JP7616610B2

JP7616610B2 - Ｎｋ細胞の活性化及び増幅のために遺伝的に操作された細胞株、及びその用途

Info

Publication number: JP7616610B2
Application number: JP2022570170A
Authority: JP
Inventors: チョ、ドク; ド、ジュンサン; ミン－チャンファン、ティ; キム、ジンホ
Original assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation; Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation; SNU R&DB Foundation
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2025-01-17
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: US20230203443A1; JP2023526804A; EP4163367A1; CN115461451A; EP4163367A4; JP2024170618A; WO2021251708A1

Description

本出願は２０２０年６月９日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００６９８５４号、及び２０２１年４月８日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００４６１０６号を優先権として主張し、前述の明細書全体は、本出願の参考文献である。

本発明は、ＮＫ細胞の活性化及び増幅のために遺伝的に操作された細胞株、及びその用途に係り、具体的には、該細胞株を利用したＮＫ細胞を増殖する方法、または該細胞株を利用したＮＫ細胞の活性度を測定する方法に関する。

ＮＫ細胞（natural killer cell）とは、先天的免疫に重要な細胞毒性リンパ球の一種類である。該ＮＫ細胞は、ウイルス感染された細胞や癌細胞に反応するが、それら反応は、ＮＫ細胞のさまざまな活性受容体（activating receptor）と抑制受容体（inhibitory receptor）とが、対象細胞が有するそれぞれのリガンドと反応して出すシグナル（signal）によって左右される。一般的に、活性シグナルが抑制シグナルより強ければ、該ＮＫ細胞は、対象細胞を攻撃することができるが、抑制シグナルがさらに強ければ、攻撃することはない。従って、正常細胞は、該ＮＫ細胞の抑制受容体リガンド（ＭＨＣ：major histocompatibility complex）が存在し、抑制シグナルを出すので、該ＮＫ細胞に攻撃されない。

癌細胞のうち一部は、細胞表面に、ＭＨＣの異常が生じ、それが減少してしまう。そのような場合には、ＮＫ細胞の抑制シグナルがなく、該ＮＫ細胞が対象細胞を攻撃することになる。パーフォリン（perforin）を分泌し、感染細胞や癌細胞の細胞膜に孔を作り、そこにグランザイム（granzyme）を出し、その細胞を死滅させる細胞毒性を有する。Ｂ細胞リンパ腫患者、及び多くの癌患者の場合、ＮＫ細胞の数や、抗癌活性に欠陥が発見されており、ＮＫ細胞の機能異常は、そのような癌の発生と密接な関連を有していることが知られている。

従って、そのようなＮＫ細胞の抗癌力を活用した癌患者の治療法が勢いをつけてきているが、その性能の多くのＮＫ細胞を確保するための増幅法の開発が重要である。また、該ＮＫ細胞の機能低下や、異常のある者は、癌や各種疾患と関連性が知られており、ＮＫ細胞の活性度測定法開発が求められている。

従来に報告されたＮＫ細胞の増殖方法は、高価の多様なサイトカインを、高濃度で利用するか、あるいは末梢血液単核球や癌細胞株を共に使用する方法である。ところで、それは、そのコストが必要となるだけではなく、増幅率もあまり高くない実情である。また、多数の研究においては、ＮＫ細胞以外にも、Ｔ細胞のような他のリンパ球の増幅が伴って示され、該ＮＫ細胞基盤の免疫細胞治療に不適であるという面を示したりする。従って、ＮＫ細胞のみを選択的に増幅するための効率的な方法の開発が主な課題の対象になっており、それに係わる研究がなされているが（韓国登録特許１０－１５２５１９９）、まだ不備な実情である。

一方、ＮＫ細胞の活性度検査法において、細胞毒性能（cytotoxicity）検査は、標的癌細胞（Ｋ５６２細胞株）を直接殺害する機能を調べる検査法であり、現在臨床検査室で使用されているいる。最近、複雑な細胞分離過程が必要な末梢血液単核球の代わりに、細胞分離過程が不必要な全血を使用した細胞毒性能検査が紹介されている。ただし、全血を使用する場合には、さまざまな種類のサイトカインが必要であるが、検査コストが増大する問題点が大きくなっており、克服が必要な実情である。

一態様は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８：membrane bound interleukin－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１：membrane bound interleukin－２１）を発現するように遺伝的に操作された細胞株、または培養補助細胞（feeder cell）を提供するものである。

他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団（mixed immune cells）を含む血液試料を得る段階と、前記ＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、を含む、ＮＫ細胞を増殖させる方法を提供するものである。

さらに他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、前記混合されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させてＮＫ細胞を活性化させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、前記活性化されたＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階と、を含む、ＮＫ細胞の活性度を検査する方法を提供するものである。

さらに他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、前記混合されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させてＮＫ細胞を活性化させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、前記活性化されたＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階と、を含む、ＮＫ細胞関連疾患を診断する方法、または診断に係わる情報を提供する方法を提供するものである。

一態様は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作された細胞株を提供する。

前記細胞株は、ＮＫ細胞のみを選択的に増幅させる培養補助細胞としても使用される。一般的に、ＮＫ細胞増殖に使用される代表的な栄養補助細胞であるＫ５６２細胞株は、ＮＫ細胞の増殖のために使用されるだけであるので、該Ｋ５６２細胞株自体が増殖することがあってはならない。従って、ＮＫ細胞と培養する前、前記Ｋ５６２細胞株に強力な放射線（例えば、５０～１００Ｇｙ）の照射を介する前処理を行い、前記Ｋ５６２細胞株自体は全く増殖せず、該ＮＫ細胞の増殖のみの一助となるようにする。一方、該ＮＫ細胞の効率的な増殖のためには、ＩＬ－２、ＩＬ－１５のようなほとんどのサイトカインが、ＮＫ細胞に持続的に露出されなければならない。従って、癌細胞株基盤栄養補助細胞に、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５のようなサイトカインを発現するように遺伝的に操作する場合、放射線の照射などによって前処理した癌細胞株自体が、培養過程において、長期間生存することができないが、ＮＫ細胞の選択的増殖効率が下がるという問題点がある。一実施例においては、Ｋ５６２の存在下において、ＮＫ細胞を、ＩＬ－１８またはＩＬ－２１に短期間露出させた場合、２１日目までは、細胞増幅効果が示されなかったが、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１で同時に露出させた場合、２８日以後、細胞増幅効果が示されることを確認した。従って、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１の場合、培養開始日に、ただ１回の露出、及び短期間露出にもかかわらず、ＮＫ細胞の増殖に効果があるということが分かる。すなわち、一態様による、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１を発現するように遺伝的に操作された培養補助細胞株は、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１の短期間発現にもかかわらず、ＮＫ細胞増殖効率が低下しないが、ＮＫ細胞のみを選択的に増幅させることができる。

