JP7601952B2 - 二重特異性抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、改善された医薬特性を示す二重特異性抗体、かかる抗体を含む組成物、ならびにこのような抗体および組成物の使用、例えば、医薬的および治療的使用に関する。
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
血液凝固の過程は、血管損傷後に一緒に作用して、体液の重度の喪失および／または病原性侵襲を防止する血栓を生成するいくつかのタンパク質を伴う。血栓の形成につながる事象のカスケードは、内因性（接触）および外因性（組織因子）経路として知られる２つの経路を介して開始され得る。各経路は、新たに活性化された酵素が、プロトロンビンがトロンビンに変換されるまで、一連の中の次の酵素前駆体の活性化を触媒する一連の酵素前駆体活性化ステップで構成されている。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリン網目構造に変換し、血小板を活性化して血小板血栓を形成し、一緒になって安定した血栓を形成する。外因性凝固経路の開始は、血管壁への損傷の結果として曝露される膜結合組織因子（ＴＦ）と、低レベルの循環因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の間の複合体の形成によって媒介される。ＦＶＩＩａ：ＴＦ複合体は、少量の凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化することによって、凝固カスケードを開始する。初期の段階の間、低濃度のＦＸａは、第ＸＩ因子および補因子ＶＩＩＩおよびＶを活性化することができる微量のトロンビンを産生する。増殖段階の間、凝固促進性複合体が組み立てられ、それらは、それぞれ、テナーゼ（ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩａ、Ｃａ２＋、リン脂質）およびプロトロンビナーゼ（ＦＸａ、ＦＶａ、Ｃａ２＋、リン脂質）複合体によるＦＸａおよびトロンビンの生成を著しく強化する。
血友病ＡおよびＢ（それぞれ、ＨＡおよびＨＢ）の患者では、機能的ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸのそれぞれが存在しないか、または不十分な存在のために、凝固カスケードの様々なステップが機能不全に陥る。これは、血液凝固障害および不十分な血液凝固、ならびに生命を脅かす可能性のある出血または関節などの内臓への損傷につながる。
組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）は、インヒビター（ＨｗＩ）保有血友病（ＡおよびＢ）患者における出血のオンデマンド（ＯＤ）治療のためのバイパス薬剤として広く使用されている。ｒＦＶＩＩａは、静脈内（ＩＶ）に投与された場合、２～３時間の短い全身半減期を有し、皮下（ＳＣ）に投与された場合、低い生物学的利用能を有する。ｒＦＶＩＩａの短い全身半減期は、血漿インヒビターであるアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）（Ａｇｅｒｓφ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：３３３－８．）およびアルファ－２－マクログロブリン（α２Ｍ）による阻害ならびに腎クリアランスを含むいくつかの機序の関与によると考えられている。ｒＦＶＩＩａの短い全身半減期および低ＳＣ生物学的利用能は、予防的治療のためにｒＦＶＩＩａを利用することを困難にする。さらに、ｒＦＶＩＩａの低固有活性は、より高いｒＦＶＩＩａ用量の投与を必要とする。
したがって、より少ない頻度での投与およびＳＣ投与で予防的治療をサポートできる改善された化合物が必要とされている。
Ｒｏｃｈｅは最近、二重特異性抗体であるエミシズマブを発売した。これは、ＨＡおよびインヒビター保有ＨＡ（ＨＡｗＩ）を有する人々に対して、ＳＣ投与により週１回投与されるルーチン的予防に適応されている。それにもかかわらず、代替的な作用機序を備えた安全で有効な分子の開発は、血友病患者の標準的なケアを改善し、補完するために重要な関心分野である。
本発明は、改善された医薬特性を示す二重特異性抗体に関し、特に、先天性および／または後天性凝固異常を有する対象の治療、例えば、インヒビター保有または非保有血友病ＡまたはＢを有する人々の治療に使用され得る二重特異性抗体に関する。さらに、本発明は、凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ（ａ））およびＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ－１）を結合することができる二重特異性抗体に特に関連する。
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、（ｉ）ＦＶＩＩ（ａ）に結合する第１の抗原結合部位、および（ｉｉ）ＴＬＴ－１に結合する第２の抗原結合部位を含む。
本発明の一態様では、二重特異性抗体は、内因性ＦＶＩＩａ活性を失うことなく内因性ＦＶＩＩａの活性循環半減期を延長し、活性化された血小板に選択的に局在化することによって内因性ＦＶＩＩａ活性を刺激する。
本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を含む。Ｆｃ領域は、二重特異性抗体のリサイクルを媒介し、循環中のその半減期を延長する。
本発明の一実施形態では、第１の抗原結合部位は、以下に示す、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のうちのいずれか１つと、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦＶＩＩ（ａ）への結合について競合する。
・ｍＡｂ０５２２（ＶＬ：配列番号８４６およびＶＨ：配列番号８５０）、
・Ｆａｂ０８８３（ＶＬ：配列番号８１４およびＶＨ：配列番号８１８）、
・ｍＡｂ０００５（ＶＬ：配列番号７５０およびＶＨ：配列番号７５４）、
・ｍＡｂ０００４（ＶＬ：配列番号１４およびＶＨ：配列番号１８）、
・ｍＡｂ００１３（ＶＬ：配列番号４６およびＶＨ：配列番号５０）、
・ｍＡｂ００１８（ＶＬ：配列番号６２およびＶＨ：配列番号６６）、
・ｍＡｂ０５４４（ＶＬ：配列番号６９４およびＶＨ：配列番号６９８）、
・ｍＡｂ０５５２（ＶＬ：配列番号７０２およびＶＨ：配列番号７０６）、
・ｍＡｂ０００１（ＶＬ：配列番号７１０およびＶＨ：配列番号７１４）、
・ｍＡｂ０００７（ＶＬ：配列番号７１８およびＶＨ：配列番号７２２）、
・ｍＡｂ０５７８（ＶＬ：配列番号７２６およびＶＨ：配列番号７３０）、
・ｍＡｂ０７０１（ＶＬ：配列番号７３４およびＶＨ：配列番号７３８）、および
・ｍＡｂ０５８７（ＶＬ：配列番号７４２およびＶＨ：配列番号７４６）
本発明のさらなる実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合部位は、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）のアミノ酸残基Ｈ１１５、Ｔ１３０、Ｖ１３１、およびＲ３９２を含むエピトープを結合することができる。
本発明の一態様では、二重特異性抗体は、本発明の二重特異性抗体および医薬的に許容可能な担体を含む医薬製剤に製剤化される。
本発明の一態様では、二重特異性抗体は、静脈内、筋肉内、または皮下など、非経口的に投与される。本発明の一態様では、二重特異性抗体は、血友病Ａ、血友病Ｂ、インヒビター保有血友病Ａ、またはインヒビター保有血友病Ｂなどの先天性および／または後天性の凝固異常を有する対象の予防的治療を可能にする。したがって、二重特異性抗体は、出血に対する止血適用範囲を提供するよう設計される。本発明の一態様では、二重特異性抗体は、週に１回、月１回、またはそれ以下の頻度での投与に適しているように設計される。
本発明の二重特異性抗体を用いた治療は、注射間のより長い持続時間、より簡便な投与、および注射間の止血保護の潜在的改善など、多くの利点を提供し得る。したがって、本明細書に記載される二重特異性抗体は、インヒビター保有または非保有血友病ＡまたはＢを有する個体の生活の質に実質的な影響を与え得る。
配列表の簡単な説明
表１は、抗体および対応するＶＬおよびＶＬドメイン配列に対するその対応する配列番号の概要である。重鎖定常ドメインのタイプは、表２ａに定義されるとおりである（「Ｍ」はマウスＩｇＧ１定常ドメインを示す）。
表２ａは、二価抗体、一価（ＯＡ）抗体、および二重特異性抗体の組み換え型発現に使用される様々なフォーマットの概要である。第１の重鎖（ＨＣ－１）および第２の重鎖（ＨＣ－２、またはＯＡ抗体については切断された（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）重鎖（ｔｒＨＣ））に対応する配列番号が列挙されている。軽鎖定常ドメインは、すべての場合において、配列番号 １２に対応するヒトカッパであった。
表２ｂは、本発明のマウス抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の概要である。クローン名、完全マウス（組み換え発現されたｍＡｂ０７６５を除く、ハイブリドーマ由来）抗体および、対応するマウス／ヒトキメラバリアント（マウス可変ドメイン、ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ定常ドメイン）の間の対応。
表２ｃは、マウスおよびヒト化１１Ｆ２系統における抗体の概要である
表２ｄは抗ＴＬＴ－１ ｍＡｂ００１２系統の抗体の概要である
本発明では、組み換え産生抗体はすべてヒトＩｇＧ４バックグラウンドで発現され、すべて標準ヒンジ安定化置換Ｓ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング）を含有した。いくつかのバリアントでは、重鎖のＣ末端リジン（Ｋ４４７、インビボで急速に切断される；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１１ ｖｏｌ．１０８，ｐｐ４０４－４１２を参照されたい）を省略した（デルタ－ｌｙｓと称する）。表２ａによれば、追加の置換が、二重特異性および一価抗体における所望の鎖対形成を確保するために、重鎖定常ドメインに導入された。（デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）変異Ｆ４０５Ｌ Ｒ４０９Ｋ（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１３，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．５１４５－５１５０）およびノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）変異（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１，，ｖｏｌ．２４８，ｐｐ．７－１５を参照されたい）Ｔ３６６Ｗ（ノブ）およびＴ３６６Ｓ Ｌ３６８Ａ Ｙ４０７Ｖ（ホール））、またはインビボでの半減期を延長する（ＹＴＥ変異Ｍ２５２Ｙ Ｓ２５４Ｔ Ｔ２５６Ｅ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２３５１４－２３５２４））。本発明のすべての組み換え産生抗体は、ヒトカッパ軽鎖定常ドメイン（配列番号１２）を有する。
本発明は、改善された医薬特性を呈する抗体組成物の設計および使用に関する。特に、凝固ＦＶＩＩ（ａ）およびＴＬＴ－１を結合することができる二重特異性抗体に関する。
抗体
本明細書において「抗体」という用語は、抗原またはその一部分に結合することができる免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語は、任意のクラス（またはアイソタイプ）の完全長抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および／またはＩｇＹを含むが、これらに限定されない。
治療用抗体にとって特に興味深いのは、ＩｇＧサブクラスであり、ヒトでは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類される。軽鎖は、それらの配列組成物の差異に基づいて、２つのタイプ、カッパ鎖およびラムダ鎖に分けることができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖、および各々がジスルフィド結合によって重鎖に付着した２つの軽鎖で構成されている。ＩｇＧ重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および最大３つの重鎖定常（ＣＨ）ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み得る。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。ＶＨおよびＶＬドメインは、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。超可変領域（ＣＤＲ）を含有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、抗原と相互作用することができる構造を形成する一方で、抗体の定常領域は、Ｆｃ受容体、および古典的補体系のＣ１複合体の第１の成分であるＣ１ｑへの結合を媒介し得る。
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合を可能にする抗体の部分を指す。
抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書に説明されるように、ＦＶＩＩ（ａ）、ＴＬＴ－１などのその同族の抗原または別の標的分子に結合する能力を保持する抗体の断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または単一のＶＨドメインもしくはＶＬドメインが挙げられる（が、これらに限定されない）。
本明細書で使用される場合、「ワンアームド抗体（ｏｎｅ－ａｒｍｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、抗体重鎖、Ｆａｂ領域を欠いている切断された重鎖、および単一軽鎖によって構成される特定のタイプの一価抗体断片を指す。
本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、１つの特定のエピトープに結合することができる抗体（二価抗体を含むがこれらに限定されない）を指す。
本明細書における、「二重特異性抗体」および「ｂｉＡｂ」という用語は、ＦＶＩＩ（ａ）およびＴＬＴ－１などの２つの異なる抗原、または同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。
本発明の二重特異性抗体は、抗体またはその抗原結合断片に由来する。本発明の二重特異性抗体は、抗体および抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、またはｓｃＦｖなどの、融合物またはコンジュゲートであってもよい。本発明の二重特異性抗体は、抗体断片の融合物またはコンジュゲートであってもよい。抗体および抗体断片に由来する二重特異性抗体の広範な分子形式は、当技術分野で公知であり、例えば、（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７，（２０１５），ｐｐ．９５－１０６）および（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ：ＭＡＢＳ，９（２０１７），ｐｐ１８２－２１２）を参照されたい。
二重特異性抗体は、当技術分野に記載される様々な方法で作製されてもよく、例えば、（Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７，（２０１５），ｐｐ．９５－１０６）および（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ：ＭＡＢＳ，９（２０１７），ｐｐ１８２－２１２）を参照されたい。例えば、所望の重鎖対形成は、ヘテロ二量体化を促進するためにＦｃ領域の二量体化界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を操作することによって達成することができる。この一例は、いわゆるノブ・イン・ホール変異であり、立体的に嵩高い側鎖（ノブ）が、対向するＦｃ上の立体的に小さい側鎖（ホール）に一致する１つのＦｃに導入され、それによってヘテロ二量体化を促進する立体的相補性を作製する。操作されたヘテロ二量体化Ｆｃ界面についての他の方法は、静電相補性、非ＩｇＧヘテロ二量体化ドメインへの融合、またはヒトＩｇＧ４の天然Ｆａｂアーム交換現象を利用してインビトロでヘテロ二量体化を行うことである。ヘテロ二量体化二重特異性抗体の例は、文献、例えば、（Ｋｌｅｉｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．；ＭＡｂｓ．２０１２ ４，ｐｐ６５３－６６３）に詳しく説明されている。ヘテロ二量体抗体の軽鎖には、特別な注意を払う必要がある。ＬＣとＨＣとの正しい対形成は、共通の軽鎖の使用によって達成することができる。この場合も、ＬＣ／ＨＣ界面の操作を使用して、ＣｒｏｓｓＭａｂの場合のように、ヘテロ二量体化または軽鎖クロスオーバー操作を促進することができる。適切な変異を含有する２つの個別ＩｇＧからの穏やかな還元条件下での抗体のインビトロ再構築も、二重特異性抗体の生成に使用できる（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０（２０１３），ｐｐ５１４５－５１５０）。また、正しい軽鎖の対形成を確実にするための、天然Ｆａｂアーム交換方法も報告されている。
本明細書で使用される場合、「多重特異性」抗体という用語は、２つ以上の異なる抗原または同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。したがって、多重特異性抗体は、二重特異性抗体を含む。
本明細書の抗体は、当該技術分野で公知の他の抗体および抗体断片と組み合わせて、二重特異性、三重特異性、または多重特異性抗体分子を作り出すことができる。
一態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。このような抗体は、例えば、適切な抗体ディスプレイまたは免疫化プラットフォーム、または当分野で公知のその他の適切なプラットフォームまたは方法を使用することによって生成することができる。
さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域またはその一部分も、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）。
ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づいて構築された配列ライブラリから単離されてもよく、天然および合成の配列多様性でさらに多様化されている。
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続いて、リンパ球のエプスタイン・バーウイルスでの形質転換によって調製され得る。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の組み換え方法によって産生されてもよい。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（ＣＤＲ領域またはその部分）を含有するヒト／非ヒト抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの少なくとも超可変領域からの残基が、所望の特異性、アフィニティー、配列組成および機能性を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）からの抗体の超可変領域からの残基で置換される。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。そのような修飾の例は、１つ以上のいわゆる逆突然変異の導入であり、これは典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に公知の組み換え技法を使用して実施されてもよい（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４８，Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｌｏ編を参照）。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に対する適切なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造相同性によって識別され得る。あるいは、例えば、構造、生物物理学特性および生化学特性の知識に基づいて、固定レシピエントフレームワークを使用してもよい。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来または成熟抗体配列由来とすることができる。ドナー抗体からのＣＤＲ領域は、ＣＤＲ移植によって移すことができる。ＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入（逆突然変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を与える重要なフレームワーク位置の特定により、例えば、アフィニティー、機能性、および生物物理学特性をさらに最適化することができる。ドナー抗体由来の逆突然変異に加えて、ヒト化抗体を、ＣＤＲまたはフレームワーク領域への生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的変異誘発、アフィニティー成熟などによって操作することができる。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するためになされる。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのその部分も含むことができる。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２種以上の種に由来する抗体の部分を含む抗体を指す。例えば、こうした抗体をコードする遺伝子は、２つの異なる種から生じた、可変ドメインをコードする遺伝子および定常ドメインをコードする遺伝子を含む。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子は、ヒト起源の抗体の定常ドメインをコードする遺伝子に結合されてもよい。
抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の観点から画定され得る。「相補性決定領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与するアミノ酸残基が典型的位置する抗体の領域を指す。ＣＤＲは、抗体可変ドメイン間の最も高い可変性を有する領域として特定することができる。ＫａｂａｔデータベースなどのデータベースをＣＤＲ識別に使用することができ、このＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのアミノ酸残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）を含むものとして画定される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、上述のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に説明される方法によって実施される。本明細書において、「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」、および「Ｋａｂａｔによれば」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）もしくはＣＤＲの短縮化、またはそれらへの挿入に対応する、より少ないか、または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる、残基５２ａ、５２ｂ、および５２ｃ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定され得る。ナンバリングは、具体的に記載されている場合のみＫａｂａｔに従うが、そうでない場合、ナンバリングは指定された配列番号に従って連続する。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内にないこれらのＶＨまたはＶＬアミノ酸残基を指す。
本発明の抗体は、本明細書に開示される特定の抗体のうちの１つ以上からのＣＤＲ領域を含み得る。
「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生成するために、免疫応答性の脊椎動物の免疫化のために使用される分子実体を指す。本明細書において、Ａｇはより広く呼称され、概して、Ａｂによって認識される標的分子を含むことが意図される。
本発明は、本明細書に開示される特定の配列に１、２、３、４、または５個のアミノ酸置換ならびに／または欠失および／もしくは挿入を含み得る本発明の抗体のバリアントまたはその抗原結合断片を包含する。
「置換」バリアントは、好ましくは、１つ以上のアミノ酸を同数のアミノ酸で置換することを含む。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体（Ａｂ）などの「抗原結合ポリペプチド」とその対応する抗原（Ａｇ）の間の分子相互作用に関して定義される。一般に、「エピトープ」は、Ａｂが結合するＡｇ上の区域または領域、すなわちＡｂと物理的接触する区域または領域を指す。本発明において、エピトープは、Ｘ線導出結晶構造を使用して決定され、例えばＦａｂ断片などのＡｂとそのＡｇ間の複合体の空間座標を定義する。本明細書において、エピトープという用語は、別段の指定がない限り、または文脈によって矛盾しない限り、Ｆａｂ中の重原子から４Åの距離内に重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＡｇ（ここではＦＶＩＩ（ａ）またはＴＬＴ－１）残基として定義される。
例えば、Ｘ線構造から判定されるアミノ酸レベルで記載されるエピトープは、同一のアミノ酸残基の組を含有する場合には同一であると言われる。少なくとも１つのアミノ酸残基がエピトープによって共有される場合、エピトープは重複すると言われる。アミノ酸残基がエピトープによって共有されない場合、エピトープは分離されている（固有である）と言われる。
「パラトープ」という用語の定義は、見方を逆転することによって「エピトープ」の上述の定義から導き出される。したがって、「パラトープ」という用語は、抗原が結合する、すなわち抗原と物理的接触をする、抗体またはその断片上の区域または領域を指す。パラトープという用語は、本明細書では、別段の指定がない限り、または文脈によって矛盾しない限り、ＦＶＩＩ（ａ）またはＴＬＴ－１の重原子から４Åの距離内に重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＡｂ残基として定義される。
抗原上のエピトープは、１つ以上のホットスポット残基、すなわち、同族抗体との相互作用に特に重要な残基を含んでもよく、前記ホットスポット残基の側鎖によって媒介される相互作用は、抗体／抗原相互作用の結合エネルギーに著しく寄与する（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１１，（２０１４），Ｅ２６５６－Ｅ２６６５）。ホットスポット残基は、抗原のバリアントを試験することによって識別することができ、単一エピトープ残基が、例えば、同族抗体への結合のためにアラニンによって置換されている。アラニンへのエピトープ残基の置換が、抗体への結合に強い影響を及ぼす場合、前記エピトープ残基はホットスポット残基とみなされ、したがって抗原への抗体の結合に特に重要である。
