JP7595342B2

JP7595342B2 - 抗ストレス用組成物

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Publication number: JP7595342B2
Application number: JP2021015721A
Authority: JP
Inventors: 一豊依田; 方何; 淳豊田
Original assignee: Takanashi Milk Products Co Ltd
Current assignee: Takanashi Milk Products Co Ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2024-12-06
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: JP2022118901A

Description

NPMD

NITE P-03300

特許法第３０条第２項適用公益社団法人日本農芸化学会２０２０年度（令和２年度）大会講演要旨集（オンライン）、表紙、目次、抄録、裏付、大会中止連絡、２０２０年３月５日公開

本発明は、ストレスによって生じる身体の状態変化を改善又は抑制するための組成物に関する。

現代病ともいえる心理的ストレス及び社会的ストレスは、生体において種々の疾患及び症状を引き起こすとされる。特に、これらのストレスは、中枢神経及び脳機能の障害をもたらし得る。

ストレスを要因とする疾患及び症状としては、鬱病、躁病、食欲低下、意欲低下、心身症、不安神経症（パニック障害）、適応障害、気分障害、ＰＴＳＤ（心的外傷後ストレス障害）、ＡＳＤ（急性ストレス障害）、摂食障害、飲水障害、アルコール依存症、薬物依存症、炎症、不眠症、アルツハイマー病、認知障害、記憶障害、言語障害、脳卒中、脳梗塞、パーキンソン病、過敏性腸症候群、胃潰瘍、喘息、アトピー皮膚炎、蕁麻疹、脱毛症、高血圧、生活習慣病、頭痛、リウマチなど、数多く挙げられる。

例えば、ストレスなどに起因した精神的及び神経的な問題により、食事摂取が不安定になること、過活動となりエネルギー消費が亢進することなどにより、体重減少が生じる。特に、児童思春期において鬱病が発現した場合、体重の減少のみならず、期待される体重増加が見られないことがある。非特許文献１には、鬱病患者において、不眠症及び倦怠感の増大とともに、体重及び食欲の著しい低下が見られたことが記載されている。

また、ストレス又は緊張から、喉が渇き、過剰に水分を取り多尿になる症状がみられる疾患を心因性多飲症とよぶ。なかには、飲水量が１日１５Ｌに及ぶ重度の心因性多飲症の臨床知見も得られている。

一方、ストレスにより鬱病、認知症などの疾患が発症する要因の一つに、脳組織などにおける炎症反応が挙げられる。そして、炎症反応には炎症性サイトカインが関与する。炎症性サイトカインとしては、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＬ－１、ＴＮＦ－αなどが挙げられる。このうち、ＩＬ－６は、鬱病、不安症などのストレス関連疾患と関連性があるという報告がある（非特許文献２を参照）。

Psychiatry Journal, Volume 2015, Article ID 575931 Neurobiology of Stress 4 (2016) 15-22

上記したように、ストレスによって、身体及び行動などにおいて外面的に異常を来す場合もあれば、神経組織学的及び精神的な内面的な異常が生じる場合がある。

そこで、ストレスによる外面的な異常及び内面的な異常の両方の異常を改善し得る有効成分があれば、ストレスによる心身の異常を改善することができる。しかし、これまでにこのような有効成分についてほとんど知られていない。

そこで、本発明は、ストレスによる外面的な異常及び内面的な異常の両方の異常を改善し得る有効成分を含む組成物を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、種々の生理活性成分について、ストレスによる心身の異常への改善作用を確認すべく試行錯誤した結果、驚くべきことに、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）は、摂食量の低下を抑制する作用、体重増加の抑制を緩和する作用、飲水量の増加を抑制する作用といったストレスによる外面的な異常を改善する作用とともに、炎症性サイトカインの増加を抑制する作用といったストレスによる内面的な異常を改善する作用を有することを見出した。そして、このような知見を基に、本発明者らは遂に、本発明の課題を解決し得るものとして、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びその成分を有効成分として含む、抗ストレス用組成物などを創作することに成功した。本発明は、本発明者らによって初めて見出された知見及び成功例に基づいて完成されたものである。