本明細書で使用される用語「培養補助細胞（feeder cells）（支持細胞とも言う）」とは、放射線の照射により、分裂増殖する能力はないが、代謝活性があるために、さまざまな代謝物質を生産し、目的ＮＫ細胞の増殖の一助となる細胞を意味しうる。本明細書において使用されうる培養補助細胞としては、遺伝子が導入された動物細胞株であり、ヒト慢性骨髄白血病細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）、ＲＰＭＩ８８６６、ＥＢＶ＿ＬＣＬ、７２１．２２１、ＨＦＷＴ、ＮＫ－９２などでもある。

本明細書において、用語「遺伝的操作（genetic engineering）」または「遺伝的に操作された（genetically engineered）」とは、細胞につき、１以上の遺伝的変形（genetic modification）を導入する行為、またはそれによって作られた細胞を意味する。

詳細には、前記遺伝的に操作された細胞は、前述の遺伝子をコーディングする外因性遺伝子（exogenousgene）を含むものでもありえる。用語「外因性」とは、言及された分子（referenced molecule）、または言及された活性（referenced activity）が、宿主細胞に導入されたことを意味する。分子は、例えば、宿主染色体内への挿入によるようなコーディング核酸（encoding nucleic acid）の宿主遺伝物質内への導入、またはプラスミドのような非染色体遺伝物質としても導入されえる。該コーディング核酸の発現と係わり、前記用語「外因性」とは、前記コーディング核酸が個体内への発現可能な形態で導入されたことを示す。生合成活性と係わり、前記用語「外因性」とは、宿主母細胞に導入された活性を示す。その起源（source）は、例えば、宿主母細胞に導入された後、言及された活性を発現する同質性（homologous）または異質性（heterologous）のコーディング核酸でもありえる。その故、用語「内因性（endogenous）」とは、前記宿主細胞に存在する言及された分子または活性を示す。類似して、コーディング核酸の発現と係わり、前記用語「内因性」とは、個体内に含まれたコーディング核酸の発現を示す。用語「異質性」とは、言及された種以外の他の起源からの分子または活性を示し、用語「同質性」とは、宿主母細胞からの分子または活性を示す。従って、コーディング核酸の外因性発現は、異質性または同質性のコーディング核酸のうちいずれか、一つまたは両方をも利用することができる。

従って、前記細胞は、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１を暗号化する核酸を含むものでもありえる。さらに詳細には、前記細胞は、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１を暗号化する核酸を含むベクターで形質転換されたものでもありえる。

本明細書で使用される用語「ベクター」とは、適切な宿主細胞において、目的タンパク質を発現することができるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された調節要素を含む遺伝子作製物を称する。一実施例によるベクターは、プローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及び／またはエンハンサーのような発現調節要素を含むものでもあり、該ベクターのプローモーターは、構成的または誘導的でもありえる。また、前記ベクターは、宿主細胞内において、安定して前記融合タンパク質を発現させることができる発現用ベクターでもある。前記発現用ベクターは、当業界において、植物、動物または微生物において、外来のタンパク質を発現するのに使用される一般のものを使用することができる。前記組み換えベクターは、当業界に公知された多様な方法を介しても構築される。例えば、前記ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能なベクターである場合、複製起源を含むものでもありえる。また、該ベクターは自家複製するか、宿あるいは主ＤＮＡに導入され、前記ベクターは、プラスミド、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス及びワシニアウイルスからなる群のうちからも選択される。

また、前記ベクターにおいて、前述の融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド配列は、プローモーターに作動可能に連結されていてもよい。本明細書において使用された用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現調節配列（例：プローモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と異なる核酸配列間の機能的な結合を意味し、それにより、前記調節配列は、前述の他の核酸配列の転写及び／または翻訳を調節することになる。

本明細書において「膜結合性インターロイキン」（membrane bound interleukin）とは、細胞膜に結合されたインターロイキンを意味するものであり、細胞外にインターロイキンが分泌するものとは区分される意味でもありえる。ｍｂＩＬ－１８は、配列番号１の核酸配列またはそのアミノ酸配列と、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列相同性を有するものでもありえる。ｍｂＩＬ－２１は、配列番号２の核酸配列またはそのアミノ酸配列と、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列相同性を有するものでもありえる。

他の態様は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作された細胞を含むＮＫ細胞培養用組成物を提供する。

前記遺伝的に操作された細胞の具体的な内容は、前述の通りである。

一実施形態によるｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１を発現するように遺伝的に操作された細胞を含むＮＫ細胞培養用組成物は、ＮＫ細胞（例えば、自然殺害細胞）の増幅及び／または活性化を誘導することができ、ＮＫ細胞の培養、分離または増殖などに有用に使用されうる。

さらに他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、前記混合されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、を含む、ＮＫ細胞を増殖させる方法を提供する。

一実施形態において、前記接触させる段階は、前記遺伝的に操作された細胞と混合されたＮＫ細胞の集団とを共培養し、前記ＮＫ細胞のサブ集団（subpopulation）を刺激、活性化または増幅（expanding）させる段階を含むものでもありえる。

本明細書において用語「ＮＫ細胞の刺激」とは、試験管内または生体内において、自然殺害細胞の活性、例えば、細胞毒性活性を増大させるか、あるいは活性化された自然殺害細胞が生成、増加、増幅または増殖されることを意味しうる。

一実施形態において、前記ＮＫ細胞の非制限的例には、大食細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単核球、樹枝状細胞、好酸球、自然殺害細胞、好塩基球、好中球が含まれる。従って、特定実施形態において、前記ＮＫ細胞は、大食細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球（ＣＤ８＋ＣＴＬ）、肥満細胞、単核球、樹枝状細胞、好酸球、自然殺害細胞、好塩基球または好中球からなる群のうちから選択されたいずれか一つでもある。特定実施形態において、ＮＫ細胞は、自然殺害細胞またはＴリンパ球でもある。前記混合されたＮＫ細胞は、大食細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単核球、樹枝状細胞、好酸球、自然殺害細胞、好塩基球及び好中球からなる群のうちから選択された１以上を含むものでもありえる。

