JP7577191B2 - フェニルアルキルカルバマート化合物を含むｋｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、フェニルアルキルカルバマート化合物を含むＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物に関し、より詳細に説明すると、従来嗜眠症治療剤に使用されているソリアムフェトール（ｓｏｌｒｉａｍｆｅｔｏｌ）、すなわち２－アミノ－３－フェニルプロピルカルバマートに代表されるフェニルアルキルカルバマート化合物を有効成分として含み、細胞膜でＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現を抑制することによって、Ｋ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患、例えば、線維化疾患、自己免疫疾患およびがん疾患を治療する用途に使用できる医薬組成物に関する。

人体内でＫ_Ｃａ３．１チャネルは、非興奮性細胞（ｎｏｎ－ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）の線維芽細胞、肝星細胞、血管内皮細胞、神経細胞、がん細胞、免疫細胞（Ｔ ｃｅｌｌｓ、Ｂ ｃｅｌｌｓ）などに分布している。一般的に、Ｋ^＋チャネルは、膜電圧の過分極を通じてＣａ^２＋の細胞内流入を増加させて細胞を活性化させる役割をする。ところで、Ｃａ^２＋は、二次メッセンジャー（ｓｅｃｏｎｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）あるいは細胞内の様々な酵素のｃｏ－ｆａｃｔｏｒとして作用し、細胞内シグナル伝達過程に非常に重要な役割をする。したがって、Ｋ_Ｃａ３．１チャネルが活性化して細胞内Ｃａ^２＋が増加すると、細胞増殖、上皮間葉移行（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）、あるいは酸化窒素のような物質の生産および分泌などが促進される。

筋線維芽細胞（あるいは活性化した肝星細胞）の形成は、線維化過程で最も重要な段階であり、上皮間葉移行などを通じて起こる。筋線維芽細胞が形成され、肝星細胞が活性化すると、このような細胞の増殖が活発に起こり、この細胞で細胞外基質の形成が起こり、線維化が活発に行われる。血管内皮細胞あるいは上皮細胞などから筋線維芽細胞が形成される上皮間葉移行は、Ｃａ^２＋依存的な過程であることが知られている。線維化誘発因子であるＴＧＦ_βによる上皮間葉移行は、特にＣａ^２＋に敏感であることが知られている。Ｋ_Ｃａ３．１チャネルは、筋線維芽細胞と肝星細胞などで細胞内Ｃａ^２＋を調節して上皮間葉移行を調節する。

Ｋ_Ｃａ３．１チャネルが活性化すると、このようなＫ^＋チャネルが発現する細胞によって異なる反応が起こる。免疫細胞を介して免疫細胞の増殖とサイトカインの分泌などを通じて炎症および免疫反応を増加させる。血管内皮細胞を介して血管新生を促進し、酸化窒素の分泌を通じて血管弛緩を誘発させる。また、線維芽細胞および肝星細胞を介して線維化疾患を誘発する。すなわち、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を生成したり肝星細胞を活性化させ、コラーゲンなど細胞外基質の生成などを誘発して結合組織（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）の形成に寄与する。また、一部のがん細胞の増殖および転移にも重要な役割をする。したがって、Ｋ_Ｃａ３．１チャネルは、炎症および自己免疫疾患、線維化疾患およびがん疾患の進行に非常に重要な役割をすると推定することができる。

サイトカインとＨ_２Ｏ_２のような炎症誘発因子（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）は、免疫細胞の増殖など免疫および炎症反応を増幅させ、ＴＧＦ_βとＰＤＧＦのような成長因子を含む線維化誘発因子（ｐｒｏ－ｆｉｂｒｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）は、線維化反応を増幅させる。ところで、このような炎症誘発因子と線維化誘発因子は、Ｋ_Ｃａ３．１チャネルの発現を増加させる。すなわち、炎症誘発因子と線維化誘発因子による炎症および免疫反応、および線維化反応を増幅させる過程にＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現増加が重要な役割をする。

このようにＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現が増加すると、線維化疾患とがん疾患など増殖性疾患、自己免疫疾患など炎症性疾患などの進行が促進される。したがって、このような疾患をＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患と規定することができる。近年、Ｋ_Ｃａ３．１チャネル抑制薬物を用いて炎症および自己免疫疾患、線維化疾患およびがん疾患治療剤を開発しようとする努力が続いて試みられている。このような努力の一環として、代表的なＫ_Ｃａ３．１抑制剤であるセニカポク（ｓｅｎｉｃａｐｏｃ）は、鎌状赤血球貧血症（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ）を含む各種炎症および自己免疫疾患、線維化疾患治療剤として開発中にある。

本発明者らは、梨花女子大学校の産学協力団の米国特許ＵＳ９，２５９，４１２Ｂ２（特許文献１）およびそのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国登録特許第１０－１４１４８３１号において、従来嗜眠症（ｎａｒｃｏｌｅｐｓｙ）治療剤に使用されているモダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）およびその誘導体を有効成分として含むＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患の治療または予防用組成物を提示している。ここで、Ｋ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患としては、鎌状赤血球貧血症、急性免疫反応または自己免疫疾患を含む免疫疾患、前立腺がんまたはすい臓がんを含むがん疾患、トラウマ脳損傷、退行性神経疾患および分泌性下痢などが例示されている。

なお、ソリアムフェトール（ｓｏｌｒｉａｍｆｅｔｏｌ）、すなわち２－アミノ－３－フェニルプロピルカルバマート（２－ａｍｉｎｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ）は、嗜眠症治療剤であり、韓国ＳＫ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより「スノシ（Ｓｕｎｏｓｉ）」という製品名で開発、販売されている。これと関連して、ＳＫ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの米国特許ＵＳ５，９５５，４９９Ｂ２（特許文献２）およびＵＳ ６，１４０，５３２Ｂ２（特許文献３）とこれらのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国登録特許第１０－１９７８９２号および第１０－１７３８６３号には、ソリアムフェトールおよびその誘導体が中枢神経系治療剤、特に抗うつ剤および抗不安剤として有用であると報告されている。

また、米国特許ＵＳ９，４６４，０４１Ｂ２（特許文献４）およびそのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国公開特許第１０－２０１９－１０５６７５号には、ソリアムフェトールおよびその誘導体を使用してうつ病、がん、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、慢性疲労、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、慢性痛、外傷性脳損傷、ＡＩＤＳ、および骨関節炎などの疾患によって伴う疲労を治療または予防する方法が開示されており、米国特許ＵＳ１０，３５１，５１７Ｂ２（特許文献５）およびそのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国登録特許第１０－１３３５９４１号には、日中の過剰な眠気（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｄａｙｔｉｍｅ ｓｌｅｅｐｉｎｅｓｓ）および病的睡眠（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｍｎｏｌｅｎｃｅ）を含む睡眠覚醒障害を治療する方法が開示されている。

米国特許第９，２５９，４１２号明細書（韓国登録特許第１０－１４１４８３１号） 米国特許第５，９５５，４９９号明細書（韓国登録特許第１０－１９７８９２号） 米国特許第６，１４０，５３２号明細書（韓国登録特許第１０－１７３８６３号） 米国特許第９，４６４，０４１号明細書（韓国公開特許第１０－２０１９－１０５６７５） 米国特許第１０，３５１，５１７号明細書（韓国登録特許第１０－１３３５９４１号）

本発明者らは、Ｋ^＋チャネルを抑制する物質を用いてＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患を治療する方法について研究しているところ、 驚くべきことに、従来嗜眠症治療剤に使用されているソリアムフェトールを含むフェニルアルキルカルバマート化合物がＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現を抑制することができるという可能性を把握し、多様な実験を通じてこのような可能性を事実として立証することによって、本発明を完成するに至った。

これより、本発明の目的は、前記フェニルアルキルカルバマート化合物を有効成分として含む新しいＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物を提供することにある。

本発明によるＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物は、下記［構造式１］で表されるフェニルアルキルカルバマート化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする。

上記［構造式１］中、Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミン、ニトロ、硫化水素、メチル、メチルハロゲン、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、ビニル、アリールの中から選ばれた１個または２個の官能基であり、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ水素、メチル、エチル、プロピル、アミドの中から選ばれた１個の官能基であり、＊表示は、キラル中心を意味する。

