JP7573760B2 - 長時間作用型グルカゴン誘導体 - Google Patents

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Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、長時間作用型グルカゴン誘導体に関する。
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）とは、生体内で発現されたプログルカゴン（Ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）が特定の組織内で加工されてなる低分子ペプチドであり、分子量は約３ｋＤａほどである。人体において、プログルカゴン分子の選択的切断により生成されるＧＬＰ－１の２種類の生物活性形式は、それぞれ、ＧＬＰ－１（７－３７）－ＯＨ及びＧＬＰ－１（７－３６）－ＮＨ２である。このうち、後者の３０個のアミノ酸形式が生体内で主要な部分を占め、その割合は８０％程度となる。ＧＬＰ－１の生理学的作用は、ランゲルハンス島β細胞の増殖及び再生刺激、ランゲルハンス島β細胞のアポトーシス阻害、インスリン分泌の促進、膵臓からのトリプシン及びエステラーゼの分泌抑制、グルカゴン分泌の抑制、胃腸の蠕動を弱め、胃排出を抑制することによる食欲低下や食物吸収の減少、及び心血管系の保護などとして表れる。よって、臨床では、２型糖尿病や肥満症の治療に適用可能である。ＧＬＰ－１は、インスリンと比較して低血糖症を招来するリスクが低い。
グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ，ＧＣＧと略称する）は、生体内で血糖を調整するホルモンとして、やはりプログルカゴンが組織内で加工されることにより形成される。分子量は約３ｋＤａほどであり、生物活性形式はＧＣＧ－（１－２９）ＯＨである。グルカゴンは、生体内で血糖を上昇させる唯一のホルモンとして、低血糖状況における血糖レベルの上昇、脂肪の分解促進、満腹感の増加に使用可能である。また、ＧＣＧと血糖降下系の薬物を併用することで、エネルギー消費を増加させ、体重を減少させることが可能となる（非特許文献１）。
グルコース依存性インスリン分泌性ペプチドは、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）とも称される生理学的インクレチンホルモンの一種であって、インスリン分泌を刺激し、胃酸分泌を抑制することで血糖を低下させる。
ＧＬＰ－１やＧＣＧ及びＧＩＰは、いずれもプログルカゴン（Ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）が処理及び加工されてなるため、配列に高い相同性が存在しており、インクレチン（ｉｎｃｒｅｔｉｎｓ）系ホルモンと総称される。また、ＧＣＧ配列を改変することで、ＧＬＰ－１又はＧＩＰの活性を強化する作用が得られるとの報告がある。例えば、特許文献１及び特許文献２では、改変によりＧＣＧ／ＧＬＰ－１両活性ハイブリッドペプチドを生成しており、特許文献３では、改変によりＧＣＧ／ＧＩＰ両活性ハイブリッドペプチドを生成している。また、特許文献４では、ＧＣＧの改変により、ＧＣＧ／ＧＬＰ－１／ＧＩＰ三活性ハイブリッドペプチドを取得したことに言及している。しかし、現在のところ、この種の両活性ないしは複数活性のハイブリッドペプチド薬物は上市が承認されていない。そのほか、現在研究されている両活性又は複数活性のハイブリッドペプチド系薬物はいずれも活性が極めて高い。しかし、周知のように、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストの副作用には、一般的に、吐き気、嘔吐、下痢、緊張、腹痛等があり、臨床患者が深刻な副作用のために臨床試験から離脱することすらある。よって、副作用が低く、治療効果が相応か、ひいてはより優れた製品を開発することには依然として深い意義がある。
国際公開第２０１１０７５３９３号 国際公開第２０１２１７７４４４号 国際公開第２０１３１９２１３０号 国際公開第２０１５０６７７１６号
Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９７：７２１-７６６，２０１７
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の課題を解決するために、長時間作用型グルカゴン誘導体を提供することである。
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の局面において、長時間作用型グルカゴン誘導体を提供する。
前記長時間作用型グルカゴン誘導体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示されたＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＸ１３Ｘ１４ＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）という配列を含み、Ｘ２は、Ａｉｂを表し、Ｘ１０は、Ｙ又は第１長時間作用型ベクターを架橋したＫを表し、Ｘ１３は、Ｙ又はＡｉｂを表し、Ｘ１４は、Ｌ又は第２長時間作用型ベクターを架橋したＫを表す。
本発明のいくつかの実施形態において、前記第１長時間作用型ベクター及び／又は第２長時間作用型ベクターは脂肪酸鎖である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記脂肪酸鎖の炭素鎖長は５～３０であり、好ましくは８～３０である。
及び／又は、前記脂肪酸鎖の化学構造式は次のいずれかで表される。
Figure 0007573760000001
各ｎは、それぞれが独立して３～２８であり、好ましくは、６～２８であり、より好ましくは、１７、１８又は１９である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記脂肪酸鎖はリンカーを介してＫに連結される。前記リンカーは、－Ａｂｕ－、－ＧＡＢＡ－、－ＥＡＣＡ－、－β－Ａｌａ－、－γＧｌｕ－、－Ｄ－γＧｌｕ－又はそのジペプチド、－β－Ａｌａ－β－Ａｌａ－、－γＧｌｕ－γＧｌｕ－及びその立体異性体形式、－５－Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ－、－８－Ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｙｌ－、－９－Ａｍｉｎｏｎｏｎａｎｏｙｌ－、－１０－Ａｍ
