切り替わる。
抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストで治療される被験体は、家族性がんを発症するリスクがあると以前判定されたことがあってもよい。例えば、被験体は、家族歴に基づいて、及び／又は家族性がんを発症させるか若しくは発症するリスクを増大させることが知られている遺伝子の突然変異を該被験体が有していることから、リスクがあると判断されたことがあってよい。
家族性がんは、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ）とも呼ばれるリンチ症候群であってよい。家族性がんは、家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ）であってもよい。
本発明者らは、抗ＧＲＥＭ１抗体を使用すると、ＡｐｃＭｉｎモデルマウスの生存率が実質的に増加することを実証した（例えば、以下の実施例１１、１９、及び２３を参照）。ＡｐｃＭｉｎマウスは、家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ）の十分に確立されたモデルである。従って、ＦＡＰに罹患している患者又は被験体は、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療に特に好適であり得る。抗ＧＲＥＭ１アンタゴニスト（例えば、抗ＧＲＥＭ１抗体）で治療又は予防される家族性がんは、ＦＡＰであってよい。以前ＦＡＰに罹患したことがある被験体に、例えば、再発を予防するために抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを予防的に投与してもよい。これまでＦＡＰに罹患したことはないが、ＦＡＰを発症するリスクがあると以前判定されたことのある被験体に、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを予防的に投与してもよい。被験体は、Ａｐｃ遺伝子に有害な突然変異を有していることが判明したことから、ＦＡＰを発症するリスクがあると判定された可能性がある。
多発性骨髄腫
本発明は、別の好ましい態様では、多発性骨髄腫の治療又は予防に関する。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄（ＢＭ）内での形質細胞（ＰＣ）のクローン増殖を特徴とする血液学的悪性腫瘍である。ＭＭではＢＭが腫瘍の成長を支援していることが周知であり、腫瘍細胞とＢＭの間の双方向のシグナル伝達が、ＭＭ ＰＣの成長、拡散、及び生存の継続にとって非常に重要である。細胞性及び非細胞性のＢＭ構成要素は、ＭＭ ＰＣの成長及び拡散に対して異なる影響を及ぼす。疾患の進行において役割を果たすＢＭの構成要素が最近の研究で同定され、これらを標的とした治療法が開発されたが、ＭＭの標準治療は、未だ腫瘍細胞自体を標的とするものに主に頼っている。このような療法は患者の生存期間を延長するのに有効であるが、ＭＭ細胞の成長、拡散、生存、及び薬剤抵抗性においてＢＭが果たす役割は大きいため、この重要な疾患の局面を標的とするより有効な療法が必要とされている。実際、ＭＭはほとんどが不治の病であり、この疾患の有効な治療において直面している重要な課題は疾患の再発である。
従って、本発明は、好ましくは、多発性骨髄腫の治療又は予防も目的とする。多発性骨髄腫は、典型的には、骨髄内に１つ超の形質細胞の塊が存在する。従って、多発性骨髄腫は、典型的には、骨髄における形質細胞の異常な増殖に関連している。治療のための多発性骨髄腫の特に好ましい形態は、骨髄においてＧＲＥＭ１が過剰発現していることを特徴とする。従って、多発性骨髄腫は、間質においてＧＲＥＭ１が過剰発現していてよい。間質におけるＧＲＥＭ１の過剰発現は、骨の緻密骨コンパートメントに存在し得る。間質におけるＧＲＥＭ１の過剰発現は、間質細胞の数の増加又は既存のＧＲＥＭ１発現間質細胞内でのＧＲＥＭ１の発現レベルの増加を反映している可能性がある。骨髄は、骨軟骨網様（osteochrondroreticular、ＯＣＲ）幹細胞を含み得る。ＧＲＥＭ１を過剰発現している間質細胞は、ＯＣＲ幹細胞を含み得る。治療のための多発性骨髄腫の好ましい種類は、以下に更に記載される通り、１つ以上の公知の抗がん剤（例えば、化学療法剤）に対して抵抗性であり得る。
乳がん
本発明は、別の好ましい態様では、乳がんの治療又は予防に関する。実施例に更に詳細に記載する通り、本発明者らは、ＧＲＥＭ１が乳がん細胞の増殖を誘導すること、更に、ＧＲＥＭ１を発現している間質細胞と乳がん細胞との共培養もこのような増殖を誘導することを観察した。更に、ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、乳がん細胞に対するＧＲＥＭ１の活性化作用を中和することができる。
従って、乳がんで得られた結果は、間質細胞におけるＧＲＥＭ１の発現を含む、乳がん細胞の増殖におけるＧＲＥＭ１の役割を裏付けるものである。
また、本発明者らは、前臨床マウスモデルにおいて、乳がんの予防及び治療におけるＧＲＥＭ１アンタゴニストのインビボにおける有効性を実証した（下記実施例２４参照）。特に、ＧＲＥＭ１アンタゴニストで処理した乳がん担がんマウスが、全身腫瘍負荷、肺腫瘍負荷、肝臓腫瘍負荷の減少を示すことが観察された。
従って、本発明は、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを投与することによる乳がんの治療及び予防を提供する。乳がんは、間質においてＧＲＥＭ１が過剰発現していてよい。ＧＲＥＭ１を過剰発現している間質性乳腺細胞は、本明細書ではがん関連線維芽細胞とも記載される間質線維芽細胞を含み得る。治療のための乳がんの好ましい種類は、以下に更に記載される通り、１つ以上の公知の抗がん剤（例えば、化学療法剤）に対して抵抗性であってよい。乳がんは、播種性乳がんであってもよい。乳がんは、転移性乳がんであってもよい。乳がんは、肺の転移性乳がんであってもよい。乳がんは、肝臓の転移性乳がんであり得る。乳がんは、骨の転移性乳がんであってもよい。
前立腺がん
更なる態様では、本発明は、前立腺がんの治療又は予防に関する。
実施例２５に更に詳細に記載されている通り、本発明者らは、前臨床マウスモデルにおいて、前立腺がんの予防及び治療におけるＧＲＥＭ１アンタゴニストの有効性を実証した。特に、ＧＲＥＭ１アンタゴニストで処理した前立腺がん担がんマウスが、全身腫瘍負荷、肝臓腫瘍負荷、骨格腫瘍負荷、及び肺腫瘍負荷の減少を示すことが観察された。
従って、本発明は、更に、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを投与することによる前立腺がんの治療及び予防を提供する。前立腺がんは、播種性前立腺がんであってよい。前立腺がんは、転移性前立腺がんであってもよい。前立腺がんは、肺の転移性前立腺がんであってもよい。前立腺がんは、肝臓の転移性前立腺がんであってもよい。前立腺がんは、骨の転移性前立腺がんであってもよい。
他のがん
結腸直腸がん、多発性骨髄腫、乳がん、及び前立腺がんの治療及び予防における具体的に例示された用途に加えて、本発明者らは、これらがんで示されたＧＲＥＭ１アンタゴニストの治療有効性が、対応する特徴を有する他のがんの治療にも適用可能であると予想している。特に、間質及び／又は上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現しており、この過剰発現が悪性細胞の成長に寄与しているがんの予防又は治療において、ＧＲＥＭ１アンタゴニストが有用であることが予想される。このようながんとしては、膵臓がん、膀胱がん、肺がん、胃がん、十二指腸がん、食道がん、頭頸部がん、神経膠腫、子宮内膜がん、肝臓がん、脾臓がん、骨常在がん、及び骨肉腫が挙げられる。公的に入手可能なデータ（Ｒ２サーバーから。ｈｔｔｐｓ：／／ｈｇｓｅｒｖｅｒ１．ａｍｃ．ｎｌ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｒ２／ｍａｉｎ．ｃｇｉ）を用いて判定した、様々な固形腫瘍におけるＧｒｅｍ１発現と生存率との関係を図２４～図２９に示す。
間質及び上皮
本明細書において予防又は治療について記載されたがんは、間質及び／又は上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現していてよい。
本明細書で使用するとき、用語「間質細胞（複数可）」又は「間質」は、組織又は器官の構造及び／又は結合部分を指す。
間質組織は、結合組織細胞を含む細胞外マトリックスで主に構成されている。細胞外マトリックスは、主にプロテオグリカン凝集体で構成される多孔質の水和ゲルである基質と、結合組織線維とで主に構成されている。間質内で一般的にみられる繊維には、Ｉ型コラーゲン線維、弾性線維、細網線維（ＩＩＩ型コラーゲン線維）の３種類がある。線維芽細胞及び周皮細胞が、間質細胞の中で最も一般的な種類である。
がん又は腫瘍（例えば、組織又は器官の上皮を起始とする）に関連して、組織又は器官の間質は、がんの成長及び進行を支援し得る。がん又は腫瘍に関連する間質は、がん又は腫瘍の周囲の線維組織又は結合組織の成長によって引き起こされる線維形成性間質であり得る。
ＧＲＥＭ１の過剰発現は、間質／任意の間質細胞のいずれの部分でも観察され得る。間質細胞は、線維芽細胞であってもよく、線維芽細胞様支持細胞であってもよい。間質細胞は、上記任意のがん又は腫瘍の線維形成性間質から、例えば、結腸直腸がんでは結腸若しくは直腸から又は多発性骨髄腫では骨髄から単離された線維芽細胞又は線維芽細胞様支持細胞であってよい。間質細胞は、がん関連線維芽細胞であってよい。
用語「上皮」は、本明細書で使用するとき、組織又は器官の外膜に由来する細胞を指す。結腸に関しては、腸管上皮は、消化管の小腸及び大腸の両方の管腔表層又は裏層を形成する細胞の層である。それは、単純な円柱上皮で構成されている。「上部関門」は、吸収腸細胞、杯細胞、パネート細胞、及び腸内分泌細胞の４種類の腸上皮細胞からなる円柱細胞の腸上皮単層である。上部関門の特徴は、小腸及び大腸で類似している。主な違いは、吸収面を増加させることができる、十二指腸、空腸、及び回腸における隆起及び突起（輪状ひだ、絨毛、及び微絨毛）の存在で構成される。これは結腸では観察されず、結腸は代わりに平坦な表面を示す。絨毛と呼ばれる粘膜の突出の中には、リーベルキューン陰窩と呼ばれる屈曲があり、これは明確な腺陥入である。上皮においてＧＲＥＭ１の過剰発現が観察される細胞は、任意の上皮細胞、例えば、任意の腸管上皮細胞であり得る。
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、上皮及び／又は間質におけるＧＲＥＭ１の過剰発現が、上皮幹細胞の挙動を促進し、がんの進行及び／又は化学療法剤に対する抵抗性を駆動する、幹／前駆細胞の表現型（幹／前駆細胞の数を増加させる）を促進し得ると推測する。従って、本発明に従って使用されるＧＲＥＭ１アンタゴニストは、がんを予防又は治療する被験体の組織又は器官の上皮、例えば腸上皮において、異常ながん幹／前駆細胞の表現型の誘導を阻止し、上皮幹細胞の挙動を減少させ、及び／又は幹／前駆細胞の数を減少させることができる。幹細胞の挙動に影響を与えるＧＲＥＭ１アンタゴニストの能力は、公知の上皮及びがん幹細胞マーカーの評価によって臨床的にアッセイすることができる。
ＧＲＥＭ１
タンパク質に関連して本発明で使用するとき、ＧＲＥＭ１又はＧｒｅｍｌｉｎ－１という用語は、典型的にはＵｎｉＰｒｏｔエントリＯ６０５６５（配列番号１）に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質、ヒトＧＲＥＭ１を指す。また、ＧＲＥＭ１及びＧｒｅｍｌｉｎ－１という用語は、以下のＧｒｅｍｌｉｎ－１ポリペプチドを指す場合もある：
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドを有する若しくは有しない配列番号１のアミノ酸配列を含むか若しくはからなる、すなわち、配列番号２１に示す成熟ペプチド配列を含み得る若しくはからなり得る；又は
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列等、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の活性を保持している、Ｎ末端シグナルペプチドを有する若しくは有しない（配列番号２１に示す）配列番号１のアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸の置換、修飾、欠失、若しくは挿入を有する誘導体である；
（ｃ）これらの変異体であって、典型的には、配列番号１（又は配列番号２０若しくは２１）に対して少なくとも約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、若しくは約９５％の同一性（又は更には約９６％、約９７％、約９８％、若しくは９９％の同一性）を保持している変異体。言い換えれば、このような変異体は、配列番号１に対して約６０％～約９９％の同一性、好適には配列番号１に対して約８０％～約９９％の同一性、より好適には配列番号１に対して約９０％～約９９％の同一性、最も好適には配列番号１に対して約９５％～約９９％の同一性を保持し得る。変異体については、以下に更に説明する。
以下で更に論じる通り、残基番号は、典型的には配列番号１の配列に基づいて引用される。しかしながら、当業者であれば、上で論じた誘導体又は変異体の配列の残基の付番を容易に推定することができる。残基番号を引用する場合、本発明は、変異体又は誘導体の配列におけるこれら残基も包含する。
ＧＲＥＭ１又はＧｒｅｍｌｉｎ－１の核酸配列は、配列番号３６若しくは配列番号３７の配列又はこれらの変異体を含み得るか又はからなり得る。変異体の核酸配列については、以下に更に記載する。ＧＲＥＭ１又はＧｒｅｍｌｉｎ－１の核配列は、任意のＧＲＥＭ１転写物変異体を含み得るか又はからなり得る。ＧＲＥＭ１転写物変異体の例は、転写物１（ＮＣＢＩ：ＮＭ＿０１３３７２．６；ＥＮＳＥＭＢＬ：ＥＮＳＴ０００００５６０６７７．５）；転写物２（ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１１９１３２３．１；ＥＮＳＥＭＢＬ：ＥＮＳＴ０００００５６０８３０．１）；転写物３：ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１１９１３２２．１；ＥＮＳＥＭＢＬ：ＥＮＳＴ０００００６２２０７４．１である。２０１８年６月１８日現在、上記アクセッション番号で入手可能な配列は、参照により本明細書に援用される。
過剰発現
間質及び／又は上皮におけるＧＲＥＭ１の過剰発現は、任意の手段によって測定することができる。ＧＲＥＭ１の過剰発現は、典型的には、同じ組織型の正常細胞におけるマーカーのレベル、すなわち、基底発現レベルとの比較によって判定される。典型的には、好ましくは１つ以上のハウスキーピング遺伝子を含む他の遺伝子の発現レベルに対して発現を正規化する。また、ＧＲＥＭ１は、がん患者の集団の閾値割合において過剰発現又は過小発現を示すものとして分類されてもよい。集団の各患者における過剰発現は、幾何学的平均から２超高くてよい。集団の患者の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％、又はそれ以上が、このような過剰発現を示し得る。
間質におけるＧＲＥＭ１の過剰発現とは、間質におけるＧＲＥＭ１のレベルが、対応する正常組織のレベルよりも高いことを指す。例えば、間質におけるＧＲＥＭ１レベルは、対応する正常組織のレベルよりも少なくとも２倍高くてよい。
ＧＲＥＭ１が過剰発現している場合、その量は基底値に対して任意の量だけ増加し得る。例えば、ＨＭＰＳ等のＧＲＥＭ１起始がんでは、上皮でＧＲＥＭ１が数千倍アップレギュレーションされ得るが、一方、正常上皮ではＧＲＥＭ１の発現が観察されない。間質でＧＲＥＭが過剰発現している散発性がんでは、器官の正常間質における生理学的ＧＲＥＭ１発現レベルを超える任意のレベルの間質における過剰発現を含み得る。当業者は、同じ種類の正常細胞におけるＧＲＥＭ１のレベルと比較して、間質又は上皮における過剰発現の存在を評価することができる。
測定される量は、ｍＲＮＡの量であってもよい。従って、がんでは、ＧＲＥＭ１ ｍＲＮＡが過剰発現し得る。がんでは、同じ組織型の正常細胞と比較して、ＧＲＥＭ１ ｍＲＮＡの量が増加し得る。ｍＲＮＡは、任意の量だけ増加し得る。ｍＲＮＡの量は、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ等の定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ノーザンブロッティングによって、又はマイクロアレイ、ＲＮＡシークエンシングを用いて測定することができる。ｍＲＮＡ発現は、好ましくは、サンプルの遺伝子発現を、その遺伝子について二倍体である腫瘍で構成される参照サンプル全体の特定の遺伝子の発現レベルの分布と比較することによって決定される。期待値最大化（ＲＳＥＭ）アルゴリズムによりＲＮＡｓｅｑを用いてｚスコアを導き出すことができる（ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，２０１３ ａｎｄ Ｓｅｒａｍｉ ｅｔａ ａｌ ２０１２）。好ましくは、参照セットの平均よりも２ＳＤだけ高い又は低いｚスコアを、それぞれ過剰発現又は過小発現とみなす。
測定される量は、タンパク質の量であってもよい。がんでは、例えば、同じ組織型の正常細胞と比較して、ＧＲＥＭ１タンパク質が過剰発現し得る。タンパク質は、任意の量だけ増加し得る。タンパク質の量は、本発明の抗ＧＲＥＭ１抗体の使用を含む、免疫組織化学的検査、ウエスタンブロッティング、質量分析、又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて測定することができる。発現を判定するための閾値は、使用される技術によって変動し得、免疫組織化学的スコアに対して検証され得る。
従って、本明細書に記載の患者におけるがんを治療又は予防するためのＧＲＥＭ１アンタゴニストの使用は、（ａ）がんにおけるＧＲＥＭ１の量を測定すること、及び（ｂ）がんでＧＲＥＭ１が過剰発現している場合、患者にＧＲＥＭ１アンタゴニストを投与し、それによって、がんを治療又は予防することを含む。ＧＲＥＭ１の量は、ｍＲＮＡ量又はタンパク質量であってよく、過剰発現は、上述したいずれの過剰発現であってもよい。
サンプル
上記の測定は、患者由来の任意の好適なサンプルにおいて行ってよい。測定は、患者から得られたがん又は腫瘍の生検において行ってもよい。生検から、間質及び／又は上皮（間質及び／又は上皮の細胞）を単離してもよい。生検組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよく、新鮮組織であってもよい。組織は、膵臓組織、膀胱組織、肺組織、子宮内膜組織、乳房組織、胃組織、十二指腸組織、食道組織、骨髄、又は結腸直腸組織であってよい。がん生検に対して上で論じた方法のいずれを実施してもよい。患者の血液中を循環しているがん細胞に対して、このような方法を実施してもよい。ＲＮＡ法は、尿又は血液のエキソソームに対して行うことができる。
アンタゴニスト
抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能又は活性を低下させる任意の分子である。抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能又は活性を任意の量だけ低下させることができる。抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％だけＧＲＥＭ１の機能若しくは活性を低下させることができるか、又は任意のＧＲＥＭ１の機能若しくは活性を阻止することができる。抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストがＧＲＥＭ１の機能又は活性を低下させる程度は、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストの存在下及び非存在下で細胞におけるＧＲＥＭ１の機能又は活性を測定することによって決定することができる。細胞は、正常細胞であっても、がん細胞であってもよい。細胞は、上記のがん細胞であってもよい。細胞は、結腸直腸がん細胞であってもよい。結腸直腸がん細胞は、実施例に記載のＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１及び／又はＡＰＣ（Ｍｉｎ）マウスモデルに存在し得る。このように、結腸直腸がんにおけるＧＲＥＭ１アンタゴニストの活性のインビボアッセイは、ＧＲＥＭ１起始がん又は間質においてＧＲＥＭ１が過剰発現する散発性がんのマウスモデルにおいて実施することができる。あるいは、がん細胞は、骨髄に存在する骨髄腫から単離された形質細胞等の多発性骨髄腫がん細胞であってもよい。より一般的には、任意の手段によってＧＲＥＭ１の機能又は活性を低下させることが示されたＧＲＥＭ１アンタゴニストを、次に、結腸直腸がん細胞若しくは多発性骨髄腫がん細胞若しくは乳がん細胞等のがん細胞の増殖を阻止若しくは減少させる能力、又はがん若しくは腫瘍を予防、低減、又は排除する能力について、インビトロ又はインビボでアッセイしてよい。
アンタゴニストは、任意の手段によってＧＲＥＭ１の機能を低下させ得る。アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能に直接又は間接的に影響を与える任意の分子の活性又は量を増加又は減少させてもよい。アンタゴニストは、ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルでＧＲＥＭ１の量を減少させてもよい。アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の分解を増加させてもよい。アンタゴニストは、阻害的修飾によりＧＲＥＭ１の機能を低下させてもよい。アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能を増強する分子の転写を低下させてもよい。アンタゴニストは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ等の剤を用いて、ＧＲＥＭ１をコードしているＤＮＡ又はＧＲＥＭ１の機能を増強する分子を破壊してもよい。
アンタゴニストは、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１と相互作用する剤であってもよい。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１と相互作用する剤は、典型的には、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に結合する剤である。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１と相互作用する剤は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１を調節し得る。阻害性調節剤は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の機能のいずれに対する効果を有していてもよいが、典型的には、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１のＢＭＰ（ＢＭＰ２／４／７）への結合を減少させる。アンタゴニストは、ＢＭＰ－７模倣分子であってよく、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１はＢＭＰの負の調節因子であるため、結合が減少すると、ＢＭＰを介したシグナル伝達が増加する。活性化調節剤は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１のＢＭＰへの結合を増加させ得る。
ＢＭＰの結合及びシグナル伝達は、当技術分野において公知の任意の方法によって検出することができる。例えば、本願の実施例は、ＳＭＡＤリン酸化アッセイについて説明している。ＳＭＡＤ１、５、及び８は、ＢＭＰシグナル伝達の際にリン酸化される。従って、ＳＭＡＤリン酸化の増加を使用して、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に対する結合の減少を反映し得るＢＭＰシグナル伝達の増加を判定することができる。また、実施例は、Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイについても説明しており、ここでは、Ｉｄ１遺伝子がＢＭＰシグナル伝達の標的遺伝子である。従って、このアッセイにおけるシグナルの回復の増加を、剤がＧｒｅｍｌｉｎ－１のＢＭＰへの結合を阻害するか否かを判定するために使用することもできる。
アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の活性部位に結合することにより作用する場合もあり、又は異なる部位に結合することによりアロステリックに作用する場合もある。アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の調節因子又はリガンドに結合することにより作用し、それによってＧＲＥＭ１の活性化を低下させる場合もある。アンタゴニストは、可逆的であっても不可逆的であってもよい。
ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、低分子阻害剤、ペプチド、タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってよい。
ＧＲＥＭ１のアンタゴニストは、ＧＲＥＭ１をコードしているｍＲＮＡ又はＧＲＥＭ１活性を増強する分子をコードしているｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。ＧＲＥＭ１のアンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能を低下させる任意の分子をコードしているポリヌクレオチドであってもよい。例えば、ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているポリヌクレオチドであってもよい。
ＧＲＥＭ１のアンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の機能を直接又は間接的に低下させるように、任意の標的分子（典型的にはタンパク質）に特異的に結合する抗体であってもよい。アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１に特異的に結合する抗体であってもよい。この態様では、抗体は、アロステリック不活性化により又は活性に必要なその標的とリガンドとの相互作用をブロックすることにより、ＧＲＥＭ１の機能を低下させることができる。
アンタゴニストとタンパク質残基との相互作用は、Ｘ線結晶構造解析によって求められる残基と剤との間の距離（典型的には、６Å未満又は４Å未満）等、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定することができる。以下の実施例で論じる通り、治療薬が標的とし得るＧｒｅｍｌｉｎ－１の領域は、アミノ酸Ａｓｐ９２～Ｌｅｕ９９、Ａｒｇ１１６～Ｈｉｓ１３０、Ｓｅｒ１３７～Ｓｅｒ１４２、Ｃｙｓ１７６～Ｃｙｓ１７８を含み得る。これらは、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の表面における変異したものの６Å以内にある。
抗体アンタゴニスト
用語「抗体」は、本明細書で言及するとき、抗体全体及びその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又は単鎖を含む。抗体とは、ジスルフィド結合によって互いに結合している少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分化することができる。
抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本発明に従って使用される抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、典型的にはモノクローナル抗体である。本発明に従って使用される抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ナノボディ、ヒト若しくはヒト化抗体、又はこれらのいずれかの抗原結合部分であってよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を生成する場合、実験動物は、典型的には、ヤギ、ウサギ、ラット、又はマウス等の非ヒト哺乳動物であるが、他の種で抗体を産生させることもできる。
ポリクローナル抗体は、関心対象の抗原で好適な動物を免疫する等のルーチンな方法で生成することができる。その後、動物から血液を採取し、ＩｇＧ画分を精製してよい。
Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に対する抗体は、動物の免疫が必要な場合には、周知かつルーチンなプロトコルを使用して、動物、例えば非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタ等の多くの温血動物を免疫することができる。しかし、一般的には、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが最も好適である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）等、当技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる。
また、本発明に従って使用される抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３－７８４８ｌ；国際公開第９２／０２５５１号；同第２００４／０５１２６８号、及び同第２００４／１０６３７７号に記載の方法によって、特異的抗体の生成について選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによって、単一リンパ球抗体法を使用して生成することもできる。