また、本発明によるＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物は、上記［構造式１］中、Ｒ２とＲ３が水素である化合物を含むことを特徴とする。

また、本発明によるＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物は、上記［構造式１］中、Ｒ１が水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉの中から選ばれた１個または２個の官能基である化合物を含むことを特徴とする。

また、本発明によるＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患治療用組成物は、上記［構造式１］中、Ｒ１が１個または２個のＦであり、Ｒ２とＲ３は、それぞれ水素、メチル、アミドの中から選ばれた１個の官能基である化合物を含むことを特徴とする。

また、上記［構造式１］で表される化合物は、Ｒ－異性体またはＳ－異性体の含有量が９０％以上のキラル化合物であることを特徴とする。

また、上記［構造式１］で表される化合物は、
２－アミノ－３－フェニルプロピルカルバマート；
２－アミノ－３－（３－フルオロフェニル）プロピルカルバマート；
２－アミノ－３－（３，４－ジクロロフェニル）プロピルカルバマート；
２－アミノ－３－フェニルプロピルメチルカルバマート；
２－アミノ－３－フェニルプロピル（アミノカルボニル）カルバマート；
２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピルカルバマート；
２－アミノ－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］プロピルカルバマートの中から選ばれたいずれか１つであることを特徴とする。

また、前記Ｋ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患は、肝線維化および肺線維化を含む線維化疾患、自己免疫疾患、およびがん疾患であることを特徴とする。

本発明による上記構造式１化合物は、線維芽細胞を対象とする生体外実験でＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現を抑制する効果とともに、炎症および線維化を抑制する効果があり、さらに、肝疾患が誘発されたマウスモデルに対する生体内実験でも炎症および線維化を抑制する効果があることが確認された。

したがって、上記構造式１化合物は、人体内で発生するＫ_Ｃａ３．１チャネル介在性疾患である各種炎症および自己免疫疾患、線維化疾患、およびがん疾患の治療のための新しい医薬組成物に有用に使用でき、必要によっては、動物用薬品として開発されることもできることが期待される。

本発明の構造式２化合物が線維芽細胞においてＫ_Ｃａ３．１電流に及ぼす効果を示す図である。 本発明の構造式３～８化合物が線維芽細胞においてＫ_Ｃａ３．１電流に及ぼす効果を示す図である。 炎症を誘発するＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）に２４時間露出させた線維芽細胞において本発明の構造式２～８化合物が炎症マーカーの発現に及ぼす効果を示す図である。 線維化を誘発するＴＧＦ_βに２４時間露出させた線維芽細胞において本発明の構造式２～８化合物が線維化マーカーの発現に及ぼす効果を示す図である。 ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）により肺線維化が誘発されたマウスモデルにおいて本発明による構造式２化合物の線維化抑制効果をコラーゲンに対するＭａｓｓｏｎ’ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色で確認した結果を示す図である。 ブレオマイシンにより肺線維化が誘発されたマウスモデルにおいて本発明による構造式２化合物が線維化マーカーであるｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示す図である。 ＣＤＡＨＦＤ給餌により肝線維化が誘発されたマウスモデルにおいて本発明による構造式２化合物の線維化抑制効果をコラーゲンに対するＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色で確認した結果を示す図である。 ＣＤＡＨＦＤ給餌により肝線維化が誘発されたマウスモデルにおいて本発明による構造式２化合物が線維化マーカーであるｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を示す図である。

本発明による上記構造式１のフェニルアルキルカルバマート化合物は、具体的には、次の構造式２～構造式８化合物を含む。

上記構造式２～構造式８化合物の化学名と本発明者が付与したコード名は、次のとおりである。

上記構造式２化合物は、ソリアムフェトール（ｓｏｌｒｉａｍｆｅｔｏｌ）という一般名で知られており、現在嗜眠症治療剤に使用されている。上記構造式３化合物の製造方法は、米国特許ＵＳ６，１４０，５３２Ｂ２およびＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国登録特許第１０－１７３８６３号に公知にされており、上記構造式４化合物は、米国公開特許ＵＳ２００５／００８０２６８Ａ１に記載された方法によって製造することができる。