ｉｎｏｄｅｃａｎｏｙｌ－、－ＯＥＧ－、－２ｘＯＥＧ－、－γＧｌｕ－ＯＥＧ－、－γＧｌｕ－２ｘＯＥＧ－、－Ｄ－γＧｌｕ－２ｘＯＥＧ－、－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－、－γＧｌｕ－３ｘＯＥＧ－、－γＧｌｕ－８ｘＰＥＧ－、－γＧｌｕ－３ｘＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－８ｘＰＥＧ－のうちの１種類又は複数種類の組み合わせから選択される。
本発明のいくつかの実施形態において、Ｘ１３はＹを表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
及び／又は、Ｘ１３はＡｉｂを表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
及び／又は、Ｘ１３はＡｉｂを表し、Ｘ１０はＹを表し、Ｘ１４は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記長時間作用型グルカゴン誘導体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６～８のいずれかに示す配列を含む。
本発明は、第２の局面において、上述した長時間作用型グルカゴン誘導体の調製方法を提供する。当該方法は、固相合成法により前記長時間作用型グルカゴン誘導体を生成することを含む。
本発明は、第３の局面において、上記長時間作用型グルカゴン誘導体の、薬物の調製における使用を提供する。好ましくは、前記薬物は代謝性疾患を治療するための薬物である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記代謝性疾患は、糖尿病、肥満、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病に関連するその他のメタボリックシンドローム、高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール、インスリン抵抗性、肥満症又は耐糖能異常から選択される。
本発明は、第４の局面において、治療有効量の上記長時間作用型グルカゴン誘導体を含む薬物組成物を提供する。
図１は、本発明の実施例２におけるＰ１３Ｆの質量分析結果の概略図を示す。 図２は、本発明の実施例３におけるＰ１６Ｆの質量分析結果の概略図を示す。 図３は、本発明の実施例４におけるＰ２９Ｆの質量分析結果の概略図を示す。 図４は、本発明の実施例５におけるインビトロでのグルカゴン誘導体のｈＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の結果の概略図を示す。 図５は、本発明の実施例５におけるインビトロでのグルカゴン誘導体のｈＧＩＰＲアゴニスト活性の結果の概略図を示す。 図６は、本発明の実施例５におけるインビトロでのグルカゴン誘導体のｈＧＣＧＲアゴニスト活性の結果の概略図を示す。 図７は、本発明の実施例６のＩＰＧＴＴテストにおけるＩＣＲマウスの血糖変動に対するグルカゴン誘導体の影響の概略図を示す。 図８は、本発明の実施例６における血糖変動のＡＵＣ結果の概略図を示す。 図９は、本発明の実施例７におけるグルカゴン誘導体がｄｂ／ｄｂマウス体内に存在する場合の随時血糖変動の結果の概略図を示す。 図１０は、本発明の実施例８におけるグルカゴン誘導体がＤＩＯマウス体内に存在する場合の体重変動の結果の概略図を示す。
本発明における発明の目的、技術方案及び有益な技術的効果をより明瞭にするために、以下に、実施例を組み合わせて本発明につき更に詳細に説明する。本技術を熟知する者は、本明細書で開示する内容から本願の発明におけるその他の利点及び効果を容易に理解可能である。
本発明の発明者は、膨大な実践研究の結果、新たな長時間作用型グルカゴン誘導体を提供する。当該長時間作用型グルカゴン誘導体は、潜在的に良好なインビボ臨床活性を有し、動物実験では、被験体の血糖レベルを有効にコントロール可能であったほか、被験体の体重を明らかに減少させられたため、薬物の調製に適用可能である。よって、これに基づき本発明を完成させた。
本発明は、第１の局面において、長時間作用型グルカゴン誘導体を提供する。前記長時間作用型グルカゴン誘導体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示されたＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＸ１３Ｘ１４ＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）という配列を含み、Ｘ２は、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸基）を表し、Ｘ１０は、Ｙ又は第１長時間作用型ベクターを架橋したＫを表し、Ｘ１３は、Ｙ又はＡｉｂを表し、Ｘ１４は、Ｌ又は第２長時間作用型ベクターを架橋したＫを表す。
２－アミノイソ酪酸基の化学構造式は以下で表すことができる。
Figure 0007573760000002
本発明で提供する長時間作用型グルカゴン誘導体は、通常、グルカゴン類似体（ＧＣＧ類似体）を適切に修飾（例えば、長時間作用型ベクターを架橋）して調製することで得られる。これらのＧＣＧ類似体は、天然型ＧＣＧと、天然型ＧＣＧ配列をベースにアミノ酸の突然変異、添加又は欠失等を実施することで得られるＧＣＧ突然変異体を含み得る。本発明の具体的実施例において、ＧＣＧ類似体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３～５のいずれかで示される配列を含み得る。ＧＣＧ類似体のＣ末端のアミノ酸は修飾可能であり、例えばアミド化してもよい。通常、アミド化とは、Ｃ末端の－ＣＯＯＨ基を－ＣＯＮＨ２基に変換することを意味する。
Figure 0007573760000003
本発明で提供する長時間作用型グルカゴン誘導体において、第１長時間作用型ベクター及び／又は第２長時間作用型ベクターは脂肪酸鎖とすることができる。通常、脂肪酸鎖とは、炭素、水素、酸素の３種類の元素からなる基の一種である。脂肪酸鎖には一定の長さの炭素鎖が備わっている。例えば、炭素鎖長は、５～３０、５～６、６～８、８～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５又は２５～３０であり、好ましくは８～３０である。本発明の具体的実施例において、脂肪酸鎖の化学構造式は、次のいずれかで表すことができる。
