JP7618287B2

JP7618287B2 - 医薬の製造におけるＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦの使用

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Publication number: JP7618287B2
Application number: JP2023127560A
Authority: JP
Inventors: リーピンヤン，; シャオホンチェン，; ルイシュエンジャ，; ティエンフージャン，; ファンジャン，; チャオリーゾン，; サイチャオフー，; ティエンヨンシー，; ダンダンハオ，; シャンウェイジァン，; ホンジェペイ，; シュドンワン，; ルーインゾン，
Original assignee: Chigenovo Co Ltd
Current assignee: Chigenovo Co Ltd
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2023-08-04
Publication date: 2025-01-21
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN113260704A; JP2023139317A; EP4074828B1; EP4074828A1; EP4074828A4; JP2025041881A; JP2023506458A; JP7495756B2; CN113260704B; US20230146121A1; EP4268895A3; US20240024433A1; WO2021114662A1; EP4268895A2; EP4074828C0

Description

本願は生物医薬分野に関し、具体的には医薬の製造におけるＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦの使用に関する。

結晶性網膜変性（Ｂｉｅｔｔｉ’ｓｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＢＣＤ）は、角膜の結晶（透明カバー）、網膜の光感受性組織に沈着した微細、黄色、または白色の結晶質の沈着、および網膜、脈絡膜毛細血管、および脈絡膜の進行性萎縮を特徴とする網膜変性のまれな疾患である。沈着物によって網膜が損傷され、視力が徐々に失われる。結晶性網膜変性の人は、典型的には１０代から２０代の間に視力障害を感じ始め、それぞれの眼の視力障害が異なるペースで悪化することがある。症状の重症度や進行は、同じ家族内でも個人によって大きく異なるが、ほとんどの人は４０歳または５０歳までに失明する。世界中で６７，０００人に１人が結晶性網膜変性を有すると推定され、東アジア人、特に中国人と日本人で多くみられる。

現在の研究により、ＢＣＤは常染色体劣性遺伝疾患であり、しかもＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の突然変異による引き起こし、現在国内外のＢＣＤ患者の遺伝子研究中にすでにＣＹＰ４Ｖ２の多数の遺伝子突然変異部位を発見した。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子はシトクロムＰ４５０スーパーファミリー中の蛋白質の一つであり、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子コード蛋白は脂肪酸代謝の過程に参与し、結晶性網膜変性中のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子突然変異は脂肪酸代謝に参与する酵素機能を破壊し、それによる脂質の分解に影響したと思われる。しかしながらＣＹＰ４Ｖ２がどのようにＢＣＤの特異的な徴候および症状を引き起こすかは不明である。現在ＢＣＤの治療は主に網膜色素変性（ＲＰ）の治療方法を参考し、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子突然変異の研究が未来の遺伝子治療に可能を提供したが、現在まだ有効な治療方法がない。

本願は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防のための医薬の製造における、ＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦの使用を提供する。

いくつかの実施形態では、前記疾患または状態は結晶性網膜変性を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２はヒトＣＹＰ４Ｖ２である。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６～８２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦはヒトＲｄＣＶＦである。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３～８９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記医薬は、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは異なるベクターに位置する。

いくつかの実施形態では、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは同一のベクターに位置する。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターを含む。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターはＡＡＶベクターを含む。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、さらに、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは、さらに、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはさらに自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドと前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する。

いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドはＰ２Ａを含む。

いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは５’～３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリアデニレーションシグナル部位。

いくつかの実施形態では、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリアデニレーションシグナル部位；または、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリアデニレーションシグナル部位。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはイントロンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記イントロンは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記イントロンは、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド中に位置するか、または、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記イントロンは、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド中に位置するか、または、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：９０～１１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

本願はまた、網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防のためのベクターの組み合わせを提供し、前記ベクターの組み合わせは第１ベクターと第２ベクターを含み、前記第１ベクターはＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第２ベクターはＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第１のベクターは、さらに、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記第２のベクターは、さらに、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記第一ベクターはさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記第２ベクターはさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記第１ベクターは５’から３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、および前記ポリアデニレーションシグナル部位；および／または、前記第２ベクターは５’から３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記コードＲｄＣＶＦのポリヌクレオチド、および前記ポリアデニレーションシグナル部位。

いくつかの実施形態では、前記第１ベクターおよび／または前記第２ベクターはさらにイントロンを含む。

いくつかの実施形態では、第１のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０～９５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含み、および／または、前記第２ベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：９６～１００のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

本願はまた、１種または多種の単離された核酸分子を提供し、該核酸分子はａ）ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、およびｂ）ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、さらに、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’末端に位置し、かつ前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、さらに、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’末端に位置し、かつ前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子はＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよびＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子はさらに自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドと前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する。

いくつかの実施形態では、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子はさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子はさらにポリアデニレーションシグナル部位を含み、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの３’端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、５’から３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリアデニレーションシグナル部位。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、さらにイントロンを含む。

いくつかの実施形態では、イントロンは、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド中に位置するか、またはＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’末端に位置する。

いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１～１１５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

本願は、さらに、本願に記載の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターはＡＡＶベクターを含む。

本願は、さらに、本願に記載の核酸分子または本願に記載のベクターを含む細胞を提供する。

本願はまた医薬組成物を提供し、該医薬組成物は本願の前記核酸分子、本願の前記ベクターおよび／または本願の前記細胞を含む。

本願はまた本願に記載する核酸分子、本願に記載するベクター、または本願に記載する細胞の、医薬の製造における使用を提供し、前記医薬は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防に用いる。

当業者は、本願の他の態様及び利点について、以下の詳細な説明から容易に洞察することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が認識するであろうように、本願の内容は、当業者が、本願に係る発明の精神及び範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にするものである。したがって、本願の添付図面及び明細書の記載は単なる例示であり、限定的なものではない。

本願に係る発明の具体的な特徴は、特許請求の範囲に記載のとおりである。本願で詳細に説明される例示的な実施形態及び添付図面を参照することによって、本願に係る発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。添付図面の概略説明は以下のとおりである。

本願における異なるＣＹＰ４Ｖ２プロモーターの発現効果を示す。本願におけるＣＡＧ、ＥＦ１ａ、ＯＰＥＦＳおよびＥＦＳプロモーターの発現効果を示す。本願におけるプロモーター後結合イントロンの発現増強作用を示す。本願におけるプロモーター後結合イントロンの発現増強作用を示す。本願中の発現ベクターの異なるＰｏｌｙＡシグナル部位の選択による目的遺伝子発現への影響を示す。本願のＣＹＰ４Ｖ２、ＲｄＣＶＦ遺伝子を含む発現ベクターの２９３Ｔ細胞における発現を示す。本願のＣＹＰ４Ｖ２、ＲｄＣＶＦ遺伝子を含む発現ベクターのＡＲＰＥ－１９細胞での発現を示す。本願における異なる血清型のＡＡＶウイルスによるマウス網膜への感染を示し、両矢印はＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現範囲を示す。本願のＲＰＥ細胞の作製過程で蛍光顕微鏡で観察された腎上皮細胞、ＩＰＳＣ細胞、ＲＰＥ細胞の形態を示す。１０Ａは、本願におけるウイルス力価がヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞の死亡に与える影響を示し、１０Ｂ、１０Ｃはそれぞれウイルス力価がヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞における炎症性サイトカインＮＬＲＰ３、ＴＮＦ－αの発現状況に与える影響を示し、１０Ｄは異なるウイルス力価条件下でヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞における目的遺伝子の発現状況を示した。ヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞に本願の異なるウイルスを感染させた場合のＣＹＰ４Ｖ２、ＲｄＣＶＦの発現状況を示す。異なるプロモーターとＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含むウイルス処理のＢＣＤマウスの眼底結晶沈着に及ぼす影響を示す。異なるプロモーターとＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含むウイルス処理のＢＣＤマウスの眼底結晶沈着に及ぼす影響の統計的結果を示す。異なるプロモーターとＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含むウイルス処理のＢＣＤマウスにおけるＣＹＰ４Ｖ２免疫蛍光染色の結果を示す。本願においてＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含む異なる用量のウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の眼底結晶沈着状況に対する影響を示す。本願においてＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含む異なる用量のウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の眼底結晶沈着状況に対する影響の統計結果を示す。本願においてＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を含む異なる用量のウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＮＬＲＰ３の発現レベルに対する影響を示す。本願においてＢＣＤマウスを異なるウイルスで処理した後の眼底結晶沈着状況への影響を示す。本願においてＢＣＤマウスを異なるウイルスで処理した後の眼底結晶沈着状況への影響の統計的結果を示す。本願において異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の網膜機能（網膜電図検査（ＥＲＧ））への影響を示す。本願において異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後のＣＹＰ４Ｖ２、ＲｄＣＶＦの免疫蛍光染色結果を示す。本願において異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後のＲＰＥ細胞の数および形態への影響を示す。本願において異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後のＲＰＥ細胞数への影響の統計結果を示す。本願においてプロモーター後にイントロンを含まない異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の網膜機能（網膜電図検査（ＥＲＧ））への影響を示す。本願においてｐ１プロモーターの異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の網膜機能（網膜電図検査（ＥＲＧ））への影響を示す。本願においてＷＰＲＥ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナル部位の異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の網膜機能（網膜電図検査（ＥＲＧ））への影響を示す。本願においてシグナル部位を含まない異なるウイルスでＢＣＤマウスを処理した後の網膜機能（網膜電図検査（ＥＲＧ））への影響を示す。

以下では、特定の具体的な実施形態を用いて本願発明の実施形態を説明するが、当業者は、本願で開示されることにより、本願発明の他の利点及び効果を容易に理解され得る。

以下では、本願についてさらに説明する：本発明において、特に明記されていない限り、本願で使用される科学技術用語は、当業者にとって一般的に理解され得る意味を有する。さらに、本明細書で使用されるタンパク質及び核酸化学、分子生物学、細胞及び組織培養、微生物学、免疫学に関する用語及び実験手順は、それぞれの分野で広く使用されている用語及び日常的な手順である。また、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。

本願では、「単離された」という用語は、通常、自然の状態から人為的に得られたものを指す。もし自然界にある「単離」の物質或いは成分が出現すれば、それが置かれた自然環境に変化が発生したか、あるいは自然環境からその物質を単離したか、あるいはその両方が発生した可能性がある。例えば、ある生体動物体内にはある種の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然に存在し、この自然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドを単離したと称する。「単離された」という用語は、人工または合成が混在する物質、または物質の活性に影響しないその他の不純物の存在を排除しない。

本願では、「単離された核酸分子」という用語は、通常、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドの任意の長さの単離形式、またはその自然環境から単離され、または人工的に合成された類似物を指す。

本願では、「ＣＹＰ４Ｖ２」という用語は、通常、チトクロームＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２であるタンパク質を指す。シトクロムＰ４５０はｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０あるいはＣＹＰ４５０とも呼ばれ、通常に１種類の鉄ヘム蛋白ファミリーを指し、モノオキシゲナーゼの１種類に属し、内因性物質あるいは医薬、環境化合物を含む外因性物質の代謝に参与する。アミノ酸配列の同源程度によって、そのメンバーはファミリー、サブファミリーと酵素個体の三級に分けられる。チトクロームＰ４５０酵素系はＣＹＰと略記することができ、その中、ファミリーはアラビア数字で表示され、サブファミリーは大文字の英字で表示され、酵素個体はアラビア数字で表示され、例えば、本願中のＣＹＰ４Ｖ２。ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＨＧＮＣ：：２３１９８）は全長１９．２８ｋｂであり、４ｑ３５に位置し、１１個のエクソンを有し、脂肪酸代謝において重要な役割を果たす（ＫｕｍａｒＳ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、２０１１、７：３６０－３６５）。ＣＹＰ４Ｖ２はほぼ全ての組織で発現するが、網膜および網膜色素上皮では高レベルで発現し、角膜、組織ではやや低レベルで発現する一方、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異はＢＣＤを引き起こす可能性がある（Ｌｉら，ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ。７４：８１７－８２６，２００４）。