上記構造式５化合物の製造方法は、米国特許ＵＳ５，７０５，６４０Ｂ２に公知にされており、上記構造式６化合物の製造方法は、米国特許ＵＳ９，４０３，７６１Ｂ２またはそのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国公開特許第１０－２０１６－０１２６９８８号に公知にされており、上記構造式７化合物は、米国特許ＵＳ６，１４０，５３２Ｂ２の［実施例９］および国際公開特許ＷＯ９８／１５５２６の［実施例９］に記載された方法によって製造することができる。

上記構造式８化合物は、バイエルが出願した米国特許ＵＳ９，１８０，１２０Ｂ２またはそのＦａｍｉｌｙ ｐａｔｅｎｔである韓国公開特許第１０－２０１３－０１３８２１６号の［実施例４８Ａ］に記載された方法によって製造することができる。

参考として、前記バイエル特許には、上記構造式８化合物が肝硬変などに使用できると記載されている。しかしながら、前記バイエル特許では、上記構造式８化合物がＶ１ａ、Ｖ２受容体拮抗剤として抗利尿ホルモンであるバソプレシン作用を抑制することで、心不全治療、腎臓、血流力学効果を通じて心血管障害を含む肝硬変などを治療することを目的としている。

一方、本発明では、上記構造式８化合物がＫ_Ｃａ３．１チャネルの発現を抑制することで、線維化発生の直接的な原因を解決することを目的としているので、本発明は、前記バイエル特許によって付随的に得られる肝硬変治療とは明らかな差異があると言える。

本発明による薬学的組成物は、上記構造式１化合物の薬学的に許容可能な塩を含む。ここで、「薬学的に許容可能な塩」というのは、通常、金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが含まれ得る。

また、本発明による薬学的組成物は、上記構造式１化合物の溶媒和物および水和物を全部含み、ラセミ体と可能なすべての立体異性体も含み、また、各化合物の結晶形態または非結晶形態を含んでもよい。

本発明による薬学的組成物は、通常の方法によって錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾル、滅菌注射溶液などの形態に剤形化することができる。また、使用目的によって経口投与したり非経口投与することができ、非経口投与時に皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射の注入方式を選択することができる。

本発明による薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によって変わることができる。好ましい一日投与量は、有効成分を基準として０．２～２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．５～１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に１回～２回投与することができるが、これに制限されない。

以下、本発明によるフェニルアルキルカルバマート化合物の薬理効果を説明する。

１）実験方法
１－１）線維芽細胞の培養
ダルベッコ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で線維芽細胞（ＣＲＬ－２７９５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＡ）を培養した。すべての細胞は、５％二酸化炭素湿式条件で３７℃に維持した。このように培養した線維芽細胞は、炎症誘発物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）と、線維化誘発因子であるＴＧＦ_β、および本発明の構造式２～８化合物（以下、ＳＦ－２～ＳＦ－８化合物という）にそれぞれ２４時間露出させた後、抗炎症および抗線維化効果の試験を行った。

１－２）肺線維化マウスモデルの構築
本発明によるＳＦ－２化合物の線維化抑制効果を確認するために、次のような実験を実施した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（オリエンタルバイオ社から購入）を６～８匹ずつ３グループに分類して、それぞれ疾患誘発群と薬物投与群および正常対照群として使用した。各グループ別の試験対象マウスを次のように処理した。

（１）疾患誘発群；試験対象マウスの気道内にブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）１．５ｕｎｉｔを注入し、肺線維化を誘発した。次に、下記薬物投与群に投与したＳＦ－２化合物と同量の蒸留水を週５回腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）した。添付の図面においてＢＬＭ（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）は、このような疾患誘発群を意味する。

（２）薬物投与群；試験対象マウスの気道内にブレオマイシン１．５ｕｎｉｔを注入し、次に、本発明のＳＦ－２化合物を週５回腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）した。添付の図面においてＢＬＭ＋ＳＦ－２は、このような薬物投与群を意味する。

