JP7620123B2

JP7620123B2 - Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシン生産方法

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Publication number: JP7620123B2
Application number: JP2023566852A
Authority: JP
Inventors: ピョホン、イン; ヒイ、ソン; ウンキム、ハ; ヒョンパク、ソク; ヒョンパク、ジュン
Original assignee: シージェイチェイルジェダングコーポレイション
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2025-01-22
Anticipated expiration: 2041-05-28
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Description

本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたＬ－リシン生産方法に関する。

Ｌ－リシンは、ヒトや動物の体内で合成されない必須アミノ酸であるので外部から供給されなければならず、一般に細菌や酵母などの微生物を用いた発酵により生産される。Ｌ－リシンの生産には、自然状態で得られた野生型菌株や、そのＬ－リシン生産能が向上するように改変された変異株が用いられる。最近は、Ｌ－リシンの生産効率を改善するために、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられる大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用することにより、優れたＬ－リシン生産能を有する様々な組換え菌株又は変異株及びそれらを用いたＬ－リシン生産方法が開発されている。

特許文献１及び２によれば、Ｌ－リシンの生産に関与する酵素を含むタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列又はアミノ酸配列を変更してその遺伝子の発現を増加させるか、不要な遺伝子を欠失させることにより、Ｌ－リシン生産能を向上させることができる。また、特許文献３には、Ｌ－リシンの生産に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子の既存のプロモーターを活性の強いプロモーターに変更する方法が開示されている。

このように、Ｌ－リシン生産能を向上させる様々な方法が開発されているが、Ｌ－リシンの生産に直接、間接的に関与する酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質の種類が数十種に及ぶので、このようなタンパク質の活性変化によりＬ－リシン生産能が向上するか否かに関して依然として多くの研究が求められている現状である。

韓国登録特許第１０－０８３８０３８号公報韓国登録特許第１０－２１３９８０６号公報韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号公報韓国登録特許第１０－１５０４９００号公報

ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（２００１） "ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．ｖｏｌｕｍｅ２．１３．３６～１３．３９Ｓｈａｗ等，１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０（４４）：１０８０６Ｋｉｍ等，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０Ｔａｕｃｈ等，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７Ｓｃｈａｆｅｒ等，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３

本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リシン生産方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－リシン生産能が向上した新たな変異株を開発すべく研究を重ねた結果、Ｌ－リシン生合成経路に関与するトランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子のプロモーター中の特定位置の塩基配列を置換すると、Ｌ－リシン生産量が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の一態様は、トランスケトラーゼの活性が強化されてＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。
本発明における「トランスケトラーゼ（ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ）」とは、ペントースリン酸経路においてキシルロースリン酸からリボースリン酸にケトール基（ＨＯＣＨ_２ＣＯ^－）を転移してセドヘプツロースリン酸を形成する反応を触媒する酵素を意味する。このようなトランスケトラーゼをコードする遺伝子は、トランスアルドラーゼ（ｔｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅ）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及び６－ホスホグルコノラクトナーゼ（６－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をコードする遺伝子とオペロン（ｏｐｅｒｏｎ）を構成し、そのオペロンは１つのプロモーターにより遺伝子発現が調節される。

本発明の一具体例によれば、前記トランスケトラーゼは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スラナレアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ドサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ウテレキ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・パカエンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム・マリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・カニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・レナーレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・カスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードペラーギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「活性の強化」とは、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子の発現を新たに導入又は増大することにより、野生型菌株又は改変前の菌株に比べて発現量を増加させることを意味する。このような活性の強化には、遺伝子をコードするヌクレオチドの置換、挿入、欠失又はそれらの組み合わせにより本来の微生物が有するタンパク質の活性よりタンパク質自体の活性が向上することや、それをコードする遺伝子の発現の増加や翻訳の増加などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株又は改変前の菌株に比べて上昇することや、それらの組み合わせが含まれる。

本発明の一具体例によれば、前記トランスケトラーゼの活性強化は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーターに位置特異的変異を誘発することであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記トランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーターは、配列番号１の塩基配列で表されるものであってもよい。