本願では、用語「ＲｄＣＶＦ」はまた杆体細胞性錐体細胞成長因子（Ｒｏｄｄｅｒｉｖｅｄｃｏｎｅｓｕｒｖｉｖａｌｆａｃｔｏｒ）と呼ばれ、通常、チオール酸化還元酵素活性がない切断型チオレドキシンを指す。ＲｄＣＶＦは、レチノイド１（ｎｕｃｌｅｏｒｅｄｏｘｉｎ－ｌｉｋｅ１、Ｎｘｎｌ１）遺伝子のスプライス変異体であり、この遺伝子の追加スプライス産物は、ＲｄＣＶＦＬであり、ＲｄＣＶＦＬは、その結合リガンドである微小管関連タンパク質ＴＡＵを酸化および凝集から保護する、活性チオレドキシンである（Ｅｌａｃｈｏｕｒｉら、２０１５およびＦｒｉｄｌｉｃｈら、２００９）。Ｎｘｎｌ１遺伝子欠損マウスは年齢依存性の桿体視細胞と錐体視細胞の機能喪失と錐体視細胞の退行性変化を示すことができ、また桿体視細胞と錐体視細胞の酸化ストレスに対する過敏反応（Ｃｒｏｎｉｎら、２０１０）Ｎｘｎｌ１の発現は杆体視細胞依存性であることができ、網膜色素変性（ＲＰ）における桿体視細胞死後に有意に減少する（Ｄｅｌｙｆｅｒら、２０１１；Ｒｅｉｃｈｍａｎら、２０１０）。ＲｄＣＶＦは、いくつかの異なる遺伝子型（Ｂｙｍｅら，２０１５；Ｌｅ’ｖｅｉｌｌａｒｄら、２００４；Ｙａｎｇら、２００９）の網膜色素変性（ＲＰ）モデルにおいて錐体細胞機能を保護することができる。ＲｄＣＶＦ分子は、光受容細胞によるグルコースの吸収を促進し、光受容細胞の生存を維持するシグナルペプチドとして細胞外に分泌される。１遺伝子はヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ラット、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、カエルで保存されている。ヒトではＮｘｎｌ１はＴｘｎｌ６とも呼ばれ、Ｎｘｎｌ１は１９ｐ１３．１１に位置し、２つのエクソンを含む。Ｎｘｎｌ１は、水晶体、網膜、胃、腎臓、心臓、結腸、および脾臓などのヒト組織で普遍的に発現し、水晶体および網膜では比較的高いレベルで発現する。

本願では、「プロモーター」という用語は、通常、特定の遺伝子を転写させるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を指す。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼによって認識され、ＲＮＡの転写合成を開始する。リボ核酸（ＲＮＡ）合成においては、プロモーターは遺伝子転写を制御する転写因子と相互作用を起こし、遺伝子発現（転写）の開始時期と発現の程度を制御する。プロモーターはコアプロモーター領域とコントロール領域を含み、遺伝子発現をコントロールするコントロール配列の中、遺伝子転写開始部位の上流（ＤＮＡアンチセンス鎖の５’方向）に位置し、それ自身はコンパイル機能がない。その作用方式と機能によって三種類に分けられる：構成的プロモーター（ほとんどまたは全ての組織で持続的な活動を維持する）、特異的プロモーター（組織特異性または発生期特異性）と誘導性プロモーター（外界の化学的あるいは物理的な信号によって制御されている）。

本願では、「作動可能に連結された」という用語は、一般に、符号化配列の表現を可能にするために、符号化配列の表現に必要な制御配列を、符号化配列に対して適切な位置に配置することを指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列との機能関係にあるとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、発現ベクター中のコード化配列および転写制御要素の配列を表すことができる。前記制御デバイスはプロモーター、増強子と終止デバイスを含む。Ｎｘｎｌ１遺伝子はヒト、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ラット、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、カエルで保存されている。いくつかの実施形態では、「作動可能に連結された」という用語は、さらに、ベクター内の転写および翻訳制御配列が目的遺伝子の転写および翻訳を調節する期待される機能を発揮するように、目的遺伝子がベクター内に連結されていることを指す場合がある。

本願では、用語「自己切断ペプチド」は、２Ａペプチド（２Ａｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ）とも呼ばれ、通常１８～２２個アミノ酸残基のペプチド断片であり、細胞内に２Ａペプチドを含む組換え蛋白の自己スプライシングを誘導できる。２Ａペプチドは通常、ウイルスゲノムの２Ａ領域に由来する。遺伝子操作において、２Ａペプチドは一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から翻訳したペプチド鎖をいくつかの独立したペプチド鎖に分けることができる。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質を別々に発現させる必要がある場合（例えば、１つのタンパク質が核に入り、もう１つのタンパク質が細胞質に発現する必要がある。）、ベクター上に１つのオープンリーディングフレームのみを構築したい場合、それらのコード領域に１段の２Ａペプチド配列を挿入することによって実現することができる。いくつかの実施形態では、２つの蛋白融合後の融合蛋白が機能しなければ、２つの蛋白のコード領域の中間に１段の２Ａペプチドをコードする配列を挿入することができ、または結合ペプチドを２Ａペプチドに取り替え、翻訳完成後の２つの蛋白を分離させ、独立に折り畳み、これによって２つの蛋白の機能を回復させる可能性を提供する。２ＡペプチドはＰ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａを含むことができ、それらはすべて起源のウイルスに命名される。その中のＰ２ＡはＰｏｒｃｉｎｅｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓの２Ａペプチドから由来する。

本願では、用語「ポリアデニレーションシグナル配列」は、ポリアデニレーションシグナルテール、ＰｏｌｙＡテールとも呼ばれ、通常、転写されたｍＲＮＡの３’端に数十から数百の単一アデニル酸鎖を加えたものを指す。ポリアデニル化は通常、核内でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）がリボ核酸（ＲＮＡ）に転写される過程と、その反応がポリアデニル酸ポリメラーゼによって完了する過程で起こる。真核生物の中で、ポリアデニル化は１種の機序で、ｍＲＮＡ分子をその３’端で中断させることができ、ポリアデニル酸序列はｍＲＮＡを核酸エキソヌクレアーゼの攻撃から保護することができ、しかもｍＲＮＡの細胞核の輸出、翻訳と安定性に対するすべて非常に重要である。

本願では、用語「ポリアデニレーションシグナル部位」は通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’端に位置するポリアデニル化関連切断因子に識別される塩基配列を指す。通常はｍＲＮＡ上の順行性調節シグナルでもある。一般的に、尾を付ける過程（ポリアデニル化）は転写終了後から始まり、ポリアデニル化関連切断因子はポリアデニレーションシグナル部位のコントロール下で、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの後に数十から数百個の単一アデニル酸を加える。一般的なテール信号には、ＳＶ４０、ＢＧＨ、ＨＳＶ、ＴＫ信号などがある。前記ポリアデニル化関連分解因子は分解／ポリアデニル酸特異性因子（ＣＰＳＦ）、分解刺激因子（ＣｓｔＦ）、分解因子Ｉ（ＣＦＩ）、分解因子ＩＩ（ＣＦＩＩ）を含む。ポリアデニレーションシグナル部位は、典型的にはＡＡＵＡＡＡ配列を含むことができるが、真核生物群間で異なる。例えば、ほとんどのヒトのポリアデニレーションシグナル部位はＡＡＵＡＡＡ配列を含むが、この配列は植物や真菌では稀である。

本願では、「イントロン」という用語は、ＲＮＡ転写物から、配列（エクソン）の両端のいずれかの端をつなぎ合わせることによって取り除かれたＤＮＡ断片を含むことができる。イントロンは通常、遺伝子のタンパクコード領域内の干渉配列と考えられ、通常は遺伝子が産生するタンパクによって表される情報を含まない。

本願では、「ベクター」という用語は、通常、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入され、その中でタンパク質が発現し得る核酸送達ビヒクルを指す。ベクターは形質転換、形質転換または宿主細胞へのトランスフェクションにより、宿主細胞内で遺伝子を発現させる。例えばベクターには次のようなものがある：プラスミド；バクテリオファージ；コスプラスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体；ファージはλファージやＭ１３ファージ、ウイルスベクターなどである。１種のベクターは多種の発現を制御する要素を含み、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含む。また、ベクターは複製開始部位を含み得る。また、ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質シェルなど、細胞への侵入を補助する成分を含み得るが、これらの物質だけに限定されるものではない。

本願では、「ウイルスベクター」という用語は、一般に、遺伝子送達ベクターとして機能し、ウイルスカプシド内にパッケージングされた組換えウイルスゲノムを含む非野生型組換えウイルス粒子を指す。ベクターとして用いられる動物ウイルスの種類は逆転写酵素ウイルス（スローウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、乳頭腫ウイルス、乳頭腫空胞ウイルス（例えばＳＶ４０）を含むことができる。

本願では、「ＡＡＶベクター」という用語は、アデノ随伴ウイルスベクターとも呼ばれ、通常はアデノウイルス自体またはその誘導体を指す。アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）は通常微小ウイルス科に属する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶゲノムはＤＮＡ鎖の両端の逆末端反復配列（ＩＴＲ）と２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができる。オープンリーディングボックスは、ｒｅｐ及びｃａｐを含むことができる。ｒｅｐはＡＡＶのライフサイクルに必要なＲｅｐ蛋白質をコードする複数の重複遺伝子からなり、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含むことができるカプシド蛋白質をコードする重複ヌクレオチド配列を含む。前記カプシド蛋白質は相互作用してカプシドを形成する。アシスタントウイルスが欠如している場合、ＡＡＶは、潜伏状態からアシスタントウイルス（Ｋｏｔｉｎら、１９９０）が救済されるまで、ヒト第１９染色体の特定の座位（ＡＡＶＳ部位）にそのゲノムを統合することができる。一般にＡＡＶは不整合の形が主体と考えられている。ＡＡＶの部位特異性の整合能力、その自然欠陥及びその免疫原性が低いため、理想的な遺伝子治療ベクターになる。ＡＡＶには多くの一般的な血清型があり、１００種類以上のウイルスの変種がある。本願では、ＡＡＶカプラ、ＩＴＲおよび他の選択されたＡＡＶコンポーネントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８およびＡＡＶＡｎｃ８０、既知または言及されているＡＡＶの任意の変種、または発見されていないＡＡＶまたはその変種または混合物を含むがこれらに限定されない任意のＡＡＶから選択される。

本願では、用語「細胞」は、通常、核酸分子またはベクターの受容体であるか、あるいはすでにある単一の細胞、細胞株、または細胞培養である。細胞は、本願に記載の核酸分子または本発明に記載のベクターを含むことができる。細胞は単一細胞の子孫を含み得る。自然突然変異、偶発突然変異、または意図的突然変異のために、子孫が必ずしも始原母細胞と同一でなくてもよい（全ＤＮＡ相互補体の形態学的またはゲノム的）。細胞は、本願に記載のベクターを用いてｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた細胞を含み得る。細胞は細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞あるいは他の真核細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞あるいは骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

本願では、「医薬組成物」という用語は、通常、人のような患者に投与するのに適した組成物に関する。例えば、本願に記載された医薬組成物は、本願に記載された核酸分子、本願に記載されたベクターおよび／または本願に記載された細胞、および任意に選択された薬学的に許容されるアジュバントを含むことができる。そのほか、前記医薬組成物はまた１種または多種（薬学的に有効な）のベクター、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤および／または防腐剤の適当な製剤を含むことができる。組成物の受容可能な成分は使用用量と濃度でレシピエントに無毒である。本発明の医薬組成物は液体、冷凍と凍結乾燥組成物を含むがそれに限定されない。

本願では、「予防」という用語は、一般に、ある疾患又は状態の発生を予防するために、健康な被験者に対して予防的に投与される組合せを意味する。それは、さらに、治療対象のアレルギー疾患の前段階にある患者への予防的投与の組み合わせを含むことができる。「予防」は、疾病又は障害の発生の可能性を１００％排除する必要はなく、言い換えれば、「予防」は、通常、前記投与の組み合わせの存在下で疾病又は障害の発生の可能性が低下することを意味する。

本願では、「緩解する」という用語は、特定の病状、疾患、状態、または表現型の減少、縮小、または遅滞を意味する。前記病状、疾病、病状または表現型は被験者が主観的に感じる例えば疼痛、眩暈またはその他の生理性障害、または医学的に検出できる指標、例えば医学検査手段によって検出される病巣状況を含むことができる。

