JP7618208B2 - 単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 - Google Patents

単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法に関する。さらに詳しくは、Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、一塩基多型、点突然変異、又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のような遺伝的変異が含まれた単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合が可能な塩基配列で構成された一本鎖核酸を用いて、単一標的遺伝子の遺伝的変異をリアルタイムで検出する方法及びそのためのキットに関する。
遺伝子組換えにおいて、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）による変異は、最も一般的な形態であり、様々な疾病を引き起こす原因として作用する（Ｂａｒｒｅｉｒｏ ＬＢ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５７８：２５５－２７６， ２００９； Ｂｅａｕｄｅｔ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １１（４）：６００－６０８， ２００１）。よって、遺伝子組換えによる様々な疾病を早期に診断するために、ＳＮＰの検出による診断方法は、極めて効率的であり、速い診断が可能である。したがって、ＳＮＰを正確に検出するための多くの方法が提示されており、今でも、これに関連した多くの研究が進行されている（Ｅｒｍｉｎｉ ＭＬ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｅｎ． ＆ Ｂｉｏｅｌｅ．， ６１：２８－３７， ２０１４； Ｋ． Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｓｅｎ． ＆ Ｂｉｏｅｌｅ．， ６６：２９７－３０７， ２０１５）。
具体的に、多数の遺伝子分析のための最も普通に用いる方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を用いる方法、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）方法が挙げられる。
前記ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡと結合することができ、蛍光物質と消光物質が結合されたプライマー又はプローブを任意で設計することにより、検出しようとする遺伝子の所望の部位のみを正確に増幅することができるという長所がある。しかし、一度の反応で、一つの関心遺伝子のみを増幅させることができるので、増幅しようとする関心遺伝子が多数である場合は、同じ作業を繰り返さなければならないことがあった。
前記多重ポリメラーゼ連鎖反応は、数個のポリメラーゼ連鎖反応を一つのチューブで行うことにより、多数の遺伝子領域を同時に分析することができるという長所があった。しかし、数個のプライマー又はプローブを一つのチューブで同時に使用することにより、プライマー又はプライマー間の交差反応が発生してしまうので、一度に増幅可能な遺伝子領域の数が限られる。また、反応条件を見い出すための多大な労力と時間を要し、敏感度及び特異度において良好な結果が得られないという短所があった（Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ Ｐ．
ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１（６）：６７３－６７８，２００３）。
近年、多重ポリメラーゼ連鎖反応を利用せず、共通プライマーを用いて多数の遺伝子領域を同時に増幅し、大量分析を可能にする研究が盛んに行われており、代表的な技術としては、同時にいくつかの遺伝子領域の一塩基多型（ＳＮＰ）を分析することができるＳＮＰｌｅｘ、ゴールデンゲートアッセイ（Ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ ａｓｓａｙ）、分子反転プ
ローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ（ＭＩＰｓ））などがある。
前記ＳＮＰｌｅｘは、ＯＬＡ（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）以降、エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いた精製過程を行い、プローブの両端にある共通のプライマー塩基配列でポリメラーゼ連鎖反応増幅を行ってから、最後にプローブに含まれたジップコード（ＺｉｐＣｏｄｅ）塩基配列を用いてＤＮＡチップで分析する方法である（Ｔｏｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｔｅｃｈ．， １６（４）：３９８－４０６， ２００５）。
ゴールデンゲートアッセイは、固体表面に固定化したゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）に、アップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）プローブで、対立遺伝子特異的なプライマー伸長反応を行った後、ダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）プローブとのＤＮＡ連結反応を行い、洗浄過程を経て、ＤＮＡ連結反応されなかったプローブを除去してから、ＳＮＰｌｅｘと同様に、プローブに含まれた共通のプライマー塩基配列で増幅させ、増幅されたポリメラーゼ連鎖反応の結果物をイルミナ社製ビーズチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐ）で分析する方法である（Ｓｈｅｎ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， ５７３（１－２）：７０－８２， ２００５）。
分子反転プローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ（ＭＩＰｓ））は、パドロックプローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ）を用いてギャップライゲーション（ｇａｐ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った後、ＤＮＡが連結されなかったプローブとゲノムＤＮＡをエクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて除去し、ウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）を用いてパドロックプローブを線形化させた後、プローブに含まれた共通のプライマー塩基配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＧｅｎＦｌｅｘ Ｔａｇ Ａｒｒａｙ（アフィメトリクス社）にハイブリダイズさせて一塩基多型を分析する方法である（Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２１（６）：６７３－６７８， ２００３）。
しかしながら、これらの方法は、一番目のチューブで反応させた生成物の一部を、二番目のチューブに移して反応を行わなければならず、又は、数種の酵素を利用しなければならないので、異なるサンプル間の汚染が発生し、実験方法が複雑であるという問題点があった。しかも、蛍光標識されたプローブの個数だけの一塩基多型のみが検出できるので、分析しようとする一塩基多型の個数が増えるほど、分析費用が高くなるという問題点があった。
点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、一般に、ＤＮＡ複製中に発生することが知られている。ＤＮＡ複製は、一つの二本鎖ＤＮＡ分子が、二つの一本鎖ＤＮＡを生成するときに発生し、それぞれの鎖は、相補鎖の生成のためのテンプレートとして用いられる。単一点突然変異は、全ＤＮＡ配列を変化させることができ、一つのプリン（ｐｕｒｉｎｅ）又はピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）を変更すれば、ヌクレオチドがコードするアミノ酸が変更され得る。
点突然変異は、ＤＮＡを複製する間、自然突然変異から発生し、突然変異率は、そのような原因により上昇され得る。
１９５９年、エルンスト・フリーセ（Ｅｒｎｓｔ Ｆｒｅｅｓｅ）は、「転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）」又は「転換（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎｓ）」との用語を作り出し、異なる類型の点突然変異を分類した。転移は、プリン塩基を他のプリンに代替し、又はピ
リミジンを他のピリミジンに代替することである。転換は、プリンをピリミジンに、又は、それとは逆に代替することである。転移（Ａｌｐｈａ）及び転換（Ｂｅｔａ）への突然変異率は異なり、通常、転移突然変異は、転換よりも約１０倍も多いことが知られている。
点突然変異の機能的分類は、ナンセンス突然変異と同様に、ストップゲイン（ｓｔｏｐ－ｇａｉｎ）及びスタートロス（ｓｔａｒｔ－ｌｏｓｓ）のように、蛋白質の生成が非正常的に短縮又は追加されると、ミスセンス突然変異と同様に、他のアミノ酸をコードする場合（ＢＲＡＦ遺伝子におけるバリン（ｖａｌｉｎｅ）をグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ
ａｃｉｄ）に変化させる場合、これは、癌細胞における無制限増殖信号を引き起こすＲＡＦ蛋白質の活性化につながる。）、サイレント突然変異と同様に、同じアミノ酸をコードすることがあり、通常の研究者に公知されている事項である。
このような点突然変異は、特定疾病の原因としても知られている。多重腫瘍抑制蛋白質における点突然変異は、癌を引き起こし、神経線維腫症（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）は、ニューロフィブロミン（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍｉｎ）１又はニューロフィブロミン２遺伝子の点突然変異により発生する。鎌状赤血球貧血（Ｓｉｃｋｌｅ－ｃｅｌｌ
ａｎｅｍｉａ）は、ヘモグロビンのβ－グロビン鎖における点突然変異により引き起こされ、６番目の位置における親水性アミノ酸グルタミン酸が疎水性アミノ酸バリンに代替される。それ以外にも、テイ・サックス病（Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ ｄｉｓｅａｓｅ）や色覚異常でも見い出される。
このような点突然変異の分析は、特に癌を診断し、治療剤の選択に重要な要素として作用している。同伴診断は、癌突然変異による最適化した抗がん剤の選択又は特定の抗がん剤を排除するにあたって重要な判断の根拠として活用されており、近年、特定突然変異をターゲットとした抗がん剤の開発は、増加し続けている。
このような突然変異の分析方法は、ＰＣＲ、ＮＧＳ（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）などにより行われており、液体生検への需要度と関心は、増加し続けており、さらに精密な測定方法が要求されている。しかし、現在知られている方法は、十分な分析機能を保有しておらず、又は分析機能を満たす場合は、高価の別途の装備と複雑な分析過程を要求しているので、さらに簡単な分析が可能な方法の開発が要求されている。
よって、本発明者等は、ＳＮＰ、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）などの遺伝子組換えをリアルタイムで検出するにあたり、低い敏感度と特異度を増加させ、癌を簡単かつ正確に診断することができる方法について、長い間研究しているうち、本発明者等の一本鎖核酸を活用するとき、高い敏感度及び高い特異性を示し、癌をはじめとして癌のような遺伝子組換えによる様々な疾患の診断に極めて有用であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明の一つの目的は、ｉ）Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、ｉｉ）遺伝的変異を含む単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合を行い、ｉｉｉ）両末端又は内部に同一であり又は少なくとも二つの異なる探知可能なマーカーが付されており、前記Ｙは、単一標的遺伝子に位置する一つ又は二つの塩基配列で構成されたＲＮＡであることを特徴とする、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を提供することである。