（３）正常対照群；前記疾患誘発群に注入したブレオマイシンの量と同量の蒸留水を気道内に注入した。次に、前記薬物投与群に投与したＳＦ－２化合物と同量の蒸留水を週５回腹腔内注射した。添付の図面においてＣあるいはＣｏｎｔｒｏｌは、このような正常対照群を意味する。

各グループ別のマウスモデルを前記のような方法で４週間薬物処理を行った後、過量の麻酔剤を投与して即死させた後、肺を摘出し、次の試験に使用した。

１－３）脂肪性肝疾患マウスモデルの構築
本発明のＳＦ－２化合物が肝炎症および線維化に及ぼす治療効果を確認するために、次の実験を実施した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（オリエンタルバイオ社から購入）をそれぞれ６～８匹ずつ３グループに分類して、疾患誘発群と薬物投与群および正常対照群として使用した。各グループ別の試験対象マウスを次のように処理した。

（１）疾患誘発群；試験対象マウスをＣＤＡＨＦＤ給餌（ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ，Ｌ－ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ－ｄｅｆｉｎｅｄ，ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ｗｉｔｈ ０．１％ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．Ａ０６０７１３０２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）で飼育し、脂肪性肝疾患および線維化を誘発した。次に、ゾンデ（オラルチューブ）を用いて下記薬物投与群に投与したＳＦ－２化合物と同量の蒸留水を週５回投与した。添付の図面においてＣＤＡＨＦＤは、このような疾患誘発群を意味する。

（２）薬物投与群；試験対象マウスを前記ＣＤＡＨＦＤ給餌とともに本発明のＳＦ－２化合物を週５回投与（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）した。添付の図面においてＣＤＡＨＦＤ＋ＳＦ－２は、このような薬物投与群を意味する。

（３）正常対照群；試験対象マウスを正常な給餌で飼育した。次に、ゾンデ（オラルチューブ）を用いて前記薬物投与群に投与したＳＦ－２化合物と同量の蒸留水を週５回投与した。添付の図面においてＣあるいはＣｏｎｔｒｏｌは、このような正常対照群を意味する。

各グループ別のマウスモデルを前記のような方法で１６週間薬物処理した後、過量の麻酔剤を投与して即死させた後、肝を摘出し、次の試験に使用した。

１－４）肺および肝組織のパラフィン組織標本の製作および形態学的変化の観察
前記マウスモデルから摘出した肺および肝組織をパラホルムアルデヒド溶液で固定させ、１～２ｍｍの厚さに切断した。切断した組織をパラフィンに包埋し、４μｍの厚さに切ってキシレンでパラフィンを除去した後、エタノールでキシレンを除去し、水道水で洗浄して、パラフィン組織標本を製作した。

前記肺および肝組織で線維化マーカーであるコラーゲンに対する組織免疫学的染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法で実施した。

１－５）リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）分析
前記マウスモデルから摘出した肺および肝組織で炎症あるいは線維化因子のｍＲＮＡ発現程度をリアルタイム重合酵素連鎖反応で測定した。前記組織のＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で分離し、ＢｃａＢＥＳＴ重合酵素（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ）を使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、重合酵素連鎖反応を行った。

この際、使用した炎症誘発サイトカインおよび線維化マーカーのプライマー配列（配列番号１～３０）は、下記表２および表３の通りである。

１－６）電気生理学的分析
分離培養した単一線維芽細胞で細胞膜を介した電流（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）をパッチクランプ法（ｐａｃｈ－ｃｌａｍｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で測定した。全細胞電圧固定（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ）細胞で微細ガラス電極を通じて－１００ｍＶから＋１００ｍＶまでの電圧ランプ（ｖｏｌｔａｇｅ ｒａｍｐ）を加え、発生する電流を増幅器（ＥＰＣ－１０，ＨＥＫＡ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で増幅した後、１～４ｋＨｚの標本抽出率で記録した。

標準外用液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４（ＮａＯＨで滴定）を含み、微細ガラス電極（ピペット）溶液は、４０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｋ－ａｓｐａｒｔａｔｅ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２（ＫＯＨで滴定）を含む。ピペット溶液中、自由Ｃａ^２＋濃度は、５ｍＭ ＥＧＴＡ存在下に適当量のＣａ^２＋を加えて、１μＭに調節した（ＣａＢｕｆで計算；Ｇ．Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。