従って、本発明によれば、以下の各態様の組成物及び方法が提供される。
［１］ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、抗ストレス用組成物。
［２］ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、抗鬱用組成物又は抗不安用組成物。
［３］ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、体重減少、多飲、摂食障害及び炎症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患及び／又は症状を改善又は抑制するための組成物。
［４］前記疾患及び症状は、ストレスに起因する疾患及び症状である、［３］に記載の組成物。
［５］ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、インターロイキン－６産生抑制用組成物又はＴＮＦ－α産生抑制用組成物。
［６］前記ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、受託番号がＮＩＴＥＰ－０３３００であるビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の組成物。

本発明によれば、有効成分によるストレスに起因する疾患及び症状の改善作用を通じて、生物個体に対してストレスによる心身の異常を改善又は抑制し、心身ともに健康な状態を達成することが期待される。

図１Ａは、受託番号ＮＩＴＥＰ－０３３００（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株）の受託証の写しである。図１Ｂは、受託番号ＮＩＴＥＰ－０３３００（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株）の生存に関する証明書の写しである。図２は、ｓＣＳＤＳモデルの概要を試験計画とともに模式的に表した図である。図３は、社会性行動試験に使用したオープンフィールドにおけるケージを模式的に表した図である。図４は、後述する実施例に記載があるとおりの、増体量の測定結果を示した図である。図５は、後述する実施例に記載があるとおりの、飲水量の測定結果を示した図である。図６は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＩＬ－６の測定結果を示した図である。

以下、本発明の各態様について詳細に説明するが、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、食品、医薬品、化粧品などの分野における当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。

「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の成分が組み合わさってなる物である。
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。

「抗ストレス作用」は、ストレスに曝されることによって生じる、外面的な異常及び内面的な異常からなる群から選ばれる少なくとも１種の異常を改善又は抑制することをいう。なお、異常な状態を「改善又は抑制すること」は、異常な状態を健常な状態とすること、異常な状態を健常な状態に近付けること、健常な状態を維持すること、及び健常な状態から異常な状態になるのを緩和乃至妨げることを包含する。
「抗鬱作用」及び「抗不安作用」は、それぞれ鬱症状及び不安症状を改善又は抑制することをいう。なお、鬱症状には、日本うつ病学会治療ガイドラン「ＩＩ．うつ病（ＤＳＭ－５）／大うつ病性障害２０１６」に記載されているうつ病の症状などが挙げられる。鬱症状には意欲の低下、気分障害なども含まれる。
「体重減少」、「多飲」、「摂食障害」及び「炎症」について、体重減少は体重が減少すること及び期待される体重増加が見られないことを包含し；多飲は飲水の量及び回数が多いこと並びに尿の量及び回数が多いことを包含し；摂食障害は摂食の量及び回数が少ないことを包含し；炎症は細胞学的かつ組織学的所見により炎症が確認されること及び炎症性サイトカインの量が増大することを包含する。これらについては、ストレスに起因しないものであってもよいが、ストレスに起因するものであることが好ましい。
「インターロイキン－６産生抑制作用」は、インターロイキン（ＩＬ）－６の量を減じること、ＩＬ－６の産生増加を抑制すること、及びＩＬ－６の量を維持することを包含する。ある有効成分について、インターロイキン－６産生抑制作用を有するか否かの評価は、後述する実施例に記載の方法によって試験及びＩＬ－６を測定することにより評価できる。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む。そして、本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、有効成分を含むことにより、抗ストレス作用を発揮する。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物が有する抗ストレス作用は、後述する実施例に記載があるとおりに、本発明の一態様の抗ストレス用組成物をＢ６マウスに少なくとも３日間適用した場合に、本発明の一態様の抗ストレス用組成物を適用しない場合と比べて、ストレスによる、体重への影響を低減すること、飲水量の増加を抑制すること、摂食量の低下を抑制すること、並びにＩＬ－６及びＴＮＦ－αの増加を抑制することからなる群から選ばれる少なくとも１種のストレスによる異常の改善又は抑制を評価することにより確認することができる。

ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムに分類される微生物であればよい。ビフィドバクテリウム・ビフィダムを入手する方法は特に限定されないが、例えば、市販又は寄託されているものを利用する方法、天然又は市販の乳製品などから分離して利用する方法などが挙げられる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムの寄託されているものとしては、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株（寄託番号：ＮＩＴＥＰ－０３３００）などがある。ＴＭＣ３１１５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室）から入手することができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムとしては、優れた抗ストレス作用を有することから、ＴＭＣ３１１５株が好ましい。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、いずれか１種の株を単独で、又は２種以上の株を組み合わせて使用できる。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物における有効成分は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムそれ自体、すなわち、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体に加えて、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体成分及びビフィドバクテリウム・ビフィダムの培養物であってもよい。また、本発明の一態様の抗ストレス用組成物における有効成分は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び／又は培養物を処理したものであってもよい。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体は、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの培養物を遠心分離などの通常知られている固液分離手段を用いて培地を除去することにより得られる菌体などが挙げられる。菌体成分は、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体内に存在する、又は菌体外に分泌する精製又は非精製の成分などが挙げられる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムの培養物は、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムを培養して得た培養液そのものなどが挙げられる。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物は、それらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物を入手する方法は特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体を入手する方法としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの増殖に適した培地、好ましくは改変ＦＧ培地に植菌し、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの増殖に適した温度、好ましくは約３７℃にて、数時間～数十時間、好ましくは１８時間～３０時間、嫌気培養することにより、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの培養物を得て、次いで遠心分離などの通常の菌体回収手段を用いて菌体を回収する方法などが挙げられる。ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体成分は、例えば、細胞外の成分については菌体回収後の培養物（培養液）から入手することができ、細胞内の成分については回収した菌体をホモジナイズすることなどにより菌体を破砕することにより入手することができる。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物の処理物としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体の乾燥処理物などが挙げられ、安定した抗ストレス作用を得るという観点から、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの凍結乾燥処理物であることが好ましい。凍結乾燥処理の条件は、微生物の凍結乾燥粉末が得られるような、通常の微生物の凍結乾燥処理の条件であればよい。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムは食経験があり、安全性が確認されていることから、本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、実用性が高く、そのままで、又は加工することにより、経口的又は非経口的な形態で種々の用途に適用可能である。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内などへ投与することによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物を適用する生物個体は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。生物個体は、健常な個体であってもよいが、現にストレスを受けている個体、ストレスを受け易い個体及びストレスによる異常が発現する危険性のある個体であることが好ましい。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、抗ストレス作用を有する限り、用途に応じて、その他の成分を含む。このように、本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、有効成分に加えて、本発明の目的を達成し得る限り、種々のその他の成分を含み得る。その他の成分の含有量は、本発明の課題解決を妨げない限り、当業者により適宜設定し得る。

その他の成分は特に限定されないが、例えば、本発明の一態様の抗ストレス用組成物を飲食品用組成物として用いる場合は、食品及び調味料に使用される成分などが挙げられ、具体的には、ヨーグルト、ドリンクヨーグルトなどの発酵乳、乳飲料、アイスクリーム類、乳等を主要原料とする食品などの乳製品が挙げられる。また、固形成分としては、食塩、糖類（砂糖、ぶどう糖、果糖、水飴、異性化液糖など）、穀類成分（パン粉、小麦粉、オートミールなど）、香辛料（生姜、唐辛子、こしょう、バジル、オレガノ、ジンジャー、ミックススパイスなど）、増粘剤（カラギーナンなどの増粘多糖類、でん粉、加工でん粉、ガム類など）、食肉加工成分（チキンパウダー、ミートパウダー、フィッシュパウダーなど）、化学調味料（グルタミン酸ナトリウム、グリシン、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウムなど）、フレーバー、味噌、カレー粉などが挙げられ；液体成分としては、水、アルコール、甘味成分（みりん、液糖、水飴など）、酸味成分（食酢、りんご、ゆず、レモンといった香酸柑橘など）、油脂成分（ごま油、オリーブオイル、サラダ油、大豆油、ラー油、バター、牛脂、ラードなど）、酒類成分（ワイン、清酒など）、果汁（りんご果汁など）などが挙げられる。この場合、その他の成分は、魚介類エキス、海藻エキス、肉エキス、野菜エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物などのエキス；魚節類、海藻類、キノコ類などを、熱水、エタノールなどの溶媒で抽出して得られるダシ汁；野菜類、香辛野菜類、キノコ類、果実類、肉類、魚介類、海藻類などの食材であってもよい。

また、その他の成分は、例えば、本発明の一態様の抗ストレス用組成物を化粧品用組成物又は医薬品用組成物として用いる場合は、通常の化粧品及び医薬品に使用される成分などが挙げられ、具体的には水などの基剤、油性成分、保湿剤、清涼剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、増粘剤、美白剤、乳化剤、ビタミン類、その他各種薬効成分、粉体、香料、色材、賦形剤、結合剤、滑沢剤などが挙げられる。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態をとり得る。

