JP7610624B2 - 膜を用いた結合及び溶出クロマトグラフィーのための装置、並びに製造方法 - Google Patents

Description

本出願は、２０２０年６月１０日に出願された米国仮出願第６３／０３７，２６２号の優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

全体的に、本開示は、クロマトグラフィーユニットを対象とし、特に、膜ベースの結合／溶出クロマトグラフィーを含む用途を備えた、膜を介した使い捨て又はシングルユースのクロマトグラフィー装置を対象とする。

適正製造基準と政府規制は、多くのバイオ医薬品製造プロセスの中核である。そのような製造プロセスは、多くの場合、義務付けられており、多くの場合、時間と費用のかかる検証手順を経る必要がある。例えば、バイオ医薬品の分離と精製に使用される機器は、当然のことながら、厳しい清浄度要件を満たさなければならない。単一の機器の場合、１回の洗浄検証に関連して繰り返し発生するコストは、すぐに数千ドルを超える可能性がある。このような洗浄検証のコストと費用を削減するため、及び／又は洗浄が必要又は要求される場合を減らすために、製薬及びバイオテクノロジー業界では、検証済みのモジュール式の使い捨てソリューションをますます模索している。

これらの方針に沿って、生の薬学的に合成された流体（例えば、細胞培養）の産業、実験室、及び臨床ボリュームの一次及び／又は二次清澄化に対する使い捨てソリューションの開発に、最近かなりの関心が寄せられている。このようなプロセスの大量、高スループットの要件は、一般に、高価な、設置済みのステンレス鋼装置（交換可能なカセット又はカートリッジ（例えば、典型的にはレンチキュラーフィルタエレメントのスタックを含む）が、ステンレス鋼ハウジング又は同様のレセプタクル内に設置される）の使用が望ましい。ろ過操作の終了時、及び使用済みのカセット又はカートリッジの除去において、装置は、再度使用する前に、かなりの費用と労力をかけて洗浄し、有効性を確認しなければならない。

バイオ医薬品処理産業で使用するために設計された膜ベースの装置は、通常、すべて熱可塑性部材で構成されている。これは、選択された熱可塑性樹脂（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテルスルホンなど）が化学薬品や環境にさらされても安定しているため、望ましいことである。製造中に二次成形操作を利用するすべての熱可塑性装置のマイナス面の１つは、収縮である。熱可塑性樹脂が冷えると収縮し、膜がゆがみ、膜に望ましくない空隙ができる。

スケールダウンモデルは、ウイルスろ過操作などのろ過操作の検証に使用できる。例えば、汚染をシミュレートするためにサンプルに既知の量のウイルスをスパイクし、その後、スケールダウン装置で除去することができる。装置の性能を測定して、そのウイルス除去能力を確認することができる。

このような装置は通常、熱可塑性樹脂でできており、オーバーモールド工程を使用して製造されている。そこで、熱可塑性樹脂（通常はポリプロピレン）の「窓枠」は、膜又は媒体の長方形片の周囲に射出成形され、次に、接合ステップ（振動、ホットプレートなど）を使用して、サブアセンブリを取り付ける。分離メカニズムがサイズ排除又は電荷ベースのいずれかであるフロースルー用途では、装置が冷却するにつれて収縮する（及び膜又は媒体にしわが寄る）ことによって作成される装置内部の追加の空隙は、装置の性能に悪影響を与えない。ただし、クロマトグラフィー列での捕捉のための結合及び溶出モードの用途では、しわのある膜によって作成される追加の空隙が装置の性能を低下させる。この性能の低下は、破過曲線の鋭さと溶出効率に見られる。

さらに、ウェット又はセミウェット膜を使用する場合でも、装置内で膜の一体型シールを作成することが重要である。

したがって、所望のリガンド（例えば、プロテインＡリガンド）と結合した１つ又は複数の膜を使用して、装置内で平坦で空隙がなく密封された状態を維持する、結合及び溶出クロマトグラフィー装置などのろ過装置を有することが望ましい。

本発明の性質及びこれら及び他の目的をさらに理解するために、添付の図面と併せて考慮される以下の説明を参照する必要がある。

従来技術の問題は、本明細書に開示された、入口と出口を有する一体型クロマトグラフィーユニットに関連し、入口と出口との間のユニットの領域に配置された１つ又は複数の膜を含む実施形態によって解決された。膜の膨潤を可能にするために、膜間に十分な空間が提供される。いくつかの実施形態では、入口を通ってユニットに入る流体は、入口から離間した出口を通ってユニットを出る前に、１つ又は複数の膜を通過する。