本発明の他の一つの目的は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）である場合、前記一本鎖核酸は、（ａ）前記Ｘは、４～２０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであり、（ｂ）前記Ｚは、４～２０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであることを特徴とする、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を提供することである。
本発明のまた他の一つの目的は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）又は点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）である場合、（ｃ）前記Ｘは、１０～３０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであり、（ｄ）前記Ｚは、１～５個の塩基配列で構成されるＤＮＡであることを特徴とする、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を提供することである。
本発明のまた他の一つの目的は、前記一本鎖核酸を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用キットを提供することである。
本発明のまた他の一つの目的は、ａ）生物学的試料から検出しようとする遺伝的変異を含む標的核酸を得る段階と、ｂ）前記単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を製造する段階と、ｃ）前記段階ａ）で得られた標的核酸、前記段階ｂ）で製造された一本鎖核酸、前記段階ａ）で得られた標的核酸と相補的な塩基配列を有するプライマーセット、及び切断試薬と混合した後、伸長反応により遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階と、ｄ）前記段階ｃ）で増幅された遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体から分離された一本鎖核酸断片の量を測定する段階と、を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法を提供することである。
上記目的を達成するための本発明は、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を提供する。
詳しくは、前記一本鎖核酸は、ｉ）Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、ｉｉ）遺伝的変異を含む単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合を行い、ｉｉｉ）両末端又は内部に同一であり又は少なくとも二つの異なる探知可能なマーカーが付されており、前記Ｙは、単一標的遺伝子に位置する一つ又は二つの塩基配列で構成されたＲＮＡであって、単一標的遺伝子とハイブリダイズするときに切断試薬により切断される。
このとき、前記一本鎖核酸は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）である場合、前記一本鎖核酸は、（ａ）前記Ｘは、４～２０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであり、（ｂ）前記Ｚは、４～２０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであることを特徴とし、又は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）である場合、（ｃ）前記Ｘは、１０～３０個の塩基配列で構成されるＤＮＡであり、（ｄ）前記Ｚは、１～５個の塩基配列で構成されるＤＮＡであることを特徴とする。
また、前記一本鎖核酸は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）である場合、単一標的遺伝子とハイブリダイズした後、切断試薬により前記Ｙが切断されると、前記Ｘ及びＺも、単一標的遺伝子から分離され、プローブとして作動することを特徴とし、又は、単一標的遺伝子の遺伝的変異が、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡ
アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）である場合、単一標的遺伝子とハイブリダイズした後、切断試薬により前記Ｙが切断されると、前記Ｚは、単一標的遺伝子から分離されるが、前記Ｘは分離されず、プライマー及びプローブとして同時に作動することを特徴とする。
また、本発明は、前記一本鎖核酸を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用キットを提供する。
さらに、本発明は、ａ）生物学的試料から検出しようとする遺伝的変異を含む標的核酸を得る段階と、ｂ）前記単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を製造する段階と、ｃ）前記段階ａ）で得られた標的核酸、前記段階ｂ）で製造された一本鎖核酸、前記段階ａ）で得られた標的核酸と相補的な塩基配列を有するプライマーセット、及び切断試薬と混合した後、伸長反応により遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階と、ｄ）前記段階ｃ）で増幅された遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体から分離された一本鎖核酸断片の量を測定する段階と、を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法を提供する。
本発明に係る一本鎖核酸を用いた単一標的遺伝子の遺伝的変異をリアルタイムで検出する方法は、従来、ｑＰＣＲを用いたＳＮＰ及び点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）分析方法と比べて、リアルタイムの確認のための別途位置のプローブを必要とせず、ＳＮＰ及び点突然変異のような遺伝的変異をさらに正確に測定することができる利点がある。すなわち、本発明に係る一本鎖核酸は、切断試薬によってのみ切断され、従来、プローブを利用した遺伝的変異検出方法に比べてさらに正確に測定することができる。
また、本発明に係る一本鎖核酸を用いてＳＮＰ及び点突然変異のような遺伝的変異の分析時、溶融温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）分析のような別途の突然変異確認過程を要せず、直ちに突然変異の区別が可能である。
したがって、本発明の一本鎖核酸及びこれを用いた単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出方法は、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲなどで発生する様々な点突然変異を迅速かつ正確に区別することができ、癌をはじめとした様々な疾病の診断、治療剤の選択及び予後診断に有用に用いられる。
本発明の一実施例に係る一本鎖核酸を用いてＡｐｏＥ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＡｐｏＥ一本鎖核酸１型（配列番号３乃至６）を用いて、ＡｐｏＥ遺伝子の６種の表現型のＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４の区別が可能であることを確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＧ１３Ｄ一本鎖核酸１型を用いてＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１３Ｄ突然変異細胞株であるＨＣＴ－１５細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１３Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１３Ｄ一本鎖核酸１型（配列番号７）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＫＲＡＳ野生型一本鎖核酸を用いて野生型ＫＲＡＳ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＫＲＡＳ野生型細胞株であるＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株のｇＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度による野生型ＫＲＡＳ遺伝子の発現有無を、ＫＲＡＳ野生型一本鎖核酸１型（配列番号８）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＫＲＡＳ野生型一本鎖核酸１型を用いて野生型ＫＲＡＳ遺伝子の発現有無を確認した図である。詳しくは、ＨＣＴ－１５細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度による野生型ＫＲＡＳ遺伝子の発現有無を、ＫＲＡＳ野生型一本鎖核酸１型（配列番号８）を用いて確認したＰＣＲ結果であって、ＨＣＴ－１５細胞株は、ヘテロ接合型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｔｙｐｅ）の遺伝子として、Ｇ１３Ｄ突然変異及びＫＲＡＳ野生型の遺伝子を同時に保有している細胞株であることを確認した図である。 本発明の一実施例に係るＫＲＡＳ野生型一本鎖核酸１型を用いて野生型ＫＲＡＳ遺伝子と混合されたＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＨＣＴ－１５細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の濃度に対して１０～０．０１％となるように希釈し、これらの細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を混合した後、Ｇ１３Ｄ一本鎖核酸１型（配列番号７）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてＡｐｏＥ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＡｐｏＥ一本鎖核酸２型（配列番号１１乃至１４）を用いて、ＡｐｏＥ遺伝子の６種の表現型のＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４の区別が可能であることを確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株であるＳＷ６２０細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｖ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｖ一本鎖核酸２型（配列番号１５）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｃ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｃ突然変異細胞株であるＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株のｇＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｃ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｃ一本鎖核酸２型（配列番号１６）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｓ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｓ突然変異細胞株であるＡ５４９細胞株のｇＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｓ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｓ一本鎖核酸２型（配列番号１７）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてＥＧＦＲ遺伝子アクソン２０のＴ７９０Ｍ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｔ７９０Ｍ突然変異細胞株であるＨ１９７５細胞株及び野生型細胞株であるＡ５４９細胞株のｇＤＮＡをそれぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＴ７９０Ｍ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｔ７９０Ｍ一本鎖核酸２型（配列番号２４）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＲＴ－ＰＣＲによりｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡから合成して得られたｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を、ｌｅｔ－７ａ一本鎖核酸２型（配列番号２１）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｌｅｔ－７ｄ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＲＴ－ＰＣＲによりｌｅｔ－７ｄ ｍｉＲＮＡから合成して得られたｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｌｅｔ－７ｄ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を、ｌｅｔ－７ｄ一本鎖核酸２型（配列番号２４）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡ遺伝子の特異的検出能を確認した図であって、詳しくは、ｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡ（１ｐＭ濃度）の存在下で、ｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無、すなわち、ｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡの存在下でのｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡ遺伝子に対する特異的検出の有無を、ｌｅｔ－７ａ一本鎖核酸２型（配列番号２１）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｍｉＲＮＡ ３４ａ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＲＴ－ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ ３４ａから合成して得られたｍｉＲＮＡ ３４ａ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ａ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ａ一本鎖核酸２型（配列番号２７）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｍｉＲＮＡ ３４ｂ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＲＴ－ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ ３４ｂから合成して得られたｍｉＲＮＡ ３４ｂ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｂ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ一本鎖核酸２型（配列番号３０）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、ＲＴ－ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ ３４ｃから合成して得られたｍｉＲＮＡ ３４ｃ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ一本鎖核酸２型（配列番号３３）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｍｉＲＮＡ ３４遺伝子の特異的検出能を確認した図であって、詳しくは、ｍｉＲＮＡ ３４ａ ｃＤＮＡ（１００ｐＭ濃度）の存在下で、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無、すなわち、ｍｉＲＮＡ ３４ａ ｃＤＮＡの存在下でのｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子に対する特異的検出の有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ一本鎖核酸２型（配列番号３３）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係る一本鎖核酸２型を用いてｍｉＲＮＡ ３４遺伝子の特異的検出能を確認した図であって、詳しくは、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ ｃＤＮＡ（１００ｐＭ濃度）の存在下で、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無、すなわち、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ ｃＤＮＡの存在下でのｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子に対する特異的検出の有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ一本鎖核酸２型（配列番号３３）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＤＮＡオリゴ（ＤＮＡｏｌｉｇｏ）－ＤＮＡ－ＲＮＡ－突然変異－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸２型（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤｒＭＲ２）を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｄ一本鎖核酸２型（配列番号３６）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＤＮＡオリゴ－ＲＮＡ－ＤＮＡ－突然変異－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸２型（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ｒＤＭＲ２）を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｄ一本鎖核酸２型（配列番号３７）を用いて確認したＰＣＲ結果である。 本発明の一実施例に係るＤＮＡオリゴ－ＤＮＡ－突然変異－ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸２型（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤＭｒＤＲ２）を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を確認した図であって、詳しくは、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｄ一本鎖核酸２型（配列番号３８）を用いて確認したＰＣＲ結果である。
本発明は、単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法に関する。さらに詳しくは、Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、一塩基多型（ＳＮＰ）、点突然変異、又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のような遺伝的変異が含まれた単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合が可能な塩基配列で構成された一本鎖核酸を用いて、単一標的遺伝子の遺伝的変異をリアルタイムで検出する方法及びそのためのキットに関する。
一つの態様によれば、本発明は、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出用の一本鎖核酸を提供する。
本発明において、前記一本鎖核酸は、ｉ）Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、ｉｉ）遺伝的変異を含む単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合を行い、ｉｉｉ）両末端又は内部に同一であり又は少なくとも二つの異なる探知可能なマーカーが付されているいることを特徴とする。
このとき、付される探知可能なマーカーの位置は、特定の部位に限定されず、切断試薬によるＹ部位の切断時に探知可能なマーカーが分離される位置であればどこでも可能である。
また、前記一本鎖核酸は、リアルタイムの検出を目的とする遺伝的変異を含む単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合して複合体を形成し、増幅させることを特徴とする。
本発明において、前記一本鎖核酸は、遺伝的変異の検出時、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）、点突然変異（ｐｏｉｎｔ
ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を探知する核酸を意味する。ここで、一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を探知する一本鎖核酸は、「１型一本鎖核酸」又は「一本鎖核酸１型」と称され、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）又は点突然変異又はｍｉＲＮＡアイソフォームの存在を探知する一本鎖核酸は、「２型一本鎖核酸」又は「一本鎖核酸２型」と称される。前記１型一本鎖核酸は、２型一本鎖核酸とは異なり、プローブ（ｐｒｏｂｅ）として作動可能であり、２型一本鎖核酸は、１型一本鎖核酸とは異なり、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）及びプローブ（ｐｒｏｂｅ）として同時に使用可能である。
具体的に、１型一本鎖核酸が単一標的遺伝子とハイブリダイズした後、切断試薬により、前記Ｙが切断されると、前記Ｘ及びＺも、単一標的遺伝子から分離され、プローブとして作動可能であり、２型一本鎖核酸が単一標的遺伝子とハイブリダイズした後、切断試薬により、前記Ｙが切断されると、前記Ｚは、単一標的遺伝子から分離されるが、前記Ｘは分離されず、プライマー及びプローブとして同時に作動することを特徴とする。
本発明の一本鎖核酸は、Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、それぞれのＸ、Ｙ及びＺは、多様な個数のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有してもよい。
前記Ｙは、単一標的遺伝子に位置する一つ又は二つの塩基配列で構成されたＲＮＡであり、切断試薬により切断される部位である。
ここで、切断試薬としては、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、エクソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼのような酵素による切断が行われること
が好ましいが、その他の公知された切断試薬が用いられても構わない。
前記Ｘは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の存在を探知する場合、４～２０個、好まししく４～１９個、より好ましくは４～１８個、さらにより好ましくは５～１８個、さらにより好ましくは６～１８個、さらにより好ましくは６～１７個、さらにより好ましくは６～１６個、最も好ましくは６～１５個の塩基配列で構成されるＤＮＡである。これによるＸは、１型一本鎖核酸に属する。
また、前記Ｘは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）又は点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を探知する場合、１０～３０個、好ましくは１１～３０個、より好ましくは１２～３０個、さらにより好ましくは１３～３０個、さらにより好ましくは１４～３０個、さらにより好ましくは１５～３０個、さらにより好ましくは１５～３０個、さらにより好ましくは１５～２９個、さらにより好ましくは１５～２８個、さらにより好ましくは１５～２７個、さらにより好ましくは１５～２６個、さらにより好ましくは１５～２５個、さらにより好ましくは１５～２４個、さらにより好ましくは１５～２３個、さらにより好ましくは１５～２２個、さらにより好ましくは１５～２１個、最も好ましくは１５～２０個の塩基配列で構成されるＤＮＡである。これによるＸは、２型一本鎖核酸に属する。
前記Ｚは、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の存在を探知する場合、４～２０個、好ましくは４～１９個、より好ましくは４～１８個、さらにより好ましくは５～１８個、さらにより好ましくは６～１８個、さらにより好ましくは６～１７個、さらにより好ましくは６～１６個、最も好ましくは６～１５個の塩基配列で構成されるＤＮＡである。これによるＺは、１型一本鎖核酸に属する。