本願では、「治療」という用語は、臨床病理学的過程において、処置された個人または細胞の自然経過を変化させるために用いられる臨床的介入を一般的に指す。病状の改善、病変の消失、または予後の改善が含まれることがある。

本願では、「網膜色素上皮（ＲＰＥ）」という用語は、通常、網膜感覚神経の外側に付着している色素細胞の層を指す。網膜色素上皮は単層の六角形細胞からなり、内部には色素顆粒が密集している。網膜色素上皮（ＲＰＥ）はその下の脈絡膜とその上の網膜神経細胞と緊密に連結し、その主要な機能は以下を含む：網膜下隙間の液体と栄養を制御し、血液－網膜関門の機能を果たす。合成成長因子による局所構造の調整；光を吸収し、電気バランスを調整する；視物質の再生と合成；光受容器の外節の貪食と消化；網膜の付着を維持する；損傷後の再生と修復。ＲＰＥは光受容体機能を維持する重要な組織であり、同時に脈絡膜と網膜の多くの病変に影響される。

本願では、「網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮」という用語は通常、細胞死または機能不全を示す網膜色素上皮（ＲＰＥ）の変性変化を指す。加齢黄斑変性または網膜色素変性（ＲＰ）は、しばしば網膜色素上皮の萎縮を伴う。網膜色素変性（ＲｅｔｉｎｉｔｉｓＰｉｇｍｅｎｔｏｓａ、ＲＰ）は網膜色素病変とも呼ばれ、通常遺伝性眼科疾患を指す。遺伝形式は常染色体劣性、優性、Ｘ連鎖の３つであり、二遺伝子型およびミトコンドリア型も存在する。初期によくみられる徴候は、夜盲症、視野の狭小化、正面の景色が見え、左右にわずかに偏位した視野が見えなくなることなどである。ＲＰには、単眼性の原発性網膜色素変性、象限性の原発性網膜色素変性、中心性または傍中心性の原発性網膜色素変性、無色素性網膜色素変性による白色点状網膜変性、結晶性網膜変性、静脈内の肥厚性網膜色素変性、細動脈の傍色素上皮の保持性網膜色素変性、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障およびその他の症候群における網膜色素変性などがある。

本願では、「結晶性網膜変性」という用語は、通常、１９３７年にイタリアの眼科医ＧＢＢｉｅｔｔｉ博士によって最初に記述された常染色体劣性眼疾患を指す。主な症状には、角膜内の結晶（透明カバー）、網膜の感光性組織内に沈着した小さく黄色または白色の結晶性の沈着、網膜、脈絡膜毛細血管、および脈絡膜の進行性萎縮などがある。結晶性網膜変性には、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の突然変異に起因する疾患が含まれることがある。

本願では、「含む」又は「含む」という用語は、一般に、他の要素を除外することなく、明確に特定された特徴を含むことを意味する。

本願では、「約」という用語は、通常、指定値以上０．５％～１０％の範囲での変動を意味し、例えば、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％の範囲での変動を指す。

一方、本願はＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦの医薬の製造における使用を提供し、前記医薬は網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防に用いる。

本願では、前記医薬は、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは異なるベクターに位置する。例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよび前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは同一のベクターに位置する。

一方、本願はまた網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防のためのベクターの組み合わせを提供し、それは第１ベクターと第２ベクターを含み、前記第１ベクターはＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、前記第２ベクターはＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

一方、本願は、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドおよびＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる単離された核酸分子を提供する。

一方、本願は、さらに、本願に記載された核酸分子または本願に記載されたベクターの組み合わせを含むことができる細胞を提供する。

本願はまた医薬組成物を提供し、それは本願に記載する前記核酸分子、本願に記載するベクターの組み合わせおよび／または本願に記載する細胞を含むことができる。

一方、本願はまた本願記載の核酸分子、本願記載のベクターの組み合わせ、本願記載の細胞および／または本願記載の医薬組成物の医薬の製造における使用を提供し、前記医薬は網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の予防、緩和および／または治療に用いることができる。

ＣＹＰ４Ｖ２
本願では、ＣＹＰ４Ｖ２は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ショウジョウバエ、線虫またはカエルのＣＹＰ４Ｖ２またはその機能的変異体を含むが、これらに限定されなく、機能障害を有するタンパク質、または結晶性網膜変性を引き起こす遺伝子変異をコードするタンパク質を含むことができる。

例えば、ＣＹＰ４Ｖ２は、ヒトＣＹＰ４Ｖ２を含むことができる。

例えば、ＣＹＰ４Ｖ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６～８２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７６で示されるアミノ酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２はＳＥＱＩＤＮＯ：７６～８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ前記アミノ酸配列と本願の前記ＲｄＣＶＦとの併用投与は網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態を改善することができる。

本願では、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２で示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８に示す核酸配列と少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性の任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、かつ前記ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドは本願の前記ＲｄＣＶＦと併用して網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮と関係する疾患または状態を改善することができる。

ＲｄＣＶＦ
本願では、前記ＲｄＣＶＦは、杆体細胞から生成され、錐体細胞に有利なタンパク質を含むことができる。前記ＲｄＣＶＦは人間、チンパンジー、ゴリラ、アカゲザル、犬、牛、ラット、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュとカエルのＲｄＣＶＦまたはその機能性変異体を含むが、それに限定されない。

例えば、ＲｄＣＶＦは、ヒトＲｄＣＶＦを含むことができる。

例えば、ＲｄＣＶＦは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３～８９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＲｄＣＶＦは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３で示されるアミノ酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＲｄＣＶＦはＳＥＱＩＤＮＯ：８３～８９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性のアミノ酸配列、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一性の任意のアミノ酸配列を含むことができ、かつ前記アミノ酸配列と本願の前記ＣＹＰ４Ｖ２との連合使用は網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態を改善することができる。

本願では、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９で示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５に示す核酸配列と少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列、例えば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性の任意のポリヌクレオチド配列を含むことができ、かつ前記ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドと本願の前記ＣＹＰ４Ｖ２との連合使用は網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮と関係する疾患または状態を改善することができる。

プロモーター
本願では、前記プロモーターはＲＰＥ細胞特異的プロモーター、網膜細胞特異的プロモーター、角膜細胞特異的プロモーター、眼細胞特異的プロモーターまたは構成的プロモーターを含むことができる。前記プロモーターはまた哺乳動物βアクチンプロモーターまたはウイルスプロモーターを含むことができる。前記プロモーターはまたＣＡＧプロモーター（ＣＡＧＧＳプロモーター、ＣＢプロモーターまたはＣＢＡプロモーターとしても知られるヘテロ接合ＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター）、人βアクチンプロモーター、小ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、ＣＢＳプロモーター或はＣＢｈプロモーター、延伸因子１α短（ＥＦＳ）プロモーター、延伸因子１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＧＵＳＢプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター、ＶＭＤ２（ＢＥＳＴ１とも呼ばれる。）プロモーター、ＯＰＥＦＳプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２自身プロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター或はそのヘテロ体或は誘導体を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＣＹＰ４Ｖ２自身プロモーターを含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２自身プロモーターは前記コードＣＹＰ４Ｖ２のポリヌクレオチド上流の２０００ｂｐヌクレオチド配列の全部または一部を含むことができる。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２自己プロモーターは、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐｆプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ１プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ３プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ４プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ６プロモーターを含んでもよい。前記ＣＹＰ４Ｖ２－ＰｆプロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：６で示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２プロモーターはＣＹＰ４Ｖ２－Ｐｆ：７で示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ１プロモーターはＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２：８で示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ３プロモーターはＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ４：９で示される核酸配列を含むことができ、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーターはＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ６：１０で示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１１で示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ１プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１２で示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＯＰＥＦＳであってもよく、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される核酸配列を含む。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示される核酸配列を含むＥＦＳであってもよい。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示される核酸配列を含むＥＦ１ａであってもよい。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示される核酸配列を含むＣＡＧであってもよい。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５で示される核酸配列を含むＲＰＥ６５であってもよい。

ポリアデニレーションシグナル部位
本願では、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＶ４０シグナル部位、ＢＧＨシグナル部位、ＷＰＲＥシグナル部位、ＷＰＲＥ－ＳＶ４０シグナル部位、ＷＰＲＥ－ＢＧＨシグナル部位或はその誘導体を含む。

例えば、前記ポリアデニレーションシグナル部位はポリアデニル化相関分解因子に識別されて、ＳＶ４０ポリアデニル酸配列、ＢＧＨ信号ポリアデニル酸配列、ＨＳＶ信号ポリアデニル酸配列、ＴＫ信号ポリアデニル酸配列、ＷＰＲＥ信号ポリアデニル酸配列などを産生する。

例えば、ポリアデニレーションシグナル部位は、ＡＡＵＡＡＡの配列を含むことができる。

例えば、ポリアデニレーションシグナル部位は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１によって示される核酸配列を含むことができる。

自己切断ペプチド
本願では、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドと前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する。

例えば、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａを含むことができる。

例えば、自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａを含むことができる。

例えば、自己切断ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６～２９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むことができる。

例えば、自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、スプライシングペプチドのＮ末端は、ＧＳＧ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、グリシン、セリン、グリシン）配列に連結されていてもよい。

イントロン
本願では、前記イントロンは目的遺伝子の５’端または目的遺伝子のヌクレオチド配列に位置することができる。前記目的遺伝子はＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたはＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。前記イントロンは前記目的遺伝子の発現を増強できる。例えば、イントロンは、ヒトβ－ｇｌｏｂｉｎイントロン、ＳＶ４０イントロン、ヘテロ合成ＣＢＡ／ＭＶＭイントロン、または他の人工的に合成されたイントロンを含むことができる。

例えば、前記イントロンは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む。

単離された核酸分子
本願では、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順にＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができる。

本願では、前記分離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができる。

本願では、前記分離された核酸分子はまた前記プロモーターを含むことができる。

例えば、前記プロモーターは前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつ前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結される。

例えば、前記プロモーターは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつ前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結される。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順に前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

本願では、前記分離された核酸分子はまた前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順にプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’端から３’端まで順にプロモーター、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、分離された核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１～１０５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

本願では、前記分離する核酸分子はまた前記ポリアデニレーションシグナル部位を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＣＹＰ４Ｖ２のポリヌクレオチドの３’端に位置する。

本願では、前記分離する核酸分子はまたポリアデニレーションシグナル部位を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＲｄＣＶＦのポリヌクレオチドの３’端に位置する。

例えば、前記単離された核酸分子は５’から３’方向から順に前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

本願では、前記分離する核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示すヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、分離された核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６～１０８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

本願では、前記分離された核酸分子はまた前記イントロンを含むことができる。

例えば、前記イントロンは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記イントロンは前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに位置する、或は、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

例えば、前記単離された核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロン、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロンが挿入された前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記イントロンはＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記分離する核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロン、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含む。

例えば、前記分離する核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロンを挿入する前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記イントロンはＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示すヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードする前記イントロンが挿入されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６に記載の核酸配列を含むことができる。

例えば、前記イントロンは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに位置する、或は、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

例えば、前記単離された核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロン、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロンが挿入された前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記イントロンは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示される核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記分離する核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロン、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含む。

例えば、前記分離する核酸分子は５’から３’方向に順に前記プロモーター、前記イントロンを挿入する前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記自己剪断ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位を含むことができる。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記イントロンはＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記自己切断ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：２２～２５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示すヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記単離された核酸分子はＳＥＱＩＤＮＯ：１０９～１１５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

ベクター
本願では、前記ベクターはプラスミド、ファージ、コスプラスミド、人工染色体例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ファージ例えばλファージまたはＭ１３ファージおよびウイルスベクターを含むことができる。

例えば、前記ウイルスベクターは逆転写酵素ウイルス（スローウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶベクター）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスのように）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばＳＶ４０）を含むことができる。

例えば、前記アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）遺伝子は逆末端反復配列（ＩＴＲ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことができ、前記オープンリーディングフレームはＲｅｐ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、またカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むこともできる。

