JP7601904B2 - 医療用三次元スキャフォールドを調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、医薬品または化粧品の生体材料として使用するための三次元スキャフォールドを調製する方法に関する。スキャフォールドは、ポリラクチドまたはポリ乳酸ポリマーもしくはコポリマー（一般にＰＬＡと表記される）とコラーゲンとから構成される。本方法は、ｉ）１組の生体力学的特徴、ｉｉ）安定性、およびｉｉｉ）純度に関する所望の特性を有するスキャフォールドの調製を可能にする工程を含む。さらに、本方法は、使用される成分、すなわちＰＬＡおよびコラーゲンの著しい分解をもたらし得る工程を含まない、または得られたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの著しい分解をもたらし得る工程を含まない。さらに、滅菌工程が、スキャフォールドにある特定の生体力学的特性を付与することが予想外に示された。

組織代替物と再生プラットフォームを開発する必要性は、現代の組織工学において、最も要求が高く、挑戦しがいのある適用の１つである。三次元生体材料構造（スキャフォールド）は非常に望ましく、組織の生体力学的特性に一致し、ｉｎ ｖｉｖｏの挙動を厳密に模倣する（細胞の接着、成長および組織形成を促進する）。このような生体材料は通常、身体が損傷した組織を再構築するのを助け、最終的には関連する疼痛と治癒時間を最小限にする。特に荷重適応特性が必要な組織では、スキャフォールドの静的および動的生体力学的特性の組合せが、治療の最終的な成功にとって非常に重要である。スキャフォールドの開発のあらゆる進歩は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件と予想されるｉｎ ｖｉｖｏ組織再生との間に高い相関関係を確実にするはずである。スキャフォールドの非毒性生分解は、適切な期間にわたってストレスを新しい成長組織に徐々に伝達するはずである。正しい機械的刺激の相乗効果は、スキャフォールド材料、その意図された生物学的環境および細胞の存在に大きく依存する。

生物医学スキャフォールドの最も困難な適用の１つは、関節軟骨（ＡＣ）修復である。ＡＣの損傷と退化は、年齢、肥満または全身性疾患によるだけでなく、怪我などの身体的原因により、若くて活動的な集団でも進行している。治療しなければ、これらの欠損は変形性関節症（ＯＡ）に進行する可能性があり、世界中で２億４０００万を超える人が罹患している。軟骨の全層欠損の自然な創傷治癒は、しばしば線維軟骨の形成をもたらし、これは元の硝子軟骨よりも機能的および生体力学的に劣っており、組織をさらに悪化させ、関節の変形性関節症の変化を起こしやすくする。始まってしまった悪循環は、最終的に全体的または部分的な関節置換術を必要とする。したがって、軟骨を再生する能力を有する生体材料溶液は、ＯＡの発現前の初期段階で軟骨病変を治療するために非常に望ましい。

臨床的に使用される生体材料には、様々な天然由来および合成材料が含まれる。動物由来の材料（異種移植片）の適用では、汚染および望ましくない免疫応答などのある特定のリスクが含まれているが、天然材料の利点は目的のために自然な実現可能性である。これは、異物反応または過敏反応を引き起こさない合成材料を使用することによって回避することができる。合成材料は、生物学的により有利で生体適合性にすることができる。一方、天然由来の材料と比較して、合成ポリマーは通常、細胞の接着、増殖および組織回復を促進する望ましい固有の生物学的手がかりを欠いている。しかし、いかなる生体材料も、臨床使用および「精密な医療」ソリューションを目指す目的について評価し最適化することは常に困難である。現在、生体材料および組織工学的構築物の機械的機能を評価するための現在のレベルはまだまだ不十分であることが広く予想されている。

繊維起源の合成材料は、ＡＣ修復用途によく使用される。これらのスキャフォールドは７５～８５％の多孔度を有している。

ＡＣの構造、機能および生体力学的挙動は非常に複雑で、異方性が高く、時間と荷重履歴とに依存する。関節軟骨は、多成分マトリックスに囲まれた比較的少数の軟骨細胞で構成されており、７０～８５％の水と残りのプロテオグリカン（グリコサミノグリカンがボトルブラシのような構造として結合したタンパク質）とコラーゲンとの複合体として画像化することができる。プロテオグリカンと水分濃度とは、軟骨組織の深さによって異なる。

血液供給とリンパドレナージがなければ、関節軟骨は孤立したままになり、他の結合組織の創傷治癒反応を事実上欠いている。生体力学的異常への組織の高い曝露は、軟骨病変の発生率レベルを高くする。このような病変は、外傷性または長期の非生理学的負荷に起因して、変形性関節症（ＯＡ）に発展することが多い。ＯＡは世界で筋骨格系疾患の最大の原因であり、発生率は西洋人口の７～１０％である。新たに診断された患者のＯＡの推定費用は年間６，８００ドルであるため、ＯＡを１０年延期すると、患者あたり６８，０００ドルの費用節約につながる。ＥＵにおけるＯＡの支出は、年間約１５０～２００億である。従来はＯＡの治療には適応されていないが、軟骨修復は、関節置換術の必要性を遅らせたり回避したりすることを期待して、変性疾患の進行を変える可能性があるため、関心が高まっている。

重大な罹患率と障害の可能性に加えて、軟骨の外傷と変性も大きな経済的影響を及ぼす。軟骨病変の年間発生率は人口１０万人あたり２３人であると推定すると、ＥＵでは、修復治療を必要とする膝の軟骨欠損を有する患者が１０万人以上いる。軟骨の病状の有病率は、高齢化と肥満率の増加により、今後数十年で急速に増加すると予想される；膝関節置換術の需要は、２０３０年までに大幅に増加することが予測されている。

一方、症候性軟骨病変を有する若年患者は、高い機能的要求と限られた治療選択肢の組合せのために、やりがいのある集団を表している。関節軟骨修復治療の目的は、自然の硝子軟骨と見分けがつかない修復組織構造で関節の正常な機能を回復および維持することである。しかし、軟骨病変に対する現在の修復技術は不十分であり、開発が必要である。

外科的修復後、修復部位の生体力学的特性は弱まり、術後負荷を減らす必要がある。したがって、機械的刺激の欠如は、組織の代謝回転と治癒を遅らせると予想される；したがって、回復時間は長いままである。上記のように、生体材料スキャフォールドは、治癒病変に構造的支持を提供して、早期の荷重負荷を可能にし、したがって治癒プロセスを強化することができる。軟骨修復のために、天然および合成の両方の多種多様な三次元スキャフォールドが導入されている。

本発明の文脈に特に関心のあるスキャフォールドの１つのタイプは、一般にＰＬＡと表記されるポリラクチドポリマーまたはコポリマーから作製されるスキャフォールドである。このようなスキャフォールドは、いくつかの刊行物の主題になっている：

ＰＬＡスキャフォールドについては、例えば、非特許文献１に記載されている。ガンマ線照射されたＰＬＡスキャフォールドを組換えヒトＩＩ型コラーゲンの溶液に浸漬してｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドを得、このスキャフォールドを、膜誘発自家軟骨細胞移植（ＭＡＣＩ）術を用いたブタ研究で試験した。結果は、市販の膜（Ｃｈｏｎｄｒｏ－Ｇｉｄｅ（登録商標））を使用したＭＡＣＩ処置群と、無処置の対照群と比較された。両処置群とも対照群と比較して改善を示したが、その差は統計学的に有意ではなかった。いくつかのｒｈＣｏ－ＰＬＡ処置病変において、機械的特性、ならびに修復組織構造は、健康な軟骨の特性と極めてよく似ていた。

非特許文献２は、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドを得るために、組換えヒトコラーゲンＩＩＩの溶液をドープした滅菌ＰＬＡスキャフォールドに関する。ＰＬＡとｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの２種類のスキャフォールドが比較された：２つのスキャフォールドタイプの生体力学的比較の結果は、コラーゲン添加と培地組成の両方がスキャフォールドの弾性、粘弾性および非弾性特性をどのように変化させるかを示した。本研究では、Ｍｕｈｏｎｅｎらの研究によるｉｎ ｖｉｖｏ軟骨修復スコアの分析を、マルコフ連鎖モンテカルロサンプリングの一形態であるＢＵＧＳ－Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｕｓｉｎｇ Ｇｉｂｂｓ Ｓａｍｐｌｉｎｇを使用して追加的に実施した。正規化されたＩＣＲＳ（国際軟骨修復学会）スコアの合計の正規分布またはポアソン分布を使用した結果は、ｒｈＣｏ－ＰＬＡが統計的に有意により高い平均スコア（０．５１５）を有することを示し、それに対して市販のスキャフォールドは０．３８、自然治癒対照群は０．２８８であった。

非特許文献３は、生体材料スキャフォールドと組み合わせた細胞療法に関する。使用した実験的スキャフォールドタイプは、組換えヒトコラーゲンＩＩまたはＩＩＩの溶液に滅菌ＰＬＡスキャフォールドを浸漬することによって調製された組換えヒトコラーゲン－ポリラクチド（ｒｈＣｏ－ＰＬＡ）に基づいていた。対照スキャフォールドタイプは、ブタ由来のＩ／ＩＩＩ型コラーゲンから製造された市販のＣｈｏｎｄｒｏ－Ｇｉｄｅ（登録商標）膜であった。その結果、ＩＩ型コラーゲンは間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の増殖を促進するが、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドに使用されているコラーゲンタイプはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養中のＭＳＣ分化に影響しないこと、ＭＳＣの軟骨形成分化はｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドおよび市販のコラーゲン膜の細胞肥大を導くことが示された。しかし、肥大はＭＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ軟骨形成における一般的な現象であるのに対し、ｉｎ ｖｉｖｏの関節軟骨欠損におけるＭＳＣは肥大マーカーのアップレギュレーションを示さないため、静的細胞培養の限界が結果に影響を与えた可能性があると言われた。関節では、細胞は関節に栄養素の流れと分化の手がかりを提供する周期的な機械的負荷を受けている。

特許文献１（ヘルシンキ大学ら）は、ポリマーの滅菌フェルトをコラーゲンの溶液に浸漬することによって得られる三次元材料に関する。このポリマーはＰＬＡであってもよい。このようなスキャフォールドは、ウシＩ型コラーゲンまたは組換えヒトＩＩ型コラーゲンを含むスキャフォールドと比較して、保持性／剛性が改善されたことが示されている。ｒｈＣｏ－ＰＬＡは、ブタから抽出した２層の親水性コラーゲンタイプＩ／ＩＩＩ膜であるＣｈｏｎｄｒｏ－Ｇｉｄｅ（登録商標）スキャフォールドと比較して、ブタの右膝に移植した後、治癒４か月後により良好な性能を示した。

しかしながら、望ましい特性を有し、なお安全で無菌である、費用効果が高い、安全で信頼性の高いスキャフォールドが明らかに必要である。さらに、そのようなスキャフォールドが軟骨修復だけでなく、ヒトおよび獣医師の使用を含む医学または化粧品全般において一般的な有用性を有するならば有利である。

