JP7619941B2

JP7619941B2 - Ｃｄ２５抗体

Info

Publication number: JP7619941B2
Application number: JP2021526461A
Authority: JP
Inventors: リィ，ビン; ピーグリービング，マシュー; トゥジップ，プン; ルンドバーグ，マット; スリニバサン，モハン
Original assignee: Ibio Inc
Current assignee: Ibio Inc
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2025-01-22
Anticipated expiration: 2039-11-14
Also published as: CN113677359A; WO2020102591A1; US20250122301A1; JP2024175003A; EP3880227A4; EP3880227A1; CA3120096A1; JP2022507487A; US12215163B2; US20230220102A1

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７６７，４０５号の優先権の利益を主張し、この仮出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。

ＣＤ２５タンパク質は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）受容体のα鎖であり、制御性Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞に存在する膜貫通タンパク質である。正常状態において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５を恒常的に発現し、エフェクター細胞の増殖を抑制するように働く。制御性Ｔ細胞は、健康状態を維持し、エフェクターＴ細胞が自己抗原に対して反応しまたは外来抗原へ過剰反応するのを阻害する。正常な防御免疫応答において、エフェクターＴ細胞は、外来抗原との接触後、増加し、制御性Ｔ細胞による阻害に打ち勝つ。しかしながら、増殖性疾患の場合、癌細胞は、制御性Ｔ細胞の量を増加させ、それにより癌細胞に対するエフェクターＴ細胞の産生を制限することにより、健康な免疫応答を不能とする。例えば、癌治療用として免疫系を弱めるために、または自己免疫疾患用として免疫系を上方制御するために、ＣＤ２５を発現する制御性Ｔ細胞の増殖を変化させるためのさらなる分子ツールが必要とされており、そのようなツールが本明細書で提供される。

ＣＤ２５と特異的に結合する抗体（抗ＣＤ２５抗体、本明細書では、ＣＤ２５抗体と、交換可能に呼ばれる）が本明細書で提供される。その抗体は、ヒト、キメラ、またはヒト化であり得る。記載された抗体の使用の方法、およびそれを作製する方法もまた本明細書で提供される。例えば、ＣＤ２５抗体は、処置を必要としている対象に抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、癌の処置に治療的に用いられ得る。本明細書に記載されたＣＤ２５抗体を産生する方法もまた提供される。

一態様において、ヒトＣＤ２５と結合するモノクローナルＣＤ２５抗体であって、以下の特性：
ａ．前記抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まず、かつ７Ｇ７Ｂ６が結合するものとは異なるエピトープと結合する；
ｂ．前記抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まないが、ＩＬ－２受容体のβ鎖とγ鎖とα鎖（ＣＤ２５）の三量体形成を阻む；
ｃ．前記抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖、β鎖、および／またはγ鎖との結合を阻み、かつダクリズマブまたはバシリキシマブが結合するものとは異なるエピトープと結合する；
ｄ．前記抗体は、７．４のｐＨにおけるＣＤ２５との結合親和性と比較した場合、７．４未満のｐＨにおいてＣＤ２５とのより高い結合親和性を示す；
ｅ．前記抗体は、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、もしくは図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｈｅａｖｙｃｈａｉｎｓ）のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む；
ｆ．前記抗体は、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、もしくは図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｓ）のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む；
ｇ．前記抗体のＶＨは、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、表５Ａ、および表６に提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列のいずれか１つを含む；
ｈ．前記ＣＤ２５抗体のＶＬは、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、表５Ｂ、および表７に提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列のいずれか１つを含む；
ｉ．前記抗体は、表６に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに表７に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む、
のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを有するモノクローナルＣＤ２５抗体が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態において、抗体のＶＨは、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、表５Ａ、もしくは表６に提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、もしくは図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の組合せのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＬは、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、表５Ｂ、もしくは表７に提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、もしくは図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の組合せのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表６に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表７に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体はまた、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓｍｏｎｋｅｙ）ＣＤ２５も結合する。

別の態様において、本明細書に記載された抗体または医薬組成物のいずれか１つの治療的有効量を対象に投与することを含む、処置を必要としている対象を処置する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された抗体または医薬組成物のいずれか１つの治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる（ｄｅｐｌｅｔｅ）方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、対象は、癌を患っており、他の実施形態においては、対象は自己免疫関連疾患または障害を患っている。

別の態様において、末梢血単核細胞を含む試料における制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、試料を本明細書に記載された抗体のいずれか１つと接触させることを含む、方法が本明細書で提供される。

関連態様において、本明細書に記載されたいずれか１つまたは複数の抗体、本明細書に記載された抗体のいずれかをコードする核酸配列、前記核酸を含むベクター、本明細書に記載された抗体のいずれかを発現するファージを含む医薬組成物またはキットが、本明細書で提供される。

本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む）に記載された上記の特徴の全部、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の全部は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部がお互いに排他的である組合せを除いて、任意の組合せで組み合わされ得る。

本出願は、添付の図と共に示された以下の説明を参照することにより理解することができる。

図１は、本明細書に記載されたＣＤ２５抗体のクラスの１つの所望の特性の例示的な説明である：ＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）のみを遮断し、ＩＬ－２の結合を遮断せず、ＩＬ－２により媒介されるシグナル伝達を阻まず、Ｔｒｅｇの枯渇をもたらすＣＤ２５抗体。データは、Ｆａｂクローンに関して収集されるが、本明細書で提供されているように、いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は完全長抗体、すなわち、ヒトＩｇＧ１抗体である。

図２は、ＣＤ２５抗体発見、インビトロ試験、およびインビボ試験についての例示的なワークフローである。

図３Ａおよび図３Ｂは、本開示の例示的なＣＤ２５抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列（配列番号６１～１０７、１５０１及び４３２～４６０）を描く。図３Ａおよび図３Ｂは、本開示の例示的なＣＤ２５抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を描く。

図４Ａおよび図４Ｂは、本開示の例示的なＣＤ２５抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（配列番号７０３、７０５、７０７、７０９、７１５、７１７、７２２、７２４、７２５、７２７、７２８、７３９、７４２、７４５、７４７、７４９～７５２、７５４～７５６、７５９、７６２、７６５、７６７、７６９、７７６、７８０、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９４、７９７、７９９、８０１、８０３、８０４、８０６、８０９～８１１、８１３、８１５、８１８、８２４、８２７、８２９、８３５、８４１、８４２、８４４、８４６、８４８、８４９、８５１、８５３、８７５～８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９２、８９７、９０１～９０３、９０５～９０８、９１４、９１７、９１９～９２２）を描く。図４Ａおよび図４Ｂは、本開示の例示的なＣＤ２５抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を描く。

図５は、本開示の例示的なＣＤ２５抗体のＶＨアミノ酸配列（配列番号８６８、８６９、１２２２、１２２９～１２３８、１３１６～１３１８及び１３２７～１３３５）を描く。

図６は、本開示の例示的なＣＤ２５抗体のＶＬアミノ酸配列（配列番号３４、７０１、７１２、７３５、７３６、７３７、７７５、７７７、７７８、７９５、８２２、８２３、８２５、８３８、８５７、８５９、８６０、８６１、８６４、８９５及び９１２）を描く。

図７は、バイオセンサーを用いた交差遮断アッセイを用いる、非ＩＬ－２遮断剤の同定を描く。

図８は、バイオセンサーを用いて、ＩＬ－２非遮断抗体、７Ｇ７Ｂ６と競合する本開示のＦａｂを発現するファージを描く。

図９は、ｐＳＴＡＴ５レベルが、ＩＬ－２用量依存的であり、かつＩＬ－２遮断抗体、ダクリズマブで阻害されることを示す。

図１０は、本開示のＤ５ＦａｂのｐＳＴＡＴ５レベルへの効果を描く。データは、Ｄ５Ｆａｂが部分的ＩＬ－２遮断剤であることを示している。

図１１は、最大ＩＬ－２ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、異なる濃度におけるＤ５ＦａｂのｐＳＴＡＴ５レベルへの効果を描く。

図１２は、対照［ＩＬ－２のみ、ダクリズマブ（Ｄａｃ）、および７Ｇ７Ｂ６］と比較した、１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、および５ｕｇ／ｍＬにおけるいくつかのＦａｂクローン間のｐＳＴＡＴ５レベルの差を描く。

図１３Ａ～１３Ｃは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたいくつかのＦａｂクローンについてのＫｄおよびＫｏｆｆ速度定数の差を描く（図１３Ａ）。いくつかの再フォーマット化クローンは、市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブよりも良い親和性およびＫｏｆｆ速度定数を有する（図１３Ｂ、図１３Ｃ）。図１３Ａ～１３Ｃは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたいくつかのＦａｂクローンについてのＫｄおよびＫｏｆｆ速度定数の差を描く（図１３Ａ）。いくつかの再フォーマット化クローンは、市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブよりも良い親和性およびＫｏｆｆ速度定数を有する（図１３Ｂ、図１３Ｃ）。図１３Ａ～１３Ｃは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたいくつかのＦａｂクローンについてのＫｄおよびＫｏｆｆ速度定数の差を描く（図１３Ａ）。いくつかの再フォーマット化クローンは、市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブよりも良い親和性およびＫｏｆｆ速度定数を有する（図１３Ｂ、図１３Ｃ）。

図１４Ａ～１４Ｄは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたＦａｂクローンを用いた、ＩＬ－２、ならびに市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブに対するエピトープビニング（ｂｉｎｉｎｇ）交差競合アッセイからの代表的なデータを示す。抗体は、異なる交差遮断プロファイルを有した。図１４Ａ～１４Ｄは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたＦａｂクローンを用いた、ＩＬ－２、ならびに市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブに対するエピトープビニング（ｂｉｎｉｎｇ）交差競合アッセイからの代表的なデータを示す。抗体は、異なる交差遮断プロファイルを有した。図１４Ａ～１４Ｄは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたＦａｂクローンを用いた、ＩＬ－２、ならびに市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブに対するエピトープビニング（ｂｉｎｉｎｇ）交差競合アッセイからの代表的なデータを示す。抗体は、異なる交差遮断プロファイルを有した。図１４Ａ～１４Ｄは、ヒトＩｇＧ１抗体へ再フォーマットされたＦａｂクローンを用いた、ＩＬ－２、ならびに市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブに対するエピトープビニング（ｂｉｎｉｎｇ）交差競合アッセイからの代表的なデータを示す。抗体は、異なる交差遮断プロファイルを有した。

図１５Ａ～１５Ｂは、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂの、ＣＤ２５＋細胞株ＳＵＤＨＬ－１およびＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞における特異的な結合（図１５Ａ）、ならびにＣＤ２５－細胞株ＳＵＤＨＬ－２における無結合（図１５Ｂ）を描く。図１５Ａ～１５Ｂは、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂの、ＣＤ２５＋細胞株ＳＵＤＨＬ－１およびＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞における特異的な結合（図１５Ａ）、ならびにＣＤ２５－細胞株ＳＵＤＨＬ－２における無結合（図１５Ｂ）を描く。図１５Ａ～１５Ｂは、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂの、ＣＤ２５＋細胞株ＳＵＤＨＬ－１およびＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞における特異的な結合（図１５Ａ）、ならびにＣＤ２５－細胞株ＳＵＤＨＬ－２における無結合（図１５Ｂ）を描く。

図１６Ａ～１６Ｂは、市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブと比較した、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンの、ＣＤ２５＋細胞株ＳＵＤＨＬ－１における代表的な用量応答曲線を示す（図１６Ａ）。いくつかのクローンは、ＩＬ－２非遮断剤７Ｇ７Ｂ６よりも良いＥＣ５０値を示している（図１６Ｂ）。図１６Ａ～１６Ｂは、市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブと比較した、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンの、ＣＤ２５＋細胞株ＳＵＤＨＬ－１における代表的な用量応答曲線を示す（図１６Ａ）。いくつかのクローンは、ＩＬ－２非遮断剤７Ｇ７Ｂ６よりも良いＥＣ５０値を示している（図１６Ｂ）。