例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）を含むこともできる。

例えば、組換えアデノ随伴ウイルスベクター中のカプシド、ＩＴＲおよび他の選択されたＡＡＶコンポーネントは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８およびＡＡＶＡｎｃ８０、ＤＪ、ＤＪ／８、Ｒｈ１０を含むがこれらに限定されない任意のＡＡＶから選択されてもよい。

例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＤＪ、ＤＪ／８、Ｒｈ１０のいずれであってもよい。

例えば、ＡＡＶベクターは眼組織親和性ＡＡＶベクターであり、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＤＪ／８又は任意のｒＡＡＶベクターである。

例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９とすることができる。

例えば、ウイルスベクターは、ｐＡＡＶ－ＲＣ５－Ａｍｐ、ＲＣ８－ｃａｐ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ－Ａｍｐ、ＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒを含むことができる。

例えば、前記ウイルスベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：１３３～１３７のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０～１１５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むこともできる。

例えば、前記ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１７～１２１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むこともできる。

例えば、ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２～１３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

本願では、前記ベクターは、本願に記載の単離された核酸分子を含むことができる。

例えば、ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１～１１５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

本願では、前記ベクターは、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記ベクターは、さらに、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつ前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。

例えば、前記ベクターは、さらに、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつ前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。

例えば、前記ベクターはまたポリアデニレーションシグナル部位を含む、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＣＹＰ４Ｖ２のポリヌクレオチドの３’端に位置する。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示すプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示すＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示すポリアデニレーションシグナル部位配列。

例えば、前記ベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：９０～９２のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記ベクターはまたポリアデニレーションシグナル部位を含む、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＲｄＣＶＦのポリヌクレオチドの３’端に位置する。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２の任意の項目に示すようなプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５の任意の項目に示すようなＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１の任意の項目に示すようなポリアデニレーションシグナル部位配列。

例えば、ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６～９８のいずれかに示される核酸配列を含むことができる。

例えば、前記ベクターはまたイントロンを含むことができる。

例えば、前記イントロンは前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに位置し、または、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

例えば、前記イントロンは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドに位置し、または、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置する。

例えば、前記ベクターは５’～３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記イントロン、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド。

例えば、前記ベクターは５’乃至３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記イントロンを挿入する前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたは前記イントロンを挿入する前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記イントロン、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたは前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位。

例えば、前記ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記イントロンを挿入する前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドまたは前記イントロンを挿入する前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位。

例えば、前記プロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記イントロンはＳＥＱＩＤＮＯ：１３～１６のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示す核酸配列を含むことができ、前記ポリアデニレーションシグナル部位はＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１のいずれかに示すヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記ベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：９３～９５および９９～１００のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

ベクターの組合せ
本願はまた網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防のためのベクターの組み合わせを提供し、それは第１ベクターと第２ベクターを含み、前記第１ベクターはＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、前記第２ベクターはＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

例えば、前記第１ベクターは、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつ前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むことができる。

例えば、前記第１ベクターは、５’～３’方向に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示すようなプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８のいずれかに示すようなＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド配列を、順次含んでいてもよい。

例えば、第１のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１７で示されるポリヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記第２ベクターは、ＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドの５’端に位置し、かつＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むことができる。

例えば、前記第２のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０で示されるポリヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記第１ベクターは、５’～３’方向に、順に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２のいずれかに示されるプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５のいずれかに示されるＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記第一ベクターはまたポリアデニレーションシグナル部位を含む、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＣＹＰ４Ｖ２のポリヌクレオチドの３’端に位置する。

例えば、前記第２ベクターはまたポリアデニレーションシグナル部位を含む、前記ポリアデニレーションシグナル部位は前記コードＲｄＣＶＦのポリヌクレオチドの３’端に位置する。

例えば、前記第１ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：前記プロモーター、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位；および／または、前記第２ベクターは５’～３’方向で順に以下を含む：前記プロモーター、前記エンコードＲｄＣＶＦのポリヌクレオチド、前記ポリアデニレーションシグナル部位。

例えば、前記第１ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２の任意の項目に示すようなプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２～６８の任意の項目に示すようなＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１の任意の項目に示すようなポリアデニレーションシグナル部位配列。

例えば、前記第１のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９０～９２のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記第２ベクターは５’から３’方向で順に以下を含むことができる：ＳＥＱＩＤＮＯ：１～１２の任意の項目に示すプロモーター配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９～７５の任意の項目に示すＲｄＣＶＦをコードするポリヌクレオチド配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１の任意の項目に示すポリアデニレーションシグナル部位配列。

例えば、前記第２のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９６～９８のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、前記第１ベクターおよび／または前記第２ベクターはまたイントロンを含むことができる。

例えば、前記第１のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９３～９５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。および／または、前記第２ベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：９９～１００のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

例えば、第１のベクターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８～１１９のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。および／または、前記第２ベクターはＳＥＱＩＤＮＯ：１２１のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含むことができる。

細胞
本願は、さらに、本願に記載の核酸分子または本願に記載のベクターの組み合わせを含むことができる細胞を提供する。

例えば、前記細胞は前記核酸分子をその中に発現させる細胞である。

例えば、前記細胞は単一細胞の子孫を含むことができる。子孫は必ずしも始原母細胞と同一でなくてもよい（全ＤＮＡ相互補体の形態学的またはゲノム的）。

例えば、前記細胞は、本発明に記載のベクターでｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた細胞をさらに含むことができる。

例えば、前記細胞は細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞または他の真核細胞、例えば、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞または骨髄腫細胞、２９３Ｔ細胞を含むことができる。

例えば、前記細胞は結晶性網膜変性患者からの細胞である。

例えば、前記細胞は体細胞または幹細胞を含むことができる。

例えば、前記細胞は網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、水晶体細胞、神経細胞、ＲＰＥ細胞、幹細胞を含むことができ、前記幹細胞は誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、成体幹細胞または幹細胞から由来する任意の細胞を含むことができる。

例えば、前記網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、水晶体細胞、神経細胞、ＲＰＥ細胞は前記幹細胞から分化を誘導することができる。

例えば、前記細胞はＡＲＰＥ－１９細胞、ヒトｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ細胞を含むことができる。

医薬組成物
本願はまた医薬組成物を提供し、それは本願に記載する前記核酸分子、本願に記載するベクターの組み合わせおよび／または本願に記載する細胞を含むことができる。

例えば、前記医薬組成物はまた任意に薬学上受け入れ可能な補助剤を含むことができる。

例えば、前記医薬組成物はまた１種または多種（薬学的に有効な）のベクター、安定剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤および／または防腐剤の適当な製剤を含むことができる。

例えば、前記組成物の受容可能成分は使用用量と濃度で受信者に無毒である。

例えば、前記医薬組成物は液体、冷凍と凍結乾燥組成物を含むが、それに限定されない。

例えば、前記薬学的に受け入れ可能な補助剤は、医薬投与と適合する任意およびすべての溶剤、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤を含み、通常は安全であり、無毒であり、かつ生物学的にも他の態様でも望ましくない。

例えば、前記医薬組成物は胃腸外、経皮、腔内、動脈内、髄腔内と／または眼内投与または直接組織に注射することを含む。

例えば、前記医薬組成物は点滴、点滴または注射によって患者または被験者に投与できる。

例えば、前記医薬組成物は間断なく（または連続）使用できる。

例えば、ノンストップ（または連続）投与は、Ｗ０２０１５／０３６５８３で説明されているように、患者の体内に流れ込む治療薬を測定するために患者が装着する小さなポンプシステムによって行うことができる。

本願では、前記被験者は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことができる。例えば、被験者は、猫、犬、馬、豚、乳牛、羊、ウサギ、マウス、ラットまたはサルを含むことができるが、これらに限定されない。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態
本願では、前記網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態は加齢黄斑変性または網膜色素変性（ＲＰ）を含むことができる。

例えば、前記網膜色素変性は単眼性原発性網膜色素変性、象限性原発性網膜色素変性、中心性或いは傍中心性原発性網膜色素変性、無色素性網膜色素変性白点状網膜変性、結晶性網膜変性、静脈脂肪色素性網膜色素変性、小動脈傍色素上皮保留型網膜色素変性、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障と他の症候群の網膜色素変性を含む。

例えば、前記網膜色素変性は結晶性網膜変性を含むことができる。

例えば、結晶性網膜変性は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異によって引き起こされる疾患を含むことができる。

例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異には、ミスセンス変異、複製エラー、スプライス部位エラー、フレームシフト、塩基欠損または挿入、ナンセンス変異、多型（例えば、一塩基多型）、早期終了、ＣＹＰ４Ｖ２部分的または全遺伝子欠失、および未同定の結晶性網膜変性に関連するＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異が含まれるが、これらに限定されない。

例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異は、表１に示す変異を含んでもよい。

表１に示されているＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異体は、データベースｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／？ｔｅｒｍ＝ＣＹＰ４Ｖ２［ｇｅｎｅ］から得られる。

いかなる理論によっても限定されることを意図するものではなく、以下の実施形態は、本願の発明の範囲を限定するものではなく、本願の核酸分子、製造方法および使用等を説明するためのものである。実施形態は、ベクター及びプラスミドを構築する方法、そのようなベクター及びプラスミドにタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法、またはプラスミドを宿主細胞に導入する方法など、従来の方法の詳細な説明を含まない。このような方法は、当業者にはよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇを含む多くの出版物に記載されている：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ。記載されていない化学薬品はすべて通常の商業ルートで購入することができる。

実施例１．ＣＹＰ４Ｖ２の表現によるプロモーター強度の検証
（１）全長ＣＹＰ４Ｖ２プロモーター配列は人源ゲノムＣＹＰ４Ｖ２（ＨＧＮＣ：２３１９８）コード領域の２０００ｂｐ上流で、蘇州金唯智会社によって合成された。

（２）異なる長さのプロモーターＣＹＰ４Ｖ２－Ｐｆ、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ１、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ３、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ４、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ６のプライマー配列を設計し、ステップ（１）で得られた核酸分子を鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、ゲル電気泳動で増幅産物を回収した。引用配列をＳＥＱＩＤＮＯ：３０～３７に示す。

（３）ｐＡＶ－ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰベクター（山東維真生物科技有限公司から購入）をＣＡＧプロモーターの両端からそれぞれ増幅し、ゲル電気泳動により増幅産物を回収した。引用配列をＳＥＱＩＤＮＯ：３８～３９に示す。ＰＣＲ反応系（５０μｌ）は以下の通りである。

（４）工程（２）で得られた異なるＣＹＰ４Ｖ２プロモーター配列（例：ＳＥＱＩＤＮＯ：６－１２）を工程（３）で得られた直鎖状ｐＡＶ－ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰベクターに相同的に連結し、元のベクター中のＣＡＧプロモーターを代替する。

連結系（氷上で実施）は以下のとおりである。

連結系を５０℃の水浴釜内で４０分放置し、５μｌの反応液を取ってｔｒａｎｓＳｔｂｌ３大腸菌のコンピテント細胞に転化し、細菌配列を測定し、抽出キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６９１５－０４）を用いてプラスミドを抽出した。

（５）１日目に２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）を３５ｍｍ細胞培養皿に分け、２日目から７０％ぐらいまで、トランスフェクション体系を調製した：１００μｌ血清フリーＤＭＥＭにそれぞれ２μｇステップ（４）で得たプラスミドを加え、３μｌＰＥＩを加え、均一に混合し、２０分静止した。得られたトランスフェクション体系を細胞培地に加え、均等に振り混ぜ、ＣＯ_２培養箱に置き、６ｈ後または一晩で液を交換した。

（６）ＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）は４８時間後に細胞を溶解し、タンパク質のゲル電気泳動を行った。ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔはＣＹＰ４Ｖ２の発現を検出した。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）。

結果、図１に示すように、ＣＹＰ４Ｖ２－ＰＦプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ１プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ３プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ４プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ６プロモーターはすべてＣＹＰ４Ｖ２の発現を実現することができ、その中でＣＹＰ４Ｖ２－ＰＦプロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ３プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ４プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーターは比較的に良い発現効果があり、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５配列は更に短く、優勢であった。