Figure 0007573760000004
本発明の別の具体的実施例において、各ｎは、それぞれが独立して３～２８である。
本発明の別の具体的実施例において、各ｎは、それぞれが独立して６～２８である。
本発明の別の具体的実施例において、各ｎは、それぞれが独立して１７～１９であり、例えば、１７、１８、１９である。
本発明で提供する長時間作用型グルカゴン誘導体において、第１長時間作用型ベクターは、第２長時間作用型ベクターと同時に存在してもよいし、単独で存在してもよい。通常、長時間作用型ベクターは、リンカーを介してアミノ酸残基（例えば、Ｋ）に連結されるため、－Ｌｉｎｋｅｒ－Ａと表すことができる。このうち、Ｌｉｎｋｅｒはリンカーであり、Ａは長時間作用型ベクターである。本発明の具体的実施例において、リンカーは、－Ａ
ｂｕ－（－Ｌ－２－アミノブタノイル－）、－ＧＡＢＡ－（－γ－アミノブタノイル－）、－ＥＡＣＡ－（－ε－アミノカプロイル－）、－β－Ａｌａ－（－β－アラニル－）、－γＧｌｕ－（－γ－グルタミル）、－Ｄ－γＧｌｕ－（－Ｄ－γ－グルタミル－）又はそのジペプチド、例えば、－β－Ａｌａ－β－Ａｌａ－、－γＧｌｕ－γＧｌｕ－及びその立体異性体形式（Ｓ及びＲエナンチオマー）、－５－Ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ－（－５－アミノペンタノイル－）、－８－Ａｍｉｎｏｏｃｔａｎｏｙｌ－（－ω－アミノオクタノイル－）、－９－Ａｍｉｎｏｎｏｎａｎｏｙｌ－（－９－アミノノナノイル－）、－１０－Ａｍｉｎｏｄｅｃａｎｏｙｌ－（－１０－アミノデカノイル－）、－ＯＥＧ－（２－（２－（－２－アミノエトキシ）エトキシ）アセチル－）、－２ｘＯＥＧ－、－γＧｌｕ－ＯＥＧ－、－γＧｌｕ－２ｘＯＥＧ－、－Ｄ－γＧｌｕ－２ｘＯＥＧ－、－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－、－γＧｌｕ－３ｘＯＥＧ－、－γＧｌｕ－８ｘＰＥＧ－（－３－（（γ－グルタミン）－８ｘポリエチレングリコール）－プロピオニル－）、－γＧｌｕ－３ｘＯＥＧ－γ－Ｇｌｕ－８ｘＰＥＧ－、のうちの１種類又は複数種類の組み合わせから選択可能である。
本発明の別の具体的実施例において、リンカーの化学構造式は、次のいずれかで表すことができる。
Figure 0007573760000005
本発明の具体的実施例において、Ｘ１３はＹを表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
本発明の具体的実施例において、Ｘ１３はＡｉｂを表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
本発明の具体的実施例において、Ｘ１３はＡｉｂを表し、Ｘ１０はＹを表し、Ｘ１４は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは－２ｘＯＥＧ－γＧｌｕ－である。
本発明の具体的実施例において、長時間作用型グルカゴン誘導体のアミノ酸配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．６～８のいずれかに示す配列を含む。
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＫ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ） ＳＫＹＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２ Ｘ２＝Ａｉｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＫ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ） ＳＫＸ１３ＬＤ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２ Ｘ２＝Ａｉｂ Ｘ１３＝Ａｉｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
ＨＸ２ＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＸ１３Ｋ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ）Ｄ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２ Ｘ２＝Ａｉｂ Ｘ１３＝Ａｉｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
本発明は、第２の局面において、本発明の第１の局面で提供した長時間作用型グルカゴン誘導体の調製方法を提供する。当該方法は、固相合成法により前記長時間作用型グルカゴン誘導体を生成することを含み得る。例えば、グルカゴン誘導体は、固相化学合成法によりワンステップで調製してもよい。即ち、まず、脂肪酸鎖を架橋したアミノ酸を生成してから（例えば、リシンＫに脂肪酸鎖を架橋する）、固相化学合成過程でこのアミノ酸をポリペプチド鎖に直接連結する。
上述した長時間作用型グルカゴン誘導体の調製方法は、以下を含んでもよい。即ち、適切な条件で適切な宿主細胞を培養し、当該宿主細胞に上記のグルカゴン類似体を発現させて、分離、精製することによりグルカゴン類似体を取得する。次に、化学架橋によりグルカゴン類似体に脂肪酸鎖を連結して、上記の長時間作用型グルカゴン誘導体を提供する。例えば、宿主細胞は、通常、上記のグルカゴン類似体をコードするポリヌクレオチドを含有する構造体を含むか、ゲノム中に上記グルカゴン類似体をコードする外来のポリヌクレオチドが統合されている。
本発明は、第３の局面において、本発明の第１の局面で提供した長時間作用型グルカゴン誘導体の、薬物の調製における使用を提供する。本発明で提供する長時間作用型グルカゴン誘導体は、インビトロの細胞学的活性実験では明らかな優位性を示さなかったが（例えば、高いＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲ又はＧＣＧＲ活性等を有さなかった）、インビボ実験では、被験体（例えば、疾病モデル（例えば、ｄｂ／ｄｂマウス）又は正常モデル）の血糖レベルを有効に低下させることができ、更には、被験体の体重を著しく減少させることも可能であったため、薬物の調製に適用可能であった。