図１７は、組換えカニクイザルＣＤ２５タンパク質（２５ｎＭ）と結合する、ヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンの代表的なデータを示す。クローンの大部分は、用量依存的様式（２５ｎＭから開始して、３倍希釈）で結合する。

図１８Ａ～１８Ｂは、０．１ｎｇ／ｍＬにおけるＩＬ－２レベルと比較した、５ｕｇ／ｍｌにおけるいくつかのヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンに渡るｐＳＴＡＴ５レベルの差を示す（図１８Ａ）。図１８Ｂは、各抗体の５ｕｇ／ｍＬを用いた、ＩＬ－２用量応答曲線（１０ｎｇ／ｍＬから開始して、１０倍希釈）に関するｐＳＴＡＴ５レベルを示す。いくつかのクローンは、０．１ｎｇ／ｍＬにおける市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブよりも良いＩＬ－２遮断剤およびＩＬ－２非遮断剤であることが示された。図１８Ａ～１８Ｂは、０．１ｎｇ／ｍＬにおけるＩＬ－２レベルと比較した、５ｕｇ／ｍｌにおけるいくつかのヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンに渡るｐＳＴＡＴ５レベルの差を示す（図１８Ａ）。図１８Ｂは、各抗体の５ｕｇ／ｍＬを用いた、ＩＬ－２用量応答曲線（１０ｎｇ／ｍＬから開始して、１０倍希釈）に関するｐＳＴＡＴ５レベルを示す。いくつかのクローンは、０．１ｎｇ／ｍＬにおける市販抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブよりも良いＩＬ－２遮断剤およびＩＬ－２非遮断剤であることが示された。

図１９Ａ～１９Ｂは、エフェクター細胞としてＰＢＭＣおよび標的としてＳＵＨＬ－１細胞を用いるＡＤＣＣアッセイにおいて細胞殺害を誘発する、２０ｕｇ／ｍＬでのヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンの代表的なデータを示す（図１９Ａ）。いくつかのクローンは、抗体の１０ｕｇ／ｍＬから開始して、５倍希釈を用いた場合、７Ｇ７Ｂ６よりも高いＡＤＣＣを示した（図１９Ｂ）。図１９Ａ～１９Ｂは、エフェクター細胞としてＰＢＭＣおよび標的としてＳＵＨＬ－１細胞を用いるＡＤＣＣアッセイにおいて細胞殺害を誘発する、２０ｕｇ／ｍＬでのヒトＩｇＧ１へ再フォーマットされたＦａｂクローンの代表的なデータを示す（図１９Ａ）。いくつかのクローンは、抗体の１０ｕｇ／ｍＬから開始して、５倍希釈を用いた場合、７Ｇ７Ｂ６よりも高いＡＤＣＣを示した（図１９Ｂ）。

ＣＤ２５と特異的に結合する抗体が本明細書で提供される。抗体は、ヒト、キメラ、またはヒト化であり得る。記載された抗体を用いる方法およびそれを作製する方法もまた本明細書で提供される。例えば、ＣＤ２５抗体は、処置を必要としている対象に抗体またはその医薬組成物を投与することを含む、癌を処置するために治療的に用いられ得る。本明細書に記載されたＣＤ２５抗体を産生する方法もまた提供される。

定義
本明細書で他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の任意の方法および材料が、本発明の実践または試験に用いることができ、例示的な方法および材料が記載されている。

本明細書に提供された見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下に定義された用語は、総じて、本明細書を参照することにより、より完全に定義される。

数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。

本明細書で用いられる場合、抗体という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、一価抗体、および抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、またはｓｃＦＶ）を含むが、それらに限定されない。ＣＤ２５に対する特異性を示す、抗体－薬物コンジュゲート、二特異性抗体、および多特異性抗体もまた本明細書で提供される。非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）は、通常の技術を用いて（例えば、マウスＣＤＲを保持しながら、フレームワーク領域において変化を導入することにより）、「ヒト化」され得る。

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で交換可能に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであり得る、任意の長さのヌクレオチドの重合体型を指す。その用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的修飾型の、非天然の、もしくは誘導体化のヌクレオチド塩基を含む重合体を含むが、それらに限定されない。その用語は、具体的に他に限定または明示がない限り、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有し、かつ類似した結合性質を有し、しかも天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される核酸を包含する。

核酸またはアミノ酸配列が、別の核酸またはアミノ酸配列と、ある特定のパーセント「配列同一性」もしくは「同一性」を有し、またはある特定のパーセント「同一」であると言われる場合、それらの配列がアライメントされている時、その２つの配列を比較した場合、そのパーセンテージの塩基またはアミノ酸が同じであり、かつ同じ相対的位置にある。

用語「個体」、「対象」、および「患者」は、本明細書で交換可能に用いられ、処置または治療が望まれている任意の対象を指す。対象は、哺乳動物対象であり得る。哺乳動物対象には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目の動物（例えば、ウサギ）、有蹄動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、およびその他）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態において、対象はコンパニオンアニマル（例えば、ネコ、イヌ）である。

抗体
ＣＤ２５と特異的に結合する抗体が本明細書で提供される。そのような抗体は、制御性Ｔ細胞上に存在する、単独か、または高親和性ＩＬ－２受容体を形成する他の分子と会合したかのいずれかでＣＤ２５抗原と結合する能力がある。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５と特異的に結合するヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、キメラ抗体、例えば、マウス－ヒトキメラ抗体、例えば、マウス可変ドメインおよびヒト定常領域を含む抗体である。

本開示のＣＤ２５抗体は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体のいずれかであり得る。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２抗体であり得る。ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。これらの抗体のいずれかの組合せもまた作製され、用いられ得る。いくつかの実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ型、例えば、ヒトＩｇＧ型である。いくつかの実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１型、例えば、ヒトＩｇＧ１型である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、１つより多い種との交差反応性を示し、例えば、ヒトＣＤ２５と非ヒトＣＤ２５の両方と特異的に結合し、例えば、ヒトＣＤ２５とカニクイザルＣＤ２５の両方と特異的に結合する。

本明細書に提供された抗体のＫＤ（親和定数）は、約１０^－５ｎＭから約１０^－１４ｎＭまでの範囲である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供された抗体のＫＤは、約１０^－８ｎＭから約１０^－１２ｎＭまでの範囲である。例示的な実施形態において、ＣＤ２５抗体のＫＤは、少なくとも約１０^－５ｎＭ、約１０^－６ｎＭ、約１０^－７ｎＭ、約１０^－８ｎＭ、約１０^－９ｎＭ、約１０^－１０ｎＭ、約１０^－１１ｎＭ、約１０^－１２ｎＭ、約１０^－１３ｎＭ、またはさらに約１０^－１４ｎＭである。

本明細書に提供された抗体のＫｄ（解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）定数）は、約１０^－２１／ｓから約１０^－６１／ｓまでの範囲である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨの両方において、ＣＤ２５抗原に対して同じ親和性（ＫＤ）を示す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨの両方において、ＣＤ２５抗原に対して同じ解離速度（Ｋｄ）を示す。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨにおいて、ＣＤ２５抗原に対して異なる親和性（異なるＫＤ）を示す。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨ（約７．４）と非生理的ｐＨにおいて、ＣＤ２５抗原に対して異なる解離速度定数（異なるＫｄ）を示す。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、生理的ｐＨより低いｐＨにおいてより、例えば、ｐＨが７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、またはそれ未満である時より、生理的ｐＨ（約７．４）においてＣＤ２５抗原に対してより低い親和性（より高いＫＤ）を示す。例示的な実施形態において、抗体は、約７．４のｐＨにおける親和性と比較して、約６．５のｐＨにおいてＣＤ２５抗原に対するより高い親和性を示す。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、酸性環境、低酸素環境、例えば、腫瘍微小環境において活性を保持し、または活性の増強を示すのに有用である。

いくつかの実施形態において、抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体（ｂｌｏｃｋｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ）（非ＩＬ－２遮断剤（ｂｌｏｃｋｅｒ））であり、すなわち、その抗体のＣＤ２５との結合は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５（ＩＬ－２α鎖）との結合を阻まずまたは妨げず、かつＩＬ－２媒介性シグナル伝達、例えば、ＩＬ－２／ＪＡＫ３／ＳＴＡＴ－５シグナル伝達経路を通してのシグナル伝達に影響しない。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５（ＩＬ－２ α鎖）との結合を阻まず、かつ７Ｇ７Ｂ６抗体が結合する所とは異なるエピトープと結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５（ＩＬ－２ α鎖）との結合を阻まないが、ＩＬ－２受容体のβ鎖とγ鎖とα鎖（ＣＤ２５）の三量体形成を阻む。

いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ－２遮断抗体（ＩＬ－２遮断剤）であり、例えば、その抗体は、ＩＬ－２リガンドのその受容体のα鎖、β鎖、および／またはγ鎖との結合を阻みまたは妨げ、かつＩＬ－２媒介性シグナル伝達を減少させまたは阻害する。ある特定の実施形態において、抗体は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５との結合を阻みまたは妨げる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５との結合を阻みまたは妨げ、かつダクリズマブかまたはバシリキシマブのいずれかが結合するエピトープとは異なるエピトープと結合する。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、部分的遮断抗体（部分的ＩＬ－２遮断剤）であり、ＩＬ－２リガンドの、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα鎖、β鎖、および／もしくはγ鎖との結合を完全ではないが、部分的に、阻み、ならびに／または、ＩＬ－２媒介性シグナル伝達を、完全ではないが、部分的に減少させる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＩＬ－２ α鎖、ＩＬ－２ β鎖、およびＩＬ－２ γ鎖のヘテロ三量体形成を阻みまたは妨げる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５との結合を遮断しないが、ＩＬ－２ α鎖、ＩＬ－２ β鎖、およびＩＬ－２ γ鎖のヘテロ三量体形成を阻みまたは妨げる。ある特定の実施形態において、抗体は、制御性Ｔ細胞と選択的に結合する。他の実施形態において、抗体は、Ｔエフェクター細胞に選択的に結合する。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体の結合は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇をもたらすが、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を許容する。

いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＤ２５とトランス配向で結合する。他の実施形態において、抗体は、ＣＤ２５とシス配向で結合する。なおさらなる実施形態において、抗体は、ＣＤ２５と、シス立体配置またはトランス立体配置のどちらでも結合する能力がある。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、７Ｇ７Ｂ６（マウスＩｇＧ２ａＦｃ受容体を有する抗ヒトＣＤ２５；ＩＬ－２非遮断剤；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のＣＤ２５との結合と比較して、ＣＤ２５に対するより高い結合親和性を示す。