Ｋ_Ｃａ３．１電流は、次のような方法で分離した。全細胞電圧固定された細胞にガラス電極を通じて１μＭ Ｃａ^２＋を注入し、Ｋ_Ｃａ３．１電流を活性化させる１－エチル－２－ベンゾイミダゾリノン（１－ｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ；１－ＥＢＩＯ、１００μＭ）を加えて記録した電流においてＫ_Ｃａ３．１チャネル抑制剤であるＴＲＡＭ－３４（１０μＭ）により抑制される電流をＫ_Ｃａ３．１電流と判定し、記録された電流は、細胞静電容量で割って標準化した。

１－７）統計的分析
実験結果は、平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で表現した。統計的な分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで行い、有意レベル０．０５以下を有意差があるものと判定した。

２）培養細胞を用いた実験結果
２－１）Ｋ_Ｃａ３．１電流に及ぼすＳＦ－２化合物の効果

添付の図１は、前記線維芽細胞でＫ_Ｃａ３．１チャネル電流に及ぼすＳＦ－２化合物の効果を示す図である。細胞内Ｃａ^２＋と１－ＥＢＩＯによって活性化したＫ_Ｃａ３．１電流は、ＳＦ－２によって濃度依存的に抑制された。

Ｋ_Ｃａ３．１電流の大きさは、ＳＦ－２化合物に露出させない細胞において３７．４９±１．５１ｐＡ／ｐＦ、およびＳＦ－２化合物１０、３０、１００、３００、１０００ｎＭに露出させた細胞においてそれぞれ２６．６５±１．８９ｍＶ／ｐＦ、１１．６９±１．６６ｍＶ／ｐＦ、７．１２±１．３３ｍＶ／ｐＦ、１．８７±０．２４ｍＶ／ｐＦ、１．９５±０．４４ｍＶ／ｐＦであって、Ｋ_Ｃａ３．１電流が有意に減少した。

２－２）Ｋ_Ｃａ３．１電流に及ぼすＳＦ－３～ＳＦ－８化合物の効果
添付の図２は、前記線維芽細胞においてＫ_Ｃａ３．１チャネル電流に及ぼすＳＦ－３～ＳＦ－８化合物の効果を示す図である。細胞内Ｃａ^２＋と１－ＥＢＩＯによって活性化したＫ_Ｃａ３．１電流は、ＳＦ－３～ＳＦ－８化合物によって濃度依存的に抑制された。

２－３）ＳＦ－３～ＳＦ－８化合物による炎症抑制効果
添付の図３は、前記線維芽細胞においてＬＰＳによって誘発された炎症に対するＳＦ－２～ＳＦ－８化合物の抑制効果を示す図である。ＬＰＳによる炎症誘発効果は、炎症マーカーのｍＲＮＡ発現程度で判定した。前記線維芽細胞をＬＰＳ（１０ｕｇ／ｍｌ）に２４時間露出させると、炎症マーカーであるＩＬ６などのｍＲＮＡ量が増加した。

また、線維芽細胞をＬＰＳとともにＳＦ－２～ＳＦ－８化合物中の１つに２４時間露出させると、炎症マーカーのｍＲＮＡの発現程度が減少した。添付の図３では、試験結果は、平均±ＳＥで表記し、ｎ＝６～８、＃＃＜０．０１（正常対照群ｖｓ．疾患誘発群）、＊＊＜０．０１（疾患誘発群ｖｓ．薬物投与群）を意味する。

２－４）ＳＦ－３～ＳＦ－８化合物による線維化抑制効果
添付の図４は、線維芽細胞においてＴＧＦ_βによって誘発された線維化に対するＳＦ－２～ＳＦ－８化合物の線維化抑制効果を示す図である。ここで、ＴＧＦ_βによる線維化誘発効果は、線維化マーカーのｍＲＮＡ発現程度で判定した。前記線維芽細胞をＴＧＦ_β（１０ｎｇ／ｍｌ）に２４時間露出させると、線維化マーカーであるα－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）、ｃｏｌｌａｇｅｎ １α（Ｃｏｌ１α）、ｃｏｌｌａｇｅｎ ３α（Ｃｏｌ３α）ｍＲＮＡ量が増加した。