本発明で提供する使用において、上記の薬物は、代謝性疾患を治療するための薬物の使用に使用可能である。通常、上記の代謝性疾患は、インスリン分泌異常に関連する疾患とすることができる。或いは、例えば、代謝性疾患は、糖尿病、肥満、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病に関連するその他のメタボリックシンドローム、高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール、インスリン抵抗性、肥満症又は耐糖能異常から選択可能である。
本発明は、第４の局面において、治療有効量の上記長時間作用型グルカゴン誘導体を含む薬物組成物を提供する。上記の薬物組成物は、更に、薬学的に許容可能なベクターを含んでもよい。これらのベクターは、各種の賦形剤及び希釈剤を含み得るが、通常、これらのベクター自体は必須の活性成分ではなく、且つ、投与後に過度の毒性を有さない。適切な
ベクターとは、当業者が熟知するものとし、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．，１９９１）から、薬学的に許容可能なベクターについての十分な検討を得ることができる。
本発明では、上記の薬物又は組成物等において、上記の長時間作用型グルカゴン誘導体を単一の有効成分としてもよいし、その他の活性成分と組み合わせて使用してもよい。
本発明は、第５の局面において、治療方法を提供する。当該治療方法は、個体に対し、治療有効量の本発明の第１の局面で提供した長時間作用型グルカゴン誘導体、又は本発明の第４の局面で提供した組成物を投与することを含む。本発明で提供する治療方法は、代謝性疾患等の治療に適用可能である。
本発明において、「個体」には、通常、ヒト、ヒト以外の霊長類、哺乳動物（例えば、犬、猫、馬、羊、豚、牛）等が含まれる。「個体」は、上記の薬物、組成物、製剤、試薬キット又は配合剤を用いて治療することで利益を獲得可能である。
本発明において、「治療有効量」とは、通常、適切な投与期間を経たあと、上記で列挙した疾患を治療又は緩和する効果を達成可能な用量を意味する。
本発明で提供する長時間作用型グルカゴン誘導体は、低いＧＬＰ－１Ｒ及びＧＩＰＲアゴニスト活性と、微弱なＧＣＧＲアゴニスト活性を有するが、動物実験では、類似の脂肪酸で修飾されたＧＬＰ－１Ｒ単一アゴニストであるセマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）（Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１５、５８（１８）：７３７０－８０）と比較して、マウス体内における耐糖能及び体重減少活性がいずれも強く、且つ、より長時間にわたり持続可能であった。よって、良好な産業化の可能性を有している。
以下に、実施例によって本願の発明につき更に説明するが、これにより本願の範囲は制限されない。
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、調製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術については、既存の文献で十分に説明されている。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等を参照すればよい。
実施例で言及する略語の意味は、具体的に次の通りである。
ＲＴ：室温
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ：９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチル基
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＢＬＫ：２０％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドピペリジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ａｉｂ：２－アミノイソ酪酸
ＴＦＥＡ：２，２，２－トリフルオロエタノール
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル基
－ＯＥＧ－：－２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）アセチル－
－γＥ－：－γ－グルタミル－
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
実施例で言及する商業的に取引される各アミノ酸及びアミノ酸断片、及び商業的に取引される各樹脂のメーカー及び商品型番は下記の通りである。
Ｆｍｏｃ保護基アミノ酸原料、２－ＣＴＣ樹脂及び王樹脂（Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ）は、いずれも一般的な市販試薬である（保護アミノ酸メーカー：成都鄭源生化科技有限公司、樹脂メーカー：天津南開和成科技有限公司）。
有機溶媒及びその他の原料の入手元は、いずれも市販品である（メーカー：シノファーム化学試剤有限公司。化学的純品）。
そのほか、ＨＰＬＣ及び質量分析法の条件、使用する機器の型番及びメーカーの説明は下記の通りである。
計器：ＨＰＬＣ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００（サーモフィッシャー社）、検出条件は表２に示す通りとした。
Figure 0007573760000006
分取液体：北京創新通恒、ＬＣ３０００。
質量分析法：計器型番は５８００ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ（エービー・サイエックス社）、分析ソフトはＴＯＦ／ＴＯＦ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒとした。また、ＭＳには、Ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅパラメータとして、ＣＩＤ（ＯＦＦ）、ｍａｓｓｒａｎｇ（７００－６５００Ｄａ）Ｆｏｃｕｓ Ｍａｓｓ（１２００Ｄａ）Ｆｉｘｅｄ ｌａｓｅｒ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（５６００）Ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ：ＢｉｎＳｉｚｅ（０．５ｎｓ）を使用した。
分枝鎖を有する保護アミノ酸Ｗ２の合成
Ａｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（（Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｄｉｏｉｃ Ａｃｉｄ ｍｏｎｏ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ）－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ）－ＯＥＧ－ＯＥＧ）－ＯＨの構造は次の通りである。
Figure 0007573760000007
Ｗ２の合成：
置換度が１．０ｍｍｏｌ／ｇの２－ＣＴＣ樹脂（天津南開和成科技有限公司、製品番号Ｇ５５Ｗ０５０９）を２０ｇ計量し、固相反応カラムに投入して、ＤＭＦで１回洗浄した。ＤＭＦで樹脂を３０分間膨潤させたあと、８．５３ｇのＡｌｌｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ（２０ｍｍｏｌ）を取り、ＤＭＦで溶解した。続いて、氷水浴しつつ、７．５ｍｌのＤＩＥＡ（４５ｍｍｏｌ）を加えて活性化させてから、これを上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入した。そして、２時間反応させたあと、３０ｍｌのメタノールを加えて１時間ブロッキングし、ＤＭＦで３回洗浄した。次に、ＤＭＦ：ピペリジンの体積比が４：１の混合溶液を用いてＦｍｏｃの保護を解除してから、ＤＭＦで６回洗浄した。次に、１５．４２ｇの［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸と、５．４１ｇのＨＯＢｔを計量し、ＤＭＦに加えて溶解させた。そして、氷水浴しつつ、６
．２ｍｌのＤＩＣを加えて活性化させたあと、上記の樹脂が充填されている反応カラムに投入し、室温下で２時間反応させた。上記のＦｍｏｃの保護解除及び対応材料を加えてカップリングするステップを繰り返し、分枝鎖断片の順序に従って、［２－［２－（Ｆｍｏｃ－アミノ）エトキシ］エトキシ］酢酸、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、オクタデカン二酸モノ－ｔｅｒｔ－ブチルを順に完成させた。カップリングの完了後、樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、ＭｅＯＨで５回洗浄してから乾燥させた。次に、樹脂を４００ｍｌのＴＦＥＡ／ＤＣＭ＝１：４に加え、室温で４ｈ反応させた。そして、樹脂を濾過したあと、濾液からＤＣＭを遠心除去し、５００ｍｌのＭＴＢＥに加えて沈降させた。これを遠心乾燥して目標とする化合物を２０．１２ｇ取得した。
グルカゴン誘導体－Ｐ１３Ｆの調製：
グルカゴン誘導体Ｐ１３Ｆの構造式は下記の通りである。
Figure 0007573760000008
 即ち、ＨＡｉｂＱＧＴ ＦＴＳＤ Ｋ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ）ＳＫＹＬ Ｄ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
ペプチド樹脂の合成：
置換度が０．３５ｍｍｏｌ／ｇのＲｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（天津南開和成科技有限公司、ＧＲＭＳ１２１７）を２．８５ｇ計量し、固相反応カラムに投入して、２０ｍＬのＤＣＭで３０分間膨潤させたあと、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。洗浄の完了後、反応カラムに１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加え、５分間反応させてから吸引濾過した。そして、２０ｍＬのＤＭＦで１回洗浄したあと、１０ｍＬのＤＢＬＫ溶液（２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｖ／Ｖ））を加えて１０分間反応させたところ、カイザーテストで陽性となった。これを吸引濾過し、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。また、上記とは別に、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（１．９１ｇ、５．０ｅｑ）、ＨＯＢｔ（０．８１ｇ、６．０ｅｑ）を計量し、１０ｍＬのＤＭＦに投入して溶解した。続いて、５～８℃下でＤＩＣ（０．６９ｇ、５．５ｅｑ）を加えて５ｍｉｎ活性化させたあと、反応カラムに投入して１時間反応させた。そして、カイザーテストで陰性となり、完全に反応してから、ＤＭＦで３回（毎回２０ｍＬ）洗浄した。上記の保護及びカップリング操作を繰り返し、ポリペプチドのアミノ酸配列に従ってその他のアミノ酸のカップリングを順次完了した。Ｘ１０にはＷ２を用いてカップリングを行うとともに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を用いてＡｌｌｏｃ基を除去した。最後のアミノ酸のカップリングが完了したあと、上記の保護方法で保護し、完全に保護されてから、順に、ＤＭＦ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回、ＤＣＭ洗浄を２回、ＭｅＯＨ洗浄を２回行った。なお、洗浄溶媒は毎回２０ｍＬとした。そして、材料を回収し、常温で減圧乾燥させて目標のペプチド樹脂を取得した。
粗ペプチドの切断：
上記のペプチド樹脂を４．９３ｇ計量し、２０～３０℃で６０ｍＬの破砕液（トリフルオロ酢酸：チオアニソール：アニソール：エタンジチオール＝９０：５：３：２）にゆっくりと加え、更に２時間反応させた。反応完了後、樹脂を濾過により除去した。そして、激
しく攪拌しながら、濾液を事前に冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（６００ｍＬ）に投入し、取得した混合溶液を冷蔵庫に投入して２時間沈降させた。その後、上清液を除去し、予め冷却しておいたメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて５回（毎回４００ｍＬ）遠心分離洗浄した。完了後に材料を回収し、常温で減圧乾燥させて粗ペプチド２．３７ｇ取得した。
粗ペプチドの精製：
分取液体（北京創新通恒、ＬＣ３０００）を使用して、複数のステップで粗ペプチドを精製した。
第１ステップ：固定相をＣ１８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－４０／６０－Ｃ１８－ＲＰＳ）とし、移動相を０．１％ＴＦＡ、アセトニトリルとした。