表１Ａ～１Ｌ、表２Ａ～２Ｃ、表３Ａ～３Ｃ、表４Ａ～４Ｂ、表５Ａ～５Ｂ、表６、および表７、ならびに図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ、図５、および図６は、本明細書に記載されたＣＤ２５抗体についての例示的な配列を提供する。示された相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク（ＦＲ）配列は、抗体アノテーションについてのＩＭＧＴ協定に基づいていることは留意されたい。しかしながら、当業者は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａなどの抗体アノテーションのための他のアルゴリズム／協定を用いて、提示されたＶＨおよびＶＬ配列に基づいたＣＤＲおよびフレームワーク配列の他の表現を決定することができる。したがって、本開示のＣＤＲおよびＦＲ配列は、下記の表にアノテーションされた例示的なＣＤＲおよびＦＲ配列に限定されないが、むしろ、可変領域の配列を考慮すれば、ＣＤＲは、当業者により理解され、決定されるであろう。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表２Ａ、表２Ｂ、および表２Ｃのいずれか１つに提示された「Ｖ－Ｄ－Ｊ領域」重鎖配列と表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃのいずれか１つに提示された「Ｖ－Ｊ領域」軽鎖配列、それらのヒト化バージョン、またはそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、与えられた「ＩＤ」によりそのように名づけられた特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列（またはそのヒト化バージョン）、および同じ抗体クローン由来の軽鎖（例えば、同じ「ＩＤ」により識別されるクローン由来の軽鎖）可変領域配列（またはそのヒト化バージョン）を含む。したがって、起源の抗体クローンは、表２Ａ～２Ｃまたは表３Ａ～３Ｃに示されたＩＤにより識別することができる。例えば、そのような実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表２Ｂの行１に提示されている抗体クローン「ＡＨＨ０３７６０」の重鎖可変領域（またはそのヒト化バージョン）、および表３Ｂの行３に提示されている抗体クローン「ＡＨＨ０３７６０」の軽鎖可変領域（またはそのヒト化バージョン）を含む。他の実施形態において、ＣＤ２５抗体は、与えられた「ＩＤ」によりそのように名づけられた特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列（またはそのヒト化バージョン）、および異なる抗体クローン由来の軽鎖（例えば、同じ「ＩＤ」により識別されるクローン由来の軽鎖）可変領域配列（またはそのヒト化バージョン）を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表２Ａ、表２Ｂ、および表２Ｃのいずれか１つに提示されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびに表３Ａ、表３Ｂ、および表３Ｃのいずれか１つに提示されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。そのような実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３、ならびに同じ抗体クローン由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。上記で論じられているように、起源の抗体クローンは、表２Ａ～２Ｃまたは表３Ａ～３Ｃに示されたＩＤにより識別することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表４Ａに提示された重鎖可変領域、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。その可変領域は、完全な可変領域を形成し得る連続したＨＦＲ１、ＣＤＲＨ１、ＨＦＲ２、ＣＤＲＨ２、ＨＦＲ３、ＣＤＲＨ３、ＨＲＦ４配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表４Ｂに提示された軽鎖可変領域、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。その可変領域は、完全な可変領域を形成し得る連続したＬＦＲ１、ＣＤＲＬ１、ＬＦＲ２、ＣＤＲＬ２、ＬＦＲ３、ＣＤＲＬ３、ＬＲＦ４配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表４Ａに提示されている完全な重鎖可変領域および表４Ｂに提示されている完全な軽鎖可変領域を含み、その可変領域には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列および同じ抗体クローン由来の軽鎖可変領域配列を含み、その可変領域配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列および異なる抗体クローン由来の軽鎖可変領域配列を含み、その可変領域配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。起源の抗体クローンは、表４Ａおよび表４Ｂに示されたＩＤにより識別することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表４Ａに提示されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに表４Ｂに提示されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに同じ抗体クローン由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。他の実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに異なる抗体クローン由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。上記で論じられているように、起源の抗体クローンは、表４Ａおよび表４Ｂに示されたＩＤにより識別することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ａに提示された重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。その可変領域は、完全な可変領域を形成し得る連続したＨＦＲ１、ＣＤＲＨ１、ＨＦＲ２、ＣＤＲＨ２、ＨＦＲ３、ＣＤＲＨ３、ＨＲＦ４配列を含み得、その配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ｂに提示された軽鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。その可変領域は、完全な可変領域を形成し得る連続したＬＦＲ１、ＣＤＲＬ１、ＬＦＲ２、ＣＤＲＬ２、ＬＦＲ３、ＣＤＲＬ３、ＬＲＦ４配列を含み得、その配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ａに提示されている完全な重鎖可変領域および表５Ｂに提示されている完全な軽鎖可変領域を含み、その可変領域には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列および同じ抗体クローン由来の軽鎖可変領域配列を含み、その可変領域配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。他の実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来の重鎖可変領域配列および異なる抗体クローン由来の軽鎖可変領域配列を含み、その可変領域配列には、そのヒト化バージョン、およびそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列も挙げられる。起源の抗体クローンは、表５Ａおよび表５Ｂに示されたＩＤにより識別することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ａに提示されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに表５Ｂに提示されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに同じ抗体クローン由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。他の実施形態において、ＣＤ２５抗体は、特定の抗体クローン由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２，およびＣＤＲＨ３、ならびに異なる抗体クローン由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む。上記で論じられているように、起源の抗体クローンは、表５Ａおよび表５Ｂに示されたＩＤにより識別することができる。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、もしくは図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、さらにヒト化されている、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、または図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、もしくは図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された軽鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、通常の技術を用いて、さらにヒト化されている、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、または図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、もしくは図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含み、かつＣＤ２５抗体は、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、もしくは図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された軽鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＨは、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、もしくは表５Ａに提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、もしくは図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＨは、表６に提示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＬは、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、もしくは表５Ｂに提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、もしくは図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＬは、表７に提示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＨは、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、もしくは表５Ａに提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、もしくは図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含み、かつＣＤ２５抗体のＶＬは、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、もしくは表５Ｂに提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、もしくは図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体のＶＨは、表６に提示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含み、かつＣＤ２５抗体のＶＬは、表７に提示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体のＶＨは、表５Ａに提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体のＶＬは、表５Ｂに提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、表５Ａに提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに表５Ｂに提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ａおよび表１Ｂに提示された、Ｄ５ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ５ＶＨおよびＤ５ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ａおよび表１Ｂに提示されたＤ５ＶＨおよびＤ５ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ｃおよび１Ｄに提示された、Ｄ１１ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ１１ＶＨおよびＤ１１ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ｃおよび１Ｄに提示されたＤ１１ＶＨおよびＤ１１ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ｅおよび１Ｆに提示された、Ｄ１６ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ１６ＶＨおよびＤ１６ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ｅおよび１Ｆに提示されたＤ１６ＶＨおよびＤ１６ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ｇおよび１Ｈに提示された、Ｄ１７ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ１７ＶＨおよびＤ１７ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ｇおよび１Ｈに提示されたＤ１７ＶＨおよびＤ１７ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ｉおよび１Ｊに提示された、Ｄ３４ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ３４ＶＨおよびＤ３４ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ｉおよび１Ｊに提示されたＤ３４ＶＨおよびＤ３４ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、表１Ｋおよび１Ｌに提示された、Ｄ３６ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、Ｄ３６ＶＨおよびＤ３６ＶＬのアミノ酸配列、または表１Ｋおよび１Ｌに提示されたＤ３６ＶＨおよびＤ３６ＶＬのアミノ酸配列のヒト化バージョンを含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ａに提示された、ＡＨ０４５０７、ＡＨ０４５２２、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０４５２７、ＡＨ０４７３４、ＡＨ０４７５０、ＡＨ０５２１４、ＡＨ０５２４７、ＡＨ０５２４９、ＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２５６、ＡＨ０５２５７、ＡＨ０５２５８、ＡＨ０５２５９、ＡＨ０５２６８、ＡＨ０５２７１、ＡＨ０５２７４、ＡＨ０５２８０、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２８６、ＡＨ４５０１、ＡＨ４５０２、ＡＨ４５０３、ＡＨ４５０５、ＡＨ４５０９、ＡＨ４５１１、ＡＨ４５１８、ＡＨ４５２３、ＡＨ４５２４、ＡＨ４５２５、Ｄ１１、Ｄ１７、Ｄ３４、Ｄ３６、Ｄ５、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｃ４、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１０、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｅ３、またはＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１のクローンのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ｂに提示された、ＡＨ０４５０７、ＡＨ０４５２２、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０４５２７、ＡＨ０４７３４、ＡＨ０４７５０、ＡＨ０５２１４、ＡＨ０５２４７、ＡＨ０５２４９、ＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２５６、ＡＨ０５２５７、ＡＨ０５２５８、ＡＨ０５２５９、ＡＨ０５２６８、ＡＨ０５２７１、ＡＨ０５２７４、ＡＨ０５２８０、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２８６、ＡＨ４５０１、ＡＨ４５０２、ＡＨ４５０３、ＡＨ４５０５、ＡＨ４５０９、ＡＨ４５１１、ＡＨ４５１８、ＡＨ４５２３、ＡＨ４５２４、ＡＨ４５２５、Ｄ１１、Ｄ１７、Ｄ３４、Ｄ３６、Ｄ５、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｃ４、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１０、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｅ３、またはＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１のクローンのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、表５Ａに提示された、ＡＨ０４５０７、ＡＨ０４５２２、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０４５２７、ＡＨ０４７３４、ＡＨ０４７５０、ＡＨ０５２１４、ＡＨ０５２４７、ＡＨ０５２４９、ＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２５６、ＡＨ０５２５７、ＡＨ０５２５８、ＡＨ０５２５９、ＡＨ０５２６８、ＡＨ０５２７１、ＡＨ０５２７４、ＡＨ０５２８０、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２８６、ＡＨ４５０１、ＡＨ４５０２、ＡＨ４５０３、ＡＨ４５０５、ＡＨ４５０９、ＡＨ４５１１、ＡＨ４５１８、ＡＨ４５２３、ＡＨ４５２４、ＡＨ４５２５、Ｄ１１、Ｄ１７、Ｄ３４、Ｄ３６、Ｄ５、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｃ４、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１０、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｅ３、またはＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１のクローンのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含み、かつＣＤ２５抗体は、表５Ｂに提示された、ＡＨ０４５０７、ＡＨ０４５２２、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０４５２７、ＡＨ０４７３４、ＡＨ０４７５０、ＡＨ０５２１４、ＡＨ０５２４７、ＡＨ０５２４９、ＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２５６、ＡＨ０５２５７、ＡＨ０５２５８、ＡＨ０５２５９、ＡＨ０５２６８、ＡＨ０５２７１、ＡＨ０５２７４、ＡＨ０５２８０、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２８６、ＡＨ４５０１、ＡＨ４５０２、ＡＨ４５０３、ＡＨ４５０５、ＡＨ４５０９、ＡＨ４５１１、ＡＨ４５１８、ＡＨ４５２３、ＡＨ４５２４、ＡＨ４５２５、Ｄ１１、Ｄ１７、Ｄ３４、Ｄ３６、Ｄ５、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｃ４、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１０、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｅ３、またはＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１のクローンのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４５０７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４５２２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４５２６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４５２７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４７３４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０４７５０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２１４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２４７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２４９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２５１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２５６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２５７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２５８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２５９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２６８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２７１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２７４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２８０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２８５のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ０５２８６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５０１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５０２のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５０３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５０５のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５０９のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５１１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５１８のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５２３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５２４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＡＨ４５２５のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、Ｄ１１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、Ｄ１７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、Ｄ３４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、Ｄ３６のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、Ｄ５のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｃ４のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１０のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｅ３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、ＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（表５Ａおよび表５Ｂ、それぞれに提示されている）を含む；いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体はヒト化抗体である。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、様々な目的のためにコンジュゲートされ、その目的には、治療学および検出／診断学における使用が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書に提供されたＣＤ２５抗体のいずれかをコードする核酸配列もまた本明細書で提供される。Ｄ５、Ｄ１１、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ３４、およびＤ３６ＶＨおよびＶＬ領域をコードする例示的な核酸配列は、表１Ａ～１Ｌに提供されている－そのヒト化バージョンを用いることができる。前記抗体をコードする核酸のいずれかを含むベクター、そのようなベクターを含むファージ、およびそのようなベクターを含む宿主細胞もまた本明細書で提供される。

抗体産生および試験
図２は、ＣＤ２５抗体発見、インビトロ試験、およびインビボ試験についての例示的な非限定的ワークフローであるが、抗体発見および試験にアプローチする代替方法があることを当業者は認識している。

本明細書に記載されたＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５完全または部分的免疫原を動物、例えば、マウスまたはウサギへの注射により産生することができる。その動物由来のＣＤ２５免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅ）陽性Ｂ細胞を収集し、それからファージライブラリを作製することができる。いくつかの実施形態において、ファージは、候補ＣＤ２５抗体のＦａｂ断片を発現する。ファージは、例えば連続的に低くなった濃度のＣＤ２５抗原に対する、複数ラウンドのスクリーニング（本明細書ではファージパニングと呼ばれる）を受けて、ＣＤ２５を高親和性で結合する能力があるＦａｂ断片が選択され得る。ファージは、ＣＤ２５抗原をコーティングされたビーズ、または例えば、いくつかの他の基板に対してスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態において、スクリーニングは、生理的ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．４）で実行される。他の実施形態において、スクリーニングは、治療関連における使用のために、例えば、低酸素の酸性腫瘍微小環境における使用のために、より低いｐＨにおいてＣＤ２５抗原を結合する能力があるＦａｂ断片についてスクリーニングするために、より低いｐＨ、例えば、約６．５のｐＨで実行される。