また、線維芽細胞をＴＧＦ_βとともにＳＦ－２～ＳＦ－８化合物中の１つに２４時間露出させると、線維化マーカーの発現程度が減少した。添付の図４において試験結果は、平均±ＳＥで表記し、ｎ＝６、＃＃＜０．０１（正常対照群ｖｓ．疾患誘発群）、＊＊＜０．０１（疾患誘発群ｖｓ．薬物投与群）を意味する。

３）肺疾患マウスモデルに対するＳＦ－２化合物の効果
３－１）組織学的あるいは免疫組織学的分析結果
前記マウスモデルから摘出した肺組織でパラフィン組織標本を製作し、線維化マーカーであるコラーゲンに対する組織免疫学的染色を施行した。添付の図５は、前記肺組織のＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色結果を示す図であり、正常対照群（Ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（ＢＬＭ）において線維化程度が増加し、薬物投与群（ＢＬＭ＋ＳＦ－２）では、線維化程度が減少したことが確認された。

したがって、本発明のＳＦ－２化合物は、肺線維化を抑制する効能があることを確認することができる。添付の図５において、「ＢＬＭ」は、ブレオマイシン１．５ｕｎｉｔｓ処理による疾患誘発群、「ＢＬＭ＋ＳＦ－２」は、ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ１．５ｕｎｉｔとともにＳＦ－２化合物１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙまたは１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを投与した薬物投与群を意味する。

３－２）線維化マーカーｍＲＮＡ発現に対する分析結果
前記マウスモデルでＳＦ－２化合物が線維化マーカーであるｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を確認するために、線維化マーカーであるＣｏｌ１α（ｃｏｌｌａｇｅｎ １α）、Ｃｏｌ３α（ｃｏｌｌａｇｅｎ ３α）、α－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）に対するＲＴ－ＰＣＲを行った。

図６から分かるように、正常対照群（Ｃ）に比べて疾患誘発群（ＢＬＭ）の肺組織においてＣｏｌ１α、Ｃｏｌ３α、α－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルが大きく増加し、線維化が進行されたことが分かった。しかしながら、薬物投与群（ＢＬＭ＋ＳＦ－２）では、Ｃｏｌ１α、Ｃｏｌ３α、α－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルが大きく減少して線維化が抑制されることを確認した。このような結果は、本発明のＳＦ－２化合物が肺線維化を抑制する効果があることを示唆する。図６で、試験結果は、平均±ＳＥで表記し、ｎ＝６、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１を意味する。

４）肝疾患マウスモデルに対する実験結果
４－１）組織学的あるいは免疫組織学的分析
添付の図７は、前記肝組織のコラーゲン繊維に対するＭａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色結果を示す図であり、正常対照群（Ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ）の肝組織は、まだ線維化が進行されない健康な状態であるのに対し、疾患誘発群（ＣＤＡＨＦＤ）の肝組織は、青色で染色されていて、線維化が進行していることを確認した。ところで、前記疾患誘発群にＳＦ－２化合物を投与した薬物投与群（ＣＤＡＨＦＤ＋ＳＦ－２）の肝組織では、青色で染色された程度が大きく減少し、線維化が大きく抑制されることが観察された。

４－２）線維化マーカーｍＲＮＡ発現に対する分析結果
前記マウスモデルでＳＦ－２化合物が線維化マーカーｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を確認するために、線維化マーカーであるＣｏｌ１α（ｃｏｌｌａｇｅｎ １α）、Ｃｏｌ３α（ｃｏｌｌａｇｅｎ ３α）、α－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）に対してＲＴ－ＰＣＲを行った。

図８から分かるように、正常対照群（Ｃ）に比べて疾患誘発群（ＣＤＡＨＦＤ）の肺組織においてＣｏｌ１α、Ｃｏｌ３α、α－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルが大きく増加し、線維化が進行されたことが示された。しかしながら、薬物投与群（ＣＤＡＨＦＤ＋ＳＦ－２）では、Ｃｏｌ１α、Ｃｏｌ３α、α－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現レベルが大きく減少し、線維化が抑制されることを確認した。