本明細書において、用語「自然殺害細胞」または「ＮＫ細胞」とは、先天性免疫系の主要成分を構成する細胞毒性リンパ球であり、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ：large granular lymphocyte）と定義され、リンパ系前駆細胞（ＣＬＰ：common lymphoid progenitor）生成のＢリンパ球及びＴリンパ球から分化された第３の細胞を構成する。前述の「自然殺害細胞」または「ＮＫ細胞」とは、任意の組織供給源（source）に由来するさらなる変形がない自然殺害細胞を含み、成熟した自然殺害細胞だけではなく、自然殺害前駆細胞を含むものでもありえる。前記自然殺害細胞は、インターフェロンまたは大食細胞由来サイトカインに対する反応によって活性化され、該自然殺害細胞は、「活性化受容体」及び「抑制性受容体」とも標識される、細胞の細胞毒性活性を制御する２種類の表面受容体を含む。該自然殺害細胞は、任意の供給源、例えば、胎盤組織、胎盤灌流液、臍帯血、胎盤血、末梢血、脾臓、肝臓などからの造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆体からも生成される。

一実施形態において、前記自然殺害細胞は、活性化された自然殺害細胞でもある。前記活性化された自然殺害細胞は、母細胞、例えば、造血細胞または自然殺害前駆細胞に比べ、細胞毒性、または自然殺害細胞の本然の免疫調節能が活性化された細胞を意味しうる。

一実施形態において、活性化された自然殺害細胞、または活性化された自然殺害細胞が豊かな（enriched）集団は、１種以上の機能的に関連するマーカー、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ１６１、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＫｐ４６、ＣＤ９４、ＫＩＲ（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１）、及び活性化受容体のＮＫＧ２ファミリー（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ）を検出することによっても評価されえる。

一実施形態において、前記共培養は、サイトカインの存在下において行われえる。

本明細書において使用される用語「サイトカイン」とは、細胞信号伝逹の役割を行うタンパク質（５～２０ｋＤａ）を意味しうる。該サイトカインは、細胞によって放出され、該サイトカインを放出する細胞、及び／または他の細胞の挙動に影響を与える。該サイトカインの非制限的例には、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍懐死因子、モノカイン及びコロニー刺激因子が含まれる。該サイトカインは、免疫細胞、例えば、大食細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞及び単核球、内皮細胞、線維母細胞及び間質細胞を始めとする（しかしながら、それらに制限されるものではない）広範囲な細胞によっても生成される。該サイトカインは、１以上の類型の細胞によっても生成されえる。該サイトカインは、受容体を介して作用し、免疫系において、特に重要であり、体液性免疫反応と細胞系免疫反応との均衡を調節し、細胞集団の成熟、成長及び反応性（responsiveness）を調節する。本明細書のサイトカインは、自然発生サイトカインでもあるか、あるいは自然発生サイトカインの突然変異バージョンでもある。本出願で使用される「自然発生」とは、また野生型とも称され、対立遺伝子変種を含む。該自然発生サイトカインの突然変異されたバージョン、または「突然変異」とは、該サイトカインの機能、活性及び／または特異性を変化させるために、自然発生配列についてなされた特定突然変異を称する。一実施形態において、該突然変異は、サイトカインの機能、活性及び／または特異性を向上させることができる。他の実施形態において、該突然変異は、サイトカインの機能、活性及び／または特異性を低減させうる。該突然変異は、サイトカインの１以上のアミノ酸残基の欠失または付加を含むものでもありえる。

前記サイトカインは、ＢＭＰ（Bone Morphogenetic Protein）ファミリー、ＣＣＬ（chemokine ligands）ファミリー、ＣＭＴＭ（ＣＫＬＦ－like MARVEL transmembrane domain containing member）ファミリー、ＣＸＣＬ（Ｃ－Ｘ－Ｃ motif ligand）ファミリー、ＧＤＦ（Growth/Differentiation Factor）ファミリー、成長ホルモン、ＩＦＮ（interferon）ファミリー、ＩＬ（interleukin）ファミリー、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factors）ファミリー、ＧＰＩ（glycophosphatidylinositol）、ＳＬＵＰＲ－１（secreted Ｌｙ－６／ｕＰＡＲ－related protein１）、ＳＬＵＰＲ－２（secreted Ｌｙ－６／ｕＰＡＲ－related protein ２）、及びそれらの組み合わせによって構成された群れから選択されるいずれか一つでもありえる。

一実施形態において、前記サイトカインは、インターロイキン、またはその突然変異である。多数のインターロイキンは、補助ＣＤ４Ｔリンパ球だけではなく、単核球、大食細胞及び内皮細胞によって合成される。該インターロイキンは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球、並びに造血細胞の発達及び分化を促進させることができる。該インターロイキンの非制限的例には、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６が含まれる。それにより、特定実施形態において、前記サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６の野生型及び突然変異形態を始めとする（しかしながら、それらに制限されるのではない）インターロイキン、またはその突然変異である。

他の実施形態において、前記共培養に添加されるサイトカインは、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１でもある。さらに詳細には、前記共培養は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の存在下で培養しながら、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１を培養培地に添加することを含むものでもありえる。前記ＩＬ－２１は、１ないし２０ｎｇ／ｍｌ、１ないし１５ｎｇ／ｍｌ、１ないし１０ｎｇ／ｍｌ、または２ないし８ｎｇ／ｍｌの濃度でもっても使用される。前記ＩＬ－１８は、１０ないし２００ｎｇ／ｍｌ、１０ないし１８０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし１６０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし１２０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし４０ｎｇ／ｍｌ、２０ないし８０ｎｇ／ｍｌ、４０ないし１６０ｎｇ／ｍｌ、４０ないし１２０ｎｇ／ｍｌ、４０ないし８０ｎｇ／ｍｌ、８０ないし１６０ｎｇ／ｍｌ、または８０ないし１２０ｎｇ／ｍｌの濃度でもっても使用される。一実施形態において、共培養時、前記ＩＬ－１８及び前記ＩＬ－２１に細胞を露出させることにより、ＮＫ細胞の増殖をさらに相乗的に増大させることができる。

一実施形態において、前記共培養は、２日間ないし３０日間行われるものでもありえる。

一実施形態において、前記遺伝的に操作された細胞は、５０Ｇｙないし３００Ｇｙの放射線処理されたものでもありえる。

一実施形態において、前記試料は、個体、例えば、ヒトを含む哺乳類などに由来する生物学的試料でもある。また、前記生物学的試料は、個体から分離されたものでもあり、血液、全血、血清、血漿、リンパ、尿、糞便、組織、細胞、器官、骨髄、唾液、喀痰、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせでもある。また、前記生物学的試料は、ＰＢＭＣ、精製されたＮＫ細胞、または一次性休止期細胞（primary resting cell）（すなわち、血液から分離されたばかりのもの）を含むものでもありえる。