本明細書で作製されたＣＤ２５抗体は、いくつかのインビトロの、インビボの、エクスビボの、および／または細胞に基づいたアッセイを用いて有効性について試験され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、制御性Ｔ細胞を枯渇させるそれらの能力についてアッセイし、かつさらに、それに基づいて選択することができる。特定の実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、酸性環境、例えば、生理的ｐＨより低いｐＨ、例えば、ｐＨ７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、またはそれ未満において、制御性Ｔ細胞を枯渇させるそれらの能力についてアッセイし、かつさらに、それに基づいて選択することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、ＩＬ－２／ＩＬ－２受容体経路を通してのシグナル伝達についてアッセイするために、ｐＳＴＡＴ５インビトロアッセイに基づいて、アッセイしかつさらに選択することができ、そのシグナル伝達の維持は、その抗体がＩＬ－２遮断抗体ではないことを示している。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、分子相互作用を特徴づけるためにバイオセンサースクリーニングを用いてアッセイすることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、既知の機構を有する他の既知のＣＤ２５抗体に対する、結合における競合についてアッセイすることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、エピトープ特異性についてアッセイすることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書におけるＣＤ２５抗体は、非ＩＬ－２遮断剤、ＩＬ－２遮断剤、または部分的ＩＬ－２遮断剤であるそれらの能力についてアッセイすることができる。

治療的使用
治療的使用、例えば、癌などの増殖性疾患もしくは障害における使用、または自己免疫疾患における使用のためのＣＤ２５抗体が本明細書で提供される。

したがって、治療的有効量の治療用ＣＤ２５抗体を、必要としている対象に投与することを含む、癌を処置する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、癌は原発性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、転移性癌である。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍を含み、他の実施形態においては、癌は液性腫瘍、例えば、血液に基づいた癌を含む。例示的な実施形態において、ＣＤ２５抗体は非ＩＬ－２遮断抗体である。

したがって、治療的有効量の治療用ＣＤ２５抗体を、必要としている対象に投与することを含む、自己免疫関連疾患または障害を処置する方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態において、ＣＤ２５抗体はＩＬ－２遮断抗体である。

本明細書で用いられる場合、対象は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、それには、ヒト、家庭用および農場用動物、ならびに動物園用、スポーツ用、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどが挙げられる。対象は雄性または雌性であり得る。

本明細書に提供された治療用ＣＤ２５抗体のいずれかの投与は、他の既知の薬物／処置（例えば、小分子薬または生物製剤）と併用して、投与され得る。投与は逐次的または同時的であり得る。

本明細書に記載された治療用ＣＤ２５抗体のインビボ投与は、静脈内に、腫瘍内に、頭蓋内に、病変内に（例えば、病変内注射、直接的接触拡散）、腔内（腹腔内、胸膜内、子宮内、直腸内）、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、埋入により、吸入により、髄腔内に、脳室内に、または鼻腔内に、実行され得る。例示的な実施形態において、投与経路は静脈内注射による。

治療的有効量の治療用抗体が投与される。治療用抗体の適切な投薬量は、癌の重症度、対象の臨床状態、対象の病歴および処置に対する応答、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。

本明細書に提供されたＣＤ２５抗体の投薬量は、投与経路に依存して、１日あたり対象の体重１ｋｇにつき約１ｎｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上まで変動し得る。数日間またはそれ以上に渡る反復投与について、癌の重症度に依存して、処置は、症状の所望の抑制が達成されるまで持続され得る。投薬レジメンは、医師が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに依存して、有用であり得る。例えば、１週間に１回から２１回まで個体に投薬することが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、投薬頻度は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、週１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、または月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、またはそれより長い間隔である。治療の過程は、通常の技術およびアッセイによりモニターされ得る。投薬レジメンは、用いられる用量に関わりなく、時間と共に変わり得る。

診断的使用
本明細書に提供されたＣＤ２５抗体は、診断および検出のために用いられ得る。適用に依存して、ＣＤ２５抗体は、インビボまたはインビトロで検出および定量化され得る。

本明細書に提供されたＣＤ２５抗体は、様々なイムノアッセイにおける使用のために修正可能である。これらのイムノアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、分光光度法、放射線写真撮影、電気泳動、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書に提供されたＣＤ２５抗体は、検出可能な標識、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、蛍光性、電気的、光学的、または化学的方法により検出可能な標識を含み得る。本開示における有用な標識には、蛍光色素、放射標識、酵素、比色標識、アビジン、またはビオチンが挙げられるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ＣＤ２５抗体は、核医学装置（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、またはシンチグラフィー）による画像化に有用な同位元素で放射標識される。

医薬組成物
本開示は、治療用ＣＤ２５抗体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は無菌である。医薬組成物は、一般的に、薬学的に許容される賦形剤中に有効量の治療用抗体を含む。

キットおよび製造品
本開示はまた、例えば、治療的かまたは診断的かのいずれかの使用のための、本明細書に記載されたＣＤ２５抗体のいずれかを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットはさらに、二次抗体のいずれか、免疫組織化学分析のための試薬、薬学的に許容される賦形剤、および取扱説明書、ならびにそれらの任意の組合せから選択されるコンポーネントを含有する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載された治療用組成物のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含む。

本出願はまた、本明細書に記載された治療的または診断的組成物またはキットのいずれか１つを含む製造品を提供する。製造品の例には、バイアル（例えば、密封バイアル）が挙げられる。

本明細書に提供された説明は、多数の例示的な構造、方法、パラメータなどを示している。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲への限定として意図されるものではなく、そうではなく、例示的な実施形態の説明として提供されることは、認識されるべきである。

以下の例は、例証を目的として含まれ、本発明の範囲を限定することを意図されない。

実施形態の列挙
実施形態１．ヒトＣＤ２５と結合するモノクローナルＣＤ２５抗体であって、以下の特性：
ａ．抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まず、かつ７Ｇ７Ｂ６が結合するものとは異なるエピトープと結合する；
ｂ．抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まないが、ＩＬ－２受容体のβ鎖とγ鎖とα鎖（ＣＤ２５）の三量体形成を阻む；
ｃ．抗体は、ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）、β鎖、および／またはγ鎖との結合を阻み、かつダクリズマブまたはバシリキシマブが結合するものとは異なるエピトープと結合する；
ｄ．抗体は、７．４のｐＨにおけるＣＤ２５との結合親和性と比較した場合、７．４未満のｐＨにおいてＣＤ２５とのより高い結合親和性を示す；
ｅ．抗体は、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、もしくは図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む；
ｆ．抗体は、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、もしくは図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された軽鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む；
ｇ．抗体のＶＨは、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、表５Ａ、および表６に提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列のいずれか１つを含む；
ｈ．ＣＤ２５抗体のＶＬは、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、表５Ｂ、および表７に提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列のいずれか１つを含む；
ｉ．抗体は、表６に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに表７に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。
の少なくとも１つを有する、モノクローナルＣＤ２５抗体。

実施形態２．実施形態１で提供された特性の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを有する、実施形態１に記載の抗体。

実施形態３．ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まず、かつ７Ｇ７Ｂ６が結合するものとは異なるエピトープと結合する、実施形態１に記載の抗体。

実施形態４．ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体のα鎖（ＣＤ２５）との結合を阻まないが、ＩＬ－２受容体のβ鎖とγ鎖とα鎖（ＣＤ２５）の三量体形成を阻む、実施形態１に記載の抗体。

実施形態５．ＩＬ－２リガンドのＩＬ－２受容体との結合を阻み、かつダクリズマブまたはバシリキシマブが結合するものとは異なるエピトープと結合する、実施形態１に記載の抗体。

実施形態６．７．４のｐＨにおけるＣＤ２５との結合親和性と比較した場合、７．４未満のｐＨにおいてＣＤ２５とのより高い結合親和性を示す、実施形態１に記載の抗体。

実施形態７．約６．５のｐＨにおいてＣＤ２５との結合のより高い親和性を示す、実施形態６に記載の抗体。

実施形態８．表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、および表５Ａ、もしくは図３Ａ、図３Ｂ、および図５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態９．表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、および表５Ｂ、もしくは図４Ａ、図４Ｂ、および図６に提示された軽鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１０．抗体のＶＨが、表１Ａ、表１Ｃ、表１Ｅ、表１Ｇ、表１Ｉ、表１Ｋ、表２Ａ、表２Ｂ、表２Ｃ、表４Ａ、もしくは表５Ａに提示されている、または図３Ａ、図３Ｂ、もしくは図５に提示された配列に含有されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１１．ＣＤ２５抗体のＶＬが、表１Ｂ、表１Ｄ、表１Ｆ、表１Ｈ、表１Ｊ、表１Ｌ、表３Ａ、表３Ｂ、表３Ｃ、表４Ｂ、もしくは表５Ｂに提示されている、または図４Ａ、図４Ｂ、もしくは図６に提示された配列に含有されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～７および実施形態１０のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１２．ＣＤ２５抗体が、表６に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１３．ＣＤ２５抗体が、表７に提示された組合せのいずれか１つのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１４．ヒト抗体である、実施形態１～１３のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１５．ヒト化抗体である、実施形態１～１３のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１６．キメラ抗体である、実施形態１～１３のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１７．マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを含む、実施形態１６に記載の抗体。

実施形態１８．抗体断片である、実施形態１～１５のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態１９．カニクイザルＣＤ２５も結合する、実施形態１～１８のいずれか一実施形態に記載の抗体。

実施形態２０．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つを含む、医薬組成物。

実施形態２１．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つをコードする核酸配列。

実施形態２２．実施形態２１に記載の核酸配列を含むベクター。

実施形態２３．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つを発現するファージ。

実施形態２４．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つまたは実施形態２０に記載の医薬組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、処置を必要としている対象を処置する方法。

実施形態２５．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つまたは実施形態２０に記載の医薬組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法。

実施形態２６．対象が癌を患っている、実施形態２４または２５に記載の方法。

実施形態２７．対象が自己免疫関連疾患または障害を患っている、実施形態２４または２５に記載の方法。

実施形態２８．末梢血単核細胞を含む試料における制御性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、前記試料を実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つと接触させることを含む、方法。

実施形態２９．実施形態１～１９のいずれか一実施形態に記載の抗体のいずれか１つまたは実施形態２０に記載の医薬組成物を含むキット。

実施例１
ＣＤ２５での免疫化
ＫＬＨとコンジュゲートされた完全長ＣＤ２５を、５匹の異なるＢａｌｂＣマウスへ注射した。全ての注射を、尾静脈を介して行った。免疫化プロトコールは以下の通りであった：
－０日目：免疫化１
－１４日目：免疫化２
－２８日目：免疫化３
－３５日目：採血

５匹のマウスのうちの４匹からの脾細胞および白血球を用いて、４つのファージライブラリを作製した。ファージライブラリは、抗原結合断片（Ｆａｂ）を発現するファージを含有した。より具体的には、免疫化動物由来の材料を用いるＭ１３ファージミドライブラリを、以下のように構築した。（ｉ）白血球および脾細胞由来の全ＲＮＡを抽出した；（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、特異的なプライマーを用いて増幅した；ならびに（ｉｉｉ）ＶＨおよびＶＬ断片を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＭ１３ファージミドベクターへ２段階クローニングにより挿入した。ライブラリサイズ＞２×１０^８；挿入率は＞９０％であり、インフレーム率は＞８０％であった。ライブラリは、＞９５％の固有配列を有する、高度な多様性のライブラリであった。