同じ抗原に結合する抗体は、それらの共通抗原に同時に結合する能力に関して特徴付けることができ、「競合結合」／「ビニング」の対象となる場合がある。本文脈では、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体をグループ化する方法を指す。抗体の「ビニング」は、標準技法に基づくアッセイにおける２つの抗体のそれらの共通抗原に対する競合結合に基づくことができる。抗体の「ビン」は、参照抗体を使用して定義される。二次抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができない場合、二次抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および二次抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合し、「競合抗体」と呼ばれる。二次抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができる場合、二次抗体は、別々の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および二次抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」と呼ばれる。
抗体が本明細書に開示される抗ＦＶＩＩ（ａ）または抗ＴＬＴ－１抗体との結合について競合するかどうかを決定するための競合アッセイは、当該技術分野で公知である。例示的な競合アッセイとしては、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴解析（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）機器の使用）、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））、およびフローサイトメトリーが挙げられる。
典型的には、競合アッセイは、固体表面に結合した、または細胞表面上に発現した抗原、試験ＦＶＩＩ－またはＦＶＩＩａ結合抗体、および参照抗体の使用を含む。参照抗体は標識化され、試験抗体は標識化されない。競合阻害は、試験抗体の存在下での固体表面または細胞に結合した標識化された参照抗体の量を決定することによって測定される。通常、試験抗体は、過剰に存在する（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍）。競合アッセイで競合的であると特定される抗体（すなわち、競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープ、または重複エピトープに結合する抗体、および立体障害が生じるために参照抗体が結合するエピトープに十分に近位の隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。
例示的な競合アッセイでは、参照抗ＦＶＩＩまたは抗ＦＶＩＩａ抗体は、市販の試薬を使用してビオチン化される。ビオチン化参照抗体は、試験抗体または標識化されていない参照抗体の段階希釈液と混合し（自己競合対照）、標識化された参照抗体に対して、試験抗体（または標識化されていない参照抗体）の様々なモル比の混合物（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）が得られる。抗体混合物を、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａポリペプチドコーティングＥＬＩＳＡプレートに添加する。次いで、プレートを洗浄し、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）をプレートに添加する。標的抗原に結合された標識された参照抗体の量は、当技術分野で公知の発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）またはＡＢＴＳ（２，２”－アジノ－ジ－（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸塩）の添加後に検出される。光学密度の読み取り（ＯＤ単位）は、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を使用して行われる。ゼロパーセント阻害に対応する応答（ＯＤ単位）は、競合抗体を有さないウェルから決定される。１００％阻害に対応する応答（ＯＤ単位）、すなわちアッセイバックグラウンドは、標識された参照抗体または試験抗体を有さないウェルから決定される。各濃度での試験抗体（または標識されていない参照抗体）による、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａに対する標識された参照抗体の阻害率を、以下のように計算する：％阻害＝（１－（ＯＤ単位－１００％阻害）／（０％阻害－１００％阻害））＊１００。
当業者であれば、２つ以上の抗ＴＬＴ－１抗体が、結合領域、ビンを共有するか、かつ／または競合的に抗原を結合するかどうかを決定するために、類似のアッセイを実施し得ることを理解するであろう。当業者であれば、競合アッセイが、当該技術分野で公知の様々な検出システムを使用して実施することができることも理解するであろう。
過剰な１つの抗体（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）が他の抗体の結合を阻害する場合、例えば、競合結合アッセイで測定されるように、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％阻害する場合、試験抗体は、抗原への結合について参照抗体と競合する。
特に明記しない限り、競合は、上記の、および実施例７および３２に提示されるように競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定される。
「結合親和性」という用語は、本明細書では、２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有相互作用の強度の尺度として使用される。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用を説明するために使用される。
２つの分子間、例えば、一価の相互作用による、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を決定することによって定量化され得る。ＫＤは、複合体形成および解離の動態を、例えば、実施例６および１６で行われるような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法または当技術分野で知られている他の方法によって測定することによって決定することができる。一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）、および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを介して、ｋａおよびｋｄと関連する。
上記の定義にしたがって、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較など、異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個別の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較によって比較されてもよい。
その標的に対する本発明の抗体のＫＤは、１ｐＭ未満、例えば１０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満、例えば４００ｐＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば１ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、例えば２００ｎＭ未満、例えば４００ｎＭ未満、例えば６００ｎＭ未満、例えば８００ｎＭ未満、などであってもよい。
このような一実施形態では、抗体は、１ｐＭ未満、例えば１０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満、例えば４００ｐＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば１ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、例えば２００ｎＭ未満、例えば４００ｎＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば８００ｐＭ未満などのＦＶＩＩａに対するＫＤを有する抗ＦＶＩＩ（ａ）アームと、１ｐＭ未満、例えば１０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満、例えば４００ｐＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば１ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、例えば２００ｎＭ未満、例えば４００ｎＭ未満、例えば６００ｎＭ未満、例えば８００ｎＭ未満などのＴＬＴ－１に対するＫＤを有する第２の抗ＴＬＴ－１アームと、を含む、二重特異性抗体である。
当該技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の文字列の間の一致の数によって決定されるような、ポリペプチド間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全一致の割合を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。本発明では、ＥＭＢＯＳＳ－６．６．０からのＮｅｅｄｌｅｍａｎ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３－４５３）を使用し、ギャップ開始およびギャップ伸長についてそれぞれパラメータ１０および０．５を使用して（ｇａｐｏｐｅｎ＝１０、ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５）、類似性および同一性が決定された。
抗体の断片結晶可能領域（「Ｆｃ領域」／「Ｆｃドメイン」）は、抗体のＣ末端領域であり、これはヒンジおよび定常ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
本発明の抗体は、野生型アミノ酸配列を有し得るＦｃ領域を含み得るか、または抗体のエフェクター機能を調節するアミノ酸置換を含み得、例えば、（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．９（２０１８），ｐｐ．６３－７３）を参照されたい。修飾エフェクター機能を有するＦｃバリアントの特定の例は、Ｆｃγ受容体への結合が低減されているバリアントである。そのようなバリアントの１つの具体的な例は、特定のＦｃγ受容体およびＣ１ｑに対する親和性が低下したＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵインデックスによる残基ナンバリング）の置換を含むＩｇＧ１である。
二重特異性分子
本明細書中の「二重特異性分子」という用語は、ＦＶＩＩ（ａ）およびＴＬＴ－１などの異なる標的に結合することができる分子を指す。二重特異性分子の結合部分は、抗体由来であってもよく、または非抗体起源であってもよい。二重特異性分子の１つの特定の例は、二重特異性抗体である。
本発明の一態様では、二重特異性分子は、第ＶＩＩ因子（ａ）を結合することができる第１の抗原結合部位と、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ－１）を結合することができる第２の抗原結合部位とを含む。
本発明の二重特異性分子は、非抗体由来結合部分を含んでもよく、これは代替的足場とも呼ばれる。本発明の二重特異性分子は、代替的足場の融合物またはコンジュゲートであってもよい。本発明の二重特異性分子は、抗体および代替的足場の融合物またはコンジュゲートであってもよい。本発明の二重特異性分子はまた、抗体断片および代替的足場の融合物またはコンジュゲートであってもよい。
多数の様々な代替的足場が当技術分野で公知であり、例えば、（Ｓｉｍｅｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ９（２０１８），ｐｐ．３－１４）、（Ｋoｎｎｉｎｇ ａｎｄ Ｋｏｌｍａｒ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（２０１８），ｐｐ．１７－３２）、および（Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０（２００４），ｐｐ３－２８）を参照されたい。
代替的な足場の具体的な例は、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）、アンティカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アヴィマー（Ａｖｉｍｅｒ）、アトリマー（Ａｔｒｉｍｅｒ）、ＦＮ３足場、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、オボディ（Ｏｂｏｄｙ）、クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメイン、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメイン、ノッティン（Ｋｎｏｔｔｉｎ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ダーピン（ＤＡＲＰｉｎ）、二環性ペプチド、およびシステインノット（Ｃｙｓ－ｋｎｏｔ）である。
第ＶＩＩ（ａ）因子
本明細書中の「第ＶＩＩ因子」および「ＦＶＩＩ」という用語は、凝固第ＶＩＩ因子の酵素前駆体を指す。本明細書中の「第ＶＩＩａ因子」および「ＦＶＩＩａ」という用語は、セリンプロテアーゼである活性化凝固第ＶＩＩ因子を指す。本明細書中の「第ＶＩＩ（ａ）因子」および「ＦＶＩＩ（ａ）」という用語は、非切断の酵素前駆体である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、ならびに切断されて活性化されたプロテアーゼである第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）を包含する。本明細書中の「第ＶＩＩ（ａ）因子」および「ＦＶＩＩ（ａ）」という用語は、存在し得るＦＶＩＩ（ａ）の天然対立遺伝子バリアントを含む。１つの野生型ヒト第ＶＩＩ（ａ）因子配列が、配列番号 １に提示される。
野生型ヒト凝固第ＶＩＩ（ａ）因子（配列番号１）：
ＡＮＡＦＬＥＥＬＲＰＧＳＬＥＲＥＣＫＥＥＱＣＳＦＥＥＡＲＥＩＦＫＤＡＥＲＴＫＬＦＷＩＳＹＳＤＧＤＱＣＡＳＳＰＣＱＮＧＧＳＣＫＤＱＬＱＳＹＩＣＦＣＬＰＡＦＥＧＲＮＣＥＴＨＫＤＤＱＬＩＣＶＮＥＮＧＧＣＥＱＹＣＳＤＨＴＧＴＫＲＳＣＲＣＨＥＧＹＳＬＬＡＤＧＶＳＣＴＰＴＶＥＹＰＣＧＫＩＰＩＬＥＫＲＮＡＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧＫＶＣＰＫＧＥＣＰＷＱＶＬＬＬＶＮＧＡＱＬＣＧＧＴＬＩＮＴＩＷＶＶＳＡＡＨＣＦＤＫＩＫＮＷＲＮＬＩＡＶＬＧＥＨＤＬＳＥＨＤＧＤＥＱＳＲＲＶＡＱＶＩＩＰＳＴＹＶＰＧＴＴＮＨＤＩＡＬＬＲＬＨＱＰＶＶＬＴＤＨＶＶＰＬＣＬＰＥＲＴＦＳＥＲＴＬＡＦＶＲＦＳＬＶＳＧＷＧＱＬＬＤＲＧＡＴＡＬＥＬＭＶＬＮＶＰＲＬＭＴＱＤＣＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮＩＴＥＹＭＦＣＡＧＹＳＤＧＳＫＤＳＣＫＧＤＳＧＧＰＨＡＴＨＹＲＧＴＷＹＬＴＧＩＶＳＷＧＱＧＣＡＴＶＧＨＦＧＶＹＴＲＶＳＱＹＩＥＷＬＱＫＬＭＲＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲＡＰＦＰ
野生型ＦＶＩＩ（ａ）は、４０６個のアミノ酸残基からなり、４つのドメインから構成されている。Ｎ末端のガンマ－カルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメインがあり、ここで、１０個のグルタミン酸残基（上の配列では太字で強調表示されている）は、ガンマ－カルボキシル化されてもよい。ｇｌａドメインに続いて、２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインと、Ｃ末端セリンプロテアーゼドメインとが続く。ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａの両方は循環中に存在するが、ＦＶＩＩａは少量のみである（ＦＶＩＩ（ａ）プール全体の約１％、Ｍａｒｄｅｒ ＶＪ，Ａｉｒｄ ＷＣ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＪＳ，Ｓｃｈｕｌｍａｎ Ｓ，Ｗｈｉｔｅ ＩＩ ＧＣ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ．６ｔｈ ｅｄ．Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ ＆ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ；２０１３．ｐ．１６３－７８中のＭｏｒｒｉｓｓｅｙ ＪＨ，Ｂｒｏｚｅ Ｊｒ ＧＪ．Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＴＦＰＩ）ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．）。ＦＶＩＩは、残基Ａｒｇ１５２とＩｌｅ１５３との間のタンパク質分解切断によってＦＶＩＩａに活性化され、軽鎖および重鎖からなる２鎖ＦＶＩＩａ分子をもたらすことができる。ＦＶＩＩａ中の２つの鎖は、ジスルフィド結合によって繋がれている。軽鎖は、ＧｌａおよびＥＧＦ様ドメインを含有し、ならびに重鎖はプロテアーゼドメインを含有する。ＦＶＩＩａは、その完全な生物活性に達するために、その細胞表面補因子組織因子（ＴＦ）への結合を必要とする。
予測全長カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＦＶＩＩアイソフォームＸ１は、ＮＣＢＩ参照配列ＩＤ ＸＰ＿０１５２９５０４３．１を有する４０６アミノ酸で構成されている。本明細書中の用語「ｃＦＶＩＩａ－キメラ」は、キメラカニクイザルＦＶＩＩａ構築物を指す。ｃＦＶＩＩａ－キメラのアミノ酸配列は、Ｇｌａおよび第１のＥＧＦ様ドメイン（ヒトＦＶＩＩａ配列と整列した場合にアミノ酸１～８８）がヒトＦＶＩＩ配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ０８７０９）で構成され、一方で第２のＥＧＦ様ドメインおよびプロテアーゼドメイン（ヒトＦＶＩＩａ配列と整列した場合にアミノ酸８９－４０６）がカニクイザルＦＶＩＩアイソフォームＸ１配列（ＮＣＢＩ参照配列ＩＤ ＸＰ＿０１５２９５０４３．１）で構成される。
ヒトにおける組み換えＦＶＩＩａ（および内因性ＦＶＩＩａ）の活性半減期は、静脈内に投与した場合、約２～３時間である。第ＶＩＩ（ａ）因子は、生産および精製の周知の方法を使用して、内因性、血漿由来、または組み換え的に産生され得る。グリコシル化、ガンマカルボキシル化、および他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞およびその成長条件に応じて変化し得る。
第ＶＩＩａ因子は、様々なコンフォメーションで見出され得る。第ＶＩＩａ因子は、不活性なコンフォメーションまたは不活性な形態で血液中に循環する。このコンフォメーションは、触媒活性を有しない。ＦＶＩＩａはまた、活性コンフォメーションまたは活性形態で見出されてもよく、本明細書では、完全に活性または完全に活性化されたＦＶＩＩａとも呼ぶ。ＦＶＩＩａという用語は、不活性形態またはコンフォメーションのＦＶＩＩａ、および活性形態またはコンフォメーションのＦＶＩＩａを包含する。例えば、ＦＶＩＩａの活性コンフォメーションは、例えば、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ（１～２１９）の形態で、ＦＶＩＩａと組織因子（ＦＶＩＩａ／ＴＦ）との間の複合体を含んでもよく、ここでｓＴＦ（１～２１９）は、組織因子の切断されたおよび可溶性形態であり、または、ＦＶＩＩａの活性コンフォメーションは、活性部位阻害ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）を含んでもよい。ＦＶＩＩａｉは、ダンシル－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－ＡｒｇクロロメチルケトンまたはＰｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－クロロメチルケトン（ＦＦＲ－クロロメチルケトン）（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：３４１３－３４２０およびＳｈφｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１１８６３－１１８６８）を用いたＦＶＩＩａの処理によって産生され得る、ＦＶＩＩａの触媒的に不活性な形態である。ＦＶＩＩａｉは、ＴＦに対するその親和性を保持しており、ＴＦ結合によってＦＶＩＩａに誘導されるのと同じコンフォメーションを採用すると考えられている。したがって、ＦＶＩＩａｉは、活性化コンフォメーションを有し、試験化合物のＦＶＩＩａｉへの結合は、試験化合物が野生型ＦＶＩＩａの活性化形態にも結合することを示唆する。
抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の標的分子は、本明細書に記載される任意のＦＶＩＩ（ａ）分子であってもよい。
ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ－１）
骨髄細胞（ＴＲＥＭ）上に発現されるトリガー受容体は、様々な骨髄系遺伝子の生物学において十分に確立された役割を有し、自然免疫および適応免疫の調節において重要な役割を果たしている。ＴＲＥＭ様転写物（ＴＬＴ）－１は、このタンパク質ファミリーに属するが、ＴＬＴ－１遺伝子は、単系統、すなわち巨核球および血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）（血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ））でのみ発現し、巨核球および血小板のアルファ顆粒にのみ見られる。ＴＬＴ－１は、アルファ顆粒放出時に活性化された血小板の表面上に露出される膜貫通型タンパク質である。これまでのところ、ＴＬＴ－１は、休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）血小板の表面または他の細胞型の表面上には見出されていない。
ＴＬＴ－１は、細胞外球状頭部、ストーク領域（ｓｔａｌｋ ｒｅｇｉｏｎ）、膜貫通ドメイン、および免疫受容体チロシン系阻害性モチーフを含有する細胞内ドメインを含有する（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００２；１００：３８２２－３８２４）。ヒトＴＬＴ－１（ｈＴＬＴ－１）の細胞外球状頭部は、単一の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインである。これは、ストーク（ｓｔａｌｋ）と呼ばれる３７個のアミノ酸リンカー領域によって血小板膜に接続される（Ｇａｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００６，２８１，１９，１３３９６－１３４０３）。
ｈＴＬＴ－１の推定上の膜貫通セグメントは、２０アミノ酸長である。ＴＬＴ－１はまた、細胞内シグナル伝達モチーフとして機能し得る細胞質の免疫受容体チロシン系阻害性モチ－フ（ＩＴＩＭ）を有する。
ＴＬＴ－１の小部分は、血小板活性化時に脱落し、可溶性形態（ｓＴＬＴ－１）を形成する（Ｇａｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００６，２８１，１９，１３３９６－１３４０３）。切断部位は、血小板膜に近接して位置する。切断された細胞内ドメインを有するＴＬＴ－１のより短いアイソフォームも、血小板中に存在する。
ＴＬＴ－１は、損傷部位における凝固およびおそらく炎症の制御に関与する。ＴＬＴ－１は、いくつかの血小板アゴニストの最適以下の濃度に応答して、血小板凝集において役割を果たす（Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００７；９７：９５５－９６３．）。ＴＬＴ－１に対し最もよく説明されるリガンドはフィブリノーゲンである（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００９；１１９：１４８９－３８２４．）。最近ＴＬＴ－１は、フォン・ヴィルブランド因子にも結合することが示された（Ｄｏｅｒｒ Ａ ｅｔ ａｌ，ａｂｓｔｒａｃｔ ＰＢ３５９ ａｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２０１９）。ｓＴＬＴ－１は、白血球活性化を弱め、血小板－好中球クロストークを調節することによって敗血症に関連する出血に関与することが示唆されている（Ｄｅｒｉｖｅ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２，１８８：５５８５－５５９２）。
本発明に関して、ＴＬＴ－１は、げっ歯類（マウス、ラット、またはモルモットなど）、ウサギ目（ウサギなど）、偶蹄目（ブタ、ウシ、ヒツジ、またはラクダなど）、または霊長類（サルまたはヒトなど）などの任意の哺乳動物などの任意の脊椎動物由来のものであってもよい。ＴＬＴ－１は、好ましくはヒトＴＬＴ－１である。ＴＬＴ－１は、機能性ＴＬＴ－１タンパク質を生じさせる任意の天然由来の遺伝子型または対立遺伝子から翻訳されてもよい。１つのヒトＴＬＴ－１の非限定的な例は、配列番号 ２のポリペプチド配列である。
ＴＬＴ－１抗体の標的分子は、本明細書に記載される任意のＴＬＴ－１分子であってもよい。
抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体
本明細書中の「抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体」という用語は、その標的としてＦＶＩＩ（ａ）を有する抗体を指す。抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、本明細書に記載のＦＶＩＩ（ａ）分子に結合することができ、それらは限定されないが、ヒト血漿中に存在する内因性ＦＶＩＩ（ａ）、組み換え野生型ヒトＦＶＩＩ（ａ）のような外因性ＦＶＩＩ（ａ）、例えば、ウサギ、マウス、ラット、イヌ、またはサルなどの動物血漿中に存在する内因性ＦＶＩＩ（ａ）などが含まれる。
抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、その標的としてＦＶＩＩ（ａ）を有するモノクローナル、単一特異性抗体であり得る。単一特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、典型的には、ＦＶＩＩ（ａ）に結合する２つの同一の抗原結合部位を含み、非限定的な例では、モノクローナルＩｇＧ４抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体である。
適切な抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、限定されるものではないが、表３に示される抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のいずれか１つを含む。
抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）への結合について、表３に示す抗体のいずれか１つと競合する可能性があり得る。抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体が、ＦＶＩＩ（ａ）への結合について表３に示される抗体のいずれか１つと競合するか否かは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーなどの周知の方法（すなわち、競合結合アッセイ）を使用して決定され得る。実施例７は、競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＦＶＩＩ（ａ）への競合結合がどのように決定され得るかを記載する。
一実施形態では、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、高い親和性でＦＶＩＩ（ａ）に結合する。抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、１ｐＭ未満、例えば１０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満、例えば４００ｐＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば１ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、例えば２００ｎＭ未満、例えば４００ｎＭ未満、例えば６００ｎＭ未満、例えば８００ｎＭ未満、などのその標的に対するＫＤを有し得る。インビボでは、高親和性抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、それと複合体を形成することによって、ＦＶＩＩ（ａ）のクリアランスを減少させる。それによって、ＦＶＩＩ（ａ）の半減期を延ばし、循環中に蓄積させる。このようにして、抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）の定常状態濃度の上昇をもたらすことができる。
一実施形態では、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）の生物学的機能を妨害しない。一実施形態では、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、内因性ＦＶＩＩがＦＶＩＩａに活性化されることを妨げない。例えば、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、ＴＦに結合されている間（実施例１２に記載されるように）、ＦＶＩＩａに変換する（すなわち、自動活性化する）ＦＶＩＩの能力を妨害しない。また、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、（実施例１０に記載されるように）ＦＶＩＩ（ａ）が組織因子（ＴＦ）といわゆる開始複合体を形成するのを妨げず、ＴＦ依存的または非依存的にで第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化するのを妨げないことも好ましい。一実施形態では、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）基質または補因子と競合しない。しかしながら、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、（実施例１１に記載されるように）アンチトロンビン（ＡＴ）およびアルファ－２－マクログロブリンなどのＦＶＩＩａのインヒビターと競合する場合がある。
抗ＴＬＴ－１抗体
本明細書中の「抗ＴＬＴ－１抗体」という用語は、その標的としてＴＬＴ－１を有する抗体を指す。抗ＴＬＴ－１抗体は、本明細書に記載されるようにＴＬＴ－１分子に結合することができる。ＴＬＴ－１抗体は、モノクローナル、単一特異性抗体であり得る。
適切な抗ＴＬＴ－１抗体には、限定されるものではないが、表４に示される抗ＴＬＴ－１抗体が含まれる。
抗ＴＬＴ－１抗体は、ＴＬＴ－１への結合について、表４に示す抗体のいずれか１つと競合する可能性があり得る。抗ＴＬＴ－１抗体が、ＴＬＴ－１への結合について、表４に示される抗体のいずれか１つと競合するか否かは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリーなどの周知の方法（すなわち、競合結合アッセイ）を使用して決定され得る。ＴＬＴ－１への競合結合は、競合ＥＬＩＳＡを使用して決定されてもよい。実施例３２は、競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＴＬＴ－１への競合結合がどのように決定され得るかを記載する。
抗ＴＬＴ－１抗体は、１ｐＭ未満、例えば１０ｐＭ未満、例えば１００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満、例えば４００ｐＭ未満、例えば６００ｐＭ未満、例えば１ｎＭ未満、例えば５ｎＭ未満、例えば１０ｎＭ未満、例えば２０ｎＭ未満、例えば５０ｎＭ未満、例えば１００ｎＭ未満、例えば２００ｎＭ未満、例えば４００ｎＭ未満、例えば６００ｎＭ未満、例えば８００ｎＭ未満などのその標的に対するＫＤを有し得る。
抗ＴＬＴ－１抗体は、ＴＬＴ－１の機能を妨害せず、特に血小板凝集を阻害しないことが好ましい。
好ましい一実施形態では、抗ＴＬＴ－１抗体は、血小板凝集を妨害することなく、ＴＬＴ－１に結合することができる。
別の好ましい実施形態では、抗ＴＬＴ－１抗体は、ＴＬＴ－１への結合についてフィブリノーゲンと競合することなく、ＴＬＴ－１に結合することができる。
別の好ましい実施形態では、ＴＬＴ－１抗体は、ＴＬＴ－１の脱落を妨害しない。
抗ＴＬＴ－１抗体が、ＴＬＴ－１以外の任意の他の骨髄細胞上に発現されるトリガー受容体（ＴＲＥＭ）、または任意の他の休止血小板もしくは活性化血小板上の受容体、に結合しないか、またはそれらに対してほとんど親和性を示さないことが好ましい。
一実施形態では、抗ＴＬＴ－１抗体は、ＴＬＴ－１のストークに結合する。
二重特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１抗体
本発明の二重特異性抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）を結合することができる第１の抗原結合部位、およびＴＬＴ－１を結合することができる第２の抗原結合部位を含む。
抗ＦＶＩＩ（ａ）抗原結合部位
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＦＶＩＩ（ａ）を結合することができる第１の抗原結合部位を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合部位は、表３に識別された抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のいずれか１つとＦＶＩＩ（ａ）への結合について競合し、表３に識別された抗体のいずれか１つと同一のエピトープを有し、表３に識別された抗体のいずれか１つと同一のＣＤＲ領域を有し、表３に識別された抗体のいずれか１つと同一のＶＬ領域およびＶＨ領域を有する。
抗ＴＬＴ－１抗原結合部位
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＴＬＴ－１を結合することができる第２の抗原結合部位を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合部位は、表４に識別された抗ＴＬＴ－１抗体のいずれか１つとＴＬＴ－１への結合について競合し、表４に識別された抗体のいずれか１つと同一のエピトープを有し、表４に識別された抗体のいずれか１つと同一のＣＤＲ領域を有し、表４に識別された抗体のいずれか１つと同一のＶＬ領域およびＶＨ領域を有する。
修飾エフェクター機能
本発明の二重特異性抗体は、野生型アミノ酸配列を有し得るＦｃ領域を含むことができ、または抗体のエフェクター機能を調節するアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．９（２０１８），ｐｐ．６３－７３）を参照されたい。修飾エフェクター機能を有するＦｃバリアントの具体例は、Ｆｃγ受容体への結合が低減されているバリアントである。そのようなバリアントの一具体例は、特定のＦｃγ受容体およびＣ１ｑに対する親和性が低下した、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＥＵインデックスによる残基ナンバリング）を含むＩｇＧ１である。
本発明の二重特異性抗体の所望の特性は、インビボでの長い半減期である。Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体は、ＦｃＲｎ受容体を介してリサイクルされ、レスキューされてもよく、それにより所望の長い半減期をもたらし得る。Ｆｃ領域を欠く本発明の二重特異性抗体については、半減期は他の手段によって延長され得る。ポリペプチドおよび抗体の半減期の延長を取得するための様々な方法および原理が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ：Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２０１６），ｐｐ．９０３－９１５）およびその参考文献を参照されたい。
ポリペプチドおよび抗体のＦｃベースの半減期延長に加えて、アルブミンまたはアルブミンバリアントへの融合またはコンジュゲーションは、半減期の延長において効果的であることが実証されている。別のアプローチは、ＸＴＥＮまたはＰＥＧなどのポリマーの付着である（参照を挿入）。さらに、インビボでの半減期の延長は、アルブミン結合部分の付着によって得ることができ、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ２４（２０１８），ｐｐ．４９３２－４９４６、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ：Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２０１６），ｐｐ．９０３－９１５）およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（２０１１），ｐｐ８６８－８７６）を参照されたい。
機能的特徴
ＦＶＩＩ（ａ）に結合することにより、本発明の二重特異性抗体は、循環中に存在するＦＶＩＩａの活性循環半減期を延長することができ、ＴＬＴ－１に結合することにより、二重特異性抗体および結合ＦＶＩＩ（ａ）は、活性化された血小板の表面に向けられる。これは次に、活性化された血小板上のＦＶＩＩａの蓄積の増加をもたらし、したがって血管損傷部位におけるＦＶＩＩａ凝固促進活性を増強する。したがって、本明細書に記載される二重特異性抗体は、薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性が改善された、ＦＶＩＩ（ａ）の内因性プールを与えることができる。
ヒトにおいて、投与された組み換えＦＶＩＩａの活性半減期は約２～３時間であることが知られている。組み換えＦＶＩＩａの短い半減期は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）による阻害、アルファ－２－マクログロブリン（α２Ｍ）による阻害、および腎クリアランスを含む、いくつかの機序の関与によると考えられる。同様の機序は、内因性ＦＶＩＩａにも当てはまり、したがってそれに同様の短い半減期を与えると考えられる。
内因性ＦＶＩＩａの半減期を含む、ＦＶＩＩａの活性半減期を延長するために、本明細書に記載される二重特異性抗体は、内因性ＦＶＩＩａ活性を失うことなく、その抗ＦＶＩＩアームまたはいわゆる「第１の抗原結合部位」によって、これらのクリアランス機構のうちの１つ以上を遮断することを目指す。ｂｉＡｂ：ＦＶＩＩａ複合体のＦｃ部分は、エンドソーム中で、ＦｃＲｎへの結合を介して、複合体のリサイクルを媒介し、分解からレスキューする。さらに、二重特異性抗体の高親和性抗ＦＶＩＩアームは、遊離内因性ＦＶＩＩａのサイズと比較して、ｂｉＡｂ：ＦＶＩＩａ複合体の分子サイズが増加するため、内因性ＦＶＩＩａをα２Ｍ阻害および腎クリアランスから保護する。二重特異性抗体の抗ＴＬＴ－１アームは、長期化された内因性ＦＶＩＩａを活性化された血小板に選択的に局在させる。活性化された血小板に対するＦＶＩＩａのこの局在化は、ＡＴ阻害に対する感受性を増加させることなく、ＦＶＩＩａ活性を増強する。
本発明の二重特異性抗体は、内因性または外因性ＦＶＩＩ（ａ）の平均滞留時間（ＭＲＴ）を増加させることができる。二重特異性抗体は、インビボでＦＶＩＩ（ａ）の活性を増強することができることが好ましい。
平均滞留時間
平均滞留時間（ＭＲＴ）は、分子が体内に留まり、治療活性に利用可能な平均時間である。ＭＲＴは、全身クリアランス（ＣＬ）で割った定常状態での分布容積（Ｖｓｓ）の関数として、式１に従って計算される。
ＭＲＴ＝Ｖｓｓ／ＣＬ 式 １
結果は、時間で表される。ＭＲＴは、式２に従って、有効血漿内半減期（ｔ１／２）と相関する。
ＭＲＴ＝ｌｎ（２）＊ｔ１／２ 式 ２
ＦＶＩＩ（ａ）のＭＲＴを増加させる抗体の能力は、例えば、例えばＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇａｂｒｉｅｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ）に記載されるものなど、周知の方法によって決定され得る。例えば、実験動物、例えばマウス、ラット、またはサルへのＩＶまたはＳＣ投与後のＦＶＩＩ（ａ）の血漿濃度または活性プロファイルの分析による。ＦＶＩＩ（ａ）の機能的ＭＲＴを増加させる抗体の能力は、限定されるものではないが、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイなどのアッセイで測定される、ＦＶＩＩ（ａ）の血漿活性プロファイルの分析によって決定され得る。
ＦＶＩＩ（ａ）のＭＲＴおよび機能的ＭＲＴを増加させる抗体の能力は、例えば、実施例９および１８に記載されるように決定されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明の抗体（ＦＶＩＩ（ａ））の非存在下でのＦＶＩＩ（ａ）の投与（ＦＶＩＩ（ａ）ポリペプチドのみ）と比較して、ＦＶＩＩ（ａ）のＭＲＴを、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイで測定されたように、本発明の二重特異性抗体の非存在下でのＦＶＩＩ（ａ）の投与と比較して、ＦＶＩＩ（ａ）の機能的ＭＲＴを、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍増加させることができる。
内因性ＦＶＩＩａの蓄積
本発明の二重特異性抗体が、循環する内因性機能的活性ＦＶＩＩａのレベルを増加させる能力は、例えば、これに限定されないが、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイなどのアッセイで測定される、例えばマウス、ラットまたはサルなどの実験動物への抗体の投与の前後で内因性ＦＶＩＩａのレベルを測定することによって決定され得る。
循環する内因性機能的活性ＦＶＩＩａのレベルを増加させる抗体の能力は、例えば、実施例２７および２８に記載されるように決定され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、投与された二重特異性抗体の非存在下での循環する内因性ＦＶＩＩａのレベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１６０倍、少なくとも３２０倍、少なくとも６４０倍、循環する内因性ＦＶＩＩａのレベルを増加させることができる。
ＴＬＴ－１およびＴＦ非依存性トロンビン生成
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、トロンビンを生成する第ＶＩＩａ因子のＴＬＴ－１およびＴＦ非依存性能力を維持または増加させることができる。
ＦＶＩＩ（ａ）ポリペプチドのトロンビン生成を増加させる抗体の能力は、例えば、実施例５に記載されるようなトロンビン生成アッセイなど、当該技術分野で周知の方法によって決定され得る。このアッセイでは、このアッセイではトロンビン生成を、リン脂質、２５ｎＭのＦＶＩＩａ、および添加されたＦＶＩＩａの飽和に近い濃度の抗体の存在下での血友病Ａ誘発性ヒト血漿で測定する。例えば、実施例６に例示されるようなＳＰＲによってＦＶＩＩａ－抗体相互作用について決定された測定された解離定数に従って、ＦＶＩＩａの＞９０％が抗体によって結合された場合に飽和に近づく。抗体の存在下および非存在下でのピークトロンビン形成の比率に基づき、抗体は、刺激性（＞１２０％）、阻害性（＜９０％）、または中性（９０～１２０％）に分類される。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、抗体の非存在下でのＦＶＩＩ（ａ）と比較して、トロンビン生成アッセイで測定されるように、第ＶＩＩ（ａ）ポリペプチドのトロンビンを生成する能力を維持する（中性）／増加させる（刺激）ことができる。
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、トロンビン生成アッセイで測定される、第ＶＩＩ（ａ）因子のトロンビンを生成する能力を、抗体の非存在下でのＦＶＩＩ（ａ）と比較して、少なくとも２０％まで増加させることができる。
アンチトロンビンおよび／またはアルファ－２－マクログロブリンによる阻害
一態様では、本発明の二重特異性抗体は、アンチトロンビン（ＡＴ）および／またはアルファ－２－マクログロブリンによる阻害に対するＦＶＩＩａの感受性を低減させることができる。
アンチトロンビン（ＡＴ）および／またはアルファ－２－マクログロブリンによるＦＶＩＩａの阻害を低減させる抗体の能力は、実施例５および１１に記載されるような当技術分野で周知の方法によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、抗体の非存在下でのＦＶＩＩａの阻害と比較して、アンチトロンビン（ＡＴ）および／またはアルファ－２－マクログロブリンによるＦＶＩＩａの阻害を低減させることができる。
ＴＬＴ－１依存性ＦＸａ生成（刺激活性アッセイ）
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、ＴＬＴ－１含有凝固促進性膜表面の存在下でＦＸ活性化を促進するＦＶＩＩａポリペプチドの能力を維持または増加させることができる。
ＦＸ活性化を促進するＦＶＩＩａポリペプチドの能力を増加させる、本発明の二重特異性抗体の能力は、例えば、実施例２１に記載されるＴＬＴ－１依存性刺激活性アッセイなど、当技術分野で周知の方法によって決定され得る。このアッセイでは、ＦＸ活性化は、ＦＸ（１５０ｎＭ）、ＦＶＩＩａ（２．５ｎＭ）、ＴＬＴ－１（４ｎＭ）を含有するリン脂質膜、および抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１二重特異性抗体の存在下で測定される。二重特異性抗体のいわゆる刺激活性（倍数増加として表される）は、二重特異性抗体の非存在下でのＦＶＩＩａによって生成される量に対する、１００ｎＭの二重特異性抗体の存在下で生成されたＦＸａの量である。
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体の刺激活性は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１５０倍である。
ＴＬＴ－１依存性全血栓形成
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、血友病Ａ条件下で、組み換えＦＶＩＩａの治療有効濃度に類似またはそれよりも良好に血栓形成を促進することができる。
全血血栓形成を改善する二重特異性抗体の能力は、例えば、実施例２９に記載されるようなトロンボエラストグラフィーアッセイなど、当技術分野で周知の方法によって決定され得る。このアッセイでは、実施例２７、２８、および２９に記載されるような二重特異性抗体の反復投与時に対応する内因性因子のインビボ定常状態血漿レベルを模倣する濃度で、二重特異性抗体がＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩａ：ＡＴと共に添加される、ヒト血友病－Ａ誘発全血において、血栓形成が測定される。凝固は、ＰＡＲ１アゴニストペプチドＳＦＬＬＲＮおよびカルシウムの添加によって誘導される。これらの条件下での凝固時間は、抗体の非存在下での２５ｎＭのＦＶＩＩａの添加によって達成される凝固時間と比較される。
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒト血友病Ａ誘発全血における凝固時間を、２５ｎＭのＦＶＩＩａの添加によって達成されるレベルと類似の、またはそれを下回るレベルに低減させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒト血友病Ａ誘発全血における凝固時間を、２ｎＭのＦＶＩＩａ、４ｎＭのＦＶＩＩａ、６ｎＭのＦＶＩＩａ、８ｎＭのＦＶＩＩａ、１０ｎＭのＦＶＩＩａ、１２ｎＭのＦＶＩＩａ、１６ｎＭのＦＶＩＩａ、または２０ｎＭのＦＶＩＩａの添加によって達成されるレベルと類似の、またはそれを下回るレベルに低減することができる。
医薬製剤
一態様では、本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、医薬的に許容可能な担体と共に製剤化された、二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。
本発明の一実施形態では、医薬製剤は、８０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、例えば１００～１８０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する二重特異性抗体を含み、当該製剤は２．０～１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、または界面活性剤、ならびにそれらの様々な組み合わせのうちの１つ以上をさらに含んでもよい。医薬組成物に保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤、および界面活性剤を使用することは、当業者には周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が参照され得る。
一実施形態では、医薬製剤は水性製剤である。そのような製剤は典型的には溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散剤、乳濁液、および多相材料も含み得る。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態では、医薬製剤は、使用前に医師または患者が溶媒および／または希釈剤を加える凍結乾燥製剤である。
さらなる態様では、医薬製剤は、製剤は、ＦＶＩＩ（ａ）ポリペプチド、本明細書に記載の二重特異性抗体、および緩衝液の水溶液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在し、当該製剤は約２．０～約１０．０のｐＨを有する。
本発明の組成物は、非経口的に、例えば静脈内、例えば筋肉内、例えば皮下など、好ましくは皮下に、投与されてもよい。本発明の組成物は、予防的に投与されてもよい。
本発明の医薬組成物は、凝固異常を有する対象を治療するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、凝固異常を有する任意のヒト患者または非ヒト脊椎動物を含む。
医療用途
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、は、それを必要とする任意のヒトまたは他の動物対象の医学的療法を指す。当該対象は、当該特定の治療の使用が当該ヒトまたは他の動物対象の健康に有益であることを示す、暫定的または決定的な診断を与えた医師による身体検査を受けていることが期待されている。前述の治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態の現状に応じて、個人によって異なり得る。本発明の凝固促進剤化合物の予防的または予防的投与も企図されており、予防は、疾患または障害の１つ以上の症状の発現もしくは悪化を遅延または回避することとして定義される。したがって、前述の治療は、予防的、緩和的、対症的（「オンデマンド」）および／または治癒的であり得る。
本発明に関して、予防的、緩和的および／または対症療法は、本発明の別個の態様を表し得る。
出血性傾向の増加をもたらす凝固異常は、正常な凝固カスケードの任意の凝固促進成分の任意の質的または量的欠損、または線維素溶解の任意の発現上昇によって引き起こされる可能性がある。こうした凝固異常は、先天性および／または後天性および／または医原性であり得、当業者によって識別される。
先天性低凝固障害（ｈｙｐｏｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ）の非限定的な例としては、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＶＩＩ因子欠損症、第Ｘ因子欠損症、第ＸＩ因子欠損症、フォン・ヴィルブランド病、およびグランツマン血小板無力症およびベルナール・スーリエ症候群などの血小板減少症が挙げられる。
後天性凝固異常の非限定的な例は、ビタミンＫ欠乏症によって引き起こされるセリンプロテアーゼ欠乏症であり、そのようなビタミンＫ欠乏症は、例えばワルファリンなどのビタミンＫ拮抗薬の投与によって引き起こされる場合がある。後天性凝固異常は、広範な外傷後にも起こり得る。この場合、別名、「血性の悪循環」として知られているが、これは、血液希釈（希釈性血小板減少症および凝固因子の希釈）、低体温症、凝固因子の消費、および代謝異常（アシドーシス）によって特徴付けられる。輸液療法および線維素溶解の増加は、この状況を悪化させる可能性がある。当該出血は、身体の任意の部分からの出血であってもよい。
「インヒビター」保有血友病Ａ（すなわち、第ＶＩＩＩ因子に対する同種抗体）および「インヒビター」保有血友病Ｂ（すなわち、第ＩＸ因子に対する同種抗体）は、部分的に先天性かつ部分的に後天性の凝固異常の非限定的な例である。
医原性凝固異常の非限定的な例は、輸血によって誘発され得るものなど、過剰および／または不適切な輸液療法によって誘発されるものである。
本発明の好ましい一実施形態では、出血は血友病Ａに関連する。本発明の別の好ましい実施形態では、出血は血友病Ｂに関連する。別の好ましい実施形態では、出血は、後天性インヒビター保有する血友病ＡまたはＢに関連する。別の好ましい実施形態では、出血はＦＶＩＩ欠損症と関連している。別の好ましい実施形態では、出血はグランツマン血小板無力症と関連している。別の実施形態では、出血はフォン・ヴィルブランド病と関連している。別の実施形態では、出血は重度の組織損傷と関連する。別の実施形態では、出血は重度の外傷と関連する。別の実施形態では、出血は手術と関連する。別の実施形態では、出血は出血性胃炎および／または腸炎と関連している。別の実施形態では、出血は、胎盤早期剥離など、多量の子宮出血である。別の実施形態では、出血は、例えば頭蓋内、耳内、または眼内などの機械的止血の可能性が限られている器官で発生する。別の実施形態では、出血は抗凝固療法と関連する。
さらなる実施形態では、出血は、血小板減少症と関連し得る。血小板減少症を有する固体では、本明細書に記載の二重特異性抗体は、血小板と同時投与することができる。
投与経路
本明細書に記載される二重特異性抗体は、非経口投与、好ましくは静脈内および／または皮下投与に適している可能性がある。皮下投与が好ましい投与経路である
投与レジメン
本明細書に記載される二重特異性抗体の生物学的利用能および半減期は、後天性および／または先天性凝固異常症を有する対象の予防的、皮下治療のため、それらに特に魅力的な薬剤にする。本明細書に記載される二重特異性抗体は、後天性および／または先天性凝固異常を有するが出血のない対象に、週に１回、例えば、２週間に１回、好ましくは月に１回投与することができる。本明細書に記載される二重特異性抗体は、凝固異常症を有し、外科手術などの侵襲的処置が必要な対象に、術前に投与されてもよい。本明細書に記載される二重特異性抗体は、凝固異常症を有し、外科手術などの侵襲的処置を受けている対象に投与されてもよい。
