JP7585015B2 - 核酸構築物のセット、キット、検出方法及び薬剤効果予測方法 - Google Patents

核酸構築物のセット、キット、検出方法及び薬剤効果予測方法 Download PDF

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Description

本発明の実施形態は、核酸構築物のセット、キット、検出方法及び薬剤効果予測方法に関する。
ＤＮＡ相同組換えは、損傷を受けたＤＮＡを修復する重要な機能である。多くのがんにおいてＤＮＡ相同組換え機能の低下が生じていることが知られている。例えば、ＤＮＡ相同組換え機能不全の乳がんはトリプルネガティブタイプに分類される難治性のがんである。このような疾患の早期発見及び有効な治療のために、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞を効率的に検出する方法が求められている。
国際公開第２０１９／１３１９６１号
本発明が解決しようとする課題は、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞を効率よく検出することができる核酸構築物のセット、キット、検出方法及び薬剤効果予測方法を提供することである。
実施形態に従うＤＮＡ相同性組換え機能の不全を検出する核酸構築物のセットは、第１核酸構築物と第２核酸構築物とを含む。第１核酸構築物は、第１プロモーター配列と、第１プロモーター配列の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子とを含む。第２核酸構築物は、第２プロモーター配列と、第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む。
図１は、実施形態に従う核酸構築物のセットの一例を示す図である。 図２は、実施形態に従う検出方法の一例を示すフローチャートである。 図３は、ＤＮＡ相同組換え機能を有する細胞における実施形態の核酸構築物の挙動の一例を示す図である。 図４は、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞における実施形態の核酸構築物の挙動の一例を示す図である。 図５は、実施形態のＣＭＯＳイメージセンサの一例を示す平面図及び断面図である。 図６は、実施形態の薬剤効果予測方法の一例を示すフローチャートである。 図７は、実施形態の核酸構築物を内包する脂質粒子の断面図である。 図８は、例１において作成したベクター１－１０、ベクター１－２０、ベクター１－３０を示す図である。 図９は、例２において作成したベクター２を示す図である。 図１０は、例４における実験結果を示すグラフである。
以下、実施形態について、添付の図面を参照して説明する。なお、各実施形態において、実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、その説明を一部省略する場合がある。図面は模式的なものであり、各部の厚さと平面寸法との関係、各部の厚さの比率等は現実のものとは異なる場合がある。
・核酸構築物のセット
実施形態によれば、ＤＮＡ相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）の機能不全の細胞を検出するために用いられる核酸構築物のセットが提供される。セットは第１核酸構築物と第２核酸構築物とを含む。詳細は後述するが、本核酸構築物のセットを検査対象の細胞（被検細胞）に導入することにより当該細胞がＤＮＡ相同組換え機能不全か否かを検出することができる。
図１の（ａ）に示すように、第１核酸構築物１は、第１プロモーター配列Ｐ１と、第１プロモーター配列Ｐ１の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子２とを含む。第１核酸構築物１は二本鎖ＤＮＡであり得る。
図１の（ｂ）に示すように、第２核酸構築物１０は、第２プロモーター配列Ｐ２と、第２プロモーター配列Ｐ２の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列１１と、第１ｌｏｘＰ配列１１の下流に連結されたレポーター遺伝子１２と、レポーター遺伝子１２の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列１３とを含む。第２核酸構築物１０は二本鎖ＤＮＡであり得る。
本明細書において連結とは、２つの配列の間に他の配列を含むことなく連結されている場合、及び２つの配列の間に任意の配列が含まれて連結されている場合を含む。任意の配列は例えばスペーサー配列である。スペーサー配列は、上記の各配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、且つこれらの配列の活性に影響を与える可能性が低い核酸配列である。上記配列は、各々の機能が作動できるように連結されている。
以下、核酸構築物に含まれる配列について詳細に説明する。
第１プロモーター配列Ｐ１及び第２プロモーター配列Ｐ２は、ウイルス由来プロモーター又は組織特異的プロモーターから選択されることが好ましい。ウイルス由来プロモーターは、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター又はシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）プロモーター又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター等である。組織特異的プロモーターは、被検細胞の由来の組織において特異的に使用されているプロモーターである。したがって組織特異的プロモーターは被検細胞の種類に従って選択される。例えば、被検細胞が乳がん細胞である場合、乳腺組織特異的プロモーター、例えば、エストロゲンプロモーター又はエストロゲンレセプタープロモーターを用いることが好ましい。しかしながら第１プロモーター配列Ｐ１及び第２プロモーター配列Ｐ２は、プロモーター配列の機能を有する限りにおいて上で列挙したものに限定されるものではなく、また上記プロモーター配列の塩基配列のうち任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。
第１プロモーター配列Ｐ１及び第２プロモーター配列Ｐ２は、互に同じものを用いてもよいし、互に異なるものを用いてもよい。
切断されたＣｒｅ遺伝子２は、例えば１箇所で切断されたＣｒｅ遺伝子である。ここで、Ｃｒｅ遺伝子は、バクテリオファージＰ１由来の遺伝子組換え反応系であるＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるものである。Ｃｒｅ遺伝子は、Ｃｒｅタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば表１の配列番号１の配列を有する。
Figure 0007585015000001
切断されたＣｒｅ遺伝子２の切断部３は、ＤＮＡ相同組換え機能により修復されることでＣｒｅタンパク質を発現できる構成を有する。
例えば、切断部３の５’末端には、切断部３の３’側末端の一部の塩基配列である第１配列４と相同な塩基配列を有する第２配列５が配置されている。第１配列４と第２配列５とは同じ向きで配置されている。第１配列４及び第２配列５の塩基長は、例えば３塩基～１２０塩基、好ましくは１０塩基～３０塩基である。
表２を用いて第１配列４及び第２配列５の具体例を説明する。Ｃｒｅ遺伝子（配列番号１）の中のＴＴＡＴＧＣＧＧＣＧ（配列番号２、下線部）を第１配列４として選択した場合、切断されたＣｒｅ遺伝子２の５’側断片６の塩基配列は、表２の配列番号３の塩基配列となり得る（下線部が第１配列４）。また３’側断片７の塩基配列は、表２の配列番号４の塩基配列となり得る（下線部が第２配列５）。
Figure 0007585015000002