様々な実施形態において開示されるのは、流体入口及び前記流体入口から離れた流体出口を有するハウジングと、前記流体入口と前記流体出口との間の領域内の内部容積と、前記ハウジングの前記内部容積内に配置された少なくとも第１及び第２の膜と、前記第１の膜と第２の膜との間に配置された少なくとも１つのスペーサーを含む、クロマトグラフィー装置である。１つ又は複数の膜（及びスペーサー）を通る結果として生じる流路は、例えばバイオ医薬品流体の結合／溶出クロマトグラフィー操作を含むクロマトグラフィー用途のためのユニットの使用を促進する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのスペーサーは、環状の形状（例えば、ワッシャー又はドーナツ形状の部材）である。いくつかの実施形態では、少なくとも第１及び第２の膜の活性膜領域によって画定されるハウジングの内部容積内にろ過ゾーンがあり、環はそのろ過ゾーン内に配置された開放領域を有する。

いくつかの実施形態では、第１の膜は、クロマトグラフィー装置の動作中の流体の流れの方向で第２の膜の上流に配置され、スペーサーは第１の膜と第２の膜との間に配置される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー装置は、流体入口と第１の膜との間に配置された多孔質フリットをさらに備える。いくつかの実施形態では、流体出口と、クロマトグラフィー装置の動作中の流体の流れの方向で、第１の膜の下流に配置された第２の膜との間に配置された多孔質フリットがあってもよい。いくつかの実施形態では、流体入口と第１の膜との間、及び流体出口と第２の膜との間の両方にフリットを配置することができる。

そのようなクロマトグラフィーユニットを製造する方法も開示される。

ハウジングの内部容積内に１つ又は複数のスペーサーを適切に配置し、ハウジング内で１つ又は複数の膜が膨潤又は拡張するための空間を提供することによって、膜の凹凸やしわによる装置性能の低下の問題が最小限に抑えられるか、解決される。

したがって、膜ベースの結合及び溶出クロマトグラフィーユニット又は装置が開示され、膜又は複数の膜は装置内で平坦かつ均一なままであり、空隙を最小限に抑え、それによって装置の活性膜面積を最大化する。

特定の実施形態で開示されるのは入口及び出口を有するろ過装置であり、この装置は、ろ過ゾーンを有するポリマーフレームワークと、ろ過ゾーンにおいて前記ポリマーフレームワークに結合又は接着された１つ又は複数の膜とを含み、装置内の膜を分離する１つ又は複数のスペーサーを備えている。

特定の実施形態では、複数の膜内の各膜は同じであり、例えば、それぞれが同じ化学及び性能の特性又は等級を有する。特定の実施形態では、複数の膜内の各膜は、結果として得られるフィルタユニットの特定の性能特性を得るために、異なる化学的特性又は性能特性が変わる。

いくつかの実施形態で開示されるのは、入口及び出口を有し、少なくとも１つの膜を含む一体型ユニットであり、入口を通ってこの使い捨て一体型ユニットに入る流体は、出口を通ってユニットを出る前に、少なくとも１つの膜を通過する。１つ又は複数のスペーサーが一体型ユニット内に、好ましくはワッシャー又は環の形態で配置され、ユニット内の１つ又は複数の膜の拡張領域を提供する。このユニットは、高速サイクリングによる清澄化細胞培養物からのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産性の高いクロマトグラフィー捕捉に適している。従来のプロテインＡレジンよりもはるかに高い流速で操作できる。

特定の実施形態によるろ過装置の断面図である。 特定の実施形態によるスペーサーの斜視図である。 別の実施形態によるろ過装置の断面図である。 特定の実施形態による１ｍＬ装置の圧力流量関係の例示的なグラフである。 特定の実施形態による、注入弁と検出器との間に示されたシステムホールドアップボリュームを含む、システム構成の概略図である。 特定の実施形態に従ってシステムホールドアップボリュームを測定するために使用される２％アセトンパルスのＵＶ２８０を示す例示的なクロマトグラフである。 特定の実施形態による、１ｍＬ装置の２８０ｎｍでの正規化された吸光度を示す例示的な破過クロマトグラフである。

添付の図面を参照することにより、本明細書に開示される構成要素、プロセス、及び装置をより完全に理解することができる。これらの図は、便宜上及び本開示の説明の容易さに基づいた単なる概略図であり、したがって、例示的な実施形態の範囲を定義又は限定することを意図するものではない。

以下の説明では明確にするために特定の用語が使用されているが、これらの用語は、図面で説明するために選択された実施形態の特定の構造のみを指すことを意図しており、開示の範囲を定義又は制限することを意図していない。以下の図面及び以下の説明において、同様の番号指定は同様の機能の構成要素を指すことが理解されるべきである。

単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用されるように、様々な装置及び部品は、他の構成要素を「含む」ものとして説明される場合がある。本明細書で使用される用語「含む」、「備える」、「有する」、「できる」、「含有する」、及びそれらの変形は、追加の構成要素の可能性を排除しない、制限のない移行句、用語、又は単語であることを意図している。