本明細書に記載される二重特異性抗体はまた、凝固異常症を有する、または出血エピソードを経験している対象のオンデマンドまたは予防的治療のために、血漿由来または組み換えで産生されたＦＶＩＩａなどの外因性ＦＶＩＩａと同時投与されてもよい。
凝固異常症を有する対象に投与される用量は、投与経路、それが予防的にまたはオンデマンドで投与されるか、および個人差に依存する。皮下投与は、静脈内投与よりも高用量を必要とする。
本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１．０～３０．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下投与される。
本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状態も含む。
実施形態のリスト
本発明は、本発明の実施形態の以下の非限定的リストによってさらに説明される。
１．二重特異性抗体であって、
（ｉ）第ＶＩＩ（ａ）因子を結合することができる第１の抗原結合部位と、
（ｉｉ）ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ－１）を結合することができる第２の抗原結合部位と、を含む、二重特異性抗体。
２．第１の抗原結合部位が、表３の抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のうちのいずれか１つとＦＶＩＩ（ａ）への結合について競合する、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３．抗体が、実施例７に記載されるような競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて競合する、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
４．第１の抗原結合部位が、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）のアミノ酸残基Ｈ１１５、Ｔ１３０、Ｖ１３１、およびＲ３９２を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
５．第１の抗原結合部位が、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）のアミノ酸残基Ｈ１１５、Ｔ１３０、Ｖ１３１、およびＲ３９２のうちの１つ以上を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
６．第１の抗原結合部位が、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）の以下のアミノ酸残基Ｒ１１３、Ｃ１１４、Ｈ１１５、Ｅ１１６、Ｇ１１７、Ｙ１１８、Ｓ１１９、Ｌ１２０、Ｔ１３０、Ｖ１３１、Ｎ１８４、Ｔ１８５、Ｐ２５１、Ｖ２５２、Ｖ２５３、Ｑ３８８、Ｍ３９１、およびＲ３９２を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
７．第１の抗原結合部位が、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）の以下のアミノ酸残基Ｒ１１３、Ｃ１１４、Ｈ１１５、Ｅ１１６、Ｇ１１７、Ｙ１１８、Ｓ１１９、Ｌ１２０、Ｔ１３０、Ｖ１３１、Ｎ１８４、Ｔ１８５、Ｐ２５１、Ｖ２５２、Ｖ２５３、Ｑ３８８、Ｍ３９１、およびＲ３９２のうちの１つ以上を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
８．第１の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８４７により表されるＣＤＲＬ１、
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８４８により表されるＣＤＲＬ２、
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、配列番号８４９により表されるＣＤＲＬ３、
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５１により表されるＣＤＲＨ１、
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５２により表されるＣＤＲＨ２、
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５３により表されるＣＤＲＨ３
９．第１の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・配列番号 ８４７により表されるＣＤＲＬ１、
・配列番号 ８４８により表されるＣＤＲＬ２、
・配列番号 ８４９により表されるＣＤＲＬ３、
・配列番号 ８５１により表されるＣＤＲＨ１、
・配列番号８５２により表されるＣＤＲＨ２、
・配列番号 ８５３により表されるＣＤＲＨ３
１０．第１の抗原結合部位が、表１３または１４に列挙された抗体による可変重鎖ドメイン配列および可変軽鎖ドメイン配列を含み、親和性（ＫＤ）が１ｎＭ以下である、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１１．第１の抗原結合部位が、表１３または１４に列挙された抗体による可変重鎖ドメイン配列および可変軽鎖ドメイン配列を含み、親和性（ＫＤ）が５ｎＭ以下である、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１２．第１の抗原結合部位が、表１３または１４に列挙された抗体による可変重鎖ドメイン配列および可変軽鎖ドメイン配列を含み、親和性（ＫＤ）が１０ｎＭ以下である、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１３．第１の抗原結合部位が、表１３または１４に列挙された抗体による可変重鎖ドメイン配列および可変軽鎖ドメイン配列を含み、親和性（ＫＤ）が２５ｎＭ以下である、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１４．抗体が、１ｐＭ未満の、例えば１０ｐＭ未満の、例えば１００ｐＭ未満の、例えば２００ｐＭ未満の、例えば４００ｐＭ未満の、例えば６００ｐＭ未満の、例えば１ｎＭ未満の、例えば５ｎＭ未満の、例えば１０ｎＭ未満の、例えば２０ｎＭ未満の、例えば５０ｎＭ未満の、例えば１００ｎＭ未満の、例えば２００ｎＭ未満の、例えば４００ｎＭ未満の、例えば６００ｎＭ未満の、例えば８００ｎＭ未満の、ＦＶＩＩ（ａ）に対する親和性（ＫＤ）を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１５．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１６．軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸置換を有する、実施形態１５に記載の二重特異性抗体。
１７．第２の抗原結合部位が、表４の抗ＴＬＴ－１抗体のうちのいずれか１つとＴＬＴ－１への結合について競合する、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
１８．抗体が、実施例３２に記載されるような競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて競合する、実施形態１７に記載の二重特異性抗体。
１９．第２の抗原結合部位が、ＴＬＴ－１（配列番号１３）の以下のアミノ酸残基Ｋ８、Ｉ９、Ｇ１０、Ｓ１１、Ｌ１２、Ａ１３、Ｎ１５、Ａ１６、Ｆ１７、Ｓ１８、Ｄ１９、Ｐ２０、Ａ２１を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
２０．第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５５により表されるＣＤＲＬ１、
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５６により表されるＣＤＲＬ２、
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５７により表されるＣＤＲＬ３、
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５９により表されるＣＤＲＨ１、
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８６０により表されるＣＤＲＨ２、
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８６１により表されるＣＤＲＨ３
２１．第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・配列番号 ８５５により表されるＣＤＲＬ１、
・配列番号 ８５６により表されるＣＤＲＬ２、
・配列番号 ８５７により表されるＣＤＲＬ３、
・配列番号 ８５９により表されるＣＤＲＨ１、
・配列番号 ８６０により表されるＣＤＲＨ２、
・配列番号 ８６１により表されるＣＤＲＨ３
２２．第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・配列番号 ８７１により表されるＣＤＲＬ１、
・配列番号 ８７２により表されるＣＤＲＬ２、
・配列番号 ８７３により表されるＣＤＲＬ３、
・配列番号 ８７５により表されるＣＤＲＨ１、
・配列番号８７６により表されるＣＤＲＨ２、および
・配列番号 ８７７により表されるＣＤＲＨ３
２３．第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・配列番号 ８７９により表されるＣＤＲＬ１、
・配列番号 ８８０により表されるＣＤＲＬ２、
・配列番号 ８８１により表されるＣＤＲＬ３、
・配列番号 ８８３により表されるＣＤＲＨ１、
・配列番号８８４により表される前記ＣＤＲＨ２、および
・配列番号 ８８５により表されるＣＤＲＨ３
２４．第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・配列番号 ８９５により表されるＣＤＲＬ１、
・配列番号 ８９６により表されるＣＤＲＬ２、
・配列番号 ８９７により表されるＣＤＲＬ３、
・配列番号 ８９９により表されるＣＤＲＨ１、
・配列番号９００により表されるＣＤＲＨ２、および
・配列番号 ９０１により表されるＣＤＲＨ３
２５．第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
２６．軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸置換を有する、実施形態２５に記載の二重特異性抗体。
２７．抗体が、１ｐＭ未満の、例えば１０ｐＭ未満の、例えば１００ｐＭ未満の、例えば２００ｐＭ未満の、例えば４００ｐＭ未満の、例えば６００ｐＭ未満の、例えば１ｎＭ未満の、例えば５ｎＭ未満の、例えば１０ｎＭ未満の、例えば２０ｎＭ未満の、例えば５０ｎＭ未満の、例えば１００ｎＭ未満の、例えば２００ｎＭ未満の、例えば４００ｎＭ未満の、例えば６００ｎＭ未満の、例えば８００ｎＭ未満の、ＴＬＴ－１に対する親和性（ＫＤ）を有する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２８．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
２９．抗体が、Ｆｃ領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３０．Ｆｃ領域が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓの置換を含むＩｇＧ１のＦｃ領域のＦｃバリアントである、実施形態２９に記載の二重特異性抗体。
３１．抗体が、抗体の抗原結合断片の融合またはコンジュゲートである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３２．結合断片のうちの１つ以上が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、およびｓｃＦｖの群から選択される、実施形態３１に記載の二重特異性抗体。
３３．抗体が、多重特異性抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３４．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号５および４によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３５．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号９４３および９４２によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３６．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号７および６によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３７．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号４および５によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３８．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号９４２および９４３によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
３９．第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定される軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定される重鎖可変ドメインとを含み、第１および第２の重鎖可変ドメインに付着された重鎖定常ドメインが、それぞれ配列番号６および７によって特定され、第１および第２の軽鎖可変ドメインに付着された軽鎖定常ドメインが、両方とも配列番号１２によって特定される、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
４０．抗体が、ＦＶＩＩ（ａ）への結合について競合し、表５に記載されるような１つ以上の二重特異性抗体とＴＬＴ－１への結合について競合する（定常ドメインの略語は、表２ａに従って定義される）、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
４１．抗体が、競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＦＶＩＩ（ａ）への結合について競合し、表５に記載されるような１つ以上の二重特異性抗体とＴＬＴ－１への結合について競合する、実施形態３８に記載の二重特異性抗体。
４２．抗体が、実施例７および実施例３２に記載されるような競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて競合する、実施形態３８に記載の二重特異性抗体。
４３．第１の抗原結合部位が、ＦＶＩＩ（ａ）（配列番号１）のアミノ酸残基Ｈ１１５、Ｔ１３０、Ｖ１３１、およびＲ３９２を含むエピトープを結合することができ、第２の抗原結合部位が、ＴＬＴ－１（配列番号１３）の以下のアミノ酸残基Ｋ８、Ｉ９、Ｇ１０、Ｓ１１、Ｌ１２、Ａ１３、Ｎ１５、Ａ１６、Ｆ１７、Ｓ１８、Ｄ１９、Ｐ２０、Ａ２１を含むエピトープを結合することができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
４４．第１の抗原結合部位が、以下を含み、
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸残基（配列番号８４７）により表されるＣＤＲＬ１
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸残基（配列番号８４８）により表されるＣＤＲＬ２
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸残基（配列番号８４９）により表されるＣＤＲＬ３
・アミノ酸残基（配列番号８５１）により表される前記ＣＤＲＨ１、
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸残基（配列番号８５２）により表されるＣＤＲＨ２、
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸残基（配列番号８５３）により表されるＣＤＲＨ３、
かつ第２の抗原結合部位が、以下を含む、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５５により表されるＣＤＲＬ１
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５６により表されるＣＤＲＬ２
・０、１、または２個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５７により表されるＣＤＲＬ３
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８５９により表されるＣＤＲＨ１
・０、１、２、または３個のアミノ酸置換を有する、配列番号８６０により表されるＣＤＲＨ２
・０、または１個のアミノ酸置換を有する、配列番号８６１により表されるＣＤＲＨ３
４５．抗体が、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイで測定されるように、ＦＶＩＩ（ａ）の機能的ＭＲＴを増加させる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
４６．抗体が、本発明の二重特異性抗体の非存在下でのＦＶＩＩ（ａ）の投与と比較して、ＦＶＩＩ（ａ）の機能的ＭＲＴを、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍増加させる、実施形態４１に記載の二重特異性抗体。
４７．抗体が、投与された二重特異性抗体の非存在下での循環する内因性ＦＶＩＩａのレベルと比較して、実施例２７および２８に従って決定される循環する内因性機能的活性ＦＶＩＩａのレベルを増加させることができる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
４８．抗体が、循環する内因性機能的活性ＦＶＩＩａのレベルを、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１６０倍、少なくとも３２０倍、少なくとも６４０倍増加させる、実施形態４５に記載の二重特異性抗体。
４９．抗体が、実施例２１に記載される刺激活性アッセイによって決定されるＦＸ活性化を促進するＦＶＩＩａポリペプチドの能力を増加させることができる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
５０．刺激活性が、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１５０倍である、実施形態４３に記載の二重特異性抗体。
５１．先行する実施形態のいずれか１つに記載の二重特異性抗体および医薬的に許容可能な担体を含む医薬製剤。
５２．実施形態４９に記載の医薬製剤が、皮下投与によって投与される、実施形態１～４８に記載の二重特異性抗体。
５３．薬剤として使用するための、実施形態１～４８に記載の二重特異性抗体、または実施形態４９に記載の医薬製剤。
５４．凝固異常の治療に使用するための、実施形態１～４８および５０～５１のいずれか１つに記載の二重特異性抗体、または実施形態４９に記載の医薬製剤であって、当該凝固異常が、先天性および／または後天性である、二重特異性抗体または医薬製剤。
５５．当該凝固異常が、インヒビター保有もしくは非保有血友病Ａ、またはインヒビター保有もしくは非保有血友病Ｂ、ＦＶＩＩ（ａ）欠損症およびグランツマン血小板無力症からなる群から選択される、実施形態５２に記載の二重特異性抗体。
５６．出血の治療のための、実施形態１～４８および５０～５１に記載の二重特異性抗体であって、出血が、先天性もしくは後天性の血友病Ａ、先天性もしくは後天性の血友病Ｂ、インヒビター保有血友病Ａ、インヒビター保有血友病Ｂ、または第ＶＩＩ（ａ）因子欠損症に関連する、二重特異性抗体。
５７．実施形態４９に記載の当該二重特異性抗体または医薬製剤が、静脈内、筋肉内、または皮下投与などの非経口投与される、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の使用。
実施例１：ハイブリドーマ技術を使用した抗ＦＶＩＩ（ａ）マウスモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体は、公開番号ＷＯ０７／１１５９５３の国際特許出願に記載される、ＦＶＩＩａ Ｑ６４Ｃ－ｓＴＦ（１－２１９）Ｇ１０９Ｃジスルフィド結合複合体を用いたＮＭＲＣＦ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の免疫化で調製された。
マウスに、ＦＣＡ（Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント）での２０ｕｇの最初の皮下注射を与え、その後に、２０ｕｇの抗原のＩＦＡ（Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント）でのブースター腹腔内注射を行った。脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液に分散させた。脾臓細胞は、電気融合を使用してＸ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合された。
細胞をマイクロタイタープレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。選択のためのＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する組織培養培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎仔血清）を２回交換した。１０日間の増殖後、特定の抗体産生ハイブリドーマクローンを、以下のプロトコルを使用したＥＬＩＳＡスクリーニングにより特定した。ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、ＦＶＩＩａ Ｑ６４Ｃ－ｓＴＦ（１－２１９）Ｇ１０９Ｃジスルフィド結合複合体、またはＦＶＩＩａ（Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５－７７９３およびＰｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３８５：２４１－２４３に記載されているように発現および精製された）で、１μｇ／ｍＬ（５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液）、５０μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを５回洗浄し、洗浄緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ＴＷＥＥＮ ２０）中で１５分間ブロッキングした。５０μＬの上清を各ウェルに移し、１時間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、５０μｌのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスを添加した（Ｆｃガンマ断片特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ、作業希釈１／１００００）。プレートを１時間インキュベートし、５回洗浄し、５０μｌのＴＭＢ（使用準備済みＴＭＢ ＯＮＥ、Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ）で１０分間発色させた。反応を５０μｌの４Ｍ Ｈ３ＰＯ４を添加して停止し、ＦＬＵＯＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダーにて４５０および６２０ｎｍで読み取った。
陽性結果をもたらすハイブリドーマ細胞を、単クローン性を確保するために限界希釈法によって少なくとも２回サブクローニングした。抗体精製は、標準的なプロテインＡ精製を使用して行った。
ＰＫ研究で使用するための抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地で、Ｔフラスコまたは振とうフラスコにアップスケールした。条件培地を遠心分離により採取し、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、次いで脱塩した。
実施例２：マウス抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のクローニングおよび配列決定
本実施例は、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の可変ドメインをコードするマウス重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）ｃＤＮＡ配列のクローニングおよび配列決定を記載する。
ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ－Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から抽出し、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを使用して、５’－ＲＡＣＥ反応でｃＤＮＡを合成した。ＨＣ（指定ＶＨ）配列の可変ドメインおよびＬＣ（指定ＶＬ）配列の可変ドメインのその後の標的増幅を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびフォワードプライマーとしてＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥキットに含まれるユニバーサルプライマーミックス（ＵＰＭ）を使用したＰＣＲにより行った。ＶＨ増幅に使用されたリバースプライマーの配列は、５’ａｇｃｔｇｇｇａａｇｇｔｇｔｇｃａｃａｃ３’であった。ＶＬ増幅に使用されたリバースプライマーの配列は、５’ｇｃｔｃｔａｇａｃｔａａｃａｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔｃｔｔｇ３’であった。
ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動により分離し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－ＳｃｉｅｎｃｅｓのＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ＆ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抽出し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔおよび化学的に応答能のあるＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して配列決定のためにクローニングした。Ｍ１３ｕｎｉ（－２１）／Ｍ１３ｒｅｖ（－２９）シーケンシングプライマーを使用して、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ Ｇｅｒｍａｎｙで配列決定を行った。すべてのキットおよび試薬を、製造業者の指示に従って使用した。
実施例３：二価抗体、一価抗体（ＯＡ抗体）、および抗体Ｆａｂ断片の組み換え発現