さらに他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、前記混合されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させてＮＫ細胞を活性化させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、前記活性化されたＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階と、を含む、ＮＫ細胞の活性度を検査する方法を提供する。

さらに他の態様は、混合されたＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、前記混合されたＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させてＮＫ細胞を活性化させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、前記活性化されたＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階と、を含む、ＮＫ細胞関連疾患を診断する方法、または該診断に係わる情報を提供する方法を提供する。

本発明のＮＫ細胞の活性度を検査する方法において、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞の活性化を比較する段階は、具体的には、正常なＮＫ細胞を対照群とし、実験群と同等な条件でもって、前述の遺伝的に操作された細胞で刺激したとき、正常なＮＫ細胞で示される活性化現象が、実験群において、顕著に高いか、示されないか、あるいはその程度が顕著に低い場合、異常であると判断することを含む。前記段階により、異常なＮＫ細胞と係わる疾患の病理学的兆候、ウイルス感染、癌細胞の存在、及び特定癌を判断し、前記疾病に対して予後を予測することができる。前記「正常ＮＫ細胞」とは、疾病を有していない個体が有する化、あるいはそのような個体に由来するＮＫ細胞を言い、前記疾病を有さない個体は、少なくともＮＫ細胞活性に影響を及ぼすと知られている身体的、遺伝的または外来的な条件を有さない。

一実施形態において、前記方法は、前記試料内において、必要とするＮＫ細胞を分離する段階をさらに含むものでもありえる。必要により、他の血球またはリンパ球と共に存在する間、刺激後、前記段階がなされ、リンパ球として、ＮＫ細胞のみを含む試料にするために、前記段階がなされた後、前記刺激する段階がなされもする。分離されたＮＫ細胞の精製度、及びその試料の構成は、実験に必要なほどに多様でもある。該ＮＫ細胞は、必要により、試料で精製されたそのままを使用することができ、実験に適する条件または細胞量を確保するために、増殖させた後、使用することができる。

しかしながら、特定因子の組み合わせの場合、ＮＫ細胞に特異的であるので、本発明の方法において、前記ＮＫ細胞に特異的な因子の組み合わせを利用する場合、前記ＮＫ細胞を分離する段階は、必ず必須なものではない。

一実施形態において、前記活性化の程度を測定する段階は、脱顆粒化（degranulation）活性、細胞毒性（cytotoxicity）活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を含むものでもありえる。

前記脱顆粒化活性は、例えば、パーフォリン分泌またはグランザイム分泌により、標的細胞の溶解を誘導することを意味しうるし、それを、ＦＡＣＳを利用して分析することができる。具体的には、全血試料から分離されたＰＢＭＣ、あるいは純粋分離されたＮＫ細胞を刺激した後、脱顆粒化と比例するＣＤ１０７ａ発現を、フルオロクロム接合された抗体を利用して測定する方法を利用することができる。

前記細胞毒性活性は、例えば、ユロピウム（europium）蛍光染料で標識されたＮＫ細胞を活性化させることができる標的細胞を含む培養物と培養した後、標的細胞溶解を介して排出された蛍光染料の量を、マイクロプレートリーダ（microplate reader）を利用して測定することができる。

一実施形態において、前記サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ－８及びＩＬ－１０のうちから選択されるものでもありえる。前述のようなＮＫ細胞の免疫活性因子発現分析は、ＦＡＣＳ、細胞内シトキン染色またはＥＬＩＳＡなどを利用してもなされる。具体的には、フルオロクロム接合された特定抗体を利用し、ＮＫ細胞表面を染色した後、細胞を透過性化（permeabilization）させ、フルオロクロム接合された他の特定免疫活性因子（例えば、ＩＦＮ－γ抗体）で前記サイトカインなどを染色し、ＮＫ細胞内の免疫活性因子の発現を測定する方法を利用することができる。

一実施形態において、前記ＮＫ細胞の活性と係わる疾患は、異常なＮＫ細胞の活性度を示すものであり、例えば、過敏性免疫疾患、自家免疫疾患、免疫拒否反応、免疫欠乏疾患、組織球症、癌、２型糖尿病、寄生虫感染疾患及びウイルス疾患でもある。前記過敏性免疫疾患は、喘息及び蓄膿症のうちから選択された１以上の者であるか、あるいは前記自家免疫疾患は、ループス、多発性硬化症（multiple sclerosis）、１型糖尿病及びリュウマチ関節炎のうちから選択された１以上のものであるか、あるいは前記組織球症は、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、ＸＬＰ１及びＸＬＰ２のうちから選択されたいずれか１以上のものでもありえる。該血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）は、第２群ランゲルハンス細胞組織球症、赤血球貪食性リンパ組織球増殖症（家族性、散発性）、感染関連性血球貪食症侯群、ウイルス関連性血球貪食症侯群、巨大なリンパ節腫脹を伴う組織球症、または網状組織球症の意味を含むものでもありえる。前記「癌」とは、腫瘍、血液癌または固形癌を含む意味であり、個体のＮＫ細胞のシナジー活性を損傷させるか、あるいは特定条件において、標的細胞として、ＮＫ細胞のシナジー活性を起こさないものを含む。一実施形態において、前記癌は、肺癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、小腸癌、膵臓癌、黒色腫、乳癌、口腔癌、脳腫瘍、甲状腺癌、副甲状線癌、腎臓癌、子宮頸部癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、睾丸癌、血液癌、リンパ腫、皮膚癌、乾癬及び線維腺腫からなる群のうちから選択されたものでもありえる。一実施形態において、前記癌は、膵臓癌またはＢ細胞リンパ腫（Ｂ celllymphoma）でもある。一実施形態において、前記ウイルス疾患は、Ｂ型肝炎でもある。一実施形態において、前記免疫欠乏疾患は、ディジョージ症候群（DiGeorge syndrome）またはチェディアック・東症候群（Chediak-Higashi syndrome）でもある。

前記ＮＫ細胞活性関連疾患に係わる情報は、正常ＮＫ細胞対比で、実験群ＮＫ細胞の活性化が検出されていない場合、異常なＮＫ細胞と判断することができ、あるいは特定受容体に対して活性を喪失したＮＫ細胞が標的細胞に対し、異常に活性を起こしたり、活性を起こさなかったりする場合、前記標的細胞が特定の疾病と関連があると判断することができる。