表１は、第１配列４及び第２配列５の塩基長が１０塩基である例を示したが、塩基長を２０塩基とする場合、例えば第１配列４及び第２配列５としてＴＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡ（配列番号５）の配列が選択され得る。塩基長を３０塩基とする場合、例えばＴＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号６）の配列が選択され得る。切断部３の位置並びに第１配列４及び第２配列５として選択される配列は上記の例に限定されるものではなく、切断されていることによりＣｒｅ遺伝子が不活性化されており、このままの状態ではＣｒｅタンパク質を発現しないように選択されればＣｒｅ遺伝子中の何れの位置及び配列が選択されてもよい。
上記のように切断部３が相同な配列、第１配列４及び第２配列５を有することによりＤＮＡ相同組換え修復によりＣｒｅ遺伝子が形成し発現され得る。
第１配列４及び第２配列５の切断部３側の末端は、更なる塩基配列を含んでもよい。例えば、切断されたＣｒｅ遺伝子２を合成する際に残留した塩基配列、例えば制限酵素サイトの突出末端等が存在していてもよい。これらはＤＮＡ修復の際に除去され得る。
第１ｌｏｘＰ配列１１及び第２ｌｏｘＰ配列１３は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムにおいてＣｒｅタンパク質が認識してそこにおいて組換えを行うための配列である。第１ｌｏｘＰ配列１１及び第２ｌｏｘＰ配列１３は、例えばともに下記表２の塩基配列を含み得るが、ｌｏｘＰ配列の上記機能を有する限りにおいて塩基配列を改変したものを用いてもよい。
Figure 0007585015000003
第１ｌｏｘＰ配列１１及び第２ｌｏｘＰ配列１３は、第２核酸構築物１０内で同じ向きで配置されることが好ましいが、互に逆の向きで配置されてもよい。
レポーター遺伝子１２は、例えば蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子又は薬剤耐性遺伝子等である。例えば、青色蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子又は赤色蛍光タンパク質遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子；ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子等の発光酵素タンパク質の遺伝子；キサンチンオキシダーゼ遺伝子又は一酸化窒素合成酵素遺伝子等の活性酸素生成酵素の遺伝子；βアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子；或いは重金属結合タンパク質遺伝子等を用いることができる。
しかしながらレポーター遺伝子１２は、上で列挙したレポーター遺伝子に限定されるものではなく、レポーターとしての機能を有する限りにおいては他のレポーター遺伝子、又は上記のレポーター遺伝子の塩基配列の任意の塩基を置換、或いは欠失させたものであってもよい。
レポーター遺伝子１２は、例えばルシフェラーゼであるＮａｎｏｌｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。その塩基配列の例を表２に示す。
Figure 0007585015000004
第１核酸構築物１の切断されたＣｒｅ遺伝子２の下流、及び第２核酸構築物１０のレポーター遺伝子１２の下流には、転写終結配列が更に連結されていてもよい。転写終結配列は、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列又は人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列等である。ただし、転写終結配列はこれらに限定されるものではなく、転写終結配列としての機能を有する限りにおいては、他の配列、又は上記した転写終結配列の塩基配列を改変したもの等を用いてもよい。
第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０は、ベクターであってもよい。例えば、プラスミドベクター又はウイルスベクターを基礎としたベクターであってもよい。
第１核酸構築物１の切断されたＣｒｅ遺伝子２の部分は、例えば次のように作製することができる。まず、切断されたＣｒｅ遺伝子２の５’側断片６、第１制限酵素サイト、任意の配列、第２制限酵素サイト及び切断されたＣｒｅ遺伝子２の３’断片７を含む配列を合成する。次に、第１プロモーター配列Ｐ１を含む、第１核酸構築物１の基礎となるベクターを用意し、上記のようにして得られた合成ＤＮＡを基礎となるベクターの第１プロモーター配列Ｐ１の下流に導入する。次いで、第１制限酵素サイト及び第２制限酵サイトを制限酵素で切断することで、切断されたＣｒｅ遺伝子２を有する第１核酸構築物が得られる。
第２核酸構築物１０は次のようにして得られる。まず、レポーター遺伝子１２を用意し、その端に第１ｌｏｘＰ配列１１及び第２ｌｏｘＰ配列１３をそれぞれ付加する。例えば、ｌｏｘＰ配列を含むプライマーを用いてレポーター遺伝子１２を増幅することで第１ｌｏｘＰ配列１１、レポーター遺伝子１２及び第２ｌｏｘＰ配列１３を含む配列を合成することができる。次に、第２プロモーター配列Ｐ２を含む、第２核酸構築物１０の基礎となるベクターを用意し、上記のようにして得られた合成ＤＮＡを基礎となるベクターの第２プロモーター配列Ｐ２の下流に導入することで第２核酸構築物１０が得られる。
第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０は、上記の配列の他にも任意の塩基配列を含んでもよい。このような塩基配列は、例えば特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。機能を有する塩基配列は、例えば、更なるレポーター遺伝子発現ユニット、複製開始配列及び／又は複製開始タンパク質発現ユニット等である。
更なる実施形態において、切断されたＣｒｅ遺伝子２の切断部３は複数個所あってもよい。しかしながらその場合ＤＮＡ修復の効率が下がるため、切断箇所は少ないことが好ましく、１箇所であることがより好ましい。
・ＤＮＡ相同組換え機能不全の検出方法
実施形態によれば、第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０を用いたＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の検出方法が提供される。
本検出方法は、例えば図２に示す次の工程を含む。
（Ｓ１）第１核酸構築物と第２核酸構築物とを被検細胞に導入する導入工程、
（Ｓ２）被検細胞を培養する培養工程、及び
（Ｓ３）レポーター遺伝子から発現したレポータータンパク質の活性を検出する検出工程。
以下、各工程の手順の例について詳細に説明する。
まず、被検細胞を用意する。被検細胞は例えば、ヒト、動物又は植物由来のもの、或いは細菌又は菌類等の微生物由来の細胞であり得る。被検細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。被検細胞は、例えば生体外に取り出された細胞であり、例えば、血液等の体液、組織又はバイオプシー等から分離された細胞であってもよい。被検細胞は、例えばがん細胞である。がん細胞は、例えば乳がん、卵巣がん、前立腺がん及び／又は消化器のがんの原発巣から得られたもの、或いはそれらのがんが転移した病巣のがん細胞等であることが好ましい。被検細胞は、例えば、単離細胞、培養細胞又は株化された細胞であってもよい。或いは、細胞は、生体内の細胞であってもよい。
次に、被検細胞に第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０を細胞に導入する（導入工程Ｓ１）。導入工程Ｓ１は、例えば被検細胞が生体外に取り出された細胞である場合、リポソーム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、カチオン性ポリマー法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法又はソノポレーション法等の公知の方法で行うことができる。