抗体はまた、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を用いて生成することもでき、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１－５０）、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７－１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２－９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９－１８）、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１－２８０）、並びに国際公開第９０／０２８０９号；同第９１／１０７３７号；同第９２／０１０４７号；同第９２／１８６１９号；同第９３／１１２３６号；同第９５／１５９８２号；同第９５／２０４０１号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号、及び同第５，９６９，１０８に開示されているものが挙げられる。
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが、必ずしも同一の抗体由来であるとは限らない抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号、及び同第０４６３１５１号において一般用語に記載されているように、例えば、上記のファージディスプレイ法によって生成される抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域、そして、任意で定常領域の遺伝子がヒトの対応する遺伝子に置換されているマウスによって産生される抗体を含み得る。
あるいは、本発明に従って使用される抗体は、非ヒト哺乳動物をＧｒｅｍｌｉｎ－１免疫原で免疫し、該哺乳動物から抗体調製物を得、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１を認識するモノクローナル抗体をそれから得ることを含む方法によって生成することもできる。
本発明に従って使用される抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、又はその断片若しくは抗原結合部分を含み得る。抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原に選択的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。抗体並びにその断片及び抗原結合部分は、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価の抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってよいが、これらに限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９－２１７を参照）。これら抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照）。本発明で使用するための他の抗体断片としては、国際特許出願公開第２００５／００３１６９号、同第２００５／００３１７０号、及び同第２００５／００３１７１号に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’断片、並びに国際特許出願公開第２００９／０４０５６２号に記載されているＦａｂ－ｄＡｂ断片が挙げられる。多価抗体は、多重特異性を有していてもよく、又は単一特異的であってもよい（例えば、国際公開第９２／２２８５３号及び同第０５／１１３６０５号を参照）。これら抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングすることができる。
抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択してよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療に使用することを意図するものであり、抗体のエフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３のアイソタイプの定常領域ドメインを使用してよい。あるいは、抗体分子が治療目的を意図するものであり、抗体のエフェクター機能を必要としない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプを使用してもよい。
例えば、（ａ）関心対象の免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組み換え若しくは染色体組み換えである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又はそれから調製されたハイブリドーマ、（ｂ）関心対象の抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体等、本発明に従って使用される抗体は、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離することができる。
本発明に従って使用される抗体は、ヒト抗体であってもよく、ヒト化抗体であってもよい。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域も、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム又は部位特異的突然変異誘発によって又はインビボで体細胞突然変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図していない。
このようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。このようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合しているヒトの重鎖トランスジーン及び軽鎖トランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得る。
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫に続いて、リンパ球をエプスタインバーウイルスで形質転換することにより調製することができる。
用語「ヒト抗体誘導体」は、ヒト抗体の任意の改変形態、例えば、抗体と別の剤又は抗体とのコンジュゲートを指す。
用語「ヒト化抗体」は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされているＣＤＲグラフト抗体分子を指すことを意図する。ヒトフレームワーク配列内において、追加のフレームワーク領域の改変を行ってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＲグラフト抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体（例えば、マウス又はラットのモノクローナル抗体）由来の１つ以上のＣＤＲ（必要に応じて、１つ以上の改変ＣＤＲを含む）を含有する抗体分子を指す。概説については、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５－５３９，１９９８を参照。一実施形態では、ＣＤＲ全体が導入されるのではなく、本明細書に上記したＣＤＲのいずれか１つ由来の特異性決定残基のうちの１つ以上のみが、ヒト抗体フレームワークに導入される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照）。一実施形態では、本明細書に上記したＣＤＲのうちの１つ以上由来の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに導入される。別の実施形態では、本明細書に上記したＣＤＲの各々由来の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに導入される。
ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフトされる場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、マウス、霊長類、及びヒトのフレームワーク領域を含む任意の適切なアクセプター可変領域のフレームワーク配列を使用してよい。好適には、本発明に係るＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域に加えて上記ＣＤＲ又は特異性決定残基のうちの１つ以上を含む可変ドメインを有する。従って、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む中和ＣＤＲグラフト抗体が提供される。
本発明において使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔら、上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは、重鎖と軽鎖の両方に用いることができる。あるいは、ヒトの生殖細胞配列を使用してもよい；これらは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／で入手可能である（Ｒｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００５）３３（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １），Ｄ６７１－Ｄ６７４を参照）。
本明細書に記載のＣＤＲグラフト抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同一の抗体に由来している必要はなく、必要に応じて、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
また、本明細書に記載のＣＤＲグラフト抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有している必要はない。例えば、稀な残基を、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプにおいてより高頻度で存在する残基に変更してもよい。あるいは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基を、ドナー抗体の同じ位置にみられる残基に対応するように変更してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３－３２４を参照）。このような変更は、ドナー抗体の親和性を回復させるために必要最小限にとどめるべきである。変更する必要がある可能性のあるアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコルは、国際公開第９１／０９９６７号に記載されている。
また、抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることを、当業者であれば理解するであろう。これら修飾の種類及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞株及び培養条件に依存することが多い。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミド化にばらつきを含み得る。高頻度の修飾は、（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９－１３４，１９９５に記載の通り）カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニン等）の欠失である。
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
抗体又は断片等の生体分子は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体的な「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、三次元構造における荷電基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）とは、特定の分子又は表面が正味の電荷を持たないｐＨである。一実施形態では、本開示に係る抗体又は断片は、少なくとも７の等電点（ｐＩ）を有する。一実施形態では、抗体又は断片は、少なくとも８、例えば、８．５、８．６、８．７、８．８、又は９の等電点を有する。一実施態様では、抗体のｐＩは８である。＊＊ＥｘＰＡＳＹ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ（Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５），５７１－６０７を参照）等のプログラムを使用して、抗体又は断片の等電点を予測することができる。
好ましいＧｒｅｍｌｉｎ－１エピトープの特性評価を行うために、本発明者らは、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１を単独で、そしてＡｂ７３２６と呼ばれる抗体（Ｆａｂ断片）との複合体で結晶化した。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の結晶化により、ＢＭＰ結合部位における推定残基を決定することができた。更に、アロステリック阻害性抗体であるＡｂ７３２６と共に結晶化することにより、抗体エピトープにおける残基を決定することができた。このエピトープに結合する抗体は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に関連する疾患の治療において治療薬として特に有望である。
本明細書に記載の好ましいＡｂ７３２６抗体は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の以下の残基：Ｉｌｅ１１０（１３１）、Ｌｙｓ１２６（１４７）、Ｌｙｓ１２７（１４８）、Ｐｈｅ１２８（１４９）、Ｔｈｒ１２９（１５０）、Ｔｈｒ１３０（１５１）、Ａｒｇ１４８（１６９）、Ｌｙｓ１５３（１７４）、及びＧｌｎ１５４（１７５）に結合すると同定され、Ｌｙｓ１２６（１４７）、Ｌｙｓ１２７（１４８）、Ｐｈｅ１２８（１４９）、Ｔｈｒ１２９（１５０）、Ｔｈｒ１３０（１５１）、Ａｒｇ１４８（１６９）、Ｌｙｓ１５３（１７４）、及びＧｌｎ１５４（１７５）が、あるＧｒｅｍｌｉｎ－１モノマーに存在する場合、Ｉｌｅ１１０（１３１）は第２のＧｒｅｍｌｉｎ－１モノマーに存在する。括弧内ではない付番は、構造ファイルに基づいている（構造アライメントに基づくマウスＧｒｅｍｌｉｎ－２の付番と一致する）。括弧内の数字は、配列番号１のＵｎｉＰｒｏｔエントリＯ６０５６５に基づく残基を表す。実施例の章で論じる通り、これらエピトープ残基は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１－Ａｂ７３２６ Ｆａｂ複合体から４ÅにおけるＮＣＯＮＴ分析で同定された。
従って、本明細書に記載の抗体は、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４、及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基を含むエピトープに結合することができる（配列番号１に基づいて残基を付番）。本明細書に記載の抗体は、これらの残基のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又は９個全て（好ましくは、少なくとも５個の残基）を含むエピトープに結合し得る。
本明細書に記載の抗体はまた、Ｉｌｅ１３１が他の残基とは異なるＧｒｅｍｌｉｎ－１モノマーに存在するエピトープを認識することもできる。
これら残基は、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の特定の配列について提供されるが、当業者は、ルーチンな技術を用いて、これら残基の位置から他の対応するＧｒｅｍｌｉｎ配列（例えば、マウス）を容易に推定することができる。従って、これら他のＧｒｅｍｌｉｎ配列内の対応する残基を含むエピトープに結合する抗体も、本発明によって提供される。
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されているもの等のルーチンなクロスブロッキングアッセイを実施することができる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－６３）、又はペプチド切断分析が挙げられる。また、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、及び化学修飾等の方法を用いてもよい（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。このような方法は、当技術分野において周知である。
また、抗体エピトープは、Ｘ線結晶構造解析により決定することもできる。従って、本開示の抗体は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に結合している抗体のＸ線結晶構造解析によって評価することができる。エピトープは、特に、抗体パラトープ残基の４Å以内にあるＧｒｅｍｌｉｎ－１における残基を決定することによって、この方法で同定され得る。
従って、本明細書に記載の抗体は、Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６、及びＰｈｅ１３８から選択される少なくとも１つの残基を含むＧｒｅｍｌｉｎ－１におけるエピトープに結合することができる（残基の付番は配列番号１に従う）。Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６、及びＰｈｅ１３８の全てを含むエピトープに結合する抗体について本明細書に更に記載する。更に、以下の残基を含むエピトープに結合する抗体についても記載する：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４、及びＧｌｎ１７５。好ましくは、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４、及びＧｌｎ１７５は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の一方のモノマーに位置し、Ｉｌｅ１３１は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の他方のモノマーに位置する（Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の二量体はＢＭＰ二量体に結合する）。
Ｘ線結晶構造解析によって決定したときに抗体パラトープがＧｒｅｍｌｉｎ－１残基の４Å以内にある場合、抗体は、上記Ｇｒｅｍｌｉｎ－１残基に結合することができる。
本明細書に開示されるエピトープに結合する抗体は、配列番号４～６の重鎖ＣＤＲ配列（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てを含み得る。これらは、Ｋａｂａｔ法を用いて決定した実施例のＡｂ７３２６抗体のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３配列である。
ＣＤＲ配列を決定するためのＫａｂａｔ法及びＣｈｏｔｈｉａ法は、当技術分野において周知である（他の技術と同様に）。ＣＤＲ配列は、任意の適切な方法を用いて決定することができ、本発明では、典型的にはＫａｂａｔを使用するが、他の技術も同様に使用することができる。本例では、配列番号３は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔの複合定義を用いて決定したＡｂ７３２６のＨＣＤＲ１配列を表す。
本発明に従って使用される抗体は、配列番号７～９の軽鎖ＣＤＲ配列（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てを含んでいてよい。これらは、Ｋａｂａｔ法を用いたＡｂ７３２６のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列である。
好ましくは、抗体は、配列番号６の少なくともＨＣＤＲ３配列を含む。
典型的には、抗体は、配列番号４～６から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列及び配列番号７～９から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。抗体は、配列番号４～６から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ配列及び配列番号７～９から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ配列を含んでいてもよい。抗体は、典型的には、配列番号４～６の３つの重鎖ＣＤＲ配列全て（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）及び配列番号７～９の３つの軽鎖ＣＤＲ配列全て（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）を含む。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であってよい。
抗体は、配列番号１０又は１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６のＨＣＶＲの変異体１及び２）を含み得る。抗体は、配列番号１１又は１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６のＬＣＶＲの変異体１及び２）を含み得る。抗体は、好ましくは、配列番号１０又は１２の重鎖可変領域配列及び配列番号１１又は１３の軽鎖可変領域配列を含む（特に、配列番号１０／１１又は１２／１３のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲ対）。
抗体は、
配列番号１４のマウス完全長ＩｇＧ１重鎖変異体１、又は
配列番号２８のマウス完全長ＩｇＧ１重鎖変異体２、又は
配列番号３０のヒト完全長ＩｇＧ１重鎖変異体１、又は
配列番号１６のヒト完全長ＩｇＧ１重鎖変異体２、又は
配列番号２２のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体１、又は
配列番号３４のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体２、又は
配列番号１８のＦａｂ重鎖変異体１、又は
配列番号３２のＦａｂ重鎖変異体２
の重鎖（Ｈ鎖）配列を含み得る。
抗体は、
配列番号１５のマウス完全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１、又は
配列番号２９のマウス完全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２、又は
配列番号３１のヒト完全長ＩｇＧ１軽鎖変異体１、又は
配列番号１７のヒト完全長ＩｇＧ１軽鎖変異体２、又は
配列番号２３のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体１、又は
配列番号３５のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖変異体２、又は
配列番号１９のＦａｂ軽鎖変異体１、又は
配列番号３３のＦａｂ軽鎖変異体２
の軽鎖（Ｌ鎖）配列を含み得る。
一例では、抗体は、
配列番号１４／１５のマウス完全長ＩｇＧ１変異体１、又は
配列番号２８／２９のマウス完全長ＩｇＧ１変異体２、又は
配列番号３０／３１のヒト完全長ＩｇＧ１変異体１、又は
配列番号１６／１７のヒト完全長ＩｇＧ１変異体２、又は
配列番号２２／２３のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ変異体１、又は
配列番号３４／３５のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ変異体２、又は
配列番号１８／１９のＦａｂ軽鎖変異体１、又は
配列番号３２／３３のＦａｂ軽鎖変異体２
の重鎖／軽鎖配列対を含む。
対応する配列の変異体形態は、相互に交換可能である。例えば、抗体は、
配列番号１４／２９のマウス完全長ＩｇＧ１重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号２８／１５のマウス完全長ＩｇＧ１重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号３０／１７のヒト完全長ＩｇＧ１重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号１６／３１のヒト完全長ＩｇＧ１重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号２２／３５のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号３４／２３のヒト完全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖変異体２／軽鎖変異体１、又は
配列番号１８／３３のＦａｂ重鎖変異体１／軽鎖変異体２、又は
配列番号３２／１９のＦａｂ重鎖変異体２／軽鎖変異体１。
の重鎖／軽鎖配列対を含み得る。
抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であってよい。
あるいは、抗体は、上に列挙した特定の配列のうちの１つの変異体であってもよく、該変異体を含んでいてもよい。抗体変異体についての以下の説明は、上記のＧＲＥＭ１ポリペプチド変異体の選択にも適用可能である。
例えば、変異体は、上記アミノ酸配列のいずれかの置換、欠失、又は付加変異体であってよい。
変異体抗体は、上述の特定の配列のうちの１、２、３、４、５、１０以下、２０以下、又はそれ以上（典型的には最大５０以下）のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含み得る。「欠失」変異体は、個々のアミノ酸の欠失、２、３、４若しくは５アミノ酸等の小さなアミノ酸群の欠失、又は特定のアミノ酸ドメイン若しくは他の機構の欠失等のより大きなアミノ酸領域の欠失を含み得る。「置換」変異体は、典型的には、１つ以上のアミノ酸を同じ数のアミノ酸で置換すること、及び保存的アミノ酸置換を行うことを含む。例えば、アミノ酸を、類似の性質を有する別のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、又は別の脂肪族アミノ酸で置換してよい。好適な置換基を選択するために使用することができる２０種の主なアミノ酸の幾つかの性質は、以下の通りである：
「誘導体」又は「変異体」は、一般に、天然に存在するアミノ酸の代わりに、配列中に存在するアミノ酸がその構造類似体であるものを含む。また、配列において使用されるアミノ酸は、抗体の機能が著しく悪影響を受けることのない限り、誘導体化又は修飾、例えば、標識されていてもよい。
上記の誘導体及び変異体は、抗体の合成中に、又は生成後の修飾によって、又は抗体が組換え体の形態である場合、核酸の部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、又は酵素的切断及び／若しくはライゲーションの公知の技術を用いて調製することができる。
変異体抗体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列（特に、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列、並びにＨ鎖及びＬ鎖の配列）に対して約６０％超、又は約７０％超、例えば７５％又は８０％、典型的には約８５％超、例えば約９０％超又は約９５％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。更に、抗体は、これら配列について開示される正確なＣＤＲを保持しながら、本明細書に開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列並びにＨ鎖及びＬ鎖の配列に対して約６０％超、又は約７０％超、例えば７５％又は８０％、典型的には約８５％超、例えば約９０％超又は約９５％超のアミノ酸同一性を有する変異体であってもよい。変異体は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列並びにＨ鎖及びＬ鎖の配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を保持し得る（幾つかの状況では、正確なＣＤＲを保持しながら）。
変異体は、典型的には、約６０％～約９９％の同一性、約８０％～約９９％の同一性、約９０％～約９９％の同一性、又は約９５％～約９９％の同一性を保持する。このアミノ酸同一性のレベルは、関連する配列番号の配列の全長にわたって、又は配列の一部にわたって、例えば、完全長ポリペプチドのサイズに応じて、約２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、又はそれ以上のアミノ酸にわたってみられ得る。
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４、上記）を用いて評価したときに指定の値を有する配列を指す：
ペアワイズアラインメントパラメータ－方法：正確、マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０；
マルチプルアライメントパラメータ－マトリクス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延についての同一性％：３０、エンドギャップのペナルティ：オン、ギャップの分離距離：０、ネガティブマトリクス：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特異的ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残渣：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基における配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことを意図する。