ＷＯ２０１６／０４２２１１

Ｍｕｈｏｎｅｎら、Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＤＯＩ １０．１００２／ｊｏｒ ２３０９９、２０１５にオンライン発行 Ｇａｓｉｋら、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第６巻、２０１８年１１月 Ｓａｌｏｎｉｕｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１９

本発明は、医療用の滅菌スキャフォールドを調製する方法であって、以下の工程：
ｉ）ポリラクチドまたはコポリマー（一般にＰＬＡと表記される）の繊維を含む繊維メッシュにコラーゲンを充填してＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥する工程、
ｉｉｉ）乾燥する工程ｉｉ）から得られたＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを滅菌して、滅菌スキャフォールドを得る工程を含む、方法に関する。

調製中、ＰＬＡ、コラーゲンおよびＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの不必要な分解を避けるための対策が講じられる。したがって、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの滅菌する工程は、スキャフォールドにいかなる温度上昇も与えない、または少なくともわずかな温度上昇しか与えずに実施される。これは、例えば、滅菌方法の選択および／または温度上昇を避けるために特別な予防措置を講じることによって行うことができる。さらに、本明細書の実施例３に示すように、滅菌スキャフォールドは、非滅菌スキャフォールドと比較して生体力学的特性が改善されており、これにより、無菌条件下で調製されたスキャフォールドと比較して生体力学的特性も改善されている。

本発明の方法に用いられる繊維メッシュは、
ｉ）ＰＬＡを固体形態で準備すること、
ｉｉ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得ること、および
ｉｉｉ）得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得ること、によって得ることができる。

ＰＬＡの繊維は、公知の方法で製造することができる。本発明の実施形態では、ＰＬＡ繊維を製造する好適な方法は、メルトスピニングまたはエレクトロスピニングなどの紡糸によるものである。紡糸は、典型的には、ＰＬＡを溶融し、溶融したＰＬＡを紡糸プロセスに供する、またはＰＬＡを適当な溶媒に溶解し、ＰＬＡ溶液を紡糸プロセスに供することによって行われる。得られた繊維は、あるプロセスに供してもよく、それによって繊維がメッシュに含まれ、さらにそのようなメッシュを、あるプロセスに供してもよく、それによって３Ｄ構造が得られる；さらに、メッシュは、メッシュの繊維またはその３Ｄ構造が保持されることを保証するプロセスに供してもよい。

異なる構造のスキャフォールドを得ることができる。
１．コラーゲンが繊維上に充填される一次元（１Ｄ）繊維構造（繊維の長さおよび直径は変化し得る）
２．不透過性の二次元（２Ｄ）基質：この構造は、生物活性体（例えば細胞）を構造に含めることを可能にする。一般的に、細胞は２Ｄ環境で培養される。
３．三次元（３Ｄ）、ナノ多孔性ヒドロゲルスキャフォールド、コラーゲンは通常、ヒドロゲルの上に位置する（すなわち、ナノスケールの表面を有する２Ｄ基板と相互作用する）、または３Ｄ構造の内側に封入される（細胞は、工程を移動または延長するために周囲のヒドロゲルを分解しなければならない）。
４．三次元（マイクロ多孔質）スキャフォールド、多孔度が高いため（典型的には＞７０％）、生物活性体が三次元に広がることができ、スキャフォールドの孔径に応じて、三次元スキャフォールドは、一次元スキャフォールドストラットに沿って整列する、または複数のストラットに付着し、三次元に広がることができる。

本発明の文脈において、スキャフォールドの説明はまた、滅菌スキャフォールドを包含することを意図する。

一般的には、本発明のスキャフォールドは三次元構造を有する。上述のように、三次元構造は、さらに、ナノ多孔性ヒドロゲルスキャフォールドの形態であってもよく、生物活性体は、ヒドロゲルの上部にあるか、または３Ｄ構造の内部に封入され、周囲のヒドロゲルは、生物活性体を放出するために分解されなければないか、または、三次元構造は、微多孔性スキャフォールドの形態であってもよく、生物活性体は、高い多孔度のスキャフォールドのために三次元に広がることができる。

本発明のスキャフォールドは、そのまま使用してもよく、または１つまたはそれ以上の生物活性体を充填してもよい。生物活性体は、１つまたはそれ以上の細胞であってもよく、または生物学的環境、特に哺乳動物の体内で活性を有する薬剤であってもよい。本発明のスキャフォールドに充填される細胞は、罹患組織または損傷組織を修復することを意図した細胞であることができる。他の生物活性体は、疼痛を緩和するのに適した、または特定の組織における疾患を治療するのに適した薬剤物質であることができる。全身使用を意図した薬剤物質であってもよいが、移植片に薬剤物質を投与することが容易である。スキャフォールドは、移植片の形態または包帯であり得る。スキャフォールドは、ヒト医学および獣医学のような医学で使用することができる。本発明のスキャフォールドは、異なる医療目的、特にＡＣのような軟骨の修復に関連して、または骨軟骨修復に関連して使用することができる。また、本発明のスキャフォールドは、例えばＡＯなどの治療レジメンに使用してもよい。

天然軟骨は多孔質ではないが、例えば、コラーゲンを多量に含む天然骨の多孔度は、骨の種類に応じて５０～９０％の範囲である。組織工学のスキャフォールドには、組織の内部成長と栄養素や代謝廃棄物の流れ輸送とを確実にするために、かなり多孔質で相互接続された開いた開放孔構造が必要である。材料の多孔度は、複数の手段で決定することができる。例えば、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析、画像解析（走査型電子顕微鏡または透過型電子顕微鏡など）、ガスピクノメトリーならびに水銀および液体押出ポロシメトリーを使用することができる。全体的な多孔度については、マイクロＣＴ分析が、全体的な多孔度の決定に関して信頼できる結果を提供するため、最良の方法と考えられている。

本発明の方法に用いられる繊維メッシュは、多孔質構造を有する。ＰＬＡ繊維メッシュの多孔度は約８０～９９％であり、好ましくは８５～９５％程度である。ＰＬＡ繊維メッシュとコラーゲン成分との両成分を有するスキャフォールドの多孔度は、約７０～９９％であり、好ましくは８０～９５％程度である。滅菌前後のスキャフォールドは、同じ範囲の多孔度を有する。

上述したように、本発明は、滅菌スキャフォールドを調製する方法を提供する。方法は、以下：
ｉ）ポリラクチドまたはコポリマー（一般にＰＬＡと表記される）の繊維を含む繊維メッシュにコラーゲンを充填してＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｉｉ）工程ｉ）から得られたＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥する工程、
ｉｉｉ）乾燥する工程ｉｉ）から得られたＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを滅菌してスキャフォールドを得る工程を含む。

本発明の方法は、使用されるＰＬＡおよびコラーゲンのあらゆる不必要な分解を回避し、繊維メッシュおよび／またはＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの不必要な分解を回避するように設計されている。したがって、出発材料ＰＬＡに存在するモノマーの量／数は方法の間に大きく変化しないため、最終的なスキャフォールドのＰＬＡモノマーの量／数は出発ＰＬＡ材料に近くなる。本発明の前方法工程の間、ＰＬＡは、ＰＬＡ繊維を含む繊維メッシュを得るために高温に供され、例えば、ＰＬＡ繊維のメッシュを得るための紡糸プロセスの間に、未加工のＰＬＡ材料がいくらか分解することが予想される。一般に、未加工のＰＬＡ材料（繊維形成前）のモノマーの含有量は約０．１％のように非常に低く、繊維メッシュのモノマーの含有量は通常せいぜい約１％である。

同様に、本発明の方法によるスキャフォールドの製造中にコラーゲンの最小限の分解のみが起こる。滅菌スキャフォールドへの形質転換中のスキャフォールドの安定性は、とりわけ、製造中、特に滅菌プロセス中のコラーゲン成分の温度上昇を回避することによって、および滅菌方法がスキャフォールドの生体力学的特性に広範なマイナス効果を及ぼさないことを保証することによって保証される。本明細書で先に述べたように、滅菌プロセスは、予想外にスキャフォールドの生体力学的特性にプラス効果を有する。したがって、室温または低温でのガンマ線による滅菌は、スキャフォールドの乾燥状態および湿潤状態の両方でより安定した構造を付与する。スキャフォールドはより硬くなり、生体力学的特性の変動がより少なくなり、調製されたスキャフォールドの承認に関して有利である。

安定性の問題に関しては、ＰＬＡには熱、放射線および加水分解の影響を受けやすいエステル結合が含まれている。コラーゲンはまた、酵素的、放射線誘発性または温度依存性の分解を含むいくつかのメカニズムによって分解される場合がある。

得られたスキャフォールドは、そのまま使用してもよく、または限定されないが、細胞のような生物活性体を装填してもよく、または薬剤物質を装填し、移植片として使用してもよい。そのような場合、スキャフォールドの滅菌は、限定されないが、薬剤物質または細胞のような生物活性体をスキャフォールドに充填する前または後に行ってもよい。

本発明の方法は、以下の特性のうちの１つまたはそれ以上を有するスキャフォールドを提供する：
・移植片に使用する場合、新しい組織が時間の経過とともにスキャフォールドに取って代わり、分解生成物が局所的または全身的に有害にならないように、スキャフォールドは、細胞生存率と生分解性とを支持するために生体適合性であるべきである。
・細胞がスキャフォールド内を移動することができるように、細胞が新しい組織を増殖し形成することができるように、スキャフォールドは、相互接続された細孔を備えた極めて多孔質の３Ｄ構造を有するべきである。
・細胞がスキャフォールド内にとどまるように、細胞が増殖して新しい組織を形成することができるように、使用前に細胞をスキャフォールドに充填する適切な多孔度を有するべきである。
・例えば、機械的刺激がＡＣ周囲でうまく機能し、新しい組織形成を可能にするために、スキャフォールドは、その適用に適した生体力学的強度を有するべきである。
・スキャフォールドは、置き換えようとしている天然組織を厳密に模倣することはできないが、適用に適した圧縮および減圧機能、ならびに充填および圧縮中の流体吸収および間質液加圧を有するべきである。
・スキャフォールドは、この適用によって組織の内部成長とそれに続く新しい組織の形成とを補助することができる適切な分解時間を有するべきである。

本発明の方法に使用されるポリマー
ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドは、本発明に従って調製される。本発明の文脈では、ＰＬＡは、Ｌ－ラクチド、Ｄ－ラクチド、およびＬ－ラクチドとＤ－ラクチドとの両方に基づくポリラクチドを含む全ての立体異性体形態のポリラクチドを含むことを意図している。Ｌ体とＤ体の含有量との比率は様々であり得る。典型的には、本発明の方法に使用されるＰＬＡは、ラクチドのＬ体とＤ体の両方を含む。ポリラクチドに関しては、ポリマー中のＤ体の存在は、通常、ポリマーが分解するのにかかる時間に影響を与える。Ｄ体の含有量は、分解時間を短縮する。このようにして、ポリマー中のＬ体およびＤ体の含有量を変えることによって、所望の分解時間を有したＰＬＡを設計することができる。しかしながら、Ｄ体の含有量は、得られたスキャフォールドの生体力学的特性にも影響を及ぼす。したがって、スキャフォールド中のＤ体の含有量が多いほど、生体力学的特性は弱くなる。したがって、本発明の方法に使用するためのポリラクチドのＬ体とＤ体との間の適切なバランスを選択することが重要である。一般に、Ｄ体の含有量は、典型的には、約１～約５０％ｗ／ｗ、例えば約２～約４０％ｗ／ｗ、約３～約３５％ｗ／ｗ、または約４～約３０％ｗ／ｗである。本発明の一実施形態では、ポリラクチドは、９６％のＬ体および４％のＤ体を含有し；このようなラクチドは、９６／４ポリ（Ｌ／Ｄ）ラクチドとも呼ばれている。