従来、スケールダウンろ過装置は、単一工程の成形操作で製造されてきた。１つ又は複数の膜層が２つのプラスチック部材（及び入口と出口）の間に積み重ねられ、部材と膜が一緒に機械的に圧縮される熱可塑性金型に配置され、そして、溶融熱可塑性物質が周囲に射出され、上部のプラスチック部材から下部のプラスチック部材までのシールが作成される。接触又はホットプレート溶接操作を使用できる。膜又は膜と装置との間に一体型シールが形成され、装置ハウジング全体が溶接される。各膜の下に配置された膜スクリーンを装置に含めることができる。適切なスクリーンには、ポリプロピレン、ポリエチレン、及びナイロン製のスクリーンが含まれる。１つの適切なスクリーンは、ＤｅｌＳｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＮａｌｔｅｘ押出網（厚さ０．０１０インチ、ストランド数（イン）１３．５ＳＰＩ、ストランド数（アウト）１３．５ＳＰＩ、スタンド角度６０度、坪量５．５０オンス／１０フィート）である。スクリーンで膜を分離すると、溶出圧力が低下し、ばらつきが減少する。いくつかの実施形態では、スペーサー２２のうちの１つ又は複数は、圧入や接着剤による結合などにより、スペーサー２２の内径内に配置された膜スクリーン２５を有することができる（図３）。

しかしながら、膜は典型的には、最適な機能を達成するために膨潤（例えば、典型的には５～３０％の膨潤）を必要とする多孔性ヒドロゲルである。この膨潤により、動的結合能力が低下し、圧力損失性能が高くなる可能性がある。本明細書に開示される実施形態は、膨潤に適応し、装置の性能を改善する。

次に図１を参照すると、流体入口１３と、入口１３から離れた流体出口１４とを有するハウジング１２を含むろ過ユニット１０が示されている。流体入口１３及び流体出口１４は、チューブなどへの便利な接続のために適切なルアーコネクタを含むことができる。ハウジングは、流体不浸透性の壁によって画定される。流体入口１３及び／又は流体出口１４におけるハウジング１２の内面は、ハウジング内の流体分布を高めるために格子状表面８を有してもよい（図１では流体出口１３でのみ示される）。格子状表面８は、ハウジングと一体であってもよいし、ハウジングに接合された別個の部品であってもよい。

図示の実施形態では、ユニット１０内に配置された複数の膜１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ及び１５ｅがある。この実施形態では５つの膜が示されているが、当業者は、より少ない又はより多くの膜を使用できることを理解できる。膜１５ａは、上流膜として配置される。膜１５ｂは、入口１３から出口１４への流体の流れの方向において、膜１５ａの下流に配置される。膜１５ｃは、入口１３から出口１４への流体の流れの方向において、膜１５ｂの下流に配置される。膜１５ｄは、入口１３から出口１４への流体の流れの方向において、膜１５ｃの下流に配置される。そして、膜１５ｅは、入口１３から出口１４への流体の流れの方向において、膜１５ｄの下流に配置される。好ましくは、膜１５はそれぞれ、オーバーモールドプロセスなどによって、ハウジング１２の流体不浸透性壁の表面にシールされる。オーバーモールド材料は、ハウジングの材料と同じ、例えばポリエチレンであってもよい。このように、ハウジングの上部と下部、膜、任意選択のスクリーンとワッシャーを成形機に配置して、成形機はこのスタックを圧縮し、例えば周囲に溶融ポリプロピレンを射出して、上部、下部、膜／スクリーン／ワッシャースタックを一緒に溶接する。組み立てられると、各膜１５は、活性領域、すなわちサンプルの流れに利用できる膜の領域、及び膜の不活性領域、すなわちハウジングに密閉され、したがってサンプルフローには使用できない領域（通常は膜の周囲）を有する。いくつかの実施形態では、流体入口１３と最も上流に配置された膜（図１の実施形態では膜１５ａ）との間に、及び／又は、流体出口１４と最も下流に配置された膜（図１の実施形態では膜１５ｅ）との間に、多孔質フリット１７を任意に配置することができる。いくつかの実施形態では、多孔質フリット１７は、図３に示すように、ユニットの流体入口１３及び／又は流体出口１４に配置することができる。すなわち、フリット１７は、図１の実施形態のようにユニットのハウジングにオーバーモールドされるのではなく、流体入口１３及び／又は流体出口１４の内径内に圧入されてもよい。したがって、図３に示されるように入口又は出口に配置されるフリットの外径は、図１に示されるように配置されるフリットの外径よりも小さい。適切なフリット材料には、ポリオレフィン、特にポリエチレンが含まれる。適切なフリットの厚さは、約０．０３インチから約０．０６インチの範囲であり得る。フリットの厚さは均一であることが好ましい。