従って、これら鎖の機能又は活性を維持する特定の配列及び変異体を有する抗体が提供される。
抗体は、Ｈ鎖／Ｌ鎖、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ、又はＣＤＲの配列の観点で上に定義されたものと、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１への結合について競合してもよく、又は同じエピトープに結合してもよい。特に、抗体は、配列番号４／５／６／７／８／９のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む抗体と、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１への結合について競合してもよく、又は同じエピトープに結合してもよい。抗体は、配列番号１０／１１若しくは１２／１３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列対、又は配列番号１４／１５若しくは１６／１７の完全長鎖を含む抗体と、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１への結合について競合してもよく、又は同じエピトープに結合してもよい。
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の領域である。エピトープは、構造的又は機能的と定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、高次構造を有していてもよい、すなわち、非線状アミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基等の分子の化学的に活性な表面基である決定基を含んでいてよく、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有していてよい。
当技術分野において公知のルーチンな方法を使用することによって、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうか又は参照抗体と結合について競合するかどうかを容易に判定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定するには、飽和条件下で参照抗体をタンパク質又はペプチドに結合させる。次に、試験抗体の該タンパク質又はペプチドに結合する能力を評価する。参照抗体との飽和結合後、試験抗体が該タンパク質又はペプチドに結合できる場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、参照抗体との飽和結合後、試験抗体が該タンパク質又はペプチドに結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合することができる。
抗体が参照抗体と結合について競合するかどうかを判定するには、上記の結合方法を２つの向きで実施する。第１の向きでは、飽和条件下で参照抗体をタンパク質／ペプチドに結合させ、続いて、試験抗体の該タンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。第２の向きでは、飽和条件下で試験抗体をタンパク質／ペプチドに結合させ、続いて、参照抗体の該タンパク質／ペプチドへの結合を評価する。両方の向きにおいて、第１の（飽和）抗体のみが該タンパク質／ペプチドに結合できる場合、試験抗体及び参照抗体が該タンパク質／ペプチドに対する結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解される通り、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複するエピトープ又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的にブロックする場合もある。
それぞれが他方の抗原への結合を競合的に阻害（ブロック）する場合、２つの抗体は、同じ又は重複するエピトープに結合する。すなわち、一方の抗体が１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍過剰であると、競合結合アッセイで測定したとき、他方の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％、又は更には９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減又は排除する幾つかのアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。
次いで、追加のルーチンな実験（例えば、ペプチドの突然変異及び結合分析）を実施して、観察された試験抗体の結合の欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるかどうか、又は観察された結合の欠如の原因が立体的なブロッキング（又は別の現象）であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを用いて実施することができる。
抗体は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロッティングにより、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１への結合について試験することができる。ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に陽性反応性を示すハイブリドーマのスクリーニングにも使用することができる。また、抗体の結合選択性は、例えばフローサイトメトリーによって、標的タンパク質を発現している細胞に対する抗体の結合をモニタリングすることによって判定することもできる。従って、スクリーニング方法は、ＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロットを実施することにより又はフローサイトメトリーにより、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に結合することができる抗体を同定する工程を含んでいてよい。
抗体は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１を選択的に（又は特異的に）認識することができる。選択的であるタンパク質には優先的に又は高親和性で結合するが、他のタンパク質には実質的に結合しないか又は低親和性でしか結合しない場合、抗体又は他の化合物は該タンパク質「に選択的に結合する」又は「を選択的に認識する」。上述したように、抗体が他の関連するタンパク質と結合するかどうか、又は抗体が他の関連するタンパク質同士を識別するかどうかを判定することによって、抗体の選択性について更に研究することができる。本発明に従って使用される抗体は、典型的には、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１を認識する。
抗体はまた、関連するタンパク質、又はヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１及び他の種由来のＧｒｅｍｌｉｎ－１に対して交差反応性を有する場合がある。
特異的（又は選択的）であることにより、抗体は、任意の他の分子に対して顕著な交差反応性を示さずに、関心対象のタンパク質に結合することが理解されるであろう。交差反応性は、本明細書に記載の任意の好適な方法によって評価することができる。抗体が関心対象のタンパク質に結合する強度の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は１００％の強度で他の分子に結合する場合、抗体の交差反応性が顕著であるとみなしてよい。特異的（又は選択的）な抗体は、関心対象のタンパク質に結合する強度の約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、又は約２０％未満の強度で別の分子に結合し得る。抗体は、関心対象のタンパク質に結合する強度の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、又は約５％未満、約２％未満、又は約１％未満の強度で他の分子に結合し得る。
抗ｇｒｅｍｌｉｎ抗体については既に記載されており、例えば、国際公開第２０１４／１５９０１０Ａ１号（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）には、２５℃で６２５ｐＭ～２７０ｎＭの範囲の結合親和性ＫＤ値を有する、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１活性を阻害する抗ｇｒｅｍｌｉｎ抗体が記載されている。Ｃｉｕｃｌａｎら（２０１３）は、結合親和性ＫＤが５．６×１０－１０Ｍである抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１モノクローナル抗体について記載している。
本明細書に新たに記載される抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体（全体が参照により本明細書に援用される、２０１７年１２月１９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０８３６５０号にも記載）は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１活性のアロステリック阻害剤であり、ＢＭＰ結合部位から遠位の上記新規エピトープに結合する。該抗体は、Ｋｄ値＜１００ｐＭの極めて高い親和性でＧｒｅｍｌｉｎ－１に結合する。従って、該抗体は、現在利用可能な抗体を超える顕著な改善を示し、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１媒介疾患の治療に特に有用であると予測される。
従って、本発明の使用に好適な抗体は、（ヒト）Ｇｒｅｍｌｉｎ－１に対して高い結合親和性を有し得る。抗体は、＜１ｎＭ未満、好ましくは＜５００ｐＭの解離定数（ＫＤ）を有し得る。一例では、抗体は、２００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。一例では、抗体は、１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。当業者には周知である通り、抗体の標的抗原に対する結合親和性を求めるために、表面プラズモン共鳴アッセイ、飽和アッセイ、又はＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡ等のイムノアッセイ等の様々な方法を使用することができる。結合親和性を求めるための例示的な方法は、Ｋｒｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ；４４（５）：９１６－２５．（Ｅｐｕｂ ２００６ Ｍａｙ １１））に記載の通り、ＣＭ５センサーチップを用いてＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において表面プラズモン共鳴分析を行うことによる。
本発明に従って使用される抗体は、典型的には、阻害抗体である。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１は、ＢＭＰ－２、４、及び７を負に制御するので、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１を阻害すると、ＢＭＰを介したシグナル伝達が増加する。
上述したように、本願の実施例は、抗体がＧｒｅｍｌｉｎ－１を阻害することができるかどうかをスクリーニングするための２つの機能アッセイ、すなわち、ＳＭＡＤリン酸化アッセイ及びＨｅｋ Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイについて説明する。典型的には、阻害抗体は、ＳＭＡＤのリン酸化を回復させる及び／又はＨｅｋ Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてＢＭＰのシグナル伝達を回復させる。ＳＭＡＤのリン酸化は、ＢＭＰ対照と比較して、少なくとも８０％、９０％、又は１００％まで回復させることができる。Ｈｅｋ Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイでは、阻害抗体は、１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。
好適な抗体を同定し、選択したら、当該技術分野において公知の方法により、抗体のアミノ酸配列を同定してよい。抗体をコードしている遺伝子は、縮重プライマーを用いてクローニングすることができる。抗体は、ルーチンな方法で組換え的に生成され得る。
本開示はまた、本明細書に新たに記載される抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖可変領域（複数可）（又は完全長Ｈ鎖及びＬ鎖）をコードしている単離されたＤＮＡ配列を提供する。
変異体ポリヌクレオチドは、配列表に与えられる核酸配列（ＧＲＥＭ１及び抗ＧＲＥＭ１抗体の核酸配列を含む）のいずれかのうちの１個、２個、３個、４個、５個、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、７５個以下、又はそれ以上の核酸の置換及び／又は欠失を含んでいてもよい。一般に、変異体は、１～２０個、１～５０個、１～７５個、又は１～１００個の置換及び／又は欠失を有する。
好適な変異体は、本明細書に開示される核酸配列のいずれか１つのポリヌクレオチドに対して少なくとも約７０％、典型的には少なくとも約８０％又は約９０％、より好適には少なくとも約９５％、約９７％、又は約９９％相同性であってよい。変異体は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を保持し得る。変異体は、典型的には、約６０％～約９９％の同一性、約８０％～約９９％の同一性、約９０％～約９９％の同一性、又は約９５％～約９９％の同一性を保持する。これらレベルの相同性及び同一性は、少なくともポリヌクレオチドのコーディング領域に関して一般的に存在する。相同性を測定する方法は当技術分野において周知であり、現在の状況では、相同性は核酸の同一性に基づいて計算されることが当業者には理解されるであろう。このような相同性は、（長さに応じて）少なくとも約１５、少なくとも約３０、例えば、少なくとも約４０、約６０、約１００、約２００、又はそれ以上のヌクレオチドの連続する領域にわたって存在し得る。このような相同性は、修飾されていないポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在し得る。
ポリヌクレオチドの相同性又は同一性を測定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ３８７－３９５）。
例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して、（典型的には、そのデフォルト設定で）相同性を計算するか又は配列を並べることができる。
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これら初期近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見つけるために検索を始めるためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの拡張を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が約１未満、典型的には約０．１未満、好適には約０．０１未満、最も好適には約０．００１未満である場合、ある配列が別の配列と類似しているとみなされる。例えば、最小和確率は、約１～約０．００１、多くの場合、約０．０１～約０．００１の範囲であり得る。
ホモログは、約３未満、約５未満、約１０未満、約１５未満、約２０未満、又はそれ以上の突然変異（それぞれ置換、欠失又は挿入であってよい）だけ、関連するポリヌクレオチドにおける配列と異なっていてもよい。例えば、ホモログは、３～５０個の突然変異、多くの場合３～２０個の突然変異だけ異なっていてもよい。これら突然変異は、ホモログの少なくとも３０個、例えば、少なくとも約４０個、約６０個、若しくは約１００個、又はそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
一実施形態では、変異体配列は、遺伝子コードの重複性のために、配列表に与えられた特定の配列とは異なっている場合がある。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）を有し、これらを使用して、生物の遺伝子にコードされているタンパク質のアミノ酸を表す３文字のコドンを「綴る」。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの線状配列は、その遺伝子によってコードされているタンパク質（複数可）のアミノ酸の線状配列に翻訳される。このコードは高度に縮重しており、６１種のコドンが２０種の天然アミノ酸をコードし、３種のコドンが「終止」シグナルを表している。従って、ほとんどのアミノ酸は１超のコドンによってコードされており、実際、幾つかのアミノ酸は４種以上の異なるコドンによってコードされている。従って、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードしている場合もあるが、同じアミノ酸をコードするために異なるコドンが使用されていることから、異なる核酸配列を有している場合もある。
ＤＮＡ配列は、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書に記載の抗体分子をコードしているＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法により得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードしているＤＮＡ配列は、必要に応じて、決定されたＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
ベクターを構築することができる一般的な方法であるトランスフェクション法及び培養法は、当業者に周知である。これに関しては、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成されたｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
核酸アンタゴニスト
核酸等のポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマーである。ヌクレオチドは、天然に存在するものであってもよく、人工的なものであってもよい。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、及び少なくとも１つの連結基、例えば、リン酸基、２’Ｏ－メチル基、２’メトキシ－エチル基、ホスホロアミデート基、メチルホスホネート基、又はホスホロチオエート基を含む。核酸塩基は、典型的には、複素環式である。核酸塩基としては、プリン及びピリミジン、より具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、及びシトシン（Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチドの糖としては、リボース及びデオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸を含む。リン酸は、ヌクレオチドの５’側又は３’側に結合し得る。
ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５－メチルシチジン一リン酸、５－メチルシチジン二リン酸、５－メチルシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン一リン酸。５－ヒドロキシメチルチジン二リン酸、５－ヒドロキシメチルチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキサアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５－メチル－２’－デオキシシチジン一リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン二リン酸、５－メチル－２’－デオキシチジン三リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシチジン一リン酸、５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシチジン二リン酸、及び５－ヒドロキシメチル－２’－デオキシチジン三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。
ヌクレオチドは、更なる修飾を含んでいてもよい。特に、好適な修飾ヌクレオチドとしては、２’アミノピリミジン（例えば、２’－アミノシチジン及び２’－アミノウリジン）、２’－ヒドロキシルプリン（例えば、２’－フルオロピリミジン（例えば、２’－フルオロシチジン及び２’フルオロウリジン）、ヒドロキシルピリミジン（例えば、５’－α－Ｐ－ボラノウリジン）、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジン）、４’－チオピリミジン（例えば、４’－チオウリジン及び４’－チオシチジン）が挙げられるが、これらに限定されず、ヌクレオチドは、核酸塩基の修飾を有する（例えば、５－ペンチニル－２’－デオキシウリジン、５－（３－アミノプロピル）ウリジン、及び１，６－ジアミノヘキシル－Ｎ－５－カルバモイルメチルウリジン）。
ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドは、任意の方法で互いに結合していてよい。ヌクレオチドは、リン酸結合、２’Ｏ－メチル結合、２’メトキシ－エチル結合、ホスホロアミデート結合、メチルホスホネート結合、又はホスホロチオエート結合によって結合し得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸のように、その糖及びリン酸基によって結合している。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体のように、その核酸塩基を介して結合していてもよい。
ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているポリヌクレオチドであってもよい。
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸であってよい。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸、又はヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマー等、当技術分野において公知の任意の合成核酸であってもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
ポリヌクレオチド配列を、任意の好適な発現ベクターにクローニングしてもよい。発現ベクターにおいて、コンストラクトをコードしているポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によってコード配列を発現させることができる制御配列に機能可能に連結される。このような表現ベクターを使用して、コンストラクトを発現させることができる。
一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、遺伝子治療において使用するために提供され得る。ポリヌクレオチドは、インビボにおいて抗ＧＲＥＭ１抗体を発現させることができる任意の好適なベクターで提供され得る。
抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列であってよい。ＤＮＡ配列は、それを必要としている被験体に投与するための任意の好適なベクター、例えば、発現ベクターで提供され得る。例えば、インビボにおいて抗ＧＲＥＭ１抗体を発現させることができる発現ベクターで、ＤＮＡ配列を被験体に投与してよい。発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター等のウイルス発現ベクターであってよい。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているＤＮＡ配列である。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、遺伝子治療において使用するためのＤＮＡ配列であって、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているＤＮＡ配列である。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているＤＮＡ配列を含むＡＡＶである。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、遺伝子治療において使用するためのＡＡＶであって、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているＤＮＡ配列を含むＡＡＶである。
抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列であってもよい。ＲＮＡ配列は、任意の好適なベクターで、それを必要としている被験体に投与され得る。ＲＮＡ配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列であってもよい。ｍＲＮＡ配列は、安定化された形態で、それを必要としている被験体に投与することができる。例えば、ｍＲＮＡ配列は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物で提供され得る。ＬＮＰ組成物は、ｍＲＮＡ配列の安定性を高めるために該ｍＲＮＡ配列を封入することができる任意の好適なＬＮＰを含んでいてよい。従って、一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしている安定化されたｍＲＮＡ配列である。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、遺伝子治療において使用するための安定化されたｍＲＮＡ配列であって、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているｍＲＮＡ配列である。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物である。一実施形態では、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、遺伝子治療において使用するためのＬＮＰ組成物であって、本明細書に記載の抗ＧＲＥＭ１抗体をコードしているｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物である。
用語「機能可能に連結される」とは、記載されている構成要素が、その意図される通りに機能することができる関係で並置されていることを指す。コード配列に「機能可能に連結された」制御配列は、該制御配列に適合する条件下でコード配列が発現するようにライゲーションされている。複数コピーの同じ又は異なるポリヌクレオチドをベクターに導入してもよい。
次いで、発現ベクターを好適な宿主細胞に導入してよい。従って、コンストラクトをコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適合する細菌宿主細胞に該ベクターを導入し、ポリヌクレオチド配列を発現させる条件下で該宿主細胞を増殖させることにより、コンストラクトを生成することができる。
核酸ベースのＧＲＥＭ１アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１の発現を減少させることができる。タンパク質発現をノックダウンするためのアンチセンス及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、当技術分野において周知であり、標準的な方法を使用して、関心対象の分子の発現をノックダウンすることができる。アンチセンス及びｓｉＲＮＡの技術はいずれもｍＲＮＡに干渉する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの一部に結合（ハイブリダイズ）することによってｍＲＮＡに干渉する。従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対して相補的であるように設計される（ただし、後述するように、オリゴヌクレオチドは１００％相補的である必要はない）。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの一部であってもよい。ここでも、オリゴヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列と１００％同一ではなくてもよい。これについては後述する。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに結合し、タンパク質の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用することを含む。