二価抗体、一価抗体（ワンアームド、ＯＡ抗体と呼ばれる）、および抗体Ｆａｂ断片は、基本的に製造元の指示に従って、ＨＥＫ２９３懸濁細胞（２９３Ｅｘｐｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションを使用して発現された。２９３Ｅｘｐｉ細胞は、１％のＰ／Ｓ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１５１４０－１２２）で補充されたＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１４３５１０４）で、３～４日ごとに継代培養された。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して２５０万～３００万個／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトされた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の各１リットルに対して、合計１ｍｇのプラスミドＤＮＡを、５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号５１９８５－０２６、希釈物Ａ）へと希釈することによって、および２．７ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（希釈物Ｂ）へと希釈することによって、トランスフェクションを実施した。二価抗体は、ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（ＨＣ）およびＶＬ－ＣＬ（ＬＣ）プラスミド（１：１の比率）をコトランスフェクトすることによって産生され、Ｆａｂ断片プラスミドについては、ＶＨ－ＣＨ１およびＬＣ（１：１の比率）であった。ＯＡ抗体の産生については、細胞を３つのプラスミド、すなわちＬＣプラスミドＨＣプラスミド、および切断されたＨＣ（ｔｒＨＣ）をコードする第３のプラスミドでトランスフェクトした。ＯＡ抗体のＨＣは、ホールの変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を含有し、ｔｒＨＣはノブ（Ｔ３６６Ｗ）の変異であったが、ノブとホールを逆転させることもできる。ノブ／ホール変異は、国際特許ＥＰ０９７９２８１Ｂ１に記載されており、所望のヘテロ二量体、すなわちＨＣとｔｒＨＣとの対形成を最適化し、ホモ二量体の望ましくない形成、すなわちｔｒＨＣとｔｒＨＣおよびＨＣとＨＣとの対形成を抑制するために、導入される。希釈物ＡおよびＢを混合し、かつ室温で１０～２０分間インキュベートした。この後、トランスフェクション混合物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に加え、細胞を軌道回転（８５～１２５ｒｐｍ）を備えた加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの１日後、トランスフェクトされた細胞に、５ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー１および５０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー２を補充した。細胞培養上清は、トランスフェクションの４～５日後に遠心分離とそれに続く濾過によって回収した。
二価抗体および一価抗体は、当業者に公知の標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、および必要に応じて、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーなどの追加の精製ステップによって精製された。Ｆａｂ断片を、Ｆａｂのカッパ鎖を認識するアフィニティー樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
実施例４：インビトロアセンブリによる二重特異性抗体およびＯＡ抗体の調製
インビトロアセンブリによって調製された二重特異性抗体
二重特異性抗体は、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１３，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．５１４５－５１５０に記載されているのと類似の方法、およびＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術（Ｇｅｎｍａｂ）として知られる方法による、２つの親抗体のインビトロアセンブリによって生成された。Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．によって使用されたＩｇＧ１サブタイプの代わりに、ＩｇＧ４を本発明で使用した。交換反応を、７５ｍＭの２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）の存在下で、３０℃で４時間行った。得られた二重特異性抗体を、イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、残留親抗体を二重特異性抗体から分離した。本実施例では、第１の親抗体（抗ＦＶＩＩ（ａ））の重鎖定常領域は ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆ４０５Ｌ Ｒ４０９Ｋ であり、第２の親抗体（抗ＴＬＴ－１）の重鎖定常領域はＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（両方ともＥＵナンバリングを使用）であった。軽鎖定常ドメインはヒトカッパであった。２つの親抗体は、実施例３に記載されているように産生された。二重特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１抗体は、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の定常ドメインがＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐであり 抗ＴＬＴ－１抗体の定常ドメインがＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆ４０５Ｌ Ｒ４０９Ｋである、親抗体のセットから構築されてもよい。
インビトロアセンブリによって調製された一価抗体
一価抗体は、（１）２つの抗体を組み合わせて二重特異性抗体を形成する代わりに、抗体とｔｒＨＣ二量体を組み合わせて一価抗体を形成することを除いて、二重特異性抗体について上述したと同様にインビトロアセンブリによって生成された。本実施例では、ｔｒＨＣは、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆ４０５Ｌ Ｒ４０９Ｋであり、ＨＣは、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐであった（両方ともＥＵのナンバリングを使用）。また、軽鎖定常領域はヒトカッパであった。典型的には、反応混合物中の二価抗体の量を最小限にするために、２０～５０％モル過剰でｔｒＨＣ二量体を用いてアーム交換反応を実施した。一価抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、任意選択で、所望に応じて、イオン交換クロマトグラフィーなどの追加の精製ステップにより補充した。
実施例５：機能的アッセイにおける抗ＦＶＩＩａ（ａ）のインビトロ特性評価
内因性ＦＶＩＩａの蓄積を促進し、その凝固促進活性を発揮できるようにするために、本発明の抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、好ましくは、ＦＶＩＩａの活性を損なうべきでなく、同様に好ましくは、その主要な血漿インヒビターであるアンチトロンビンによる、ＦＶＩＩａの不活性化を促進するべきではない（Ａｇｅｒｓφ Ｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９：３３３－３３８）。これらの態様を探索するために、ＦＶＩＩａの凝固促進活性およびアンチトロンビンによるＦＶＩＩａの不活性化に対する抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の効果を、以下に記載されるアッセイを使用してインビトロで決定した。
血友病Ａ誘発ヒト血漿におけるトロンビン生成に対する抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の効果
トロンビン生成に対する二価または一価の抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の効果を、９６ウェルセットアップのカオリントリガード（ｋａｏｌｉｎ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）トロンビン生成アッセイ（ＴＧＴ）で測定した。簡潔に述べると、血友病Ａ誘導血漿は、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体４Ｆ３０（公開番号ＷＯ２０１２／０３５０５０の国際特許出願に記載）を最終濃度３７．５μｇ／ｍｌまで添加することによって調製した。最終濃度１０μＭ（Ｒｏｓｓｉｘ）のリン脂質を血友病Ａ血漿に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。 精製抗体（１００ｎＭ）およびＦＶＩＩａ（２５ｎＭ）を混合物に加え、室温で１０分間インキュベートした。抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、実施例１、２、および３に記載されるように生成された。トリガリングは、１０μｌのカオリン（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を添加し、続いて１０μｌのＦＩＩａ ＦｌｕＣａ－ｋｉｔ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を添加して行い、蛍光（３９０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの発光）をＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルリーダー上で２時間測定した。
測定された蛍光の一次導関数としてトロンボグラムを計算した。トロンビンのピーク高さを、トロンボグラム中の最大値として計算した。続いてこれを正規化し、観察されたピーク高さを、抗体の非存在下で２５ｎＭのＦＶＩＩａについて観察された対応するピーク高さで割ることによってパーセンテージとして表された。これに基づいて、抗体は、刺激性（＞１２０％）、阻害性（＜９０％）、または中性（９０％～１２０％）に分類された。表６に示すように、すべてのカテゴリーからの抗体が特定された。好ましい抗体は、ＴＧＴアッセイにおいて刺激性または中性であった。
血漿由来アンチトロンビンによるＦＶＩＩａ不活性化に対する抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の効果
二価または一価の抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の存在下での血漿由来アンチトロンビン（ＡＴ）によるＦＶＩＩａ活性の 阻害は、ＦＶＩＩａ（２００ ｎＭ）を、低分子量ヘパリン（エノキサパリン、１２ μＭ）および抗体（２００－１０００ ｎＭ）と共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの ＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．３中で１０分間インキュベートすることによって測定した。次にＡＴ（５μＭ）を添加し、１０、２０、３０、４０、６０、および８０分の時点で、試料を新しいマイクロタイタープレートに移し、そこで残留活性を、１ｍＭのＳ－２２８８発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）、２００ｎＭの可溶性組織因子（ｓＴＦ、Ｆｒｅｓｋｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ５：１５３１－１５４０に記載されたように産生した）、およびポリブレン（０．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４０５ｎｍで５分間測定した。ＡＴの代わりに緩衝液を用いた試料は、阻害されていないＦＶＩＩａの活性を提供した。
残留アミド分解活性を、阻害剤の非存在下での活性に対する時間の関数として決定した。阻害定数（ｋｉｎｈ）は、データを一相減衰モデル（ｏｎｅ ｐｈａｓｅ ｄｅｃａｙ ｍｏｄｅｌ）にフィッティングすることによって推定した。ＦＶＩＩ（ａ）抗体の存在下でのｋｉｎｈの値（抗体の非存在下で決定された値のパーセント）は、ｋｉｎｈ％と称され、表６の各抗体について報告される。
推定ｋｉｎｈ％＜６０％の抗体は、ＡＴ阻害からＦＶＩＩａを保護するものとして分類された。推定６０％≦ｋｉｎｈ％≦１５０％の抗体は、中性として分類され、一方で推定ｋｉｎｈ％＞１５０％の抗体は、ＡＴによるＦＶＩＩａの阻害を加速するものとして分類された。表６に報告されるように、３つのカテゴリーすべてからの抗体が特定された。好ましい抗体は、中性であるか、またはＡＴ阻害からＦＶＩＩａを保護した。
試験された抗体のうち、１１Ｆ２（それぞれ、完全マウスおよびマウス／ヒトキメラに対応するｍＡｂ００５およびｍＡｂ００４８）を含む抗体のサブセットは、上述のように所望のインビトロ特性を有することが見出された。
実施例６：ＦＶＩＩａに結合する抗体のＳＰＲ分析とｐＨおよびカルシウムの影響
実施例５からの抗体のＦＶＩＩａへの結合を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によりプローブした。抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を、標準のアミンカップリングケミストリーキット（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給）を使用して ＣＭ４ センサーチップ上に固定した。表７に従って精製された抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体（０．２５ｎＭ）を、１０μｌ／分の流量で１分間注入した。続いて、５、１５、４５および１３５ｎＭのＦＶＩＩａを３０μｌ／分の流量で７分間注入し、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体への結合を可能にし、続いて９分間の緩衝液注入により抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体から解離させた。１０ｘＨＢＳ－Ｐ 緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）を１０倍に希釈することによってランニング緩衝液を調製し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５ｍＭの ＣａＣｌ２ で補充して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのポリソルベート２０（Ｐ２０）、ｐＨ７．４、５ｍＭの ＣａＣｌ２ 、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を得た。ランニング緩衝液はまた、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体およびＦＶＩＩ試料の希釈にも使用された。１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ１．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）からなる再生緩衝液を使用して、チップの再生を達成した。結合データを、製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用する１：１モデルに従って解析した。分析の結果、表７に報告された結合定数が得られ、１１Ｆ２（ｍＡｂ００５およびｍＡｂ００４８、それぞれ完全マウスおよびマウス／ヒトキメラに対応する）を含む、いくつかの抗体がＦＶＩＩａへの高親和性結合を示した。
実施例５からの選択された抗体のＦＶＩＩａおよびｃＦＶＩＩａ－キメラへの結合に対するｐＨおよび ＣａＣｌ２ の影響を、３７℃で表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によってプローブした。ｃＦＶＩＩａ－キメラ配列は、本発明の詳細な説明と題されたセクションに示され、実施例１６および２６に概説されるように表される。抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を、標準アミンカップリングケミストリーキット（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給）を使用して ＣＭ４ センサーチップ上に固定した。１．２ｎＭのＦＶＩＩａおよび ０．５ｎＭの４Ｆ９（ＦＶＩＩａ ＥＧＦ１ドメインに結合するＮＮ内部抗ＦＶＩＩマウスＡｂ）の事前に平衡化された混合物を、１０μｌ／分の流量で１分間注射した。 続いて、５４０、１８０、６０、２０、６．６６、２．２２、０．７４、０．２５ｎＭの抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体を、３０μｌ／分の流量で７分間注入してＦＶＩＩａへの結合を可能にし、続いて９分間の緩衝液注入によりＦＶＩＩａから解離させた。２つのランニング緩衝液を調製した。緩衝液１を、１０×ＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）を１０倍希釈することによって調製し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５ｍＭの ＣａＣｌ２ で補充して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、ｐＨ７．４、５ｍＭの ＣａＣｌ２、１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を得た。緩衝液２を、１０ｘＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）を１０倍に希釈することによって調製し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５μＭの ＣａＣｌ２ および６．０に調整したｐＨ（４Ｍ のＨＣｌを用いて調整した）で補充して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のｖ／ｖのポリソルベート２０、ｐＨ６．０、５ μＭの ＣａＣｌ２、１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を得た。ＦＶＩＩａ、抗ＦＶＩＩ抗体４Ｆ９、および抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体を、両方のランニング緩衝液で別々に希釈した。１０ｍＭのＧｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ１．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）からなる再生緩衝液を使用して、チップの再生を達成した。結合データを、製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用する１：１モデルに従って解析した。分析の結果、表７ｂに報告された結合定数が得られ、ＦＶＩＩａと抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体との間の保持された高親和性結合を示した。
表７ｂは、実施例６による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって決定される、２つの異なる緩衝液におけるＦＶＩＩａ抗体と抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の相互作用に対する推定結合定数および倍率差（ｆｏｌｄ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）。
実施例７：競合ＥＬＩＳＡにおけるＦＶＩＩ（ａ）への結合についてｍＡｂ０００５（１１Ｆ２）と競合する抗体の特定
実施例５からの所望のインビトロ特性を有する抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体が、ＦＶＩＩａ（ａ）への結合について、ｍＡｂ０００５（１１Ｆ２）およびそれに由来する抗体と競合するかどうかを決定するため、対応するＦａｂ断片、Ｆａｂ００７６を用いて競合研究を行った。ＦＶＩＩａ、Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ－ｃｍｋ、Ｂａｃｈｅｍ、スイス）活性部位阻害ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ、実施例９を参照）を、希釈緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中１２５ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩固定した。プレートを洗浄し、洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．２）で１５分間ブロッキングした。１１Ｆ２－Ｆａｂ００７６を、製造元の指示に従って使用される標準ビオチン化キット（ＥＺ－Ｌｉｎｋ、Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してビオチン化した。競合研究では、最終固定濃度１０ｎｇ／ｍｌのビオチン化Ｆａｂ００７６を、一連の抗ＦＶＩＩａ（ａ）抗体の希釈と組み合わせて。希釈緩衝液で１００ｍｇ／ｍｌ～９．５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得た。混合物をプレートのウェルに加え、１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン－ＨＲＰＯ（希釈緩衝液で１：２０００、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ）を添加し、１時間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、ＴＭＢ ＯＮＥ（ＫＥＭＥＮＴＥＣ）で１０分間発色させた。反応は、Ｈ３ＰＯ４（４Ｍ）を添加して停止し、プレートを、６２０ｎｍで測定されたバックグラウンドシグナルを差し引いて４５０ｎｍでＦＬＵＯＳｔａｒオプティマプレートリーダーで読み取った。別段の指定がない限り、すべてのインキュベーションを室温で行い、プレートを洗浄緩衝液を使用して５回洗浄した。
測定されたシグナル（ＯＤ単位）から、任意の所与の抗体濃度での競合を、以下のように計算し、
阻害率％＝（１－（ＯＤ単位－１００％阻害）／（０％阻害－１００％阻害））＊ １００
式中、０％の阻害は、競合する抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体を全く含まないウェルでのシグナルから決定され、１００％の阻害は、ビオチン化Ｆａｂ００７６を含まないウェルからのシグナルとして決定した（すなわち、アッセイバックグラウンドに対応する）。抗体の濃度をビオチン化Ｆａｂ００７６の最大１００００倍過剰で試験したときに、少なくとも５０％の阻害（阻害％）が観察された場合、ＦＶＩＩ（ａ）への結合について抗体は１１Ｆ２（ｍＡｂ０００５）と競合するとみなされた。結果を表８に要約する。
実施例８：ＦＶＩＩａ活性アッセイ
ＦＶＩＩａ活性は、基本的にＭｏｒｉｓｓｅｙ ＪＨ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ，１９９３；８１：７３４－４４に記載されているように、ＳＴＡｃｌｏｔ（登録商標）ＶＩＩａ－ｒＴＦキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）からの試薬を使用して測定した。アッセイは、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの ＡＣＬＴＯＰ５００ 自動凝固装置で実施された。アッセイでは、４０μｌ希釈動物血漿試料、キャリブレータ（国際ＷＨＯ基準に対して較正された組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）標準物質）、または４０μｌのＦＶＩＩ欠損血漿および４０μｌの可溶性組織因子（ｓＴＦ）とリン脂質とを混合した品質管理（ＱＣ）試料であった。反応を開始するため、４０μｌの体積の２５ｍＭ ＣａＣｌ２を加え、装置によって凝固時間を測定した。試料およびＱＣの凝固時間を、血漿の干渉を軽減するために、希釈した試料と同じ濃度の血漿を用いたｒＦＶＩＩａ検量線と比較した。検量線範囲は、５～１０００ｍＩＵ／ｍＬであり、三次多項式を用いて適合させた。ＱＣおよび試料の結果を、ＡＣＬＴＯＰ５００機器上のソフトウェアによって計算した。ＩＵ／ｍＬでの結果を、投与された化合物の特異的活性（ＩＵ／Ｐｍｏｌ）を使用してｎＭに変換した。
実施例９：抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体との共製剤化における組み換えＦＶＩＩａのラットにおける薬物動態
実施例５からの所望のインビトロ特性を有するモノクローナル抗体抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体を、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのヒトＦＶＩＩａとの共製剤でオスのスプラーグドーリーラットにＩＶ投与した。表９に示されるように、ＦＶＩＩａと抗体とのモル比は１：１または１：５であった。実験中、動物は飼料および水を自由に摂取できるようにした。ＦＶＩＩａ血漿活性を、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイを使用して測定した。
薬物動態解析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用した非コンパートメント法によって実施された。データから、平均滞留時間（ＭＲＴ）を計算した。結果を表９に示す。
実施例５の所望の特性を有する抗体のうち、ｍＡｂ０００５（１１Ｆ２）およびｍＡｂ０００１（１１Ｆ２６）は、遊離ヒトＦＶＩＩａに対する遊離平均滞留時間１．１時間と比較して、それぞれ７．９および７．５時間の最長の平均滞留時間をヒトＦＶＩＩａに与えた（表９を参照）。ｍＡｂ０００５およびｍＡｂ０００１（ｍＡｂ０７５９）は、ＦＶＩＩａ（実施例７）への結合に対する競合を示す、高親和性抗体（実施例６）である。
実施例１０：遊離ＦＶＩＩまたはＴＦ複合体化ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化に対する１１Ｆ２抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の効果
好ましくは、本発明の抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体は、膜表面上のＦＶＩＩａの薬理作用、または凝固の開始、すなわち、ＦＶＩＩａ－ＴＦ複合体によるＦＸの活性化を妨害してはならない。これらの態様を調査するために、ＦＶＩＩａのＴＦ非依存性およびＴＦ依存性タンパク質分解活性に対する１１Ｆ２の効果を、それぞれ、脂質化ＴＦの非存在下または存在下で決定した。２つのＦＶＩＩａ分子の正常な二価抗体への同時結合から生じる結合活性の影響を回避するために、ワンアームド一価抗体フォーマットを使用した。
リン脂質膜の存在下でのＦＶＩＩａによるＦＸ活性化に対する１１Ｆ２抗体の効果