適切な膜には、結合／溶出クロマトグラフィーに適しており、プロテインＡリガンドなどのリガンドが付着した膜が含まれる。特定の実施形態では、膜１５は、多孔性ヒドロゲルなどの乾燥不可能な湿潤膜であってもよい。適切な膜には、米国特許第７，３１６，９１９号、第８，２０６，９５８号、第８，３８３，７８２号、第８，３６７，８０９号、第８，２０６，９８２号、第８，６５２，８４９号、第８，２１１，６８２号、第８，１９２，９７１号、第８，１８７，８８０号に開示されるものが含まれ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。そのような膜は、支持部材を通って延びる複数の細孔を有する支持部材と、支持部材の細孔内に位置し、支持部材の細孔を本質的に満たすマクロポーラス架橋ゲルを含む複合材料を備える。いくつかの実施形態では、使用されるマクロポーラスゲルは、環境条件に応答性であり、応答性複合材料を提供する。他の実施形態では、微孔性ゲルは、微生物又は細胞の化学合成を促進するか、又は成長をサポートするのに役立つ。

特定の実施形態では、１つ又は複数の膜１５は、好ましくは熱可塑性物質などのポリマー材料で作製されたハウジング１２に接着され、シールされる。適切な熱可塑性物質には、ポリプロピレン及びポリエチレンなどのポリオレフィン、それらのブレンド、及びポリエーテルスルホンが含まれる。ハウジング１２内の膜１５の配置及びシールは、好ましくは、装置１０の流体入口１３に入るすべての流体が、装置１０の流体出口１４に到達する前に、１つ又は複数の膜１５の活性領域を通過するような配置及びシールでなければならない。

様々な実施形態において、膜１５のうちの１つ以上の間に配置されるのは、スペーサー又はワッシャー２０である（図２）。いくつかの実施形態では、スペーサー又はワッシャー２０は、フレーム２２又は周囲によって画定され、これは、環状周囲であってもよく、連続的又は不連続的であってもよい。５つの膜１５がある図１の実施形態では、４つのワッシャー２０があってもよい。したがって、ワッシャー２０ａは、膜１５ａと１５ｂとの間に配置される。ワッシャー２０ｂは、膜１５ｂと１５ｃとの間に配置される。ワッシャー２０ｃは、膜１５ｃと１５ｄとの間に配置される。そして、ワッシャー２０ｄは、膜１５ｄと１５ｅとの間に配置される。ワッシャー２０は、膜１５の各々がしわや反りを最小限又はゼロに抑えてハウジング内で膨潤又は膨張するのに十分なスペースを提供するのに適した厚さである。適切なワッシャーの厚さには、０．０１０インチ、０．０１５インチ、０．０２０インチ、及び０．０３０インチが含まれる。１つ又は複数の膜１５の所望の拡張空間に応じて、他の厚さのワッシャー２０を使用することができる。特定の実施形態では、ワッシャー２０の外径は、膜１５の外径と同じ又は実質的に同じである。特定の実施形態では、ワッシャー２０の外径は、ハウジング１２への取り付け及びシールを可能にするのに十分である。

装置１０内に複数のワッシャーがある特定の実施形態では、ワッシャー２０の各々は同じ寸法を有する。特定の実施形態では、各ワッシャー２０は、組み立てられた状態にあるときに膜１５の活性膜領域と流体連通する開放領域２１を有する。好ましくは、各ワッシャーの開放領域２１は、装置１０のろ過ゾーンに配置され、ろ過ゾーンは、活性膜領域を含むハウジング１２の内部容積内の領域（すなわち、ハウジング１２内のろ過に利用できる膜の面積）である。したがって、ワッシャー２０は、装置１０内及び装置１０を通る流体の流れ又はろ過を妨げない。特定の実施形態では、開放領域２１は、膜１５の活性領域と整列する。各ワッシャー２０の周囲又はフレーム２２は、非多孔性であり、ハウジング１２の内壁へのシールに利用可能であり得る。ワッシャー２０に適した材料には、ポリエステル、ポリプロピレン及びポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン及びポリスルホンが含まれる。

この装置は、比較的低コストで実装することができる。装置１０は、再利用可能であるか、又は「シングルユース」アイテムとして製造することができる。すなわち、「シングルユース」とは、目的の（又は所定の）操作の完了時に、装置は、廃棄するか（例えば、特定の環境規制物質をフィルタリングした後、法律で要求される場合）、部分的又は完全に再生又はリサイクルすることができる（例えば、非規制物質をフィルタリングした後）ことを意味する。装置内に１つ又は複数のワッシャーが存在することで、ばらつき（すなわち、１０％ブレークスルーでの溶出圧力対動的結合ボリューム、及び溶出量対溶出遅延を測定する際のデータ拡散の減少）がなくなる。