従って、アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１をコードしているｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号３６若しくは配列番号３７又はその変異体のコード配列であってよい。標的配列には優先的又は高親和性でハイブリダイズするが、他の配列に対しては実質的にハイブリダイズしない、ハイブリダイズしない、又は低親和性でしかハイブリダイズしない場合、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対して「特異的にハイブリダイズする」。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、他の核酸についてのＴｍよりも少なくとも５℃、少なくとも少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃、又は少なくとも４０℃高いＴｍで、標的配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。ハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において記載の通りのストリンジェントな条件であってよい。
オリゴヌクレオチドは、典型的には、５０以下のヌクレオチド、例えば４０以下、３０以下、２２以下、２１以下、２０以下、１０以下、又は５以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。使用されるオリゴヌクレオチドは、２０～２５ヌクレオチド長、より好ましくは２１又は２２ヌクレオチド長であってよい。ヌクレオチドは、天然に存在するものであってもよく、人工的なものであってもよい。ヌクレオチドは、上記のもののうちのいずれであってもよい。
ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、ＧＲＥＭ１に結合する、典型的にはＧＲＥＭ１に特異的に結合する抗体であってよい。あるタンパク質には優先的又は高親和性で結合するが、他のタンパク質には実質的には結合しない、結合しない、又は低親和性でしか結合しない場合、抗体は、そのタンパク質に「特異的に結合する」。例えば、標的には優先的又は高親和性で結合するが、他のヒトタンパク質には実質的には結合しない、結合しない、又は低親和性でしか結合しない場合、抗体は、その標的分子に「特異的に結合する」。
１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、抗体は、優先的に又は高親和性で結合する。１×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１×１０－４Ｍ以上、より好ましくは１×１０－３Ｍ以上、更に好ましくは１×１０－２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、抗体は、低親和性で結合する。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ＣＤＲグラフト抗体、又はヒト化抗体であってよい。抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子、又はその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、若しくはＦｖの断片であってよい。
患者
任意の患者を本発明に従って治療することができる。患者は、典型的にはヒトである。ただし、患者は、別の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、魚、ニワトリ、若しくはブタ等の商業的に飼育されている動物、マウス若しくはラット等の実験動物、又はモルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、若しくはイヌ等のペットであってもよい。
医薬品組成物、投与量、及び投与レジメン
本発明のＧＲＥＭ１アンタゴニストは、医薬組成物で提供されてもよい。医薬組成物は、通常無菌であり、典型的には、薬学的に許容し得る担体及び／又はアジュバントを含む。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得るアジュバント及び／又は担体を更に含んでいてもよい。
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。担体は、非経口的、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口的な投与経路、例えば、注射又は注入に好適であり得る。あるいは、担体は、局所、上皮、又は粘膜の投与経路等の非非経口的な投与（non-parenteral administration）に好適であり得る。担体は、経口投与に好適であってもよい。投与経路に応じて、化合物を不活化する可能性のある酸及び他の自然条件の作用から該化合物を保護するための材料で調節因子をコーティングしてもよい。
本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容し得る塩を含んでいてもよい。「薬学的に許容し得る塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、任意の不所望の毒性作用を与えることのない塩を指す。このような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
薬学的に許容し得る担体は、水性の担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物において使用することができる好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物、オリーブオイル等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが望ましい。
治療組成物は、典型的には、無菌でなければならず、製造及び保管の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、追加の活性成分を含んでいてもよい。
また、本明細書に記載のアンタゴニストと使用説明書とを含むキットも本開示の範囲内である。キットは、本明細書で論じる通りの追加の治療剤又は予防剤等の１つ以上の追加の試薬を更に含有していてもよい。
本明細書に記載のアンタゴニスト又はその製剤若しくは組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与してよい。
治療用途では、既に上記の障害又は病態に罹患している被験体に、病態又はその症状のうちの１つ以上を治癒、緩和、又は部分的に停止させるのに十分な量の化合物を投与する。このような治療的処置の結果、疾患の症状の重症度が低下し得る又は無症状期間の頻度若しくは期間が増加し得る。これを達成するのに適切な量を「治療上有効な量」と定義する。
予防用途では、上記の障害又は病態のリスクを有する被験体に、病態又はその症状のうちの１つ以上のその後の作用を予防又は低減するのに十分な量の製剤を投与する。これを達成するのに適切な量を「予防上有効な量」と定義する。それぞれの目的のための有効量は、疾患又は傷害の重症度、並びに被験体の体重及び全身状態に依存する。
投与する被験体は、ヒトであっても非ヒト動物であってもよい。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。ヒトへの投与が典型的である。
本発明のアンタゴニスト又は医薬組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法のうちの１つ以上の方法を用い、１つ以上の投与経路を介して投与してよい。当業者には理解される通り、投与経路及び／又は投与モードは、所望の結果に応じて変化する。本発明の化合物又は医薬組成物の投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口的な投与経路、例えば、注射又は注入が挙げられる。「非経口投与」という表現は、本明細書で使用するとき、経腸投与及び局所投与以外の投与モードを意味し、通常は注射による。あるいは、本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物は、非非経口的な経路(non-parenteral route)、例えば、局所、上皮、又は粘膜の投与経路を介して投与してもよい。本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物は、経口投与用であってもよい。
本発明の抗体／調節剤又は医薬組成物の好適な投与量は、熟練の医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように変化させてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療の持続時間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、及び前病歴、並びに医学分野で周知である同様の要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
好適な用量は、例えば、治療される患者の約０．０１μｇ／ｋｇ（体重）～約１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、典型的には約０．１μｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であってよい。例えば、好適な投与量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ（体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、又は１日あたり約１０μｇ／ｋｇ（体重）～約５ｍｇ／ｋｇ（体重）であってよい。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してよい。例えば、単一用量を投与してもよく、経時的に何回か分割用量を投与してもよく、治療状況の要件によって示唆される通り用量を比例的に減少させたり、増加させたりしてもよい。本明細書で使用するとき、単位剤形とは、治療される被験体にとって投与単位として適している物理的に分離している単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同して所望の処置効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
投与は、１回であってもよく、複数回であってもよい。同じ又は異なる経路を介して、同じ又は異なる箇所に複数回投与してよい。あるいは、徐放性製剤を介して投与してもよく、この場合には、必要な投与頻度がより少なくなる。投与量及び頻度は、患者におけるアンタゴニストの半減期及び所望の治療期間に応じて変化させてよい。
上述した通り、本発明の調節因子／抗体又は医薬組成物は、１つ又は他のより多くの他の治療剤と共投与されてもよい。
２つ以上の剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成することができる。両者を単一の組成物で一緒に投与してもよく、又は併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、一方を他方の前に、すなわち別々に投与してもよく、他方の後に、すなわち逐次投与してもよく、一斉に、すなわち同時に投与してもよい。
医薬組成物及び投与モード
本明細書に記載の治療方法において使用するためのアンタゴニストは、医薬組成物に配合してもよい。これら組成物は、治療上活性のある成分（複数可）に加えて、薬学的に許容し得る賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定化剤、又は当業者に周知の他の材料を含んでいてよい。このような材料は、非毒性でなければならず、そして、活性成分の有効性に干渉してはならない。医薬担体又は希釈剤は、例えば、等張溶液であってよい。
担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、鼻腔内、筋肉内、及び腹腔内の経路に依存し得る。例えば、固体経口形態は、活性物質と共に、希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、又はバレイショデンプン；滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルピロリドン；脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、又はデンプングリコール酸ナトリウム；飽和剤；染料；甘味料；湿潤剤、例えば、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；並びに一般に、医薬製剤で使用される非毒性かつ薬理学的に不活性な物質を含有していてよい。このような医薬調製品は、公知の方法で製造することができ、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣、フィルムコーティングのプロセス等を用いて製造することができる。
経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、活性成分を１０％～９５％、好ましくは２５％～７０％含有する。医薬組成物を凍結乾燥させる場合、凍結乾燥した材料を、投与前に、例えば懸濁液等に再構成してもよい。再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。
例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングを有する、個体に経口投与するためのカプセル剤、錠剤、及び錠剤を提供することができる。
経口投与用の液体分散剤は、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤であってよい。シロップ剤は、担体として、例えば、ショ糖、又はグリセリン及び／若しくはマンニトール及び／若しくはソルビトールと共にショ糖を含有していてよい。
懸濁剤及び乳剤は、担体として、例えば、天然ガム、アガー、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含有していてよい。筋肉内注射用の懸濁剤又は液剤は、活性物質と共に、薬学的に許容し得る担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、及び必要に応じて好適な量の塩酸リドカインを含有していてよい。
静脈内投与又は注入用の液剤は、担体として、例えば、滅菌水を含有していてよく、又は好ましくは、滅菌、水性、等張生理食塩水の形態であってよい。
坐剤の場合、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてよく、このような坐剤は、０．５％～１０％、好ましくは１％～２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド阻害剤は、ネイキッドヌクレオチド配列であってもよく、カチオン性脂質、ポリマー、又はターゲティング系と組み合わされてもよい。これらは、任意の利用可能な技術によって送達することができる。例えば、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、針注射により、好ましくは皮内、皮下、又は筋肉内に導入してよい。あるいは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、粒子媒介遺伝子送達等の送達デバイスを使用して、皮膚を超えて直接送達してもよい。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、皮膚に局所的に投与してもよく、例えば、鼻腔内、経口、又は直腸内の投与により粘膜表面に投与してもよい。
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのコンストラクトの取り込みは、幾つかの既知のトランスフェクション技術、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものによって増強され得る。これら剤の例としては、カチオン性剤、例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ－デキストラン、並びにリポフェクション剤、例えば、リポフェクタム及びトランスフェクタムが挙げられる。投与されるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの投与量は、変更することができる。
投与は、典型的には、「予防上有効な量」又は「治療上有効な量」（場合によっては、予防が治療とみなされる場合もあるが）で行われ、これは、個体に対して効果を示すのに十分な量であり、例えば、疾患若しくは病態の発病を予防若しくは遅延させる、１つ以上の症状を改善する、寛解を誘導若しくは延長する、又は再発を遅延させるのに有効な量である。
用量は、様々なパラメータ、特に使用される物質；治療される個体の年齢、体重、及び状態；投与経路；並びに必要なレジメンに応じて決定され得る。医師は、任意の特定の個体に必要な投与経路及び投与量を決定することができる。典型的な日用量は、上記の条件に応じて体重１ｋｇあたり約０．１～５０ｍｇである。用量は、単回投与されてもよく、複数回投与されてもよく、例えば、１時間ごとに２回、３回、又は４回投与する等、一定間隔で服用されてもよい。典型的には、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド阻害剤は、１ｐｇ～１ｍｇ、好ましくは、粒子媒介送達の場合は１ｐｇ～１０μｇの核酸、他の経路の場合は１０μｇ～１ｍｇの範囲で投与される。
上述の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。
治療的組み合わせ
上記の本発明の組成物は、単独で、又は例えば補助療法として、他の治療用組成物若しくは治療と組み合わせて使用／投与することができる。他の治療用組成物又は治療は、例えば、本明細書で論じるもののうちの１つ以上であってよく、本発明の組成物と同時に又は逐次投与してよい。
上述した通り、ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、化学療法剤等の別の抗がん剤又は放射線療法若しくは外科手術等の別のがん治療法に対してがん又は腫瘍を感作するために使用され得るので、併用治療において特に有用である。がんは、ＧＲＥＭ１アンタゴニストの非存在下では他の抗がん剤又はがん治療法に対して抵抗性である場合がある。
従って、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、任意の他のがん治療法又はがんのための任意の他の治療剤、例えば化学療法剤と併用してもよい。他のがん治療法は、関連するがんのための任意の公知の治療法、例えば、結腸直腸がんのための任意の公知の治療法から選択することができる。他のがん治療法は、放射線療法であってよい。好適な放射線療法による治療は、例えば、Ｖａｎ Ｃｕｔｓｅｍ（ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１４．Ｖｏｌ ２５，Ｉｓｓｕｅ ３に記載されている。放射線療法は、がんの外科手術前に行ってもよく、がんの外科手術後に行ってもよい。放射線療法は、アジュバント放射線療法であってもよい。放射線療法は、化学療法、例えば、後述する化学療法剤の投与と組み合わせて行ってもよい。
がんのための他の治療剤、例えば化学療法剤は、関連するがんのための任意の公知の化学療法剤又は化学療法剤の組み合わせを含む、関連するがんのための任意の公知の治療剤から選択してよい。例えば、ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、特に結腸直腸がんの治療において、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、及びフォリン酸のうちの１つ以上と併用することができる。結腸直腸がん及び多発性骨髄腫を治療するための他の抗がん剤とＧＲＥＭ１アンタゴニストとを組み合わせた併用療法の更なる例については、治療のための組成物及びキットに関連して以下に記載する。ＧＲＥＭ１アンタゴニストと併用して投与しない場合、がんが、１つ以上の化学療法剤（例えば、上記の化学療法剤のうちの１つ）に対して抵抗性になる可能性がある。ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、セツキシマブ、ニボルマブ、又はベバシズマブと併用してよい。抗ＧＲＥＭ１特異性とニボルマブ又はベバシズマブ特異性とを組み合わせた二重特異性抗体を投与してもよい。
上記の態様の一部として、本発明は、本発明に係るがんの治療及び／又は予防方法において使用するための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストであって、該方法が化学療法剤を別々、逐次、又は同時に投与することを含むアンタゴニストを提供する。本発明はまた、本発明に係るがんの治療及び／又は予防方法において使用するための抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストであって、該方法が、別々、逐次、又は同時に放射線療法を行うことを含むアンタゴニストを提供する。本発明は更に、間質においてＧＲＥＭ１が過剰発現しているがんを治療する方法において使用するための化学療法剤であって、該方法が、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを別々、逐次、又は同時に投与することを含む化学療法剤を提供する。本発明はまた、上皮においてＧＲＥＭ１が過剰発現しているがんを予防又は治療する方法において使用するための化学療法剤であって、該方法が、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストを別々、逐次、又は同時に投与することを含む化学療法剤を提供する。
更に、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニスト及び追加の抗がん剤を含む組成物又はキットが提供される。追加の抗がん剤は、標的治療剤であってもよく、化学療法剤であってもよい。追加の抗がん剤は、上記のいずれの抗がん剤であってもよい。このような１つを超える追加の抗がん剤を、組成物又はキットに組み込んでもよい。組成物又はキットは、特に結腸直腸がんの治療のための組成物又はキットの一部として、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストと、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、及びフォリン酸、セツキシマブ、ニボルマブ、及びベバシズマブから選択される１つ以上の抗がん剤とを含み得る。多発性骨髄腫を治療するための組成物又はキットは、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストと、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（例えば、エロツズマブ）、及び／又は抗ＩＬ－６抗体（例えば、シルツキシマブ）のうちの１つ以上とを含み得る。抗ＧＲＥＭ１特異性と他の上記の特異性のうちの１つとを組み合わせた二重特異性抗体が、組成物又はキットで提供されてもよい。好ましい組み合わせは、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニスト及び抗ＩＬ－６抗体（好ましくは、シルツキシマブ）を含む。多発性骨髄腫を治療するための組成物又はキットは、抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストと、ボルテズミブ及び／若しくはｉＭＩＤ（レナリドミド／ポマレノミド）又はこれらのいずれかの類似体とを含み得る。上記組成物及びキットのいずれかにおける抗ＧＲＥＭ１アンタゴニストは、好ましくは、抗ＧＲＥＭ１抗体であってよい。
治療適応症
本発明のアンタゴニストは、がんの治療又は予防において使用される。
がんの予防は、被験体ががんと診断されるのを防ぐこと又はがんの発症を遅らせることを含み得る。また、がんの予防は、以前がんと診断されたことのある被験体のがんの再発防止も含み得る。がんの予防は、更に、がんと診断されていない被験体又は以前がんと診断されたことのある被験体の生存期間を延長することも含み得る。
がんの治療は、がんの１つ以上の症状を回復させる、がんの寛解を誘導若しくは延長する、又はがんの再発を遅らせることを含み得る。治療は、がんを治癒、緩和、又は部分的に停止ることができる。その結果、疾患症状の重症度が低下し得る又は無症状期間の頻度若しくは期間が増加し得る。がんの治療はまた、がん（例えば、確立されたがん）が、患者の体内の起始部位から患者の体内の１つ以上の続発部位に広がるのを防ぐことも含み得る。従って、がんの治療は、既存のがんの播種又は転移の防止を含み得る。結腸直腸がんの治療の結果、例えば内視鏡検査によってアッセイしたときのポリープ負荷（ポリープ数）を減少させることができる。多発性骨髄腫の治療の結果、例えばＭＲＩ／ＣＴスキャンによってアッセイしたときの骨髄腫瘍負荷を減少させることができる、並びに／又は骨髄生検後に求めることができる形質細胞負荷を減少させることができる、並びに／又はモノクローナル抗体産生（パラプロテイン）及び無血清軽鎖（ＦＬＣ）比等の１つ以上の血清マーカーを減少させることができる、並びに／又はＸ線検査によって検出することができる骨格の関連する溶骨性病変を減少させることができる。
検出及び診断
間質ＧＲＥＭ１とがんとの相関関係に基づいて、本発明は、がんの検出及び診断、並びにがんの予後判定及び治療に対するがんの応答性の予測のための追加の手段も提供する。
従って、本発明は、患者におけるがんを検出する方法であって、該患者における間質でのＧＲＥＭ１の発現を測定することを含み、間質でのＧＲＥＭ１の過剰発現が、該患者ががんを有していることを示す方法を提供する。本発明はまた、患者におけるがんの予後を判定する方法であって、該がんにおいてＧＲＥＭ１が間質で過剰発現しているか否かを判定することを含み、該がんにおける間質でのＧＲＥＭ１の過剰発現が、ＧＲＥＭ１が間質で正常に発現している状況よりも該患者の予後が悪いことを示す方法を提供する。がんは、本明細書に記載される任意のがんであってよい。がんは、好ましくは、結腸直腸がんであり、典型的には、線維形成性間質、多発性骨髄腫、又は乳がんを含む。
診断は、個体ががん若しくは腫瘍を有しているか否かを判定すること、及び／又はがん若しくは腫瘍の重症度を決定することを含む。
予後判定は、個体ががん又は腫瘍を発症するか否か、治療が必要か否か、個体が必要とする治療の種類、治療に応答するか否か、がんのエピソードを患う又は再発するか否か及び／又はその時期、症状又はがんのエピソード又は再発の重症度又は期間を予測することを含む。予後判定の方法は、がんが寛解した個体が再発するか否かを予測することができる。個体が再発するかどうかを予測することは、個体が再発する可能性を求めること及び／又は個体がいつ再発するかを予測することを含む。本発明は、更に、がんを有しているか、又はがんを有している若しくはがんを発症するリスクがあると疑われる患者が、化学療法剤による治療に応答する可能性があるか否かを判定する方法であって、該患者における間質でのＧＲＥＭ１の発現を測定し、それによって、該患者が該化学療法剤による治療に応答する可能性があるか否かを予測することを含む方法を提供する。
本発明は、更に、がんを有しているか、又はがんを有している若しくはがんを発症するリスクがあると疑われる患者がＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療に応答する可能性が高いか否かを判定する方法であって、該患者におけるＧＲＥＭ１の間質発現を測定し、それによって、該患者がＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療に応答する可能性があるか否かを予測することを含む方法を提供する。上記の方法は、更に、ＧＲＥＭ１アンタゴニストと化学療法剤との併用治療、又はＧＲＥＭ１アンタゴニストの投与と放射線治療とを含む併用治療に対する応答性を予測することができる。
所与の治療法に対して個体の応答性が予測されるとは、個体がその治療法を受けることで利益又は十分な程度の利益を得ると予想されることを意味する。治療法に対して個体の非応答性が予測されるとは、個体がその治療法を受けることで利益又は十分な程度の利益を得るとは予想されないことを意味する。応答を予測する方法は、ＧＲＥＭ１アンタゴニスト又は化学療法剤の投与前に実施してよい。個体に適した治療を選択又は推奨する際に、予測を考慮することができる。あるいは、該方法は、治療法による治療の後に実施されてもよく、該方法を用いて治療に対する個体の応答をモニタリングし、予測することができる。典型的には、方法は、個体が治療法による治療に対する一次応答を有するか否か、すなわち、個体が最初に治療を受けたときに応答するか否かを予測するためのものである。幾つかの場合、方法は、二次非応答性、すなわち、最初に治療に応答した個体が、後に治療に応答しなくなるか否か、又は治療に対してそれほど応答しなくなるか否かを予測するためのものである。
本発明によれば、参照サンプル又は参照レベルと比較して個体における間質及び／又は上皮でのＧＲＥＭ１のレベルが上昇することは、がんの存在に関連する陽性の診断、例えば、個体ががん若しくはがんの特定の形態を有する又はより重症度の高いがんを有することを示す。また、間質及び／又は上皮でのＧＲＥＭ１のレベルの上昇は、負の予後、すなわち、個体が特定の治療法に応答しない、がんが寛解した患者が再発する、又は個体ががんを発症するリスクが高くなる等、個体の予測される転帰が悪いことを示す。
逆に、ＧＲＥＭ１のレベルの低下は又は正常レベルは、陰性の診断、例えば、個体ががんを有していない又はより重症度の低いがんを有することを示す。ＧＲＥＭ１のレベルの低下は、正の予後、すなわち、患者が特定の治療法に応答する、又はがんが寛解した個体が再発しない、又は疾患若しくは状態を発症するリスクが高くない等、患者の転帰が良好であることを示し得る。個体ががんを有しているか否かの診断については、参照サンプル又はレベルは、典型的には、関連するがんを有していないか、又はがんを有すると疑われるが、その後がんを有していないことが確認された個体におけるＧＲＥＭ１のベースラインレベルを表す。
診断又は予後判定の方法は、すなわち、診断又は予後判定に基づいて個体に適した治療を選択又は推奨することを含み得る。次いで、選択又は推奨された治療を、個体に施してよい。従って、上記の検出、診断、予後判定、及び応答性の予測の方法は、１つ以上の予防的又は治療的な抗がん剤を個体に投与する工程、又は放射線療法等のがん治療法を施す工程を更に含んでいてよい。１つ以上の剤は、典型的には、ＧＲＥＭ１アンタゴニストを含み、任意のものは、上記の追加の抗がん剤を更に含んでいてもよい。