有効成分の含有量は、抗ストレス作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、組成物の全体量に対して、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１．０×１０^５ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^１０ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１．０×１０^６ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^９ＣＦＵ／ｇであり；又は０．０１質量％～９９．９質量％、好ましくは０．０５質量％～９９質量％、より好ましくは０．１質量％～９０質量％である。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物の１回の使用量、１日の使用量、使用期間、使用間隔などの用法及び用量は特に限定されず、使用態様、適用する生物個体の状態などに応じて適宜設定され得る。

１回の使用量は、例えば、有効成分の使用量が、好ましくは０．０１ｍｇ～１０，０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ～１，０００ｍｇ、さらに好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇになるような量である。１日の使用量は、生物個体の症状及び体格に合わせて適宜設定すればよいが、例えば、１００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日～１０ｇ／体重６０ｋｇ／日であることが好ましい。

使用間隔は、例えば、１日に１回、２回、３回又は数回を、一定期間、すなわち１日以上、好ましくは２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、１週間以上、２週間以上、１ヶ月以上、６ヶ月以上又は１年以上にわたって継続的に適用することなどが挙げられる。本発明の一態様の抗ストレス用組成物の適用は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に適用する限り、本発明の一態様の抗ストレス用組成物を毎日適用しなくてもよい。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、それ自体単独で、又は飲食品、化粧品、医薬品などに添加して使用することができる。本発明の具体的な態様は、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品；乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品；化粧品；医薬品；医薬部外品；動物飼料；及びこれらの製品を製造するための原料などである。

本発明の一態様の抗ストレス用組成物は、容器に詰めて密封した容器詰組成物とすることができる。容器は特に限定されないが、例えば、アルミなどの金属、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、１層又は積層（ラミネート）のフィルム、ガラスなどを素材とするパウチ、小袋、ボトル、缶、瓶などの包装容器が挙げられる。容器詰組成物は、製造して得られた抗ストレス用組成物を、分注、充填及び／又は個装して、それ自体で独立して、流通におかれて市販され得るものであることが好ましい。

ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、ストレスを受けることによる様々な身体及び精神に対する外面的及び内面的な異常を改善又は抑制することができる。ストレスを受けることにより、鬱症状及び不安症状が発現することはよく知られている。そこで、本発明の別の一態様は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、抗鬱用組成物及び抗不安用組成物である。

ストレスに曝されると、及びストレスを受けて鬱症状及び不安症状を発現するようになると、認知障害、記憶障害、アルツハイマー病、言語障害、脳卒中、脳梗塞といった脳機能障害に関連する疾患及び症状を発症することがこれまでに知られている。そこで、本発明の一態様の組成物は、抗ストレス作用、抗鬱作用及び抗不安作用を有することにより、脳機能障害に関連する疾患及び症状を改善又は抑制するために用いることができる。

後述する実施例に記載のとおり、ストレスを受けた生物個体は、期待される体重の増加が抑制されること、飲水量が増加すること、摂食量が低下すること、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αといった炎症性サイトカインが増加することといった異常が発現する。それに対して、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、これらの異常を改善又は抑制することができる。そこで、本発明の別の一態様は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、体重減少、多飲、摂食障害及び炎症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患及び症状を改善又は抑制するための組成物である。これらの疾患及び症状は、ストレスとの関係性については特に限定されないが、ストレスに起因する疾患及び症状であることが好ましい。

また、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６及びＴＮＦ－αの産生を抑制することができ、特にＩＬ－６の産生抑制作用は顕著である。そこで、本発明の別の一態様は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、インターロイキン－６産生抑制用組成物及びＴＮＦ－α産生抑制用組成物である。

本発明の一態様の組成物の製造方法は特に限定されないが、例えば、有効成分とその他の成分とを混合すること、及び得られた混合物を所望の形態に成形することを含む方法などが挙げられる。

本発明の別の一態様は、有効成分又は該有効成分を含む組成物を生物個体に適用することにより、ストレスに曝されることによって生じる、外面的な異常及び内面的な異常からなる群から選ばれる少なくとも１種の異常を改善又は抑制する方法、鬱症状及び不安症状を改善又は抑制する方法、体重減少、多飲、摂食障害及び炎症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患及び症状を改善又は抑制する方法、インターロイキン－６及びＴＮＦ－αの産生を抑制する方法である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