実施例２
ＣＤ２５結合についてのファージパニング
Ｆａｂ含有ファージライブラリのファージパニングの３ラウンドを、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイを用いて実行した。ファージを、ＣＤ２５でコーティングされたビーズに対してスクリーニングした。各ラウンドを、減少する濃度のＣＤ２５を用いて実行した。個々のファージクローンは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（ＬＢ／カルベニシリン上にプレーティングされた）において発現した。単一コロニーを、０．４ｍｌ２ＹＴブロス中、３７℃で３０分間、培養し、その後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージに、３７℃で３時間、感染させた。その後、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌカナマイシンを、その培養物へ加え、その後、それを２５℃で一晩、増殖させた。次の日、ファージをその培養物から採取した。

陽性クローンを以下のようにシーケンシングした。陽性ヒットクローンを一晩、培養し、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて調製した。精製されたプラスミドを、サンガーシーケンシングのために、ＧｅｎｅｗｉｚおよびＥＬＩＭＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓへ提出した。ＶＨ配列は、シーケンシングプライマー（ＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴ（配列番号１４９７））または（ＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣ（配列番号１４９８））を用いて得られた。ＶＬ配列は、シーケンシングプライマー（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ（配列番号１４９９））または（ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ（配列番号１５００））を用いて得られた。

図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、および図４Ｂ、ならびに表２Ａ、表２Ｂ、表３Ａ、および表３Ｂは、第２ラウンドのパニング後に選択されたＦａｂのＶＨおよびＶＬ配列を示す。

図５および図６、ならびに表２Ｃおよび３Ｃは、第３ラウンドのパニング後に選択されたＦａｂのＶＨおよびＶＬ配列を示す。

表４Ａ、表４Ｂ、表５Ａ、および表５Ｂは、類似したパニングプロトコール後の追加のクローンを示す。

さらなるｐＨに基づいたファージパニングを実行した。

実施例３
ｐＨ６．５におけるＣＤ２５結合についてのファージパニング
より低いｐＨ範囲においてＣＤ２５を結合するＦａｂ候補について選択するために、例えば低酸素の酸性腫瘍微小環境において、結合することができる結合剤について選択するために、さらなるファージパニングを実行した。

標準ファージディスプレイプロトコール（Barbas et al., 2001）を用いて、４つのマウスＨｕＣＤ２５免疫化ファージライブラリ（７８０７、７８０８、７８０９、７８１０）を、ＴＧ１においてエレクトロポレーションにより形質転換し、ファージをＣＭ１３の添加により増殖させた。ファージを分泌するＴＧ１培養物を、氷上での１時間のインキュベーション後、ＰＥＧ／ＮａＣｌでＰＥＧ沈殿させた。

ファージライブラリ（７８０７、７８０８、７８０９、７８１０）を、標準プロトコールを用いる特定のｐＨ選択に用いた。生理的ｐＨにおいて高親和性で結合する抗体を除去するために、まず、ＰＢＳＴｐＨ７．４中１０ｕｇ／ｍｌ完全長ＣＤ２５（４００ｎＭ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上での１時間の吸収によるｐＨ７．４における３×１０^１１個のｐｆｕファージ（３×１０^８個の１０００倍表示）の対抗選択により、サブトラクティブパニングを実行した。生じたファージ上清を収集し、ｐＨを、ＰＢＳＴを用いてｐＨ６．５に調整した。次のファージパニング選択を、ｐＨ６．５において実行した。

パニング選択物を、１時間のインキュベーション後、ＣＤ２５抗原を含まない２５マイクロリットルのストレプトアビジンダイナビーズを用いて、予め清浄化した。その後、ファージを、新しい、予めブロッキングされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆＬｏＢｉｎｄチューブへ加えた。ビオチン化完全長ＣＤ２５抗原を、１００ｎＭ濃度において１時間、加えた。その後、試料を、２５マイクロリットルのストレプトアビジンビーズと、室温で１時間、インキュベートした。試料をペレット化し、ＰＢＳＴと共に磁石／磁気ビーズを用いて、７～９回、洗浄した。残留ファージを除去するために、チューブを２回、交換した。

ファージを溶出するために、８００マイクロリットルのグリシン、ｐＨ２．２をビーズに加え、１０分間だけ、インキュベートした。その後、それらを、高いｐＨのＴｒｉｓ９．０で中和した。溶出されたファージを、新鮮に増殖した（ＯＤ６００約０．５）１ｍｌＴＧ１に加え、２０～３０分間、インキュベートした。分画の対数希釈系列（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｌｏｇｄｉｌｕｔｉｏｎｓｅｒｉｅｓ）をプレート上にプレーティングし、その残りを、２５ｍｌ２×ＹＴ（２×酵母トリプトンブロス）へ移した。これらの工程を、さらに２回、合計３パニングラウンド、繰り返し、その後、ペリプラスム抽出物のファージＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔスクリーニングを行った。

シーケンシング
陽性ヒットクローンを、一晩、培養し、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて調製した。精製されたプラスミドを、サンガーシーケンシングのために、ＧｅｎｅｗｉｚおよびＥＬＩＭＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓへ提出した。ＶＨ配列は、シーケンシングプライマー（ＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴ（配列番号１４９７））または（ＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣ（配列番号１４９８））を用いて得られた。ＶＬ配列は、シーケンシングプライマー（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ（配列番号１４９９））または（ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ（配列番号１５００））を用いて得られた。ＶＨおよびＶＬＶ－Ｄ－Ｊ配置、核酸アライメント、およびアミノ酸アライメントを、ＩＭＧＴＨｉｇｈＶ－Ｑｕｅｓｔにより同定した。

選択されたＦａｂクローンＤ５、Ｄ１１、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ３４、およびＤ３６についての配列は、表１Ａ～１Ｌに提示されている。

実施例４
ファージＥＬＩＳＡプロトコールおよびバイオセンサー／Ｏｃｔｅｔスクリーニング
ＥＬＩＳＡ／抽出物調製
ＣＤ２５のＦａｂファージとの結合を評価するためのファージＥＬＩＳＡ、およびＦａｂＯｃｔｅｔスクリーニングのためのペリプラスム抽出物調製を、本質的には記載されているように行い、改変を付記した（Schwimmer et al., 2013）。

ＣＤ２５抗原を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した。コーティングされ得る９６ウェルプレートの各ウェルについて１ｕｇのＣＤ２５を含有する５０マイクロリットルの抗原溶液を作製した。５０マイクロリットルの抗原溶液をＥＬＩＳＡプレートウェルに加え、４℃で一晩、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで２回、洗浄し、ウェルを、２００マイクロリットルの１×ＰＢＳＴ２．０％ＢＳＡを加えることによりブロッキングし、２５℃で２時間、インキュベートした。ファージを、１×ＰＢＳＴ１．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．５中、２倍希釈した。５０マイクロリットルを加え、室温で５分間、インキュベートした。ブロッキング溶液を、ウェルから振るい落とし、５０ｕｌの希釈ファージ調製物を各ウェルに加え、室温で１時間、インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートウェルを、２００マイクロリットルのＰＢＳＴｐＨ６．５で３～５回、洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート型抗Ｍ１３抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５０３７０）を、１×ＰＢＳＴ１．０％ＢＳＡｐＨ６．５で１：５０００希釈した。希釈された二次抗体コンジュゲートの５０マイクロリットルを、各ウェルに加え、室温で１時間、インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートウェルを、２００マイクロリットルのＰＢＳＴｐＨ６．５で３～５回、洗浄した。ＥＣＬＬｕｍｏ基質（例えば、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＥＬＩＳＡＰｉｃｏ化学発光基質）を、記載されているように、１：１混合物に調製した。５０マイクロリットルの基質溶液を各ウェルに加え、読み取り前に、室温で５０～６０分間、インキュベートした。

０．１ｍｌの一晩培養物（９６ウェルプレート中の１ｍｌ培養物または１４ｍｌｆａｌｃｏｎチューブ中の４ｍｌ培養物）に関して、コロニーを０．０３～４ｍｌ２×ＹＴ０．２％グルコース中に接種した。それらを、ＯＤ６００約０．５～１．０まで３７℃で１．５～２時間、２５０～７００ｒｐｍにおいてインキュベートした。培養物を、５０～４００ｕｌＩＰＴＧ０．０２５～０．１Ｍで誘導した。場合によっては、２５０ｒｐｍで振盪しながら、温度を３０℃へ下げた。その後、それらを一晩、インキュベートした。次の日、培養物を、３４００ｒｃｆで１０～１５分間、ペレット化することにより採取した。上清を捨てた。

培養物を、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤を含む５０～７５ｕｌＰＰＢバッファー（３０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、２０％スクロース）で再懸濁し、ロッキングプラットフォーム上において、室温で１５分間、または４℃で１０分間、インキュベートした。培養物を、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤を含む１５０～２２５ｕｌの冷たいｄｄＨ２０で再懸濁し、ロッキングプラットフォーム上において、室温で１時間、または４℃で１～２時間、インキュベートした。溶解物懸濁液を、１５０００ｒｃｆ、４℃で１０～１５分間、回転させた。上清を収集し、希釈した。

Ｆａｂ発現および精製プロトコール
プレート中０．０３～０．５ｍｌ一晩培養物または５０ｍＬ培養物に関して、単一の大腸菌コロニーを、５０２×ＹＴ０．２％グルコース中に接種し、増殖した。培養物を、２５０～７００ｒｐｍ、３７℃で１．５時間、インキュベートした。培養物を、５０ｕｌの２５ｍＭ～１ＭＩＰＴＧで誘導した。温度を３０℃へ、ｒｐｍを１５０へ下げた。インキュベーションを一晩、行った。５０ｍｌ培養物またはプレートを、３４００ｒｃｆで１５分間、ペレット化することにより採取した。上清を捨てた。５０ｍＬ培養物からの細胞ペレットを、－８０℃フリーザーに１時間、置き、一方、プレート中で増殖した培養物に、ＥＤＴＡフリーの１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に７５ｕＬのＰＰＢを加え、ボルテックスした。プレートを、１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、振盪した。ＥＤＴＡフリーの１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に２２５ｕＬの容量の冷水を各ウェルに加えた。試料を混合し、最大速度、すなわち、１０００ｒｐｍで、４℃、１～２時間、振盪した。プレートを３５００ｒｐｍ、４℃で１０分間、回転させた。上清（ＰＰＥ）を、新しいプレートへ移し、－２０℃で保存した。５０ｍｌ培養物からの細胞ペレットを、フリーザーから取り出し、５ｍｌＰＢＳ、１０ｍＭイミダゾールを、２．５ｍｇ／ｍｌリゾチームおよびＥＤＴＡフリーの１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に加えた。ペレットが完全に解凍／混合したらすぐに、これらを室温で３０分間、インキュベートした。溶解物を、３４００ｒｃｆで１５分間、遠心分離した。上清を取り出し、ペレットを捨てた。５００ｕｌＮｉ－ＮＴＡ樹脂を加え（予洗およびペレット化）、またはＮｉ－ＮＴＡスピンカラムをＦａｂ精製に用いた。清浄化された溶解物を３０分間～１時間、インキュベートした。これを１５００ｒｃｆで回転させた。これらを、１ｍｌＰＢＳ、１０ｍＭイミダゾールで５回、洗浄した。各回転後、バッファーを捨てた。１ｍｌＰＢＳ、２００ｍＭイミダゾールを加え、混合し、３０分間、インキュベートし、１５００ｒｃｆで１５分間、回転させた。溶出されたタンパク質を、タンパク質濃度を決定した後、４℃または２０℃で保存した。Ｚｅｂａカラムを、脱塩／バッファー交換に用いた。