さらに他の態様は、前記ＮＫ細胞の増殖方法によって製造されたＮＫ細胞を提供する。

さらに他の態様は、前記免疫細胞またはその細胞集団を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。

さらに他の態様は、前記免疫細胞またはその細胞集団を有効成分として、癌または感染性疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。

さらに他の態様は、前記免疫細胞またはその細胞集団を医薬の製造に使用するための用途を提供する。

さらに他の態様は、前記免疫細胞またはその細胞集団を、個体に投与する段階を含む疾患治療方法を提供する。

本明細書において用語「疾患」とは、１つの病理的状態、特に、癌、感染性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、自家免疫性障害、退行性疾患、細胞死滅関連疾患、及び移植片拒否を意味しうる。

本明細書において用語「治療」とは、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防を称するか、あるいはそれを含み、「有効成分」または「薬剤学的有効量」とは、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分な、本願で提供される発明を実施する過程において利用される組成物の任意の量を意味しうる。

本明細書において、用語「投与する」、「導入する」及び「移植する」とは、相互交換的に使用され、一実施形態による組成物の所望する部位への少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への、一実施形態による組成物の配置を意味しうる。一実施形態による組成物の細胞または細胞成分の少なくとも一部を、生存する個体内において所望する位置に伝達する任意の適切な経路によっても投与される。個体投与後、細胞の生存期間は、短ければ、数時間、例えば、２４時間ないし数日、あるいは長ければ、数年でもある。

本明細書において、用語「分離された細胞」、例えば、「分離された免疫細胞」とは、細胞が起源となる組織、例えば、造血細胞から実質的に分離された細胞を意味する。

一実施形態による、薬学的組成物の投与方法は、特別に制限されるのではないが、目的とする方法により、静脈内、皮下、腹腔内、吸入または局所適用のように、非経口投与するか、あるいは経口投与することができる。投与量は、患者の体重・年齢・、性別・健康状態・食餌、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度などにより、その範囲が多様である。一日投与量は、治療を必要とする個体に投与されることによって軽減された疾病状態に対する治療に十分な、一態様による治療用物質の量を意味する。治療用物質の効果的な量は、特定化合物、疾病状態及びその深刻度、治療を必要とする個体によって異なり、それは、当業者により、一般的に決定されうる。非制限的な例として、一態様による組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢・体重・性別・健康状態、投与形態、及び疾患程度によっても異なる。体重が７０ｋｇである成人患者を基準にするとき、例えば、約１，０００～１０，０００細胞／回、１，０００～１００，０００細胞／回、１，０００～１，０００，０００細胞／回、１，０００～１０，０００，０００、１，０００～１００，０００，０００細胞／回、１，０００～１，０００，０００，０００細胞／回、１，０００～１０，０００，０００，０００細胞／回であり、一定時間間隔で、１日１回、あるいは１日数回に分割投与することもでき、一定時間間隔で何回か投与することができる。

「個体」とは、疾患の治療を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒト、または非ヒトである霊長類、マウス（mouse）、ラット（rat）、犬、猫、馬及び牛のような哺乳類を意味する。

一実施形態による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含むものでもありえる。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含むものでもありえる。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）のような有機物、ヒドロキシアパタイトのような無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸の重合体または共重合体、ポリエチレングリコールの重合体または共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わされるものを含むものでもありえる。一実施形態による薬学的組成物が、注射に適切な剤形に調剤される場合には、免疫細胞、またはその活性を増大させる物質は、薬学的に許容可能な担体内に溶解されているか、あるいは溶解されている溶液状態に凍結されたものでもありえる。

一実施形態による薬学的組成物は、その投与方法や剤形により、必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含むものでもありえる。前述のところに例示されたものを含め、本発明に適する、薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995］に詳細に記載されている。一実施形態による薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者であるならば、容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形制を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、あるいは多容量容器内に内入されても製造される。そのとき、該剤形は、油性媒質中または水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、あるいは粉末、顆粒、錠剤またはカプセル型でもありえる。

一態様による、遺伝的に操作された細胞によれば、遺伝的に操作されていない細胞に比べ、ＮＫ細胞の増殖及び活性に、少なくとも２倍ないし数倍ほど増大させることができるが、ＮＫ細胞を増殖させ、細胞治療剤としても使用することができる。

一態様による培養補助細胞を製造するために、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１を生産するレンチウイルスの遺伝子を示した模式図である。一態様による培養補助細胞において、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１の発現特性を確認したグラフである。一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を示したグラフである。一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞をＤＳ培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を示したグラフである。一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を比較したグラフである。ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地において、一態様による培養補助細胞（青色）、及びＫ５６２培養補助細胞（赤色）を利用してＮＫ細胞を増幅させた後、前記増幅されたＮＫ細胞で発現するマーカーを比較したグラフである。ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地において、一態様による培養補助細胞（青色）、及びＫ５６２培養補助細胞（赤色）を利用してＮＫ細胞を増幅させた後、前記増幅されたＮＫ細胞で発現するマーカーを比較したグラフである。一態様による培養補助細胞を利用して増幅された健常人供与者（ＨＤ）からのＮＫ細胞の細胞毒性を確認したグラフである。一態様による培養補助細胞を利用して増幅された健常人供与者（ＨＤ）からのＮＫ細胞のＡＤＣＣ細胞毒性を確認したグラフである。一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現を測定したグラフである。一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現を測定したグラフである。一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞の標的細胞溶解率を測定したグラフである。一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞の標的細胞溶解率を測定したグラフである。

以下、本発明の理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１．遺伝的に操作された培養補助細胞の製造
膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現する培養補助細胞を製造した。