本発明の文脈では、ＰＬＡという用語は、例えばラクチドとグリコリド、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）との間に形成されたもののようなポリラクチドまたはコポリマーを含む。ラクチドおよびグリコリドの含有量は異なる場合がある。

本発明の方法に使用するために、ＰＬＡ繊維メッシュを得るために使用される未加工のＰＬＡ材料は、固有の粘度－室温で決定される－を有しており約１．５ｄｌ／ｇ～約５ｄｌ／ｇ、例えば約１．５ｄｌ／ｇ～約４ｄｌ／ｇ、約１．７ｄｌ／ｇ～約３ｄｌ／ｇ、約１．７ｄｌ／ｇ～約２．５ｄｌ／ｇ、または約１．８ｄｌ／ｇ、約１．９ｄｌ／ｇ、約２．０ｄｌ／ｇまたは約２．１ｄｌ／ｇであり、モノマーの最大含有量は約０重量％～約１重量％、例えば約０．１重量％～最大１重量％である。

以下に、本発明の方法の使用に適した生分解性ＰＬＡポリマーに関するより詳細な説明が与えられる。

好適なポリマーは、生分解性ポリマーである。好適なポリマーは、天然または合成ポリマーである。一般に、合成生体吸収性ポリマーは、組織工学スキャフォールドとして広く研究されている。合成生体吸収性ポリマーの制御可能な化学的性質と特性、ならびに容易に再現可能であるという特徴は、スキャフォールド材料としての使用を超えている。合成生体吸収性ポリマーは、加水分解に対する官能基の感受性に応じて、エステル、オルトエステル、無水物、炭酸塩およびアミドなどの様々なサブグループに分類することができる。特に、ポリエステルは、エステル結合の加水分解による分解の容易さのために、いくつかの臨床用途に使用されている。また、ポリエステルの分解産物は代謝経路を介して吸収される場合があり、その構造を調整することによって、分解速度を変化させる能力を有している。

組織工学に使用される最も広くそして最も初期に研究された合成生体吸収性ポリマーのいくつかはポリエステルである。ポリ（α－エステル）の独自性は、その広大な多様性と合成の多用途性とにある。ポリ（α－エステル）のクラスでは、ポリグリコリド（ＰＧＡ）およびポリラクチド（ＰＬＡ）の立体異性体形態を含むポリ（α－ヒドロキシ酸）が最も広く研究されているポリマーである。

本発明の方法では、ＰＬＡが使用される。ＰＬＡは、トウモロコシ、サトウキビおよびタピオカなどの炭水化物源からの糖の発酵に由来する乳酸からの縮重合によって、または乳酸の環状ダイマーであるラクチドからの開環重合によって生成される熱可塑性の生分解性ポリマーである。そのキラル炭素原子のために、乳酸は、全ての動物および微生物の代謝で生じるＬ－乳酸（Ｓ）ならびにＤ－乳酸（Ｒ）と呼ばれる２つの鏡像異性体形態で存在する。縮重合では、通常、低分子量のＰＬＡのみが得られる。高分子量ＰＬＡは、乳酸を重縮合させた後、脱水環状ダイマーラクチドに解重合する開環重合によって得ることができる。光学活性ラクチドは、Ｄ－ラクチド、Ｌ－ラクチドまたはメソラクチド（Ｄ，Ｌ－ラクチド）のいずれかとして見出すことができる。３つのジアステレオマー構造に加えて、ラセミラクチド、Ｄ－ラクチドとＬ－ラクチドとのラセミ混合物も存在する。ポリマー鎖の構造と組成、および特に乳酸のＬ－異性体のＤ－異性体に対する比率は、ＰＬＡの処理、結晶化および分解挙動に影響を与える。Ｌ－ラクチドとメソ－Ｌ，Ｄ－またはラセミラクチドとの共重合を使用することにより、１３０～１８５℃の融解範囲を有する高分子量非晶質または半結晶性ポリマーを得ることができる。Ｌ－ラクチドのみを含むホモポリマーであるポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）は、半結晶性であり、最高融点を有するのに対し、より高いＤ－異性体含有量を有するＰＬＡコポリマーは、融点がより低く、劇的により低い結晶化挙動を示し、Ｄ含有量が１２～１５％より高くなると非晶質になる。

ＰＬＡは脂肪族ポリエステルであるため、その構造にエステル基が存在するため、加水分解を受けやすい。加水分解挙動、速度およびメカニズムは、分子構造およびより高次の構造の変化によって、ならびにＰＬＡの温度、ｐＨおよび触媒種（例えば、アルカリおよび酵素）などの培地の要因によって制御することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ加水分解速度はｉｎ ｖｉｔｒｏ分解に匹敵するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分解挙動と速度からｉｎ ｖｉｖｏ分解をある程度予測することができる。ＰＬＡは、加水分解を触媒するために酵素の存在を必要としない。乳酸は生物の代謝で生じ、その結果、ＰＬＡの分解生成物は非毒性である。脂肪族ポリエステルの加水分解は、マトリックスへの水の取り込みから始まり、続いてエステル結合の加水分解分裂が起こる。非晶質部分は、より高い水の取り込み速度を有し、結晶セグメントはマトリックス内の水浸透性を低減するため、初期の結晶化度は加水分解分解速度に影響する。また、ＰＬＡ試験片の自己触媒効果も報告されている。自己触媒作用は、分解生成物が周囲の溶液に溶解する外殻に低モル質量の化合物が浸透することができない場合に、試験片の中心にカルボキシ末端基を含む化合物の数が増えるためである。

ＰＬＡは、その熱可塑性の性質により、様々な形態に加工することができる。溶融加工はＰＬＡで最も広く使用されている方法である。さらに、射出成形および押出成形は、異なる不織布または繊維用のＰＬＡフィルムおよび繊維を製造するために広く使用されている方法である。また、ＰＬＡのエレクトロスピニングは、医療用組織のスキャフォールド、創傷被覆材、薬物の担体、保護布およびナノコンポジット材料として使用することができる細い繊維を製造する医療用途に使用されている。ＰＬＡの幅広い医療用途には、整形外科用スクリュー、組織工学スキャフォールド、縫合糸、タンパク質のカプセル化および送達、ミクロスフェアならびに薬物送達システムが含まれる。ＰＬＬＡは、良好な引張強度、低伸長および高弾性率を有する低速分解ポリマー（完全にｉｎ ｖｉｖｏ再吸収に２～５年以上かかる）である。そのため、ＰＬＬＡは、整形外科用固定デバイスなどの荷重負荷用途に理想的であると考えられている。一方、ＰＤＬＬＡは、より速く分解し、１～２か月以内にその強度を失い、加水分解されると、１２～１６か月以内に質量が喪失する。また、ＰＤＬＬＡは、ＰＬＬＡと比較してより低い引張強度を有する。そのため、ＰＤＬＬＡは薬物送達ビヒクルとして、および組織工学のための低強度スキャフォールド材料として好まれている。ＰＬＬＡ（半結晶性）、ＰＬＤＬＡ（非晶質）、Ｐ（Ｌ／ＤＬ）ＬＡ７０／３０（非晶質）およびＰ（Ｌ／Ｄ）ＬＡ９６／４（半結晶性）は、医療産業で最も一般的に使用されているＰＬＡポリマーである。

ポリラクチド系共重合体
ＰＬＧＡは、生物医学用途で最も研究されている分解性ポリマーである。ＰＬＡとＰＧＡとは特性が大きく異なるため、共重合体組成が異なると、ＰＬＧＡを異なる用途に最適化することができる。２５～７５％のラクチド組成で、ＰＬＧＡは、より安定なホモポリマーと比較して非常に加水分解的に不安定な非晶質ポリマーを形成する。ＰＬＧＡスキャフォールドの製造には、ガス発泡、マイクロスフェア焼結、ポロゲン浸出、エレクトロスピニングおよびポリマー印刷のようないくつかの異なる処理技術が使用されてきた。ＰＬＧＡは他のポリエステルと比較して急速に分解するため、ＰＬＧＡは特に縫合糸や薬物送達デバイスとして使用されてきた。ＰＬＧＡは、優れた細胞接着および増殖特性を示すため、組織工学的スキャフォールドにも製造されている。

上述のように、本発明の文脈において、ＰＬＡという用語は、全てのポリラクチドポリマー（ポリ乳酸ポリマーとも呼ばれる）ならびにラクチドおよびグリコリドとのコポリマーを包含する。特定の実施形態では、ＰＬＡはポリラクチドポリマーである。

安定性に関しては、ＰＬＡは、より低い分子量のＰＬＡ、またはモノマー、ダイマーなどに分解することができるエステル結合を含む。本発明の方法では、広範な分解を回避するための対策が講じられている。分解速度は、温度とｐＨとに依存する。本発明の方法では、メルトスピニング後、そのまたは全ての方法工程の少なくともいくつかは、高くても室温、すなわち高くても２５～３０℃、例えば高くても２５℃で実行され、方法工程の２、３（例えば、乾燥と滅菌のいくつかの工程）は、室温より明らかに低い温度、例えば、０℃以下、例えば、－１０℃、－２０℃または－２５℃以下で実行される。

ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドのＰＬＡ成分の安定性は、固有の粘度またはモノマー量の変化によって処理後に保証される（例えば本明細書の実施例１を参照されたい）。ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの全体的な安定性は、本明細書の実施例２および３に示されるように、例えば生体力学的特徴化によって、全ての処理する工程の後に保証される。

定義
本明細書で使用される場合、「三次元材料」または「三次元構造」は、高さ、幅および深さを有するあらゆる材料を指す。三次元構造の１つの例はスキャフォールドである。本発明の三次元材料は、好ましくは、移植可能、生分解性および生体適合性である。

本明細書で定義されるように、「生分解性材料」は、体内への導入後に可溶性かつ非毒性の副産物に分解されるため、取り出しまたはさらなる操作を必要としない材料である。

本明細書で定義されるように、「移植可能な材料」は、あらゆる形状またはサイズの材料であり、これは、対象に移植するのに適している。

本明細書で定義されるように、「生体適合性材料」は、生体組織に対して有害または毒性のない材料である。

本明細書で定義されるように、「充填」、例えば繊維メッシュへのコラーゲンの充填は、コラーゲンが繊維メッシュの上に見出され、繊維メッシュに組み込まれる、またはその両方に組み込まれるように、または繊維メッシュにコラーゲンが含浸されるように、コラーゲンが繊維に添加される、または繊維メッシュに接触させるプロセスを意味することを意図する。