特にリポソーム法を用いることが好ましい。リポソーム法は、第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０をリポソーム（脂質粒子）に内包し、それを含む組成物等を細胞と接触させる。それにより、脂質粒子は例えばエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、内包物を細胞内に放出する。脂質粒子の詳細については、後のキットの実施形態において説明する。
被検細胞が生体内の細胞である場合、導入は、第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０を含む組成物を生体へ注射又は点滴すること等によって行うことができる。組成物は、例えば第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０を内包する上記脂質粒子を含んでもよい。
次に、被検細胞を培養する（培養工程Ｓ２）。培養は、被検細胞の種類によって選択される、被検細胞の生存に適した公知の方法で行えばよい。例えば培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約５％であることが好ましい。また、培養は１日～３日間行われることが好ましい。培地は固体培地又は液体培地であり、被検細胞の生存に適した培地を用いることができる。
導入工程Ｓ１後、ＤＮＡ相同組換え機能を有する被検細胞における各核酸構築物の挙動について図３を用いて説明する。また、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞における挙動について図４を用いて説明する。
図３に示すように、ＤＮＡ相同組換え機能を有する被検細胞では、ＤＮＡ相同組換え活性（ＨＲ）により第１核酸構築物１の切断されたＣｒｅ遺伝子２の切断部が修復され、Ｃｒｅ遺伝子２ａが形成され得る（図３の（ａ））。それにより、Ｃｒｅ遺伝子２ａが発現してＣｒｅタンパク質８が合成され得る（図３の（ｂ））。Ｃｒｅタンパク質８は、第２核酸構築物１０の第１ｌｏｘＰ配列１１及び第２ｌｏｘＰ配列１３に結合し（図３の（ｃ））、２つのｌｏｘＰ配列間で組換えを起こす。その結果、第２核酸構築物１０が２つの環状核酸に分割され、第２プロモーター配列Ｐ２とレポーター遺伝子１２とが分離される（図３の（ｄ））。そのため、レポーター遺伝子１２が不活性化し、その発現が減少するか、又は発現されない。
一方、図４に示すように、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞では、第１核酸構築物１において切断されたＣｒｅ遺伝子２が修復されない（図４の（ａ））。この場合、Ｃｒｅ遺伝子が発現しないため、第２核酸構築物１０のレポーター遺伝子１２が不活性化されず、レポーター遺伝子１２が発現し、レポータータンパク質１４が合成される（図４の（ｂ））。レポータータンパク質１４は、例えば信号１５を生じる等、種類に応じた検出可能な活性を示す。
上では第１ｌｏｘＰ配列１１と第２ｌｏｘＰ配列１３とが互いに同じ向きで配置されている場合の例を示したが、互に逆向きに配置した場合には図３の（ｃ）でＣｒｅタンパク質８が結合した後、２つのｌｏｘＰ配列間で組換えによりレポーター遺伝子１２の向きが反転する。それによりレポーター遺伝子１２が不活性化される。
次にレポータータンパク質１４の活性を検出する（検出工程Ｓ３）。検出工程Ｓ３は、被検細胞からレポータータンパク質１４を抽出して得られた抽出液又は被検細胞の培養液の上清において行ってもよい。又は生きたままの被検細胞において行うことも可能である。
レポーター遺伝子１２の活性は、レポータータンパク質１４が信号１５を生ずるものである場合、それを検出することにより検出可能である。信号１５は、例えば蛍光、化学発光、生物発光、生物化学発光及び呈色等、或いはタンパク質等の分子の呈示である。信号１５はレポータータンパク質１４自体から発せられるか、又はレポータータンパク質１４と特定の物質（以下、「第１物質」と記載する）との反応、例えば、酵素反応又は結合等により生じるもので有り得る。
第１物質は、例えば、レポータータンパク質１４が酵素である場合、その基質である。例えば、レポータータンパク質１４がルシフェラーゼである場合、第１物質は、ルシフェリンである。或いは、信号１５は、レポータータンパク質１４と第１物質との反応により生じる物質の存在を検出するための更なる検出試薬（以下、「第２物質」と記載する）に由来する信号であってもよい。
例えば、上記第１物質及び／又は第２物質を用いる場合、これらの物質は検出工程Ｓ３のはじめに被検細胞に添加され得る。これらの物質は、被検細胞の培養培地に添加してもよいし、細胞に導入してもよい。或いは、被検細胞から得られた抽出液又は上清に添加してもよい。
信号１５の検出は、その種類に応じて選択された何れかの公知の方法を用いて行えばよい。
レポータータンパク質１４が蛍光タンパク質である場合、細胞に励起光を照射することにより蛍光タンパク質から発生する蛍光として信号１５が得られる。蛍光（信号１５）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はフルオロメーター等により検出することができる。
レポータータンパク質１４がルシフェラーゼである場合、ルシフェリンを添加することにより化学発光として信号１５が得られる。化学発光（信号１５）は、目視、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージ解析ソフト、又はルミノメーター等により検出することができる。
レポータータンパク質１４がβ－ガラクトシダーゼである場合、５－ブルモー４－クロロー３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）又はｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）等の基質を添加することにより、細胞溶液又は抽出液の吸光度として信号１５が得られる。吸光度（信号１５）は、吸光度計、分光光度計又は濁度計等で検出することができる。
レポータータンパク質１４が一酸化窒素合成酵素又はキサンチンオキシダーゼである場合、基質を添加し、発生する活性酸素が信号１５として得られる。活性酸素（信号１５）は電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）等で検出することができる。
レポータータンパク質１４が重金属結合タンパク質である場合、測定可能な重金属を添加し、レポータータンパク質に結合した重金属が信号１５として得られる。重金属は、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、ＭＲＩ撮像装置、又はＸ線コンピュータ断層撮影装置により検出することができる。
例えば信号１５の強度はレポータータンパク質１４の発現量と相関するため、信号１５が得られた細胞、信号１５の強度が閾値よりも高い細胞は、レポーター遺伝子１２の活性が高く、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞と判断することができる。反対に信号１５が得られない細胞、信号１５の強度が閾値よりも低い細胞は、ＤＮＡ相同組換え機能を有する細胞と判断することができる。
閾値は、例えば、ＤＮＡ相同組換え機能不全であることが既知である細胞を用いて実施形態の検出方法を実施した際に得られたレポータータンパク質１４の発現量（信号１５の強度）の値とすることができる。
レポータータンパク質１４が薬剤耐性遺伝子である場合、対応する薬剤を培地に添加して培養工程Ｓ２を行えばよい。この場合、ＤＮＡ相同組換え機能不全の被検細胞は生存し、ＤＮＡ相同組換え機能を有する被検細胞は死滅し得る。それによって生存した細胞についてはレポーター遺伝子１２の活性が高く、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞と判断することができる。