活性測定を、１０ｎＭのＦＶＩＩａ、０または２００ｎＭの抗体（表１０参照）、および２５μＭの２５：７５ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン小胞（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を含有する、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ７．３、０．１％ ＰＥＧ８０００および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で実施した。反応は、０～３００ｎＭのヒト血漿由来第Ｘ因子（ＦＸ）の添加によって開始され、９６ウェルプレート（ｎ＝２）中、総反応体積１００μｌで、室温で２０分間インキュベートされた。インキュベーション後、反応を、５０ μｌのクエンチ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ 、８０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）の添加によりクエンチし、続いて水中５０μｌの １ｍＭ Ｓ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添加した。生成されたＦＸａによる発色基質の変換は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレート分光光度計を使用して、４０５ｎｍで１０分間、線形吸光度増加の傾きとして測定した。測定された傾きを、既知の量の血漿由来ヒトＦＸａを用いて同様の条件下で生成されたた傾きに関連付けることによって、モルベースのＦＸａ生成の初期速度を推定することができた。酵素反応速度パラメータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、データをミカエリスメンテン式（ｖ＝ｋｃａｔ ＊ ［ＦＸ］ ＊ ［ＦＶＩＩａ－ＴＦ］ ／（Ｋｍ ＋ ［ＦＸ］））に非線形曲線適合することによって推定した。
表１０に示されるように、一価の１１Ｆ２は、リン脂質小胞の存在下での遊離ＦＶＩＩａによるＦＸ活性化の速度に影響を与えなかった。
ＴＦの存在下でのＦＶＩＩａによるＦＸ活性化に対する１１Ｆ２抗体の効果
活性測定を、１００ｐＭ ＦＶＩＩａ、０または２００ｎＭ抗体（表１０を参照されたい）、およびＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２：１１５５－１１６２に記載されているような２５：７５ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン（ＰＳ：ＰＣ）小胞に組み込まれた２ｐＭ Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＴＦ断片１－２４４を含むアッセイ緩衝液（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．３、０．１％ＰＥＧ８０００および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で実施した。反応は、０～３０ｎＭのヒト血漿由来第Ｘ因子（ＦＸ）の添加によって開始され、９６ウェルプレート（ｎ＝２）中、総反応体積１００μｌで室温で２０分間インキュベートされた。インキュベーション後、反応をクエンチし、上述のようにＦＸａを定量した。
表１０に示されるように、一価の１１Ｆ２（ｍＡｂ００７７（ＯＡ））は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体によるＦＸ活性化の速度に影響を与えなかった。
実施例１１：血漿阻害剤によるＦＶＩＩａの阻害に対する１１Ｆ２抗体の効果
ＦＶＩＩａは、豊富な血漿阻害剤アンチトロンビン（ＡＴ）によるその不活性化のために、部分的には循環中比較的短い半減期を呈する。同様に、動物試験では、ＦＶＩＩａの不活性化において、別の血漿阻害剤であるアルファ－２－マクログロブリンが関連している。精製血漿由来阻害剤を使用して、これらの阻害剤によるＦＶＩＩａの不活性化に対する一価の１１Ｆ２抗体の効果を研究した。
アンチトロンビンによるＦＶＩＩａの阻害に対する１１Ｆ２抗体の効果
一価の１１Ｆ２抗体（ｍＡｂ００４８、ｍＡｂ００７７（ＯＡ））の存在下でのヒト血漿由来ＡＴによるＦＶＩＩａの阻害を、疑一次条件下で実施した。アッセイを、室温で、２００ｎＭのＦＶＩＩａ、１２μＭの低分子量ヘパリン（エノキサパリン、欧州薬局方参照、コードＥ０１８００００ バッチ５．０、Ｉｄ ００ＣＫ１８）、および０または１０００ｎＭのいずれかの抗体を含有するアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ８０００、１ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．３）中の２００μｌの体積で行った。１０分間のプレインキュベーション後、反応は、５μＭ ＡＴ（アンチトロンビンＩＩＩ， Ｂａｘｔｅｒ， Ｌｏｔ ＶＮＢ１Ｍ００７； 製剤中の血清アルブミンを除去するためにヘパリン－セファロースカラム上で再精製）の添加により開始された。選択された時点で、１０μＬのアリコートを、０．５ｍｇ／ｍｌのポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド、シグマ、カタログ番号 Ｈ９２６８ ロット ＳＬＢＣ８６８３Ｖ）、２００ｎＭのｓＴＦ、および１ｍＭのＳ－２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）を含有する総体積２００μｌに移し、反応をクエンチし、ｓＴＦでＦＶＩＩａを飽和させ、これにより、４０５ｎｍで５分間モニターされた発色基質の加水分解による残留ＦＶＩＩａ活性の測定が可能となった。残留アミド分解活性を、ブランク減算後の線形進行曲線の傾きとして決定し、その後、これらをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、一次指数減衰関数にフィッティングし、反応に対する疑一次速度定数（ｋａｐｐ）を導出した。見かけの二次速度定数（ｋｉｎｈ）を、ｋａｐｐをＡＴ濃度で割ったものとして推定した。
この解析から、一価の１１Ｆ２（ｍＡｂ００７７（ＯＡ））の存在下でのＦＶＩＩａの阻害速度は、遊離ＦＶＩＩａの阻害に対する１２４±７Ｍ－１ｓ－１と比較して、１３３±１０Ｍ－１ｓ－１であることが分かった。
アルファ－２－マクログロブリンによるＦＶＩＩａの阻害に対する１１Ｆ２抗体の効果
０または１０００ｎＭの一価の１１Ｆ２抗体（ｍＡｂ００７７（ＯＡ））の存在下でのヒト血漿由来アルファ－２－マクログロブリンによるＦＶＩＩａの阻害を、疑一次条件下で実施した。アッセイを、室温で、２００ｎＭのＦＶＩＩａ、および０または１０００ｎＭのいずれかの抗体を含有するアッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ８０００、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ７．３）中の１００μｌの体積で行った。反応は、Ｂａｎｂｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：５２７－５３７に従って、ヒト血漿から精製した０または１０００ｎＭのアルファ－２－マクログロブリンの添加によって開始した。選択された時点で、１０μｌのアリコートを、２００ｎＭのｓＴＦと１ｍＭの Ｓ－２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）を含有する、１９０μｌの緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの ＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ ７．３）に移し、これにより４０５ｎｍで５分間モニターされた発色基質の加水分解による残留ＦＶＩＩａ活性の測定が可能となった。 残留アミド分解活性を、ブランク減算後の線形進行曲線の傾きとして決定し、その後、これらをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、一次指数減衰関数にフィッティングし、反応に対する疑一次速度定数（ｋａｐｐ）を導出した。見かけの二次速度定数（ｋｉｎｈ）を、ｋａｐｐをアルファ－２－マクログロブリン濃度で割ったものとして推定した。
抗体の非存在下では、アルファ－２－マクログロブリンによるＦＶＩＩａの阻害に対する見かけの二次速度定数は、４７５±２１Ｍ－１ｓ－１であることが判明した。しかしながら、一価の１１Ｆ２抗体（ｍＡｂ００７７（ＯＡ））の存在下では、ＦＶＩＩａの明白な阻害は、１２５分での最後の時点まで観察されなかった。これらの研究から、１１Ｆ２は、アンチトロンビンによるＦＶＩＩａの阻害に影響を与えないが、アルファ－２－マクログロブリンによる阻害からＦＶＩＩａを保護すると結論付けられる。
実施例１２：ＦＶＩＩ自己活性化に対する１１Ｆ２抗体の効果
血管損傷時、内因性ＦＶＩＩは、血管内皮を取り囲む細胞上に露出される補因子組織因子（ＴＦ）と高い親和性で結合する。この過程の間、ＦＶＩＩは、タンパク質限定加水分解によってＦＶＩＩａに変換される。活性化は、自己活性化とも呼ばれるＴＦ介在性ＦＶＩＩａ－ＦＶＩＩトランス活性化の結果として起こると考えられる。ＦＶＩＩ自己活性化に対する１１Ｆ２抗体の効果を決定するために、ＦＶＩＩの活性化を、脂質化ＴＦ、ＦＶＩＩ、限定濃度のＦＶＩＩａ、および一価の１１Ｆ２抗体の存在下で測定した。
活性測定を、２ｎＭのＦＶＩＩａ、１４５ｎＭのＦＶＩＩ、０または２００ｎＭの一価の１１Ｆ２抗体（ｍＡｂ００７７（ＯＡ））を含有するアッセイ緩衝液（０．１％のＰＥＧ８０００と１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．３）中で実施した。反応は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，２：１１５５－１１６２によって記載されるように、２５：７５のＰＳ：ＰＣ小胞に組み込まれた２ｎＭの脂質化大腸菌由来ＴＦ断片１～２４４の添加によって開始された。総反応体積は１００μｌであった。選択された時点（典型的には５、１０、１５、２０、３０、４０、５０および６０分）で生成されたＦＶＩＩａを、以下に記載されるサブサンプリング手順に従って定量した。
サブサンプリングによるＦＶＩＩａの定量 － 選択された時点で、１０μｌの試料を、１４０ μｌの、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＰＥＧ８０００を含有する５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび２１５ｎＭの可溶性組織因子（ｓＴＦ）に移すことによってクエンチした。すべての試料の収集後、ＦＶＩＩａ発色活性を、６０ｍＭのＣａＣｌ２に５０μｌのＳ－２２８８（４ｍＭ）を添加することによって測定した。生成されたＦＶＩＩａによる発色基質の変換は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍで１０分間の線形吸光度増加の傾きとして測定された。測定された傾きを、既知の量のＦＶＩＩａと類似の条件下で生成された傾きに関連付けることによって、ＦＶＩＩａのモル濃度を推定することができる。
ＦＶＩＩａの自己活性化はＴＦ依存性であることが見出され、表１１の測定されたＦＶＩＩａ活性から、一価の１１Ｆ２抗体の存在によって損なわれないことが示されている。
実施例１３：活性部位阻害ＦＶＩＩａおよび可溶性組織因子と複合体を形成した１１Ｆ２－Ｆａｂ００７６の結晶構造
ＦＶＩＩ（ａ）上のマウス抗体１１Ｆ２によって認識されるエピトープを決定するために、対応するＦａｂ断片（Ｆａｂ００７６）を、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（１９９５）、２２、４１９～４２５に従う、ハンギングドロップ法（ｈａｎｇｉｎｇ－ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ－ｃｍｋ；Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）活性部位阻害ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）および可溶性組織因子断片１～２１９（ｓＴＦ）と複合体を形成して結晶化した。
結晶化
ＦＶＩＩａｉ／ｓＴＦ複合体と１：１のモル比で混合されたＦａｂ００７６の結晶を、１８°Ｃでのハンギングドロップ蒸気拡散技術を使用して成長させた。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．０中の４．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質複合体１μｌのタンパク質溶液を、０．５μｌの１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ ６．２および沈殿剤として２０％のＰＥＧ ６０００と混合し、沈殿物溶液１ｍｌで１８℃の温度でインキュベートして、複合体の結晶を得た。
回折データ収集
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ ６．２ 、１５％のＰＥＧ ６０００、４％のグリセロール、４％のエチレングリコール、４．５％のスクロース、および１％のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、ＭＡＲ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の ｍａｒＣＣＤ２２５ 検出器を使用して、ＭＡＸ－ｌａｂ（スウェーデン、ルンド）ビームラインＩ９１１－３で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス作成、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表１２に要約する）。
構造の決定と精緻化
構造は、タンパク質データバンクエントリ１ＹＹ８およびタンパク質データバンクエントリ３ＥＬＡのＡ鎖およびＢ鎖を用いて、プログラムスイートＰｈｅｎｉｘで実装されたＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、２つのＦａｂ：ＦＶＩＩａｉ／ｓＴＦ複合体を含む。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築のステップを使用して改良された。精緻化統計が表１２に示される。
エピトープ（Ｆａｂ００７６の非水素原子から４Å以下の距離内に位置付けられた非水素原子を有するＦＶＩＩａｉ中の残基として定義される）は、配列番号１に従う以下の残基を含むことが見出された：
Ｒ１１３
Ｃ１１４
Ｈ１１５
Ｅ１１６
Ｇ１１７
Ｙ１１８
Ｓ１１９
Ｌ１２０
Ｔ１３０
Ｖ１３１
Ｎ１８４
Ｔ１８５
Ｉ１８６
Ｐ２５１
Ｖ２５２
Ｅ２６５
Ｍ３９１
Ｒ３９２
Ｅ３９４
パラトープ（ＦＶＩＩａｉ中の非水素原子から４Å以下の距離内に位置付けられた非水素原子を有するＦａｂ００７６中の残基として定義される）は、配列番号６４に従う以下の軽鎖残基：
Ｑ２７
Ｇ２８
Ｓ３０
Ｄ３１
Ｙ３２
Ｋ４９
Ｙ５０
Ｑ５３
Ｈ９２
Ｓ９３
Ｆ９４
および配列番号６３に従う以下の重鎖残基を含むことが見出された。
Ｄ３２
Ｙ５４
Ｎ５９
Ｎ１０１
Ｙ１０２
Ｙ１０３
Ｇ１０４
Ｎ１０５
実施例１４：ヒト化マウス１１Ｆ２
配列番号７５４および配列番号７５０にそれぞれ対応するＶＨおよびＶＬドメイン配列でマウス抗体１１Ｆ２（ｍＡｂ０００５）をヒト化するために、それぞれＦＶＩＩ（ａ）に対する高い結合親和性を保存しながら、ヒト生殖系列に関連する配列同一性、Ｆａｂ００７６（実施例１２）と活性部位阻害ＦＶＩＩａ（実施例９）との間の複合体の結晶構造、およびインビトロ結合データからの情報を組み合わせた。最初に、我々は、ブラストアルゴリズム（ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、ヒト生殖系列のデータベースで、１１Ｆ２のマウス可変ドメイン配列に対して高い配列同一性を有するＶＨ、ＶＬ、およびＶＪのヒト配列（重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の両方について）を検索した。ＨＣのＶＨの配列同一性が最も高い配列は、ＩＧＨＶ４－３０－４＊０１、ＩＧＨＶ４－２８＊０１、ＩＧＨＶ４－２８＊０６、およびＩＧＨＶ４５９＊０１であり、ＨＣ上位生殖系列のＶＪセグメントでは：ＩＧＨＪ５＊０１、ＩＧＨＪ４＊０１である。ＬＣについて、ＶＬの上位配列は、ＩＧＫＶ６Ｄ－４１＊０１およびＩＧＫＶ３－１１＊０１であり、ＶＪセグメントでは：ＩＧＫＪ２＊０１およびＩＧＫＪ２＊０２（表１２）である。次に、ヒト生殖系列とマウスＶＨ配列およびＶＬ配列との間の差異を、Ｆａｂ００７６／ＦＶＩＩａ複合体の結晶構造上にマッピングした。エピトープ中の残基から１０Å以上の距離で離れているマウス可変ドメイン中の残基は、結合親和性に全くまたはほとんど影響しないと予想され、対応するヒト生殖系列アミノ酸実体と交換された。次いで、パラトープを構成する残基は、親和性に影響を与えることなく置換することがより問題であると考えられ、ここでマウスアミノ酸実体が保存された。結合親和性に影響を及ぼす可能性のある結合界面近くの残基のサブセットが特定された。ヒト化バリアントは、エピトープの遠位の残基を、生殖系列アライメントからのヒトアミノ酸実体に変異させることによって生成された。さらに、パラトープに近い残基を、サブセット中のヒト実体に変異させて、バリアントを可能な限りヒト生殖系列に近づけた。セットに含まれたバリアントは、マウスＣＤＲが、ＨＣおよびＬＣの完全ヒト生殖系に移植されたものであった。表１３に従って、最初の解析から、１２個のＬＣおよび１３個のＨＣを生成し、２３個のバリアントに対形成した。
ヒト化抗体について、ＦＶＩＩａへの結合の親和性（表１３に列挙される）を、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社）を使用して測定した。すべてのステップを、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍｇ／ｍｌ ＩｇＧ－遊離ＢＳＡ）中、３０℃で行った。抗体は、１０μｇ／ｍｌの濃度で、抗ヒトチップ（ＡＨＣ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）に３分間捕捉した。続いて３分間のインキュベーションを行い、ベースラインを確立した。これに続いて、４つの異なる濃度のＦＶＩＩａ（２５ｎｍ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭ）を使用して３分間会合をモニターし、続いて３分間の解離を行った。センサグラムを、Ｆｏｒｔｅｂｉｏデータ解析ソフトウェアを使用して解析した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏデータがランク付けに使用されたため、絶対親和性値がＳＰＲによって決定された値から逸脱する場合がある（実施例６、表７）。
親マウス抗体と同等以上の親和性を有するヒト化の第１ラウンドからのバリアントが同定され、結合親和性を維持または改善することが見出されたそれらの変異が、第２ラウンドのバリアントを設計するために使用された。この一連の変異から、既に所望の親和性を有するヒト化ＨＣおよびＬＣ上にこれらの変異の多くを挿入することによって、第２のラウンドのバリアントを生成した。解析から、１９個のＶＨ配列（配列番号３１４、５１４、５２２、５３０、５３８、５４６、５５４、５６２、５７０、５７８、５８６、５９４、６０２、６１０、６１８、６２６、６３４、６４２および６５０に相当）および２５個のＶＬ配列（配列番号３１０、３１８、３２６、３３４、３４２、３５０、３５８、３６６、３７４、３８２、３９０、３９８、４０６、４１４、４２２、４３０、４３８、４４６、４５４、４６２、４７０、４７８、４８６、４９４および５０２に相当）が設計され、すべてのＶＬをＶＬと組み合わせて実験的に試験した結果、合計４７５個の組み合わせが得られた。上述のように、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して、得られた４７５個のヒト化抗体について、ＦＶＩＩａに結合する解離定数（ＫＤ）値を測定した。測定されたＫＤ値を表１４に列挙する。
ヒト化１１Ｆ２バリアントのＳＰＲ分析
選択されたヒト化１１Ｆ２バリアントの親和性を、実施例６に詳述されるＳＰＲ分析によって決定した。測定された解離定数を表１５に列挙し、バリアントのヒトＦＶＩＩａへの高親和性結合が保持されていることを示す。
ヒト化１１Ｆ２バリアントの機能的特性評価
ＦＶＩＩａの活性およびアンチトロンビンによる阻害に対する感受性に対する選択されたヒト化１１Ｆ２バリアントの効果を、実施例５に詳述されるように決定した。結果を表１６に列挙し、ヒト化バリアントがこれらのパラメータに関して望ましい特性を保持することを示す。
ヒト化１１Ｆ２バリアントとの共製剤化におけるＦＶＩＩａのラットにおける薬物動態
ヒト化 １１Ｆ２ バリアントファミリーを、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＶＩＩａとの共製剤で、実施例９に詳述したように、オスのスプラーグドーリーラットにＩＶ投与した。
結果は表１７に示され、ヒト化１１Ｆ２バリアントのいくつかが、親抗体と同じ長い半減期をＦＶＩＩａに与えることを示す。
実施例１５：活性部位阻害ＦＶＩＩａおよび可溶性組織因子と複合体を形成した１１Ｆ２Ｆａｂ０８８３の結晶化およびエピトープマッピング
ヒト化１１Ｆ２、すなわちｍＡｂ０７０５（ＯＡ）およびｍＡｂ０８４２（ＯＡ）によって認識されるＦＶＩＩ（ａ）上のエピトープを決定するために、対応するＦａｂ断片Ｆａｂ０８８３を、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（１９９５），２２，４１９－４２５に従う、ハンギングドロップ法を使用して、Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ａｒｇクロロメチルケトン（ＦＦＲ－ｃｍｋ；Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）活性部位阻害ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩａｉ）および可溶性組織因子断片１～２１９（ｓＴＦ）と複合体を形成して結晶化した。
結晶化
ＦＶＩＩａｉ／ｓＴＦと複合体を形成したＦａｂのＳＥＣ精製された複合体の結晶を、１８℃でのシッティングドロップ（ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ）蒸気拡散技術を使用して成長させた。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４中の３６０ｎｌのタンパク質複合体（４．５ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質溶液を、０．１５ＭのＣｓＣｌと１５％（ｗ／ｖ）のポリチレングリコール３３５０を含有する３６０ｎｌの沈殿物溶液および３６０ｎｌの水と混合し、８０μｌの沈殿物溶液に対して平衡化した。結晶は６週間以内に成長した。
回折データ収集
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、０．１５Ｍ ＣｓＣｌ、１５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール３３５０、および２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールからなる溶液中で凍結保護された。回折データは、Ｄｅｃｔｒｉｓ Ｐｉｌａｔｕｓ １Ｍ検出器を備えたＲｉｇａｋｕ ＦＲＸ回転アノードジェネレーターで１００Ｋで収集された。ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いてデータ削減を実施した（回折データの統計を表１８に要約する）。
構造の決定と精緻化
すべての結晶学的計算は、結晶学的プログラムのＰｈｅｎｉｘスイートを使用して実行された。構造は、検索モデルとして実施例１３に記載されるように取得された複雑な構造の座標を有するプログラムＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、４つのＦａｂ：ＦＶＩＩａｉ／ｓＴＦ複合体を含む。ＣＯＯＴおよびＰｈｅｎｉｘ改良を使用した手動再構成の反復サイクルにより、最終モデルが得られた（表１８）
エピトープマッピング
残基は、結晶中の４つの独立して決定されたＦＶＩＩａ分子のすべてが、Ｆａｂ中の非水素原子から４Å以下の距離内に位置付けられた前記残基の非水素原子を有する場合、エピトープの一部であるとみなされる。したがって、エピトープは、配列番号１に従って以下の残基を含むことが見出された：
Ｒ１１３
Ｃ１１４
Ｈ１１５
Ｅ１１６
Ｇ１１７
Ｙ１１８
Ｓ１１９
Ｌ１２０
Ｔ１３０
Ｖ１３１
Ｎ１８４
Ｔ１８５
Ｐ２５１
Ｖ２５２
Ｖ２５３
Ｑ３８８
Ｍ３９１
Ｒ３９２
パラトープ決定
結晶中の４つの独立して決定されたＦａｂ分子のすべてが、ＦＶＩＩａ中の非水素原子から４Å以下の距離内に位置付けられた前記残基の非水素原子を有する場合、残基はパラトープの一部とみなされる。パラトープは、以下の軽鎖残基（配列番号８１４に従う）：
Ｑ２７
Ｇ２８
Ｙ３２
Ｙ５０
Ｈ９２
Ｓ９３
Ｆ９４
および以下の重鎖残基（配列番号８１８に従う）、を含むことが見出された。
Ｄ３２
Ｙ５４
Ｙ１０３
Ｎ１０５
実施例１６：ＳＰＲを使用した １１Ｆ２ ｍＡｂ０８４２（ＯＡ）のホットスポット分析
ＦＶＩＩａのアラニンバリアントの発現
ｈＦＶＩＩアラニンバリアントを、安定したエピソーム発現系であるＱＭＣＦ技術（Ｉｃｏｓａｇｅｎ）を用いて生成した。ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５ 細胞を ＣＯ２ 振とうインキュベーター中の Ｅ１２５ フラスコ中の Ｑｍｉｘ１ 培地（１Ｌ＝１：１のＣＤ－ＣＨＯおよびＳＦＭ ＩＩ（ＮＶＯ１１５１４７０１）＋１０ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）＋２ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ， Ａ１１１３８－０３））で培養した。トランスフェクションの日に、１×１０ｅ７ ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５ 細胞を、エレクトロポレーション（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、３００Ｖ、９００μＦ、４ｍｍキュベット）を使用して、２μｇのｈＦＶＩＩバリアントコードプラスミドおよび５０μｇのサーモン精子ＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を Ｑｍｉｘ２ 培地（１Ｌ＝１：１のＣＤ－ＣＨＯおよびＳＦＭ ＩＩ（ＮＶＯ１１５１４７０１）＋１０ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）＋１ｍｌのＫ－ビタミン（Ｋ．ｖｉｔ １３Ａ ０１３１１）＋１４ｍｌの Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ、１０１３１－０２７））に移すことによって、Ｇ４１８選択を開始した。Ｇ４１８選択細胞の１０～１４日後、＞９５％の生存率に達した（Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ細胞カウンター）。細胞を、２×Ｅ１０００フラスコで、０．４×１０ｅ６細胞／ｍｌから２×２５０ｍｌのＱｍｉｘ２に分割した。３～４日後、細胞は、約４～５×１０ｅ６細胞／ｍＬの密度に達した。発現は、２０％ ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ（Ｇｉｂｃｏ Ａ１０２４０）＋６ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５０）を加えることによって開始された。開始４日後、さらに１０％ ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｂ＋６ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸを添加した。開始後６日目に、培養物を収穫し、スピンダウンした（２００ｇ、５分）。上清を収集し、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、１５６３０）および５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、２１１１５）を添加した。上清を、０．２２μｍのボトルトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ４３００４９）を使用して滅菌濾過した。