ＦａｂのＯｃｔｅｔ／バイオセンサースクリーニング
未加工の上清におけるＯｃｔｅｔＫｏｆｆ速度定数スクリーニングについて、５０ｕｌの溶解物を、３８４ウェルＰａｌｌＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔプレートに用いた。データを、ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４（ＭＤＦｏｒｔｅＢｉｏ）において収集した。簡単に述べれば、ヒトＣＤ２５を、ＡＲ２Ｇチップに連結した（１ｕｇ／ｍｌ）。データ収集について、ベースラインを、ｐＨ６．５におけるＰＢＳＴ１％ＢＳＡバッファー中、６０秒間、評価した。その後、ｐＨ６．５に調整された５０ｕｌ溶解物へチップを移動させ、会合を、３００秒間、測定した。最後に、チップを、ｐＨ６．５におけるＰＢＳＴ１％ＢＳＡバッファーへ移動させた。その後、チップを、２００ｍＭＴｒｉｓ－グリシン、ｐＨ２．５で再生し、ＰＢＳＴ、１％ＢＳＡ、ｐＨ６．５で中和した。データ分析に関して、参照サブトラクションについて、二重参照（チップ上のＣＤ２５なし、およびブランク参照ウェル）を、ＯｃｔｅｔＨＴ１１．０ソフトウェアにおいて実施した。

選択されたＦａｂが、ＩＬ－２のＣＤ２５との結合を遮断するかどうかを決定するために、バイオセンサーアッセイを実行した。

ヒトＩｇＧ１抗体のＯｃｔｅｔ／バイオセンサースクリーニング
選択された４０個のＦａｂのサブセットを、ヒトＩｇＧ１（本明細書ではヒトＩｇＧ１抗体と呼ばれている）を含有するように再フォーマットし、データをこれらから収集した。再フォーマットのために選択されたＦａｂは、表５Ａ（重鎖）および表５Ｂ（軽鎖）に示されている。異なる再フォーマット化ＩｇＧ１抗体のＫｏｆｆ速度定数および親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）ＯｃｔｅｔＲＥＤ３８４（商標）バイオレイヤー干渉法（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）装置において評価した。精製された抗体を、アミン反応性バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ（登録商標）ＡＲ２Ｇ）上に共有結合性に固定化し、過剰な反応性エステルをエタノールアミンでブロッキングした。その後、ベースラインとして、センサーをランニングバッファー中へ漬け、３００ｎＭ完全長ＣＤ２５を含有するウェルへ移し、その後、ランニングバッファー中へ戻した。ＣＤ２５の会合およびその後の解離を、二連で記録した。ランニングバッファーのみの会合（センサードリフトについて照合するために）、およびヒトＮＤ血清由来の固定化ＩｇＧを有する追加のセンサー（非特異的ＩｇＧ結合について照合するために）を、対照として実行した。観察された結合速度（ｏｎｒａｔｅ）および解離速度を、１：１結合フィットモデルを用いてフィッティングし、平衡結合定数（ＫＤ）を計算した。

再フォーマット化ヒトＩｇＧ１抗体のエピトープビニング（ｅｐｉｔｏｐｅｂｉｎｎｉｎｇ）を、古典的サンドイッチ形式で実施される交差競合アッセイを用いて行い、そのアッセイは、ベースラインを収集し、試料抗体をバイオセンサー上に固定化し、抗原を捕獲し、その後、競合分析物とインキュベートすることを含む。競合分析物は、それの結合エピトープが、固定化された抗体のそれと重複しない場合のみ、捕獲されたＣＤ２５を結合することができる。精製された抗体は、アミン反応性バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ（登録商標）ＡＲ２Ｇ）上に共有結合性に固定化され、過剰な反応性エステルをエタノールアミンでブロッキングした。センサーを、ベースラインとしてランニングバッファー中へ漬け、その後、完全長ＣＤ２５へ漬けた。その後、センサーを、競合分析物（ＩＬ－２、７Ｇ７Ｂ６、バシリキシマブ、ダクリズマブ）を含有するウェル、または参照としてのランニングバッファーを含有するウェルへ移した。センサーは、必要な場合、０．１ＭグリシンｐＨ２．０、１０秒間の３サイクルに、その後、ランニングバッファーに１０秒間、それらを曝すことにより、再生された。

結果
図７は、分子レベルでの交差遮断アッセイを用いる、非ＩＬ－２遮断剤およびＩＬ－２遮断剤（Ｆａｂ）の同定を描く。ＣＤ２５をバイオセンサーチップ上にコーティングし、示されたＦａｂと接触させた。その後、ＩＬ２を加えた。シグナル伝達の増加は、そのＦａｂとＩＬ２が、ＣＤ２５上に異なる結合部位を有することを示す。

表８は、試験されたＦａｂクローンが、生理的ｐＨおよび酸性ｐＨにおいて類似した結合動態を示したことを示している。

図８は、ファージが、ＩＬ－２非遮断抗体、７Ｇ７Ｂ６と競合する、本開示のＦａｂを発現することを描く。バイオセンサーチップを、抗体７Ｇ７Ｂ６でコーティングし、最初にＣＤ２５と、その後、示されたＦａｂ、または既知のＩＬ２遮断抗体であるバシリキシマブと接触させた。７Ｇ７Ｂ６がＣＤ２５と結合している時、クローンＤ１１、Ｄ３４、およびＤ３６は結合しない。クローンＤ５、Ｄ１６、およびＤ１７は結合するが、すぐに外れ、可能な交差遮断機能を示している。

図１３Ａ～１３Ｃは、再フォーマット化ヒトＩｇＧ１抗体クローンに関するＫｏｆｆ速度定数および親和性についての動態解析を示す（図１３Ａ）。抗体のＫＤ値は、４．４Ｅ－１０から８．４Ｅ－０９までの範囲であり、Ｋｏｆｆ値は、６．４Ｅ－０５から１．９Ｅ－０３までであった。いくつかの抗体は、市販の抗体７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブ（それぞれ、Ｋｄ値２．６Ｅ－０９、４．５Ｅ－１０、４．７Ｅ－１０、およびそれぞれ、２．３Ｅ－０４、１．１Ｅ－０４、１．９Ｅ－０４のＫｏｆｆ速度定数）よりも高い親和性（図１３Ｂ）およびＫｏｆｆ値（図１３Ｃ）を有した。クローンＢＰ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ７、ＡＨ０５８０、ＡＨ０５２６８、Ｄ３６、Ｄ１１、ＡＨ０５２５９、ＢＦ００３－Ｔ２Ｐ１Ｄ１、およびＤ３４は、この解析において、７Ｇ７Ｂ６よりも良いＫｄ値を有し、クローンＤ１７、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０４７５０、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２５６、およびＡＨ０４５２７は、この解析において、ダクリズマブおよびバシリキシマブよりも良いＫｄ値を有する（図１３Ｂ）。クローンＡＨ０５２５６、ＡＨ０４５２７、ＡＨ０４５２６、ＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２８５、ＡＨ０５２５９、Ｄ１７、ＡＨ０４７５０は、この解析において、７Ｇ７Ｂ６よりも良いＫｏｆｆ速度定数を有する（図１３Ｃ）。

図１４Ａ～１４Ｄ：市販の抗ヒトＣＤ２５抗体、７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、およびバシリキシマブ、加えてＩＬ－２と重複するエピトープとの、再フォーマット化ヒトＩｇＧ１Ｆａｂの結合を評価するためにエピトープビニングを実行した。クローンの遮断プロファイルは以下である：（図１４Ａ）７Ｇ７Ｂ６より遮断されるが、ＩＬ－２にもダクリズマブにもバシリキシマブにも遮断されない；（図１４Ｂ）ＩＬ－２、ダクリズマブ、バシリキシマブにより遮断されるが、７Ｇ７Ｂ６により遮断されない；（図１４Ｃ）７Ｇ７Ｂ６およびダクリズマブにより遮断されるが、バシリキシマブにより遮断されない；（図１４Ｄ）ＩＬ－２、ダクリズマブ、およびバシリキシマブにより遮断される。これらの遮断プロファイルは、抗体の異なるエピトープとの異なるアプローチ角度からの結合を示している。

機能性エピトープの追加のエピトープマッピングが、アラニン突然変異誘発により実施される。この方法は、それが、競合アッセイにより定義される構造的エピトープよりむしろ、機能性エピトープにおいて作動するため、抗体をビニングするための直交法として用いられる。様々なペアの表面アクセス可能残基が、突然変異誘発のために選択される。これらのアッセイに用いるために選択されたアラニン突然変異が全体的または局所的な安定性に影響しないことを確認するために計算モデル化が用いられる。

実施例５
結合アッセイ
ヒトＩｇＧ抗体のＣＤ２５特異的結合についての細胞結合アッセイ
細胞上のＣＤ２５との抗体結合および特異性を確証するために、３つの細胞株ＳＵＤＨＬ－１およびＳＵＤＨＬ－２（ヒト大型びまん性組織球性リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ）、ならびにＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて、ＣＤ２５結合について試験した。ＳＵＤＨＬ－１およびＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞株はＣＤ２５＋であるが、ＳＵＤＨＬ－２はＣＤ２５－細胞である。各細胞株について、１００，０００個の細胞を、９６ウェル丸底プレートの細胞バッファー（ＰＢＳ＋２％ＨＩＦＢＳ）においてプレーティングし、遠心分離した。１～１０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を用いて、各抗体の結合を試験した。細胞を、１００ｕＬの抗体／ウェル中に再懸濁し、氷上で２０分間、インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、３００ｘｇ、室温で５分間、遠心分離し、氷冷の細胞バッファーで再懸濁および洗浄した。その後、細胞を、ＡＦ６４７にコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、暗闇中、氷上で２０分間、インキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、ＤＡＰＩを含む冷たい細胞バッファー中で洗浄および再懸濁し、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。ＤＡＰＩ＋細胞を分析から除外した。平均蛍光強度を、中央値を用いて計算した（ＦｌｏｗＪｏ、ＴｒｅｅＳｔａｒ）。

ヒトＩｇＧ１クローンの組換えＣＤ２５カニクイザル結合
組換えカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ２５との結合について試験するために、マイクロタイタープレートを、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６中１ｕｇ／ｍｌＣｙｎｏＣＤ２５の８０ｕｌで、４℃で、一晩、コーティングした。次の日、ウェルから前記タンパク質を除去し、２００ｕｌＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした。プレートを、室温で１時間、インキュベートした。ヒトＩｇＧ１再フォーマット化Ｆａｂクローン（ヒトＩｇＧ１抗体）を２５ｎＭから開始し、ＰＢＴバッファー中に３倍の段階希釈し、ＲＴで１時間のインキュベーションのためにプレートへ加えた。その後、プレートを洗浄し、その後、１：２５００希釈のＨＲＰコンジュゲート型抗Ｆａｂ抗体を加えた。プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０で５～１０回、洗浄して、非特異的結合剤を除去した。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液を加え、発色させるのに必要とされる時間の間、インキュベートし、その終了時に８０ｕＬのＥＬＩＳＡ停止溶液を加えた。その後、ＯＤ測定値を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉＤ３プレートリーダー、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎＭにおいて取得した。

図１５Ａ～１５Ｂは、全ての抗体クローン（１０ｕｇ／ｍＬ）の、ＣＤ２５＋細胞株、ＳＵＤＨＬ－１細胞とＨＥＫ細胞の両方との特異的結合、およびＣＤ２５－ＳＵＤＨＬ－２細胞株における結合なしの確証を示す。追加として、抗体の大部分が、対照の、７Ｇ７Ｂ６、ダクリズマブ、バシリキシマブと同じ様に、結合した。

図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＵＤＨＬ－１ＣＤ２５＋細胞株における、１０ｕｇ／ｍＬから開始して、５倍の段階希釈で結合したクローンの用量応答曲線を示す（図１６Ａ）。クローンの大部分は、用量依存的様式で結合し、市販の７Ｇ７Ｂ６よりも良いＥＣ５０値を有した（図１６Ｂ、表９）（クローン名は、本開示の上記表に提示された名前が参照される）。表９におけるいくつかのクローンは、７Ｇ７Ｂ６よりも良いＥＣ５０値を有する。