１ｍＬの膜を含むプロテインＡ膜装置の接続
フラクションコレクターを備えた適切なサイズのクロマトグラフィーシステム（例：ＡＫＴＡ（商標）Ａｖａｎｔ２５又はＡＫＴＡ（商標）Ｐｕｒｅ２５）は、２８０ｎｍ（ＵＶ２８０）でのＵＶ吸光度、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで、１０ｍＬ／分の流速で平衡化バッファーでプライミングされる。適切なチューブが装置の入口と出口に取り付けられ、入口チューブを出口チューブに接続するためにゼロボリュームルアーコネクタが使用される。ＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達したら、チューブを１０ｍＬ／分ユニットの流速で平衡化バッファーで洗い流す。流れを停止し、ゼロボリュームルアーコネクタを取り外した。出口は、装置への空気の導入を回避しながら、ルアーフィッティングで出口チューブに接続される。平衡化バッファーを流速１ｍＬ／分で逆方向に流して（出口→入口）、気泡を除去し、入口をルアーフィッティングを介して入口チューブに接続する。

装置は、出口が上になるように配置され、出口キャップを取り外した。出口は、装置への空気の導入を回避しながら、ルアーフィッティングで出口チューブに接続される。平衡化バッファーを流速１ｍＬ／分で逆方向に流して（出口→入口）、気泡を除去し、入口をルアーフィッティングを介して入口チューブに接続する。平衡化バッファーを、１ｍＬ／分の流速で装置を通って逆方向に導入する。流速を１０ｍＬ／分まで徐々に上げ、圧力低下（ＤｅｌｔａＣ圧力）を装置全体で監視する。圧力が安定するまで、流量を１０ｍＬ／分で流す。圧力降下（ＤｅｌｔａＣ圧力）は１００ｐｓｉを超えてはならない。

５０ＭＶの平衡化バッファーを１０ｍＬ／分の流速で装置を通して順方向に流す。このフローは、ＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで続けられる。

圧力流量特性評価
目標圧力降下
好ましくは、流速は、２バールの操作デルタカラム圧力に到達するように調整される。観測された圧力は、選択したバッファー液によって異なる。最適な流量を特定するために、７、８、９、及び１０ＭＶ／分の流量でブランクランを実行できる。ブランクラン中、ｍＡｂ溶液は装置にロードされない。残りの手順は同じである。

ブランクラン方法
１．すべてのバッファーは、システムポンプＡ又はシステムポンプＢのいずれかを介して接続される。平衡化バッファーは、ＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで、カラムバイパスを介して１０ｍＬ／分で流される。ＵＶ２８０シグナルはゼロに設定される。
２．目標流量が選択される（７、８、９、又は１０ＭＶ／分）。
３．動作流量を調査する次の手順は、以下の表１にも示されている。
ａ．ステップＰ１：１０ｍＬのポンプを使用して洗浄し、平衡化バッファーをプライミングする。装置は、目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで平衡化される
ｂ．ステップＰ２：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、高塩バッファーをプライミングする。装置は、目標流量で１０ＭＶの高塩バッファーで洗浄される
ｃ．ステップＰ３：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。装置は、目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで洗浄される
ｄ．ステップＰ４：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、溶出バッファーをプライミングする。装置には、目標流量で１５ＭＶの溶出バッファーが流れる
ｅ．ステップＰ５：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、ＣＩＰ溶液をプライミングする。装置は、目標流量で１０ＭＶのＣＩＰ溶液で洗浄される。
ｆ．ステップＰ６：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。装置は、１０ＭＶの目標流量で、又はＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで、平衡化バッファーで平衡化される。
４．ステップＤ１～Ｄ６は、７～１０ＭＶ／分の範囲の残りの流量で、必要に応じて繰り返される。
５．高速サイクリング研究の同じセッションで装置を使用しない場合は、クロマトグラフィーシステムから装置を取り外し、入口／出口キャップを取り付け直して、冷蔵庫に保管する。
６．適切な操作流量を決定する手順については、次のセクションで説明する。

流量測定
流量を最適化するために、各流量の最大作動圧力が最初に決定される。これは典型的にはＣＩＰ中に起こり、図４に示されるものと同様の圧力－流量曲線をもたらす。

最適化された流量は、次の式に示すように、線形補間によって決定できる：
式中、Ｑ_opは決定された動作流量、Ｐ_opは２バールの目標動作デルタカラム圧力降下である。Ｐ₁とＰ₂は観測された２つの圧力で、２バールに最も近いものであり、Ｑ₁とＱ₂は対応する流量である。