実施例２．ＥＧＦＰをレポーター遺伝子としてプロモーター強度を検証
（１）ＰＣＲによりプロモーターＥＦ１ａ、ＥＦＳ、ＯＰＥＦＳを増幅した。ＥＦ１ａプライマー配列をＳＥＱＩＤＮＯ：４０～４１に、ＥＦＳプライマー配列をＳＥＱＩＤＮＯ：４２～４３に示した。ＯＰＥＦＳプロモーターは汎用プロモーターＥＦＳをベースとし、プライマーの設計は二輪ＰＣＲを用いてＥＦＳをＯＰＥＦＳに改造した。第１回ＰＣＲ反応に用いたプライマーはＥＦＳフォワードプライマー（例：ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）とＯＰＥＦＳ－ｏｖｅｒｌａｐＲ１（例：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）、第２回ＰＣＲ反応に用いたプライマーはＥＦＳフォワードプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示す）とＯＰＥＦＳ－ｏｖｅｒｌａｐＲ２（例：ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）であった。増幅産物はゲル電気泳動で回収した。ＰＣＲ反応系（５０μｌ）は以下の通りである。

（２）ステップ（１）で得られた増幅産物（プロモーターＯＰＥＦＳ、ＥＦＳ、ＥＦ１ａ核酸分子、配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１～３に示す）の相同組換えを、実施例１のステップ（３）で得られた直鎖状ｐＡＶ－ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰに連結し、ｐＡＶ－ＥＦ１ａ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰが得られる。連結系（氷上で実施）は以下のとおりである。

（３）実施例１ステップ（５）の方法に従い、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５－１）を利用して、それぞれｐＡＶ－ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ＥＦ１ａ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰとｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰプラスミドを６穴プレートに予め敷く２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクションし、細胞密度は７０％ぐらいだった。

（４）２４時間後蛍光顕微鏡（ＬｉｆｅＡＭＦ４３０５）により蛍光シグナルを観察した。

結果は図２に示すように、ＣＡＧ、ＥＦ１ａ、ＯＰＥＦＳはＥＦＳに比べてすべて比較的に良い発現効果があり、その中でＯＰＥＦＳ序列は比較的に短く、更に優位がある。

実施例３．イントロンの増強効果の検証
（Ｉ）イントロンを遺伝子５’非コード領域にクローニングした。

（１）Ｐ５－ｉｎｔｒｏｎのクローン。ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーター配列とヒトβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンを基に、プライマーを設計し、ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲで改造してＰ５－ｉｎｔｒｏｎを得た。１）ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５プロモーター配列を鋳型として、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５フォワードプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５Ｆ）とＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５（ｉｎ）リバースプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）を利用してＰＣＲ増幅を行う；２）ヒトβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンを鋳型として、β－ｇｌｏｂｉｎイントロン（ｃ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）とβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンリバースプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）を用いたＰＣＲ増幅；３）増幅産物をそれぞれ回収し、１）と２）で得られた目的産物を共通鋳型としてＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５フォワードプライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５Ｆ）とβ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ５イントロンリバースプライマーを用いてＳＥＱＩＤＮＯＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅は実施例２ステップ（１４９）の体系と条件で行った。増幅したＰ５－ｉｎｔｒｏｎ目的産物を回収した。

（２）増幅して得られたＰ５－ｉｎｔｒｏｎ配列をシークエンシングし、その後、実施例１のステップ（３）で得られた直鎖状ＰＡＶ－ＣＡＧ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰに相同組換えを連結し、ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰを得る。連結系（氷上で実施）は以下のとおりである。

（３）連結系を５０℃の水浴釜内で４０分放置し、５μｌの反応液を取ってｔｒａｎｓＳｔｂｌ３大腸菌のコンピテント細胞に転化し、細菌配列を測定し、抽出キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６９１５－０４）を用いてプラスミドを抽出した。

（ＩＩ）イントロンを遺伝子コード領域にクローニングした。

（１）ＣＹＰ４Ｖ２－ＣＤＳｉｎｔｒｏｎのクローンであり、このフラグメントでは、イントロンはＣＹＰ４Ｖ２の第１および第２エクソンの間に位置する。ＣＹＰ４Ｖ２のＣＤＳ序列とヒトβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンを基礎にして、プライマーを設計して、ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲを採用して改造してＣＤＳｉｎｔｒｏｎを得た。

１）ＣＹＰ４Ｖ２のＣＤＳ配列を鋳型として、プライマーＣＹＰ４Ｖ２－Ｆｐｒ／ＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ１－Ｒ（配列はそれぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５０、５１に示す）とＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ２－Ｆ／ＣＹＰ４Ｖ２－Ｒ（配列はそれぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２、５３に示す）を用いてＰＣＲ増幅し、それぞれＰＣＲ産物ＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ１とＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ２～１１を得た。

２）β－ｇｌｏｂｉｎイントロンを鋳型として、プライマーＩｎｔｒｏｎ－Ｆ／Ｉｎｔｒｏｎ－Ｒ（配列はそれぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：５４、５５に示す）を用いてＰＣＲ増幅した。

３）増幅産物をそれぞれ回収し、１）得られた目的産物ＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ１と２）得られた目的産物を共通鋳型として、ＣＹＰ４Ｖ２－ＣＤＳのフォワードプライマーＣＹＰ４Ｖ２－Ｆｐｒ（配列は、ＣＹＰ４Ｖ２－Ｒ：５０に示す）とβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンリバースプライマーｉｎｔｒｏｎ－Ｒ（配列はＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ２：５５に示す）を用いてＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ増幅は実施例２ステップ（１）の体系と条件で行った。増幅したＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ１－ｉｎｔｒｏｎ目的産物を回収した。

４）３）で得られた目的産物ＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ１－ｉｎｔｒｏｎと１）得られた目的産物ＣＹＰ４Ｖ２－Ｅ２～１１を共通鋳型として、ＣＹＰ４Ｖ２－ＣＤＳフォワードプライマーＣＹＰ４Ｖ２－ＦｐｒとＣＹＰ４Ｖ２－ＣＤＳリバースプライマーＣＹＰ４Ｖ２－Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅は実施例２ステップ（１）の体系と条件で行った。

（２）増幅したＣＤＳｉｎｔｒｏｎ配列をシークエンシングした。

（３）３７℃、２ｈで酵素切断ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰして直鎖状ベクターを得て、ゲル電気泳動で回収した。酵素体系は以下の通りである。

（４）ＣＹＰ４Ｖ２－ＣＤＳｉｎｔｒｏｎ相同組換えを直鎖状ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰに連結し、ｐＡＶ－ｐ５－ＣＤＳｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰを得た。連結系（氷上で実施）は以下のとおりである。

（５）連結系を５０℃の水浴釜内で４０分放置し、５μｌの反応液を取ってｔｒａｎｓＳｔｂｌ３大腸菌のコンピテント細胞に転化し、細菌配列を測定し、抽出キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６９１５－０４）を用いてプラスミドを抽出した。

（ＩＩＩ）イントロンが遺伝子５’非コード領域とコード領域に位置する時の増強効果の検証
（１）ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ、ｐＡＶ－ｐ５－ＣＤＳｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰを、実施例１ステップ（５）の方法でＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５－１）を用いて６ウェルプレートに予め敷き詰めた２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクトし、細胞密度は７０％程度であった。

（２）２４時間後蛍光顕微鏡（ＬｉｆｅＡＭＦ４３０５）により蛍光シグナルを観察した。

（３）ＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）は４８時間後に細胞を溶解し、タンパク質のゲル電気泳動を行った。ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔはＣＹＰ４Ｖ２の発現を検出した。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）。

その結果、図３および図４に示すように、ヒトβ－ｇｌｏｂｉｎイントロンに遺伝子５’非コード領域とコード領域を挿入すると発現が増強した。

実施例４．ＰｏｌｙＡシグナル部位の選択
（１）実施形態２で得られたｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰベクターのＳＶ４０は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９～２１で示されるように、ＢＧＨ、ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ－ＳＶ４０、およびＷＰＲＥ－ＢＧＨにそれぞれ置き換えられ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ＢＧＨが得られた。この部分の遺伝子合成とサブクローニングの担当は北京Ｏｐｔｉｍｉｋｏ。

（２）ステップ（１）で得られたベクターをシークエンシングして検証した後、抽出キット（Ｏｍｅｇａ、Ｄ６９１５－０４）を用いてプラスミドを抽出した。

（３）実施例１ステップ（５）の方法でＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５－１）を用いてそれぞれ本実施例ステップ（２）で得られたプラスミドを６ウェルプレートに予め敷いた２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクションし、細胞密度は７０％程度であった。

（５）ＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）は４８時間後に細胞を溶解し、タンパク質のゲル電気泳動を行った。ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔはＣＹＰ４Ｖ２の発現を検出した。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）。

結果を図５に示す。ここで、Ｍ（ｍｏｃｋ）はブランクコントロール、ＳはＳＶ４０、ＢはＢＧＨ、ＷはＷＰＲＥ、ＷＳはＷＰＲＥ－ＳＶ４０、ＷＢはＷＰＲＥ－ＢＧＨである。各実験群は対照群と比較していずれもＣＹＰ４Ｖ２の発現を検出できた。

実施例５．発現ベクターの構築
（１）ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（カルナ抵抗性）の構築。ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰ－ＢＧＨ中アンベンジル耐性遺伝子をカルナ耐性遺伝子に換え、蘇州金唯智がベクター改造を担当した。ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９０に示す）、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９６に示す）、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０６に示す）は蘇州金唯智が関連遺伝子の合成とベクター（カルナ抵抗性）を改造した。

（２）ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）、ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９９に示す）、ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（表現順序はＳＥＱＩＤＮＯ：１１３に示す）（カルナ抵抗性）の構築。３７℃でｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（カルナ抵抗性）を２時間酵素切断して直鎖状ベクターを得、ゲル電気泳動回収した。酵素体系は以下の通りである。

（３）ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＰからＰＣＲ増幅によりＰ５－ｉｎｔｒｏｎフラグメントを得、ゲル電気泳動により回収した。フォワードプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：４６、リバースプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：５５を用いた。

（４）酵素切断された回収ベクターとそれとの組換えを必要とする直鎖状断片を連結し、連結系（氷上で実施）は以下のとおりである。

実施例６．２９３Ｔ細胞における発現ベクターの発現状況の検査
（１）実施例５ステップ（１）改造で得られたｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨプラスミドを、実施例１ステップ（５）の方法でＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５－１）を用いて６穴プレートにあらかじめ敷いておいた２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクションし、細胞密度は７０％程度とした。

（２）細胞培養上清（ｓｕｐ）を４８時間後に採取し、細胞をＰＢＳで洗浄した後にＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）を用いて細胞（ｌｙｓ）を溶解しＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔで、各群の上清または細胞溶解液（ｌｙｓ）中のＣＹＰ４Ｖ２および／またはＲｄＣＶＦの発現を調べた。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）、ＲｄＣＶＦＡｎｔｉｂｏｄｙ（ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２、Ａｔｌａｓ）。

結果を図６に示す。ここで、Ｍ（ｍｏｃｋ）をブランクコントロール、ＣをＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２群、Ｃ－ＲをＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ群、ＲをＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ群とした。ブランクコントロール群Ｍ群細胞の溶解液（ｌｙｓ）と細胞培地上清（ｓｕｐ）にＣＹＰ４Ｖ２あるいはＲｄＣＶＦの発現がなかった。ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨトランスフェクション細胞溶解液におけるＣＹＰ４Ｖ２の発現があり、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨトランスフェクションした細胞上清と溶解液におけるＲｄＣＶＦの発現があり、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨトランスフェクションした細胞溶解液にはＣＹＰ４Ｖ２の発現があり、同時に細胞溶解液と上清にはＲｄＣＶＦの発現があった。

実施例７．ＡＲＰＥ－１９細胞における発現ベクターの発現状況の検査
（１）実施例５ステップ（１）改造で得られたｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨプラスミドを、実施例１ステップ（５）の方法でＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５－１）を用いて６穴プレートにあらかじめ敷いておいたＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３０２）にトランスフェクションし、細胞密度は７０％程度とした。