或いは検出工程Ｓ３は信号１５の検出又は薬剤によるスクリーニング等を行うのではなく、レポータータンパク質１４を直接検出又は定量してもよい。この場合、レポータータンパク質１４が検出された細胞、定量値が閾値よりも高い細胞、定量値が増加した細胞又は定量値の増加量が閾値よりも大きい細胞は、レポーター遺伝子１２の活性が高く、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞と判断することができる。
このようにして、ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞を検出することができる。
培養工程Ｓ２と前記検出工程Ｓ３は、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行ってもよい。図５は、ＣＭＯＳイメージセンサ２０の使用時の様子を示す。図５の（ａ）はＣＭＯＳイメージセンサ２０の平面図であり、図５の（ｂ）は（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である。ＣＭＯＳイメージセンサ２０は、二次元領域にマトリックス状に並んだ複数のセンシング部２１と、これらの複数のセンシング部２１上に設けられた試料収容部２２とを備える。試料収容部２２内で被検細胞２３を培養できる。各センシング部２１は光学センサであり、センシング部２１上の被検細胞２３の有無、及び被検細胞２３又は培地から生じる信号１５を二次元的に検出することが可能である。
実施形態の検出方法によれば、短時間で効率的にＤＮＡ相同組換え機能不全細胞を可視化し、検出することが可能である。
・薬剤効果予測方法
実施形態によれば、第１核酸構築物１及び第２核酸構築物１０を用いて、対象のがんにおける薬剤効果を予測する方法が提供される。
薬剤は、ＤＮＡ相同組換え機能不全のがんに効果を奏する薬剤である。薬剤は、例えばＤＮＡ傷害性抗がん剤、例えばシスプラチン等の白金製剤又はトポイソメラーゼ阻害剤、或いはＰｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）阻害剤等である。
本方法は、例えば図６に示す次の工程を含む。
（Ｓ１１）第１核酸構築物及び第２核酸構築物を被検細胞に導入する導入工程、
（Ｓ１２）被検細胞を培養する培養工程、
（Ｓ１３）レポーター遺伝子から発現したタンパク質からの信号を検出する検出工程
（Ｓ１４）前記検出の結果に基づいて前記被検細胞に含まれるＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率を算出する算出工程、及び
（Ｓ１５）前記存在率に基づいて前記対象のがんのＤＮＡ相同組換え機能不全のがんに効果を奏する薬剤の効果を予測する予測工程。
以下、各工程の手順の例について詳細に説明する。
まず、対象から被検細胞を採取する。対象は動物であり、好ましくはヒトである。被検細胞はがん細胞である。がん細胞は、例えば乳がん、卵巣がん、前立腺がん及び／又は消化器のがんの原発巣から得られたもの、或いはそれらのがんが転移した病巣のがん細胞等であることが好ましい。がん細胞は、対象のがん病巣から生検等により採取され得る。被検細胞は、採取後培養してもよい。
導入工程Ｓ１１～検出工程Ｓ１３は、上記導入工程Ｓ１～検出工程Ｓ３と同様に行うことができる。
次に、検出工程Ｓ１２の結果に基づいてＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率を算出する（算出工程Ｓ１４）。ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率は、被検細胞の細胞数（Ａ）とＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞数（Ｂ）とを計測し、次の式（Ｉ）に代入することにより得られる。
ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率＝（Ｂ）／（Ａ）…式（Ｉ）
細胞数の計測は、公知の方法により行われればよい。例えば顕微鏡観察を行い目視により計測してもよいし、顕微鏡画像から自動的に計測してもよい。又はフローサイトメトリーを用いてもよい。
細胞数（Ｂ）は、検出工程Ｓ１２においてレポーター遺伝子１２の活性が高い細胞の数である。例えば、細胞数（Ｂ）は信号１５が得られた細胞の数である。レポーター遺伝子１２として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、細胞数（Ｂ）は生存した細胞の数である。
被検細胞の細胞数（Ａ）は、例えば被検細胞に散乱光を照射することで検出される細胞数である。薬剤耐性遺伝子を用いる場合、被検細胞の細胞数（Ａ）は導入工程Ｓ１１の前に計測しておけばよい。
算出工程Ｓ１４は、被検細胞の全てについて行う必要はなく、サンプリングした一部又は顕微鏡の視野内の一部の被検細胞において行い、その結果から被検細胞全体のＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率を推定してもよい。
次に算出工程Ｓ１４で得られたＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率から対象のがんの薬剤効果を予測する。ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率が高いほど、薬剤の効果が高いと判定することができる。反対にＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率が低いほど、薬剤の効果が低いと判定することができる。
薬剤の効果の予測は存在率の閾値を基準に行ってもよい。例えば存在率の閾値は約４０％であり、これより存在率が高い場合薬剤の効果があると判定することも可能である。閾値は、例えば文献等の過去の知見から決定してもよい。或いは、薬剤効果が既知である細胞群のＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞の存在率を実施形態の方法を行って算出して決定してもよい。
或いは、当該存在率から、本薬剤を用いた治療のスケジュールを決定することも可能である。例えば存在率に応じて薬剤の投与量又は投与頻度を変更してもよい。
以上に説明したように、実施形態の薬剤効果予測方法によれば、短時間で効率よく対象のがんにおける薬剤効果を予測することができる。
・キット
実施形態によれば、ＤＮＡ相同組換え機能不全の細胞を検出するため又は対象のがんにおける薬剤効果を予測するために用いられる試薬キットが提供される。
キットは、第１核酸構築物と第２核酸構築物とを含む核酸構築物のセットを含む。
核酸構築物のセットは、例えば、溶媒に含まれた組成物として提供される。溶媒は、例えば、エンドトキシンフリー水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー又はＨＥＰＥＳバッファー等を用いることができる。組成物は、更に賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤等を含んでもよい。
核酸構築物のセットは、脂質粒子に内包された状態でキットに含まれていることが好ましい。脂質粒子について図７を用いて説明する。図６に示すように、脂質粒子３０は中空の球状の脂質膜である。例えば、図７の（ａ）に示すように第１核酸構築物１と第２核酸構築物１０とは一緒に脂質粒子３０に内包されている。又は図７の（ｂ）に示すように第１核酸構築物１と第２核酸構築物１０とは別々に脂質粒子３０に内包されている。
脂質粒子３０を構成する脂質膜は、単層、脂質二重層若しくは脂質三重層等の脂質膜である。また、脂質粒子３０は脂質膜が更に複数の重なった多層構造であってもよい。