その後の実験は、前述の流量で実行することが推奨される。

システムホールドアップボリューム
システムホールドアップボリュームの説明
システムホールドアップボリュームは、注入弁と検出器の間のボリュームである（図５）。これは、装置を平衡化バッファーで平衡化してから、トレーサー溶液パルス（２％アセトン、高塩溶液）を注入することによって決定できる。観測されたピークの保持ボリュームがシステムホールドアップボリュームである。

システムホールドアップボリュームの測定
１．平衡化バッファーを目標流量で装置に流し、ＵＶ２８０又は導電率検出器をモニターしてベースラインシグナルを確立する。
２．トレーサー溶液を１００μＬのサンプルループにロードする。
３．平衡化バッファーを目標流量で流し続けながら、トレーサー溶液を注入する。時間／ボリュームは、この注入イベントでゼロに設定する。
４．ピークが分割されているか、ひどく歪んでいる場合は、装置が完全ではない可能性があり、評価を中止する必要がある。
５．観測されたピーク最大ボリュームは、システムホールドアップボリュームである。１ｍＬ装置を用いたシステムホールドアップボリュームの測定中に生成されたクロマトグラムの例を図６に示す。
６．システムホールドアップボリュームは通常２～６ｍＬである。装置とクロマトグラフィーシステムは、それぞれ１～３ｍＬを提供する。測定されたシステムホールドアップボリュームが顕著に大きい場合、クロマトグラフィーシステムホールドアップボリュームは、装置をゼロボリュームコネクタに交換することによって単独で測定できる。

動的結合容量
動的結合容量フィードの調製
好ましくは、動的結合容量は、前精製されたｍＡｂ溶液を使用して決定される。その後、ＵＶ２８０シグナルをモニタリングすることで、ｍＡｂのブレークスルーを観察できる。精製されたｍＡｂ溶液は、高速サイクリング研究に使用されるｍＡｂフィードと同様の濃度、ｐＨ、及び導電率を持っている必要がある。ブレークスルー動作を完全に観察するには、装置に約５０ｇ／Ｌをロードする必要がある。

精製されたｍＡｂ溶液が利用できない場合は、浄化されたｍＡｂフィードを使用して動的結合容量を決定することもできる。清澄化細胞培養物を使用する場合、ＵＶ検出器は２８０ｎｍで飽和するため、この場合は３００ｎｍなどのより長い波長を使用する必要がある。あるいは、Ｓｗｉｎｎｅｎらによって記述された手順を使用して、より高い精度を達成できる。ここで、ｍＡｂブレークスルーボリューム画分が収集され、対応するｍＡｂ濃度が分析的プロテインＡクロマトグラフィーによってオフラインで測定される（J.Chromatograph.B,848(2007)97-107）。

動的結合容量法
１．動的結合容量測定用にバッファーとｍＡｂフィードを準備する。表１は、装置の１回の動的結合容量測定のために準備するバッファーのおおよその量を示す。
２．ｍＡｂフィードをサンプルポンプを介して接続し、すべてのバッファーをシステムポンプＡ又はシステムポンプＢを介して接続する。
３．ＵＶ２８０／ＵＶ３００、ｐＨ、及び導電率検出が一定の値に達するまで、平衡化バッファーをカラムバイパスに１０ｍＬ／分で流す。ＵＶ２８０／ＵＶ３００信号をゼロに設定する。
４．ＵＶ２８０／ＵＶ３００シグナルが安定した値に達するまで、ｍＡｂフィードを１ｍＬ／分でカラムバイパスに流す。この値は１００％のブレークスルー値として記録し、次のセクションでＤＢＣ₁₀を計算するために使用される。
５．ＵＶ２８０／ＵＶ３００、ｐＨ、及び導電率検出が一定の値に達するまで、平衡化バッファーをカラムバイパスに１０ｍＬ／分で流す。ＵＶ２８０／３００信号はゼロに戻るはずである。
６．動的結合容量を測定するための次の手順も、表３に示される。
ａ．ステップＤ１：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで装置を平衡化する
ｂ．ステップＤ２：１ｍＬ装置に５０ｍｇのｍＡｂフィードを目標流量でロードする。
ｃ．ステップＤ３：装置を目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで洗浄する
ｄ．ステップＤ４：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、高塩バッファーをプライミングする。目標流量で１０ＭＶの高塩バッファーで装置を洗浄する
ｅ．ステップＤ５：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで装置を洗浄する
ｆ．ステップＤ６：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、溶出をプライミングする。目標流量で１５ＭＶの溶出バッファーを使用して、装置からｍＡｂを溶出する
ｇ．ステップＤ７：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、ＣＩＰ溶液をプライミングする。目標流量の流量で１０ＭＶのＣＩＰ溶液で装置を洗浄する
ｈ．ステップＤ８：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。装置は、１０ＭＶの目標流量で、又はＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで、平衡化バッファーで平衡化される。
７．高速サイクリング研究の同じセッションで装置を使用しない場合は、クロマトグラフィーシステムから装置を取り外し、入口／出口キャップを取り付け、冷蔵庫に保管する。
８．ＤＢＣ₁₀値は、次のセクションで説明するように、ＵＶ２８０シグナルのクロマトグラムを分析することによって計算される。