（２）細胞培養上清（ｓｕｐ）を４８時間後に採取し、細胞をＰＢＳで洗浄した後にＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）を用いて細胞（ｌｙｓ）を溶解しＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、各群の上清または細胞溶解液（ｌｙｓ）中のＣＹＰ４Ｖ２および／またはＲｄＣＶＦの発現を調べた。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）、ＴＸＮＬ６Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２）。

結果を図７に示す。ここで、Ｍ（ｍｏｃｋ）をブランクコントロール、ＣをＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２群、Ｃ－ＲをＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ群、ＲをＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ群とした。ブランクコントロール群ｍｏｃｋ群細胞の溶解液と細胞培地上清にＣＹＰ４Ｖ２またはＲｄＣＶＦの発現がなかった。ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨトランスフェクション細胞溶解液におけるＣＹＰ４Ｖ２の発現があり、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨトランスフェクション細胞上清および細胞溶解液におけるＲｄＣＶＦの発現があり、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ、トランスフェクションした細胞溶解液にはＣＹＰ４Ｖ２の発現があり、同時に上清と細胞溶解液にはＲｄＣＶＦの発現があった。

実施例８．ウイルスベクター
（Ｉ）ＡＡＶ血清型の選択：ＧＦＰレポーターを封入したＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９血清型ウイルス（山東維真生物科技有限公司から購入）を用いて、野生型マウスに網膜下注射を行った。１か月後に切片で網膜組織形態学的観察を行った。結果図８に示すように、両矢印はＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現範囲を示し、網膜の偏好性が比較的に良いＡＡＶ２／８血清型を選択した。

ＡＡＶ２／８ベクターの構築：
（１）ｐＡＡＶ－ＲＣ５－Ａｍｐ（北京西美傑科技有限会社から購入し、ベクター配列を以下に示す：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３３）をベースに改造した。ＰＣＲはＡｍｐ以外のｐＡＡＶ－ＲＣ５配列を増幅し、用いたプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：５６～５７に示すようにＲＣ５－Ｆ／ＲＣ５－Ｒであった。

（２）Ｋａｎａ部分は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８－５９に示すように、Ｋａｎａ－Ｆ／Ｋａｎａ－Ｒのプライマーを用いたＰＣＲ法によりｐＥＧＦＰ－Ｎ１から増幅された。

（３）以上のＰＣＲにより得られた２種類のＤＮＡ断片を、相同組換え法を用いて得られたｐＡＡＶ－ＲＣ５－Ｋａｎａ。

（４）ｐＡＡＶ－ＲＣ５－Ｋａｎａをベースにして、ＰＣＲ法を用いてＲＣ５－ｃａｐ以外のｐＡＡＶ－Ｋａｎａ配列を増幅し、用いたプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：６０－６１に示すように、ＲＣ５－Ｋａｎａ－Ｆ／ＲＣ５－Ｋａｎａ－Ｒである。

（５）遺伝子合成したＲＣ８－ｃａｐ配列（ＢｅｉｊｉｎｇＯｐｔｉｍｕｓ、配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３４に示す）と、ステップ（４）で得られたｐＡＡＶ－Ｋａｎａ直鎖状ベクターを相同組換えにより得られたｐＡＡＶ－ＲＣ８－Ｋａｎａ（つまりＡＡＶ２／８）を用いて、ベクター配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１３５に示した。

（ＩＩ）ＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ選択：汎用型ＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ補助プラスミドを選択し、抵抗性をアンモニアからカルナに変更した。具体的な改造プロセスは以下の通りである。

１）ｐＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ－Ａｍｐ（北京西美傑科技有限会社から購入し、ベクター配列を以下に示す：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３６）をベースに改造。ＰＣＲ法によりＡｍｐ以外のｐＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ配列を増幅し、用いたプライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：５６－５７に示すように、ＲＣ５－Ｆ／ＲＣ５－Ｒであった。

２）Ｋａｎａ部分はＰＣＲ法でｐＥＧＦＰ－Ｎ１から増幅して得られ、用いたプライマーはＫａｎａ－Ｆ／Ｋａｎａ－Ｒであり、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８－５９で示した。

３）以上のＰＣＲにより得られた２種類のＤＮＡ断片を、相同組換え法により得られたｐＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ－Ｋａｎａ（つまりＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒ）のベクター配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１３７に示した。

実施例９．ウイルスの包装と純化
（Ｉ）ウイルス包装
（１）０日目：細胞接種（接種数１ｘ１０^７）、２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのシャーレに接種した。

（２）第１日目：２９３Ｔ細胞量が８０％～９０％の時、１０％血清（上海吉泰依科賽、ＦＳＰ５００）を含む完全培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１１９６５５００ＢＴ）２０ｍｌに換え、プラスミドトランスフェクションを行い、具体的なトランスフェクション体系は表５を参照。

（３）表５中の発現ベクターは、実施例５の方法に従って構築された発現ベクターである。（３）２日目：トランスフェクション１２－１８時間後に新鮮完全培地３０ｍｌに交換した。

（４）３日目：トランスフェクション４８時間後に新鮮完全培地３０ｍｌに交換。

（５）４日目：トランスフェクション７２ｈ後に通常の方法で膵酵素で２９３Ｔ細胞を消化し、そして５０ｍｌの遠心管の中に収集し、ＰＢＳで２回洗い、１２００ｒｐｍで遠心５分、ＰＢＳを吸入し、－８０℃の冷蔵庫に保存した。

（ＩＩ）ウイルス精製
１）本実施例のステップ（５）で得られたＡＡＶ２９３Ｔ細胞を１５℃～２５℃解凍した。

２）１５ｃｍのシャーレ１つにつき２ｍｌの細胞溶解液（１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）で細胞を再懸濁した（５０ｍｌの遠心管ごとに１５ｃｍのシャーレの細胞を３個採取し、３個で６ｍｌの細胞溶解液とした）。

３）遠心管内に細胞溶解液の半数体積（３ｍｌ）のクロロホルムを加え、管口を締め付け、水平を３７℃のロッキングベッドに２５０ｒｐｍで置いて３０分間振り混ぜた。

４）水相の１／４体積（１．５ｍｌ）５Ｍの塩化ナトリウムを加えて、均一に混合した。高速遠心管に移し、１１０００ｒｐｍで２５分遠心した。

５）上層水相をとり、境界部の吸引しにくい部分を１．５ｍｌ遠心管に移し、３０秒１２０００ｒｐｍ遠心し、上澄みを合わせ、上層水相にヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を最終濃度５０Ｕ／ｍｌまで加え、デオキシコール酸を最終濃度０．４％まで加え、最終濃度１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＣａＣｌ_２、５ＩＵ／ｍｌのＴｕｒｂｏＤＮａｓｅＩ、２５ｕｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ（貯留液濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。

６）３７°Ｃ水浴３０分。

７）水相１／４（２ｍｌ）の体積の５０％ＰＥＧ８０００を加え、振り混ぜ、氷上で１ｈｒ、１１０００ｒｐｍで２５分遠心した。

８）上清を吸引して廃棄し、再び１分遠心し、残りの上清を除去した。

９）最終溶解体積の需要によってＰＢＳを加え、懸濁を吹き付け、１．５ｍｌ遠心管に転移し、転移する時に小さい体積の移動液（＜２００μ１）を入れ、沈殿の粘着によるウイルスの損失を避けた。

１０）クロロホルム５００μｌを加え、振り混ぜ、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。

１１）無菌条件下で上清を吸引し、－８０℃に分けて保存した。

実施例１０．ウイルス力価の測定
（Ｉ）標品ｐＡＡＶ－ＥＧＦＰの配合
１．ベルグラジエント：１ｘ１０^８コピー／５μｌ、１ｘ１０^７コピー／５μｌ、１ｘ１０^６コピー／^５μｌ、１ｘ１０^５コピー／５μｌ、１ｘ１０^４コピー／５μｌ、１ｘ１０^３コピー／μｌ、１ｘ１０^２コピー／５μｌ。

２．希釈手順：
ａ．原液を１０倍希釈してナノで定量し、その定量結果をもとに後続希釈を行った。
ｂ．定量した試料を１ｎｇ／μｌに段階的に希釈した。
ｃ．１ｎｇ／μｌ試料を１ｘ１０^８コピー／μｌに希釈した。
ｄ．希釈液１ｘ１０^８コピー／μｌを５倍希釈して１ｘ１０^８コピー／５μｌとした。
ｅ．１０倍希釈して１ｘ１０^２コピー／５μｌとした。

（ＩＩ）サンプルの処理と希釈
１．１７μｌＤＮａｓｅ１＋１ｍｌ１ｘｂｕｆｆｅｒ（ＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈ、ＧＤ－２０１－０１）５０Ｕ／ｍｌのｂｕｆｆｅｒを調製した。

２．実施例９のステップ１１）で得られたサンプル５μｌを、ステップ１で調製したｂｕｆｆｅｒで９５μｌ希釈したサンプル（１０倍希釈）に加えた。

３．均一に混合（渦振動５秒）し、ＰＣＲ装置上で３７℃で３０分間放置；７５℃で１５分間放置した。

４．ステップ３の反応液を振り混ぜ、その中の５０μｌを吸い取り、４５０Ｍの脱リボザイム水を加え、第一希釈勾配（２００倍希釈）とした。

５．ステップ４で均一に混合した第１勾配反応液５０μｌを吸引し、４５０μｌの脱リボザイム水を加え、第２希釈勾配（２０００倍希釈）とした。

６．ステップ５で均一に混合した第一勾配反応液５０μｌを吸引し、４５０μｌの脱リボザイム水を加え、第三希釈勾配（２０００倍希釈）とした。

（ＩＩＩ）蛍光定量ＰＣＲ

検査・測定の結果表８はＡＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＥＧＦＰ、ＡＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２ウイルス力価はそれぞれ１．００Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌ、３．０６Ｅ＋１３ｖｇ／ｍｌであり、後続の感染実験に用いることができることを示した。本願の実施例で用いた他のウイルスの力価測定は、いずれも本実施例の方法で行われた。

実施例１１．異なる投与量のウイルスはヒトｉＰＳＣ分化のＲＰＥ細胞を感染
（１）ヒト誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の調製。腎上皮細胞はＵｒｉｎｅａｓｙ尿細胞分離キット（北京賽貝、ＣＡ３１０２５００）を用いて尿から抽出し、増幅はＵｒｉｎｅａｓｙ尿細胞増幅キット（北京賽貝ＣＡ３１０３２００）を用いて培養し、３～４世代の融合度が７０～８０％に達した細胞を用いてリプログラミング実験を行った。リプログラミング実験はｈｉＰＳＣリプログラミングキット（北京賽貝、ＣＡ５００２００２）を用い、キットの説明書にある操作法に従って行い、次の細胞分化実験のためのヒトＩＰＳＣを得た。

（２）ＲＰＥ細胞の調製。文献（ｄａＣｒｕｚ，Ｌ．，ｅｔａｌ．（２０１８），Ｐｈａｓｅ１ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｆａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｐａｔｃｈｉｎａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３６（４）：３２８－３３７．）に記載された方法によってＲＰＥ細胞を作製した。３＊１０^４／ｃｍ^２ヒトＩＰＳＣをＴ２５瓶のＴＥＳＲ－Ｅ８培地４ｍｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、ＣＡＴ＃０５９９０、＃０５９９１）で培養し、５日後に２０％血清置換物（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃Ａ３１８１５０２）６ｍｌを含む培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１０８２９０１８）に交換し、２日後に６ｍｌ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１０８２９０１８）で約２０週間培養を続けた。楕円形で濃色の分裂性細胞、すなわちＲＰＥ細胞が得られた。図９に蛍光顕微鏡（ＬｉｆｅＡＭＦ４３０５）で白色光下にそれぞれ４、１０、１０倍鏡下に観察された腎上皮細胞、ＩＰＳＣ細胞、ＲＰＥ細胞を示す。

（３）等量のヒトｉＰＳＣ分化ＲＰＥ細胞をｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＥＧＦＰ－ＢＧＨまたはｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨを含むラッピングウイルスに用量勾配（ＭＯＩ＝０、１ｘ１０^３、１ｘ１０^４、１ｘ１０^５）を用いて感染させた。