本発明における「プロモーター」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写を開始し、ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に対する結合部位を含み、遺伝子の転写を調節するＤＮＡの特定部位を意味し、一般に転写開始点より上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置する。原核生物におけるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する転写開始点付近の部位と定義され、一般に転写開始点の上流の－１０領域及び－３５領域に位置する塩基対が、離れた２つの短い塩基配列で構成される。本発明におけるプロモーター変異は、野生型プロモーターに比べて活性が向上するように改良するものであり、転写開始点の上流に位置するプロモーター領域内で変異を誘発することにより、下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に位置する遺伝子の発現を増加させることができる。

本発明の一具体例によれば、前記トランスケトラーゼの活性強化は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列中の転写開始点の上流の－３００～－１０領域の少なくとも１つの塩基が置換されることであってもよい。

より具体的には、本発明におけるプロモーター変異は、－３００～－１０領域の少なくとも１つの塩基、好ましくは－２５０～－５０領域、－２３０～－２００領域、－１９０～－１６０領域、又は－９０～－６０領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の塩基が連続的又は非連続的に置換されることであってもよい。

本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のトランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子のプロモーター配列において－８３～－７４領域の塩基配列をｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｃｔｇｔｃａに置換することにより、ｔｋｔ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号２の塩基配列で表されるｔｋｔ遺伝子の変異したプロモーターを含むものであってもよい。

本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のトランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子のプロモーター配列において－８３～－７４領域の塩基配列をｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換することにより、ｔｋｔ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号３の塩基配列で表されるｔｋｔ遺伝子の変異したプロモーターを含むものであってもよい。

本発明における「生産能が向上した」ものとは、親株に比べてＬ－リシンの生産性が向上したものを意味する。前記親株とは、変異の対象となる野生型又は変異株を意味し、直接変異の対象となるものや、組換えベクターなどにより形質転換される対象となるものが含まれる。本発明において、親株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株、又は野生型から変異した菌株であってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記親株は、リシンの生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆ及びｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株であって、韓国微生物保存センター（ＫｏｒｅａｎＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０２１年４月２日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐとして寄託したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（以下「コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株」という）であってもよい。

このような本発明のＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子の変異したプロモーター配列を含むものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記変異株は、配列番号２～４で表される塩基配列のいずれかをトランスケトラーゼ遺伝子のプロモーター配列として含むものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、前記変異株は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子のプロモーター変異を含むことにより、親株より向上したＬ－リシン生産能を示し、特に親株に比べてＬ－リシン生産量が５％以上、具体的には５～４０％、より具体的には１０～３０％増加するので、菌株培養液１リットル当たり６５～９０ｇ、好ましくは７０～８０ｇのＬ－リシンを生産することができる。また、前記変異株は、変異位置が異なる従来のｔｋｔ遺伝子のプロモーター変異株に比べてＬ－リシン生産量が約４％以上増加するので、高収率でＬ－リシンを生産することができる。

本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親株にトランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列が一部置換された変異体を含む組換えベクターにより実現される。

本発明における「一部」とは、塩基配列又はポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「変異体」とは、Ｌ－リシンの生合成に関与するトランスケトラーゼ遺伝子のプロモーター配列中の－３００～－１０領域の少なくとも１つの塩基が置換されたプロモーター変異体を意味する。

本発明の一具体例によれば、トランスケトラーゼ遺伝子のプロモーター配列中の－８３～－７４領域の塩基配列がｔｇｔｇｃｔｇｔｃａに置換された変異体は配列番号２の塩基配列を有するものであってもよく、ｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換された変異体は配列番号３の塩基配列を有するものであってもよい。

本発明における「ベクター」とは、好適な宿主細胞において標的タンパク質を発現する発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）必須の調節因子を含む遺伝子構築物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」ものとは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合されて遺伝子発現を可能にする方法により連結されたものを意味し、「調節因子」には、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。このようなベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明における「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主細胞のゲノムに関係なく複製されるか、又はゲノム自体に組み込まれる。ここで、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定塩基配列である複製起点を含むものであってもよい。

前記形質転換は、宿主細胞に応じて好適なベクター導入技術を選択することにより、目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクター導入は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱ショック（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法又はそれらの組み合わせにより行うことができる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。

前記宿主細胞には、生体内又は試験管内で本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドでトランスフェクション、形質転換又は感染された細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞又は組換え微生物である。