図１７は、組換えｃｙｎｏＣＤ２５と結合したいくつかのクローンの用量応答曲線を示す。ダクリズマブおよびバシリキシマブを陽性対照として用いた。

実施例６
一次細胞を用いたｐＳＴＡＴ５アッセイ
高度に精製されたヒト制御性Ｔ細胞におけるＦａｂクローンの生物活性をスクリーニングするためのｐＳＴＡＴ５アッセイ
ＩＬ－２／ＪＡＫ３／ＳＴＡＴ－５シグナル伝達経路は、Ｔｒｅｇの生存および増殖に関与する。この経路は、Ｔｒｅｇの抑制活性に必須である因子、転写因子Ｆｏｘｐ３の発現を惹起し、かつ維持する。ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒと結合した時、ＪＡＫタンパク質は活性化される；それらは、ＩＬ－２受容体の細胞質側領域と結合しているチロシンキナーゼである。これは、特定のチロシン残基上でトランスリン酸化を惹起し、ＳＴＡＴタンパク質が動員され、かつリン酸化されるためのドッキング部位を生じる。その後、二量体化およびリン酸化されたＳＴＡＴが、核へ転位置して、特異的なＤＮＡ配列を結合し、ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３およびＣＤ２５などのいくつかの標的遺伝子の転写を制御する。

この実施例において、一次ヒト制御性Ｔ細胞上のＣＤ２５と結合した時の、選択されたＦａｂの機能性を評価した。このアッセイは、ｐＳＴＡＴ５レベルに基づいて、どれが、ＩＬ－２遮断剤、非遮断剤、および部分的遮断剤であるか、加えて、効力の決定を可能にした。アッセイに用いられる対照は、既知のＩＬ－２遮断剤（ダクリズマブ）およびＩＬ－２非遮断剤（７Ｇ７Ｂ６）を含む。まず、新鮮なＰＢＭＣ細胞を、白血球除去システムチャンバー（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｃｈａｍｂｅｒｓ）（ＳｔａｎｆｏｒｄＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ）から単離した。等量の細胞バッファー（ＰＢＳ＋２％ＨＩＦＢＳ）を、各血液試料へ加え、５０ｍＬＳｅｐＭａｔｅコニカルチューブの内部に充填されたＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に加え、ＳｅｐＭａｔｅチューブを用いるＰＢＭＣ単離のための標準プロトコールに従った。ＰＢＭＣからヒト制御性Ｔ細胞を単離するために、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および制御性ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞キット（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を用いた。それぞれの単離キットプロトコールを、細胞の磁気に基づいた単離に用いた。Ｔｒｅｇ単離を、抗ヒトＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７抗体での細胞の染色、および細胞内Ｆｏｘｐ３染色（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により確認した。ｐＳＴＡＴ５アッセイについて、１００，０００個のＴｒｅｇを、９６ウェル丸底プレート中にプレーティングし、遠心分離した。１～５ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を用いた。Ｔｒｅｇを、５０ｕＬの抗体／ウェル中に再懸濁し、３７℃インキュベーター内で１５分間、インキュベートした。次に、ＩＬ－２についての希釈物を、細胞培地中１００ｎｇ／ｍＬ濃度から開始して１０倍希釈で調製した。ＩＬ－２希釈物をウェルに５０ｕＬ／ウェルで、３７℃インキュベーター内で１０分間、加えた。インキュベーション後、プレートを室温、３００ｘｇで５分間、遠心分離し、１００ｕＬ／ウェルの室温固定化バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１５分間、再懸濁した。細胞を遠沈し、冷たい細胞バッファー（ＰＢＳ＋２％ＨＩＦＢＳ）中に再懸濁した。その後、細胞を、１００ｕＬ／ウェルの氷冷透過処理バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、氷上で１５分間、インキュベートした。細胞を、細胞バッファーで洗浄し、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いる分析のために５０ｕＬの調製ｐＳＴＡＴ５抗体中に再懸濁した。

ＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞を用いた、抗体クローンの生物活性をスクリーニングするためのｐＳＴＡＴ５アッセイ
この実施例において、クローンを、ＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて試験した。この細胞株は、ＩＬ－２の結合によるＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化をモニターするためにＩｎｖｉｖｏｇｅｎにより作製された。完全活性ヒトＩＬ－２シグナル伝達経路を得るために、そのレポーター細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞にヒトＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、およびＩＬ－２Ｒγ遺伝子、ならびにＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５遺伝子を安定的にトランスフェクションすることにより作製された。このアッセイは、ｐＳＴＡＴ５レベルに基づいて、ＩＬ－２の存在下での抗体および競合物質の添加による、ＩＬ－２遮断剤、非遮断剤、部分的遮断剤のＩＬ－２生理機能および特徴づけを評価するためのハイスループット方法を提供する。アッセイに用いられる対照は、既知のＩＬ－２遮断剤（ダクリズマブおよびバシリキシマブ）およびＩＬ－２非遮断剤（７Ｇ７Ｂ６）を含む。ｐＳＴＡＴ５アッセイについて、１００，０００個の細胞を、９６ウェル丸底プレート中にプレーティングし、遠心分離した。１～５ｕｇ／ｍＬの抗体濃度を用いた。ＨＥＫ細胞を、５０ｕＬの抗体／ウェル中に再懸濁し、３７℃インキュベーター内で１５分間、インキュベートした。次に、ＩＬ－２についての希釈物を、細胞培地中１０ｎｇ／ｍＬ濃度から開始して１０倍希釈で調製した。ＩＬ－２希釈物をウェルに５０ｕＬ／ウェルで、３７℃インキュベーター内で１０分間、加えた。インキュベーション後、プレートを室温、３００ｘｇで５分間、遠心分離し、１００ｕＬ／ウェルの室温固定化バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、室温で１５分間、再懸濁した。細胞を遠沈し、冷たい細胞バッファー（ＰＢＳ＋２％ＨＩＦＢＳ）中に再懸濁した。その後、細胞を、１００ｕＬ／ウェルの氷冷透過処理バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、氷上で１５分間、インキュベートした。細胞を、細胞バッファーで洗浄し、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いる分析のために５０ｕＬの調製ｐＳＴＡＴ５抗体中に再懸濁した。パーセントｐＳＴＡＴ５＋細胞を、親集団に基づいて定量化し、値を、１０ｎｇ／ｍＬ濃度におけるＩＬ－２に対して標準化した。

結果
図９は、ｐＳＴＡＴ５シグナルがＩＬ－２用量依存的であり、ダクリズマブ（ＩＬ－２遮断剤）で阻害されることを示している。ｐＳＴＡＴ５レベルは、ＩＬ－２の用量と相関し、高いＩＬ－２用量がｐＳＴＡＴ５レベルを増加させ、一方、より低いレベルのＩＬ－２はより低いレベルのｐＳＴＡＴ５を生じた。加えて、抗ヒトＩＬ－２抗体のＩＬ－２遮断剤である、ダクリズマブが２ｕｇ／ｍＬの一定濃度で加えられた時、それは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路を阻害して、より低いｐＳＴＡＴ５レベルを生じた。

図１０および図１１は、ｐＳＴＡＴ５アッセイにおけるＤ５Ｆａｂの試験を示す。図１０におけるデータは、ｐＳＴＡＴ５アッセイが、ダクリズマブおよびＩＬ－２のみと比較した、１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、および５ｕｇ／ｍＬにおけるＤ５Ｆａｂ活性の差を区別できたことを示している。Ｄ５の異なる濃度において、ｐＳＴＡＴ５のレベルにおける用量依存的減少があり、Ｄ５が、１ｕｇ／ｍＬの最低濃度においてさえも、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒとの結合を部分的に遮断していることを示唆した。データは、生ＭＦＩレベル（平均蛍光強度）により表され、かつＩＬ－２の最高用量（１００ｎｇ／ｍＬ）により生じた最大ｐＳＴＡＴ５レベルに対してｐＳＴＡＴ５レベルを比較することにより、表されている（図１１）。

図１２は、１つのドナーからの予備的Ｆａｂスクリーニングデータを示す。１つのドナーからのこのアッセイは、対照（ＩＬ－２のみ、ダクリズマブ（Ｄａｃ、ＩＬ－２遮断剤）、および７Ｇ７Ｂ６（非ＩＬ－２遮断剤））と比較した、１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬ、および５ｕｇ／ｍＬにおけるいくつかのＦａｂクローン間のｐＳＴＡＴ５レベルの差を示す。７Ｇ７Ｂ６よりも良いＩＬ－２非遮断剤であるように思われるクローンもあれば、ダクリズマブよりも良いＩＬ－２遮断剤であるクローンもある。完全なＩＬ－２非遮断剤は、ＩＬ－２と類似したｐＳＴＡＴ５レベルを有することが予想され、かつ濃度依存的であることは予想されない。データは、生ＭＦＩレベル（平均蛍光強度）により表され、かつ７Ｇ７Ｂ６により生じた最大ｐＳＴＡＴ５レベルに対してｐＳＴＡＴ５レベルを比較することにより、表されている。加えて、データは、ＦａｂクローンのＩＣ５０効力値の差を観察するために用いることができる（表１０）。

次のアッセイは、ダクリズマブおよび７Ｇ７Ｂ６のＦａｂ型、加えてその同じＦａｂクローンの複数のドナーへの試験を含む。さらに、ｐＳＴＡＴ５アッセイが、生理的ｐＨにおけるクローン活性に対して腫瘍微小環境のｐＨも利用するために、より低いｐＨレベル（ｐＨ６．４～６．７）において実施される。

図１８Ａ～１８Ｂは、１０ｎｇ／ｍｌから開始して１０倍の段階希釈のＩＬ－２濃度で、ＨＥＫＩＬ－２レポーター細胞株においてｐＳＴＡＴ５を測定することによる、再フォーマット化ヒトＩｇＧ１クローン（５ｕｇ／ｍＬ）のＩＬ－２遮断剤、非遮断剤、および部分的遮断剤としての機能特徴づけを示す。０．１ｎｇ／ｍＬ（生理的レベルにより近い）のＩＬ－２濃度において、ＡＨ０４５０３、ＡＨ０４７５０などのクローンは、ダクリズマブまたはバシリキシマブのどちらよりも良いＩＬ－２遮断剤であり、一方、クローンＡＨ０５２８０およびＡＨ０２５７１は、５ｕｇ／ｍＬにおける７Ｇ７Ｂ６よりも良いＩＬ－２非遮断剤であり得る（Ａ）。クローンＡＨ０５２５１、ＡＨ０５２５７は、ＩＬ－２部分的遮断剤の例である（図１８Ａ）。ＩＬ－２用量応答曲線は、ＩＬ－２非遮断剤であるクローンを、ＩＬ－２遮断剤であるクローンから明らかに描き出し、それぞれ、７Ｇ７Ｂ６と共に左へシフトする曲線、ならびにダクリズマブおよびバシリキシマブと共に右へシフトする曲線を有する（図１８Ｂ）。

継続するｐＳＴＡＴ５研究は、一次Ｔｒｅｇおよび複数のドナーを用いてこれらの抗体クローンを試験するために行われ得る。

実施例７
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
機能細胞殺害アッセイＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ
Ｔｒｅｇ枯渇についての機構の一つは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を通してである。これは、標的細胞上の特定の抗原と結合した抗体への免疫／エフェクター細胞の認識によりトリガーされる、細胞死を通常、引き起こす、細胞媒介性免疫防御機構である。ＡＤＣＣを誘発するために、ヒトＦｃサブクラスを有する抗体、ＩｇＧ１が、以下の３つのＦｃ受容体と結合する能力を有するそれのエフェクター機能について、一般的に選択される：ＮＫ細胞、単球、および顆粒球などの免疫細胞上に発現している、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）。ＮＫ細胞は主に、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現し、ＡＤＣＣにおける主要なエフェクター細胞であると考えられる。