１．試験材料
（１－１）菌株
ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ＴＭＣ３１１５株（以下、単にＴＭＣ３１１５とよぶ。）は、本願出願人である高梨乳業株式会社の微生物コレクション（ＴａｋａｎａｓｈｉＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保存されているものを使用した。なお、ＴＭＣ３１１５は、微生物の識別の表示を「ＴＭＣ３１１５」とし、かつ、受託番号を「ＮＩＴＥＰ－０３３００」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０２０年１０月６日付けの受託日により寄託されている。受託証の写しを図１Ａに示し、生存に関する証明書を図１Ｂに示す。

ＴＭＣ３１１５は、改変ＦＧ培地（グルコース３質量％、ペプトン３質量％、酵母エキス０．５質量％、酢酸ナトリウム０．５質量％、リン酸水素二アンモニウム０．２質量％、リン酸水素二カリウム０．２質量％、硫酸マグネシウム０．０５質量％、ポリソルベート８００．１質量％、水残部）を用い、３７℃、１８時間の条件にて、嫌気培養した。培養後の培養液を、遠心分離処理（８，０００ｇ、８分、４℃）に供して菌体を回収し、滅菌水で２回洗浄した。洗浄後の菌体を凍結乾燥し、使用時まで－８０℃で保管した。凍結乾燥菌体粉末の生菌数は、１×１０^１０ＣＦＵ／ｇであった。

（１－２）マウス
７週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ（Ｂ６）マウスは日本クレア社から購入し、繁殖リタイアの雄のＩＣＲマウスは日本エスエルシー社からそれぞれ購入した。

マウスを、一頭毎に、木製床敷きを敷いたケージに入れ、１２時間の明暗周期で管理した飼育室にて、水及び餌を自由摂取できる環境で飼育した。

Ｂ６マウスには、ＡＩＮ－９３Ｇ飼料（粉末タイプ；オリエンタル酵母工業社製）（以下、標準飼料とよぶ。）又はＡＩＮ－９３Ｇ２．４ｇに対してＴＭＣ３１１５凍結乾燥菌体粉末１０ｍｇを混合した被験飼料（４．２×１０^８ＣＦＵ／ｇ）をローデンカフェに入れて給餌した。餌は毎日交換した。

ＩＣＲマウスには、ＭＦ飼料（ペレットタイプ；オリエンタル酵母工業社製）を通常の餌入れで給餌した。

Ｂ６マウスの体重、摂餌量及び飲水量は毎日測定した。また、購入後、飼育環境に慣らすために１週間馴致した。

２．試験方法
（２－１）ｓＣＳＤＳモデル
馴致終了時の体重に基づき、Ｂ６マウスを、ストレス無対照群（非ストレス負荷；ｎ＝１５）、ストレス有対照群（ストレス負荷；ｎ＝２４）及びＴＭＣ３１１５群（ｎ＝２５）の３群に分けた。全試験期間（事前投与期間１０日間（Ｄａｙ０－９）、ストレス負荷期間１０日間（Ｄａｙ１０－１９）、行動試験１日間（Ｄａｙ２０）及び試験終了日（Ｄａｙ２１））を通して、両対照群にはＡＩＮ－９３Ｇである標準飼料を与え、ＴＭＣ３１１５群にはＡＩＮ－９３ＧにＴＭＣ３１１５凍結乾燥菌体粉末を混合した被験飼料を与えた。

マウスに対するストレス負荷は、亜慢性社会的敗北ストレス（ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃａｎｄｍｉｌｄｓｏｃｉａｌｄｅｆｅａｔｓｔｒｅｓｓ；ｓＣＳＤＳ）（後藤ら、２０１４; Goto T, Kubota Y, Tanaka Y, Iio W, Moriya N, Toyoda A, "Subchronic and mild social defeat stress accelerates food intake and body weight gain with polydipsia-like features in mice.", Behav Brain Res 270:339-348（2014））モデルで実施した。ｓＣＳＤＳモデルの概要を試験計画とともに模式的に表したものを図２とした。概要として、ｓＣＳＤＳモデルは、あらかじめ選抜した攻撃性の高い居住者（ＩＣＲマウス）のケージに、侵入者としてＢ６マウスを入れ、居住者のＩＣＲマウスに一定時間、Ｂ６マウスを直接的に攻撃させる試験モデルである。