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ）を含んでもよい。前記選択マーカーはベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選択するためのものであり、前記選択マーカーで処理した培地では選択マーカーを発現する細胞のみ生存するので、形質転換された細胞を選択することができる。前記選択マーカーの代表的な例としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の形質転換用組換えベクターに挿入された遺伝子は、相同組換え交差によりコリネバクテリウム属微生物などの宿主細胞内に置換される。
本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよく、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。

また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株又は変異株を培養した培地からＬ－リシンを回収するステップとを含むＬ－リシン生産方法を提供する。

前記培養は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができ、通常の技術者であれば培地及び培養条件を容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培地は液体培地であるが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば回分培養（ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）又はその組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、前記培地は、好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならず、通常の技術者により適宜変更されるものである。コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、公知の文献（非特許文献１）に開示されているが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培地に様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。用いることのできる炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよいが、これらに限定されるものではない。その他に、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。前記培地又は個別成分は、培養過程において培養液に好適な方法でバッチ毎に又は継続して添加されるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を微生物培養液に好適な方法で添加して培養液のｐＨを調整してもよい。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃である。培養期間は、有用物質の所望の生産量が得られるまで続けられ、例えば１０～１６０時間であってもよい。

本発明の一具体例によれば、前述したように培養した変異株及び変異株を培養した培地からＬ－リシンを回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－リシンを収集又は回収するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性及びサイズ排除）などの方法が用いられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、リシンを回収するステップは、培養培地を低速で遠心分離することによりバイオマスを除去し、得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離するものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リシンを回収するステップは、Ｌ－リシンを精製する工程を含んでもよい。

本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子の発現を増加又は強化することにより、親株に比べてＬ－リシンの生産収率を向上させることができる。

本発明の一実施例によりトランスケトラーゼプロモーターの－８３～－７４領域の塩基配列がｔｇｔｇｃｔｇｔｃａに置換された変異を含むｐＣＧＩ（Ｐｔｋｔ８３－１）ベクターの構造を示す図である。トランスケトラーゼプロモーターの－８３～－７４領域の塩基配列がｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換された変異を含むｐＣＧＩ（Ｐｔｋｔ８３－７）ベクターの構造を示す図である。

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの説明は本発明の理解を助けるために例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
［実施例１］コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の作製
トランスケトラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株を用いてランダム突然変異を誘発した。

１－１．突然変異の誘発
コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株をＣＭ液体培地（グルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇ及びビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇ含有，ｐＨ６．８）５０ｍｌの入ったフラスコに接種し、突然変異誘発物質であるＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）を最終濃度３００μｇ／ｍｌになるように添加し、その後３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。培養終了後に、培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を除去し、生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄し、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）でさらに３回洗浄した。それをリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁し、その後種培養固体培地（ＣＭ液体培地に寒天１５ｇ／ｌ及びリシン８％をさらに加えたもの）に塗抹し、３０℃で３０時間培養してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）１００個を分離した。

１－２．Ｌ－リシン生産能が向上した変異株の選択及び変異ライブラリーの作製
分離したコロニー１００個を表１のリシン生産液体培地１０ｍｌの入ったフラスコにそれぞれ５％ずつ接種し、３０℃、２００ｒｐｍで３０時間振盪培養した。各培養液においてＯＤ６１０ｎｍで吸光度を測定して菌体生育の程度を確認し、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ，日本）によりＬ－リシンの生産量を測定した。このようにＬ－リシン生産量を比較してＬ－リシンを６７．０ｇ／ｌ以上生産するコロニーを選択し、そのリシン関連主要遺伝子及びプロモーター領域の塩基配列分析を行い、ｔｋｔ遺伝子プロモーターの変異を有する菌株を確認した。

［実施例２］ｔｋｔプロモーターの改良
２－１．プロモーターの改良：変異の導入
実施例１で選択したｔｋｔプロモーター上の位置を含む最大１５個の塩基配列の変形を有する３０個の候補配列を非特許文献２の方法で合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｔｋｔプロモーター配列（配列番号１参照）と合成されたｔｋｔプロモーター領域をそれぞれＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レポーターベクターｐＳＫ１－ＣＡＴベクター内にクローニングした。ＤＮＡクローニング時のオリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と変異発生の有無は、ＤＮＡシーケンシングにより確認した。このように作製した変異ライブラリーをｐＳＫ１－ｔｋｔ１～ｐＳＫ１－ｔｋｔ３０と命名した。最終的にコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、プロモーター活性を比較、検討した。