脂質粒子３０は、１種類の脂質材料からなってもよいが、好ましくは複数種類の脂質材料からなる。脂質材料は、例えば、下記に例示するベース脂質と、第１の脂質化合物と、第２の脂質化合物とを少なくとも含むことが好ましい。
ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等であることが好ましい。ベース脂質は、例えば生体膜の主成分の脂質であってもよく、人工的に合成した脂質であってもよい。
ベース脂質として、特にカチオン性脂質又は中性脂質の脂質を用いること好ましく、その含有量によって脂質粒子３０の酸解離定数を調節することができる。カチオン性脂質として１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を用いることが好ましく、中性脂質として１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いることが好ましい。
ベース脂質は、脂質材料の全体に対して３０％～約８０％（モル比）含まれることが好ましい。或いは、１００％近くがベース脂質から構成されていてもよい。
第１の脂質化合物及び第２の脂質化合物は、生分解性脂質である。第１の脂質化合物はＱ－ＣＨＲ２の式で表すことができる。
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ１２～Ｃ２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。
脂質粒子３０が第１の脂質化合物を含む場合、脂質粒子３０の表面が非カチオン性となるため、細胞導入における障害が低減され、内包物の導入効率が高まり得る。
第１の脂質化合物として、例えば下記式で表される構造を有する脂質を用いれば導入効率がより優れているため好ましい。特に、下記式（１－０１）の脂質化合物及び／又は式（１－０２）の脂質化合物を用いることが好ましい。
Figure 0007585015000005
第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］２の式で表すことができる。
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ１～Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ１２～Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）。
第２の脂質化合物を含む場合、脂質粒子３０への核酸構築物の内包量が多くなり得る。
例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、核酸構築物の内包量がより優れているため好ましい。特に、下記式（２－０１）の化合物を用いることが好ましい。
Figure 0007585015000006
以上に説明した第１及び第２の脂質化合物を含む脂質粒子３０を用いた場合、核酸構築物の内包量を増加させ、且つ核酸構築物の被検細胞への導入効率を高めることが可能である。かつ導入した被検細胞の細胞死も低減することができる。
第１及び第２の脂質化合物は、脂質材料の全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質材料は、脂質粒子３０同士の凝集を防止する脂質、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含むこともまた好ましい。このような脂質は、脂質粒子３０の脂質材料全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。
脂質材料は、毒性を調整するための相対的に毒性の低い脂質；脂質粒子３０に配位子を結合させる官能基を有する脂質；ステロール、例えばコレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を更に含んでもよい。特に、コレステロールを含ませることが好ましい。
用いられる脂質の種類及び組成は、目的とする脂質粒子３０の酸解離定数（ｐＫａ）若しくは脂質粒子３０のサイズ、内包物の種類、或いは導入する被検細胞中での安定性等を考慮して適切に選択される。
例えば、脂質粒子３０は、式（１－０１）若しくは式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物と、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＴＡＰと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含むことが好ましい。
脂質粒子３０は、小分子を脂質粒子３０に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法又は凍結融解法等を用いて製造することができる。例えば、脂質粒子３０の材料を所望の比率でアルコール等の有機溶媒に含ませて得られた脂質混合物と、ベクター等の内包するべき成分を含む水性緩衝液を用意し、脂質混合物に水性緩衝液を添加する。得られた混合物を撹拌して懸濁することによりベクター等を内包した脂質粒子３０が形成される。
また、キットは、レポータータンパク質１４を検出するための試薬を更に含んでもよい。試薬は、例えば、検出工程Ｓ３において説明した第１物質及び／又は第２物質である。
核酸構築物のセット及び試薬は、個別に又は何れかの成分が組み合わされて容器に含まれて提供される。
［例］
以下、実施形態の核酸構築物のセットを製造し、使用した例について説明する。
例１．ＤＮＡ相同組換え機能不全細胞を検出するベクター１の作製
アンピシリン耐性遺伝子配列、ＣｏｌＥ１ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＣＭＶプロモーター配列、ＢＧＨポリＡ配列が連結されたベクターＡを用意した。ＣＭＶプロモーター配列の下流にあるＸｈｏＩサイト及びＸｂａＩサイトで制限酵素処理を行った後、０．８％アガロース電気泳動を行い、ゲルを切り出して切断されたベクターＡを精製した。
下記表５～７に示す３種の配列を合成した。これらの３種の配列は、Ｃｒｅ遺伝子切断部（制限酵素サイト）の両端に１０塩基の相同配列を設けた配列、Ｃｒｅ遺伝子切断部の両端に２０塩基の相同配列を設けた配列、及びＣｒｅ遺伝子切断部の両端に３０塩基の相同配列を設けた配列である。下線で示す相同配列の間に、制限酵素サイトＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ）及びＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ）が設けられている。
Figure 0007585015000007
Figure 0007585015000008
Figure 0007585015000009
表５～７の３つの配列をテンプレートとして表８のプライマーを用いて表９の条件でＰＣＲを行ってそれぞれ増幅した。
Figure 0007585015000010
Figure 0007585015000011
増幅したＤＮＡを０．８％アガロース電気泳動によって精製し、これらの配列をベクターＡのＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングキット（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＴａＫａＲａ）を用いて連結した。その結果、図８の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すベクターがそれぞれ得られた。作製したベクターについてＤＮＡ配列解析を行い、ベクターＡのＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトに上記表５～７の塩基配列が挿入されている、意図した配列であることを確認した。