このような結果は、本発明のＳＦ－２化合物が肝線維化を抑制する効果があることを示唆する。図８で、試験結果は、平均±ＳＥで表記し、ｎ＝６、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１を意味する。

５）実験結果の評価
以上のような実験結果から、本発明の構造式２化合物、すなわちソリアムフェトールは、ブレオマイシンにより肺線維化が誘発されたマウスモデルおよびＣＤＡＨＦＤ給餌により肝線維化が誘発されたマウスモデルにおいてそれぞれ線維化抑制効能があることが確認された。

また、本発明の構造式２～８化合物は、ＬＰＳにより炎症が誘発された線維芽細胞およびＴＧＦ_βにより線維化が誘発された線維芽細胞においてそれぞれ炎症と線維化を抑制する効能があることが確認された。このような結果は、本発明の構造式２～８化合物は、Ｋ_Ｃａ３．１チャネルの発現を抑制する効果があることを意味する。

なお、背景技術で前述したように、Ｋ_Ｃａ３．１チャネルは、炎症および線維化疾患以外に自己免疫疾患およびがん疾患の進行にも非常に重要な役割をする。それで、全世界の様々な研究グループあるいは製薬会社がＴＲＡＭ－３４、セニカポク（ｓｅｎｉｃａｐｏｃ）などＫ_Ｃａ３．１チャネル抑制剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いて自己免疫疾患、炎症および線維化疾患、がん疾患治療剤を開発している。

このようにＫ_Ｃａ３．１チャネルを抑制する場合、炎症および線維化疾患だけでなく、自己免疫疾患およびがん疾患の進行を抑制することができ、したがって、本発明の構造式２～８化合物は、自己免疫疾患およびがん疾患の治療にも効能があるという結論が十分に可能である。

なお、本発明では、現実的な限界によって上記構造式１化合物に属するすべての化合物について前述のような実験を実施しなかったが、化学的活性と生体内における代謝メカニズムなどを考慮してみると、上記構造式１化合物は、いずれも、上記構造式２～８化合物と類似の薬理学的効能を有することが推測される。

Claims (7)

1. 下記［構造式１］で表されるフェニルアルキルカルバマート化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする、線維化抑制用組成物。
   上記［構造式１］中、
   Ｒ１は、１個または２個存在し、かつ、水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉの中から選ばれ、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ１個存在し、かつ、それぞれ、水素、メチル、エチル、プロピル、アミノカルボニルの中から選ばれ、＊表示は、キラル中心を意味する。
2. 上記［構造式１］中、Ｒ２とＲ３が水素であることを特徴とする請求項１に記載の線維化抑制用組成物。
3. 上記［構造式１］中、Ｒ１は、１個または２個のＦであり、Ｒ２とＲ３は、それぞれ１個存在し、かつ、それぞれ、水素、メチル、アミノカルボニルの中から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の線維化抑制用組成物。
4. 上記［構造式１］で表される化合物は、Ｒ－異性体またはＳ－異性体の含有量が９０％以上のキラル化合物であることを特徴とする請求項１に記載の線維化抑制用組成物。
5. ２－アミノ－３－フェニルプロピルカルバマート；
   ２－アミノ－３－（３－フルオロフェニル）プロピルカルバマート；
   ２－アミノ－３－（３，４－ジクロロフェニル）プロピルカルバマート；
   ２－アミノ－３－フェニルプロピルメチルカルバマート；
   ２－アミノ－３－フェニルプロピル（アミノカルボニル）カルバマート；
   ２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピルカルバマート；
   ２－アミノ－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］プロピルカルバマートの中から選ばれたいずれか１つを含むことを特徴とする線維化抑制用組成物。
6. 上記［構造式１］で表される化合物は、
   （Ｒ）－２－アミノ－３－フェニルプロピルカルバマートヒドロクロリドであることを特徴とする請求項１に記載の線維化抑制用組成物。
7. 前記線維化は、肝線維化又は肺線維化であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の線維化抑制用組成物。