ストレス有対照群及びＴＭＣ３１１５群のＢ６マウスについて、ストレス負荷期間を１０日間とし、直接攻撃の時間は、初日は５分間、その後は毎日３０秒ずつ減らした時間とした。直接攻撃の後、１日の残りの時間は、ＩＣＲマウスとＢ６マウスとを小さい孔の開いた透明アクリル板の仕切りで隔離した。これにより、Ｂ６マウスは、ＩＣＲマウスからの直接的な攻撃は受けないが、攻撃を受けたＩＣＲマウスの姿及び匂いなどの感覚的な刺激に曝された。各Ｂ６マウスに刺激を与えるＩＣＲマウスは毎日交換して、日々異なるＩＣＲマウスからの直接攻撃及び間接的な刺激を１０日間暴露させることにより、各試験群のＢ６マウスにストレスを負荷した。

ストレス無対照群のＢ６マウスは、同じケージを上記と同様のアクリル板で仕切り、その両側に１頭ずつ飼育した。したがって、ストレス無対照群のＢ６マウスはＩＣＲマウスからの直接攻撃及び間接的な刺激に曝されなかった。

（２－２）社会性行動試験（Ｓｏｃｉａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｔｅｓｔ）
１０日間のｓＣＳＤＳモデルによるストレス負荷が終了した翌日（Ｄａｙ２０）に、社会性行動試験を実施した。オープンフィールド（縦４００ｍｍ、横４００ｍｍ、高さ３００ｍｍの蓋の無いボックス）の一方の壁の中央付近に金網を張ったプラスチック製のケージ（縦１００ｍｍ、横１００ｍｍ、高さ１３０ｍｍ）を設置した。ケージの周り約７ｃｍの範囲を社交ゾーンと定義した。また、ケージを設置した壁と反対側の壁における角部２箇所をコーナーゾーンと定義した。オープンフィールドにおけるケージ、社交ゾーン及びコーナーゾーンの関係を模式的に図示したものを図３とした。

まず、ケージにＩＣＲマウスを入れずに、各試験群のＢ６マウスをコーナーゾーンからオープンフィールド内へ放し、２分３０秒間、自由に探索させた。探索後、一度マウスを回収し、臭いなどを消すために消毒用エタノールでオープンフィールド内を清浄な空間となるように清掃した。

次いで、ＩＣＲマウスをケージに入れ、再度同じＢ６マウスをコーナーゾーンからオープンフィールド内へ放して探索させた。ＩＣＲマウスが存在しない際の社交ゾーン滞在時間に対して、ＩＣＲマウス存在時の社交ゾーン滞在時間を社会性スコアとした。ＩＣＲマウスの不存在時の社交ゾーン滞在時間とＩＣＲマウス存在時の社交ゾーン滞在時間が等しい場合は社会性スコアを１００とした。社会性スコアが１００％未満（社会性スコアが１００未満）の場合をストレス感受性個体とした。一方で、社会性スコアが１００以上の個体はストレス耐性個体（「レジリエント」）とした。

（２－３）血清中の炎症性サイトカイン濃度の測定
腹部大静脈より採血するために、社会性行動試験の翌日（Ｄａｙ２１）のＢ６マウスを解剖した。具体的には、Ｂ６マウスを解剖３時間前に絶食させ、３％イソフルランで麻酔した後に、開腹することにより、腹部大静脈から血液を採取した。

採取した血液を、３７℃で２０分間保温した後、４℃で２時間静置して冷却した。冷却後の血液を遠心分離（１，０００ｇ、１５分間、４℃）によって血清を分離及び回収した。血清は分析するまで－８０℃で保管した。

血清中のインターロイキン６（ＩＬ－６）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）の濃度は、それぞれに対応するＥＬＩＳＡキット（ＩＬ－６については＃ＢＭＳ６０７ＨＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；ＴＮＦ－αについては＃ＢＭＳ６０３ＨＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、キットのマニュアルに従って測定した。

（２－４）統計解析
増体量（試験開始時からの体重の変化量）、摂餌量及び飲水量は、繰り返しのある二元配置分散分析を行った。３群間の群間比較はＴｕｋｅｙ－ＨＳＤ検定を行い、Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。