第２ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を０．５％リン酸、アセトニトリルとした。
第３ステップ：固定相をＣ８（ダイソーゲル：ｓｐ－１２０－１０－Ｃ８－Ｐ）とし、移動相を５０ｍＭの酢酸アンモニウム、０．３％酢酸、アセトニトリルとした。
最後に、凍結乾燥させて（凍結乾燥機：北京博医康社、ＦＤ－２Ａ）、精製ペプチド（９７．１％）を取得した。質量分析法Ｍｓの検出結果ｍ／ｚ ４８０６．７９５７（Ｍ＋Ｈ）＋は図１に示す通りとなった。
グルカゴン誘導体－Ｐ１６Ｆの調製：
グルカゴン誘導体Ｐ１６Ｆの構造式は下記の通りである。
Figure 0007573760000009
 即ち、ＨＡｉｂＱＧＴ ＦＴＳＤ Ｋ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ）
ＳＫＡｉｂＬ Ｄ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
ポリペプチドの合成では、Ｐ１３Ｆと同様に、Ｘ１０にＷ２を用いてカップリングを行うとともに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を用いてＡｌｌｏｃ基を除去した。取得した粗ペプチドはＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、精製ペプチド（９５．３％）を取得した。ＭＳの検出結果ｍ／ｚ ４７２８．６１２９（Ｍ＋Ｈ）＋は図２に示す通りとなった。
グルカゴン誘導体－Ｐ２９Ｆの調製：
グルカゴン誘導体Ｐ２９Ｆの構造式は下記の通りである。
Figure 0007573760000010
 即ち、ＨＡｉｂＱＧＴ ＦＴＳＤＹ ＳＫＡｉｂ Ｋ（２ｘＯＥＧ－γＥ－ＣＯＣ１８Ｈ３６ＣＯＯＨ）Ｄ ＳＱＡＡＱ ＤＦＶＱＷ ＬＬＡＧＧ ＰＳＳＧＡ ＰＰＰＳ－ＮＨ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
ポリペプチドの合成では、Ｐ１３Ｆと同様に、Ｘ１４にＷ２を用いてカップリングを行うとともに、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を用いてＡｌｌｏｃ基を除去した。取得した粗ペプチドはＲＰ－ＨＰＬＣで精製し、精製ペプチド（９６．０％）を取得した。ＭＳの検出結果ｍ／ｚ ４７７８．５９６３（Ｍ＋Ｈ）＋は図３に示す通りとなった。
インビトロの細胞学的活性測定：
（一）ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の測定：
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の測定には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｗ Ｄａｙほか：Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ；５（１０）７４９－５７）。ヒト由来ＧＬＰ－１Ｒ遺伝子（ＮＭ＿００２０６２．５）を哺乳動物細胞発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１Ｒを作製した。また、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）全長遺伝子（ＸＭ＿０３１４７３１９７．１）をｐＣＲＥプラスミドにクローニングし、ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ組換えプラスミドを取得した。次に、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１ＲとｐＣＲＥ－Ｌｕｃプラスミドをモル比１：１０の比率でＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションし、安定トランスフェクション発現株をスクリーニングした。
９－ｃｍの細胞培養シャーレ内で、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を培養した。そして、コンフルエンシーが９０％程度となった時点で培養上清を捨て、２ｍｌのパンクレアチンを加えて３ｍｉｎ消化したあと、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて中和し、１５ｍｌの遠沈管に移した。これを１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離したあと上清を捨て、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて再懸濁し、カウントした。続いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を１×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μｌ（即ち、１×１０４／ウェル）でプレーティングした。これにより、単層培養したあと、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換して培養した。そして、９６ウェルマイクロプレートにプレーティングした細胞から上清を捨てたあと、精製した組換えタンパク質（Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ、Ｐ２９Ｆ）、或いは、対照ポリペプチドタンパク質：ＧＬＰ－１（ＧＬＵＣ－０１４、中▲太▼生化有限公司）、ＧＩＰ（ＧＩＰＳ－００１、中▲太▼生化有限公司）又はＧＣＧ（ＧＬＵＣ－００４、中▲太▼生化有限公司）を、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一連の指定濃度まで希釈してから、細胞培養ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、６ｈ刺激したあと測定した。測定は、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、Ｅ２６２０）の説明書に従って行った。各サンプルの活性測定は３回繰り返した。
（二）ＧＩＰＲアゴニスト活性の測定方法：