幾つかの場合では、参照サンプル又は参照レベルと比較したＧＲＥＭ１の過剰発現は、個体がＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療法に応答することを示す。その場合、ＧＲＥＭ１アンタゴニストの使用を含む治療法を選択又は推奨してよく、次いで、更に個体に施してよい。同様に、ＧＲＥＭ１の過剰発現に基づいて、ＧＲＥＭ１アンタゴニスト及び追加の抗がん剤の使用を含む治療法を選択してもよい。
他の場合では、参照サンプル又は参照レベルと比較して、ＧＲＥＭ１レベルの低下又は正常レベルは、個体がＧＲＥＭ１アンタゴニストによる治療法に応答しないことを示す。その場合、個体にＧＲＥＭ１アンタゴニストを投与しない。更に、個体を治療するためにＧＲＥＭ１アンタゴニスト以外の治療的処置を選択又は推奨してよく、更に個体に施してもよい。
本発明の全ての態様では、がん（例えば、結腸直腸がん又は多発性骨髄腫又は乳がん）を有する個体、又は疾患若しくは状態を有する疑いのある個体、及び／又は疾患若しくは状態を発症するリスクのある個体が、治療のために選択され又は同定され得る。例えば、個体は、正式に診断されていなくてもよいが、１つ以上の症状の存在から疾患又は状態を有していると疑われる場合がある。がんに関連する１つ以上のリスク因子及び／又はがんに対する感受性を高める１つ以上の素因を有する場合、個体ががんを発症するリスクがあるとみなしてよい。結腸直腸がんに関連するリスク因子としては、上記の、例えば、上で論じたＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏｓ Ｇｅｎｅｔ，２０１１に記載のＳＮＰ、及びＧＲＥＭ１をコードしている遺伝子の突然変異（複数可）又はＨＭＰＳの原因となる突然変異を含むＧＲＥＭ１遺伝子の発現に影響を与える任意の他の突然変異等の遺伝性遺伝子突然変異が挙げられる。
以下の実施例は、本発明を説明する。
実施例１－タンパク質の発現、精製、リフォールディング、及び構造決定
タンパク質の発現及び封入体の調製
大腸菌での発現に最適化された、切断型ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１コード配列（配列番号２０）を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いて改変ｐＥＴ３２ａベクター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にクローニングし、Ｎ末端に６Ｈｉｓ－ＴＥＶタグを有するＧｒｅｍｌｉｎ配列をコードしているベクター（ｐＥＴ－ｈＧｒｅｍｌｉｎ１）を生成した。
ｐＥＴ－ｈＧｒｅｍｌｉｎ１プラスミドＤＮＡを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。アンピシリン耐性シングルコロニーをＬＢ／Ａｍｐ寒天プレートからピックし、ＬＢ／Ａｍｐのスターター培養物１００ｍＬに接種するために使用した。３７℃で１６時間振盪（２００ｒｐｍ）した後、スターター培養物２５ｍＬを使用して、２×ＴＹ／Ａｍｐ培地５００ｍＬに接種した。ＯＤ６００が３になるまで、培養物を３７℃で振盪（２５０ｒｐｍ）した。その後、培養物に、ＭＯＰＳ＋グリセロールフィードミックス（１Ｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、４０％グリセロール、０．５％ＭｇＳＯ４、０．４２％ＭｇＣｌ２）２０ｍＬを補給し、３００μＭ ＩＰＴＧで誘導し、更に１７℃で１６時間、１８０ｒｐｍでインキュベートした。遠心分離（４，０００ｇ、４℃で２０分間）で細胞を収集した。
細胞ペレットを４℃の溶解バッファ（ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．３５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、１０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、４℃で３０分間、３，５００ｇで遠心分離することにより不溶性画分を収集した。ペレット化した封入体を、洗浄バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ８．０）に再懸濁することによって３回洗浄し、続いて、２１，０００ｇで１５分間遠心分離した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含まない洗浄バッファを用いて、更に２回の洗浄を行った。
可溶化
封入体を変性バッファ（８Ｍ尿素、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｓ４Ｏ６、及び１００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３、ｐＨ８．５）に再懸濁し、室温で１６時間撹拌し、２１，０００ｇで１５分間遠心分離することにより清澄化した。
リフォールディング前精製
可溶化された封入体を、８Ｍ 尿素、５０ｍＭ ＭＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０で平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００ ２６／６０カラム（１２０ｍＬ）にロードした。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１タンパク質を含有する画分を、６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０で希釈し、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムにロードし、１０カラム容量（１０ＣＶ）にわたって１Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶出した。精製され、変性したｈＧｒｅｍｌｉｎ－１タンパク質を含有する画分をプールした。
リフォールディング
変性し、精製されたＧｒｅｍｌｉｎ－１タンパク質を、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにリフォールディングバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＧＳＨ、及び５ｍＭ ＧＳＳＧ、０．５ｍＭシステイン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍアルギニン）に滴下し、５日間常に撹拌しながら４℃でインキュベートした。５日後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対してＧｒｅｍｌｉｎ－１タンパク質を透析した。
透析後、タンパク質をヘパリンＨｉＴｒａｐカラムに適用し、２０ＣＶにわたって０→１００％ヘパリン溶出バッファ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の勾配で溶出した。正しく折り畳まれたタンパク質は１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたが、任意の誤って折り畳まれたタンパク質はより低い塩濃度で溶出された。
１Ｍ ＮａＣｌで溶出されたタンパク質を濃縮し、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌで平衡化したＳ７５ ２６／６０カラムで更に精製した。
タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥ（ゲルにおけるシフト）によって特性評価したところ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を用いて、予測された分子量及び正確な配置のジスルフィド結合を有すること、そして、細胞アッセイ（ＩＤ１レポーターアッセイ）において活性であることが立証された。
Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の構造決定
６．６ｍｇ／ｍＬ Ｇｒｅｍｌｉｎ－１溶液と、ｐＨ４の０．１Ｍクエン酸、１Ｍ塩化リチウム、及び２７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００とを１：１の比で混合することによって、懸滴法を用いてＧｒｅｍｌｉｎ－１のタンパク質の結晶を成長させた。データを収集する前に、結晶化バッファに２０％グリセロールを添加することによって結晶を凍結保護した。ダイヤモンド光源で回折データを収集し、ＸＤＳを用いて処理した（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ ６６，１２５-１３２）。回折データの統計を下の表にまとめる。
Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔ（２００７），４０，６５８－６７４）及び独自のＧｒｅｍｌｉｎ－１／Ｆａｂ複合体座標から利用可能なＧｒｅｍｌｉｎ－１モデルを用いて、分子置換によりＧｒｅｍｌｉｎ－１の構造を解析した。得られたＧｒｅｍｌｉｎ－１モデルは、２つの二量体として組織化されたＧｒｅｍｌｉｎ－１モノマーを４コピー含んでいた。Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６６（４），４８６－５０１）を用いてモデル補正を行い、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ ＲＥＦＭＡＣ５ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１１；６７（Ｐｔ ４）：３５５－３６７）を用いて座標を精密化した。Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ－ａｔｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６６：１２－２１）を用いて最終座標を確認した。モデル精密化の統計の概要を上の表２に示す。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の結晶構造解析についての完全な構造データは、参照により本明細書に援用される２０１７年１２月１９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０８３６５０号の表１（図１）に提供されている。
実施例２－Ｇｒｅｍｌｉｎ－１におけるＢＭＰ結合残基
上述した通り、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１は、ＤＡＮファミリーとして知られているサブグループ内の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストタンパク質ファミリーに属する。ＤＡＮファミリー内で、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－２（ＰＲＤＣ）と最大の相同性を共有している。
実施例１で解析された２．７ÅのヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の構造は、公開されているマウスＧｒｅｍｌｉｎ－２の構造（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７－１４２９）と共通する多くの特徴を共有している。全体的な折り畳みが非常に類似しており、２コピーのＧｒｅｍｌｉｎ－１が、アーチ状に配置された逆平行の非共有結合二量体を形成している。各モノマーは、フィンガーの反対側のリストの末端に向かってシスチンノットモチーフを有する特徴的なフィンガー－リスト－フィンガー配置を採用している。タンパク質間の配列同一性は５２％であり、２つの構造における目に見える配列内では６７％まで上昇する。最も高度に保存されている領域は、全ての主要な接触残基が１００％保存されている広大な二量体界面に存在する。
ＢＭＰ２、４、及び７のマウスＧｒｅｍｌｉｎ－２（ＰＲＤＣ）及びＤＡＮ（ＮＢＬ１）への結合に関与する残基は、突然変異誘発を用いて同定されている（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７－１４２９及びＮｏｌａｎ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，４７５９－４７７１）。予測されたＢＭＰ結合エピトープは、二量体の凸面上にある両モノマーにまたがる疎水性パッチを包含している。突然変異誘発によって６つの残基：Ｔｒｐ７２、Ｐｈｅ９６、Ｔｙｒ９８、Ｐｈｅ１０４、Ｔｙｒ１０５、及びＰｈｅ１１７が同定され、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１では１００％保存されている（付番は、マウスＧｒｅｍｌｉｎ－２配列に基づく）。相同性の程度は、両タンパク質において同一の立体構造を採用している側鎖の位置にまで及ぶ。
ＧｒｅｍｌｉｎのＰＤＢファイルで使用されるアミノ酸の付番は、構造アラインメントに基づく、公開されているマウスＧｒｅｍｌｉｎ－２における付番と一致する。これにより、構造を記述する際にアミノ酸の相似比較が可能になる。しかし、明確にするために、ＢＭＰの結合において役割を果たしていると同定された主要な残基を以下に示し、括弧内は配列番号１のＰＤＢファイル及びＵｎｉＰｒｏｔファイルに基づく付番である。
Ｔｒｐ７２（９３）、Ｐｈｅ９６（１１７）、Ｔｙｒ９８（１１９）、Ｐｈｅ１０４（１２５）、Ｔｙｒ１０５（１２６）、及びＰｈｅ１１７（１３８）。
マウスＧｒｅｍｌｉｎ－２及びヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の両方において、疎水性ＢＭＰ結合エピトープは、各タンパク質のＮ末端残基によって形成されるアルファヘリックスに部分的に埋没している。ＢＭＰ結合のモデルが提案されており、それによると、Ｎ末端が屈曲してＢＭＰ結合界面が完全に露出している（Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７－１４２９）。本解析では、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１及びマウスＧｒｅｍｌｉｎ－２の構造からＮ末端残基を除去した後、表面をレンダリングして、各タンパク質におけるＢＭＰ結合面の類似性を明らかにした。
文献には、ＢＭＰの結合に影響を及ぼす６つの残基の突然変異誘発についてしか記載されていない。実際のＢＭＰエピトープは、隣接するアミノ酸を包含するより大きな表面積をカバーしている可能性がある。Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の表面上において突然変異したものの６Å以内にある全ての残基を浮き彫りにすることにより、治療薬の標的になる可能性のあるＧｒｅｍｌｉｎ－１のより大きな領域が明らかになる。このより広範な領域は、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の以下のアミノ酸を包含する：
Ａｓｐ９２－Ｌｅｕ９９
Ａｒｇ１１６－Ｈｉｓ１３０
Ｓｅｒ１３７－Ｓｅｒ１４２
Ｃｙｓ１７６－Ｃｙｓ１７８
（配列番号１に基づいて付番）
公開されている情報をヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の結晶構造情報と組み合わせることにより、ＢＭＰとの相互作用をブロックする治療的介入の有望な経路となるヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の領域が同定された。
実施例３－Ｈｅｋ Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイ
背景
Ｈｅｋ Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイは、Ｃｌｏｎｅ１２ Ｈｅｋ２９３－Ｉｄ１レポーター細胞を使用する。この細胞株にＩｄ１転写因子を安定的にトランスフェクトした。Ｉｄ１は、ＢＭＰシグナル伝達経路の転写因子である。Ｇｒｅｍｌｉｎは、ＢＭＰに結合し、その受容体への結合を妨げて、レポーター遺伝子からのルシフェラーゼシグナルを減少させることが知られている。従って、このレポーターアッセイを用いて、抗Ｇｒｅｍｌｉｎ抗体をスクリーニングし、ＧｒｅｍｌｉｎとＢＭＰとの相互作用をブロックするものが存在するかどうかを理解することが可能である。この相互作用がブロックされた場合、これら細胞においてルシフェラーゼシグナルの回復がみられる。
方法
１０％ＦＣＳ、１×Ｌ－グルタミン、及び１×ＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中で、Ｃｌｏｎｅ１２細胞を培養した。また、細胞がＩｄ１遺伝子発現を失わないようにするため、細胞をハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍＬ）の存在下で増殖させる。０．５％ＦＣＳ、１×Ｌ－グルタミン、及び１×ＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中で細胞をアッセイした。細胞のアッセイ時間が短い場合は、ハイグロマイシンＢは必要ない。
細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞解離バッファを用いて剥離し、スピンし、カウントした後、７０μＬ中５×１０４／ウェル（７．１４×１０５／ｍＬの密度）で播種した。使用したプレートは、白色で不透明なポリ－Ｄ－リジンコーティング９６ウェル滅菌プレートであった。細胞を約３～４時間インキュベーターに入れて沈殿させる。ＢＭＰヘテロダイマーを、２００μｇ／ｍＬになるように４ｍＭ ＨＣＬで再構成した。ガラスバイアルを用いて、ＢＭＰをアッセイ培地で１０μｇ／ｍＬに希釈して、新たな作業原液を得た。
ポリプロピレンプレートにおいて、最高最終用量１μｇ／ｍＬの８点用量応答曲線のために、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１を１：２希釈した。
１ウェルあたり２０μＬの追加の体積の培地を添加し、プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。
細胞のみを含有するウェルを除く全てのウェルに、１００×で調製したＢＭＰを添加した。全てのウェルをアッセイ培地で６０μＬにし、３７℃で更に４５分間インキュベートする。
インキュベーション後、アッセイプレートのウェルあたり３０μＬのサンプルを移し、２０～２４時間インキュベートした後、発光シグナルを測定した。
Ｃｅｌｌ Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏを予め室温で解凍しておいた。アッセイプレートを約１０～１５分間かけて室温に冷却した後、試薬を添加した。シェーカー上にて室温で２０分間かけてｃｅｌｌ ｓｔｅａｄｙ ｇｌｏ試薬（１００μＬ）を添加し、Ｓｙｎｅｒｇｙ ２におけるｃｅｌｌ ｔｉｔｒｅ ｇｌｏプロトコルを用いて発光を測定することにより、ルシフェラーゼシグナルを検出した。
ＢＭＰを含有するウェルから最大シグナルが生じ、細胞のみを含有するウェルから最小シグナルが生じた。
結果
Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の完全長型及び切断型をＨｅｋ－Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイで試験して、ＢＭＰ４／７に対するブロッキング活性を確認した。
アッセイにおける最大シグナル及び最小シグナルに基づいて、用量応答アッセイから阻害率を計算し、４パラメータロジスティックフィットを用いてデータを適合させた。曲線の変曲点に基づいてＩＣ５０を算出した。
結論
Ｇｒｅｍｌｉｎ－１は、Ｈｅｋ－Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいて、ＢＭＰ４／７シグナル伝達を阻害することができた。
実施例４－抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体の生成
実施例１に記載の通り精製したｇｒｅｍｌｉｎ－１を用いた免疫、及びライブラリパンニングにより、抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体を作製した。献血から増幅されたＶ領域を有するナイーブヒトライブラリとして、ライブラリをインハウスで作製した。
免疫によって、免疫の第１のラウンドからＧｒｅｍｌｉｎ－１に結合する２６個の異なる抗体が得られた。これら抗体を、スクリーニングアッセイで試験するためにスケールアップし、精製した。
ライブラリから得られたヒト及びマウス交差反応性抗体２５個を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製の組換えヒトＧｒｅｍｌｉｎを用いてパンニングした。スケールアップのために１０個の抗体を選択し、スクリーニングアッセイにおいて試験するためにｓｃＦｖとして精製した。
実施例５－抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体のスクリーニング
実施例３に記載のＨｅｃ－Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイを用い、ＳＭＡＤのリン酸化を測定することにより、抗体をスクリーニングした。ＳＭＡＤ１、５、及び８は、ＢＭＰシグナル伝達の際にリン酸化される。従って、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１の阻害剤は、ＳＭＡＤのリン酸化を増加させる。
Ａ５４９細胞又はヒト肺線維芽細胞で、ＳＭＡＤリン酸化アッセイを実施した。リン酸化レベルは、ＭＳＤを用いて測定した。
結果
Ｈｅｋ－Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイでは、免疫由来の抗体（ＢＭＰ４／７ヘテロダイマーに対して１０倍過剰の抗体を試験した）に見かけ上のヒットは存在しなかった。結果を図１に示す。
対照的に、多数のライブラリ由来の抗体が、Ｈｅｋ－Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてシグナルを回復させることができた（５０％Ｇｒｅｍｌｉｎ用量で５０倍過剰の抗体）（図２）。これらのうち、Ａｂ２４１６及びＡｂ２４１７は高レベルのエンドトキシンを含有していた。Ａｂ７３２６は、１０倍過剰及び８０％阻害Ｇｒｅｍｌｉｎ－１濃度でブロッキング能力を維持していた。
追加の結果を図３Ａ（ヒトｇｒｅｍｌｉｎ）及び３Ｂ（マウスＧｒｅｍｌｉｎ）に示す。これら図は、１５ｎＭ以下のＡｂ７３２６（ＰＢ３７６と表示）の滴定を示す。Ａｂ７３２６は、ヒト（ＩＣ５０ １．３ｎＭ）又はマウス（ＩＣ５０ ０．２ｎＭ Ｇｒｅｍｌｉｎ）のいずれかによってブロックされた場合、ＢＭＰのシグナル伝達を回復することが示された。抗体は、ヒト及びマウスＩｇＧ１の両方として機能する。
マウス及びヒトの完全長ＩｇＧ１の配列を以下に示す。マウス及びヒトの完全長ＩｇＧ１タンパク質を合成するために、ライブラリ由来のＡｂ７３２６可変領域を、適切な抗体定常ドメインを含むベクターに再クローニングした。
Ａｂ７３２６はナイーブヒトライブラリ由来であるので、ＡｂがｓｃＦｖとしてクローニングされた場合、７３２６の可変領域を完全長Ａｂ又はＦａｂとして再クローニングするためには、プライマー／縮重プライマーのプールを使用してＶＨ及びＶＫをＰＣＲ増幅する必要があった。次いで、増幅されたＰＣＲ産物を消化し、マウス及びヒトのベクターに同時にクローニングした。ＶＨ及びＶＫは、プライマー／縮重プライマーのプールによって増幅されたので、ＰＣＲプロセス中にアニーリングする微妙に異なるプライマーに由来する、１つのアミノ酸残基が異なる２つの変異体形態の生成物が得られた。
重鎖可変領域の２つの変異体形態は、以下に示すように、６位における１個のアミノ酸が異なり、軽鎖可変領域の２つの変異体形態は、７位における１個のアミノ酸が異なっていた。
・重鎖可変領域変異体１は、６位にグルタミン酸（Ｅ）を有する。
・重鎖可変領域変異体２は、６位にグルタミン（Ｑ）を有する。
・軽鎖可変領域変異体１は、７位にセリン（Ｓ）を有する。
・軽鎖可変領域変異体２は、７位にスレオニン（Ｔ）を有する。
抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法を用いて決定した（上記配列中太字でハイライト）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義を用いた追加のＨＣＤＲ１残基はイタリック体である。定常領域の配列には下線を引いている。
抗Ｇｒｅｍｌｉｎ１抗体を用いたｐ－ＳＭＡＤシグナル伝達の回復を、以下の表４に示す。
結果は、ＢＭＰ単独（対照ＢＭＰ）によるＳＭＡＤリン酸化の百分率として示す。特発性肺線維症患者由来の肺線維芽細胞を用いて実験を行った。ｒｈＧｒｅｍｌｉｎ－１及び抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体を室温で４５分間プレインキュベートした。次いで、ｒｈＧｒｅｍｌｉｎ－１及び抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体を３０分間かけてＢＭＰと共に細胞に添加した。
次いで、表５は、抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体によるＧｒｅｍｌｉｎ－１－ＢＭＰ複合体からのＢＭＰ－２又はＢＭＰ４／７の解離について調べたＳＭＡＤリン酸化アッセイの更なる結果を示す。再度特発性肺線維症患者由来の肺線維芽細胞を用いて実験を行った。ｒｈＢＭＰ－２又はｒｈＢＭＰ４／７を、ｒｈＧｒｅｍｌｉｎ－１と共に室温で１時間プレインキュベートした。ＢＭＰ－２－又はＢＭＰ４／７－Ｇｒｅｍｌｉｎ－１複合体を、様々な濃度の抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。抗体濃度は、プレート上の最終濃度を表す。
表５に示す結果は、Ａｂ７３２６が、既に複合化されたＢＭＰ－２又はＢＭＰ４／７をＧｒｅｍｌｉｎ－１－ＢＭＰ複合体から解離させることができることを立証する。Ａｂ７３２６は、比較抗体２４８４よりもはるかに低濃度でこの解離を達成することができる。このことは、Ａｂ７３２６がアロステリック阻害剤であることの証拠を提供し、Ａｂ７３２６の結合部位がｇｒｅｍｌｉｎ－１における既知のＢＭＰ結合領域から遠位であるという本発明者らの知見と一致している。このように、Ａｂ７３２６は、ＢＭＰがｇｒｅｍｌｉｎ－１と複合体化している場合でさえもアロステリック結合部位にアクセスすることができ、その結果、ｇｒｅｍｌｉｎ活性の阻害が顕著に改善される。
実施例６－７３２６Ｆａｂとの複合体におけるＧｒｅｍｌｉｎ－１の結晶構造の取得
Ａｂ７３２６Ｆａｂとの複合体におけるヒトＧｒｅｍｌｉｎ－１の結晶構造を、２．１Åの分解能で解析した。Ｆａｂ配列を以下に示す：
重鎖：配列番号１８
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
軽鎖：配列番号１９
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
次いで、ＣＣＰ４ソフトウェアＮＣＯＮＴを用いて、Ｇｒｅｍｌｉｎ－１とＦａｂとの間の４Åにおける全ての接触を同定した。以下の残基が同定された：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４、及びＧｌｎ１７５（配列番号１のＵｎｉＰｒｏｔ配列に基づいて付番（マウスＧｒｅｍｌｉｎ－２の付番と一致する構造ファイルではＩｌｅ１１０、Ｌｙｓ１２６、Ｌｙｓ１２７、Ｐｈｅ１２８、Ｔｈｒ１２９、Ｔｈｒ１３０、Ａｒｇ１４８、Ｌｙｓ１５３、及びＧｌｎ１５４として付番）。
図４は、Ｇｒｅｍｌｉｎ－Ｆａｂ複合体の構造モデルを示し、ＢＭＰ結合領域に対するＦａｂエピトープ残基を示す。
Ａｂ７３２６は、アロステリックに作用する阻害性抗体である、すなわち、ＢＭＰ結合領域から離れて結合する。
実施例７－抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体Ａｂ７３２６のＧｒｅｍｌｉｎ－１への結合についての親和性測定。
方法
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００システム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢにおいて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いる生体分子相互作用分析によって、ヒトＧｒｅｍｌｉｎ１に対する抗Ｇｒｅｍｌｉｎ ｍＩｇＧの親和性を求めた。固定化した抗マウスＦｃ表面で抗Ｇｒｅｍｌｉｎ ｍＩｇＧを捕捉し、捕捉されたｍＩｇＧに対してＧｒｅｍｌｉｎ－１を滴定した。６００秒間の活性化及び不活性化注入を用いてアミンカップリング化学を介して、ＣＭ４センサーチップのフローセル２上に１０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０中５０μｇ／ｍＬで～１６００応答単位（ＲＵ）のレベルになるように捕捉リガンド（ヤギ抗マウスＩｇＧのａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片特異的、１１５－００６－０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を１０μＬ／分の流速でランニングバッファとして使用した。捕捉リガンドを省略したことを除いてフローセル２と同様に表面を活性化及び不活性化することにより、フローセル１上で参照表面を調製した。