具体的には、ヒト由来ｍｂＩＬ１８遺伝子（配列番号１）及びｍｂＩＬ２１遺伝子（配列番号２）を、レンチウイルスベクターであるｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＲＦＰにクローニングし、組み換えレンチウイルス生産用ベクターを作製した（図１Ａ）。その後、ウイルス生産のために、前記作製された組み換え遺伝子（ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＲＦＰ－ｍｂＩＬ－１８２１）を、２９３ＦＴ細胞に、パッケージングベクターと共に、lipofectamin３０００（Invitrogen）を利用して形質注入させた。一定時間の後、新たな培地に交換し、４８時間細胞を培養した後、ウイルスが含有された培地を回収した。回収された培地は、５００×ｇで１０分間遠心分離し、０．４５μｍフィルタを利用し、ウイルスが含有された純粋な培地だけを分離し、ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１発現レンチウイルスを生産した。その後、Ｋ５６２細胞を含む培地９ｍｌに、ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１発現レンチウイルス１ｍｌを溶かし、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）と共に添加し、４８時間細胞培養を進めた。次に、感染された細胞だけ選別するために、超高速流細胞自動分離器を利用し、赤色蛍光を発現する細胞だけ選別し、ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１の発現いかんを、流細胞分析器（ＦＡＣＳ）を介して分析し、ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１が発現されたＫ５６２細胞株（以下、「Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１」）を生産した。

［実験例］
実験例１．遺伝的に操作された培養補助細胞の細胞特性
一態様による、遺伝的に操作された培養補助細胞のｍｂＩＬ－１８発現特性及びｍｂＩＬ－２１発現特性を認めるために、ｍＲＮＡ及び表面タンパク質の発現レベルを確認した。

具体的には、前記実施例１で製造したＫ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞株及びＫ５６２培養補助細胞株の総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Mini Kit（Qiagen、フェンロー（Venlo）、オランダ)を使用して分離し、ＩＭＰＬＥＮ Nanophotometer Ｐ３３０（IMPLEN、ミュンヘン、ドイツ）を使用して定量化した。その後、分離されたＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Reverse Transcription Kit（Qiagen）を使用し、ｃＤＮＡに転換させた後、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ Green ＰＣＲ Kit（Qiagen）及びRotor－ＧｅｎｅＱ（Qiagen）を使用し、標準２０μｌ反応体積でＰＣＲを遂行した。そのとき、プライマーは、下記表１を使用し、全ての実験を３回反復実施した。

図１Ｂは、一態様による培養補助細胞において、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１の発現特性を確認したグラフである。

その結果、図１Ｂに示されているように、実施例１の培養補助細胞においては、ｍｂＩＬ－１８ｍＲＮＡ及びｍｂＩＬ－２１ｍＲＮＡが検出されたが、Ｋ５６２培養補助細胞においては、ｍｂＩＬ－１８ｍＲＮＡ及びｍｂＩＬ－２１ｍＲＮＡが検出されなかった。すなわち、一実施形態により、遺伝的に操作された培養補助細胞は、ｍｂＩＬ－１８及びｍｂＩＬ－２１の発現特性を有するということが分かる。

実験例２．Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞によるＮＫ細胞の活性化及び増幅
一態様による、遺伝的に操作された培養補助細胞の培地によるＮＫ細胞活性化及び増幅を確認した。

２－１．完全ＲＰＭＩ１６４０培地
具体的には、前記実施例１で製造されたＫ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞株を、５％ＣＯ２が供給された培養器において、３７℃の２５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地が入っているＴ－７５フラスコで培養させた。その後、４００×ｇ条件下において、３分間遠心分離を進め、５ｍｌの完全ＲＰＭＩ１６４０培地において、細胞ペレットを再浮遊させ、培養補助細胞を収穫した。その後、前記培養補助細胞の過度な成長を防止するために、前記培養補助細胞に、Gammacell ３０００ Elan放射器を利用し、１００Ｇｙでガンマ線を照射し、その後の実験に使用した。

末梢血液単核球（ＰＢＭＣｓ）分離のために、健常人供与者の全血：ＰＢＳを、１：２比率（１０ｍｌ全血：２０ｍｌＰＢＳ）に希釈し、１５ｍｌ Lymphoprep上でオーバレイした。次に、常温において、２５分間１，２００×ｇ条件において、ブレーキなしに遠心分離を進め（加速１、減速０）、バフィーコート層（buffy coat layer）から細胞を収穫し、７分間４００×ｇでＰＢＳで３回洗浄した。前記分離された末梢血液単核球３×１０^６個、及び１００Ｇｙ照射のＫ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１０．５×１０^６個を、１ｍｌＮＫ細胞培地が含まれた２４ウェルプレート上に接種した後、２０Ｕ／ｍｌＩＬ－２が含有された１ｍｌＮＫ細胞培地を追加し、総培地体積は、２ｍｌ／ウェル、ＩＬ－２の最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌにした後、ソフトにピペッティングして混合させた後、３７℃の５％ＣＯ_２培養器で培養した。培養７日目、培地に１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５を培地に添加したし、新たな培地に、２，３日ごとに交換させながら、１４日間培養した。対照群としては、Ｋ５６２細胞を使用した。

ＮＫ細胞の増幅は、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）接合マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及びＰＥ－Ｃｙ５－接合マウス抗ヒトＣＤ５６モノクローナル抗体を使用して確認し、Ｋ５６２細胞とＩＬ－２／ＩＬ－１５とで処理したときのＮＫ細胞の純度を基線にし、それぞれの増幅倍数を確認した。

図２Ａは、一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を示したグラフである。

その結果、図２Ａに示されているように、Ｋ５６２培養補助細胞の場合、ＮＫ細胞が、培養後３５日目まで増加したが、その後、それ以上の増幅が起こらないことを認めることができた。なお、実施例１の培養補助細胞の場合、ＮＫ細胞の増幅倍数が、４２日目まで増大する様相を示すということを認めることができた。また、Ｋ５６２培養補助細胞を利用して培養したＮＫ細胞と比較し、実施例１の培養補助細胞を利用して培養したＮＫ細胞の純度が、有意的に高いことを認めることができた。すなわち、一態様による培養補助細胞は、ＮＫ細胞の活性を顕著に増大させるだけでなく、ＮＫ細胞の長期培養が可能であるので、ＮＫ細胞を大量増殖し、細胞治療剤として使用することができる。

２－２．ＤＳ（ＤＭＥＭ＋supplements）培地
ＤＭＥＭ培養培地に、グルコース４．５ｇ／Ｌ、グルタミン５８４ｍｇ／Ｌが補充された、Miller groupで発表されたＤＳ media（(JOURNAL OF HEMATOTHERAPY 4: 149-158 (1995)）を使用したという点を除いては、前記実験例２－１と同一方法で遂行した。

図２Ｂは、一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞をＤＳ培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を示したグラフである。