ＧＩＰＲアゴニスト活性の測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＩＰＲ遺伝子（ＮＭ＿０００１６４）を哺乳動物細胞発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＩＰＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１細胞へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニング、作製については上記と同様とした。各サンプルの活性測定は３回繰り返した。
（三）ＧＣＧＲアゴニスト活性の測定方法：
ＧＣＧＲアゴニスト活性の測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＣＧＲ遺伝子（ＮＭ＿０００１６０）を哺乳動物細胞発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＣＧＲを作製した。ＣＨＯ－Ｋ１へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株のスクリーニング、作製については上記と同様とした。各サンプルの活性測定は３回繰り返した。
細胞の活性測定結果は図４～図６に示す通りとなった。また、対応するＥＣ５０の結果は表３に示す通りであった。
結果について：Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及びＰ２９Ｆは、いずれも低いＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性（天然型ＧＬＰ－１ペプチドの約１～３％）及びＧＩＰＲアゴニスト活性（天然型ＧＩＰペプチドの約０．５～２％）を有しており、ＧＣＧＲアゴニスト活性についてはほぼ存在しなかった。なお、Ｐ２９のＧＩＰＲアゴニスト活性は相対的に最も高く、ＧＩＰの約２％であった。
Figure 0007573760000011
正常ＩＣＲマウス体内におけるＩＰＧＴＴ実験：
検疫適応期間の終了後、動物を約１０ｈ絶食させ、尾端から採血して空腹時血糖を測定した。その後、２０％グルコース（２ｇ／ｋｇ）を腹腔注射し、注射から０．５ｈ後に血糖を測定した。次に、血糖上昇量に基づき動物を選別し、糖負荷後の血糖上昇量が平均血糖上昇量から大きく外れていた動物を除去した。これにより、４０匹の動物を選別して正式な実験に投入した。
各群が８匹のＩＣＲマウスからなるよう、体重に基づき均等に５群とし、ケージを分けて適応のために２日間飼育してから、正式な実験を開始した。絶食から１０時間後（Ｔ＝０ｈ）に皮下投与を行った。なお、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ、Ｐ２９Ｆ及び陽性対照であるセマグルチドの投与量はいずれも１０ｎｍｏｌ／ｋｇとした。また、陰性対照には生理食塩水ＰＢＳを注射した（５μｌ／ｇ体重）。続いて、２時間後（Ｔ＝２ｈ）に、腹腔内に２０％グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）の注射を開始した。そして、異なるタイミングで、即ち、グルコースの注射前と、グルコースを注射してから３０分後、６０分後及び１２０分後（Ｔ＝２．５ｈ、３ｈ、４ｈ）に血糖を測定したところ、結果は図７、図８に示す通りとなった。図から明らかなように、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及びＰ２９Ｆによる血糖降下及び血糖コントロールは、セマグルチド（ノボノルディスク社、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）よりも優れていた。
投与後のｄｂ／ｄｂマウスの随時血糖測定：
主に、体重、非空腹時血糖、投与前ＯＧＴＴ反応という３つの指標に従って、レプチン受容体欠失２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスを選別し、均等に群分けした。各群は８匹とし、大きすぎる個体又は小さすぎる個体は除外した。また、非空腹時血糖は１５ｍＭよりも大きいこととした。Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及びＰ２９Ｆは、５％ソルビトール及び０．０２％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－８０を含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。そして、陰性対照である生理食塩水ＰＢＳ又はグルカゴン誘導体を皮下注射した。グルカゴン誘導体については、段階別に異なる投与量で投与することとし、投与量は５．０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日（３０日）とした。且つ、正常マウスを対照群として加え、陰性対照である生理食塩水ＰＢＳを皮下注射した（５μｌ／ｇ体重）。そして、０～４日目まで全ての動物の随時血糖を毎日モニタリングしてから、６日目に測定を行い、その後は４日に１度随時血糖を測定した。測定日は、６日目、１０日目、１４日目、１８日目、２２日目、２６日目とし、その後は、２８日目、２９日目、３０日目の血糖含有量を測定した。随時血糖の変化傾向は図９に示す通りとなった。
結果から明らかなように、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及びＰ２９Ｆでは、２２日目あたりに正常マウスの血糖レベルまで低下が見られ、且つ３０日目までこれを維持可能であった。
食事誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重減少実験：
ＤＩＯマウスモデルの作製：約７週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂質飼料（６０％ｋｃａｌ ｆｒｏｍ ｆａｔ）を与えて約１６週間飼育を続け（合計２３週間）、体重が約４５ｇとなった時点で実験を行った。ＤＩＯマウスはランダムに群分けし、各群を６匹とした。また、基礎体重に差はなく、毎日計量した。そして、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ、Ｐ２９Ｆ、陽性対照であるセマグルチド又は陰性対照である生理食塩水ＰＢＳを皮下注射した。Ｐ２９Ｆの投与量は３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日及び１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日とし、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及び陽性対照であるセマグルチドについては３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日とした。まず、投与日から体重の計測を開始し、実験が終了するＤａｙ３０まで継続した。また、食物摂取の記録と計量を毎日行い、維持した。結果は図１０に示す通りであった。