３．試験結果及び評価
増体量の測定結果を図４に示す。図４に示すとおり、増体量は、ストレス期間において、ストレス有対照群は、ストレス無対照群及びＴＭＣ３１１５群と比べて有意に低下した。しかし、ＴＭＣ３１１５群では増体量の低下が抑制され、ストレス無対照群と有意差はなかった。このことより、ＴＭＣ３１１５には、ストレスによる体重への影響を低減する作用を有することがわかった。

飲水量の測定結果を図５に示す。図５に示すとおり、飲水量は、ストレス期間において、ストレス有対照群は、ストレス無対照群と比べて有意に増加した。しかし、ＴＭＣ３１１５群では、飲水量の増加が抑制された。このことより、ＴＭＣ３１１５には、ストレスによる飲水量の増加を抑制する作用を有することがわかった。

摂餌量について、ストレス期間の平均摂餌量は、ストレス無対照群は３．１３ｇ、ストレス有対照群は３．０４ｇ及びＴＭＣ３１１５群は３．１１ｇであった。統計解析の結果から、ストレス有対照群は、ストレス無対照群と比べて有意に低下した。しかし、ＴＭＣ３１１５群はストレス無対照群に対して有意差はなかった。このことより、ＴＭＣ３１１５には、ストレスによる摂食量の低下を抑制する作用を有することがわかった。

社会性スコアの測定結果を表１に示す。表１に示すとおり、ストレス有対照群は、ストレス無対照群と比べて、ストレス感受性個体の割合が大きかった。しかし、ＴＭＣ３１１５群は、ストレス感受性個体の割合がストレス無対照群と同程度までに少なかった。このことより、ＴＭＣ３１１５には、社会性スコアの改善作用及びストレス耐性作用を有することがわかった。

ＩＬ－６の測定結果を図６に示す。図６に示すとおり、ＩＬ－６は、ストレス有対照群は、ストレス無対照群及びＴＭＣ３１１５群と比べて有意に増加した。しかし、ＴＭＣ３１１５群ではＩＬ－６の増加が抑制され、ストレス無対照群と有意差はなかった。このことより、ＴＭＣ３１１５には、ストレスによるＩＬ－６の増加を抑制する作用を有することがわかった。

ＴＮＦ－αの測定結果を表２に示す。表２に示すとおり、ストレス無対照群に比べて、ストレス有対照群及びＴＭＣ３１１５群のＴＮＦ－αは増加した。しかし、ＴＭＣ３１１５群は、ストレス有対照群に比べて、ＴＮＦ－αの増加が僅かに抑制された。このことより、ＴＭＣ３１１５には、ＴＮＦ－αの増加を抑制する作用を有することがわかった。

本発明の一態様の組成物は、経口的及び非経口的のいずれの態様においても適用可能な有効成分を含むものであり、ストレスによる、体重への影響を低減する作用、飲水量の増加を抑制する作用、摂食量の低下を抑制する作用、炎症性サイトカインの増加を抑制する作用を通じて抗ストレス活性、抗鬱活性、抗不安活性、抗意欲低下活性、抗気分障害活性を期待する生物個体、さらには中枢神経機能の改善、脳機能の改善を期待する生物個体にとって有用なものであり、このような生物個体の健康及び福祉に資する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして利用可能なものである。

Claims

受託番号がＮＩＴＥＰ－０３３００であるビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ＴＭＣ３１１５株のみからなる菌体の凍結乾燥粉末の有効成分を含む、抗ストレス用組成物。
受託番号がＮＩＴＥＰ－０３３００であるビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株のみからなる菌体の凍結乾燥粉末の有効成分を含む、抗鬱用組成物又は抗不安用組成物。
受託番号がＮＩＴＥＰ－０３３００であるビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株のみからなる菌体の凍結乾燥粉末の有効成分を含む、体重減少、多飲、摂食障害及び炎症からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患及び／又は症状を改善又は抑制するための組成物。
前記疾患及び症状は、ストレスに起因する疾患及び症状である、請求項３に記載の組成物。
受託番号がＮＩＴＥＰ－０３３００であるビフィドバクテリウム・ビフィダムＴＭＣ３１１５株のみからなる菌体の凍結乾燥粉末の有効成分を含む、インターロイキン－６産生抑制用組成物又はＴＮＦ－α産生抑制用組成物。