本明細書で使用される用語「生体力学的強度」は、その機能性を維持しながら、断片に砕かれることなく生物学的組織に適用されるスキャフォールドの能力、および製造後、保管中および適用中のスキャフォールドの通常の取り扱いに耐えるスキャフォールドの能力を指すことを意図する。

本明細書で使用される用語「機械的強度」は、製造後、保管中および適用中のスキャフォールドの通常の取り扱いに耐えるスキャフォールドの能力を指すことを意図する。この文脈では、「機械的強度」は、「生体力学的強度」および「生体力学的機能」と同義語として使用されることがある。

本発明の文脈において、生体力学的特性の所望の改善は、ｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の増加、ｉｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の減少、またはｉｉｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の変化を伴わないことを意味する。この改善は、同じ方法によって調製されたスキャフォールドと比較した、本発明に従って調製されたスキャフォールドの生体力学的特徴または生体力学的パラメーターの測定に基づいているが、滅菌の最後の工程は省略されている。所望の改善は、増加（または減少）が１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上または１０％以上である場合であり；または１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満の変化がない場合である。使用されるデータは、２つ以上の測定値に基づく平均値である。

本発明の文脈では、関連する生体力学的特徴または生体力学的パラメーターには、以下：不変弾性率、不変クリープ弾性率（すなわち、クリープ条件下での不変弾性率）、動的不変弾性率、メモリ値、流体移動度、見かけの透過率、クリープ内の透過率（すなわち、クリープ条件下での見かけの透過率）、動的弾性率（すなわち、応力／ひずみ比）、および剛性（材料の応力／ひずみ比）が挙げられる。パラメーターは、本明細書の実験セクションでさらに定義されている。

本発明の文脈では、「クリープ試験」という用語は次のように説明される：クリープ試験の性質は擬似静的（絶えず加えられた応力でのひずみの時間変化）であり、材料の粘弾性特性を評価し、一部のモデルでそれを近似するために使用されることが多い。

本明細書において使用される場合、用語「繊維状」は、繊維からなる材料を指す。１つのサイズのみまたは異なるサイズの直径を有する繊維は、本発明の方法に使用するためのメッシュの調製に使用することができる。これらのポリマー繊維は、５～１００μｍ、例えば５～７５μｍ、５～５０μｍ、５～４０μｍ、５～３５μｍ、１０～７５μｍ、１０～５０μｍ、１０～４０μｍ、１０～３５μｍ、１５～７５μｍ、１５～５０μｍ、１５～４０μｍ、または１５～３５μｍの直径を有するＰＬＡ繊維から選択される。直径は、構造内の繊維の平均直径である。繊維の断面は、丸いものだけでなく、楕円形、星形、直角形、三角形などのあらゆる他の形状でもあってもよい。

本発明の文脈では、「多孔度」は次のように計算される：多孔度＝細孔体積／試験片体積ｘ１００％。同様に、多孔度は、構造の全体的な３Ｄ構造を分析することができるマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏＣＴ）によって評価されると考えられている。

本発明の文脈では、「生物活性体」とは、生物学的活性または薬理学的活性を有する物質、化合物および／または生体物質、すなわち、その活性は、生物に対する薬物の有益または有害作用などであるがこれらに限定されない、生物、組織および／または細胞に対する効果である。薬物が複雑な化学混合物である場合、この活性は物質の有効成分またはファルマコフォアによって発揮されるが、他の成分によって修飾される可能性がある。典型的な例は、抗生物質、酵素とビタミン、移植片と細胞である。

本発明の文脈では、「約」という用語は、記載された値－１０％から記載された値＋１０％までの範囲に対応する範囲を示すことが意図される。

繊維および繊維メッシュを得る方法
ＰＬＡポリマーの繊維は、当業者に周知の種々の方法によって得ることができる。ＰＬＡポリマーの繊維は、溶融処理またはエレクトロスピニングによって得ることができる。本明細書の実施例から明らかなように、メルトスピニングは、本発明の方法に使用するためのＰＬＡ繊維の調製に適していることが証明された。

メルトスピニングプロセスは、ポリマーを溶融すること、またはポリマーを柔らかい形態に加熱することを伴う。したがって、特定のポリマーの選択に応じて、紡糸プロセスに適した温度が選択される。典型的には、温度は、ポリラクチドが使用される場合、約７０～約２５０℃の範囲のような約６０～約３００℃の範囲である。

ポリラクチドは、Ｌ－ラクチドモノマーとＤ－ラクチドモノマーとの比率に応じて、非晶質または半結晶性のいずれかであり得る。ポリグリコリドは半結晶性である。ＰＬＡは、融点範囲が約１７０～１８０℃、ガラス転移温度が約６３℃の脆いポリマーである。Ｐ（Ｌ／Ｄ）ＬＡのガラス転移温度は約６０℃であり、半結晶性ポリ（Ｌ，Ｄ－ラクチド）は、約１３５～１７０℃の融解範囲を有する。非晶質ポリマーは融点を有しない。ポリグリコリドは、グリコリドの開環重合によって製造される。ポリグリコリドは、約４５～５５％の結晶化度を有する。ポリグリコリドは、高い融点（約２２５℃）、および約３５℃のガラス転移温度を有する。ポリグリコリドは、比較的急速に酸性生成物に分解される。

一般に、ＰＬＡのメルトスピニングプロセスは、約６０℃～３００℃の範囲の温度で行われる。

ＰＬＡ原料は紡糸前に乾燥され、保護ガスを使用して紡糸プロセス中の分解を防ぐ。

メルトスピニングプロセスは、本発明に使用するためのＰＬＡ繊維メッシュに適したＰＬＡ繊維をもたらす。紡糸プロセス中にＰＬＡ材料にいくつかの変化が発生することがあるが、これらの変化は、得られた繊維メッシュを使用してＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る適合性に大きな影響を与えるべきではない。得られた繊維は半結晶性である。一般に、得られた繊維は、ＰＬＡの初期モノマー量に近いモノマー含有量を有し、および／または原料と比較して、固有粘度が３０％、２５％または２０％未満減少する。これは、ＰＬＡ原料の固有粘度が最大２．５ｄｌ／ｇの場合に特に当てはまる。しかしながら、ＰＬＡ原料が２．５～約５ｄｌ／ｇの固有粘度を有する場合、得られた繊維は、約７０％以下、例えば約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、または約２０％以下の固有粘度の低下を有することがある。一般に、紡糸プロセスから生じる繊維が、１．５～約５ｄｌ／ｇ、例えば１．５～４ｄｌ／ｇ、または約１．５～約３ｄｌ／ｇの範囲の固有粘度を有する場合、適切なスキャフォールドが得られる。固有粘度は、室温で本明細書に記載のように決定される。

繊維が得られると、繊維はメッシュに変換される。上述したように、メッシュは、３Ｄネットワークを形成するためにカーディングされる。カーディングは、繊維を解きほぐして混合し、連続したランダム配向のウェブ、すなわちカードメッシュまたは繊維ネットワークを生成する機械的プロセスである。カーディングは、繊維のステープルのロックと組織化されていない塊とを壊し、次に個々の繊維を互いにほとんど分離するように整列させる。このようにして得られたネットワークの所望の多孔度を得るために、ネットワークは、針が繊維メッシュ／マットに入るときに繊維の最上層をつかみ、繊維の内層と絡み合う針のシャフトに沿ってノッチを有する針を使用するプロセスである、ニードルパンチングに供される。ニードルパンチングは、カードから絡み合って圧縮された３Ｄネットワークを作成し、機械的特性を改善するが、依然として構造は非常に多孔質なままである。

このようにして得られた繊維メッシュ、または繊維３Ｄネットワークは、少なくとも８５％の多孔度を有する。例示的な多孔度は、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である。したがって、３Ｄネットワークは、８５～９９％の多孔度を有することができる。本明細書に定義されるように、多孔度、すなわち、間隙率は、材料中の間隙（すなわち、「空の」）空間の尺度であり、全体積にわたる間隙の体積の割合である。得られたメッシュまたは３Ｄネットワークは、多孔質構造を有し、特に材料全体に細孔ネットワークを有する。

繊維メッシュ、または３Ｄネットワークは、所望の形状および／またはサイズに切断することができる。

得られた３Ｄネットワークの厚さは、典型的には０．１～５０ｍｍである。

繊維メッシュへのコラーゲンの充填
繊維メッシュまたは３Ｄネットワークにコラーゲンを装填する前に、繊維メッシュまたは３Ｄネットワークを洗浄手順に供してもよい。洗浄手順は、典型的には、水性培地中、アルコール水性培地中、またはエタノールなどのアルコール中で実施される。洗浄手順は数回実行してもよく、続いてメッシュまたは３Ｄネットワークの乾燥が続く。乾燥は、凍結乾燥によって、または例えばラミナーフード内で、室温で乾燥することによって行うことができる。繊維メッシュまたは３Ｄネットワークは、意図した使用に適したサイズの小片に切断することもできる。

得られた繊維メッシュまたは３Ｄネットワークにはコラーゲンが充填される。充填は、主にメッシュもしくは３Ｄネットワークの外表面への充填を確実にするために行われてもよく、またはメッシュもしくは３Ｄネットワークの間隙にコラーゲンを装填するために行われてもよい。コラーゲンはまた、メッシュまたは３Ｄネットワークの繊維に接着される。コラーゲンは、例えば、接着によって表面上に存在してもよく、コラーゲンが、例えば毛細管力によって間隙に、および／または接着によって表面に存在してもよい、組合せによってメッシュまたは３Ｄネットワーク中に存在する可能性がある。コラーゲンがスキャフォールドに含まれるメカニズムは主要な関心事ではないことが想定されるが、本発明の文脈では、コラーゲンがメッシュまたは３Ｄネットワークの間隙および表面に存在することが企図される。

典型的には、コラーゲンの充填は、コラーゲンを適切な培地に溶解または分散させることを含む。一般に、培地は水性媒地である。コラーゲンを含む水性媒地のｐＨおよび／または粘度は調整される。

適切な培地中のコラーゲンの濃度は、約０．１％～約５％ｗ／ｗ、例えば約０．１％～４％ｗ／ｗ、０．１％～約３％ｗ／ｗ、約０．１％～約２％ｗ／ｗである。

次いで、メッシュまたは３Ｄネットワークをコラーゲン含有培地中に浸漬してもよい。あるいは、メッシュまたは３Ｄネットワークを溶媒（スキャフォールドを溶解しない）に浸漬し、コラーゲンの溶液／分散液を浸漬メッシュまたは３Ｄネットワークに追加する。コラーゲンはまた、メッシュまたは３Ｄネットワークにコラーゲン含有培地を注入または噴霧することによって、メッシュまたは３Ｄネットワークに充填される。