アッセイバッファは、ＨＢＳ－ＥＰ＋３００ｍＭの最終ＮａＣｌ濃度を与えるための追加の１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋１％ ＣＭＤ４０であった。固定化された抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ表面上において約１００ＲＵの捕捉レベルを与えるために、抗Ｇｒｅｍｌｉｎ ｍＩｇＧ（ランニングバッファ中５μｇ／ｍＬ）を６０秒間注入してフローセル１及び２に通した。組換えヒトＧｒｅｍｌｉｎ１を５ｎＭからランニングバッファで滴定し（２倍希釈を使用）、３０μＬ／分の流速で３分間フローセル１及び２に注入し、続いて、５分間の解離相に供した。バッファのみの対照も含まれていた。５０ｍＭ ＨＣｌを６０秒間注入し、５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間注入し、５０ｍＭ ＨＣｌを３０秒間注入することにより、１０μＬ／分の流速で表面を再生した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いてキネティックデータを求めた。親和性測定は２５℃で行った。
結果
５回の測定の平均ＫＤ値として得られた結合親和性は、１００ｐＭ未満であることが見出された。
実施例８－抗Ｇｒｅｍ１抗体はマウスオルガノイド培養を阻害した
材料及び方法
マウス手技。全ての手技は、英国内務省の規則及びＡｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ １９８６に基づいて行った。全てのマウスは、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物ユニットで飼育した。本研究で使用した系統は全て、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドで６世代以上維持していた。ＡｐｃＭｉｎ（１）及びＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１（２）、Ａｐｃｆｌ／ｆｌ（３）及びＶｉｌｌｉｎＣｒｅＥＲＴ２（４）マウスのジェノタイピングプロトコルは既に報告されている。カプランマイヤーデータを作成するために、人道的エンドポイント（貧血、猫背、不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ Ａｂ７３２６マウスＩｇＧ１、その後の全てのマウス実験でも使用）又はマウスＩｇＧ１対照Ａｂ１０１．４抗体（ＵＣＢ）を、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週又は隔週（ｂｉ－ｗｅｅｋｌｙ）皮下注射した。長期処理コホートについては、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１及びＡｐｃＭｉｎマウスには３０ｍｇ／ｋｇの用量を６週齢から毎週投与し、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１／ＡｐｃＭｉｎコホートでは３週齢で処理を始めて、６週間にわたって週２回、その後週１回投与した。
組織の調製及び組織学。所定の時点で又は腸管ポリープの症状（貧血、猫背）を示したとき、頸椎脱臼によりマウスを殺処分した。腸管を直ちに摘出し、小腸（近位／ＳＢ１、中位／ＳＢ２、遠位／ＳＢ３）及び大腸に分けた。腸調製装置（５）を使用して縦方向に腸を切開し、ＰＢＳで洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で一晩固定した。ポリープを可視化するために、腸の調製物を０．２％メチレンブルーで１０秒間染色し、ライトボックスを用いて観察した。１０％ホルマリン固定組織の標本をパラフィンに包埋した後、４μｍの切片を作製した。固定された標本を、標準的なプロトコルに従って包埋し、Ｈ＆Ｅ染色した。
免疫組織学的検査。ホルマリン固定したパラフィン包埋組織切片（４μｍ）をキシレンで脱脂し、段階的にアルコール→水で再水和した。２０分間１．６％Ｈ２ Ｏ２を用いて内因性ペルオキシダーゼをブロックした。抗原回復のために、５分間１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファ（ｐＨ６．０）で切片を圧力調理した。３０分間１０％血清で切片をブロックした。スライドを一次抗体と共に２時間インキュベートした。本研究では以下の抗体を使用した；Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ２０（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８５７４、１：２００）、ＥｐｈＢ２（Ｒ ａｎｄ Ｄ、ＡＦ４６７、１：１２５）、Ｋｉ６７（ＣＳＴ、１２２０２５、１：５００）、リゾチーム（ＤＡＫＯ、ＥＣ ３．２．１．１７、１：５００）、及びＳｏｘ９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ａｂ５５３５、１：１０００）。適切な二次抗体を室温で１時間適用した。次いで切片をＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）中で３０分間インキュベートした。ＤＡＢ溶液を２～５分間適用し、発色反応を顕微鏡でモニタリングした。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、クリアし、次いで、標本にした。
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）。ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ）で処理したＨ２Ｏを用いて４μｍ切片を調製した。製造業者の指示に従って、Ｇｒｅｍ１（３１４７４１）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）プローブ及びＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＨＤ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを実施した。
マウス腸陰窩の培養。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ（６）に記載の通り、マウス腸陰窩を単離し、培養した。簡潔に述べると、陰窩を単離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、２４ウェルプレートにプレートアウトした。基本培養培地（ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）を補給した高度ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２）に、以下の成長因子を含む培地を重ねた：５０ｎｇ／ｍＬ 上皮成長因子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ｎｇ／ｍＬ Ｇｒｅｍｌｉｎ１（Ｒ ａｎｄ Ｄ）、５００ｎｇ／ｍＬ Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ ａｎｄ Ｄ）［ＥＧＲ培地］。抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。培地を２日間毎に交換した。
ウエスタンブロッティング。攪拌しながら４℃で２時間３０ｍＭ ＥＤＴＡと共に長さ２ｃｍの組織片をインキュベートすることによって、結腸上皮細胞の単離を実施した。プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ溶解バッファで、ペレット化した上皮細胞を溶解させた。ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ての溶解物を定量し、３５ｍｇを適量の４×ローディング色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、９５℃で５分間変性させた。製造業者のプロトコルに従ってＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてウエスタンブロッティングを行った。簡潔に述べると、変性した溶解物を４～１２％のゲルにロードし、１００Ｖで少なくとも２時間泳動した。半乾式タンクにおいてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｌｏｎ Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にゲルを転写し（１２０ｍＡで少なくとも２時間）、１０％ミルク（Ｍａｒｖｅｌｌ）を含有するＴＢＳ中室温で１時間インキュベートすることによりブロックした。次いで、５％ミルク、ｐＳｍａｄ１／５／８（Ｃｅｌｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、９５１６Ｓ、１：５００）、アクチン（Ｓｔａｎｔａ Ｃｒｕｚｚ、ｓｃ－４７７８、１：２５００）を含むＴＢＳ中適切な一次抗体中において、メンブレンを一晩インキュベートした。洗浄後、メンブレンをＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。更に洗浄した後、ブロットをＥＣＬ試薬（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中でインキュベートし、化学発光フィルム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって化学発光を検出した。
結果の説明（図５も参照）
抗ＧＲＥＭ１抗体の効果を評価するために、マウスオルガノイド培養を用いた。腸管上皮オルガノイド培養の成功は、外因性ＢＭＰアンタゴニストの培地補給に依存する。組換えＮｏｇｇｉｎ及びＧｒｅｍｌｉｎ１は、この目的のために互換的に使用することができ、これらタンパク質のうちの１つが欠けると、培養４日目以降腸陰窩培養が進行しない。
組換え上皮成長因子（Ｅ）、Ｇｒｅｍ１（Ｇ）、及びＲ－Ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ）を全て補給した培地（ＥＧＲ培地）では、陰窩の約６０％がオルガノイドを形成した。組換えＧｒｅｍ１が欠失している培地（ＥＲ培地）では、培養成功率は７日間で２％未満に低下した。
それ以外の点では全て補給された培地に１ｍｇ／ｍＬの抗Ｇｒｅｍ１抗体を添加すると（ＥＧＲ＋抗体）、腸オルガノイド培養の成功が妨げられたが、これは全て補給された培地におけるＧｒｅｍ１のＢＭＰ拮抗作用の消失と一致している。これら結果は、Ｇｒｅｍ１を除外した培地（ＥＲ）と識別不能であった。
実施例９－抗Ｇｒｅｍ１抗体処理は、処理されたＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１動物における腸内ｐＳＭＡＤ１，５シグナル伝達を部分的に回復させる（図６も参照）。
上皮ＢＭＰ活性は、ＳＭＡＤ１、５、８細胞内シグナル伝達トランスデューサのリン酸化によって測定することができる。
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１動物では、上皮における異常なＧｒｅｍ１の発現が、結腸陰窩基底部の外側に位置する細胞における異常な幹／前駆細胞の表現型の促進を介してポリポーシスを開始させる。Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスは、絨毛の異所性陰窩形成、異常な細胞増殖、及び絨毛形成不全の開始を特徴とする重度の汎腸ポリポーシスを約８週齢から発症する。
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおける上皮での異常なＧｒｅｍ１発現は、生理学的腸ＢＭＰ経路活性を抑制し、ウェスタンブロットによって検出されたｐＳＭＡＤ１、５タンパク質レベルが低下した。
抗Ｇｒｅｍ１抗体を３０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週皮下投与したところ、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１腸上皮における腸上皮ｐＳＭＡＤ１，５シグナル伝達を回復させることができたが、より低用量の１０ｍｇ／ｋｇでは回復しなかった。Ｇｒｅｍ１の機能的拮抗を示す。
実施例１０－抗Ｇｒｅｍ１抗体処理は、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１汎腸ポリポーシスの表現型を消失させ、正常な細胞運命決定を回復させる（図７及び図３０を参照）。
また、抗Ｇｒｅｍ１抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）を６週間にわたって週２回Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスに皮下投与した結果、この動物モデルを特徴付ける異常な腸陰窩絨毛構造が治療的にほぼ正常化すると共に、この汎腸ポリポーシスの表現型が用量依存的に且つ非常に顕著に消失した。
処理した動物の免疫組織化学的染色は、未処理の組織を特徴付ける絨毛の異所性陰窩形成及び細胞運命決定の乱れの回復を示した（図７及び３０）。
実施例１１－Ｇｒｅｍ１起始ポリポーシスを有する動物モデルにおける抗Ｇｒｅｍ１抗体による長期処理は、安全であり、動物の寿命を著しく延長する（図８及び３１を参照）。
３週齢（Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎ）又は６週齢（Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１）で開始して、３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体で週２回（Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎ）又は週１回（Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１）動物を皮下処理した。
Ｇｒｅｍ１起始腫瘍形成モデルにおいて抗Ｇｒｅｍ１抗体を長期投与すると、ポリープ形成が遅くなり、腫瘍負荷が減少し、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１動物の動物寿命が著しく延長された。この腫瘍消失効果は、侵襲性Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎ系統であっても、上皮における異常なＧｒｅｍ１発現を起始とする病変全体で一貫しており、抗体処理により、動物の寿命が２倍超になる（ＶＧ－ｍｉｎの平均寿命４６日間に対し、ＶＧ－ｍｉｎ処理の平均寿命１０８日間、ｐ＝２．２１×１０－６）。
４００日間を超える処理を受けた動物において、一貫した有害事象はこれまで観察されていない。
実施例１２－Ｇｒｅｍ１の薬理学的ダウンレギュレーションは、Ａｐｃ Ｍｉｎ マウスにおける変異型Ａｐｃ駆動腫瘍形成を減弱させる（図９及び３２を参照）。
また、上皮におけるＡｐｃの不活性化によって引き起こされる散発性がんのマウスモデルにおいても、ＧＲＥＭ１拮抗作用について調べた。上皮－間葉シグナル伝達クロストークは、間質細胞が急性の上皮におけるＡｐｃの不活化に応答することを意味し、Ｖｉｌｌｉｎ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ａｐｃｆｌ／ｆｌマウスにおける上皮細胞でのＡｐｃの不活化のわずか５日後に腸筋層及び固有層のＧｒｅｍ１の急速なアップレギュレーションが発生する（図９Ａ）。
６週齢から開始した抗Ｇｒｅｍ１抗体による長期処理は、ＡｐｃＭｉｎマウスのポリープ発生に対して一貫した効果を有し、腫瘍負荷の軽減を通して動物の生存期間を延長させた。この研究は、Ｇｒｅｍ１の間質におけるアップレギュレーションが変異型Ａｐｃ駆動腫瘍形成を増悪させる可能性があること、及び抗Ｇｒｅｍ１療法が、非Ｇｒｅｍ１起始腫瘍形成の治療に有用である可能性があることを示す。
実施例１３－Ｇｒｅｍ１は骨髄腫の骨髄微小環境で過剰発現し、骨髄腫の成長を減少させるための標的となり得る。
この研究は、Ｇｒｅｍ１が多発性骨髄腫（ＭＭ）の疾患進行において役割を果たしていることを初めて立証する。患者の骨髄（ＢＭ）のトレフィン生検に由来する間質細胞を分析したところ、ＭＭの間にＢＭ微小環境からのＧｒｅｍ１発現が有意に増加することが立証された。更に、ここに提示するデータは、Ｇｒｅｍ１のレベルの増加がＭＭ ＰＣの増殖を促進すること、及びＧｒｅｍ１を標的として、ＭＭの前臨床マウスモデルにおいてＭＭ腫瘍負荷を有意に低減できることを示す。これは、Ｇｒｅｍ１がＭＭの疾患進行において役割を果たしており、したがって、ＭＭの治療についての治療標的となることの初めての証拠を表す。
方法
骨髄腫細胞株の培養：別段の記載がない限り、全ての組織培養培地は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び添加剤（２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン；全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ製）を含有していた。マウス５ＴＧＭ１ ＭＭ細胞は、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び添加剤を補給したイスコフ変法イーグル培地中で維持した。本発明者らは以前、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びホタルルシフェラーゼ（Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）をコードしている３併用（ｔｒｉｍｏｄａｌｉｔｙ）レトロウイルスＮＥＳ－ＴＧＬコンストラクト（Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ ｅｔ ａｌ（２００４）を用いて５ＴＧＭ１細胞（Ｄａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を改変し、一貫した骨指向性を示す新たなクローン亜系統を樹立した（Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４；（Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＯＰ９骨髄間質細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び添加剤を含むダルベッコ変法イーグル培地中で維持した。５ＴＧＭ１細胞及びＯＰ９細胞の共培養物は、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び添加剤を補給したイスコフ変法イーグル培地中で維持した。ヒトＭＭ細胞株ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、ＫＭＳ－１１、及びＨ９２９は、全てＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。全ての細胞株は、５％二酸化炭素を含む３７℃の加湿環境で維持した。
マウスＢＭ間質からのＲＮＡの単離：Ｃ５７ＢＬ６／ＫａＬｗＲｉｊ．Ｈｓｄマウスに５×１０５個の５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを注射し、４週間にわたって腫瘍成長を確立した（既述の通り）（Ｎｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。簡潔に述べると、５ＴＧＭ１細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した後、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスの尾静脈に５×１０５個の細胞を注射した。１５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ，Ｒａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ １００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＵＳＡ））を用いた動物全身生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって腫瘍の成長をモニタリングした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて腫瘍負荷を定量した。腫瘍負荷を有するマウス及び同年齢の非腫瘍対照を、ＳＡＨＭＲＩ ｅｔｈｉｃｓ ＳＡＭ１６５に従って人道的に間引いた。各マウスの大腿骨及び脛骨を分離し、ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、及び２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＦＥ）で骨髄を洗い流した。骨を粉砕し、振盪インキュベーター内において３７℃で２時間、３ｍＬの３ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩで消化した。懸濁液をＰＦＥで１０ｍＬに希釈した。１４００ｇで５分間スピンして細胞を回収する。１×ＰＦＥで洗浄し、スピンを繰り返す。細胞ペレット及び骨細片を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）に再懸濁し、ボルテックスし、氷上で１５分間インキュベートした。ＴＲＩｚｏｌを回収し、（既述の通り）クロロホルム／イソプロパノール沈殿によりＲＮＡ抽出のために処理した。
ヒト及びマウスの間質におけるＧｒｅｍ１発現の評価：Ｒｏｙａｌ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に来院した無作為に選択された症候性ＭＭ患者及び血液学的に正常な同年齢対照から、インフォームドコンセントを受けて、腸骨稜トレフィンを採取した。全てのＭＭ患者は新たに診断され、それまで治療を受けたことがなかった。本研究は、Ｒｏｙａｌ Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの施設内倫理審査委員会から倫理的承認を取得している（倫理承認番号＃０３０２０６）。接着性間質細胞を各トレフィンからエクスビボで増殖させ、更に１回継代した後に冷凍保存した。間質サンプルを液体窒素中の保存から取り出し、２４時間培養した後、既に述べたように下流のＲＮＡ抽出のためにＴＲＩｚｏｌに回収した。ＲＱ１ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）でＲＮＡをＤＮａｓｅ処理した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを生成した。ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔにおいてＲＴ２ ＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ヒト及びマウスの両サンプルにおけるＧｒｅｍ１発現の定量ＰＣＲ分析を行い、標準曲線法を用いて内因性対照としてのＢ－アクチンに対して正規化した。以下のプライマーを使用した：マウスＧｒｅｍ１：フォワード５’－ＧＣＧＣＡＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＧＣＧＡＧ－３’（配列番号３８）；リバース５’－ＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＧＣＧＧＣＴ－３’（配列番号３９）、ヒトＧｒｅｍ１：フォワード５’－ＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧ－３’（配列番号４０）；リバース５’－ＧＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＧＣＧ－３’（配列番号４１）；Ｂ－アクチン：フォワード５’－ＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣ－３’（配列番号４２）；リバース５’－ＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴ－３’（配列番号４３）。
マウス間質Ｇｒｅｍ１過剰発現細胞株の作製：Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，ＳＡＨＭＲＩにより供与されたｐＣＭＶ６－ＫＲベクターから、Ｇｒｅｍ１のマウスｃＤＮＡを単離した。マウスＧｒｅｍ１配列をＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１制限酵素消化により切断し、ｐＬｅＧｏｉＴ２ベクターにクローニングした。ＯＰ９－ＧＦＰ＋細胞にレンチウイルスを感染させた後、ＧＦＰ及びＴｄＴｏｍａｔｏについて陽性である細胞をＦＡＣＳによって選別した。定量ＰＣＲ及びウェスタンブロットによってトランスジーンの発現を確認した。
ＭＭ ＰＣ及びＢＭ間質の共培養：それぞれ［細胞密度］で６ｃｍのＴＣディッシュ及び２４ウェルプレートの両方にＯＰ９間質細胞を播種し、５時間付着させた。５ＴＧＭ１ ＭＭ ＰＣを１×１０５細胞／ｍＬで懸濁し、間質細胞培養物に添加した。共培養開始の２４時間、４８時間、及び７２時間後に間質細胞を回収した。接触共培養については、分析のための純粋な間質集団を得るために、ＧＦＰ陰性５ＴＧＭ１親ＭＭ ＰＣからＦＡＣＳによってＧＦＰ＋ＯＰ９細胞を単離した。非接触共培養については、共培養期間中４μｍトランスウェルを用いてＯＰ９細胞から５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＰＣを分離した。ヒトＭＭ細胞株ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６、ＫＭＳ－１１、及びＨ９２９を、それぞれ造血的に健常な個体から単離された３つの初代ヒトＢＭ間質サンプルと共に７２時間培養した。ヒトＭＭ細胞株を、１×ＰＢＳで２回、接着性間質から十分に洗浄した。間質細胞をＴＲＩｚｏｌで溶解させ、クロロホルム／イソプロパノール単離によって処理した。ＲＱ１ ＤＮａｓｅでＲＮＡをＤＮａｓｅ処理した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを生成した。既述したプライマー配列を用いて定量ＰＣＲによりＧｒｅｍ１の発現を評価した。
ルシフェラーゼ増殖アッセイ：Ｇｒｅｍ１を過剰発現している及びベクターのみのＯＰ９間質細胞を、１ウェルあたり５×１０＾４細胞で２４ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを両間質細胞集団に播種し、７２時間培養した。インキュベーション後、激しくピペッティングすることにより、各ウェルの内容物全体を対応するマイクロファージチューブに移した。４℃で５分間、２００００ｇでスピンすることにより細胞を回収した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。各ウェルの細胞ペレットを１×細胞溶解バッファ（供給元名）で溶解した。細胞溶解液２０μＬを９６ウェルプレートに移した。プレートを読み取る直前に、ルシフェラーゼ反応バッファ（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０μＭ ＡＴＰ、２５０μＭ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、及び１５０μｇ／ｍＬ Ｄ－ルシフェリン）１００μＬを細胞溶解液に添加した。Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて生物発光を測定し、ＭＭ ＰＣ数の直接相関として光強度を使用した。
全身性ＭＭの免疫不全マウスモデルにおけるＧｒｅｍ１の標的化：Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウス（６～８週齢）に、尾静脈注射により５×１０５個の５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１細胞を接種した。５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１ ＭＭ ＰＣを接種した３日後、３０ｍｇ／ｋｇ Ｇｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６又はＩｇＧ対照Ａｂ１０１．４（ＵＣＢ－Ｐｈａｒｍａ，ＵＫ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射によりＫａＬｗＲｉｊマウスに投与した。４週間モデルの期間中、３日ごとにマウスを処理した。前述のようにＢＬＩによって腫瘍負荷を毎週モニタリングした。実験の最後に、尾採血により血液を採取し、２１００ｇで１０分間遠心分離し、血清を回収した。製造業者の指示に従って、Ｈｙｄｒａｇｅｌ ３０ β１β２キット（Ｓｅｂｉａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）を用いて血清パラプロテインレベルを分析した。パラプロテインに対応するバンドを血清アルブミン値に対して定量した。（ＳＡＨＭＲＩ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ＳＡＭ１６５）
統計値：数値データは平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として提示する。２つの試験条件を表すデータは、スチューデントのＴ検定によって解析した。２つを超える試験条件のデータは、一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析した後、チューキーの多重比較事後検定を行って、差の統計的有意性を判定した。全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。全ての実験をトリプリケートで実施した。
結果の説明
Ｇｒｅｍ１の発現は、ＭＭの骨髄間質でアップレギュレーションされる