また、前記Ｚは、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を探知する場合、１～５個、好ましくは２～５個、より好ましくは２～４個、さらにより好ましくは２～３個で構成されるＤＮＡである。これによるＺは、２型一本鎖核酸に属する。
本発明において、前記遺伝的変異の検出は、一塩基多型（ＳＮＰ）、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を探知するものであって、上述した一本鎖核酸中のＸ及びＺを構成する塩基の個数により、これらのそれぞれの遺伝的変異の検出を特異的かつ敏感に探知することができる。
本発明の一実施例において、ＡｐｏＥ一本鎖核酸（配列番号３乃至６）を用いて、ＡｐｏＥ遺伝子の６種の表現型のＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４が正確に区別できることを、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１）。
本発明の一実施例において、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ突然変異細胞株であるＳＷ６２０細胞株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｖ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｖ一本鎖核酸（配列番号１５）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図７）。
本発明の一実施例において、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｃ突然変異細胞株であるＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞株のｇＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｃ突然変
異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｃ一本鎖核酸（配列番号１６）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図８）。
本発明の一実施例において、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｓ突然変異細胞株であるＡ５４９細胞株のｇＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｓ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｇ１２Ｓ一本鎖核酸（配列番号１７）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図９）。
本発明の一実施例において、ＥＧＦＲ遺伝子アクソン２０のＴ７９０Ｍ突然変異細胞株であるＨ１９７５細胞株及び野生型細胞株であるＡ５４９細胞株のｇＤＮＡをそれぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＴ７９０Ｍ突然変異遺伝子の発現有無を、Ｔ７９０Ｍ一本鎖核酸（配列番号１９）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１０）。
本発明の一実施例において、ｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｌｅｔ－７ａ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を、ｌｅｔ－７ａ一本鎖核酸（配列番号２１）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１１）。
本発明の一実施例において、ｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｌｅｔ－７ｄ ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現有無を、ｌｅｔ－７ｄ一本鎖核酸（配列番号２４）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１２）。
本発明の一実施例において、１ｐＭ濃度のｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡ ２μｌに、１／１０ずつ１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈したｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡ ２μｌずつを添加した実験群から、１００ｆＭから１ｆＭの濃度までｌｅｔ－７ ａ ｃＤＮＡを探知することできることを確認した（図１３）。
本発明の一実施例において、ｍｉＲＮＡ ３４ａ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ａ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ａ一本鎖核酸（配列番号２７）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１４）。
本発明の一実施例において、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｂ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ一本鎖核酸（配列番号３０）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１５）。
本発明の一実施例において、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｃＤＮＡの濃度によるｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無を、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ一本鎖核酸（配列番号３３）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより確認した（図１６）。
本発明の一実施例において、ｍｉＲＮＡ ３４ａ ｃＤＮＡ又はｍｉＲＮＡ ３４ｂ ｃＤＮＡに、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ ｃＤＮＡを濃度別に希釈した後、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ一本鎖核酸（配列番号３３）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより、ｍｉＲＮＡ ３４ｃ遺伝子の発現有無を、微細濃度でも確認することができた（図１７及び図１８）。
本発明において、前記探知可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質及び消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５
９４、Ａｌｅｘａ ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ ｇｒｅｅｎ ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ ｇｒｅｅｎ ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ＯＲＮＡｇｅ ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ６７０及びビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ－１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６－ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３、ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ－Ｓｐ、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－２及びＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
本発明で探知可能なマーカーとして蛍光ペアを用いる場合、蛍光物質及び消光物質の位置は、Ｘ又はＺであってもよく、Ｙ部位であってもよく、これらのうちいずれか１箇所に限定されるものではない。例えば、蛍光物質はＸに位置し、消光物質はＹ又はＺに位置してもよい。
本発明の一本鎖核酸は、単一標的遺伝子の遺伝的変異として、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を検出するにあたり、ｉ）核酸のうちＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマー；ｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するための順方向プライマー；ｉｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するための逆方向プライマー； ｉｖ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するための順方向プライマー及び逆方向プライマー；又はｖ）検出しようとする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をリアルタイムで確認するためのプローブ；として使用できる。
特に、本発明の一本鎖核酸を、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなどを含む）からｃＤＮＡを合成及び増幅するためのＲＴプライマー；又は順方向プライマー及びプローブ；又は逆方向プライマー及びプローブ；として使用する場合、ｃＤＮＡ合成時にＲＴプライマーをループ状に形成する過程や、ポリＡを形成する過程が不要であり、検出しようとするＲＮＡとハイブリダイズしてｃＤＮＡを合成し、探知しようとするＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなどを含む）を増幅及びリアルタイムで検出することができる。
他の一つの態様によれば、本発明は、前記一本鎖核酸を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用キットを提供する。
本発明の一本鎖核酸を、単一標的遺伝子の遺伝的変異を検出するためのキットとして使用する場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸の他に、一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素をさらに含むことが好ましい。
本発明において、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＹ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｙ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＤＮａｓｅ ＩＩ、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｙ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＶ、ＲＮａｓｅ Ｈ、又はＲＮａｓｅ Ｔ２等を使用することが好ましい。
本発明の一本鎖核酸を、単一標的遺伝子の遺伝的変異を検出するためのキットとして使用する場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸と一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素との他に、ＤＮＡの増幅反応に必要な試薬をさらに含むことができる。
前記増幅反応に必要な試薬としては、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、テルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｕｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｉｓｆｌａｖｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）又はピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及び水（Ｈ２Ｏ）が挙げられる。また、前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０（ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）、ＰＥＧ ６０００、ホルムアミド及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