（４）７２ｈ後に細胞を消化し、そして各群を三つに分け、一つはｃｅｌｌｔｉｔｅｒｇｌｏｗ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２４１）による説明書による細胞の死亡情況を分析した。実施例６のステップ（２）の方法Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔに従って、ＣＹＰ４Ｖ２の表現を検出した。１部はＲＮＡを抽出するために使用され、ＲＴ－ｑＰＣＲは炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを検出した：ＮＬＲＰ３、ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ。その中で、ＲＮＡ抽出キット（天根ＤＰ４３０）を使って説明書どおりにＲＮＡを抽出した；ｃＤＮＡは逆転写キット（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ４０７Ａ）を用いて説明書に従って逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲ実施例１０のステップ（水）の方法によって行い、ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーの配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１３８～１４５に示す。

結果は図１０Ａ－１０Ｄのように、ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＥＧＦＰ－ＢＧＨウイルス力価の増加に従い、ＥＧＦＰの発現量は次第に増加し、炎症性サイトカインＴＮＦ－αとＮＬＲＰ３の発現レベルは次第に増加し、細胞死亡率は次第に増加した。ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨウイルス力価の増加に伴い、ＣＹＰ４Ｖ２の発現量が増加し、炎症性サイトカインＴＮＦ－αとＮＬＲＰ３の発現レベルが増加し、細胞死亡率が増加した。ヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞に対して、高力価のＡＡＶウイルスが細胞毒性を有することから、１ｘ１０^４以下の用量を選択して後続のヒトｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞の実験に用いることが可能である。

実施例１２．異なるウイルス感染ＢＣＤ患者ｉＰＳＣ分化ＲＰＥ細胞の効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９９に示す）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１３に示す）；Ｄ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＥＧＦＰ－ＢＧＨ。

（２）ＭＯＩ＝１ｘ１０^４のウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび１／２ＭＯＩのウイルスＡ＋１／２ＭＯＩのウイルスＢ（以下Ｅ群となる）を採用して等量ＢＣＤ患者（遺伝子型ＣＹＰ４Ｖ２：ｃ．８０２－８＿８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣホモ接合体変異）ｉＰＳＣ分化のＲＰＥ細胞を感染させ、ＲＰＥ細胞の製造方法は実施例１１を参照。ＢＣＤ患者は２０１８年１１月から２０１８年１２月まで北京大学第三病院眼科で治療した患者である。北京大学第三病院倫理委員会は本研究のすべての側面を承認し、被験者（またはその法定後見人）から試料採取のインフォームドコンセントを得た。患者の尿試料は採取後１時間以内に実施例１１の方法で操作した。

（３）７２ｈ後に顕微鏡下で脂質の堆積状況を観察した。

（４）細胞を採取し、培養上清（ｓｕｐ）を採取する；細胞をＰＢＳで洗浄した後にＲＩＰＡ溶解液（北京プリーレＣ１０５３－１００）で細胞を溶解し、細胞溶解液（ｌｙｓ）を得、ｗｅｓｔｅｒｎで蛋白発現レベルを検査・測定した。使用抗体：ａｎｔｉ－ＣＹＰ４Ｖ２（Ａｔｌａｓ、ＨＰＡ０２９１２２）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＣ０２６）、ｇｏａｔ－ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ（Ａｂｃｌｏｎａｌ、ＡＳ０１４）、ＴＸＮＬ６Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｔｌａｓ）。

蛋白発現の結果は図１１Ａに示し、ウイルス感染がないブランクコントロールＭ（モック）群のＢＣＤ患者ｉＰＳＣ分化のＲＰＥ細胞はＣＹＰ４Ｖ２あるいはＲｄＣＶＦの発現がなかった。ウイルスＤ群に感染したＢＣＤ患者ｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞はＣＹＰ４Ｖ２あるいはＲｄＣＶＦの発現がなく、ＥＧＦＰの発現があった。ウイルスＡ群に感染したＢＣＤ患者のｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞溶解液で検出可能なＣＹＰ４Ｖ２発現があり、ウイルスＢ群に感染したＢＣＤ患者ｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞上清と細胞溶解液で検出できるＲｄＣＶＦ発現があり、ウイルスＣ群とＥ群に感染したＢＣＤ患者ｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞溶解液にＣＹＰ４Ｖ２発現を検出でき、同時に細胞上清と細胞溶解液にＲｄＣＶＦ発現を検出できた。

脂質沈着所見は図１１ＢのようにＭ群と比較してＡ群、Ｃ群、Ｅ群で改善した。Ｄ群はＥＧＦＰ発現と脂質染色の蛍光が互いに感染するため、比較に入れなかった。

実施例１３．ウイルストランスフェクションＢＣＤマウスのプロモーター選択
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９０に示す）。プロモーターＡ：ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ；プロモーターＢ：ＯＰＥＦＳ。ＢＣＤマウス（北京百奥賽図遺伝子生物技術有限会社から購入したＣｙｐ４ｖ３－／－）に１か月齢で網膜下腔注射を行い、両プロモーター・ウイルスをそれぞれ１０匹のマウスに注入し、治療ベクター（ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）／ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９０に示す））を両側眼球に注入し、注入後３か月観察した。

網膜下腔注射方法：
１）実験物を用意し、マウスを１％アトロピンで散瞳させ、その後、８０ｍｇ／ｋｇケタミン＋８ｍｇ／ｋｇトルチアジンを腹腔内注射した。

２）麻酔後再び１％アトロピンで散瞳し、マウスを眼外科手術顕微鏡（Ｔｏｐｃｏｎ、ＯＭＳ８００）の動物実験プラットフォームの前に置き、マウスの眼球上に０．５％プロメカインの局所麻酔を点眼した。

３）フルオレセインナトリウム：ウイルス＝１００：１の濃度でフルオレセインナトリウム原液をウイルスに加え、ピペットで混合した。

４）インスリン針でマウス眼球毛様体平坦部に１つの小孔をあらかじめ刺し、マイクロシリンジの針で前記小孔を貫通した後マウス眼球ガラス体腔に入り、この時マウス眼球に適量の２％ヒドロキシメチルセルロースを加えて鏡下でマウス眼底を見ることができるようにし、また針を続けて水晶体を避けて反対側周辺の網膜下に挿入し、ゆっくりフルオレセインナトリウムを持つウイルスを押し、各眼の注射量は１０で、ウイルス濃度は１ｘ１０^９で、フルオレセインナトリウムを指示薬として網膜下腔に注射するかどうかを判断した。

術後、眼球表面を生理食塩水で洗浄し、ケージに入れてマウスの覚醒を待った。

（２）眼底写真撮影で結晶性沈積情況を観察し、
１）ブランクコントロール（ＫＯ）を取り、プロモーターＡ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）、プロモーターＢ：ｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９０に示す）を注射したマウスの眼球を１％アトロピンで散瞳し、８０ｍｇ／ｋｇケタミン＋８ｍｇ／ｋｇトルチアジンＡ腹腔内注射で麻酔した。

２）麻酔後のマウスをＭｉｃｒｏＩＩＩ小動物網膜画像システム（ＰｈｏｅｎｉｘＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭｉｃｒｏＩＩＩ）の実験台に寝かせ、マウス眼球の上に適量の２％ヒドロキシメチルセルロースを滴下し、レンズと角膜の接触効果を改善した。

３）実験台を昇降、回転してマウスの目の位置を調整し、焦点距離と光強度を調整してマウスの眼底画像を得て、ＭｉｃｒｏＩＩＩソフトで撮影した。

４）撮影後、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて結晶沈着の定量分析を行った。

眼底撮影の結果は図１２の通りである。図１３は、マウスに異なるプロモーターを持つウイルスを注入した場合の眼底結晶数の統計結果である（ｎ＝５）。図１２と１３は異なるプロモーターを含むウイルスを注射した後に眼底結晶沈着が改善したことを示していた。

（３）網膜組織形態学観察：
１）固定脱水：頸椎脱臼でマウスを犠牲し、眼球を摘出し、マウスの眼球を１．５ｍｌＥＰ管内に入れ、１ｍｌの４％パラホルムアルデヒドを加え、４℃で一晩過ごした。その後、１ｍｌ３０％ショ糖溶液を入れた１．５ｍｌＥＰチューブに眼球を入れて脱水すると、眼球が沈んだ。

２）マウスの眼球を冷凍包埋剤（ＯＣＴ）の入った１．５ｍｌＥＰ管の中に入れて、ピンセットでマウスの目をまっすぐ前を見る方位にして、ＥＰ管をかぶせた後、液体窒素の中に入れて、完全に凍った後、凍結切片をして、切片の厚さは７μｍとした。アセトン４℃で１０分間固定した後、－８０℃で保存した。

３）スライスを取り出し、室温に戻した後、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。

４）スライドガラスを無組織のところで拭き、それぞれの切片に４０μ１の閉鎖液（５％ロバ血清）を滴下し、室温で１ｈ閉鎖した。

５）５％ロバ血清で一抗を希釈し、約４０μｌの抗体作動液を滴加し、マウス眼球組織を完全に覆い、４℃で一晩放置した。本実験に用いた１次抗体は：ＣＹＰ４Ｖ２（１：５０、Ｓｉｇｍａから購入）。

６）スライドガラスを取り出し、ＰＢＳで３回洗い、毎回５分であった。

７）２次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をＰＢＳで１：８００に希釈し、左右の２次抗体作動液４０μｌを滴下し、マウス眼組織を完全に覆い、室温で１時間インキュベートした。

８）ＰＢＳを３回洗浄した後、ＤＡＰＩ希釈液（１：５０００）を滴下し、室温で１５分インキュベートした。

９）スライドガラスに蛍光消光防止カプセルを滴下し、カバーガラスを覆い、－２０℃で遮光保存した。

１０）ＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓＣソフトウエアを搭載したニコンＡ１レーザー共焦点顕微鏡で観察し、写真を撮った。

図１４の免疫蛍光の結果、プロモーターＡウイルスとプロモーターＢウイルスの両方を注入したＢＣＤマウスはＣＹＰ４Ｖ２を発現できることが分かった（図中の二重矢印が範囲を示している）。

実施例１４．ウイルス感染ＢＣＤマウスの投与量選択
（１）実施例１３の方法に従ってウイルス量を検証した。ＢＣＤマウス（Ｃｙｐ４ｖ３－／－）は１か月齢で網膜下注入、治療ベクターｐＡＶ－ＯＰＥＦＳ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９０に示す）の両側眼球注入、各眼に１Ｅ８ｖｇ、１Ｅ９ｖｇ、１Ｅ１０ｖｇウイルスを注入した。注射後３ケ月観察した。

結晶沈着状況は図１５の撮影結果に示す通りである。図１６は、１Ｅ８ｖｇおよび１Ｅ９ｖｇウイルスを注入したＢＣＤマウスの眼底結晶化数を、ウイルスを注入しなかったＢＣＤマウスと同じ面積で統計的に示したものである。１Ｅ８ｖｇ、１Ｅ９ｖｇウイルスを注入したＢＣＤマウスは、ウイルスを注入しなかったＢＣＤマウスと比較して、結晶沈着数の減少を示し、１Ｅ９ｖｇウイルスを注入したＢＣＤマウスはより顕著であった。１Ｅ１０ｖｇウイルスを注入したＢＣＤマウスは、結晶沈着の有意な改善を示さず、損傷が重度であった。

（２）ＲＰＥ細胞層を剥離し、ＲＮＡを抽出し、炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＮＬＲＰ３の発現レベルを測定した。ＲＮＡおよび逆転写の抽出は、実施形態１１のステップ（４）の方法で行われ、ＲＴ－ｑＰＣＲは、実施形態１０のステップ（３）の方法で行われた。ｑＰＣＲプライマー配列をＳＥＱＩＤＮＯ：１４６－１５３に示す。

図１７は１Ｅ１０ｖｇウイルスを注射することによる炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＮＬＲＰ３の発現を上昇させ、１Ｅ１０ｖｇのウイルス剤量がＢＣＤマウスに対する毒副作用を説明し、１Ｅ９ｖｇは１Ｅ８ｖｇより良かった。そこで、１Ｅ１０ｖｇ以下のウイルス量でのフォローアップ実験を選択した。