コラーゲン水性媒地のｐＨは、処理中８未満に保たれるべきである。このプロセスは、好ましくは室温（ＲＴ）で行われるが、４５℃を超えない高温で行われてもよい。ＰＬＡ：コラーゲンの重量比は、ＰＬＡの約９５重量％～約６０重量％およびコラーゲンの４０重量％～約５重量％、ならびに好ましくはＰＬＡの約９０重量％～７５重量％およびコラーゲンの２５重量％～１０重量％である。したがって、ＰＬＡとコラーゲン（ＰＬＡ／コラーゲン）との間の重量比は、７０／３０～９０／１０、７５／２５～８０／２０、または８０／２０～９０／１０など、６０／４０～９５／５である。細胞、薬物などを可能性として充填する前のＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの多孔度は、約７０％～９９％であり、好ましくは約８０％～９５％である。

本明細書で定義されるように、組換えヒトコラーゲンは、組換え技術を使用することによって、例えば適切なポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞を使用することによって産生されるヒトコラーゲンポリペプチドを指す。組換え技術は当業者に周知であり、例えばいくつかの市販の組換えヒトコラーゲンが市場に出回っている。

組換えヒトコラーゲンの使用は、既知および未知の動物由来病原体および望ましくない免疫学的応答を伝染させるリスクを低下させる。さらに、軟骨再生のための他の天然由来材料とは異なり、組換えヒトコラーゲンは、バッチ間のばらつきに煩わされない。したがって、組換えヒトコラーゲンは、適正製造基準（ＧＭＰ）で要求されるグレードで、大量かつ均一な品質で製造することができる。

コラーゲンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に最も豊富に存在するタンパク質であり、皮膚や筋骨格組織の主成分である。現在までに少なくとも２８種類の異なるタイプのコラーゲンが特定されている。全てのコラーゲンは、それぞれ左巻きのポリプロリンＩＩヘリックスにある３つの個々の鎖が一緒にコイル状に巻かれて、ロープのような構造を有する右巻きのスーパーコイル状のトリプルヘリックスを形成するトリプルヘリカル構造を有している。この構造では、コラーゲンは特徴的な繰り返し配列であるグリシン－Ｘ－Ｙを示し、グリシンは三重らせん構造の中心に詰め込むのに十分なほど小さいアミノ酸である。ＸおよびＹの位置は、あらゆるアミノ酸であり得るが、Ｘはプロリンであることが多く、Ｙはしばしばヒドロキシプロリンである。コラーゲンは、その構造と超分子組織に基づいて異なるグループに分けることができる。これらのグループは、原線維形成コラーゲン、線維関連コラーゲン（ＦＡＣＩＴ）、ネットワーク形成コラーゲン、係留原線維、膜貫通コラーゲン、基底膜コラーゲンなどであり、それぞれが独自の機能を有している。コラーゲンの最も豊富なグループは、全コラーゲンの約９０％を占める線維形成コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、最も豊富で最も研究されているコラーゲンであり、骨の有機塊の９０％超を形成し、硝子軟骨、脳および硝子体のような少数の組織を除いて、腱、皮膚、靭帯、角膜および多くの間質結合組織の主要なコラーゲンである。一方、ＩＩ型コラーゲンは硝子軟骨の特徴的かつ主要な成分であるが、硝子体、角膜上皮、脊索、椎間板の髄核、および胚上皮間葉転換部にも見られる。

コラーゲンは、高い機械的強度、良好な生体適合性、低い抗原性、および架橋能力を備えており、コラーゲンの機械的、分解、および水分摂取特性の調整を可能にする。多孔性の高いスキャフォールドに作製する場合、コラーゲンの架橋は、十分な機械的特性と分解速度を有するスキャフォールドを製造するために必要である。コラーゲンは、様々な医療用途、ならびに骨、軟骨および皮膚組織工学などの幅広い組織工学用途に使用するために広く研究されている。コラーゲンを他の分解性ポリマーと修飾または組み合わせることは、生体材料としてのコラーゲンの可能性を向上させる。純粋な形態で商業的な量で容易に調製することができる主要なコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、組織工学用途に最も広く使用されているコラーゲンである。コラーゲンスキャフォールドは、生分解性合成ポリマーとは異なり、成長する構築物に生物学的情報を提供するための代替的手段を提供する。コラーゲンスキャフォールドを使用しながら、組織工学製品の品質を向上させる幅広い細胞接着およびその他のシグナルが達成される。一般に、凍結乾燥または光造形法は、多孔質のコラーゲンベースのスキャフォールドの製造に使用され、カルボジイミドは架橋に適用されることが多い。多孔質コラーゲンスキャフォールドは、多くの場合、バイオセラミックスまたは合成生分解性ポリマーなどの他の成分と組み合わされる。コラーゲンは、生体人工心臓弁または創傷被覆材などとして、様々な市販の医療製品ですでに入手可能である。コラーゲンの使用は、以下：天然の安定化組織をデバイスとして使用する組織ベースのデバイス（生体人工心臓弁）と、酵素消化工程によってコラーゲンを可溶化し、様々な製品（創傷被覆材）に再構成する精製コラーゲンとの２つの異なるカテゴリに分類することができる。組換えコラーゲンは、高純度で病気を運ばないコラーゲンを生成する手段を提供し、天然組織の存在量が非常に少ないものであっても、全ての種類のコラーゲンを生成する可能性があるため、登場している。

本発明の方法に使用するための好適なコラーゲンは、動物由来、ヒト、組換えまたは合成コラーゲンを含むあらゆる供給源からのコラーゲンである。コラーゲンは、コラーゲンタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸまたはＸＩであってもよい。また、これらのコラーゲンタイプのあらゆる組合せを利用することができる。コラーゲンは、より詳細にはコラーゲンＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型である。コラーゲンはまた、少なくともＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン、少なくともＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン、少なくともＩ型およびＩＩ型コラーゲン、または少なくともＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの組合せであってもよい。いずれのコラーゲンも、動物由来、組換えもしくは合成コラーゲンと組み合わせて使用されてもよく、またはコラーゲンは、単独でまたは他のコラーゲンと組み合わせて使用してもよい。

本明細書に使用される場合、「組換えヒトコラーゲン材料」は、組換えヒトコラーゲンを含む任意の材料（例えば任意の溶液またはゲル）を指す。

本発明の方法に使用するためのコラーゲンは、多孔質であってもよい。例えば、凍結乾燥はコラーゲンを多孔質で弾力性のあるものにし、したがって軟骨細胞の増殖および軟骨基質産生を支持するなどの目的に十分に適している。凍結乾燥コラーゲンネットワークなどのコラーゲンは、細胞付着のための優れた微小環境である。本発明の実施形態では、コラーゲンは凍結乾燥される。コラーゲンは（例えばコラーゲン溶液の形態で）そのまま凍結乾燥されてもよい。コラーゲン構造の細孔径は２０～２５０μｍの間で変化し、２０～２５０μｍ、５０～２５０μｍ、３０～２００μｍ、４０～２００μｍ、５０～２００μｍ、または６０～２００μｍから選択することができる。また、凍結乾燥前にコラーゲンをゲルに変換することが可能であり、すなわちコラーゲンは凍結乾燥ゲルの形態であってもよい。

コラーゲンはスキャフォールドに使用され、スポンジ、シートまたはゲルのいずれであっても、組織の修復と再生とに使用することができる。コラーゲンスキャフォールドは、細孔構造、透過性、および親水性のような組織再生を可能にするための正しい特性を有していると考えられている。コラーゲンスキャフォールドは、細胞の接着、堅牢な細胞の拡散、増殖、および３Ｄの分化を支持する。

このようにして得られたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドは、次いで乾燥される。乾燥は、湿潤したスキャフォールドを－２０～－５０℃で１０時間を超えて凍結する先行工程を場合により有する凍結乾燥を伴っていてもよい。凍結は、使用する材料と標本のサイズに依存し、通常１０時間超かかる。凍結温度は、構造内の形成細孔のサイズに影響を与え、使用する材料にも依存する。凍結温度は、一般に－１０℃～－８０℃の間で変化し、－２０℃～－５０℃が好ましい。凍結乾燥プロセスは通常、凍結プロセスと同じ温度範囲またはより低い温度で行われる。凍結乾燥時間は、使用する材料と試験片のサイズに依存し、通常２４時間～４８時間の間で変化する。

メッシュまたは３Ｄネットワークに１つまたはそれ以上のコラーゲンを充填した後、場合により乾燥しているＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得、好ましくはＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドのコラーゲンの架橋に供される。架橋は、最終的なスキャフォールドの生体力学的強度を増大し、コラーゲン成分をｉｎ ｖｉｖｏでより安定させるために行われる。

好適な架橋方法は、当業者に周知であり、化学架橋剤、例えば１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）、グルタルアルデヒド、ゲニピンおよびＵＶ光、またはそれらの組合せの使用も挙げられるが、これらに限定されない。

架橋剤の適切な組合せはＥＤＣであり、好ましくは、ＥＤＣはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とともに使用される。架橋は、典型的には、エタノール－水溶媒中のようなアルコール培地中で行われる。エタノールの含有量は、通常、５０重量％～９９重量％、例えば６０重量％～９９重量％、７０重量％～９９重量％、８０重量％～９９重量％または９０重量％～９９重量％である。

架橋は典型的には、ＥＤＣおよびＮＨＳを使用することによって行われる。ＥＤＣの濃度は、５～２５ｍＭなどの５～３０ｍＭ、１４ｍＭのＥＤＣのような１０～２０ｍＭの範囲であってもよい。ＮＨＳの濃度は、１～１０ｍＭ、５～１０ｍｍまたは約６ｍＭのＮＨＳのような１～１５ｍＭの範囲であってもよい。

架橋されたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドは、架橋残渣を避けるために、通常、水、アルコール性水性培地またはアルコールを含む水性培地で広範囲に洗浄される。

次いで、架橋されたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを乾燥させる。乾燥は、凍結乾燥を含み得、場合により湿潤したスキャフォールドを－２０～－５０℃で１０時間を超えて凍結する先行工程を伴っていてもよい。凍結乾燥および凍結に関する詳細は、前述したものと同様である。温度は、最終産物の細孔のサイズに影響を与える可能性がある；したがって、温度が低いほど、細孔のサイズは小さくなる。

乾燥ＰＬＡコラーゲンスキャフォールドの滅菌
スキャフォールドは、例えばＡＣ環境で安全に使用でき、適切に機能することに加えて、移植前に無菌であるべきである。埋め込み型医療デバイスの最も信頼性の高い滅菌方法の１つはガンマ線照射である。ガンマ線照射は非常に効果的であり、細胞毒性を引き起こす可能性のある残留化学物質がない。しかし、ガンマ線照射は、ＰＬＡのような生分解性ポリマーの特性およびコラーゲンに影響を与えることが知られている。特にコラーゲンは、高すぎるレベルの照射中に機械的完全性の損失を被る場合がある。コラーゲンは温度に敏感であり、加工中および滅菌中の高温に上昇させることは避けるべきである。

ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの乾燥後、滅菌され、滅菌されたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドが得られる。ＰＬＡ、コラーゲンまたはＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの望ましくない分解をもたらさないあらゆる適切な方法を用いることができる。適切な方法は、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドをガンマ線照射に供することであるが、本明細書で述べたように、コラーゲン成分のいかなる劣化も避けるために、いかなる温度上昇も避けるべきである。照射はエネルギーの移動を伴うプロセスであるため、コラーゲンのような感受性の材料に対しては温度制御された条件下で実行すべきである。温度を低く保つ方法は、照射プロセス中にＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを冷却することである。スキャフォールドは、典型的には、滅菌が行われる前に約－２００℃～約２５℃の温度に冷却される。この方法により、滅菌中の温度は４０度以下に保たれる。

滅菌前のＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの温度は、滅菌中のＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの温度と本質的に同じかそれより高い。

滅菌は、典型的には、－２００℃～４０℃の範囲の温度、例えば最大３０℃または最大２５℃、または－１００℃～２５℃の範囲の温度、例えば－７０℃、－４０℃、０℃、１０℃、２０℃または２５℃の温度で行われる。

本明細書の実施例から明らかなように、使用される線量は、滅菌がガンマ線照射によってなされる場合、典型的には１０ｋＧｙ～約２７ｋＧｙの範囲、例えば１５～２６ｋＧｙ、１６～２５ｋＧｙ、例えば１８ｋＧｙ、１９ｋＧｙ、２０ｋＧｙ、２１ｋＧｙ、２２ｋＧｙ、２３ｋＧｙ、２４ｋＧｙ、２５ｋＧｙ、２６ｋＧｙ、または２７ｋＧｙである。

通常、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドは、滅菌プロセス後のスキャフォールドの無菌性の維持を確保するために、滅菌前に適切なパッケージに詰められる。

滅菌は、本発明の方法の任意の工程でも行うことができることに言及したい。したがって、繊維メッシュ（ＰＬＡメッシュ）は、コラーゲンを充填する前に滅菌に供してもよく、コラーゲン自体は、ＰＬＡ繊維メッシュまたは３Ｄネットワークに充填する前に滅菌してもよい。

滅菌プロセスの採用の主な利点は、結果として生じた滅菌のスキャフォールドがかなり均一な生体力学的特性を有する点である。実施例３に見られるように、滅菌されていないが無菌で製造されたスキャフォールドは、はるかに多様な生体力学的特性を有する。規制の観点から、特性のバッチ間の顕著なばらつきがないスキャフォールドを調製することができることは大きな利点である。その理由として、生体力学的特性が、スキャフォールドがｉｎ ｖｉｖｏでどのように振る舞うかを示す指標を与え、ｉｎ ｖｉｖｏの挙動を予測することができること、すなわち、ばらつきが全くない、またはわずかなばらつきが、ｉｎ ｖｉｖｏ特性にわずかにしか影響しないことが望ましいが、より大きなばらつきはｉｎ ｖｉｖｏ特性に影響を与える可能性があり、そのような影響がスキャフォールドの効果にマイナスの影響を与えるかどうかを調査する必要があるためである（例えば、スキャフォールドの安定性、投与部位にとどまる能力、細胞または生物活性体の放出に関するマイナスの影響、望ましくない副作用など）。したがって、同一またはほぼ同一の生体力学的特性を得ることの厳格な管理が、規制当局の承認に関連しても望まれている。一般に、±１０％の特性の変動は通常許容することができる。

本明細書の実施例からわかるように、本発明により製造されたスキャフォールドは、非滅菌スキャフォールドと比較して改善された生体力学的特性を有する。

改善された生体力学的特性は、不変係数、不変クリープ弾性率（すなわち、クリープ条件下での不変弾性率）、動的不変弾性率、メモリ値、流体移動度、見かけ透過率、クリープ内の透過率（クリープ条件下での見かけの透過率）、動的弾性率（応力／ひずみ比）、剛性（すなわち、材料の応力／ひずみ比）などの１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターまたは生体力学的特性の変化として表すことができる。所望の変化は、ｉ）増加、ｉｉ）減少、またはｉｉｉ）変化なしであってよい。

一態様において、１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターまたは生体力学的特徴は、湿潤条件下で試験した場合の不変クリープ弾性率、および乾燥条件下で試験された場合の動的弾性率から選択される。非滅菌スキャフォールドと比較して望ましい変化は増加である。典型的には、増加は、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上または１０％以上である。

一部の生体力学的パラメーターは減少または変化しない場合がある。そのようなパラメーターには、クリープ弾性率および動的弾性率の透過性から選択される生体力学的パラメーターまたは生体力学的特徴が含まれ、いずれも湿潤条件下で決定される。所望の減少は、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上または１０％以上である一方、変化なしは、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満である。

特に、改善された生体力学的特性は、改善された剛性である。

本発明の主な態様で言及されている個々の工程に関する全ての詳細は、発明の他の全ての態様について準用され、したがって以下の段落にはない。

本発明の他の態様
本発明は、滅菌ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを調製する方法であって、方法は、
ａ）ＰＬＡを固体形態で準備する工程、
ｂ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得る工程、および
ｃ）得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得る工程、
ｄ）場合により繊維のメッシュをカーディングおよび／またはニードルパンチングに供して、ＰＬＡ繊維の３Ｄネットワークを得る工程、
ｅ）場合により繊維のメッシュまたは繊維の３Ｄネットワークを１つまたはそれ以上の洗浄手順に供する工程、
ｆ）溶液またはゲルの形態のコラーゲンを準備する工程、
ｇ）工程ｃ）の後、または場合により工程ｄ）もしくはｅ）の後に得られる繊維のメッシュまたは繊維の３Ｄネットワークをコラーゲン溶液またはコラーゲンゲルに浸漬して、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｈ）場合によりＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥させる工程、ならびに
ｉ）工程ｇ）または場合により工程ｈ）で得られるＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを滅菌する工程、を含む方法に関する。

本発明は、滅菌ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを調製する方法であって、
ａ）ＰＬＡを固体形態で準備する工程、
ｂ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得る工程、
ｃ）得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得る工程、
ｄ）繊維のメッシュをカーディングおよび／またはニードルパンチングに供して、ＰＬＡ繊維の３Ｄネットワークを得る工程、
ｅ）繊維のメッシュまたは繊維の３Ｄネットワークを１つまたはそれ以上の洗浄手順に供する工程、
ｆ）溶液またはゲルの形態のコラーゲンを準備する工程、
ｇ）工程ｄ）の後、または場合により工程ｅ）の後に得られる繊維のメッシュまたは繊維の３Ｄネットワークをコラーゲン溶液またはコラーゲンゲルに浸漬して、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｈ）場合によりＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥させる工程、ならびに
ｉ）工程ｇ）、または場合により工程ｈ）で得られるＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを滅菌する工程、を含む方法に関する。

本発明は、滅菌ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを調製する方法であって、
ａ）ＰＬＡを固体形態で準備する工程、
ｂ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得る工程、
ｃ）得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得る工程、
ｄ）繊維のメッシュをカーディングおよび／またはニードルパンチングに供して、ＰＬＡ繊維の３Ｄネットワークを得る工程、
ｅ）繊維の３Ｄネットワークを１つまたはそれ以上の洗浄手順に供する工程、
ｆ）溶液またはゲルの形態のコラーゲンを準備する工程、
ｇ）工程ｅ）の後に得られた繊維の３Ｄネットワークをコラーゲン溶液またはコラーゲンゲルに浸漬して、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｈ）場合によりＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥させる工程、ならびに
ｉ）工程ｇ）または場合により工程ｈ）で得られるＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを滅菌する工程、を含む方法に関する。

本発明は、滅菌ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを調製する方法であって、
ａ）ＰＬＡを固体形態で準備する工程、
ｂ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得る工程、
ｃ）得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得る工程、
ｄ）繊維のメッシュをカーディングおよび／またはニードルパンチングに供して、ＰＬＡ繊維の３Ｄネットワークを得る工程、
ｅ）繊維の３Ｄネットワークを１つまたはそれ以上の洗浄手順に供する工程、
ｆ）溶液またはゲルの形態のコラーゲンを準備する工程、
ｇ）工程ｅ）の後に得られた繊維の３Ｄネットワークをコラーゲン溶液またはコラーゲンゲルに浸漬して、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
ｈ）ＰＬＡコラーゲンスキャフォールドを乾燥させる工程、ならびに
ｉ）工程ｈ）で得られたＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを滅菌する工程を含む、方法に関する。

本発明の方法により調製されたスキャフォールドの使用
本発明に従って得られるスキャフォールドは、典型的には、ヒトおよび獣医の外科的ケアに使用される。ヒトおよび動物、すなわちコンパニオンアニマルの他の健康および医療ケアならびに化粧品にも使用することができる。

本発明に従って得られるスキャフォールドは、関節接合面の病変、特に膝などの体重を支える関節の治療に使用することができる。これらの病変は、罹患した関節の疼痛およびロックのような症状を示し、外科的介入を必要とする。これらの病変は病因が異なるが、軟骨損傷は、外傷、変形性関節症（ＯＡ）などの変性関節疾患、および離断性骨軟骨炎のような発達障害の結果である可能性がある。

スキャフォールドは、そのまま使用してもよく、または以下のうちの１つもしくはそれ以上に充填または組み合わせてもよい：軟骨細胞のような組織特異的細胞、骨髄からの間葉系間質細胞のような体性幹細胞または胚性幹細胞、成長因子またはサイトカインのような細胞成分、血小板もしくは多血小板血漿のような血液成分および画分、または薬剤物質として、イブプロフェンのような抗炎症薬。上記の条件のための最も重要なことは、本発明のスキャフォールドを病変充填剤として使用し、そして二次的な重要性として、潜在的な添加剤を組み込むことである。

本発明に従って得られたスキャフォールドはまた、美容整形、例えば顔面強調における皮膚充填剤として使用することができる。

スキャフォールドは通常、外科的に送達される、すなわち体内に移植される。スキャフォールドは、軟骨または骨軟骨病変に使用することができる。軟骨関連の状態に関連して、スキャフォールドは清拭された病変部位に移植される。スキャフォールドは、吸収性縫合糸またはフィブリン接着剤によって病変床に固定される。

クリープ試験、湿潤条件下（実施例３）で得られた不変弾性率（ａ）、メモリ値（ｂ）および透過性（ｃ）のグラフである。 クリープ試験、湿潤条件下（実施例３）で得られた不変弾性率（ａ）、メモリ値（ｂ）および透過性（ｃ）のグラフである。 クリープ試験、湿潤条件下（実施例３）で得られた不変弾性率（ａ）、メモリ値（ｂ）および透過性（ｃ）のグラフである。 湿潤条件下の動的ひずみスイープ試験の動的（ａ）および静的（ｂ）勾配弾性率（実施例３）のグラフである。 乾燥条件下での動的弾性率対試験温度のグラフである。図に示すように、弾性率値に対する温度の影響はないが、滅菌されていない試料と滅菌された試料との間に統計的に有意な差（ｐ＝０．００）がある（実施例３）。