また他の一つの態様によれば、本発明は、ａ）生物学的試料から検出しようとする遺伝的変異を含む標的核酸を得る段階と、ｂ）上述した一本鎖核酸を製造する段階と、ｃ）前記段階ａ）で得られた標的核酸、前記段階ｂ）で製造された一本鎖核酸、前記段階ａ）で得られた標的核酸と相補的な塩基配列を有するプライマーセット、及び切断試薬と混合した後、伸長反応により遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階と、ｄ）前記段階ｃ）で増幅された遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体から分離された一本鎖核酸断片の量を測定する段階と、を含む、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法を提供する。
本発明に係る単一標的遺伝子の遺伝的変異をリアルタイムで検出する方法について、各段階に応じて具体的に説明すると、次の通りである。
ａ）生物学的試料から検出しようとする遺伝的変異を含む標的核酸を得る段階である。
本発明において、前記遺伝的変異を含む標的核酸は、試料から検出しようとするＲＮＡ又はＤＮＡであり、又は前記ＲＮＡを逆転写ポリメラーゼにより増幅して得られたｃＤＮＡであり得る。
前記試料は、生物学的試料であり、又は生物学的試料から分離されたＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの断片であり得る。具体的には、前記試料は、血液、唾液、尿、糞便、組織、細胞及び生検標本からなる群より選ばれるいずれか１つ以上であり、又は保存された生物学的試料から分離されたＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの断片であり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
前記保存された生物学的試料は、当業界に公知の通常の保存方法に基づいて１週間以上、１年以上、例えば、１年乃至１０年間保存、冷凍保存、又はホルマリンで固定された組織を常温で保存した組織から由来したものであり得る。
本発明において、試料からのＲＮＡ又はＤＮＡの抽出には、当業界に公知の様々な方法を用いることができる。
ｂ）前記一本鎖核酸を製造する段階である。
本発明において、一本鎖核酸は、上述した通りであり、詳しくは、ｉ）Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有し、ｉｉ）遺伝的変異を含む単一標的遺伝子の塩基配列の一部又は全部に相補的結合を行い、ｉｉｉ）両末端又は内部に同一であり又は少なくとも二つの異なる探知可能なマーカーが付されていることを特徴とする。
本発明において、前記探知可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質及び消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ ｇｒｅｅｎ ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ ｇｒｅｅｎ ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ＯＲＮＡｇｅ ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ ６７０及びビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ－１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６－ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３、ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ－Ｓｐ、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－２及びＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであり得るが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
ｃ）遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階である。
本発明において、前記遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体の増幅は、前記得られた標的核酸、前記製造された一本鎖核酸、前記得られた標的核酸と相補的な塩基配列を有するプライマーセット、及び切断試薬と混合した後、伸長反応により行われる。
本発明において、前記切断試薬は、酵素を介した切断が行われることが好ましいが、その他、公知の切断試薬が用いられてもよい。このとき、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、エクソヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼのような酵素により触媒されるＲＮＡ又はＤＮＡの切断の表示のため、「酵素媒介の切断（ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）」との用語を用いる。本発明の好適な実施例において、ハイブリダイズしたプローブの切れ目（ｎｉｃｋ）の生成及び切断は、エンドヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼであるリボヌクレアーゼによって行われることがさらに好ましい。リボヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリダイゼーション鎖からリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の切れ目を生成し、切断させる二本鎖リボヌクレアーゼであることがさらに好ましい。
本発明において、前記切断試薬は、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＶ又はＲＮａｓｅ Ｔ２のＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）であり得るが、これに限定されるものではない。
ｄ）前記増幅された遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体から分離された一本鎖核酸断片の量を測定する段階である。
本発明において、一本鎖核酸断片の量の測定は、様々な検出方法を用いて行うことができる。具体的には、本発明により分離された一本鎖核酸断片の量の測定は、リアルタイム又
は反応が終了した後に行うことが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定により行うことができる。
前記蛍光光度の変化又は化学発光の測定装置としては、当業界に公知の蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）又はパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ＬＢ５０Ｂ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、ライトサイクラー９６（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６）、アプライドバイオシステムズ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００）、又はバイオラッド社のＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）などが使用できるが、これらに限定されない。
本発明により切断された一本鎖核酸断片の量の測定及び検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は探知可能なマーカーの種類に応じて変わることができる。
本発明における一本鎖核酸は、Ｙ部位が切断された後、増幅する段階によって、Ｙ部位の遺伝的変異を区別し易くするので、以降の核酸増幅反応によって突然変異の確認を可能にする。すなわち、本発明の一本鎖核酸において、Ｙ部位と標的核酸の遺伝的変異部位との間にハイブリダイゼーションが形成された場合、Ｙ部位が遺伝的変異部位と正確に相補的結合を行ったときのみ切断され、以降、増幅反応が行われるので、遺伝的変異の有無を明確に確認することができる。具体的に、本発明の一本鎖核酸において、Ｙ部位と標的核酸の遺伝的変異部位がハイブリダイゼーションを形成するようにしたにもかかわらず、Ｙ部位が相補的結合を行わなかった場合は、Ｙ部位が切断されないので、増幅反応が引き起こされず、これは、標的核酸に測定しようとする遺伝的変異がないことを意味する。これに対して、本発明の一本鎖核酸におけるＹ部位と、突然変異されなかった、標的核酸の遺伝的変異が発生する部位とが、ハイブリダイゼーションを形成するようにしたにもかかわらず、Ｙ部位が相補的結合を行わなかった場合は、Ｙ部位が切断されないので、増幅反応が引き起こされず、これは、標的核酸に遺伝的変異があったことを意味する。
本発明において、前記遺伝的変異の検出は、一塩基多型（ＳＮＰ）、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又はｍｉＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の存在を探知することを意味する。
本発明の一実施例において、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、ＤＮＡオリゴ（ＤＮＡｏｌｉｇｏ）－ＤＮＡ－ＲＮＡ－突然変異－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤｒＭＲ２；配列番号３６）を用いてリアルタイムＰＣＲによって確認した（図１９）。
本発明の一実施例において、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、ＤＮＡオリゴ－ＲＮＡ－ＤＮＡ－突然変異－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ｒＤＭＲ２；配列番号３７）を用いてリアルタイムＰＣＲによって確認した（図２０）。
本発明の一実施例において、Ｇ１２Ｄ突然変異細胞株であるＡｓｐｃ－１細胞株及びＫＲ
ＡＳ野生型細胞株であるＨＴ－２９細胞株のｇＤＮＡを、それぞれ濃度別に希釈した後、ｇＤＮＡの濃度によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子の発現有無を、ＤＮＡオリゴ－ＤＮＡ－突然変異－ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＤＮＡオリゴ類型のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄの一本鎖核酸（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤＭｒＤＲ２；配列番号３８）を用いてリアルタイムＰＣＲによって確認した（図２１）。
本発明に用いられやすい伸長反応、すなわち、核酸の増幅反応は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に公知されている。すなわち、前記標的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）又は核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。前記核酸増幅の産物は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
一般に、標的核酸の増幅及び上述した一本鎖核酸の切断による探知を同時に行えるように、反応混合液に標的核酸、一本鎖核酸、核酸増幅反応の構成物、及び切断酵素が含まれる。各増幅反応は、緩衝液条件、プライマー、反応温度、及び一本鎖核酸の切断条件などを、それぞれ個別に最適化させることが必要である。核酸増幅反応と併用して、本発明の検出方法を使用すれば、標的核酸を探知する敏感度と速度が顕著に向上され得る。
一方、本発明の単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸が、癌と関連したＫＲＡＳ、ＥＧＦＲなどの点突然変異の遺伝子を迅速かつ正確に検出及び探知できることが確認されたところ、前記一本鎖核酸は、癌診断用キット又は癌診断用組成物に適用可能であり、リアルタイムで癌を診断して癌発生有無の情報を提供するのに有用に用いられる。
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果についてさらに詳細に説明する。これらの実施例は、専ら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないものではない。
実施例１：１型一本鎖核酸を用いたＡｐｏＥの分析