ｃＦＶＩＩａ－キメラの発現および精製（２２０１７－０５１）
ｃＦＶＩＩａ－キメラは、上記に概説したものと同様の発現系を使用して生成された。実施例２６に記載されるように、社内抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体（Ｆ１Ａ２）をセファロースビーズにカップリングすることによって調製されたアフィニティーカラムを使用して、酵素前駆体ｃＦＶＩＩ－キメラを培地から精製した。抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体Ｆ１Ａ２は、Ｃａ＋＋依存的にＦＶＩＩ（ａ）のＧｌａドメインに結合する。酵素前駆体ｃＦＶＩＩ－キメラは、ヒトＦＩＸａを使用して活性化され、Ｆ１Ａ２ アフィニティー精製を使用して再精製されて、最終的なｃＦＶＩＩａ－キメラを得た。
ホットスポット分析
一価ヒト化抗体 ｍＡｂ０８４２（ＯＡ）を使用したホットスポット分析は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用した、２５℃での１９個のＦＶＩＩ（ａ）バリアントのパネルとの結合研究によって実施された。ＦＶＩＩ（ａ）ｇｌａドメインを標的とする、２５μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体（ＮＮ内部Ａｂ ４Ｆ６（Ｎｉｅｌｓｅｎ ＡＬ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １１４（４７）１２４５４－１２４５９， ２０１７））を、標準アミンカップリングケミストリーキットを使用して ＣＭ４ センサーチップ上に固定した（どちらもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給）。表１９によると、細胞培養上清中のＦＶＩＩ（ａ）バリアント（上述のとおり）を、ランニング緩衝液で希釈し、１０ μｌ／分の流量で１分間注入して、５～５５ＲＵの捕捉レベルを達成した。各ＦＶＩＩ（ａ）バリアントを、固定化抗ＦＶＩＩ（ａ）ｇｌａ Ａｂによって捕捉した。続いて、５４０ｎＭ（３倍希釈）のｍＡｂ０８４２（ＯＡ）を、３０μｌ／分の流量で７分間注入して、捕捉されたＦＶＩＩ（ａ）バリアントへと結合させ、その後９分間の緩衝液注入によってワンアームド抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の解離を可能にした。ランニング緩衝液を １０ｘＨＢＳ－Ｐ 緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）を希釈することによって調製し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５ｍＭの ＣａＣｌ２ で補充して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、ｐＨ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を得た。ランニング緩衝液はまた、抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体およびＦＶＩＩ（ａ）試料の希釈にも使用された。 １０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５ｖ／ｖのポリソルベート２０、ｐＨ７．４を使用して、チップの再生を達成した。結合データを、製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用する１：１反応速度（Ｋｉｎｅｔｉｃ）モデルおよび定常状態分析により解析した。可能な限り、１：１の反応速度適合モデルからのｋａ、ｋｄ、およびＫＤ値が報告される。４つのＦＶＩＩ（ａ）バリアントについて、定常状態適合モデルを使用したＫＤ値を報告した。さらに、捕捉シグナルは、すべてのＦＶＩＩ（ａ）バリアントについて報告される。アミノ酸残基が、そのアミノ酸残基をアラニンと置換すると、野生型に対して１０倍以上の親和性低下をもたらす場合、アミノ酸残基はホットスポット残基とみなされる。表１９に提示されたデータに基づいて、アミノ酸残基Ｈ１１５、Ｔ１３０、Ｖ１３１、およびＲ３９２がホットスポットであると結論付けられる。
実施例１８：カニクイザルにおけるヒト化 １１Ｆ２ 抗体との共製剤化における組み換えＦＶＩＩａの薬物動態
ＦＶＩＩａ血漿活性時間プロファイルは、組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）のみ、または１価のワンアームド１１Ｆ２ ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）との１：３モル比の共製剤のいずれかの、ＩＶ投与またはＳＣ投与後のカニクイザル研究で推定された。製剤は、５．４ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＶＩＩａ（共製剤用の１６．２ｎｍｏｌ／ｋｇのｍＡｂ０７０５（ＯＡ）を含む）の単回投与として投与され、３週間にわたって血液試料を採取した。
実験中、動物は現地の保健当局の標準手順に従って飼育および扱われ、飼料および水を自由に摂取できるようにした。ＦＶＩＩａ血漿活性を、実施例８に記載されるＦＶＩＩａ活性アッセイを使用して測定した。内因性カニクイザルＦＶＩＩａは、投与前にＬＬＯＱ（０．１ｎＭ）未満であり、その結果無視された。
ＦＶＩＩａ血漿活性時間プロファイルの薬物動態解析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４を使用した非コンパートメント法によって実施された。データから次のパラメータを推定した：クリアランス（ＣＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、およびＳＣ生物学的利用能（Ｆ）。パラメータを表２０に列挙し、抗体の非存在下でのＦＶＩＩａと比較して、ＩＶ投与およびＳＣ投与後の両方において、ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）との共製剤によるＦＶＩＩａ活性の実質的な延長を示す。
実施例１９：マウス抗ＴＬＴ－１抗体ｍＡｂ００１２のヒト化および最適化
ヒト化
ＷＯ２０１２／１１７０９１に開示されたマウス抗ヒトＴＬＴ－１抗体ｍＡｂ００８２は、ヒト化プロセスの出発点として使用された。ｍＡｂ００８２は、ＶＬのＣ４１ＡおよびＶＨのＴ６１Ａを組み込む２つの点変異により、ＶＬのＦＲ１中の不対のシステインと、ＶＨのＣＤＲ２中のＮ－グリコシル化部位をそれぞれ除去する、ｍＡｂ００１２に由来するものである。ヒト化プロセスは、当業者に公知の標準分子生物学方法に基づくものであった。
簡潔に述べると、ｍＡｂ００８２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および ＣＤＲＨ３配列を、ＩＭＧＴデータベースに定義されるＶＨ３＿７４／ＪＨ１配列に基づいてヒト生殖系列配列上に移植した。さらに、３つのＶＨ３＿７４／ＪＨ１ヒトアミノ酸置換を、このＣＤＲ配列：Ｐ６２Ｄ、Ｌ６４ＶおよびＤ６６Ｇをさらにヒト化するために、移植されたＣＤＲＨ２配列に導入した。ｍＡｂ００８２ の結合親和性に匹敵する結合親和性を得るために、３つの復帰変異を、位置 Ｓ４９Ｇ、Ｄ６２ＰおよびＲ９８ＳでＶＬ配列に導入した。ＶＬのヒト化に関して ｍＡｂ００８２のＣＤＲＬ１、 ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ 配列を、ＩＭＧＴデータベースに定義されるＶＫＩＩ＿Ａ２３／ＪＫ２ 配列に基づいてヒト生殖系列配列上に移植した。ＶＬ配列は、ＣＤＲ１中に潜在的な脱アミド化ホットスポット（ＮＧモチーフ）を含有する。この位置で飽和変異誘発を使用すると、ＴＬＴ－１に対する親和性を損なわずにＮ３３Ｑ置換によってＮＧモチーフを除去できることが見出された。
ｍＡｂ００８２の最終的なヒト化および最適化されたバリアントは、配列番号９３４（ＶＬ）および９３８（ＶＨ）に対応し、ｍＡｂ１０７６と称される。
ヒト化ＴＬＴ１バリアントのＳＰＲ分析
（実施例４）からの ｓＴＬＴ１（Ｃ末端に６個のヒスチジン残基が付加された配列番号３に相当）のｂｉＡｂへの結合を、２５℃で表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）によりプローブした。 抗ヒトＩｇＧを、標準アミンカップリングケミストリーを使用してＣＭ５センサーチップ（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが供給）上に固定した。表２１（１ｎＭ）に従って精製されたｂｉＡｂを、１０ μｌ／分の流量で１分間注入した。 続いて、０～６０μＭの間の ｓＴＬＴ１ を、３０μｌ／分の流量で３分間注入し、ｂｉＡｂへの結合を可能にし、続いて３分間の緩衝液注入により、ｂｉＡｂからの解離を可能にした。ランニング緩衝液を １０ｘＨＢＳ－Ｐ 緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）を１０倍希釈することによって調製し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５ｍＭの ＣａＣｌ２ で補充して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖのポリソルベート２０、ｐＨ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を得た。ランニング緩衝液はまた、ｂｉＡｂおよびｓＴＬＴ１試料の希釈にも使用された。チップの再生は ３Ｍ ＭｇＣｌ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ提供）で構成される推奨再生緩衝液を使用して達成された。結合データを、製造元（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用する１：１モデルにより解析した。分析により、表２１に報告された結合定数は、ｂｉＡｂによるｓＴＬＴ１結合に対する２．９ｎＭ～３２０ｎＭの親和性の範囲を示した。
実施例２０：Ｈｚ－ＴＬＴ１およびＴＬＴ－１ペプチド複合体調製の結晶構造
ＴＬＴ－１ストークペプチドとの複合体での結晶化に使用されるＦａｂ断片は、ｍＡｂ１０７６（それぞれ配列番号８５４および８５８）、ヒト ＩｇＧ４ ＣＨ１ドメイン、および単一の点変異（Ｇ１５７Ｃ）を有するヒトカッパＣＬに対応するＶＬおよびＶＨドメイン配列を含む。ＧからＣへの置換は、Ｆａｂ断片の定常ドメイン内、すなわち抗原結合部位からは遠く、ＴＬＴ－１への結合に影響を与えない。配列番号２の残基１１１～１４７に対応する３７ｍｅｒストークペプチド、ＥＥＥＥＥＴＨＫＩＧＳＬＡＥＮＡＦＳＤＰＡＧＳＡＮＰＬＥＰＳＱＤＥＫＳＩＰ（配列番号１３）は、当業者に公知の標準ペプチド合成方法によって調製された。Ｆａｂペプチドとストークペプチドとを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．３）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で１：２モルの比で混合した。１：１のＦａｂ：ペプチド複合体を、ｈｅｐｅｓ緩衝液で溶出されたｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上でゲル濾過を使用して単離し、その後、約１１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に使用した。
結晶化
ゲル濾過した１：１モルのＦａｂ／ペプチド複合体の結晶を、１８℃でのシッティングドロップ蒸気拡散法を使用して成長させた。 ２０ｍＭ のＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．３および １５０ｍＭ のＮａＣｌ中の１５０ｎｌの１０．８ｍｇ／ｍｌのＦａｂ：ペプチド複合体のタンパク質溶液を、沈殿剤として５０ｎｌの 、１Ｍ のＬｉＣｌ、０．１Ｍ のＮａクエン酸－クエン酸、ｐＨ４および２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ ６０００と混合し、６０μｌの沈殿剤上でインキュベートした。
回折データ収集
結晶は、液体窒素中でフラッシュ冷却する前に、結晶化ドロップに２０％のエチレングリコールを加えた１μｌの沈殿剤の添加によって凍結保護した。回折データは、Ｄｅｃｔｒｉｓ社のＥｉｇｅｒ １６Ｍ Ｈｙｂｒｉｄ－ｐｉｘｅｌ検出器を使用して、ＭＡＸ ＩＶシンクロトロン（Ｌｕｎｄ， Ｓｗｅｄｅｎ）のＢｉｏＭＡＸビームラインで １００Ｋ で収集された。データの自動インデックス、統合、およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムを用いて実施された（回析データ統計を表２２に要約する）。
構造の決定と精緻化
非対称ユニットは、Ｍａｔｔｈｅｗｓ係数解析から判断されるように２つのＦａｂ：ペプチド複合体を含有する。構造を、分子置換によって決定した。プログラムスイートＰｈｅｎｉｘに実装されたＰｈａｓｅｒは、２つのＦａｂを局在化する検索モデルとして、タンパク質データバンクエントリ５ＫＭＶのＨ鎖とＬ鎖と併用された。これらは、ＣＯＯＴ を使用して正しいアミノ酸配列を用いて構築され、その後Ｐｈｅｎｉｘ改良を使用して改良された。ペプチド由来のアミノ酸７～２１は、差異電子密度マップに明確に見られ、ＣＯＯＴを使用して手動で構築したモデルとすることができる。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築のステップを使用して改良された。精緻化統計が表２２に示される。
Ｆａｂ／ペプチド複合体エピトープおよびパラトープ
エピトープは、非対称なユニットの複合体の両方においてＦａｂの重原子から４．０Åの距離内に重原子（すなわち、非水素原子）を有すること特徴とするＴＬＴ－１ストーク－ペプチドの残基として定義される。同様に、パラトープは、非対称ユニットの両方の複合体のＴＬＴ－１ストークペプチドの重原子から４．０Åの距離内に重原子を有することを特徴とするＦａｂ断片の残基として定義され、エピトープは配列番号 １３に従う、３７ａａ ＴＬＴ－１ペプチドからの以下の残基を含むことが見出され、
Ｋ８
Ｉ９
Ｇ１０
Ｓ１１
Ｌ１２
Ａ１３
Ｎ１５
Ａ１６
Ｆ１７
Ｓ１８
Ｄ１９
Ｐ２０
Ａ２１
（これは、配列番号２および３のＫ１１８、Ｉ１１９、Ｇ１２０、Ｓ１２１、Ｌ１２２、Ａ１２３、Ｎ１２５、Ａ１２６、Ｆ１２７、Ｓ１２８、Ｄ１２９、Ｐ１３０およびＡ１３１に相当する）。
パラトープは、重鎖可変ドメイン（配列番号９３８）からの以下の残基を含み：
Ｖ２
Ｆ２７
Ｒ３１
Ｙ３２
Ｗ３３
Ｅ５０
Ｔ５７
Ｎ５９
Ｓ９８
Ｇ９９
Ｖ１００
Ｔ１０２
Ｓ１０３
、および軽鎖可変ドメイン（配列番号９３４）からの：
Ｈ３１
Ｙ３７
Ｈ３９
Ｙ５４
Ｆ６０
Ｓ６１
Ｓ９６
Ｔ９７
Ｖ９９
Ｙ１０１、を含む。
実施例２１：抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１二重特異性抗体刺激活性に対する親和性の効果
二重特異性抗体活性に対する親和性の効果を決定するために、１１Ｆ２ ｍＡｂ０００５（実施例１４を参照）および ｍＡｂ００１２（実施例１９を参照）のヒト化からの、それぞれＦＶＩＩａおよび ＴＬＴ－１に対する様々な親和性を有するいくつかの抗ＦＶＩＩ（ａ）および 抗ＴＬＴ－１ｍＡｂを、ＷＯ２０１１／０２３７８５に記載される脂質化ＴＬＴ－１を使用したＦＸａ生成アッセイで二重特異性フォーマットで試験した。
第１のステップでは、ＦＸ活性化を、１０：９０ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン小胞（ＷＯ２０１１０２３７８５）に組み込まれた４ｎＭの組み換えＴＬＴ－１、２．５ｎＭのＦＶＩＩａ、および二重特異性抗体（ｂｉＡｂ）の存在下で、０～３００ｎＭの濃度系列で測定した。アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．１％ＰＥＧ８０００）中で室温で１０分間プレインキュベーションした後、１５０ｎＭの血漿由来ＦＸ（Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、総体積５０μｌを得、２０分間活性化させた。次いで、活性化を、２５μｌのクエンチ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）の添加によって終了し、生成されたＦＸａは、０．５ ｍＭ Ｓ－２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）発色基質（２５μｌの体積に２ｍＭストックとして添加）を加水分解する能力から定量化され、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダーで４０５ｎｍで５分間追跡された。線形吸光度増加の傾きから、ｂｉＡｂの非存在下でのバックグラウンド活性の減算およびアッセイ中のＦＶＩＩａ濃度による除算によって、１００ｎＭの濃度で各ｂｉＡｂに対して正規化された活性（ＡｂｉＡｂ）を計算した。
第２のステップでは、ｂｉＡｂをアッセイ緩衝液に置き換え、０～８０ｎＭのＦＶＩＩａの濃度系列にして、同じアッセイを実行した。バックグラウンド減算されたＦＸａ生成とアッセイ中のＦＶＩＩａの濃度との間の線形関係の傾きは、採用されたアッセイ条件下での遊離ＦＶＩＩａ（ＡＦＶＩＩａ）の比活性の尺度をもたらした。
測定された活性に基づいて、１００ｎＭでの各ｂｉＡｂの刺激活性を、ＡｂｉＡｂ／ＡＦＶＩＩａの比率として計算した。刺激活性は、１００ｎＭのｂｉＡｂを添加した時の、ＦＶＩＩａによる生成されたＦＸａの倍率増加の尺度を提供する。
刺激活性が表２３に提供され、ＦＶＩＩａおよびＴＬＴ－１がそれぞれ結合される強度（解離定数（ＫＤ）値として表される）に対するｂｉＡｂ刺激の依存性を示す。試験されたｂｉＡｂの中で、ｂｉＡｂ０００１は最も高い刺激活性を示す。
実施例２２：抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１二重特異性抗体刺激活性に対するエピトープ位置の効果
二重特異性抗体活性に対するエピトープ位置の効果を決定するために、ＴＬＴ－１およびＦＶＩＩａ上の異なるエピトープにそれぞれ結合するいくつかの抗ＴＬＴ－１および抗ＦＶＩＩａ ｍＡｂを、実施例２１で行われたように、ＦＸａ生成アッセイにおける二重特異性フォーマットで試験した。
結果を表２４に提示し、エピトープ位置に対するｂｉＡｂ刺激活性の依存性を示す。特に 抗ＦＶＩＩａ ｍＡｂである、ｍＡｂ０８６５と組み合わせた、抗ＴＬＴ－１ｍＡｂである、 ｍＡｂ１０７６ 、 ｍＡｂ００２３ 、 ｍＡｂ００５１ および ｍＡｂ００６２ は、同等の刺激活性を呈する。
実施例２３：ヒトＩｇＧ（ＬＯＣＩ）に対する抗原アッセイ
カニクイザル血漿中のヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）の存在を、発光酸素チャネリングイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＬＯＣＩ）により測定した。簡潔に述べると、ＬＯＣＩ試薬は、２つのラテックスビーズ試薬（ドナーおよびアクセプタービーズ）、およびｈＩｇＧに対するビオチン化モノクローナル抗体（Ｂｉｏｓｉｔｅ、カタログ番号 ＡＦＣ４２４９）が含まれていた。感光性色素を含有するドナービーズ試薬をストレプトアビジンでコーティングした。第２のビーズ試薬であるアクセプタービーズを、サンドイッチを構成するｈＩｇＧに対する社内モノクローナル抗体（０４２１）と結合した。アッセイ中、３つの反応物は、血漿中のｈＩｇＧと組み合わされて、ビーズ凝集免疫複合体を形成した。複合体の励起により、ドナービーズから一重項酸素分子が放出され、アクセプタービーズに送られ、化学発光応答が誘発された。次に、これをＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーで測定した。生成された光の量は、１秒当たりのカウント（ｃｐｓ）として報告され、ｈＩｇＧの濃度に比例した。試料をアッセイ緩衝液中で少なくとも１００倍希釈し、１％のカニクイザル血漿に添加したｈＩｇＧに基づいて検量線を調製した。
実施例２４：ＦＶＩＩ（ａ）に対する抗原アッセイ（ＬＯＣＩ）
ＦＶＩＩ酵素前駆体、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩａ：アンチトロンビン（ＦＶＩＩａ：ＡＴ）複合体を含む、ＦＶＩＩ（ａ）抗原は、実施例２３に記載されるＬＯＣＩアッセイによって測定された（ただし、ＦＶＩＩ（ａ）のアッセイが、社内抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体（４Ｆ９）および社内ビオチン化抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体（４Ｆ７）でコーティングされたアクセプタービーズでから構成されたことを除く）。試料をアッセイ緩衝液中で少なくとも１００倍希釈し、既知の量のヒトｒＦＶＩＩａをアッセイ緩衝液に添加することによって検量線を調製した。
実施例２５：ＦＶＩＩａ：ＡＴ（アンチトロンビン）（ＥＩＡ）に対する抗原アッセイ
ＦＶＩＩａ：ＡＴ（アンチトロンビン）複合体を、Ａｇｅｒｓφ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１１；９：３３３－８に記載されているように酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を使用して測定した。Ｎ末端ＥＧＦドメインに結合し、アンチトロンビン結合をブロックしないモノクローナル抗ＦＶＩＩａ抗体（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク、製品コード Ｏ９５７２）を、ＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体の捕捉に使用した。ヒトＦＶＩＩａおよびカニクイザルアンチトロンビン（ＦＶＩＩａ：ＡＴ）の予め形成された複合体を、１０μＭの低分子量ヘパリン（エノキサパリン）の存在下で、２倍モル過剰のアンチトロンビンとＦＶＩＩａをインキュベーションすることにより調製した。室温で一晩インキュベーションした後のＦＶＩＩａの残留アミド分解活性（実施例１１を参照）は、最初のＦＶＩＩａ活性の１０％未満であることが検証された。複合体を使用して、ＥＩＡ検量線を構築した。ポリクローナル抗ヒトアンチトロンビン抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡｐＳ、Ｂａｌｌｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ、製品コード ＯＷＭＧ１５）を検出に使用した。ＴＭＢを添加し、十分な発色が得られるまで発色を進行させ、Ｈ２ＳＯ４を添加して停止し、吸光度プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍの吸光度を測定した。色強度は、ＦＶＩＩａ：ＡＴの濃度に比例する。
実施例２６：ヒトＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ（酵素前駆体）、およびＦＶＩＩａ：ＡＴ（アンチトロンビン）複合体の調製
ヒトＦＶＩＩａ（活性化ＦＶＩＩ）の調製
別段の記載がない限り、組み換えヒト活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）は、Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５－７７９３およびＰｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３８５：２４１－２４３に記載されているように調製された。
ヒトＦＶＩＩ（酵素前駆体ＦＶＩＩ）の調製
ＣＨＯ細胞で産生された組み換えヒトＦＶＩＩは、Ｔｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７７８５－７７９３ によって記載されているようにシングルステップカルシウム依存性アフィニティークロマトグラフィーによって精製された。精製後、酵素前駆体ＦＶＩＩを１０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ６．０の緩衝液に透析した。調製物中の活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）のレベルは、１ｍＭの発色基質Ｓ－２２８８および２００ｎＭのｓＴＦの存在下でのアミド溶解活性を測定することによって決定された（実施例１１を参照されたい）。これを、既知の濃度のＦＶＩＩａを用いて調製された標準曲線に関連付けることによって、測定された活性を、酵素前駆体ＦＶＩＩ調製物中のＦＶＩＩａのモル濃度に変換することができる。
ヒトＦＶＩＩａ：ＡＴ（アンチトロンビン）複合体の調製
ＦＶＩＩａ：ＡＴ（アンチトロンビン）複合体を、ヒト組み換えＦＶＩＩａ、ヒト血漿由来ＡＴ（Ｂａｘｔｅｒ）、および低分子量ヘパリン（エノキサパリンナトリウム）の等モル濃度を４℃で１６時間インキュベートすることによって調製した。汚染された賦形剤を除去するために、使用前にＡＴを、ヘパリンセファロース６ファストフロー（ＧＥヘルスケア）カラムで塩化ナトリウム勾配を適用して再精製した。溶出されたＡＴを限外濾過により濃縮し、５０％グリセロールを含有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．３で最終調製物を得た。ＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体を、２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．５で４℃でのＳＥＣクロマトグラフィーにより精製し、複合体の安定性を最大化した。調製物中のＦＶＩＩａの残留レベルを、上述のように決定した。複合体の分解を最小限に抑えるために、調製物をアリコートで－８０℃で保存し、使用前に直ちに解凍し、氷上で保持した。
実施例２７：カニクイザルにおける抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１ ｂｉＡｂの単回投与薬物動態
ｂｉＡｂ０００１および、追加的な３つの半減期延長置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）が定常重鎖ドメインに導入されている、対応するＹＴＥバリアントであるｂｉＡｂ０３５２は、カニクイザルに３．０、９．４９または３０ｎｍｏｌ／ｋｇで静脈内（ｉｖ）に投与されるか、または９．４９ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下（ｓｃ）投与した。各群は、２匹のサル（雄１匹および雌１匹）から構成された。１ｍＬのクエン酸ナトリウム安定化血液試料を、投与前、およびｉｖ群に対して、投与後０．５時間、２．５時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および８日目、１０日目および１５日目に採取した。ｓｃ群については、血液試料を、投与前、および投与後０．５時間、３時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、３０時間、３８時間、４８時間、５４時間、７２時間、７８時間、９６時間、１２０時間、および８日目、１０日目、および１５日目に採取した。血液試料を２０００ｇで１０分間遠心分離し、血漿を除去し、アリコートに分割し、ｈＩｇＧ（実施例２３を参照）、総ＦＶＩＩ（ａ）抗原（実施例２４を参照）、ＦＶＩＩａ活性（実施例８を参照）、およびＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体（実施例２５）の分析まで－８０℃で保存した。ｈＩｇＧの濃度対時間プロファイルの薬物動態（ＰＫ）解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４を使用した非コンパートメント法によって実施した。以下のＰＫパラメータを表２４に示す：半減期（ｔ１／２）、クリアランス（Ｃｌ）、分布容積（Ｖｚ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）およびＳＣ生物学的利用能（Ｆ）。