本発明は、以下の非限定的な実施例にさらに説明される。
実施例

ポリラクチド繊維とコラーゲンとを有する医療用滅菌スキャフォールドを調製する方法であって、凍結乾燥により構造体を乾燥させて、スキャフォールドを実現し、スキャフォールドを滅菌して、滅菌され安定化したＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールド、ｒｈＣｏ－ＰＬＡを得る方法。この実施例では、ＰＬＡ成分が処理方法によってマイナスの影響を受けないことが実証された。

スキャフォールドは以下のようにして作製した。１．８ｄｌ／ｇ～２．２ｄｌ／ｇの範囲の固有粘度を有するＰＬＡ成分である医療グレードのポリ（Ｌ／Ｄ）ラクチド９６／４（Ｃｏｒｂｉｏｎ、Ｐｕｒａｃ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｂｖ、ゴリンケム、オランダ）および０．１％未満の残留モノマー量を使用して、メルトスピニングによって細い繊維を製造した。メルトスピニングの前に、ＰＬＡ原料を真空オーブンで乾燥させた。繊維の溶融加工は、７０～２４０℃の温度範囲内の保護雰囲気下で、メルトスピニングで行った。紡糸装置は、マイクロ押出機と高速紡糸機とで構成されていた。繊維をステープルファイバーに切断し、メッシュにカーディングした。ＰＬＡフェルトは、カーディング化されたＰＬＡメッシュをニードルパンチすることによって製造された。ＰＬＡフェルトはラミナーフードで洗浄および乾燥され、その後クリーンルーム環境に置く前に梱包された。組換えヒトＩＩＩ型コラーゲン（ＦｉｂｒｏＧｅｎ Ｌｔｄ．、カリフォルニア州、米国）の線維形成は、塩基性緩衝液を用いてコラーゲン溶液のｐＨを７に上昇させることにより行った。コラーゲンゲルの形成後、ＰＬＡフェルトをコラーゲンゲルに完全に浸漬し、サンプル型に入れた。次に、これらの構造を凍結乾燥して、完全に乾燥した構造、すなわちｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドを実現した。作製したスキャフォールドを、室温（ＲＴ）で１４ｍＭのＥＤＣ（Ｎ－［３－ジメチルアミノプロピル］－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ヘルシンキ、フィンランド）および６ｍＭのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ヘルシンキ、フィンランド）を含む９５％エタノール溶液で架橋した。次いで、作製したｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドを洗浄、凍結乾燥、詰め込んだ後、滅菌中の温度上昇を避けるために、ドライアイス下でガンマ線照射≦２５ｋＧｙによる滅菌に送った。

作製したｒｈＣｏ－ＰＬＡについて、以下の試験を行った。Ｌ－ラクチドのモノマー量測定は、０．０１重量％の下限のＧＣ－ＭＳ法（Ｒａｍｂｏｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、ラハティ、フィンランド）により行い、固有粘度（ｉ．ｖ．）はＬａｕｄａＰＶＳ粘度計（Ｌａｕｄａ ＤＲ．Ｒ．Ｗｏｂｓｔｅｒ ＧｍｂＨ、ＫＧ、ケーニヒスホーフェン、ドイツ）で測定した。試料は、ポリマーを１ｍｇ／ｍｌのクロロホルムに溶解して調製した。Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅキャピラリー粘度計タイプ０ｃ（Ｓｃｈｏｔｔ－Ｇｅｒａｔｅ、マインツ、ドイツ）を使用して粘度を決定した。

この製造方法により、ポリラクチド繊維とコラーゲンとを用いた医療用滅菌スキャフォールド、ｒｈＣｏ－ＰＬＡは、表１に示すように以下の特徴を達成した：

ＰＬＡ成分の残存モノマー量は、モノマー量が０．１重量％以下にとどまっていたため、顕著な変化はなく、原料のモノマー量と同じであった。使用したＰＬＡ処理温度および滅菌は、押出ＰＬＡの固有粘度を大きく変化させなかった：この実験における許容可能な減少は約５０％であった。

ポリラクチド繊維とコラーゲンとを有する医療用滅菌スキャフォールドは、凍結乾燥によって構造体を乾燥させることによって、スキャフォールドを実現し、スキャフォールドを滅菌して滅菌されＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得ることによって製造した。実施例１に記載のｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドをガンマ線照射で滅菌し、特にコラーゲン成分に対する滅菌の効果を評価した。同様に、滅菌用量の効果を示すために、異なるガンマ線量（ドライアイス下）をｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドに使用した。

データ解析は、米国特許第１０３７９１０６（Ｂ２）号に詳細に記載された手順に従って行われた。この解析は、加えられた荷重（応力）と変形（ひずみ）のデータから、静的および動的条件での粘性剛性とメモリ値などの不変データをそれぞれ抽出することを含んだ。本明細書では、次の定義が使用された：

「不変弾性率」は、時間および周波数に依存せず、材料の挙動の予測に使用することができる固有の弾性率値（すなわち、真値）である。

「動的不変弾性率」は、動的真（対数）ひずみ振幅に対する動的応力振幅の比であり、実数（複素数ではない）代数で表される（一般的に使用される実数（ストレージ）および虚数（損失）係数の定義とは異なる）。

「メモリ値」は、試験片の時不変特性であり、０～１の間の範囲の値を有し、材料自体が流体でなくても、材料の粘性傾向を表す。メモリ値は理論的予測を有せず、常に実験から決定されなければならない。本発明では、静的（クリープ）条件と動的条件について別々に実験的に測定し、これらの条件におけるメモリ値は異なることが判明した。

「流体移動度」は、多孔質体内の流体移動速度の尺度（係数）であり、拡散係数に類似している（ｍｍ^２／秒の同じ単位を使用）。しかし、流体の動きは拡散だけでなく、対流部分と運動量移動とにも起因するため、その性質は後者とは異なる。流体の移動度は、ある特定の条件下で流体が内部をどれだけうまく流れる可能性があるかを表している。

「見かけの透過率」は、流体がその多孔質ネットワークを通過することを可能にする多孔質体の容量を表し、それは二乗距離単位（ｍ^２）で測定される。これは、多孔質構造を介して流体を輸送するための材料の定量化されたトポロジカル能力であり、材料構造にのみ依存し、流体特性には依存しない。ここでは、ダルシーの法則によって一般的に定義されている透過率とは異なり、後者は材料の試験片全体の流体圧力勾配の増加を必要とする。しかしながら、米国特許第１０，３７９，１０６（Ｂ２）号に示されるように、ここでも適用される方法は、流体圧力勾配の知識がなくても透過率の測定を可能とし、これらの方法を区別するために、「見かけの透過率」という用語が使用される（ミリダルシーで表す；１ｍＤａｒｃｙ＝１０^－１５ｍ^２）。

最初の試験は無菌的に製造されたｒｈＣｏ－ＰＬＡ（ｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ａ）について行われ、照射線量が≧２５ｋＧｙである標準照射線量で滅菌されたｒｈＣｏ－ＰＬＡと比較した。その過程で、実際の照射線量は２９ｋＧｙと測定された（ｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ｓ）。無菌的に製造されたｒｈＣｏ－ＰＬＡ（ｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ａ）は、ガンマ線照射されたＰＬＡ成分（標準照射線量≧２５ｋＧｙで滅菌）を有していたが、無菌条件では、コラーゲン成分の添加は滅菌後に行われ、すなわちコラーゲン成分自体は照射されなかった。したがって、ＰＬＡ繊維成分は同一の特性を有し、全体的な生体力学的性能に寄与しているはずであり、その違いは主にコラーゲンとその処理との効果によるものであった。

その後、製造されたスキャフォールドは、動的機械分析装置ＤＭＡ２４２Ｅ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｇｅｒａｔｅｂａｕ ＧｍｂＨ、セルブ、ドイツ）の標準圧縮サンプルホルダー（直径１５ｍｍ）で動的機械分析（ＤＭＡ）を使用した生体力学的試験手順で試験した。

スキャフォールドの一部は０．２Ｎの一定応力下でクリープ試験に供し、別の一部は１Ｈｚの周波数で５～５０μｍの範囲のひずみを生じる振動力（ひずみ－掃引法）を行った。簡単に説明すると、プローブに試験片との接触を確立し、オフセットを風袋引きした後、培地に浸した試験片の開始時の高さを再度測定し、真のひずみ計算の開始時の高さとしてさらに使用した。

全ての場合において、スキャフォールドは室温で水に完全に浸漬し、測定の１５分前に平衡化できるようにして試験した。したがって、全ての試験片は完全に含浸されており、気泡や乾燥領域は観察されなかった。試験したスキャフォールドの断面積は２０～２６ｍｍ^２であった。全ての試験は、最大３００分（寸法変化が一定値に近づくまで；変位分解能±０．０００５μｍ）で行われた。これらのデータは保存され、ＡＳＣＩＩテキストファイルとしてデータ処理ソフトウェア（カスタマイズされたコードで補完されたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）にエクスポートした。一次データは、応力と真のひずみと、および応力に対するひずみの比率対実験時間に変換した。その後、時間畳み込みの数値アルゴリズムを適用し、処理されたデータは、米国特許第１０，３７９，１０６（Ｂ２）号に詳細に記載されている数学的方法で、行ごとに対にして非局所的に統合した。

これらの実験データを表２に示す。

表２は、線量≧２５ｋＧｙのガンマ線照射の標準手順による滅菌が、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの生体力学的特性に以下のように影響したことを示している：

クリープ試験では、滅菌線量が２９ｋＧｙの場合、ｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ｓスキャフォールドは、照射後に大幅に低下する不変弾性率の低下（－２２％）を被った。メモリ値も減少しており（－４３％）、滅菌後にｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドがより弾性になることを示している。滅菌したｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの有効流体移動度と見かけの透過性との低下（ほぼ２倍）は、スキャフォールド内部のより低下した流体の移動度の状態を示し、したがって、照射されたスキャフォールド構造が流体に対して透過性がより低下したことを示している。これらの変化は望ましくなく、ｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ｓのそのような劣った生体力学的特性は容認することはできない。したがって、クリープ試験では、この滅菌方法がｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの生体力学的特性に大きな影響を与え、意図した用途での使用を保証することができないことがわかった。

ひずみスイープ試験では、動的不変弾性率が増加し（＋３３％）、滅菌後にｒｈＣｏ－ＰＬＡ－Ｓスキャフォールドがより剛性になり、周囲の組織の動的ひずみに適合する能力が劣っていくことが示された。

第２段階は、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドに対するより正確なガンマ線照射線量効果を評価することであった。標準線量≧２５ｋＧｙのガンマ線照射下で、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドに対する異なる線量を比較するための試験が行われた。したがって、ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドに対する低線量のガンマ線照射による滅菌は、以下の線量で実施された：１８ｋＧｙ（Ｇ１８）、２０ｋＧｙ（Ｇ２０）、２２ｋＧｙ（Ｇ２２）、および２５ｋＧｙ（Ｇ２５）。非滅菌ｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールド（Ｇ０）を基準として使用した。