１型一本鎖核酸を、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ、ＡｐｏＥ）遺伝子の６種の表現型のＥ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４を分析するために用いた。
ヒト１９番染色体に位置したＡｐｏＥ遺伝子は、心血管疾患及びアルツハイマー病と関連した遺伝子である。ＡｐｏＥ遺伝子は、コドン（ｃｏｄｏｎ）１１２（ｃｙｓ／ａｒｇ）、コドン１５８（ｃｙｓ／ａｒｇ）のＤＮＡの一塩基多型（ＳＮＰ）［ゲノムＤＮＡの位置５８６（Ｔ／Ｃ）、７２４（Ｔ／Ｃ）番目］により、三つの対立遺伝子アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）であるＡｐｏＥε２、ＡｐｏＥε３、ＡｐｏＥε４を有し、この対立遺伝子の組合せにより、６種の表現型（Ｅ２／Ｅ２、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ４／Ｅ４、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４）を有するようになる。前記ＡｐｏＥ遺伝子の各６種の表現型を区別するために、５’－末端を、それぞれの蛍光染料（ｄｙｅ）が付着された４種の改善した形態の１型一本鎖核酸を用いて、４－ｐｌｅｘで分析するようにした。既存の分析法では、通常、４－ｐｌｅｘによる分析法の敏感度及び特異度を満たし難かったが、本発明では、これについて満たすべき結果を示した。
詳しくは、ＡｐｏＥ遺伝子のコドン１１２及びコドン１５８の対立遺伝子型に対するＳＮ
Ｐの有無を測定するために、本発明に係る１型一本鎖核酸とプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を、下記表１に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して製造した。ここで、１型一本鎖核酸は、Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有するプローブであって、５’－末端には、それぞれ６－ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｃｙ５を、また各３’－末端にはＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000001
分析のため、韓国細胞株バンクからヒト細胞株ＰＣ３（Ｅ２／Ｅ２）、Ａ５４９（Ｅ３／Ｅ３）、Ｕ９３７（Ｅ４／Ｅ４）を分譲され、これからゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を得た。６種の表現型に対する分析のため、ホモ接合型の表現型は、ＰＣ３（Ｅ２／Ｅ２）、Ａ５４９（Ｅ３／Ｅ３）、Ｕ９３７（Ｅ４／Ｅ４）を用い、ヘテロ接合型の表現型は、各ゲノムＤＮＡの混合型であるＰＣ３＋Ａ５４９（Ｅ２／Ｅ３）、ＰＣ３＋Ｕ９３７（Ｅ２／Ｅ４）、Ａ５４９＋Ｕ９３７（Ｅ３／Ｅ４）を、高濃度で、反応当たり３２ｎｇ（約１０４コピー）で含ませて分析に供した。
前記表１におけるＡｐｏＥ一本鎖核酸１、２、３、４のそれぞれの０．２μＭ、０．１５μＭ、０．１５μＭ、及び０．０７５μＭ、及びＡｐｏＥの順方向及び逆方向プライマーのそれぞれの０．３５μＭの最終濃度の存在下で、前記定量したゲノムＤＮＡ、０．５Ｕ
ＲＮａｓｅ－Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌ、ＧＣリッチ溶液（Ｒｏｃｈｅ社）３μｌ、ヌクレアーゼフリー水で、全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、９５℃で１５秒、６５℃で７０秒で、４５サイクルを行った。これについての結果を、図１に示した。
その結果、一つの反応ウェルにおいて、ＡｐｏＥの各対立遺伝子の組合せの６種に対する分析が可能であることが確認された。これから、先天的突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）のように、全体又は半分だけが突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）された場合、改善したプローブの形態を使用すれば、区別能力に優れたことが確認された。
実施例２：１型一本鎖核酸を用いたＫＲＡＳ突然変異の分析
実施例２－１：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムのＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異の分析
本発明に係る１型一本鎖核酸を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）の有無を測定するために、ＩＤＴに依頼して、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異の一本鎖核酸（１型）、ＫＲＡＳ野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）一本鎖核酸（１型）、ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１３Ｄ突然変異の順方向及び逆方向プライマーを、下記表２に示すように製造した。このとき、製造された一本鎖核酸は、５’－末端にはＨＥＸ、ＦＡＭを、また、３’－末端にはＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000002
測定しようとするＫＲＡＳ遺伝子は、一定期間培養したＨＣＴ－１５細胞株及びＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ（ｔｏｔａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）から検出した。全ゲノムＤＮＡは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｋ１８２０－００）を用いて、各細胞株の５×１０６細胞から抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した。定量した全ゲノムＤＮＡは、１５ｎｇ／μｌで希釈し、１／１０ずつ段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を進行し、１５ｎｇ／μｌ～１．５ｐｇ／μｌ濃度のゲノムＤＮＡを２μｌずつ用いた。ＨＣＴ－１５細胞株は、Ｇ１３Ｄ突然変異細胞株であり、ＮＣＩ－Ｈ１９７５は、ＫＲＡＳ野生型細胞株であることが知られている。
以降、前記製造した配列番号７の１０μＭ濃度のＧ１３Ｄ一本鎖核酸０．３μｌを準備し、配列番号９及び１０の１０μＭ濃度のプライマーは、それぞれ０．５μｌずつ準備した。ここに、０．５Ｕ ＲＮａｓｅ－Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３０ｎｇに、ＨＣＴ－１５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３０ｎｇ、３ｎｇ、３００ｐｇ、３０ｐｇを、それぞれ添加した後、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、Ｇ１３Ｄ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）を測定した。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１０秒、６４℃で６０秒を４０サイクル行い、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（ＨＥＸ）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図２に示した。
実施例２－２：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムのＫＲＡＳ野生型遺伝子の分析
前記実施例２－１と同じ条件で、配列番号８のＫＲＡＳ遺伝子の野生型一本鎖核酸及び配列番号９及び１０のプライマーの存在下で、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３０ｎｇ、３ｎｇ、３００ｐｇ、３０ｐｇ及びＨＣＴ－１５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３０ｎｇ、３ｎｇ、３００ｐｇ、３０ｐｇを、それぞれ添加した後、ＫＲＡＳ野生型遺伝子を測定した。このときの結果は、図３に示した。ＨＣＴ－１５細胞株は、ヘテロ接合型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｔｙｐｅ）の遺伝子であり、Ｇ１３Ｄ突然変異（図２の結果参照）及びＫＲＡＳ野生型遺伝子を同時に保有している細胞株であって、野生型を半分だけ有するときも、図４のような結果が得られる。
実施例２－３：本発明に係る一本鎖核酸を用いたリアルタイムのＫＲＡＳ野生型遺伝子と混合されたＧ１３Ｄ突然変異の分析
測定しようとするＫＲＡＳ遺伝子は、一定期間培養したＨＣＴ－１５細胞株及びＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ（ｔｏｔａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）から検出した。全ゲノムＤＮＡは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｋ１８２０－００）を用いて、各細胞株の５×１０６細胞から抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した。定量したＮＣＩ－Ｈ１９７５ ＤＮＡは、３０ｎｇ／μｌで希釈し、ＨＣＴ－１５ ＤＮＡは、３０ｎｇ／μｌで希釈した後、１／１０ずつ段階希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を進行し、３ｎｇ／μｌ～３ｐｇ／μｌ濃度のＮＣＩ－Ｈ１９７５ゲノムＤＮＡ及びＨＣＴ－１５ゲノムＤＮＡを得た。その後、それぞれのゲノムＤＮＡ２μｌずつを混合し、ＨＣＴ－１５の濃度がＮＣＩ－Ｈ１９７５の濃度に対して１０～０．０１％となるようにして実験に供した。ＨＣＴ－１５細胞株は、Ｇ１３Ｄ突然変異細胞株であり、ＮＣＩ－Ｈ１９７５は、ＫＲＡＳ野生型細胞株であることが知られている。
以降、前記製造した配列番号７の１０μＭ濃度のＧ１３Ｄ一本鎖核酸０．３μｌを使用し、配列番号９及び１０の１０μＭ濃度のプライマーは、それぞれ０．５μｌずつ準備した。ここに、０．５Ｕ ＲＮａｓｅ－Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌ、１０～０．０１％で希釈したＤＮＡを、それぞれ添加した後、３次蒸留水で全体積（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、Ｇ１３Ｄ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）を測定した。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１０秒、６４℃で６０秒を４０サイクル行い、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（ＨＥＸ）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図５に示した。
図２乃至図５に示すように、Ｇ１３Ｄ一本鎖核酸（１型）を用いて、Ｇ１３Ｄ突然変異の検出反応時、ＮＣＩ－Ｈ１９７５野生型ゲノムＤＮＡとの交差反応が引き起こされず、特異性は優れるが、ＨＣＴ－１５ゲノムＤＮＡ６００ｐｇ以下では、不正確に検出されたところ、野生型及び点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）遺伝子が含まれた分析の場合、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が１０％未満で含まれた分析は、困難であることが確認された。
実施例３：２型一本鎖核酸を用いたＡｐｏＥの分析
ＡｐｏＥ遺伝子のコドン（ｃｏｄｏｎ）１１２及びコドン１５８の対立遺伝子型に対するＳＮＰの有無を測定するために、本発明に係る２型一本鎖核酸を用いた。下記表３に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して、２型一本鎖核酸を製造した。
ここで、２型一本鎖核酸の場合、Ｘ－Ｙ－Ｚの構造を有するプライマー及びプローブであって、５’－末端には、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴｅｘａｓＲｅｄを、また、３’－末端にはＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000003
分析のため、韓国細胞株バンクからヒト細胞株ＰＣ３（Ｅ２／Ｅ２）、Ａ５４９（Ｅ３／Ｅ３）、Ｕ９３７（Ｅ４／Ｅ４）を分譲され、これからゲノムＤＮＡを得た。６種の表現型に対する分析のため、ホモ接合型の表現型は、ＰＣ３（Ｅ２／Ｅ２）、Ａ５４９（Ｅ３／Ｅ３）、Ｕ９３７（Ｅ４／Ｅ４）を用い、ヘテロ接合型の表現型は、各ゲノムＤＮＡの混合型であるＰＣ３＋Ａ５４９（Ｅ２／Ｅ３）、ＰＣ３＋Ｕ９３７（Ｅ２／Ｅ４）、Ａ５４９＋Ｕ９３７（Ｅ３／Ｅ４）を、高濃度で、反応当たり３２ｎｇ（約１０４コピー）で含ませて分析に供した。