次いで、表５～７の配列を挿入したベクターについてそれぞれＡｐａＩ及びＮｈｅＩで制限酵素処理を行った後、０．８％アガロース電気泳動を行い、切り出して精製した。その結果、表５の配列由来のベクター１－１０、表６の配列由来のベクター１－２０及び表７の配列由来のベクター１－３０が得られた。
例２．ＤＮＡ相同組換え機能不全細胞を検出するベクター２の作製
アンピシリン耐性遺伝子配列、ＣｏｌＥ１ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＣＭＶプロモーター配列、ＢＧＨポリＡ配列を連結したベクターＡを用意した。ＣＭＶプロモーター配列の下流にあるＸｈｏＩサイト及びＸｂａＩサイトで制限酵素処理を行った後、０．８％アガロース電気泳動を行い、ゲルを切り出して、切断されたベクターＡを精製した。
ルシフェラーゼであるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）の遺伝子の配列（配列番号８）をテンプレートとし、表１０に示す、ｌｏｘＰ配列（配列番号７、下線部）を含むプライマーを用いて、表９の条件でＰＣＲを行って増幅した。
Figure 0007585015000012
増幅したＤＮＡを０．８％アガロース電気泳動によって精製し、この配列をベクターＡのＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトにクローニングキット（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＴａＫａＲａ）を用いて連結した。その結果、図９に示すレポーターベクターが得られた。作製したベクターについてＤＮＡ配列解析を行い、ベクターＡのＸｈｏＩ／ＸｂａＩサイトに、ｌｏｘＰ配列（配列番号７）に挟まれたレポーター遺伝子（配列番号８）が挿入されている、意図した配列であることを確認した。これをベクター２とした。
例３．ベクター１及びベクター２を内包する脂質粒子の調製
例１で作製したベクター１－１０、ベクター１－２０及びベクター１－３０、並びに例２で作製したベクター２をそれぞれ含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドを加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール中に脂質（ＦＦＴ１０（前記式（１－０１）の脂質化合物）／ＳＳＴ０４（前記式（２－０１）の脂質化合物）／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１５／１０．５／１０．５／３０／２ｍｏｌ）を溶解した溶液に添加した。得られた混合液に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ベクター１－１０、ベクター１－２０及びベクター１－３０をそれぞれ内包する脂質粒子と、ベクター２を内包する脂質粒子とを得た。脂質粒子のＤＮＡ内包量をＤＮＡ定量キット（Ｑｕａｎｔ－ｉＴＴＭＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭｄｓＤＮＡＡｓｓａｙＫｉｔ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定した。
例４．ベクター１及びベクター２の細胞株への導入
・ヒト乳腺腫瘍由来細胞株への導入
ヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＣＦ－７）をカルチャーフラスコ内で１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地（ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で付着培養した。培養後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がした。次いで、１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁し、Ｔｒｙｐｓｉｎを不活性化した。遠心で細胞を回収した後、２．０×１０５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁した。９６ウェル培養ディッシュ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に４．０×１０４細胞／ウェルとなるように細胞懸濁液を２００μＬ加えた。
次に、例３で作製した３種のベクター１を内包する脂質粒子をＤＮＡが５０ｎｇ／ウェルとなるように上記ウェルに添加した。同時に例３で作製したベクター２を内包する脂質粒子をＤＮＡが１ｎｇ／ウェルとなるように上記ウェルに更に添加した。対照としてベクター２のみを添加するウェルも設けた。したがって、ベクター２のみを添加した試料、ベクター１－１０及びベクター２を添加した試料、ベクター１－２０及びベクター２を添加した試料、並びにベクター１－３０及びベクター２を添加した試料を得た。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
・ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発光アッセイ）
脂質粒子を添加した４８時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、培地を取り除いた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＧｌｏＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（プロメガ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、得られた混合液を－８０℃で３０分凍結した。それを室温で融解させた後、１．５ｍｌ遠心チューブに回収した。細胞溶解液を１５，０００ｒｐｍで１０分間で遠心分離し、細胞残渣を沈殿させ、上清２５μＬを９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ）に分注した。分注した上清に、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ、プロメガ）に含まれるルシフェラーゼ基質溶液を２５μＬ添加し、混合した。得られた混合液についてルミノメーター（ＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて、０．１秒当たりの１ウェルの当たりの発光量を測定した。
・プロモーター活性の比較結果
図１０に、ベクター１及びベクター２内包脂質粒子によるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発光強度（ＲＬＵ）の測定結果を示す。ベクター２のみの場合、発光強度ＲＬＵ値は約６．５×１０５であった。対して、ベクター１－１０、ベクター１－２０、又はベクター１－３０を一緒に導入した場合では発光強度ＲＬＵは、それぞれ約２．９×１０５（ベクター２のみを１とした時の発光量比：０．４５）、２．０×１０５（発光量比：０．３１）、２．４×１０５（発光量比：０．３７）であり、ベクター２のみと比較して減少した。
この結果から、相同組換え活性を有する乳がん細胞株であるＭＣＦ７においては、ベクター１が存在する場合にベクター１が相同組換え活性により修復され、ベクター１でＣｒｅ遺伝子が発現し、Ｃｒｅタンパク質がベクター２のｌｏｘＰ配列部分で組換えを行い、レポーターであるＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子の発現が抑制されたことが示唆される。このことから、相同組換え不全（ＨＲＤ）の細胞では、ベクター１の修復が行われないことからＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）発光強度（ＲＬＵ）が維持されると予想することができ、相同組換え不全（ＨＲＤ）細胞を検出できることは明らかである。