その結果、図２Ｂに示されているように、実施例１の培養補助細胞、及び比較例１の細胞のいずれも、４２日目まで、ＮＫ細胞の増幅倍数が増大することを認めることができた。しかしながら、比較例１の細胞に比べ、実施例１の培養補助細胞において、ＮＫ細胞の増幅倍数が、およそ２倍ないし６倍以上顕著に増大することを認めることができた。また、Ｋ５６２培養補助細胞を利用して培養したＮＫ細胞と比較し、実施例１の培養補助細胞を利用して培養したＮＫ細胞の純度が、有意的に高いということを認めることができた。

前述の結果を基に、ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地におけるＮＫ増幅効率を比較した。

図２Ｃは、一態様による培養補助細胞、及びＮＫ細胞を、完全ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地で培養したとき、ＮＫ細胞の増幅倍数（左）及び純度（右）を比較したグラフである。

その結果、図２Ｃに示されているように、培地種類に係わりなく、実施例１の細胞は、Ｋ５６２培養補助細胞に比べ、ＮＫ細胞の増幅倍数及び純度が上昇したことを認めることができた。しかしながら、異なる培地で培養した同一細胞を比較したとき、実施例１の細胞は、完全ＲＰＭＩ１６４０培地に比べ、ＤＳ培地において、ＮＫ細胞の増幅倍数が顕著に高いということを認めることができた。すなわち、一態様による培養補助細胞は、培地種類により、ＮＫ細胞を選択的に増幅させることができるが、培地選択的特徴を有することができる。

実験例３．Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞によって増幅されたＮＫ細胞の表現型特性
ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地において、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２細胞によって増幅されたＮＫ細胞の表現型特性を認めた。

具体的には、末梢血液単核球（ＰＢＭＣｓ）の分離のために、健常人供与者の全血：ＰＢＳを１：２比率（１０ｍｌ全血：２０ｍｌＰＢＳ）に希釈し、１５ｍｌ Lymphoprep上でオーバレイした。次に、常温において、２５分間１，２００×ｇ条件で、ブレーキなしに遠心分離を進め（加速１、減速０）、バッフィーコート層から細胞を収穫し、７分間４００×ｇで、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、増幅された健常人供与者由来ＮＫ細胞２×１０^５個をｍＦＡＣＳバッファ（ＦＢＳ１％含むＰＢＳ）で洗浄した後、ＡＰＣ－Cyanine７－接合マウス抗ヒトＣＤ３メンブレン抗体及びＰＥ－Cyanine７－接合抗ヒトＣＤ５６メンブレン抗体で１５分間処理した。その後、細胞を得て、それぞれ異なる蛍光接合された抗ヒトＣＤ１６，ＣＤ６７，ＣＤ６９，ＮＫ２Ｇ２Ａ，ＮＫ２Ｇ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄ，ＤＮＡＭ－１，ＮＫｐ３０，ＮＫｐ４６，ＫＩＲ２ＤＬ１，ＫＩＲ２ＤＬ２／３及びＫＩＲ３ＤＬ１メンブレン抗体で３０分間追加染色した。その後、前記細胞をＦＡＣＳバッファで洗浄した後、ＦＡＣＳキャリバーを利用してデータを獲得し、Kazukaで分析した。

図３Ａ及び図３Ｂは、ＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＳ培地において、一態様による培養補助細胞（青色）、及びＫ５６２培養補助細胞（赤色）を利用してＮＫ細胞を増幅させた後、前記増幅されたＮＫ細胞で発現するマーカーを比較したグラフである。

その結果、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、一態様による培養補助細胞を利用して増幅されたＮＫ細胞において、ＣＤ１６、ＣＤ６７、ＣＤ６９、ＮＫ２Ｇ２Ａ、ＮＫ２Ｇ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ－１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３及びＫＩＲ３ＤＬ１のような表面マーカーが発現されることを認めることができた。

すなわち、一態様による培養補助細胞によって増幅されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の完全な機能的特性を有するということが分かる。

実験例４．Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞によって増幅されたＮＫ細胞の細胞毒性の確認
一態様による培養補助細胞によって増幅されたＮＫ細胞の抗体治療剤としての効能を認めるために、標的細胞に対するＮＫ細胞の１４日目細胞毒性を、ＣＦＳＥ基盤分析によって４時間をかけて、測定した。

具体的には、標的細胞をＦＡＣＳバッファに添加した後、３７℃で１０分間、０．５μＭＣＦＳＥで染色し、完全培地（ＲＰＭＩまたはＤＳ）で２回洗浄した。その後、標的細胞５×１０^４個を、９６ウェル丸底プレートに三重に配し、前記実験例３の健常人供与者（ＨＤ）由来ＮＫ細胞と、Ｅ：Ｔ（effector-to-target）比が０．５：１、１：１及び２：１になるように混合した。該プレートを、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で４時間培養した。その後、混合された細胞をＦＡＣＳチューブに移し、それぞれのチューブに１μｌの１ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（SigmaAldrich、セントルイス、ＭＯ、米国）を添加した。その後、ＦＡＣＳキャリバーで細胞を獲得し、Kaluzaソフトウェアを使用して分析した。死んだ標的細胞の百分率（ＣＦＳＦ陽性及びＰＩ陽性）は、自発的に死んだ標的細胞の百分率を差し引いた後で計算した。

図４Ａは、一態様による培養補助細胞を利用して増幅された健常人供与者（ＨＤ）からのＮＫ細胞の細胞毒性を確認したグラフである。

図４Ｂは一態様による培養補助細胞を利用して増幅された健常人供与者（ＨＤ）からのＮＫ細胞のＡＤＣＣ細胞毒性を確認したグラフである。

その結果、図４Ａに示されているように、実施例１の培養補助細胞を利用して増幅されたＮＫ細胞は、Ｋ５６２培養補助細胞を利用して増幅されたＮＫ細胞と同一細胞毒性を示すということを認めることができた。また、ＤＳ培地で培養されたＮＫ細胞の細胞毒性は、ＲＰＭＩ培地で培養されたＮＫ細胞と同一細胞毒性を示すということを認めることができた。また、図４Ｂに示されているように、実施例１の培養補助細胞を利用して増幅されたＮＫ細胞は、Ｋ５６２培養補助細胞を利用して増幅されたＮＫ細胞と、リツキシマブ（rituximab）に結合されたRaji細胞途において、類似したＡＤＣＣ活性を示すということを認めることができた。また、ＤＳ培地で培養されたＮＫ細胞のＡＤＣＣは、ＲＰＭＩ培地で培養されたＮＫ細胞と類似したＡＤＣＣ活性を示すということを認めることができた。すなわち、一態様による培養補助細胞によって増幅されたＮＫ細胞は、細胞毒性を示す抗体治療剤として活用可能である。