前記表３におけるＡｐｏＥ一本鎖核酸１、２、３、４のそれぞれの０．３７５μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、及び０．２５μＭの最終濃度の存在下で、前記ゲノムＤＮＡ、０．１ｎｇの耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター ｗ／ｏ ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌ、ＧＣリッチ溶液（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌ、２．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、６２．５ｎＭ Ｌｏｗ ＲＯＸに、ヌクレアーゼフリー水で、全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６４℃で５５秒で、４０サイクルを行った。これについての結果を、図６に示した。
その結果、本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたＡｐｏＥの各対立遺伝子の組合せの６種に対する分析において、コドン１１２の５８６Ｔ変異及びコドン１５８の７２４Ｔ変異は、蛍光染料の差による分析ではなく、同じ蛍光染料による終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）における蛍光値の差により区別できるという制限があった。このような制限により、各ＤＮＡサンプルの濃度に基づく分析結果の判読に問題がある可能性がある。これは、先天的突然変異であるＡｐｏＥの場合、実施例１に示したように、２型一本鎖核酸を用いるよりも、１型一本鎖核酸を用いることが、さらに容易に分析されることを示す。
実施例４：２型一本鎖核酸を用いたＫＲＡＳ突然変異の分析
実施例４－１：本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたリアルタイムのＧ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ突然変異の分析
２型一本鎖核酸を用いて、ＫＲＡＳ遺伝子の１２コドン突然変異における３種（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ）の突然変異（ｍｕｔａｎｔ）の有無を測定した。ＩＤＴに依頼して、本発明に係る一本鎖核酸及びユニバーサル逆方向プライマー（Ｕｎｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、下記表４に示すように製造した。一本鎖核酸は、５’－末端には、ＨＥＸ、ＦＡＭ、Ｃｙ５を、また、３’－末端には、ＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000004
前記合成した一本鎖核酸を用いて、ＫＲＡＳ点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の検出能を確認するために、それぞれ野生型細胞株及び突然変異細胞株を培養し、全ゲノムＤＮＡは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｋ１８２０－００）を用いて、各細胞株の５×１０６細胞から抽出した。一方、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した後、テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用した。使用した細胞株は、下記表５の通りである。
Figure 0007618208000005
以降、前記製造した配列番号１５のＧ１２Ｖ一本鎖核酸及び配列番号１８のプライマーは、１０μＭ濃度の０．５μｌを使用し、５ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）３．６μｌ及び耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ０．２μｌに、Ｃｏｌｏ２０１（ＫＲＡＳ野生型細胞株）３０ｎｇ及びＳＷ６２０（Ｇ１２Ｖ突然変異）細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３ｎｇ、３００ｐｇ、３０ｐｇ、３ｐｇを、それぞれ添加した後、３次蒸留水で
全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、Ｇ１２Ｖ突然変異を測定した。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１５秒、６６℃で３０秒を４０サイクル行って、１次ＰＣＲ反応を行った後、８５℃で１５秒、６４℃で４０秒を４０サイクル行って、２次ＰＣＲ反応を行い、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（ＨＥＸ）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図７に示した。
また、前記製造した配列番号１６のＧ１２Ｃ一本鎖核酸及び配列番号１８のプライマーは、１０μＭ濃度の０．５μｌを使用し、５Ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）２．８μｌ、５Ｘ Ａｐｔａ Ｆａｓｔ ｂｕｆｆｅｒ１．２μｌ、１Ｕ／μｌの耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ０．４μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．５μｌに、Ｃｏｌｏ２０１（ＫＲＡＳ野生型細胞株）７０ｎｇ及びＭＩＡ－Ｐａｃａ２（Ｇ１２Ｃ突然変異）細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ７ｎｇ、７００ｐｇ、７０ｐｇ、７ｐｇを、それぞれ添加し、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｇ１２Ｃ突然変異を測定した。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１０秒、６４℃で６０秒を４０サイクル行い、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（Ｃｙ５）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図８に示した。
また、前記製造した配列番号１７のＧ１２Ｓ一本鎖核酸及び配列番号１８のプライマーは、１０μＭ濃度の０．５μｌを使用し、５ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）３．６μｌ及び１０ｎｇ／μｌの耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ０．２μｌに、Ｃｏｌｏ２０１（ＫＲＡＳ野生型細胞株）３０ｎｇ及びＡ５４９（Ｇ１２Ｓ突然変異）細胞株から抽出した全ゲノムＤＮＡ３ｎｇ、３００ｐｇ、３０ｐｇ、７ｐｇを、それぞれ添加し、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、Ｇ１２Ｓ突然変異を測定した。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１０秒、６４℃で６０秒を４０サイクル行い、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（ＦＡＭ）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図９に示した。
前記図７乃至図９から分かるように、本発明に係る一本鎖核酸は、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）遺伝子が０．０１％未満で含まれた場合も、優れた特異性及び敏感度で突然変異遺伝子を分析することができた。
実施例５：２型一本鎖核酸を用いたＥＧＦＲ突然変異の分析方法
ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、非小細胞肺癌で過剰発現され、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ；ＴＫＩ）の標的となる。このＥＧＦＲ遺伝子のアクソン（Ｅｘｏｎ）１８、１９、２０、２１に該当するチロシンキナーゼ領域（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）で発生する突然変異を分析することにより、非小細胞肺癌患者の治療剤への薬剤反応性が予測できるので、突然変異の分析が患者の薬剤処方と治療に役立つ。このうち、最も使用頻度の高いＴ７９０Ｍ（Ｃ２３６９Ｔ）突然変異に対して突然変異の有無を分析した。
本発明に係る２型一本鎖核酸及びプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を、下記表６に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して製造した。ここで、Ｔ７９０Ｍ一本鎖核酸は、５’－末端にはＦＡＭを、また、３’－末端にはＩＡＢｋＦＱを付着した。一方、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000006
分析のため、Ｔ７９０Ｍ突然変異細胞株であるＨ１９７５及び野生型細胞株であるＡ５４９からゲノムＤＮＡを得た。Ｈ１９７５及びＡ５４９ゲノムＤＮＡは、３０ｎｇ（約１×１０４コピー）で定量後、１０倍ずつ希釈して使用した。
前記表６におけるＴ７９０Ｍ一本鎖核酸０．２５μＭ、Ｔ７９０Ｍプライマー０．２５μＭの最終濃度の存在下で、前記ゲノムＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔの耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、５ｘ ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）３．６μｌを、ヌクレアーゼフリー水で、全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で１０分、９５℃で１５秒、６４℃で６０秒で、４５サイクルを行った。これについての結果を、図１０に示した。
その結果、本発明に係る一本鎖核酸を用いたＥＧＦＲ突然変異の分析において、それぞれの突然変異型を野生型と比較すれば、０．１％以下まで区別が可能であることが確認された。これから、上述した通り、癌の点突然変異のような後天的な突然変異の場合は、２型一本鎖核酸を用いた探知が有利であることが確認された。
実施例６：２型一本鎖核酸を用いたｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ ３４アイソフォームの分析
実施例６－１：本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたリアルタイムのｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡの分析
ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡのうち、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が最も多いことが知られている。このようなｌｅｔ－７のアイソフォームを区別することは、相当難しい分析であり、通常、１％未満の特異度の区別は、特に難しいことが知られている。本実験は、なかでも、ｌｅｔ－７ａ（５’－ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ）及びｌｅｔ－７ｄ（５’－ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ）の遺伝子発現の有無を測定するために、本発明に係る２型一本鎖核酸、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＴ－プライマーを、下記表７に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して製造した。また、正確な定量のため、前記ｌｅｔ－７のｍｉＲＮＡをＩＤＴに依頼して製造した。ここで、一本鎖核酸は、５’末端にはＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）を、また、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧを付着した。一方、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000007