実施例１５．異なるウイルストランスフェクションＢＣＤマウスの効果
（Ｉ）ｐ５－ｉｎｔｒｏｎＢＣＤマウスにおけるプロモーターウイルス感染の効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９３に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９９に示す）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１３に示す）。

（２）１カ月齢のＢＣＤマウス（Ｃｙｐ４ｖ３－／－）をＫＯ群、Ａ群、Ｂ群、Ａ＋Ｂ群、Ｃ群の５群に分け、１Ｅ９ｖｇのウイルスＡ、Ｂ、ＣおよびウイルスＡ＋ウイルスＢ（Ａ、Ｂはそれぞれ５Ｅ８ｖｇ）を用い、ＫＯ群はブランクコントロールとし無処置とした。網膜下注入は、実施例１３の方法に従って行われた。

（３）実施例１３の方法によって眼底写真を撮って結晶性沈積情況を観察した。図１８は、異なるウイルスを用いた網膜下注入療法後のＢＣＤマウスの眼底撮影の結果が結晶沈着を示したものである。図１９に異なるウイルスを用いた網膜下腔注入療法後のＢＣＤマウスの眼底結晶数の統計結果（ｎ＝５）を示す。結果はウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群のマウスの結晶数の減少がもっと著しいことを表明した。ウイルスＢ群のマウスの眼底結晶情況は明らかな改善が見られなかった。

（４）体網膜機能検査：網膜電図検査（ＥＲＧ）
１）マウス暗順応：マウスを少なくとも１６時間暗順応させ、その後全ての操作を暗赤色光下で行った。

２）マウス麻酔：８０ｍｇ／ｋｇケタミン＋８ｍｇ／ｋｇトルチアジンを腹腔内注射した。

３）麻酔終了後、マウスの眼を暗赤色光照明下で１％アトロピンで散瞳し、マウスを視覚電気生理学的手段ＥｓｐｉｏｎＥ２の動物実験プラットフォームの前にテープで固定し、両眼を一致させ、十分に曝露した。接地電極針をマウスの尾の根元に挿入し、参考電極針をマウスの下顎に挿入し、２つの金環記録電極を動物実験プラットフォームの電極ホルダに挟み、その角度を調整し、それぞれそれが左右眼角膜の中心先端に軽く接触するようにし、適量の２％ヒドロキシメチルセルロースを滴加し、金環電極と角膜の接触効果を改善した。

４）コンピューターＥｓｐｉｏｎＥ２システムにマウス番号と月齢情報を入力し、プログラムを実行した。行別の暗順応フラッシュの強度は、０．００３、０．０１、０．１、１、３、１０、１００ｃｄ・ｓ／ｍ^２（背景光度は０ｃｄ・ｓ／ｍ^２、刺激間隔は１５秒、３つのＥＲＧ信号の平均値を記録した。）であった。明順応閃光強度は３、１０、３０、１００ｃｄ・ｓ／ｍ^２（適応時間５分、背景光量３０ｃｄ・ｓ／ｍ^２、刺激間隔１５秒、５つのＥＲＧ信号の平均値を記録した）であった。プログラムの実行終了後に実行結果を自動的に保存し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いて結果を集計した。

図２０は異なるウイルスで網膜下腔注射治療を行ったＢＣＤマウスのＥＲＧ記録結果であり、結果によるウイルスＢ群のマウスのＥＲＧ波幅は明らかな変化がなく、ウイルスＡ群、ウイルスＡ＋Ｂ群、ウイルスＣ群のマウスのＥＲＧ波幅はすべて増加し（ｐ＜０．０５）、しかもウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群はウイルスＡ群より優れた（ｐ＜０．０５）。

（５）実施例１３ステップ（３）の方法によって、ＢＣＤマウスＣＹＰ４Ｖ２、ＲｄＣＶＦの発現状況を検査した。ＲｄＣＶＦ（１：５０、Ｈ００１１５８６１－Ｄ０１Ｐ）。

図２１は異なるウイルスを用いて網膜下腔注射治療後のＢＣＤマウスの免疫蛍光染色図である。結果、ウイルスＡ群マウスはＣＹＰ４Ｖ２（二重矢印表示範囲）を発現し、ウイルスＢ群マウスはＲｄＣＶＦ（単一矢印表示範囲）を発現し、ウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群の両方でＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦの発現が検出できた。

（６）マウス眼球ＲＰＥ切片染色にてＲＰＥ細胞数と形態を検査
１）１．５ｍｌＥＰ管に予冷ＰＢＳを入れ、マウスを犠牲した後マウス眼球を取り出し、ＰＢＳに１５分浸漬した。

２）マウスの眼球を１ｈ固定した４％パラホルムアルデヒド１．５ｍｌのＥＰチューブに移した。

３）実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＳＺ６１－ＳＥＴ）下でマウス眼球の前節を除去し、神経網膜層とＲＰＥ層を分離し、ＲＰＥ層を４つに切り取った。

４）ＲＰＥシートを予冷したＰＢＳ中で５分間ずつ３回洗浄した。

５）ＲＰＥ切片を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中に２０分間通し、その後ＰＢＳで３回洗浄し、毎回５分であった。

６）ＲＰＥ切片を９６孔板の一つの孔内に入れ、１：２００の比率でＰＢＳで希釈したＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ作動液を加え、室温で１ｈインキュベートした。

７）ＰＢＳ３回洗浄し、毎回５分で、ＲＰＥをスライドガラス上に平らに敷き、少量の錠剤を入れた後、カバーガラスで錠剤を包み、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡下で観察した。

図２２のＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ標識Ｆ－ａｃｔｉｎ染色の結果は、プロモーターＡウイルスとプロモーターＢウイルスを注入したＢＣＤマウスは、ウイルスを注入しなかったＢＣＤマウスと比較して、ＲＰＥ細胞の六角形の形態がより完全で、密に配置されていることを示している。

図２２のＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ標識Ｆ－ａｃｔｉｎ染色結果では、ＫＯ群に対してＢ群では有意な変化は認められず、ウイルスＡ＋Ｂ群およびＣ群は他の３群よりもＲＰＥ細胞の六角形の形態が整っており、緊密に配置されていることが示され、図２３では同じ面積を取ってＲＰＥ細胞数をカウントしていることが統計的に示されており、ウイルスＡ＋Ｂ群およびウイルスＣ群の同じ面積内のＲＰＥ細胞数はウイルスＡ群よりも多いことが示されている（ｎ＝５）。

結晶性沈着、網膜電図（ＥＲＧ）とＲＰＥ細胞数および形態を総合的に観察した結果、ＲｄＣＶＦ（Ｂ群）の単独発現はＢＣＤマウスの結晶性沈着、網膜電図（ＥＲＧ）とＲＰＥ細胞数および形態を改善しなかった。ＲｄＣＶＦとＣＹＰ４Ｖ２の共発現（Ａ＋Ｂ群およびＣ群）は単独発現ＣＹＰ４Ｖ２がＢＣＤマウスの結晶性沈積、網膜電図（ＥＲＧ）とＲＰＥ細胞数量と形態の改善情況に対する著しく高め、共発現ＣＹＰ４Ｖ２およびＲｄＣＶＦは単独発現ＣＹＰ４Ｖ２あるいはＥＲＧより明らかな協同作用があることを表明した。

（ＩＩ）プロモーター後のイントロンを含まないウイルス感染ＢＣＤマウスにおけるＥＲＧ効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９１に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ５－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９７に示す）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０７に示す）。

（３）実施例（一）のステップ（４）の方法によって、網膜電図検査（ＥＲＧ）を行う。図２４は上述の異なるウイルスで網膜下腔注射治療を行った後にＢＣＤマウスのＥＲＧ記録結果であり、結果によるウイルスＢ群のマウスのＥＲＧ波幅は明らかな変化がなく、ウイルスＡ群、ウイルスＡ＋Ｂ群、ウイルスＣ群のマウスのＥＲＧ波幅はすべて増加し（ｐ＜０．０５）、しかもウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群はウイルスＡ群より優れた（ｐ＜０．０５）。

（ＩＩＩ）ｐ１プロモーター・ウイルス感染ＢＣＤマウスにおけるＥＲＧ効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ１－ＣＹＰ４Ｖ２－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９２に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ１－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９８に示す）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ１－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＢＧＨ（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１０８に示す）。

（３）実施例（一）のステップ（４）の方法によって、網膜電図検査（ＥＲＧ）を行う。図２５は上述の異なるウイルスで網膜下腔注射治療を行った後にＢＣＤマウスのＥＲＧ記録結果であり、結果によるウイルスＢ群のマウスのＥＲＧ波幅は明らかな変化がなく、ウイルスＡ群、ウイルスＡ＋Ｂ群、ウイルスＣ群のマウスのＥＲＧ波幅はすべて増加し（ｐ＜０．０５）、しかもウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群はウイルスＡ群より優れた（ｐ＜０．０５）。

（ＩＶ）ＷＰＲＥ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナル部位ウイルス感染ＢＣＤマウスにおけるＥＲＧ効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９４に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＲｄＣＶＦ－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０（ＳＥＱＩＤＮＯのようなプレゼンテーション配列：（図１００）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ５－ｉｎｔｒｏｎ－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶＦ－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０（発現配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１４に示す）。

（３）実施例（一）のステップ（４）の方法によって、網膜電図検査（ＥＲＧ）を行う。図２６は上述の異なるウイルスで網膜下腔注射治療を行った後にＢＣＤマウスのＥＲＧ記録結果であり、結果によるウイルスＢ群のマウスのＥＲＧ波幅は明らかな変化がなく、ウイルスＡ群、ウイルスＡ＋Ｂ群、ウイルスＣ群のマウスのＥＲＧ波幅はすべて増加し（ｐ＜０．０５）、しかもウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群はウイルスＡ群より優れた（ｐ＜０．０５）。

（Ｖ）シグナル部位を含まないウイルス感染ＢＣＤマウスの効果
（１）実施例７の方法でウイルスを包装した。Ａ：ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１７に示す）；Ｂ：ｐＡＶ－ｐ５－ＲｄＣＶＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０に示す）；Ｃ：ｐＡＶ－ｐ５－ＣＹＰ４Ｖ２－Ｐ２Ａ－ＲｄＣＶ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２に示す）。

（３）実施例（一）のステップ（４）の方法によって、網膜電図検査（ＥＲＧ）を行った。図２７は上述の異なるウイルスを網膜下腔注射治療した後のＢＣＤマウスのＥＲＧ記録結果であり、対照と比べて、ウイルスＢ群のマウスのＥＲＧ波幅は明らかな変化がなく、ウイルスＡ群、ウイルスＡ＋Ｂ群、ウイルスＣ群のマウスのＥＲＧ波幅はすべて増加し、しかもウイルスＡ＋Ｂ群とウイルスＣ群はウイルスＡ群より優れた（ｐ＜０．０５）。

前述の詳細な説明は、説明および例として提供されるものであり、添付の請求項の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載された実施形態の様々な変更は、当業者には明白であり、添付の特許請求の範囲およびそれと同等の方法の範囲内にとどまる。

Claims

５’から３’の方向で順に、プロモーター、ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニレーションシグナル部位を含むベクターであって、前記プロモーターは、前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され、ＣＡＧプロモーターであり、前記ＣＡＧプロモーターはＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるポリヌクレオチド配列を含み、前記ＣＹＰ４Ｖ２のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７６に示されるアミノ酸配列を含み、前記ベクターはＡＡＶ２／８である、ベクター。
前記ＣＹＰ４Ｖ２をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２に示される核酸配列又はそれと少なくとも９５％の同一性のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のベクター。
前記ポリアデニレーションシグナル部位は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７～２１に示される核酸配列を含む、請求項１に記載のベクター。
請求項１～３のいずれかに記載のベクターを含む、細胞。
請求項１～３のいずれかに記載のベクターおよび／または請求項４に記載の細胞、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
被験者の網膜色素上皮（ＲＰＥ）萎縮に関連する疾患または状態の治療、緩和および／または予防のための、請求項５に記載の医薬組成物。
前記疾患または状態は、結晶性網膜変性である、請求項６に記載の医薬組成物。
前記被験者は、ヒトである、請求項６に記載の医薬組成物。