実験例５．Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１細胞によって刺激されたＮＫ細胞の活性度の確認
５－１．ＣＤ１０７ａ発現による脱顆粒活性の確認
一態様による、遺伝的に操作された培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞の全血における細胞活性度を認めるために、脱顆粒化と比例するＮＫ細胞表面におけるＣＤ１０７ａ発現の程度を測定した。具体的には、前記実験例３の健常人供与者（ＨＤ）全血１００μｌ、Ｋ５６２培養組補細胞、または実施例１で製造したＫ５６２－ｍｂＩＬ１８－ｍｂＩＬ２１培養補助細胞株２×１０^５個、及びＰＥ接合された抗ヒトＣＤ１０７ａをＦＡＣＳチューブで培養した。１時間後、Monensin及びbrefeldin Ａ（ＢＤ Biosciences）を追加し、４時間さらに培養した。その後、ＮＫ細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体及びヒトＣＤ５６抗体で染色して得て、ＣＤ１０７ａ発現を測定した。
図５Ａ及び図５Ｂは、一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現を測定したグラフである。
その結果、図５Ａに示されているように、実施例１の培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２の濃度依存的に、ＣＤ１０７ａ発現が増大することを認めることができた。具体的には、図５Ｂに示されているように、実施例１の培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞は、Ｋ５６２培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞と比較し、同一ＩＬ－２の濃度において、ＣＤ１０７ａ発現が有意的に高いということを認めることができた。
すなわち、一態様による培養補助細胞を利用したＮＫ細胞活性化は、Ｋ５６２培養補助細胞を使用するより、ＮＫ細胞活性度診断方法としてさらに有用に使用されうる。
５－２．細胞溶解（cell lysis）による細胞毒性の確認
一態様による、遺伝的に操作された培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞の全血における細胞活性度を認めるために、標的細胞の細胞毒性を、ＣＦＳＥ基盤分析によって１６～２０時間測定した。具体的には、標的細胞（Ｋ５６２培養補助細胞または実施例１の培養補助細胞）をＦＡＣＳバッファに添加した後、３７℃で１０分間、０．５μＭＣＦＳＥで染色し、完全培地（ＲＰＭＩまたはＤＳ）で２回洗浄した。その後、標的細胞５×１０^４個を、ＦＡＣＳチューブに三重に配し、ＩＬ－２が添加された完全培地と、前記健常人供与者（ＨＤ）全血とを、体積比２００μｌ，１００μｌ，５０μｌになるように混合した。ＦＡＣＳチューブを、３７℃、５％ＣＯ_２培養器において、１６～２０時間培養した。その後、混合された細胞をＦＡＣＳチューブに移し、それぞれのチューブに、１μｌの１ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（SigmaAldrich、セントルイス、ＭＯ、米国）を添加した。その後、ＦＡＣＳキャリバーで細胞を獲得し、Kaluzaソフトウェアを使用して分析した。死んだ標的細胞の百分率（ＣＦＳＦ陽性及びＰＩ陽性）は、自発的に死んだ標的細胞の百分率を差し引いた後で計算した。
図５Ｃ及び図５Ｄは、一態様による培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞の標的細胞溶解率を測定したグラフである。
その結果、図５Ｃに示されているように、実施例１の培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞は、ＩＬ－２の濃度依存的に、標的細胞溶解率が上昇することを認めることができた。具体的には、図５Ｄに示されているように、実施例１の培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞は、Ｋ５６２培養補助細胞によって刺激されたＮＫ細胞と比較し、同一ＩＬ－２の濃度において、標的細胞溶解率が有意的に高いということを認めることができた。
すなわち、一態様による培養補助細胞を利用したＮＫ細胞活性化は、Ｋ５６２培養補助細胞を使用するより、ＮＫ細胞活性度診断方法として、さらに有用に使用されうる。
前述の本発明の説明は、例示のためのものであるのみ、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、全ての面において例示的な物であり、限定的ではないと理解されなければならない。

Claims

膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作された、ＮＫ細胞の培養のための培養補助細胞であって、
ここで、培養補助細胞とＮＫ細胞はＤＳ培地で培養されている、細胞。
前記培養補助細胞は、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８８６６、ＥＢＶ＿ＬＣＬ、７２１．２２１、ＨＦＷＴ及びＮＫ－９２細胞でなる群のうちから選択される、請求項１に記載の培養補助細胞。
膜結合性インターロイキン－２１及び膜結合性インターロイキン－２１を暗号化する核酸を含む、請求項１に記載の培養補助細胞。
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の培養補助細胞を含む、ＮＫ細胞培養用組成物。
ＮＫ細胞の集団を含む、ヒト以外の個体から血液試料を得る段階と、
前記ＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、培地中でＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作された細胞である、段階と、を含む、ＮＫ細胞を増殖させる方法であって、
ここで、培養補助細胞とＮＫ細胞はＤＳ培地で培養されている、方法。
前記接触させる段階は、前記遺伝的に操作された細胞と、ＮＫ細胞の集団とを共培養し、前記ＮＫ細胞のサブ集団を増幅させる段階を含む、請求項５に記載の方法。
前記共培養は、サイトカインの存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
前記サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５及びＩＬ３６からなる群のうちから選択される１種以上である、請求項７に記載の方法。
前記サイトカインは、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１である、請求項８に記載の方法。
前記共培養は、２日間ないし３０日間行われる、請求項６に記載の方法。
前記血液試料は、全血試料である、請求項５に記載の方法。
前記遺伝的に操作された細胞は、５０Ｇｙないし３００Ｇｙ放射線処理された、請求項５に記載の方法。
ヒト以外の個体からＮＫ細胞の集団を含む血液試料を得る段階と、
前記ＮＫ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＮＫ細胞を活性化させるために、遺伝的に操作された細胞と接触させてＮＫ細胞を活性化させる段階であり、前記遺伝的に操作された細胞は、膜結合性インターロイキン－１８（ｍｂＩＬ－１８）及び膜結合性インターロイキン－２１（ｍｂＩＬ－２１）を発現するように遺伝的に操作されたものである段階と、
前記活性化されたＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階と、を含む、ＮＫ細胞の活性度を検査する方法であって、
ここで、培養補助細胞とＮＫ細胞はＤＳ培地で培養されている、方法。
前記血液試料は、全血試料である、請求項１３に記載の方法。
前記ＮＫ細胞の活性化の程度を分析する段階は、脱顆粒化活性、細胞毒性活性、及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を含む、請求項１３に記載の方法。