内因性ＦＶＩＩ（ａ）の蓄積は、ＢｉＡｂ０００１または対応するＹＴＥバリアント、ｂｉＡｂ０３５２を投与されたサルで観察された。表２５は、ＦＶＩＩ（ａ）抗原、ＦＶＩＩａ活性、およびＦＶＩＩ：ＡＴの投与前レベルと、投与後７２～２４０時間の間に測定された平均累積レベルを示す。ＦＶＩＩ（ａ）抗原、ＦＶＩＩａ活性、およびＦＶＩＩａ：ＡＴの抗体用量依存的な蓄積が観察された。ＦＶＩＩ（ａ）抗原は、投与前レベルと比較して最大３倍まで増加し、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴは最大で５倍まで増加した。データは、ｂｉＡｂ０００１またはｂｉＡｂ０３５２の単回用量のｉｖまたはｓｃ投与が、ＹＴＥ変異を有すると、インビボでの内因性ＦＶＩＩ（ａ）抗原、ＦＶＩＩａ活性、およびＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体の蓄積につながることを実証している。
実施例２８：カニクイザルにおける一価の １１Ｆ２ 抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体であるｍＡｂ０７０５（ＯＡ）の単回投与および反復投与薬物動態
ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩａ：ＡＴのインビボでの蓄積は、カニクイザルへの一価の１１Ｆ２抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）の投与、続いて血漿試料中のＦＶＩＩ抗原、ＦＶＩＩａ活性、およびＦＶＩＩａ：ＡＴの測定をすることによって分析した。約２．５ｋｇのオスのカニクイザル２匹に４０ｎｍｏｌ／ｋｇ ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）で尾部の伏在静脈、橈側皮静脈、または外側尾静脈にｉｖ投与し、３匹のオスのカニクイザルに１日おきに２週間、大腿部（左大腿部と右大腿部の間で交互に）の皮下（ｓｃ）に２０ｎｍｏｌ／ｋｇのワンアームド抗ＦＶＩＩａ抗体を投与した（すなわち、抗体を１、３、５、７、９、１１、１３、および１５日目に投与した）。血液は、投与後２１日までの時点で、橈側皮静脈または大腿静脈から３．８％クエン酸三ナトリウムに採取された。
血液を、２３００ｇで１０分間遠心分離し、血漿を分注し、ｈＩｇＧ（実施例２３を参照）、総ＦＶＩＩ（ａ）抗原（実施例２４を参照）、ＦＶＩＩａ活性（実施例８を参照）、およびＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体（実施例２５を参照）の分析まで－８０℃で保存した。濃度対時間プロファイルのＰＫ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４を使用した非コンパートメント法によって実施した。ｉｖ投与のＰＫパラメータを表２６に示す。ワンアームド抗体の半減期（ｔ１／２）は、単回ＩＶ投与後の平均１１６時間（４．８日）であった。ｓｃ投与抗体の推定半減期は、１８１±２０時間（ｎ＝３の平均およびＳＤ）であった。抗体は、投与の２週間の間に蓄積し、最初の投与後の３３６～３６６時間の間の時点で、１１７９±１４０ｎＭの最大レベルをもたらした（ｎ＝３の動物および３つの時点でのデータの平均およびＳＤ）。
ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）の単回ＩＶまたは反復ｓｃ投与は、内因性ＦＶＩＩ（ａ）の蓄積をもたらした。４０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回投与後の総ＦＶＩＩ（ａ）抗原、ＦＶＩＩａ：ＡＴおよびＦＶＩＩａを表２７に示す。総ＦＶＩＩ抗原は、７～１４日目に、投与前７．０ｎＭから３５．０±４．７ｎＭに増加した。同様に、ＦＶＩＩａは、検出限界未満（０．００９ｎＭ）から２．３±０．７ｎＭに増加し、ＦＶＩＩａ：ＡＴは、７～１４日目に１．０から６．３±０．８ｎＭに増加した。４０ｎｍｏｌ／ｋｈのワンアームド抗体投与後の酵素前駆体ＦＶＩＩレベルは、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴを総ＦＶＩＩ（ａ）抗原から差し引くことによって計算した場合、２６．４ｎＭであった。
複数回のｓｃ投与後の総ＦＶＩＩ（ａ）、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩａ：ＡＴの定常状態レベルを、表２８に示す。総ＦＶＩＩ（ａ）抗原は、投与前の６．５±１．５ｎＭから、１２～２１日目に３６．９±９．８ｎＭに増加した。同様に、ＦＶＩＩａは、検出限界未満（０．００９ｎＭ）から、１２～２１日目に３．９±１．６ｎＭに増加し、ＦＶＩＩａ：ＡＴは、１２～２１日目に１．０±０．３から９．１±０．６ｎＭに増加した。総ＦＶＩＩ（ａ）抗原からＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴを差し引くことによって計算された定常状態の酵素前駆体ＦＶＩＩレベルは２４ｎＭであった。
データは、ワンアームド抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体ｍＡｂ０７０５（ＯＡ）の投与が、インビボで内因性ＦＶＩＩ（ａ）、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴの蓄積をもたらしたことを実証する。ワンアームド抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体のクリアランス（０．４２～０．４９ｍＬ／ｋｇ×ｋｇ、表２６）は、静脈内投与後のｂｉＡｂ０００１のクリアランス（０．３３～０．６４ｍＬ／ｋｇ×ｋｇ、実施例２７、表２４）と同等であった。したがって、ワンアームド抗ＦＶＩＩ（ａ）抗体の反復投与後に測定されたＦＶＩＩ（ａ）抗原、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴの定常状態レベルは、同じＦＶＩＩ（ａ）結合アームを有するｂｉＡｂの反復投与後に定常状態で達成されるであろうレベルを表すものと予想される。
実施例２９：抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１ ｂｉＡｂ０００１ および酵素前駆体ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴの定常状態レベルを追加したヒト全血中の血友病Ａ様状態におけるトロンボエラストグラフィー
二重特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１抗体ｂｉＡｂ０００１（親抗ＦＶＩＩ（ａ）がｍＡｂ０８６５であり、親抗ＴＬＴ－１抗体がｍＡｂ１０７６である）および蓄積されたレベルの酵素前駆体ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴの実施例２８からの効果が、血友病Ａ様状態でのヒト全血中のトロンボエラストグラフィーにより評価された。トロンボエラストグラフィー解析は、ＴＥＧ（登録商標）機器（Ｔｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｈａｅｍｏｓｃｏｐｅ Ｃｏｒｐ．）を使用して、原則として、Ｖｉｕｆｆ Ｄ， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ２０１０； １２６：１４４－９に記載されているように実施された。健康なドナーからのクエン酸安定化全血を、１ｍｇ／ｍＬ中和抗ＦＶＩＩＩヒツジポリクローナル抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ， カタログ番号、ＰＡＨＦＶＩＩＩ－Ｓ－Ｃ）および５μｇ／ｍＬ中和抗ＴＦマウスモノクローナル抗体（１Ｆ４４ 、社内で調製）と共に３０分間、インキュベートした。ＨＢＳ／ＢＳＡ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、 １４０ｍＭのＮａＣｌ、 ｐＨ７，４、２％のＢＳＡ）中の最終血漿濃度１００ｎＭのｂｉＡｂ０００１を、ｒＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ Ｓｅｖｅｎ（登録商標）、 Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、 最終的な血漿濃度 ３．９ｎＭ）、 酵素前駆体ＦＶＩＩ（実施例２６で調製されたとおり）、 最終血漿濃度２４ｎＭ）およびＦＶＩＩａ：ＡＴ複合体（実施例２６で調製されたとおり）、最終的血漿濃度９ｎＭ）と混合し、血液試料に添加した。ＦＶＩＩａ：ＡＴの前希釈を、冷２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．５＋２％のＢＳＡ中で行い、アッセイを開始する直前に残りのタンパク質に添加した。ＦＶＩＩ酵素前駆体およびＦＶＩＩａ：ＡＴ調製物は、微量のＦＶＩＩａを含有していたため、これとドナー血液中のＦＶＩＩａの予想血漿濃度を補うため、対応するより低い量のＦＶＩＩａを添加した（０．１ｎＭ、Ｍｏｒｉｓｓｅｙ ＪＨ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ，１９９３；８１：７３４－４４）。同様に、添加された酵素前駆体ＦＶＩＩの量は、ドナー血液中の１０ｎＭ酵素前駆体ＦＶＩＩａの予想される血漿濃度を補償した。別の試料には、血友病Ａのヒト対象に９０μｇ／ｋｇのｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を投与した後の理論上の最大血漿濃度に対応する２５ｎＭ ｒＦＶＩＩａが含まれていた（Ｌｉｎｄｌｅｙ ＣＭ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ １９９４；５５：６３８－４８）。対照には、ｂｉＡｂのみ、およびＢｉＡｂを含まないＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩａ：ＡＴ混合物が含まれていた。血小板は、ＰＡＲ１アゴニストペプチドＳＦＬＬＲＮ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４９７）を最終濃度３０μＭまで、ＧＰＶＩアゴニストコンブルキシン（５－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号５Ｄ－１１９２－５０ＵＧ）を最終濃度１０ ｎｇ ／ ｍＬまで、添加することで最大限に活性化された。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中の２０μｌの０．２ＭのＣａＣｌ２の容量を、ＴＥＧカップに添加し、続いて３４０μｌの血液試料を添加し、直ちに分析を開始した。ＴＥＧトレースの２ｍｍ振幅までの時間として定義される凝固時間（Ｒ時間）は、ソフトウェア（ＴＥＧ（登録商標）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン４．１．７３）によって計算された。４人のドナーからのデータを表２９に示す。凝固時間は、ＦＶＩＩＩを中和することによって血友病Ａ様状態を誘発した後、正常血液中の２９０±１２秒から３５０６±１５６１秒に遅延した。２５ｎＭのｒＦＶＩＩａを加えると、擬似血友病Ａ血液の凝固時間が６９４±１５８秒に短縮した。１００ｎＭのｂｉＡｂを血液に追加すると、凝固時間が２１９８±７１２秒にわずかに短縮され、これは、おそらく血液中の内因性ＦＶＩＩａの効果の増強が増強されたためである。ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩａ：ＡＴの定常状態レベルを加えると、凝固時間が１４４０±２７５秒に減少した。１００ｎＭのｂｉＡｂおよび定常状態レベルのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩａ：ＡＴを組み合わせることにより、凝固時間が４９５±３９秒に短縮された。すなわち、２５ｎＭのＦＶＩＩａを追加した後の凝固時間と同等またはわずかに低いレベルまで減少した。データは、ｂｉＡｂが、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩａ：ＡＴの蓄積されたレベルの効果を増強し、治療有効濃度のｒＦＶＩＩａで達成された凝固時間の減少と類似またはわずかに良い凝固時間の減少をもたらすことを示す。
実施例３０：異なるＴＬＴ－１親和性および酵素前駆体ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩａ：ＡＴの定常状態レベルを有する二重特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１抗体を追加したヒト全血中の血友病Ａ様状態でのトロンボエラストグラフィー
本実施例では、ＴＬＴ－１に対して異なる親和性を有する以下の二重特異性抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１抗体を試験した。
１００ｎＭの濃度の二重特異性抗体を、実施例２９に記載されるようにトロンボエラストグラフィーにより評価した。凝固時間（Ｒ－時間）を表３０に列挙する。血友病Ａ（ＨＡ）の誘発時に、抗ＦＶＩＩＩ抗体を添加することによって、凝固時間は３４０秒から５４３３秒に遅延した。ＴＬＴ－１（ｂｉＡｂ０００１）に対する最も高い親和性を有するｂｉＡｂの存在は、凝固時間を２４６５秒に短縮させた。すなわち、３つの他のｂｉＡｂのみについて観察された凝固時間の短縮より大きかった（ｂｉＡｂ００１５は、凝固時間を３６４５秒に、－ｂｉＡｂ００９０は、４３３５秒に、ｂｉＡｂ００９５は、４１１０秒に短縮させた）。同様に、ｂｉＡｂと、定常状態レベルのＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩ：ＡＴの組み合わせは、３つの他のｂｉＡｂよりも、ｂｉＡｂ０００１の凝固時間のより顕著な減少（５４０秒に）をもたらした（すなわち、ｂｉＡｂ００１５では１１００秒に、ｂｉＡｂ００９０では１０４０秒に、およびｂｉＡｂ００９５では８１５秒に）。データは、ＴＬＴ－１に対して最も高い親和性（すなわち最低のＫＤ）を有するｂｉＡｂ０００１が凝固時間の短縮に最も効果的であることを示している。
実施例３１：ＦＶＩＩＩ欠損トランスジェニックヒトＴＬＴ－１マウスにおける尾静脈切断モデルにおける抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１二重特異性抗体ｂｉＡｂ０００１のインビボ効果
抗ＦＶＩＩ（ａ）／抗ＴＬＴ－１二重特異性抗体ｂｉＡｂ０００１のインビボ有効性を、トランスジェニックＦＶＩＩＩノックアウト（すなわち、血友病Ａ）、マウスＴＬＴ－１ノックアウト、ヒトノックインマウスにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）モデルを使用して決定した。抗ＦＶＩＩ（ａ）はマウスＦＶＩＩ（ａ）を認識しないため、ｂｉＡｂを、ヒトＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩ：ＡＴと同時投与して、実施例２８よるそれらの予想される臨床定常状態血漿レベルを模倣する、マウスでのこれらの成分の標的血漿レベル（それぞれ、３．８、２６．２および９．０ｎＭ）を得た。ｂｉＡｂの濃度は、４０または１００ｎＭのいずれかであった。要するに、マウスにイソフルランで麻酔をかけ、加温パッド上に置き、尾部を生理食塩水（３７℃）に浸した状態で、動物の体温を３７℃に保つように設定した。負傷５分前に、右側尾静脈に投与を行った。本ＴＶＴモデル（Ｊｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，２０１６，６２５－３１）では、外側静脈が切断される。１０、２０、または３０分で出血が停止した場合、尾部を生理食塩水から取り出し、かつ傷口を生理食塩水で濡らしたガーゼスワブで穏やかに拭き取った。生理食塩水中のヘモグロビンの量を定量化することにより、総出血量を４０分後に決定した。投与後４０分で、眼窩神経叢から３．８％のクエン酸三ナトリウムで血液試料を採取した。血液を４０００ｇで５分間遠心分離し、血漿を分注し、ｈＩｇＧ（実施例２３を参照）、総ＦＶＩＩ（ａ）抗原（実施例２４を参照）、およびＦＶＩＩａ活性（実施例８を参照）の分析まで、－８０℃で保存した。
表３１に示されるように、ＦＶＩＩａとｂｉＡｂのすべての組み合わせは、ｂｉＡｂ単独またはｂｉＡｂなしで投与されたＦＶＩＩ（ａ）と比較して、失血の有意な減少をもたらした。すべての組み合わせについて、処置の４５分後に測定された血小板数は、ビヒクル群について観察されたものと同等であった。
結論として、これらのデータは、期待される定常状態レベルのＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩ、およびＦＶＩＩ：ＡＴの存在下での ｂｉＡｂ０００１ の有意なインビボ止血効果を示す。
表３１．示すように、ｂｉＡｂ０００１、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩａ、およびＦＶＩＩａ：ＡＴの組み合わせを投与されたＦＶＩＩＩノックアウト／マウスＴＬＴ－１ノックアウト／ヒトＴＬＴ－１ノックインマウスにおける尾静脈切断（ＴＶＴ）後の失血。投与用量、予想および測定された血漿濃度、ならびに決定された失血は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として示される。 一元配置分散分析、それに続くダネットの多重比較検定を使用して、群３～５の失血は、群１および２と有意差があることが分かった。総ＦＶＩＩ（ａ）抗原濃度（実施例２３に従って測定）は、「ＦＶＩＩ」と標識された行に列挙され、値はアスタリスクで示されている。
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
実施例３２：競合ＥＬＩＳＡでの ＴＬＴ－１への結合について抗ＴＬＴ－１ ｍＡｂ１０７６と競合する抗体の特定
競合実験に使用されるＦａｂ断片（抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂ）は ｍＡｂ１０７６（それぞれ配列番号９３８および９３４）に相当するＶＨおよびＶＬドメイン配列、ヒト ＩｇＧ４ ＣＨ１ ドメイン、および単一点変異（Ｇ１５７Ｃ）を有するヒトカッパＣＬを含む。ＧからＣへの置換は、Ｆａｂ断片の定常ドメイン内、すなわち抗原結合部位からは遠く、ＴＬＴ－１への結合に影響を与えない（実施例２０を参照されたい）。組み換え体は、ＷＯ２０１１／０２３７８５に記載されるようにＴＬＴ－１として生産される。抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂは、製造元の指示に従うビオチン化キット（ＥＺ－ｌｉｎｋ、Ｔｈｅｒｍｏ）の適用を含む標準的な方法を使用してビオチン化される。
抗ＴＬＴ－１抗体が、抗ＴＬＴ－１Ｆａｂおよびそれに由来する抗体と競合するかどうかを決定するために、ＴＬＴ－１への結合に対する競合研究が行われた。組み換えＴＬＴ－１は、希釈緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中、４℃で一晩、ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定される。プレートを、洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．２）中で１５分間洗浄し、ブロッキングする。 競合研究では、最終固定濃度でのビオチン化 抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂを、一連の抗ＴＬＴ－１抗体の希釈液と組み合わせて、希釈緩衝液で０から最大１００ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を得る。混合物をプレートのウェルに加え、１時間インキュベートする。次いでプレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン－ＨＲＰＯ（希釈緩衝液中１：２０００、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ）を添加し、１時間インキュベートする。最後に、プレートを洗浄し、ＴＭＢ ＯＮＥ（ＫＥＭＥＮＴＥＣ）で１０分間発色させる。反応を、Ｈ３ＰＯ４（４Ｍ）を添加することによって停止し、プレートを、６２０ｎｍで測定されたバックグラウンドシグナルを減算して、４５０ｎｍでＦＬＵＯＳｔａｒオプティマプレートリーダーで読み取られる。別段の指定がない限り、すべてのインキュベーションは室温で行われ、プレートは洗浄緩衝液を使用して５回洗浄される。
競合研究のために競合抗体と混合されるビオチン化 抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂの固定濃度と同様に、ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに固定される組み換えＴＬＴ－１の濃度は、競合抗体による競合の検出（すなわち、シグナルの減少）を可能にするのに十分なシグナルを与えることを目的として、２つの成分の個々のタイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって決定される。固定化のためのＴＬＴ－１の濃度は通常、１２５ｎｇ／ｍｌなど、０～１ｍｇ／ｍｌの範囲内である。ビオチン化抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂの濃度は通常、１０ｎｇ／ｍｌなどの０～１ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
測定されたシグナル（ＯＤ単位）から、任意の所与の抗体濃度での競合は、
阻害率＝（１－（ＯＤ単位－１００％阻害）／（０％阻害－１００％阻害））＊１００
式中、０％阻害は、競合する ａ抗ＴＬＴ－１抗体を有さないウェルのシグナルから決定され、１００％阻害は、ビオチン化抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂを有さないウェルからのシグナルとして決定される（すなわち、前記アッセイバックグラウンドに対応する）。抗体の濃度が、ビオチン化 抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂの最大１００００倍過剰で試験されるときに、少なくとも５０％の観察された阻害（阻害％）がある場合、抗体は ＴＬＴ－１への結合について 抗ＴＬＴ－１ Ｆａｂと競合すると考えられる。

Claims (6)

  1. 二重特異性抗体であって、
    （ｉ）第ＶＩＩ（ａ）因子（ＦＶＩＩ（ａ））に結合することができる第１の抗原結合部位と、
    （ｉｉ）ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ－１）に結合することができる第２の抗原結合部位と、
    を含む、二重特異性抗体であって、
    前記第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインであって、
    配列番号８４７により表されるＣＤＲＬ１、
    配列番号８４８により表されるＣＤＲＬ２、および
    配列番号８４９により表されるＣＤＲＬ３
    を含む軽鎖可変ドメインと、
    配列番号８５０によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインであって、
    配列番号８５１により表されるＣＤＲＨ１、
    配列番号８５２により表されるＣＤＲＨ２、および
    配列番号８５３により表されるＣＤＲＨ３
    を含む重鎖可変ドメインとを含み、
    前記第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインであって、
    配列番号８５５により表されるＣＤＲＬ１、
    配列番号８５６により表されるＣＤＲＬ２、および
    配列番号８５７により表されるＣＤＲＬ３
    を含む軽鎖可変ドメインと、
    配列番号８５８によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメインであって、
    配列番号８５９により表されるＣＤＲＨ１、
    配列番号８６０により表されるＣＤＲＨ２、および
    配列番号８６１により表されるＣＤＲＨ３
    を含む重鎖可変ドメインとを含む、二重特異性抗体であり、
    （ｉｉｉ）Ｆｃ領域
    を含む、二重特異性抗体。
  2. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメインとを含み、前記第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である重鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記第１の抗原結合部位が、配列番号８４６によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号８５０によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメインとを含み、前記第２の抗原結合部位が、配列番号８５４によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインと、配列番号８５８によって特定されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. （ｉ）前記第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインに結合した、配列番号９４３によって特定されるアミノ酸配列を有する第１の重鎖定常ドメイン、および前記第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインに結合した、配列番号９４２によって特定されるアミノ酸配列を有する第２の重鎖定常ドメイン、ならびに
    （ｉｉ）それぞれ配列番号１２によって特定されるアミノ酸配列を有する第１および第２の軽鎖定常ドメインであって、前記第１の軽鎖定常ドメインが、前記第１の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインに結合し、前記第２の軽鎖定常ドメインが、前記第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインに結合している、第１および第２の軽鎖定常ドメイン
    を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  5. 請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬製剤。
  6. 凝固異常の治療に使用するための請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、または請求項５に記載の医薬製剤であって、前記凝固異常が、インヒビター保有もしくは非保有血友病Ａ；インヒビター保有もしくは非保有血友病Ｂ；ＦＶＩＩ（ａ）欠損症；およびグランツマン血小板無力症からなる群から選択される、二重特異性抗体、または医薬製剤。
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