結果から明らかなように、Ｐ１３Ｆ、Ｐ１６Ｆ及Ｐ２９Ｆでは、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日で投与した場合に、全ての投与群の体重減少効果がセマグルチド群よりも明らかに優れていた。また、全ての投与群は、２０日目あたりに体重減少が最大値に達し、且つ、薬効を３０日目あたりまで維持可能であった。そのほか、Ｐ２９Ｆで見ると、体重減少には投与量依存性があり、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／４日の投与量で投与した場合、３０日目あたりの体重減少比率が３０％近くに達した。このことは、本発明のグルカゴン誘導体は決して高いＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲ又はＧＣＧＲアゴニスト活性を有してはいないものの、生体内での薬効は非常に明らかなことを示している。特に、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性は胃腸の副作用との関連性が高いため、活性が非常に低いとの特性は本発明の潜在的な優位
性となる。この点は、従来の前臨床又は臨床中の候補とされている高活性マルチアゴニストと全く異なっている。
以上で述べたように、本発明は従来技術における様々な欠点を解消しており、高度な産業上の利用価値を有している。
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、当業者が本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく完成させるあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (10)

  1. アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示されたＨＸ２ＱＧＴＦＴＳＤＸ１０ＳＫＸ１３Ｘ１４ＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２という配列を含み、
    Ｘ２は、２－アミノイソ酪酸基を表し、
    Ｘ１０は、Ｙ又は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、
    Ｘ１３は、Ｙ又は２－アミノイソ酪酸基を表し、
    Ｘ１４は、Ｌ又は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、
    前記脂肪酸鎖の化学構造式は下記のいずれかで表され、
    Figure 0007573760000012
     各ｎは、それぞれが独立して３～２８である、長時間作用型グルカゴン誘導体。
  2. 前記各ｎは、それぞれが独立して１７、１８又は１９であることを特徴とする請求項１に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体。
  3. 前記脂肪酸鎖はリンカーを介してＫに連結され、前記リンカーは、－Ｄ－γＧｌｕ－のジペプチド、－γＧｌｕ－γＧｌｕ－の立体異性体（Ｓ及びＲのエナンチオマー）、又は
    下記
    Figure 0007573760000013
     のうちの１種類又は複数種類の組み合わせから選択されることを特徴とする請求項１に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体。
  4. Ｘ１３はＹを表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは
    Figure 0007573760000014
     であり、
    又は、Ｘ１３は２－アミノイソ酪酸基を表し、Ｘ１４はＬを表し、Ｘ１０は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは
    Figure 0007573760000015
     であり、
    又は、Ｘ１３は２－アミノイソ酪酸基を表し、Ｘ１０はＹを表し、Ｘ１４は脂肪酸鎖を架橋したＫを表し、リンカーは
    Figure 0007573760000016
     であることを特徴とする請求項１に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体。
  5. 前記長時間作用型グルカゴン誘導体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６～８のいずれかに示す配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体の調製方法であって、
    固相合成法により前記長時間作用型グルカゴン誘導体を生成することを含む方法。
  7. 請求項１～５のいずれか１項に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体の、薬物の調製における使用。
  8. 請求項１～５のいずれか１項に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体の、代謝性疾患を治療するための薬物の調製における使用。
  9. 前記代謝性疾患は、糖尿病、肥満、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病に関連するその他のメタボリックシンドローム、高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロール、インスリン抵抗性、肥満症又は耐糖能異常から選択されることを特徴とする請求項８に記載の使用。
  10. 治療有効量の請求項１～５のいずれか１項に記載の長時間作用型グルカゴン誘導体を含む薬物組成物。
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