ＤＮＡ相同配列の長さが１０塩基、２０塩基及び３０塩基の何れの場合でも同様に検出が可能であることが明らかとなった。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子とを含む第１核酸構築物と、
第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物と
を含む、ＤＮＡ相同性組換え機能の不全を検出する核酸構築物のセット。
［２］
前記切断部の５’末端には、前記切断部の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、［２］に記載のセット。
［３］
前記第１配列及び前記第２配列の塩基長は、３塩基～１２０塩基である、［２］
に記載のセット。
［４］
前記第１配列及び前記第２配列は、配列番号２、５、６の何れかの塩基配列から選択される、［２］又は［３］に記載のセット。
［５］
前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、［１］～［４］の何れか１つに記載のセット。
［６］
前記第１プロモーター配列及び前記第２プロモーター配列が、ウイルス由来プロモーター又は乳線組織特異的プロモーターである、［１］～［５］の何れか１つに記載のセット。
［７］
脂質粒子と、
前記脂質粒子に封入され、第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子とを含む記第１核酸構築物と、
前記脂質粒子に封入され、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物と、
を含むＤＮＡ相同性組換え機能の不全を検出するためのキット。
［８］
前記切断部の５’末端には、前記切断部の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、［７］に記載のキット。
［９］
前記第１配列及び前記第２配列の塩基長は、３塩基～１２０塩基である、［８］に記載のキット。
［１０］
前記脂質粒子は、その材料として下記式（１－０１）の化合物、式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物
Figure 0007585015000013
 を含む、［７］～［９］の何れか１つに記載のキット。
［１１］
前記レポーター遺伝子の発現を検出するための試薬を更に含む［７］～［１０］の何れか１つに記載のキット。
［１２］
第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子とを含む、第１核酸構築物、及び第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物を被検細胞に導入すること、
前記被検細胞を培養すること、及び
前記レポーター遺伝子から発現したタンパク質の活性を検出すること
を含むＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞を検出する方法。
［１３］
前記導入は、前記第１核酸構築物及び前記第２核酸構築物を封入した脂質粒子を前記被検細胞に接触させることにより行われる、［１２］に記載の方法。
［１４］
前記被検細胞のうちＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞において、前記レポータータンパク質の前記活性が高い、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］
前記培養と前記検出とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行う、［１２］～［１４］の何れか１つに記載の方法。
［１６］
第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流に連結された、切断されたＣｒｅ遺伝子とを含む第１核酸構築物及び第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物を対象由来の被検細胞に導入すること、
前記被検細胞を培養すること、
前記レポーター遺伝子から発現したタンパク質からの信号を検出すること
前記検出の結果に基づいて前記被検細胞に含まれるＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率を算出すること、及び
前記存在率に基づいて前記対象のがんにおける、ＤＮＡ相同組換え機能不全のがんに効果を奏する薬剤効果を予測すること
を含む、薬剤効果予測方法。
［１７］
前記導入は、前記第１核酸構築物及び前記第２核酸構築物を封入した脂質粒子を前記被検細胞に接触させることにより行われる、［１６］に記載の方法。
［１８］
前記培養と前記検出とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行う、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］
前記検出の結果から、前記被検細胞のうち前記レポータータンパク質の前記活性が高い細胞をＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞とし、
前記ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率は、次の式（Ｉ）
存在率＝ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞数／被検細胞数…式（Ｉ）
によって算出される、［１６］～［１８］の何れか１つに記載の方法。
［２０］
前記予測において、前記存在率が高いほど前記薬剤の効果が高いと判定する、［１６］～［１９］の何れか１つに記載の方法。
１…第１核酸構築物、２…切断されたＣｒｅ遺伝子、２ａ…Ｃｒｅ遺伝子、
３…切断部、４…第１配列、５…第２配列、
６…切断されたＣｒｅ遺伝子の５’側断片、
７…切断されたＣｒｅ遺伝子の３’側断片、
８…Ｃｒｅタンパク質、１０…第２核酸構築物、
１１…第１ｌｏｘＰ配列、１２…レポーター遺伝子、１３…第２ｌｏｘＰ配列、
１４…レポータータンパク質、１５…信号、
２０…ＣＭＯＳイメージセンサ、２３…被検細胞、
３０…脂質粒子、
Ｐ１…第１プロモーター配列、Ｐ２…第２プロモーター配列。

Claims (18)

  1. 第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流及び上流にそれぞれ連結された、分断されたＣｒｅ遺伝子とを含む第１核酸構築物と、
    第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物と
    を含み、
    前記分断されたＣｒｅ遺伝子は、不活性化されるようにＣｒｅ遺伝子の塩基配列を欠失なしに２つに切断してなる、２つのＣｒｅ遺伝子断片で構成され、
    前記２つのＣｒｅ遺伝子断片のうち、前記第１プロモーター配列の下流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の上流側の遺伝子断片であり、かつ、前記第１プロモーター配列の上流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の下流側の遺伝子断片であり、
    前記第１プロモーター配列の上流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の５’末端には、前記第１プロモーター配列の下流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、
    ＤＮＡ相同性組換え機能の不全を検出する核酸構築物のセット。
  2. 前記第１配列及び前記第２配列の塩基長は、３塩基～１２０塩基である、請求項１に記載のセット。