２－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２へのｐＳＫ１－ＣＡＴ構造体の形質導入
シーケンス分析により確認した各ｐＳＫ－ｔｋｔクローンを前述したように作製し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）するために、水溶性細胞を作製した。１００ｍｌのＢＨＩＳ培地に１０ｍｌの培養したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を接種して３０℃で一晩培養し、その後再び１００ｍｌのＣＭ液体培地にＯＤ６００が０．３になるように接種し、１８℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．８になるまで約２８時間培養した。培養液を４℃、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収し、２０ｍｌの１０％グリセリン溶液に懸濁して遠心分離する過程を３回繰り返した。回収した細胞を再び１０％グリセリン溶液に懸濁して１００μｌずつＥチューブに分注し、－７０℃ ｄｅｅｐｆｒｅｅｚｅｒに用いるまで保管した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２水溶性細胞１００μｌにＤＮＡ１μｇを添加し、冷却したエレクトロポレーションキュベット（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｃｕｖｅｔｔｅ）に添加し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のマイクロパルサー（ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）を用いてエレクトロポレーションを行った。パルス（Ｐｕｌｓｅ）直後に、４６℃で予熱（ｐｒｅ－ｗａｒｍｉｎｇ）したＣＭ液体培地１ｍｌを添加して細胞を回収し、氷（ｉｃｅ）上で２分間反応させ、その後３０℃のインキュベータにて１８０ｒｐｍで培養した。また、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加したＢＨＩＳアガープレート（ａｇａｒｐｌａｔｅ）に１００μｌ塗抹し、その後３０℃の培養器で培養した。

２－３．ＣＡＴ分析
ｔｋｔプロモーター領域変異体のＣＡＴ分析（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｓｓａｙ）は、Ｓｈａｗ方法（非特許文献３）で測定して行った。簡単に要約すると、形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０μｇ／ｍｌ）添加ＣＭ液体培地で培養し、その後細胞を回収してタンパク質ライセート（ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｓａｔｅ）を確保した。各ｐｒｏｔｅｉｎ５μｇに０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．８）、０．４ｍｇ／ｍｌの５，５’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ（ＤＴＮＢ；ＳｉｇｍａＤ８１３０）、０．１ｍＭＡｃｅｔｙｌＣｏＡ（ＳｉｇｍａＡ２０５６）及び０．１ｍＭｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌを添加してＲＴで１５分間反応させ、その後ＯＤ４１２ｎｍで吸光度を測定した。このように、ＣＡＴ活性が野生型ｔｋｔプロモーター配列と比較して向上したＰｔｋｔ８３－１及びＰｔｋｔ８３－７を選択した。

Ｐｔｋｔ８３－１及びＰｔｋｔ８３－７は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子のプロモーター配列において－８３～－７４領域の塩基配列がそれぞれｔｇｔｇｃｔｇｔｃａ、ｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換されていた。以下、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株を用いて、ｔｋｔ遺伝子のプロモーター変異によるＬ－リシン生産性向上を検証するための実験を行った。

［実施例３］コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１のプロモーター変異株の作製
トランスケトラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ＨＩＴＣｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ（商標），ＣａｔＮｏ．ＲＨ６１８）を用いた。

前記コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇ及びビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）において温度３０℃で培養した。

前記Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇ及び酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地において温度３７℃で培養した。
カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）及びストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を用いた。ＤＮＡシーケンシング分析は、マクロジェン（株）に依頼して分析した。

３－１．組換えベクターの作製
菌株の五炭糖代謝に関与するトランスケトラーゼの活性を強化してリシン生産性を向上させるために、トランスケトラーゼの強化を導入した。本実施例において用いた方法は、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子の発現を増加させるために、ｔｋｔ遺伝子のプロモーターに特異的な変異を誘発するものであった。ｔｋｔ遺伝子のプロモーターの－８３～－７４領域の塩基配列をｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｃｔｇｔｃａに置換するために変異配列を含むプライマーを作製し、実施例１で選択したコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１変異株のゲノムにおけるｔｋｔ遺伝子プロモーターの変異部分を中心として左アーム６９６ｂｐ領域と右アーム６９７ｂｐ領域をＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）方法で連結し、その後組換えベクターであるｐＣＧＩ（非特許文献４参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（Ｐｔｋｔ８３－１）と命名した（図１参照）。前記プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表２のプライマーを用いた。