ＤＢＣ ₁₀ の計算
１．ＵＶシグナルを、「動的結合容量法」セクションのステップ４で測定した１００％破過値で割ることによって正規化する（図７）。
２．破過曲線上のＵＶシグナルが１０％の値に達するローディングボリュームを特定する。
３．１０％ブレークスルーでの動的結合容量を次の式に従って計算する：
式中、ＤＢＣ₁₀は１０％ブレークスルーでの動的結合容量であり、Ｖ_10%BTはＵＶシグナルが１０％に達したときのバッファーの容量であり、Ｖ_HUはシステムホールドアップボリューム、Ｃ_feedはｍＡｂフィードの濃度であり、Ｖ_membraneは装置内の膜の容量である。
４．例えば、１０％ブレークスルーが１２．５ｍＬ、システムホールドアップボリュームが２．４７ｍＬ、ｍＡｂフィード力価が３ｇ／Ｌ、膜ボリュームが１ｍＬの場合、ＤＢＣ₁₀は３０．１ｇ／Ｌになる。［００５９］高速サイクリング研究。

研究の時間長さ
好ましくは、装置は１００サイクル評価される。単一の結合／溶出サイクルは、通常、ローディング密度、フィード濃度、動作流量、及びＬＣ装置のポンプ洗浄に必要な時間に応じて、８～１５分を必要とする。したがって、１００サイクルを完了するには１３～２５時間が必要である。

必要なｍＡｂフィードの容量の計算
高速サイクリング研究に必要なフィードの容量は、次の式で計算される：
式中、Ｖ_feedは必要なフィードの容量であり、Ｖ_membraneは装置内の膜の容量であり、ＬＤはローディング密度であり、Ｃ_feedはｍＡｂフィードの濃度であり、Ｎ_cyclesはサイクル数である。

ローディング密度は、次の式に従って計算されることに留意されたい：

例えば、装置のＤＢＣ₁₀が３０．１ｇ／Ｌであることが判明した場合、装置の負荷は３０．１ｇ／Ｌ×８０％、すなわち２４．０８ｇ／Ｌになる。１ｇ／Ｌのフィード濃度では、サイクルごとに２４．０８ｍＬをロードする必要があり、１００サイクルには２，４０８ｍＬが必要である。システムをプライミングし、フィード容器が完全に空にならないように、追加の量のフィードを準備する必要があることに留意されたい。

高速サイクリング法
１．高速サイクリング研究用のｍＡｂフィードとバッファーを準備する。上記の表１は、１ｍＬ装置を使用した１００サイクルの実験用に準備する必要があるバッファーの量を示している。
２．好ましくは、ｍＡｂフィードは、サイクリング研究全体を通して１０℃未満に保たれる。
３．ｍＡｂフィードはサンプルポンプを介して接続され、すべてのバッファーはシステムポンプＡ又はシステムポンプＢを介して接続される。
４．１回の結合／溶出サイクルについては、次の手順で説明し、表４に示す。サイクリングプロセスは、クロマトグラフィーシステムソフトウェアで自動化する必要がある。例えば、ＡＫＴＡシステムでは、これは実験を設定するときに、「メソッドエディター」の「スカウティング」機能を使用するか、「メソッドキュー」を使用してメソッドを構築することによって行われる。
ａ．ステップＲ１：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。目標流量で２０ＭＶの平衡化バッファーで装置を平衡化する。
ｂ．ステップＲ２：上記で計算されたローディング密度（８０％×ＤＢＣ₁₀）まで、装置にｍＡｂで浄化された細胞培養物をローディングする。最初のサイクルを開始する前に、フィードを注入弁にプライミングする必要がある。その後のサイクルは、プライミングを必要としない。
ｃ．ステップＲ３：装置を、目標流速の流速で１０ＭＶの平衡化バッファーで洗浄する。
ｄ．ステップＲ４：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、高塩バッファーをプライミングする。装置を、目標流量で１０ＭＶの高塩バッファーで洗浄する。
ｅ．ステップＲ５：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、平衡化バッファーをプライミングする。装置を、目標流量で１０ＭＶの平衡化バッファーで洗浄する。
ｆ．ステップＲ６：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、溶出バッファーをプライミングする。ｍＡｂは、目標流量で１５ＭＶの溶出バッファーで装置から溶出される。好ましくは、ＵＶ₂₈₀溶出ピークが１００ｍＡＵを超える場合、１０サイクルごとに溶出液を１５ｍＬチューブに収集する。１００ｍＡＵ値は、特定のフィードに合わせて調整する必要がある場合がある。
ｇ．ステップＲ７：１０ｍＬのポンプ洗浄液を使用して、ＣＩＰ溶液をプライミングする。装置を、目標流量で１０ＭＶのＣＩＰ溶液で洗浄する。
５．１００サイクルの完了後、装置は３５ＭＶの平衡化バッファーで、目標流量で、又はＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出が一定の値に達するまで、平衡化される。
６．１回のセッションで完全な１００サイクルを完了できない場合は、ＵＶ２８０、ｐＨ、圧力、及び導電率検出器が一定の値に達するまで、装置を平衡化バッファーでフラッシュする。装置をクロマトグラフィーシステムから取り外し、入口／出口キャップを再び取り付け、冷蔵庫に保管する。