  3. 前記第１配列及び前記第２配列は、配列番号２、５、６の何れかの塩基配列から選択される、請求項１又は２に記載のセット。
  4. 前記レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質遺伝子、発光タンパク質遺伝子、活性酸素産生遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項１～３の何れか１項に記載のセット。
  5. 前記第１プロモーター配列及び前記第２プロモーター配列が、ウイルス由来プロモーター又は乳線組織特異的プロモーターである、請求項１～４の何れか１項に記載のセット。
  6. 脂質粒子と、
    前記脂質粒子に封入され、第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流及び上流にそれぞれ連結された、分断されたＣｒｅ遺伝子とを含む第１核酸構築物と、
    前記脂質粒子に封入され、第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物と、
    を含むＤＮＡ相同性組換え機能の不全を検出するためのキットであって、
    前記分断されたＣｒｅ遺伝子は、不活性化されるようにＣｒｅ遺伝子の塩基配列を欠失なしに２つに切断してなる、２つのＣｒｅ遺伝子断片で構成され、
    前記２つのＣｒｅ遺伝子断片のうち、前記第１プロモーター配列の下流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の上流側の遺伝子断片であり、かつ、前記第１プロモーター配列の上流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の下流側の遺伝子断片であり、
    前記第１プロモーター配列の上流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の５’末端には、前記第１プロモーター配列の下流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、キット。
  7. 前記第１配列及び前記第２配列の塩基長は、３塩基～１２０塩基である、請求項６に記載のキット。
  8. 前記脂質粒子は、その材料として下記式（１－０１）の化合物、式（１－０２）の化合物及び／又は式（２－０１）の化合物
    Figure 0007585015000014
     を含む、請求項６又は７に記載のキット。
  9. 前記レポーター遺伝子の発現を検出するための試薬を更に含む請求項６～８の何れか１項に記載のキット。
  10. 第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流及び上流にそれぞれ連結された、分断されたＣｒｅ遺伝子とを含む、第１核酸構築物、及び第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物を被検細胞に導入すること、
    前記被検細胞を培養すること、及び
    前記レポーター遺伝子から発現したタンパク質の活性を検出すること
    を含み、
    前記分断されたＣｒｅ遺伝子は、不活性化されるようにＣｒｅ遺伝子の塩基配列を欠失なしに２つに切断してなる、２つのＣｒｅ遺伝子断片で構成され、
    前記２つのＣｒｅ遺伝子断片のうち、前記第１プロモーター配列の下流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の上流側の遺伝子断片であり、かつ、前記第１プロモーター配列の上流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の下流側の遺伝子断片であり、
    前記第１プロモーター配列の上流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の５’末端には、前記第１プロモーター配列の下流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞を検出する方法。
  11. 前記導入は、前記第１核酸構築物及び前記第２核酸構築物を封入した脂質粒子を前記被検細胞に接触させることにより行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記被検細胞のうちＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞において、前記レポータータンパク質の前記活性が高い、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記培養と前記検出とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行う、請求項１０～１２の何れか１項に記載の方法。
  14. 第１プロモーター配列と、前記第１プロモーター配列の下流及び上流にそれぞれ連結された、分断されたＣｒｅ遺伝子とを含む第１核酸構築物及び第２プロモーター配列と、前記第２プロモーター配列の下流に連結された第１ｌｏｘＰ配列と、前記第１ｌｏｘＰ配列の下流に連結されたレポーター遺伝子と、前記レポーター遺伝子の下流に連結された第２ｌｏｘＰ配列を含む第２核酸構築物を対象由来の被検細胞に導入すること、
    前記被検細胞を培養すること、
    前記レポーター遺伝子から発現したタンパク質からの信号を検出すること
    前記検出の結果に基づいて前記被検細胞に含まれるＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率を算出すること、及び
    前記存在率に基づいて前記対象のがんにおける、ＤＮＡ相同組換え機能不全のがんに効果を奏する薬剤効果を予測すること
    を含む、薬剤効果予測方法であって、
    前記分断されたＣｒｅ遺伝子は、不活性化されるようにＣｒｅ遺伝子の塩基配列を欠失なしに２つに切断してなる、２つのＣｒｅ遺伝子断片で構成され、
    前記２つのＣｒｅ遺伝子断片のうち、前記第１プロモーター配列の下流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の上流側の遺伝子断片であり、かつ、前記第１プロモーター配列の上流に連結されたＣｒｅ遺伝子断片は前記Ｃｒｅ遺伝子の下流側の遺伝子断片であり、
    前記第１プロモーター配列の上流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の５’末端には、前記第１プロモーター配列の下流に連結された前記Ｃｒｅ遺伝子断片の３’末端の一部である第１配列と相同な塩基配列を有する第２配列が連結されている、方法。
  15. 前記導入は、前記第１核酸構築物及び前記第２核酸構築物を封入した脂質粒子を前記被検細胞に接触させることにより行われる、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記培養と前記検出とは、ＣＭＯＳイメージセンサ上で行う、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 前記検出の結果から、前記被検細胞のうち前記レポータータンパク質の活性が高い細胞をＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞とし、
    前記ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞の存在率は、次の式（Ｉ）
    存在率＝ＤＮＡ相同性組換え機能不全の細胞数／被検細胞数…式（Ｉ）
    によって算出される、請求項１４～１６の何れか１項に記載の方法。
  18. 前記予測において、前記存在率が高いほど前記薬剤の効果が高いと判定する、請求項１４～１７の何れか１項に記載の方法。
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