健常患者及びＭＭ患者に由来するＢＭ間質から得られたｍＲＮＡサンプルにおいて、Ｇｒｅｍ１の発現を分析した。ＭＭ患者のＢＭ間質（ｎ＝１５）は、同年齢の造血的に正常なドナー（ｎ＝１７）由来のＢＭ間質と比較して、Ｇｒｅｍ１の発現が有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図１０）。また、５ＴＧＭ１／ＫａＬｗＲｉｊ．Ｈｓｄマウスの骨髄腫モデルにおいてもＧｒｅｍ１の発現を調べた。健常及びＭＭ担がんＣ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊ．Ｈｓｄマウスから緻密骨を分離し、Ｇｒｅｍ１発現の差について分析した。担がんマウス由来のＢＭ間質は、健常対照と比較してＧｒｅｍ１の発現の有意な増加は認められなかったが、Ｇｒｅｍ１の発現が増加する傾向が観察された（図１１Ａ）。重要なことに、生物発光イメージングによって測定したとき、最大の腫瘍負荷を有するマウスが、最高のＧｒｅｍ１発現を示した（図１１Ｂ）。この結果は、ＭＭ腫瘍増殖に応答するＧｒｅｍ１の増加がヒト状況における知見を裏付けることを示す。
ＭＭ細胞はＢＭ間質におけるＧｒｅｍ１発現の増加を促進する
ＢＭ由来の間質細胞株ＯＰ９と共にマウスＭＭ細胞株５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１を用いる共培養実験を行って、ＢＭ微小環境におけるＧｒｅｍ１の発現に対するＭＭ ＰＣの影響を調べた。７２時間の共培養後、Ｇｒｅｍ１の発現は、ＭＭ ＰＣの存在下で培養したＢＭ間質細胞において、ＭＭ ＰＣ株と接触しなかったものよりも有意に多かった（ｐ＜０．０５）（図１２ａ）。２４時間及び４８時間の共培養のより早い時点では、間質におけるＧｒｅｍ１発現の有意な変化は認められなかった（図１２ａ）。トランスウェル及び細胞接触条件の両方で共培養を実施したが、細胞接触共培養のみが、間質におけるＧｒｅｍ１発現の変化を示した（図１２ｂ）。また、造血的に正常な個体に由来する初代ヒト骨髄間質細胞を、ヒトＭＭ細胞株ＫＭＳ－１１、ＲＰＭＩ．８２２６、Ｈ９２９、及びＵ２６６と共に培養した。ＫＭＳ－１１及びＵ２６６細胞株は、７２時間の共培養後にＢＭ間質からのＧｒｅｍ１発現の増加を誘導する能力を示したが、細胞株ＲＰＭＩ．８２２６及びＨ９２９との共培養では、間質におけるＧｒｅｍ１発現は変化しなかった（図１３）。
Ｇｒｅｍ１発現の増加はＭＭ ＰＣの増殖を促進する
ＭＭ状況におけるＧｒｅｍ１の重要性について更に調べるために、Ｇｒｅｍ１を過剰発現している間質細胞を作製し、５ＴＧＭ１ ＭＭ ＰＣとの共培養に使用した。ＭＭ ＰＣは、Ｇｒｅｍｌｉｎ１過剰発現間質細胞と共培養した場合、トランスウェル培養及び細胞接触培養の両状況で有意な増殖増加を示した（図１４）（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。Ｇｒｅｍ１過剰発現ＢＭ間質と共に共培養したＭＭ ＰＣは、その後、Ｓｍａｄｓ－１／５／９のリン酸化の減少によって示される通り、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化の減少を示した（図１６）。ＢＭＰ経路は、ＭＭ ＰＣの増殖を阻害し、アポトーシスを促進することが知られており、観察されたＭＭ ＰＣの増殖を減少させる可能性のある機序を表す（Ｈｊｅｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，２００１；Ｈｏｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１２）。
Ｇｒｅｍ１を標的とすると、インビボでＭＭ腫瘍負荷が減少する
インビボにおけるＭＭ腫瘍の樹立及び成長におけるＧｒｅｍｌｉｎ１の重要性を調べるために、５ＴＧＭ１／ＫａＬｗＲｉｊマウスＭＭモデルを利用した。疾患発症後、Ｇｒｅｍｌｉｎ１中和抗体（Ａｂ７３２６、ＵＣＢ－ＣｅｌｌＴｅｃｈ，ＵＫ）又はＩｇＧ対照による処理を受けるようにマウスを無作為に割り付け（ｎ＝１３／処理群）、生物発光イメージングを介して４週間にわたって毎週疾患負荷をモニタリングした。これらの研究は、抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１療法による処理が、インビボにおいてＭＭ腫瘍負荷を有意に減少させることを立証した（図１５）（二元配置分散分析、ｐ＝０．００５６）。疾患負荷のＳＰＥＰ解析は同等の結果を示し、抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理したマウスは、対照で処理したマウスに比べて血清アルブミンに対するＭスパイク強度が有意に低かった。
考察
ＭＭ患者のＢＭ間質におけるＧｒｅｍ１の増加の所見は、微小環境細胞集団によって生成されるＧｒｅｍｌｉｎ１の増加について報告した先行研究と一致している。更に、ＭＭ様腫瘍を有するマウスの骨では、Ｇｒｅｍ１の発現が増加する傾向が観察された。インビボモデルに使用した細胞株を用いて更なる研究を実施したところ、ＢＭ由来の間質細胞株において直接マウスＭＭ ＰＣ株を培養すると、その後、間質からＧｒｅｍ１の発現が増加することが示された。この知見は、間質細胞と直接細胞間接触することができないＭＭ ＰＣでは再現されなかったが、発現が増加する傾向が観察された。このことは、間質からのＧｒｅｍ１発現の増加に関与するＭＭ細胞由来の因子が、主に細胞接触に依存していることを示す。これは、正常なヒトの間質と共に培養した４つのヒトＭＭ細胞株のうち２つでも観察された。ＭＭ細胞株ＫＭＳ－１１及びＵ２６６は、Ｇｒｅｍ１発現の増加を誘導することができたが、ＲＰＭＩ．８２２６及びＨ９２９細胞株はできなかった。一部のヒトＭＭ細胞株はＧｒｅｍ１発現の変化を誘導する能力を有するが、他はこの能力を有しないことは、これら細胞株間でＧｒｅｍ１の調節に関与する重要な因子の発現に根本的な違いがあることを示している可能性があり、予備的研究は、ＭＭにおけるＧｒｅｍ１の調節におけるインターロイキン－６（ＩＬ－６）の役割を示唆している（図１７）。また、間質でのＧｒｅｍ１発現を誘導する細胞株の能力が、Ｇｒｅｍ１に対するその増殖応答と相関するか否かを判定するために更なる研究が必要である。
ＭＭにおけるＧｒｅｍ１の役割を調べるために、腫瘍微小環境と腫瘍細胞の間のクロストークを部分的に再現するために、Ｇｒｅｍ１を過剰発現しているＢＭ間質細胞を作製し、ＭＭ ＰＣと共に共培養した。ＭＭ ＰＣは、Ｇｒｅｍ１を過剰発現している間質細胞との共培養で有意な増殖増加を示した。Ｇｒｅｍ１の増加に応答してＳｍａｄｓ１、５、及び９のリン酸化が減少したことによって示された通り、ＢＭＰシグナル伝達の下流の活性化の減少が観察された（図１６）。
Ｇｒｅｍ１はＭＭにおいて明らかな分裂促進的役割を示すことから、本発明者らは、Ｇｒｅｍ１を治療標的とすることが治療の選択肢となるか否かについて検討した。ＭＭの５ＴＧＭ１／ＫａＬｗＲｉｊマウスモデルにおいてＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６を使用すると、ＭＭの腫瘍負荷がほぼ５０％減少することが示された。５ＴＧＭ１ ＭＭ ＰＣはＧｒｅｍ１を発現しないので、この効果は純粋に微小環境を標的としたこと結果であり得る。
まとめると、本研究は、Ｇｒｅｍ１がＭＭにおける治療標的となることを示す。
実施例１４－ＭＭモデルマウスにおけるＧｒｅｍ１の前処理
序論
多発性骨髄腫（ＭＭ）腫瘍をマウスに接種した３日後にＧｒｅｍ１中和抗体を適用した結果、腫瘍負荷が約５０％減少した。このことから、ＭＭ疾患の進行におけるＧｒｅｍ１の明確な役割が証明されたが、Ｇｒｅｍ１がＭＭ疾患の発症において役割を果たしているか否かについてはまだ確定されていない。この問題に取り組むために、５ＴＧＭ１／ＫａＬｗＲｉｊマウスモデルにＧｒｅｍ１中和抗体を投与した後、腫瘍を接種した。
方法
全身性ＭＭの免疫不全マウスモデルにおける腫瘍細胞接種前のＧｒｅｍ１の標的化：腫瘍接種の３日前及び１日前に、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウス（６～８週齢）に、３０ｍｇ／ｋｇのＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６又はＩｇＧ対照Ａｂ１０１．４（ＵＣＢ－Ｐｈａｒｍａ，ＵＫ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射によって２回投与した。０日目に、尾静脈注射を介して５×１０５個の５ＴＧＭ１．Ｂｍｘ１細胞をマウスに接種した。４週間モデルの期間中、３０ｍｇ／ｋｇのＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６又はＩｇＧ対照Ａｂ１０１．４（ＵＣＢ－Ｐｈａｒｍａ，ＵＫ）のいずれかを３日ごとにｓ．ｃ．注射によってマウスに投与し続けた。前述のようにＢＬＩによって腫瘍負荷を毎週モニタリングした。実験の最後に、尾採血により血液を採取し、２１００ｇで１０分間遠心分離し、血清を回収した。製造業者の指示に従って、Ｈｙｄｒａｇｅｌ ３０ β１β２キット（Ｓｅｂｉａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）を用いて、血清パラプロテインレベルを分析した。パラプロテインに対応するバンドを血清アルブミン値に対して定量した。（ＳＡＨＭＲＩ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ＳＡＭ１６５）
結果／考察
本発明者らのこれまでのデータは、骨髄腫の５ＴＧＭ１／ＫａＬｗＲｉｊマウスモデルにおいて、Ｇｒｅｍ１を標的としてＭＭ腫瘍負荷を低減できることを立証した。これにより、Ｇｒｅｍ１が疾患の進行に寄与する重要な微小環境因子であり、治療の標的となり得ることが立証された。しかし、Ｇｒｅｍ１がＭＭ疾患の発症においても役割を果たしているか否かはまだ不明であった。この問題に対処するために、マウスをＧｒｅｍ１中和抗体処理又はＩｇＧ対照に供した後、ＭＭ腫瘍細胞を接種した。図１８に示すように、腫瘍細胞接種後４週間で腫瘍負荷の約７５％の減少が観察された。
ＭＭ腫瘍細胞の投与前にＧｒｅｍ１をブロックすると、腫瘍細胞接種後の処理と比較して、試験の終了時までに全身腫瘍負荷が更に２５％減少することが示された。腫瘍モデルの開始前に投与した場合のＧｒｅｍ１中和抗体の有効性の増加は、ＭＭ疾患の発症におけるＧｒｅｍ１の役割を示唆している。
実施例１５－Ｇｒｅｍ１によって誘導される乳がん細胞の増殖及び抗Ｇｒｅｍ１抗体によるＧｒｅｍ１効果の拮抗作用
材料及び方法
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）
ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ乳がん細胞及びヒトＭＦ９乳腺線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、正常酸素圧又は低酸素条件で４８時間培養した。正常酸素圧条件は、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２で３７℃において維持し、一方、低酸素条件は、５％Ｏ２、１０％ＣＯ２で低酸素インビトロチャンバー（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇｒａｓｓ Ｌａｋｅ，ＭＩ，ＵＳＡ）において維持した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの夾雑をＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で除去した後、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。１μｇの各ＲＮＡサンプルを逆転写し、Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔにおいてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＴ－ＰＣＲによりＧｒｅｍ１遺伝子の発現を定量した。２－ΔＣＴ法を適用し、β－ａｃｔｉｎに対して標準化された遺伝子発現を用いて、トリプリケートで実験を行った。データは、正常酸素圧対照に対する倍数変化として示す。
プライマー対：
ヒトＧｒｅｍ１：
５’－ＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧ－３’（フォワード）（配列番号４０）、
５’－ＧＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴＧＣＧ－３’（リバース）（配列番号４１）；
β－アクチン：
５’－ＧＡＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣ－３’（フォワード）（配列番号４２）、
５’－ＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴ－３’（リバース）（配列番号４３）。
低酸素下における増殖アッセイ
ルシフェラーゼを発現しているＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した（１×１０４細胞／ウェル）。細胞を正常酸素圧又は低酸素条件下で培養し、一晩付着させた。次いで、細胞を６時間血清飢餓状態にした後、漸増濃度のｒｈＧｒｅｍ１タンパク質（０～１０００ｎｇ／ｍＬ）で処理した。２４時間及び４８時間の時点で、ルシフェラーゼ発現を評価し、細胞数の代替尺度として使用した。簡潔に述べると、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、その後、細胞培養溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。ルシフェラーゼアッセイ試薬（５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０μＭ ＡＴＰ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、及び１５０μｇ／ｍＬ Ｄ－ルシフェリン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ ＡＧ，Ｓｔａａｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を細胞溶解物に添加し、ルミノメータープレートリーダー（Ｗａｌｌｌａｃ３０００）を用いて直ちに発光を定量した。
トランスウェル共培養増殖アッセイ
ルシフェラーゼを発現しているマウス４Ｔ１乳がん細胞（１×１０４細胞）を、２４ウェルプレート中の３μｍポリカーボネートメンブレントランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）に播種した。一晩培養した後、４Ｔ１細胞を無血清ＤＭＥＭ中で６時間飢餓状態にして細胞成長を同期させた。対照又はＧｒｅｍ１を発現しているｐＬＥＧＯｉＴ２コンストラクトが既に形質導入されているＧＦＰ＋マウス間質ＯＰ９細胞を、下方チャンバーの１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭ中に播種した（２×１０４細胞）。細胞を７２時間共培養した後、ルシフェラーゼ発現を介して４Ｔ１細胞の増殖を分析した。
ウェスタンブロット分析
マウス４Ｔ１ ＢｒＣａ細胞を６ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を無血清培地中で一晩飢餓状態にし、次いで、指定の処理で２時間刺激した。細胞溶解物を調製し、１０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲルにおいて等量のタンパク質（５０μｇ）を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。リン酸化Ｓｍａｄ１／５／９抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：１０００希釈）を用いてイムノブロッティングを行った。β－アクチンに対する抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，１：２５００希釈）でメンブレンをブロッティングすることによって、タンパク質サンプルが等しくロードされたことを確認した。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）を用いてタンパク質を可視化した。
結果及び考察：
本発明者らは、Ｇｒｅｍ１が低酸素条件下でヒト乳がん細胞の増殖を誘導することを明らかにした。Ｇｒｅｍ１が乳がんの増殖を促進する機序は未だ不明であるが、他の幾つかの細胞型において低酸素下でＢＭＰの発現が増加することが示されている。従って、Ｇｒｅｍ１はＢＭＰの抗増殖作用を阻害することによって低酸素下で増殖を誘導している可能性がある。ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ乳がん細胞及びヒトＭＦ９乳腺線維芽細胞を、正常酸素圧（２０％Ｏ２）及び低酸素（５％Ｏ２）条件で４８時間培養した。Ｇｒｅｍ１ ｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲで定量したところ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ細胞（ｐ＝０．００２４）及びＭＦ９細胞（ｐ＝０．０３４）のいずれにおいても、正常酸素圧対照と比較して低酸素下ではＧｒｅｍ１発現が増加することが明らかになった（図１９）。
低酸素条件下で培養した場合、ｒｈＧｒｅｍ１は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＴＸＳＡ増殖の用量依存的な増加を刺激し、それぞれ２４時間後及び４８時間後に正常酸素圧条件と比較して最大１．５倍（ｐ＜０．００５）及び１．７倍（ｐ＜０．０００５）であった（図２０）。
Ｇｒｅｍ１が他の間質因子に関連して乳がん細胞の増殖を誘導するか否かを更に調べるために、マウス４Ｔ１乳がん細胞を、Ｇｒｅｍ１又は対照ベクターのいずれかを発現している間質ＯＰ９細胞と共培養した。間質細胞由来のＧｒｅｍ１は、７２時間培養した後に乳がん細胞の増殖を１．８倍（ｐ＜０．０００５）に有意に増加させた（図２１）。このことは、Ｇｒｅｍ１が間質由来のＢＭＰに拮抗することによって増殖を誘導する可能性があることを更に示唆している。
Ｇｒｅｍ１は公知のＢＭＰ－２／４／７アンタゴニストであるので、本発明者らは、ウェスタンブロット分析を介して、Ｇｒｅｍ１によって誘導されるＳｍａｄ１／５／９のリン酸化の阻害を阻害するＵＣＢ抗体Ａｂ７３２６の能力を評価した。マウス４Ｔ１乳がん細胞を１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ２に曝露したところ、Ｓｍａｄ１／５／９がリン酸化された。１００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧｒｅｍ１とコインキュベートすると、このＢＭＰ２によって媒介されるＳｍａｄ１／５／９のリン酸化が阻害された。注目すべきことに、アイソタイプ対照と共にプレインキュベートしたｒｈＧｒｅｍ１に曝露した４Ｔ１細胞と比較して、Ａｂ７３２６と共にｒｈＧｒｅｍ１をプレインキュベートすると、４Ｔ１細胞におけるＳｍａｄ１／５／９のリン酸化が部分的に回復した（図２２）。これら結果から、Ａｂ７３２６がＧｒｅｍ１の効果を有効に標的とし、中和することができることが確認される。
実施例１６－ＶＧ／Ｍｉｎマウスにおける単剤療法及び併用療法の効果
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１／ＡｐｃＭｉｎ疾患プロセスの最晩期である３５日齢以降、マウスを３０ｍｇ／ｋｇの抗Ｇｒｅｍ１抗体で毎週処理した及び／又はマウスに４０ｍｇ／ｋｇの５－フルオロウラシル（５ＦＵ、Ｓｉｇｍａ）を１日２回腹腔内投与した。カプランマイヤーデータを作成するために、人道的エンドポイント（マウスが貧血、猫背、及び不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。
この疾患の末期における５ＦＵ又は抗Ｇｒｅｍ１のいずれかによる単剤療法は、マウスの寿命に影響を与えなかったが、併用療法は、マウスの寿命を有意に延長した（中央生存期間：無処理４５日間（ｎ＝９）、５ＦＵのみ４７日間（ｎ＝４）、抗Ｇｒｅｍ１のみ４９．５日間（ｎ＝６）、併用療法７６．５日間（ｎ＝６）：ログランクｐ＜０．０１）、図２３を参照。これらデータは、増殖している上皮を標的とした標準的な化学療法と共に抗Ｇｒｅｍ１抗体を使用して、末期の確立された疾患における併用療法の有効性を示す。
実施例１７－ヒト患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおける抗Ｇｒｅｍ１抗体の効果
マウスＩｇＧ１としての抗ｇｒｅｍｌｉｎ－１ Ａｂ７３２６の有効性を、８つの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルで試験する。対照組織に対するＧＲＥＭ１遺伝子産物の発現の増加に基づいて、ヒトＰＤＸモデルを選択した。選択されたモデルは、膵臓がん、肺がん、腎がん、結腸直腸がん、胃がん、頭頸部がん、及び肝臓がんに由来する異種移植片を含む。Ａｂ７３２６を毎週皮下投与する。モデル期間全体を通して腫瘍サイズを評価し、腫瘍及び血漿のサンプルを実験終了時に収集し、分析する。
実施例１８－Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスにおける腫瘍負荷に対する抗Ｇｒｅｍ１抗体の効果（図３３）
Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスをＧｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６で処理すると、マウスにおける腫瘍負荷が後肢骨において有意に減少したことが観察された（図３３参照）。ＩｇＧ対照（ＢＬＩにより測定）と比較して、腫瘍細胞接種後に抗Ｇｒｅｍ１抗体を投与した場合、腫瘍負荷の有意な減少がみられた（図３３Ａ）。再びＩｇＧ対照（ＢＬＩにより測定）と比較して、腫瘍細胞接種前に抗Ｇｒｅｍ１抗体を投与した場合も、腫瘍負荷の有意な減少がみられた（図３３Ｂ）。また、腫瘍細胞接種の後（図３３Ｃ）又は前（図３３Ｄ）の群の両方で、抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理した群において脾臓腫瘍負荷の減少傾向も観察された。
Ｃ５７Ｂｌ６／ＫａＬｗＲｉｊマウスは、骨髄（ＢＭ）及び脾臓内でＭＭ細胞が増殖する多発性骨髄腫（ＭＭ）のモデルである。図３３に提示されたデータは、抗Ｇｒｅｍ１処理がＢＭ関連腫瘍に加えて脾臓のＭＭ細胞を標的とすることを立証する。従って、抗Ｇｒｅｍ１療法を使用して、骨肉腫等の骨常在腫瘍、並びに肝臓がん、乳がん、及び／又は前立腺がん等の播種性がんの両方を治療することができる。
実施例１９－確立されたＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１及びＡｐｃ Ｍｉｎ ポリポーシスの抗Ｇｒｅｍ１抗体による後期処理は、疾患の進行を遅らせ、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスの腸表現型を回復させる（図３４）
ＡｐｃＭｉｎマウス（図３４Ｂ）では４月齢から、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（図３４Ａ）では５月齢から開始して、週３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ）又は対照抗体（ＵＣＢ）を皮下注射で投与した。
マウスの年齢は、抗体処理開始（ＡｐｃＭｉｎマウスでは４月齢、そして、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスでは５月齢）前に腸管ポリポーシスが発症できるようにした。カプランマイヤーデータを作成するために、人道的エンドポイント（マウスが貧血、猫背、及び不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１（Ａ）及びＡｐｃＭｉｎ（Ｂ）の両モデルにおいて、抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理するとマウスの寿命が有意に延長された。指定時点で殺処分したところ、４週間の処理でＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１の腸表現型の回復を示した。
実施例２０－抗Ｇｒｅｍ１抗体処理は、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ １マウスをＡＯＭ突然変異誘発から保護する（図３５）
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおける上皮での異常なＧｒｅｍ１の発現は、上皮幹／前駆細胞の表現型を促進する（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）ことから、本発明者らは、これら細胞が体細胞突然変異の影響を受けやすいという仮説を立てた。アゾキシメタン（ＡＯＭ）投与を用いて、未処理Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス及び抗Ｇｒｅｍ１処理Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスに対する変異原性侵襲の影響を調べた。ＡＯＭは、自然発症ＣＲＣ発がんを再現するためにマウスモデルで広く利用されている、十分実証されている突然変異原である（Ｎｅｕｆｅｒｔ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ，２００７）。カプランマイヤーデータを作成するために、人道的エンドポイント（マウスが貧血、猫背、及び不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。
マウスに、週３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体を３回皮下投与し、続いて、週１０ｍｇ／ｋｇの用量のアゾキシメタン（ＡＯＭ、Ｓｉｇｍａ）又はビヒクル（生理食塩水）を３回腹腔内投与した後、更に３週間、週３０ｍｇ／ｋｇの抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理した。前駆細胞集団の増殖及びその後の異所性陰窩病巣の形成を確実にするために、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１疾患プロセスにおいて十分に後期である９０日齢以降に処理を開始した。
ＡＯＭ投与により、未処理Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおけるポリープ形成が顕著に増強された。結腸ポリープ負荷は、ＡＯＭ処理動物において有意に増加した（図３５Ｂ）。これは、マウスの生存に負の影響を与えた（図３５Ａ）：群ＶＧ＋無処理を群ＶＧ＋ＡＯＭ＋無処理と比較。ＡＯＭ処理動物の腫瘍負荷の増加及び生存期間の減少は、突然変異原性侵襲前後の期間に抗Ｇｒｅｍ１抗体を投与することによって部分的に消失した：群ＶＧ＋ＡＯＭ＋無処理を群ＶＧ＋ＡＯＭ＋αＧｒｅｍ１と比較。これらデータは、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおける抗Ｇｒｅｍ１抗体による細胞運命決定の正常化が、上皮幹／前駆細胞の促進を防ぎ、ＡＯＭ変異原性侵襲から上皮を保護することを示唆している。
実施例２１－Ｆｏｘｌ１、Ｗｎｔ５Ａ、及びＷｎｔ２Ｂの発現は、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１の間質においてアップレギュレートされ、この表現型は、抗Ｇｒｅｍ１抗体処理によって消失する（図３６～３８）
抗体処理及び未処理のＶｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ｎ＝４）における絨毛異所性陰窩におけるＷｎｔリガンドの発現源を調べるために、Ｓｈｏｓｈｋｅｓ－Ｃａｒｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載の通り、Ｆｏｘｌ１インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して上皮下テロサイト細胞を同定した。ＨＡＬＯ画像解析ソフトウェアを用いて、Ｆｏｘｌ１の発現レベルを定量した。絨毛間質でのＦｏｘｌ１発現は、未処理Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウスにおいて有意に増加した（ｐ＝０．００３７）（図３６及び図３８Ｃ）。抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理すると、Ｆｏｘｌ１発現レベルが回復し（ｐ値ＷＴ対抗体処理Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（ｐ＝０．４８６４）、このことは、間質のリモデリング及びＦｏｘｌ１細胞の動員が上皮Ｇｒｅｍ１依存的であることを示す。
どのメディエーターがＦｏｘｌ１＋細胞によって生成されたかを決定するために、マルチプレックスＩＳＨを使用して、絨毛上皮下線維芽細胞におけるＦｏｘｌ１及びＷｎｔ５Ａの発現の組み合わせを実証した（図３７を参照）。Ｓｈｏｓｈｋｅｓ－Ｃａｒｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載のテロサイトに類似した長い突起を有する薄い構造が、染色によってマークされた。
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１モデルにおける上皮でのＧｒｅｍ１発現は、その後Ｗｎｔリガンド５Ａ及び２Ｂを発現する絨毛間質細胞集団を活性化させる。抗Ｇｒｅｍ１抗体による処理は、間質細胞の活性化を防ぎ、Ｗｎｔリガンドの発現を消失させ（図３８Ａ及び３８Ｂ）、これは、間質のリモデリングが上皮Ｇｒｅｍ１依存的であることを示す。
方法
インサイチュハイブリダイゼーション