合成したそれぞれの２０ｐＭ濃度のｍｉＲＮＡ １μｌ、Ａｍｂｉｏｎ社のポリ－（Ａ）テーリングキット、Ｒｏｃｈｅ社のＮｘｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（全２０μｌ）を用いて、４５℃で、前記表７におけるそれぞれのＲＴプライマー１０μＭ濃度の１μｌの存在下で、３０分間反応してｃＤＮＡを合成した。
前記合成したｃＤＮＡを１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈した。
前記表７における一本鎖核酸及びプライマーの、それぞれ１０μＭ濃度の０．５μｌの存在下で、前記合成後、希釈したそれぞれのｃＤＮＡ ２μｌ、１Ｕ耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌを入れ、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３～６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、４５サイクルを行った。これについての結果を、図１１及び図１２に示した。
その結果、ｍｉＲＮＡ １ａＭ濃度の希釈したｃＤＮＡ２μｌ（約１コピー）だけを用いて、それぞれのｍｉＲＮＡの分析が可能であることが確認された。
実施例６－２：本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたリアルタイムのｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡの特異度の検出
前記表７における一本鎖核酸及びプライマーの、それぞれ１０μＭ濃度の０．５μｌの存在下で、１ｐＭ濃度のｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡ ２μｌに、１／１０ずつ１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈したｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡ ２μｌを添加し、１Ｕ耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌを入れ、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５分、６３～６４℃で６０秒、９５℃で１０秒であり、４５サイクルを行った。これについての結果を、図１３に示した。
その結果、１ｐＭ濃度のｌｅｔ－７ｄ ｃＤＮＡ ２μｌに、１／１０ずつ１００ｆＭから１ａＭの濃度まで希釈したｌｅｔ－７ａ ｃＤＮＡ ２μｌずつを添加した実験群において、１００ｆＭから１ｆＭの濃度までは、安定的に分析できることが確認された。これは、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のｍｉＲＮＡを、０．１％まで特異度を維持しながら分析できることを示す。
実施例６－３：本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたリアルタイムのｍｉＲＮＡ ３４ａ、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ、及びｍｉＲＮＡ ３４ｃの分析
ｍｉＲＮＡ ３４は、３種のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）があるが、これらのアイソフォームを区別することが、相当難しいことが知られている。本実施例では、ｍｉＲＮＡ ３４ａ、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ、及びｍｉＲＮＡ ３４ｃの遺伝子発現の有無を測定するために、表８に示すように、ＩＤＴに依頼して、一本鎖核酸、プライマー、ＲＴ－プライマーを合成及び製造した。一本鎖核酸は、５’末端にはＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）及びＨＥＸ（ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を、また、３’末端には３ＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000008
それぞれのｍｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のポリ－（Ａ）テーリングキット、Ｒｏｃｈｅ社のＮｘｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（全２０μｌ）を用いて、４０℃で、ＲＴプライマー１０μＭ濃度の１μｌの存在下で、６０分間反応してｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを１ｐＭから１ａＭの濃度（約１０６～１００コピー）まで、７つの濃度
を１／１０ずつ希釈し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、それぞれの合成ｃＤＮＡ、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）、一本鎖核酸、プライマーを入れ、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、反応条件は、９５℃で５分、９５℃で１０秒、６５℃で１分で、４５サイクルを行った。
その結果、ｍｉＲＮＡ ３４ａ、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ、及びｍｉＲＮＡ ３４ｃはいずれも、１ｐＭから１０ａＭの濃度（約１０６～１０１コピー）まで、正常のＰＣＲ効率で測定が可能であることが確認された。これについての結果は、図１４乃至図１６に示した。
実施例６－４：本発明に係る２型一本鎖核酸を用いたリアルタイムのｍｉＲＮＡ ３４ａ、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ、及びｍｉＲＮＡ ３４ｃの特異度の検出
上記した実施例６－３において、ｍｉＲＮＡ ３４ａ、ｍｉＲＮＡ ３４ｂ、及びｍｉＲＮＡ ３４ｃの一本鎖核酸が、それぞれのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を区別できることが確認され、本実施例では、増幅しようとするｍｉＲＮＡが、他のアイソフォームのｍｉＲＮＡと混ぜているとき、どんな割合で、所望のアイソフォームを区別することができるかを確認した。１０８（１００ｐＭ）ｍｉＲＮＡ ３４ａ又はｍｉＲＮＡ ３４ｂのアイソフォームに、１０７から１０４又は１０３（１０ｐＭ～１０ｆＭ又は１０ｐＭ～１ｆＭ）の濃度まで、１/１０ずつ希釈したｍｉＲＮＡ ３４ｃを混合し、ｍｉＲ－３４ｃの一本鎖核酸及びプライマーを用いて、特異度の検出をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で進行した。
ＰＣＲは、それぞれの合成ｃＤＮＡ、耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ ＤＮＡマスター（Ｒｏｃｈｅ社）、一本鎖核酸、プライマーを入れ、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整し、反応条件は、９５℃で５分、９５℃で１０秒、６５℃で１分で、４５サイクルを行った。
これについての結果は、図１７乃至図１８に示した。
その結果、ｍｉＲＮＡ ３４ｃが、アイソフォームを、最大で０．００１％まで特異度を維持して、区別が可能であることが確認された。
実施例７：一本鎖核酸の構造による分析方法
本発明に係る一本鎖核酸（２型）の突然変異の検出時、特異性を高くするために、Ｇ１２Ｄの三つの類型、具体的に一本鎖核酸のリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の位置に応じて、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）の検出能を調べるために、Ｒ１ＤｒＭＲ２、Ｒ１ｒＤＭＲ２、Ｒ１ＤＭｒＤＲ２の類型を、下記表９に示すように、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して製造した。それぞれの一本鎖核酸の５’－末端にはＦＡＭを、また、３’－末端には３ＩＡＢｋＦＱを付着した。また、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
Figure 0007618208000009
実施例７－１：Ｇ１２Ｄ一本鎖核酸の類型（Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤｒＭＲ２、Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ｒＤＭＲ２、Ｇ１２Ｄ－Ｒ１ＤＭｒＤＲ２）によるＧ１２Ｄ突然変異遺伝子及びＫＲＡＳ野生型遺伝子の分析
一本鎖核酸の配列番号３６乃至３８及びプライマー配列番号１８を、１０μＭ濃度の０．５μｌずつ準備し、０．５Ｕ ＲＮａｓｅ Ｈ、ＡｐｔａＴａｑマスター（Ｒｏｃｈｅ社製）３．６μｌ、Ａｓｐｃ－１（Ｇ１２Ｄ突然変異型）及びＨＴ－２９（ＫＲＡＳ野生型）から抽出した全ゲノムＤＮＡ３０ｎｇを添加した後、３次蒸留水で全体積が２０μｌとなるように調整した後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。このとき、反応条件は、９５℃で１０分間、初期変性後、９５℃で１０秒、６４℃で６０秒を４５サイクル反応し、サイクル毎にリアルタイムでシグナル（ＦＡＭ）を測定し、結果を導出した。それについての結果を、図１９乃至図２１に示した。
一本鎖核酸の三つの構造に応じて、ＫＲＡＳ野生型遺伝子に対する特異性において異なる結果を示すが、三つの構造はいずれも、点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）の区別が可能であることが確認された。

Claims (3)

  1. 単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用キットであって、
    前記標的遺伝子が、ＡｐｏＥであり、
    前記キットは、
    （ｉ）配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３乃至６の一本鎖核酸、並びに酵素、又は、
    （ｉｉ）配列番号１１乃至１４の一本鎖核酸、及び酵素、
    を含み、
    前記酵素は、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＶ又はＲＮａｓｅ Ｔ２のＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ， ＲＮａｓｅ）である、キット。
  2. 単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法であって、
    前記標的遺伝子が、ＡｐｏＥであり、
    ａ）生物学的試料から検出しようとする遺伝的変異を含む標的核酸を得る段階であって、前記遺伝的変異が一塩基多型である段階と、
    ｂ）（ｉ）配列番号１及び２のプライマーセット並びに配列番号３乃至６の一本鎖核酸、又は、（ｉｉ）配列番号１１乃至１４の一本鎖核酸、を製造する段階と、
    ｃ）上記（ｉ）の場合、前記段階ａ）で得られた標的核酸、及び、前記段階ｂ）で製造された配列番号３乃至６の一本鎖核酸、前記段階ａ）で得られた標的核酸と相補的な塩基配列を有する配列番号１及び２のプライマーセット、並びに切断試薬と混合した後、伸長反応により遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階、又は、
    上記（ｉｉ）の場合、前記段階ａ）で得られた標的核酸、及び、前記段階ｂ）で製造された配列番号１１乃至１４の一本鎖核酸、並びに切断試薬と混合した後、伸長反応により遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体を増幅させる段階と、
    ｄ）前記段階ｃ）で増幅された遺伝的変異を含む標的核酸－一本鎖核酸複合体から分離された一本鎖核酸断片の量を測定する段階と、を含み、
    前記段階ｃ）の切断試薬は、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、Ｒ
    Ｎａｓｅ ＩＶ又はＲＮａｓｅ Ｔ２のＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ， ＲＮａｓｅ）である、単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法。
  3. 前記段階ａ）の遺伝的変異を含む標的核酸は、試料から検出しようとするＲＮＡ若しくはＤＮＡであり、又は前記ＲＮＡを逆転写ポリメラーゼにより増幅して得られたｃＤＮＡである、請求項２に記載の単一標的遺伝子の遺伝的変異検出方法。
JP2020529301A 2020-02-28 2020-04-10 単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 Active JP7618208B2 (ja)

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