製造されたスキャフォールドは、同じ動的機械分析である、ＤＭＡ２４２Ｅ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｇｅｒａｔｅｂａｕ ＧｍｂＨ、セルブ、ドイツ）を使用して、前述のように、動的機械分析を使用した生体力学的試験手順で試験した。スキャフォールドは、上記と同様に０．２Ｎ定力下でクリープ試験に供した。全ての場合において、スキャフォールドは室温で水に完全に浸漬し、測定の１５分前に平衡化できるようにして試験した。試験したスキャフォールドの面積は３７～４６ｍｍ^２であった。

これらの異なる低線量のガンマ線照射によるｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの生体力学的試験結果を表３に示す。結果は、これらの異なる量のガンマ線照射、≦２５ｋＧｙがｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドの生体力学にそれほど変化をもたらさなかったことを示している（これは、例えば、Ｇ０試料の不変弾性率の値とメモリ値とが滅菌された試料Ｇ１８－Ｇ２５で測定された限界内にあるため）。

ポリラクチド繊維とコラーゲンとを有する医療用滅菌スキャフォールドは、凍結乾燥によって構造体を乾燥させることによって、スキャフォールドを実現し、スキャフォールドを滅菌して滅菌されＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得ることによって製造した。

実施例１に記載のｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドを、ＲＴ（Ｓ－ＲＴ）または低温（－７０℃）でのガンマ線照射（Ｓ－ＬＴ）で滅菌し、滅菌の効果を評価し、非滅菌スキャフォールド（ＮＳ）と比較した。この試験では、スキャフォールドの生体力学的特性の可能性としての変化を、一般的に同じ予想線量（２５ｋＧｙ）での異なる滅菌方法によって実証し、滅菌中のより低い温度が生体力学的特性に影響を与えるかどうかを調べた。生体力学的試験は、以下に説明するように、乾燥試料と湿潤試料に対して行われた。

生体力学的分析は、６０℃までの乾燥条件と圧縮モードで２５℃の湿潤浸漬条件で行われた。製造されたスキャフォールドは、動的機械分析装置ＤＭＡ２４２Ｅ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｇｅｒａｔｅｂａｕ ＧｍｂＨ、セルブ、ドイツ）の標準圧縮サンプルホルダー（直径１５ｍｍ）で動的機械分析を使用した生体力学的試験手順で試験した。スキャフォールドの一部は０．２Ｎの一定力でクリープ試験を行い、別の部分は、１Ｈｚの周波数で５～２５μｍの振幅範囲でひずみスイープを行った。後者については、実施例２と同様に荷重サイクルを１０回繰り返した。

スキャフォールドは２５℃で水に完全に浸漬し、測定の１５分前に平衡化できるように試験した。したがって、全ての試験片は完全に含浸されており、気泡または乾燥領域は観察されなかった。機械的特性の熱安定性を評価する目的で、１Ｈｚおよび２５μｍ振幅未満の乾燥条件（空気）であるが、２Ｋ／分の速度で６０℃まで加熱して、一組の乾燥試験片に追加で試験を行った。

試験したスキャフォールドの断面積は３０～４０ｍｍ^２であった。データ解析は、米国特許第１０３７９１０６（Ｂ２）号に記載されている手順に従って行われ、図１～３に示すデータを使用して、静的条件と動的条件のそれぞれで、粘性剛性およびメモリ値などの不変データを抽出することを目的とした。繰り返しの動的荷重の下で、全ての試験片が全ての荷重シーケンスサイクルで徐々に収縮していることは言及するに値する。したがって、１Ｈｚでの動的応力／ひずみ比（「標準動的弾性率」）および関連する静的応力／ひずみ比（「標準静的弾性率」）の積分（勾配）値が抽出されて、全ての荷重サイクルをカバーする値を表す。

図１からわかるように、クリープ試験では、いくつかの試料タイプ間でいくつかの特性値に有意差があるが、他の試料タイプでは有意差はない（エラーバー＝湿潤条件での標準偏差）。例えば、Ｓ－ＲＴ試料は、クリープ対Ｓ－ＬＴ試料において、クリープ係数が低く、より高い透過率を有する。したがって、滅菌手順中に温度制御（温度を下げる）の効果がある。

２５℃、１Ｈｚの動的湿潤条件（図２）では、試料（ＮＳ、Ｓ－ＲＴ、およびＳ－ＬＴ）間の動的応力／ひずみ比（傾斜弾性率）と静的応力／ひずみ比（傾斜弾性率）に有意差はなかった。

驚くべきことに、６０℃までの温度上昇を伴う１Ｈｚの動的乾燥条件では、動的と静的応力／ひずみ比の試料間で、ｐ＝０．００（信頼区間が９５％の場合、値ｐ＜０．０５は、両側ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ｔ検定について統計的有意差がある）の有意差があり、このことは、Ｓ－ＲＴとＳ－ＬＴスキャフォールドとが滅菌プロセスの後により硬くなることを示している（図３）。これらの差は、非滅菌試料（ＮＳ）と滅菌試料（Ｓ－ＲＴおよびＳ－ＬＴ）の間ではあったが、ＲＴ（Ｓ－ＲＴ）または低温（Ｓ－ＬＴ）で滅菌されたものの間ではなかった。動的試験中の温度変化は、６０℃まで特性に影響を与えなかった。また、６０℃までは試料の剛性（すなわち、材料の応力／ひずみ比）に対する試験温度の影響はないように見えるため、観察された差は主に滅菌プロセスによるものであり、温度の違い；室温（Ｓ－ＲＴ）または低温（Ｓ－ＬＴ）は、これらの試料の特性に影響を与えないと結論付けることができる。

これらの結果は、滅菌（ＲＴまたは低温（ＬＴ））が一般的にスキャフォールドの特性を安定させることを示しているが、これは乾燥状態でのこれらの試験でのみ明白に見られる。

図３および表５に示すように、弾性率値に対する温度の影響はないが、非滅菌スキャフォールドと滅菌スキャフォールドの間に統計的な有意差（ｐ＝０．００）がある。

一般に、滅菌はスキャフォールドの材料特性に劣性の効果を有すると考えられてきたが、この場合、滅菌は予想外の結果につながる：ガンマ線照射は、スキャフォールドの生体力学的特性を安定化させるプラスの効果があるようである。

要約すると、この実施例３は、材料対非滅菌材料に対する滅菌手順の以下の効果を実証している（したがって、変化は、不良－特性の変更が望ましくない、並－中立の効果、統計的有意差なし、または良好－特性の変化は望ましい）：

前述したように、所望の改善は、ｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の増加、ｉｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の減少、またはｉｉｉ）１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターもしくは生体力学的特徴の変化を伴わないことを意味する。

上記の表からわかるように、以下の生体力学的パラメーターについては増加が望ましい：不変クリープ弾性率（湿潤条件）、動的弾性率（乾燥条件）、および動的弾性率対温度（乾燥条件）は、以下の生体力学的パラメーターに対して減少または変化がないことが望ましい：クリープ（湿潤条件）および動的弾性率（湿潤条件）での透過率。

本明細書で前述のように、所望の改善は、増加（または減少）が１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上または１０％以上である場合；または１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満の変化がない場合である。

したがって、ＲＴまたは低温（ＬＴ）でのガンマ線照射の滅菌手順は、これらの種類のスキャフォールドが、動力学において乾燥状態と湿潤状態の両方でより安定した構造を達成するためのプラスの工程であると想定できる。同様に、低温での滅菌は、特に湿潤クリープ条件で示された、ＲＴでの滅菌と比較して好ましい結果をもたらす。

また、実施例１に記載のｒｈＣｏ－ＰＬＡスキャフォールドは、生体力学的安定性の改善のような、ガンマ線滅菌条件（線量および温度制御）に対する予想外の反応性を有し、機械的特性のより正確な制御を可能にし、臨床要求に対する材料の最適化が必要であることも確認された。照射が多くの有機材料およびポリマーを弱めるか、または破壊さえすることが一般的に知られているため、この効果は予想外であった。

Claims (15)

1. 医療用の滅菌スキャフォールドを調製する方法であって、以下の工程：
   ｉ）ポリラクチドポリマーまたはコポリマー（ＰＬＡ）の繊維を含む繊維メッシュにコラーゲンを充填して、ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを得る工程、
   ｉｉ）工程ｉ）から得られた前記ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを乾燥させる工程、
   ｉｉｉ）前記乾燥させる工程ｉｉ）から得られた前記ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドを滅菌して、滅菌スキャフォールドを得る工程を含み、該滅菌は、照射線量が最大で２５ｋＧｙであるガンマ線照射で実行される、方法。
2. 前記得られた滅菌スキャフォールドは、非滅菌スキャフォールドと比較して改善された生体力学的特性を有しており、前記改善された生体力学的特性は、
   ａ）不変クリープ弾性率（湿潤条件）
   ｂ）動的弾性率（乾燥条件）、および
   ｃ）動的弾性率対温度（乾燥条件）
   からなる群から選択される１つもしくはそれ以上の生体力学的パラメーターまたは生体力学的特徴の１％以上の増加として表される、請求項１に記載の方法。
3. 前記改善された生体力学的特性は剛性である、請求項２に記載の方法。
4. 滅菌前の前記ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの温度は、滅菌中の前記ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールドの温度と本質的に同じ、またはそれより高い、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記滅菌は－２００℃～４０℃の範囲の温度で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程ｉ）の前記充填はコラーゲンのゲルで実行される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ゲル中の前記コラーゲンの濃度は約０．１％～２．０％ｗ／ｗである、請求項６に記載の方法。
8. 工程ｉ）で得られた前記スキャフォールドは、ＰＬＡおよびコラーゲンの総量に対するパーセンテージで、５～２５％ｗ／ｗのコラーゲンを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記コラーゲンは組換えコラーゲン、組織由来コラーゲン、またはそれらの組合せである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＰＬＡの繊維を含み、請求項１の工程ｉ）で使用される前記メッシュは、
    ｉ）ＰＬＡを固体形態で準備する工程、
    ｉｉ）ＰＬＡをあるプロセスに供し、それによってＰＬＡの繊維を得る工程、および
    ｉｉｉ）前記得られた繊維をあるプロセスに供し、それによって繊維のメッシュを得る工程、によって得られ、
    工程ｉｉ）は、紡糸によって実行される、および／または
    工程ｉｉｉ）の前記メッシュを、カーディングまたはニードルパンチングを含むプロセスに供して、３Ｄネットワークを得る、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 工程ｉｉ）は、エレクトロスピニングまたはメルトスピニングによって実行される、請求項１０に記載の方法。
12. ＰＬＡ－コラーゲンスキャフォールド中のコラーゲンは架橋されている、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 医療用滅菌スキャフォールドは、薬剤物質で充填され、スキャフォールドの滅菌は、薬剤物質をスキャフォールドに充填する前または後に行われる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 薬剤物質は抗炎症薬である、請求項１３に記載の方法。
15. 薬剤物質はイブプロフェンである、請求項１３に記載の方法。

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