Claims (9)

1. クロマトグラフィー装置であって、
   流体入口及び前記入口から離れた流体出口を有するハウジングと、
   前記ハウジング内の内部容積と；
   前記流体入口と前記流体出口との間の領域において前記ハウジングの前記内部容積に配置された少なくとも第１及び第２の膜であって、前記流体入口に導入された流体が流れる活性膜領域をそれぞれ有する第１及び第２の膜と、
   前記第１の膜と前記第２の膜との間に配置された少なくとも１つのスペーサーであって、前記装置内及び前記装置を通る流体の流れを妨げない、前記活性膜領域と流体連通する連続的な開口部を画定する周囲を有する少なくとも１つのスペーサーと
   を含み、
   前記第１の膜と前記第２の膜との間において、流体は前記第１の膜から前記第２の膜へのみ流れるように構成される、クロマトグラフィー装置。
2. 前記少なくとも１つのスペーサーは環状の形状である、請求項１に記載のクロマトグラフィー装置。
3. 前記少なくとも第１及び第２の膜の前記活性膜領域によって画定される前記内部容積内にろ過ゾーンがあり、前記少なくとも１つのスペーサーの前記開口部は、前記ろ過ゾーン内に配置される、請求項２に記載のクロマトグラフィー装置。
4. 前記第１の膜は、前記クロマトグラフィー装置の動作中の流体の流れの方向において、前記第２の膜の上流に配置され、前記クロマトグラフィー装置は、前記流体入口と前記第１の膜との間に配置された多孔質フリットをさらに含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー装置。
5. さらに前記流体出口と前記第２の膜との間に配置された多孔質フリットを含む、請求項３に記載のクロマトグラフィー装置。
6. 前記少なくとも第１及び第２の膜ならびに前記少なくとも１つのスペーサーは、前記装置の作動中、流体が前記流体入口に入り、前記流体出口を通って前記ハウジングを出る前に、前記第１の膜、前記少なくとも１つのスペーサー、及び前記第２の膜を連続的に通過するように、前記ハウジング内に配置される、請求項１に記載のクロマトグラフィー装置。
7. さらに、前記流体入口と前記流体出口との間の領域において前記ハウジングの前記内部容積に配置された第３の膜であって、前記流体入口に導入された流体が流れる第３の活性膜領域を有する第３の膜と、
   前記第２の膜と前記第３の膜との間に配置された第２のスペーサーであって、前記装置内及び前記装置を通る流体の流れを妨げない、前記第３の活性膜領域と流体連通する連続的な開口部を画定する周囲を有する第２のスペーサーと
   を含む、請求項１に記載のクロマトグラフィー装置。
8. さらに、前記流体入口と前記流体出口との間の領域において前記ハウジングの前記内部容積に配置された第４の膜であって、前記流体入口に導入された流体が流れる第４の活性膜領域を有する第４の膜と、
   前記第３の膜と前記第４の膜との間に配置された第３のスペーサーであって、前記装置内及び前記装置を通る流体の流れを妨げない、前記第４の活性膜領域と流体連通する連続的な開口部を画定する周囲を有する第３のスペーサーと
   を含む、請求項７に記載のクロマトグラフィー装置。
9. さらに、前記流体入口と前記流体出口との間の領域において前記ハウジングの前記内部容積に配置された第５の膜であって、前記流体入口に導入された流体が流れる第５の活性膜領域を有する第５の膜と、
   前記第４の膜と前記第５の膜との間に配置された第４のスペーサーであって、前記装置内及び前記装置を通る流体の流れを妨げない、前記第５の活性膜領域と流体連通する連続的な開口部を画定する周囲を有する第４のスペーサーと
   を含む、請求項８に記載のクロマトグラフィー装置。

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