この実施例において、ＡＤＣＣを、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害性プレートに基づいた比色アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて定量化した。このアッセイにおいて、ＬＤＨの放出は、細胞殺害の量と比例する。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、全ての細胞に存在する細胞質内酵素であり、原形質膜が損傷した時に放出される。培地中の細胞外ＬＤＨは、ＬＤＨが乳酸塩のピルビン酸塩への変換を、ＮＡＤ＋ＮＡＤＨへの還元を介して触媒する、共役酵素反応により定量化される。ジアホラーゼの添加により、ＮＡＤＨは、テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）へ還元されて、４９０ｎｍにおいて測定することができるホルマザン生成物を形成する。アッセイについての対照は、ヒトＲａｊｉリンパ腫細胞株におけるリツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）およびＳＵＤＨＬ－１細胞におけるダクリズマブの使用を含む（どちらの抗体もＡＤＣＣを誘導することが知られている）。追加の対照には以下が挙げられる：陰性対照として、非グリコシル化ヒトＩｇＧ１、および陽性対照として、非フコシル化ヒトＩｇＧ１。第１の最初のスクリーニングとして、再フォーマット化クローンを、ＡＤＣＣアッセイにおいて、１つの濃度（１０ｕｇ／ｍＬ）で、単一のドナー由来のＰＢＭＣを用いて、試験した。ヒトＰＢＭＣ（ＡＳＴＡＲＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、前日に解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５または２０培地（Ｌｏｎｚａ）を用いて、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で一晩、培養した。実験の当日、ＰＢＭＣおよびＳＵＤＨＬ－１標的細胞を、カウントし、Ｘ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ、フェノールレッド）無血清培地中に再懸濁した。抗体希釈物を、１０ｕｇ／ｍｌから開始して５倍の段階希釈により調製した。その後、標的細胞を、９６ウェル白色平底不透明プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ参照＃３９１７）において９６ウェル５０μＬ／ウェルでプレーティングし、１０μＬ／ウェルの抗体希釈物を、標的細胞へ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間、インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＭＣを標的細胞へ加えた（５０μＬ／ウェル）。自発性および最大ＬＤＨ放出計算のための対照標的細胞について、５０μＬ／ウェルのアッセイ培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５、フェノールレッドなし）を加えた。共インキュベーション（ＡＤＣＣ誘導）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間、プレートをインキュベートすることにより行い、その共インキュベーションが完了する４５分前に、ＭａｘＬＤＨ放出を計算するために、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液（ＰＢＳ中）をウェルに加えた（１０μＬ／ウェル、１１×希釈比）。インキュベーション後、５０μＬ／ウェルの反応基質を、９６ウェルプレート（透明平底）にプレーティングし、その後、アッセイプレートの上清の５０μＬ／ウェルを反応基質へ移した。プレートを、暗闇中、ＲＴで３０分間、発色させた。インキュベーション後、５０μＬ／ウェルの停止溶液を加え、４９０ｎｍおよび６８０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉＤ３プレートリーダー、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いることにより測定した。

追加として、機能抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイもまた、マクロファージの、抗体結合によるＴｒｅｇ細胞を貪食する活性を試験するために実施する。これは、Ｔｒｅｇ枯渇についての追加の作用機構であり得る。マクロファージ上のＦｃ受容体ＦＣγＲＩＩａ（ＣＤ３２ｂ）は、ＡＤＣＰについての優位な誘導因子（ｄｏｍｉｎａｎｔｉｎｄｕｃｅｒ）であると考えられる。このアッセイにおいて、一次Ｔｒｅｇが、エフェクター細胞としてのヒト単球由来マクロファージと共に標的細胞として用いられる。ＣＤ１４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いる単球単離のため、ならびに制御性ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞キット（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）およびヒトＴｒｅｇ細胞分化キット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いるＴｒｅｇのために、ＰＢＭＣが白血球除去システムチャンバー（ＳｔａｎｆｏｒｄＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ）から単離される。単球は、培地中のヒト血清またはＭ－ＣＳＦと共に５～７日間、培養される。５～７日目において、マクロファージは、１０：１のエフェクター：標的比で、事前標識されたＴｒｅｇ（固定可能な生死判別色素で標識される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と共に、抗ＣＤ２５抗体および対照を添加して、２～４時間、共培養され、固定化バッファー（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｅｓ）で固定化される。標識Ｔｒｅｇからマクロファージを同定するために、マクロファージはＣＤ１４に関して染色され、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１４＋として定義される食作用性集団およびＴｒｅｇ標識＋集団について分析される。抗ＣＤ２５抗体は、ＡＤＣＰもまた誘導することが予想される。

結果
図１９Ａ～１９Ｂは、全ての再フォーマット化クローンの機能性ＡＤＣＣ活性を示す。第１のスクリーニングにおいて、クローンはＣＤ２５＋細胞と結合し、ＡＤＣＣが誘導され、細胞殺害は、１８．２％から２６．７％までの溶解の範囲であった（Ｒａｊｉ細胞殺害は、参照として用いられている；図１９Ａ）。これらの所見を検証するために、選択クローンについての用量応答曲線に関して、アッセイを繰り返した。結果は、ベースライン溶解に対して２倍から６倍までのＡＤＣＣ活性の範囲を示し、％バックグラウンド溶解に対する倍数変化により測定された場合、クローンＡＨ０４５１１、ＡＨ０５２７４、Ｄ１１、Ｄ３４、Ｄ３６が、最も強力なＡＤＣＣを誘発し、かつ７Ｇ７Ｂ６抗体より高い効力を有した。

次の研究は、機能性ＡＤＣＣ殺害アッセイのためにエフェクターとしてＰＢＭＣおよびＮＫ細胞の追加のドナーを含む。

実施例８
ＣＤ２５抗体の機能特徴づけ
インビトロでの特徴づけ
次のインビトロでの特徴づけは、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下および存在下における、ＣＤ２５抗体のＴエフェクター細胞応答への影響を評価するためのＴ細胞活性化およびＴｒｅｇ抑制研究を含む。活性化についての読み取りは、細胞内グランザイムＢ、増殖、およびサイトカイン放出（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α）を含む。具体的には、健康なドナーおよび特定の抗原応答（例えば、ヒトサイトメガロウイルスまたはインフルエンザ抗原）を有するドナー由来のヒト一次通常Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ細胞）を、細胞増殖色素（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、様々な濃度のＣＤ２５抗体および対照抗体（１～１０ｕｇ／ｍＬ）で処理し、その後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化し、Ｔｒｅｇと共にまたはＴｒｅｇなしで、３７℃、５％ＣＯ２で４８～７２時間のインキュベーションとして、インキュベートする。Ｔ細胞活性化を評価するために、上清を、サイトカイン分析のために収集し、固定可能な生死判別色素（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）および表面抗ヒトＴ細胞マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２５で細胞を染色し、その後、細胞内グランザイムＢおよびＦｏｘｐ３の染色のために固定化および透過処理を行う。細胞を、グランザイムＢ陽性細胞および増殖性細胞についてフローサイトメトリーを用いて分析する。

インビボでの特徴づけ
マウス異種移植腫瘍モデルを用いた、ＣＤ２５抗体のインビボ活性。これらの実験は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰによるＣＤ２５＋腫瘍枯渇に基づいて、ＣＤ２５抗体の違いを区別するのに役立つ。候補抗体を、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体として産生し、免疫不全ＲＡＧ－／－ノックアウトマウス（機能性ＮＫ細胞およびＡＰＣ細胞を有するが、成熟Ｂリンパ球もＴリンパ球ももたない）において用いる。動物に、ＣＤ２５＋ヒト細胞株（例えば、ＳＵＤＨＬ－１、ＣＤ２５＋未分化大細胞リンパ腫）を皮下に移植する。抗体間の違いを認識するために、様々なサイズの腫瘍（触知可能、１００～５００ｍｍ３）が用いられ得る。動物を、異なる用量のＣＤ２５抗体（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３回または１日１回）で処置し、体重およびＴＧＩの変化についてモニターする。

ヒト化マウスでのマウス異種移植腫瘍モデルにおける薬物有効性およびＭＯＡ研究
Ｔｒｅｇ枯渇、およびＴエフェクター細胞活性の増加と共に腫瘍内Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の増加による腫瘍成長阻害についてより効果的な抗体を、有効性および作用機構を確立するために、様々なヒト腫瘍モデル（例えば、肝臓癌、乳癌、黒色腫、胃癌、ＮＳＣＬＣ、および結腸癌）において試験する。いくつかの研究は、トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、胃細胞株、黒色腫細胞株Ａ３７５、および肝臓癌細胞株Ｈｕｈ－７、加えて、十分特徴づけられており、かつ浸潤したＴｒｅｇと腫瘍成長の間の相関が示されており、ならびに／またはヒトＰＢＭＣおよび／もしくはＣＤ３４＋細胞を移植されたヒト化マウスにおいてＰＤ－１抗体組合せで処置されているヒトＰＤＸモデルを用いることを含み得る。これらのモデルにおいて、腫瘍を皮下に移植し、腫瘍が触知可能から１００～５００ｍｍ３までのサイズ範囲に達したならば、様々な用量のＣＤ２５抗体および投薬スケジュール（例えば、１～１０ｍｇ／ｋｇ、週３回または１日１回）で処置する。動物の健康スコアリング、体重、腫瘍成長、加えて、血液および腫瘍の免疫表現型検査を、腫瘍および免疫細胞組成および腫瘍浸潤細胞、ならびにサイトカイン分泌を特徴づけるために、フローサイトメトリー、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ多重プレート、および組織診断を用いて、実施する。

ヒト化マウスでのマウス異種移植腫瘍モデルにおける併用研究。いったんリード候補および適応症が、有効性およびＭＯＡ研究に基づいて確立されたならば、本発明者らは、免疫活性化のために免疫原性および他の経路の活性化を増加させるための幅広い種類の作用物質（例えば、化学療法、チェックポイント阻害剤、ＴＬＲアゴニスト、ワクチン）を用いる併用研究を実施する。併用実験は、有効性およびＭＯＡ研究に用いられた類似した腫瘍モデルにおいて行われる。

本明細書に引用された全ての特許、特許出願、刊行物、文書、Ｗｅｂリンク、および品物は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。

Claims

ヒトＣＤ２５と結合するモノクローナルＣＤ２５抗体であって、以下の表に提示された（１）～（２７８）のいずれか１つの組合せである、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む、前記モノクローナルＣＤ２５抗体。
配列番号２、１７、３２、３８、４４、６０～１０７、４３１～４６０、８６８、８６９、１２２２、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５、１２３６、１２３８、１２３７、１２９９、１３１６、１３１８、１３２７、１３２８、１３２９、１３３０、１３３１、１３３２、１３３３、１３３４、および１３３５に提示された重鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含み、かつ、配列番号１０、２５、３４、４０、５０、５９、７０１、７０３、７０５、７０７、７０９、７１２、７１５、７１７、７２２、７２４、７２５、７２７、７２８、７３５、７３６、７３７、７３９、７４２、７４５、７４７、７４９、７５０、７５１、７５２、７５４、７５５、７５６、７５９、７６２、７６５、７６７、７６９、７７５、７７６、７７７、７７８、７８０、７８１、７８３、７８５、７８７、７８９、７９１、７９４、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０４、８０６、８０９、８１０、８１１、８１３、８１５、８１８、８２２、８２３、８２４、８２５、８２７、８２９、８３５、８３８、８４１、８４２、８４４、８４６、８４８、８４９、８５１、８５３、８５７、８５９、８６０、８６１、８６４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９２、８９５、８９７、９０１、９０２、９０３、９０５、９０６、９０７、９０８、９１２、９１４、９１７、９１９、９２０、９２１、および９２２に提示された軽鎖可変領域のいずれか１つのアミノ酸配列、そのヒト化バージョン、またはそれと少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む；
請求項１に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体。
ヒト抗体である；
ヒト化抗体である；
キメラ抗体である；
マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを含む；
抗体断片である；または
カニクイザルＣＤ２５も結合する；
請求項１または２に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体。
請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体を含む、医薬組成物。
請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体をコードする核酸。
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体を発現するファージ。
癌、自己免疫疾患、自己免疫障害を処置するため、または制御性Ｔ細胞を枯渇させるための、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体を含む組成物。
請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルＣＤ２５抗体または請求項４に記載の医薬組成物を含むキット。