パラフィンブロックから、ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ）処理したＨ２Ｏを用いて切片（厚さ＝０．４μｍ）を作製し、切片を６０℃で２時間焼成した。組織を脱パラフィン化し、室温（ＲＴ）で１０分間、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＡＣＤ ３２２３３５）で処理した。１００℃でＲＮＡｓｃｏｐｅ １Ｘ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（１：１０ ＡＣＤ ３２２０００）を用いて１５分間抗原回復を実施した。ＨｙｂＥＺハイブリダイゼーションシステム（ＡＣＤ）を使用して４０℃で３０分間、サンプルをＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｐｌｕｓ（ＡＣＤ ３２２３３１）で処理した。プローブを４０℃で２時間インキュベートした。使用したプローブは以下の通りであった：ＬＧＲ４（ＡＣＤ ３１８３２１）、ＬＧＲ５（ＡＣＤ ３１２１７１）、ＦＺＤ５（ＡＣＤ ４０４９１１）、ＦＺＤ７（ＡＣＤ ５３４１０１）、ＷＮＴ２Ｂ（ＡＣＤ ４０５０３１）、ＷＮＴ５Ａ（ＡＣＤ ３１６７９１）、ＷＮＴ５Ａ－Ｃ３（ＡＣＤ、３１６７９１－Ｃ３）、及びＦＯＸＬ１（ＡＣＤ ４０７４０１）。ヘマトキシリン（茶色）又はＤＡＰＩ（蛍光）を使用してスライドを対比染色した。
ＩＳＨの定量
Ａｐｅｒｉｏ ＣＳ２ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２０倍の倍率でスライドをスキャンした。Ａｐｅｒｉｏ ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｌｉｄｅ Ｖｉｅｗｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、マウス１頭あたり１００本の絨毛をアノテーションした。ＨＡＬＯ画像解析プラットフォーム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＦｏｘｌ１発現レベルを定量し、面積当たりのＤＡＢ染色％として表した。条件間でＤＡＢレベルを比較するために、ボンフェローニ補正を適用した二元配置分散分析及び多重比較を使用した。＜０．０５のｐ値で差を有意であるとみなした。統計ソフトウェアＲを用いて解析を行った。
実施例２２－抗Ｇｒｅｍ１抗体は、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；Ａｐｃ Ｍｉｎ 処理マウスにおいて用量応答関係を示す（図３９）
Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１；ＡｐｃＭｉｎマウスにおいて２１日齢で開始して、週１５、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇの可変用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ）又は対照抗体（ＵＣＢ）を皮下注射で６週間にわたって隔週（ｂｉｗｅｅｋｌｙ）で投与し、その後、毎週投与した。カプランマイヤーデータ（図３９に提示）を作成するために、人道的エンドポイント（マウスが貧血、猫背、及び不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。抗Ｇｒｅｍ１で処理することにより、マウスの寿命は用量依存的に延長されたが、週３０ｍｇ／ｋｇを超える用量では更なる生存効果はみられなかった。
実施例２３－Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス及びＡｐｃ Ｍｉｎ マウスにおける抗Ｇｒｅｍ１抗体による早期及び後期の処理の比較（図４０）
４２日齢（早期処理）又は腸管ポリポーシス発症の１２０日後（後期処理）で開始して、週３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ）又は対照抗体（ＵＣＢ）を、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（図４０Ａ）及びＡｐｃＭｉｎマウス（図４０Ｂ）に皮下注射で投与した。
カプランマイヤーデータを作成するために、人道的エンドポイント（マウスが貧血、猫背、及び不活動を示す）に達した時点でマウスを殺処分した。両時点で開始した抗Ｇｒｅｍ１抗体処理によって、マウスの寿命が有意に延長された。具体的には、Ｖｉｌ１－Ｇｒｅｍ１マウス（図４０Ａ）については、抗Ｇｒｅｍ１抗体処理によって、ビヒクル群の中央生存期間（２４２日（ｎ＝１３））が有意に増加した：後期処理：５１９日；早期処理：５４０日。ＡｐｃＭｉｎマウス（図４０Ｂ）では、抗Ｇｒｅｍ１抗体で処理した結果、ビヒクル処理群の中央生存期間が１９２日から２６１日（後期処理群）及び４２４．５日（早期処理群）へと有意に延長された。
実施例２４－Ｇｒｅｍ１中和抗体の使用は、乳がんの前臨床モデルにおいて骨及び肺内の乳がん腫瘍の成長を有意に減少させる（図４１～４５）
新規抗Ｇｒｅｍ１中和モノクローナル抗体を用いて、２つの臨床的に関連のある乳がんの前臨床マウスモデルを用いて、乳がんの確立及び進行におけるＧｒｅｍ１のインビボにおける寄与について調べた。
方法
細胞培養
ＰｙＭＴ－Ｂ０１マウス由来の乳がん細胞は、Ｓｈｅｉｌａ Ｓｔｅｗａｒｔ教授（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）によって供与され、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞株は、Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｙｏｎｅｄａ博士（元Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）によって供与された。両細胞株ともＳＦＧ－ＮＥＳ－ＴＧＬベクターのレトロウイルス発現により生成されるルシフェラーゼを発現する（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，２００４．３１（５）：ｐ．７４０－５１。５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中でがん細胞を培養した。
動物
動物実験は、Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＡＨＭＲＩ）のＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって倫理番号ＳＡＭ３７３の下で承認された動物プロトコル手順に従って行われ、「Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ」で定められた指針に準拠する。
前臨床乳がんモデルにおけるＧｒｅｍ１抗体処理
ＰｙＭＴ－Ｂ０１：腫瘍細胞接種の１週間前に、３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体Ａｂ７３２６又はＩｇＧ対照Ａｂ１０１．４を、５週齢のＣ５７ＢＬ６免疫不全マウスに２回皮下（ｓ．ｃ）投与した。１×１０５個のルシフェラーゼを発現しているＰｙＭＴ－Ｂ０１マウス乳がん細胞を、尾動脈（ＣＡ）を介して全身に注射した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１：腫瘍細胞接種の１週間前に、３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体ＵＣＢ６１１４又はＩｇＧ対照ＡｂＡ３３を、５週齢のＮＯＤ／ＳＣｉＤ／ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）免疫不全マウスに２回皮下（ｓ．ｃ）投与した。１×１０５個のルシフェラーゼ発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞を、ＣＡを介して全身に注射した。
試験期間中、週２回の処理を継続した。１週間隔で、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンを腹腔内投与（ｉ．ｐ）し、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ生物発光イメージングシステムを用いて画像化し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて腫瘍負荷を定量した。動物倫理上の要求に従って、それぞれＰｙＭＴ－Ｂ０１モデル及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルについて腫瘍細胞注入後１３日目及び２２日目に試験を終了した。動物の淘汰時に器官を解剖し、腫瘍転移を分析するためにエクスビボでＢＬＩ画像化した。
結果
試験の終了時に、Ｇｒｅｍ１中和抗体Ａｂ７３２６で処理したＰｙＭＴ－Ｂ０１担がんマウスは、ＣＡを介して腫瘍を注入した場合、アイソタイプ対照Ａｂ１０１．４で処理したマウスと比較して、全身腫瘍負荷が３５％減少した（図４１）。このＢＬＩシグナルは主に後肢に集中しており、これは、このモデルに関連する広範囲の骨格腫瘍病変を示す。アイソタイプ対照と比較して、Ｇｒｅｍ１中和抗体で処理したマウスでは、肺転移腫瘍負荷の統計的に有意な減少も観察された（図４２Ａ）。Ｇｒｅｍ１中和抗体で処理したＰｙＭＴ－Ｂ０１担がんマウスでは、肝臓転移腫瘍負荷の減少傾向も観察された（図４２Ｂ）。
第２の試験の終了時（２２日目）に、ＡｂＡ３３で処理した対照群と比較して、Ｇｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）処理群では、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１担がんＮＳＧマウスの平均腫瘍負荷が低かった（図４３）。
また、抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ６１１４）で処理したマウスでは、肺転移の平均腫瘍負荷の減少も観察された（図４５）。これら結果は、Ｇｒｅｍ１中和抗体がＧｒｅｍ１を標的とすることで、骨及び肺内の乳がん腫瘍の成長が有意に減少することを示す。これら研究は、抗Ｇｒｅｍ１療法が転移性乳がんにおける好適な治療の選択肢となり得るという仮説を裏付ける。結論として、本発明者らは、インビボにおいてＧｒｅｍ１中和抗体がＧｒｅｍ１を標的とすることが、乳がんの骨格及び肺に転移した腫瘍の成長を減少させるための有効な治療ストラテジとなるという最初の証拠を提供する。
実施例２５－Ｇｒｅｍ１中和抗体の使用は、前立腺がんの前臨床モデルにおいて前立腺がんの腫瘍成長を減少させる（図４６及び４７）
新規抗Ｇｒｅｍ１中和モノクローナル抗体（ＵＣＢ６１１４）を用いて、前立腺がんの前臨床マウスモデルにおける前立腺がんの確立及び進行に対するＧｒｅｍ１のインビボにおける寄与について調べた。
方法
細胞培養
ＰＣ－３ヒト前立腺がん細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。細胞株は、ＳＦＧ－ＮＥＳ－ＴＧＬベクターのレトロウイルス発現により生成されるルシフェラーゼを発現する（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ． ２００４）。５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を補給したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中でがん細胞を培養した。
動物
動物実験は、Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＡＨＭＲＩ）のＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって倫理番号ＳＡＭ３７３の下で承認された動物プロトコル手順に従って行われ、「Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ」で定められた指針に準拠する。
前臨床前立腺がんモデルにおけるＧｒｅｍ１抗体処理
腫瘍細胞接種の１週間前に、３０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ｇｒｅｍ１抗体（ＵＣＢ６１１４）又はＩｇＧ対照ＡｂＡ３３を、５週齢のＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）免疫不全マウスに２回皮下（ｓ．ｃ）投与した。５×１０５個のルシフェラーゼ発現ＰＣ－３マウス前立腺がん細胞を、尾動脈（ＣＡ）を介して全身に注射した。
試験期間中、週２回の抗体処理を継続した。１週間隔で、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンを腹腔内（ｉ．ｐ）投与し、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ生物発光イメージングシステムを用いて画像化し、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて腫瘍負荷を定量した。各試験の最後に、動物の淘汰時に器官を解剖し、腫瘍転移を分析するためにエクスビボでＢＬＩ画像化した。
結果
ＰＣ－３前立腺がんモデルは、ＢＬＩによる骨格腫瘍負荷の証拠に加えて、７日目から有意な肝腫瘍負荷（前立腺がん転移の別の一般的な部位）を示した。アイソタイプ対照抗体（ＡｂＡ３３）で処理したマウスと比較して、Ｇｒｅｍ１中和抗体（ＵＣＢ６１１４）で処理したマウスでは、動物全体（図４６Ａ）及び肝臓（図４６Ｂ）の腫瘍負荷の有意な減少が観察された。Ｇｒｅｍ１中和抗体で処理したマウスでは、後肢（図４６Ｃ）及び肺（図４６Ｄ）の腫瘍負荷の減少傾向も観察された。
配列表
配列番号１（ヒトGremlin-1; Uniprot ID: O60565）
MSRTAYTVGALLLLLGTLLPAAEGKKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
配列番号２（N末端タグを有する結晶構造解析で使用したヒト切断型Gremlin-1）
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGSAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
配列番号３（Ab7326 HCDR1 Kabat及びChothiaの複合）
GYTFTDYYMH
配列番号４（Ab7326 HCDR1 Kabat）
DYYMH
配列番号５（Ab7326 HCDR2 Kabat）
LVDPEDGETIYAEKFQG
配列番号６（Ab7326 HCDR3 Kabat）
DARGSGSYYPNHFDY
配列番号７（Ab7326 LCDR1 Kabat）
KSSQSVLYSSNNKNYLA
配列番号８（Ab7326 LCDR2 Kabat）
WASTRES
配列番号９（Ab7326 LCDR3 Kabat）
QQYYDTPT
配列番号１０（Ab7326重鎖可変領域変異体1）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
配列番号１１（Ab7326軽鎖可変領域変異体1）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
配列番号１２（Ab7326重鎖可変領域変異体2）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSS
配列番号１３（Ab7326軽鎖可変領域変異体2）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIK
配列番号１４（マウス完全長IgG1重鎖変異体1）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号１５（マウス完全長IgG1軽鎖変異体1）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号１６（ヒト完全長IgG1重鎖変異体2）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１７（ヒト完全長IgG1軽鎖変異体2）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１８（Fab重鎖変異体1）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
配列番号１９（Fab軽鎖変異体1）
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配列番号２０（N末端タグを有する結晶構造解析で使用したヒト切断型Gremlin-1）
AMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
配列番号２１（アミノ酸1～21のシグナルペプチドが欠失している配列番号１の成熟Gremlin-1配列）
KKKGSQGAIPPPDKAQHNDSEQTQSPQQPGSRNRGRGQGRGTAMPGEEVLESSQEALHVTERKYLKRDWCKTQPLKQTIHEEGCNSRTIINRFCYGQCNSFYIPRHIRKEEGSFQSCSFCKPKKFTTMMVTLNCPELQPPTKKKRVTRVKQCRCISIDLD
配列番号２２（ヒトIgG4P重鎖変異体1）
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配列番号２３（ヒトIgG4P軽鎖変異体1）
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号２４（ヒトIgG1重鎖DNA変異体1）
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttcccgctcgctccatcatcgaagtctaccagcggaggcactgcggctctcggttgcctcgtgaaggactacttcccggagccggtgaccgtgtcgtggaacagcggagccctgaccagcggggtgcacacctttccggccgtcttgcagtcaagcggcctttactccctgtcatcagtggtgactgtcccgtccagctcattgggaacccaaacctacatctgcaatgtgaatcacaaacctagcaacaccaaggttgacaagaaagtcgagcccaaatcgtgtgacaagactcacacttgtccgccgtgcccggcacccgaactgctgggaggtcccagcgtctttctgttccctccaaagccgaaagacacgctgatgatctcccgcaccccggaggtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcacatgaggacccagaggtgaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaagtccacaatgccaaaactaagcccagagaagaacagtacaattcgacctaccgcgtcgtgtccgtgctcacggtgttgcatcaggattggctgaacgggaaggaatacaagtgcaaagtgtccaacaaggcgctgccggcaccgatcgagaaaactatctccaaagcgaagggacagcctagggaacctcaagtctacacgctgccaccatcacgggatgaactgactaagaatcaagtctcactgacttgtctggtgaaggggttttaccctagcgacattgccgtggagtgggaatccaacggccagccagagaacaactacaagactacccctccagtgctcgactcggatggatcgttcttcctttactcgaagctcaccgtggataagtcccggtggcagcagggaaacgtgttctcctgctcggtgatgcatgaagccctccataaccactatacccaaaagtcgctgtccctgtcgccgggaaag
配列番号２５（ヒトIgG1軽鎖DNA変異体1）
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
配列番号２６（ヒトIgG4P重鎖DNA変異体1）
caagtgcaactggtggaatccggggccgaagtgaaaaagcccggagccactgtgaagatctcttgcaaagtgtccggctacaccttcaccgactattacatgcactgggtccagcaggcacctgggaagggccttgagtggatgggtctggtcgatcccgaggacggcgaaactatctacgccgagaagttccagggtcgcgtcaccatcaccgccgacacttccaccgacaccgcgtacatggagctgtccagcttgaggtccgaggacacagccgtgtactactgcgccacggatgctcggggaagcggcagctactacccgaaccacttcgactactggggacagggcactctcgtgactgtctcgagcgcttctacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtcttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagcctgggcaag
配列番号２７（ヒトIgG4P軽鎖DNA変異体1）
gacattgtgatgacccagtcccccgattcgcttgcggtgtccctgggagaacgggccaccattaactgcaagagctcacagtccgtcctgtattcatcgaacaacaagaattacctcgcatggtatcagcagaagcctggacagcctcccaagctgctcatctactgggctagcacccgcgaatccggggtgccggatagattctccggatcgggttcgggcactgacttcactctgactatcaactcactgcaagccgaggatgtcgcggtgtacttctgtcagcagtactacgacaccccgacctttggacaaggcaccagactggagattaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc
配列番号２８（マウス完全長IgG1重鎖変異体2）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
配列番号２９（マウス完全長IgG1軽鎖変異体2）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
配列番号３０（ヒト完全長IgG1重鎖変異体1）
QVQLVESGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３１（ヒト完全長IgG1軽鎖変異体1）
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配列番号３２（Fab重鎖変異体2）
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配列番号３３（Fab軽鎖変異体2）
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配列番号３４（ヒトIgG4P重鎖変異体2）
QVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDARGSGSYYPNHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
配列番号３５（ヒトIgG4P軽鎖変異体2）
DIVMTQTPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYFCQQYYDTPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３６（ヒトGremlin-1;全配列）
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配列番号３７（ヒトGremlin-1;コード配列）
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Claims (14)

  1. 間質性ＧＲＥＭ１を過剰発現しているがんの治療又は予防剤であって、配列番号４／５／６／７／８／９若しくは配列番号３／５／６／７／８／９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３の配列組み合わせを含む抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体を含む、剤。
  2. （ａ）前記がんが、固形がんである、
    （ｂ）前記がんが、結腸直腸がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、肺がん、胃がん、十二指腸がん、食道がん、頭頸部がん、前立腺がん、神経膠腫、子宮内膜がん、肝臓がん、脾臓がん、骨常在がん、及び骨肉腫から選択され、任意で、
    （ｉ）前記がんは結腸直腸がんであり、さらに任意で、前記結腸直腸がんは間葉系サブタイプ結腸直腸がんである、
    （ｉｉ）前記がんは多発性骨髄腫である、又は
    （ｉｉｉ）前記がんは乳がんである、
    （ｃ）前記がんが、上皮ＧＲＥＭ１を過剰発現しており、任意で、前記がんはＧＲＥＭ１起始がんである、
    （ｄ）前記がんが、播種性がんである、並びに／或いは
    （ｅ）前記がんが、確立されたがんであり、任意で、前記確立されたがんが、確立された結腸直腸がんである、
    請求項１に記載の剤。
  3. 前記抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体が、配列番号１０若しくは１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／又は配列番号１１若しくは１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列、又はこれらと少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１又は２に記載の剤。
  4. （ａ）前記抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体が、配列番号１０／１１若しくは１２／１３又はこれらと少なくとも９５％同一である配列のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列対を含む、並びに／或いは
    （ｂ）前記抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体が、配列番号１４／１５、１６／１７、１８／１９、２２／２３、２８／２９、若しくは３０／３１、３２／３３、３４／３５の重鎖及び軽鎖対、又はこれらと少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項３に記載の剤。
  5. （ａ）前記抗体が、キメラ抗体、又はヒト抗体である、並びに／或いは
    （ｂ）前記抗体が、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の剤。
  6. 前記抗体が、薬学的に許容し得るアジュバント及び／又は担体を更に含む医薬組成物に含まれる、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。
  7. （ａ）前記剤が、追加の抗がん剤を別々、逐次、又は同時に投与することと組み合わせて使用され、前記追加の抗がん剤が５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、セツキシマブ、ニボルマブ、ベバシズマブ、抗ＣＤ３８抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＩＬ－６抗体、及びｉＭＩＤから選択される、並びに／或いは
    （ｂ）前記剤が、別々、逐次、又は同時に放射線療法を行うことと組み合わせて使用される、請求項１～６のいずれか一項に記載の剤。
  8. 抗ＣＤ３８抗体がダラツムマブ、抗ＳＬＡＭＦ７抗体がエロツズマブ、抗ＩＬ－６抗体がシルツキシマブ、及び／又はｉＭＩＤがイスレナリドミド／ポマレノミドである、請求項７に記載の剤。
  9. （ａ）前記がんが家族性がんである、及び／又は
    （ｂ）前記抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体が、がんに関連するポリポーシスを予防するために使用される、
    請求項１～８のいずれか一項に記載の剤。
  10. がん又はがんに関連するポリポーシスが、家族性腺腫様ポリポーシス（ＦＡＰ）又は遺伝性混合ポリポーシス症候群（ＨＭＰＳ）である、請求項９に記載の剤。
  11. 抗がん薬を含有する、間質性ＧＲＥＭ１を過剰発現しているがんの治療剤であって、請求項１及び３～５のいずれか一項に規定される抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体を別々、逐次、又は同時に投与することと組み合わせて使用され、前記抗がん薬が、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、セツキシマブ、ニボルマブ、ベバシズマブ、抗ＣＤ３８抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＩＬ－６抗体、及びｉＭＩＤから選択され、任意で、前記がんが、請求項２に規定されるものである、
    前記治療剤。
  12. 抗ＣＤ３８抗体がダラツムマブ、抗ＳＬＡＭＦ７抗体がエロツズマブ、抗ＩＬ－６抗体がシルツキシマブ、及び／又はｉＭＩＤがイスレナリドミド／ポマレノミドである、請求項１１に記載の剤。
  13. 請求項１及び３～５のいずれか一項に規定される抗Ｇｒｅｍｌｉｎ－１抗体及び追加の抗がん薬を含む、組成物又はキットであって、間質性ＧＲＥＭ１を過剰発現しているがんの治療又は予防用であり、前記追加の抗がん剤が５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、フォリン酸、セツキシマブ、ニボルマブ、ベバシズマブ、抗ＣＤ３８抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＩＬ－６抗体、及びｉＭＩＤから選択される、組成物又はキット。
  14. 抗ＣＤ３８抗体がダラツムマブ、抗ＳＬＡＭＦ７抗体がエロツズマブ、抗ＩＬ－６抗体がシルツキシマブ、及び／又はｉＭＩＤがイスレナリドミド／ポマレノミドである、請求項１３に記載の組成物又はキット。
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