以下、詳細に説明する。コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株のｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡから、当該プライマーを用いて、次の条件下にてＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００，ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩｎｃ．，日本）を用いて、各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）１００μＭを添加した反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、ｐｆｕ－ＸＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ，韓国）１ユニットの存在下で２５～３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）行った。ＰＣＲ条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒間、（ｉｉ）アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒間、及び（ｉｉｉ）伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分間（１ｋｂ当たり２分間の重合時間を付与する）とした。

このように作製した遺伝子断片をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ制限酵素とＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔＶｅｒ２．１（Ｔａｋａｒａ，日本）によりｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗抹し、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されたコロニーを分離してインサート（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するか否かを確認し、その後そのベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の組換えに用いた。

３－２．変異株の作製
前記ｐＣＧＩ（Ｐｔｋｔ８３－１）ベクターを用いて、変異菌株であるＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－１菌株を作製した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上になるように準備し、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株にエレクトロポレーション（非特許文献５参照）により１次組換えを誘導した。ここで、カナマイシンを２０μｇ／μｌ含有するＣＭ寒天プレートにエレクトロポレーションした菌株を塗抹してコロニーを分離し、その後ゲノムにおける誘導位置に好適に挿入されたか否かをＰＣＲ及び塩基配列分析により確認した。このように分離した菌株にさらに２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシンを含有するＣＭ寒天液体培地に接種して一晩以上培養し、同一濃度のストレプトマイシンを含有する寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニーにおけるカナマイシンに対する耐性の有無を確認し、その後抗生剤に対して耐性のない菌株のうちｔｋｔ遺伝子に変異が導入されたか否かを塩基配列分析により確認した（非特許文献６参照）。最終的に、変異ｔｋｔ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－１０）を得た。

［実施例４］コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の作製
ｔｋｔ遺伝子のプロモーターの－８３～－７４領域の塩基配列をｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換したことを除いて、実施例３と同様にコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を作製した。

ここで、プラスミドを作製するために、各遺伝子断片の増幅に表３のプライマーを用い、作製したプラスミドｐＣＧＩ（Ｐｔｋｔ８３－７）ベクターを用いて変異菌株であるＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－７菌株を作製した。最終的に、変異ｔｋｔ遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－７）を得た。

比較例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株
特許文献４に開示されている、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のｔｋｔ遺伝子プロモーター配列において－２１７～－２０６領域にＡＴＴＧＡＴＣＡＣＡＣＣからＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡへの変異が誘発された変異株（Ｐｔｋｔ２１７）を用いた。

実験例１．変異株のＬ－リシン生産性の比較
親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株、実施例３及び４で作製したリシン生産変異株であるＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－１及びＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－７菌株、及び比較例１の従来のリシン生産変異株であるＰｔｋｔ２１７菌株のＬ－リシン生産性を実施例１－２と同様に比較した。その結果を表４に示す。

表４に示すように、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株であるＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－１及びＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－７菌株は、リシン生合成経路の強化のためにｔｋｔ遺伝子のプロモーター配列の特定位置（－８３～－７４領域）が最適の塩基配列に置換されることにより、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に比べてＬ－リシンの生産性がそれぞれ約１４％、１７％ずつ向上することが確認された。

また、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株であるＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－１及びＤＳ１－Ｐｔｋｔ８３－７菌株は、変異位置（－２１７～－２０６領域）及び配列（ＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡ）が異なる従来の変異株であるＰｔｋｔ２１７に比べてＬ－リシンの生産性がそれぞれ約４％、７％ずつ向上することが確認された。

これらの結果から、プロモーターの－８３～－７４領域の変異がもたらすｔｋｔ遺伝子の発現強化は、リシン生合成能を強化することにより、菌株のＬ－リシン生産能を向上させることが分かる。

以上、本発明の好ましい実施例を挙げて説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明がその本質的な特性から逸脱しない範囲で変形が可能であることを理解するであろう。よって、開示された実施例は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲は、これらの説明ではなく、請求の範囲により規定されるものであり、その均等な範囲内にあるあらゆる相違点は本発明に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

配列番号１のトランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列の－８３～－７４領域における塩基配列がｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換された、プロモーター。
配列番号１のトランスケトラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列の－８３～－７４領域における塩基配列がｃｃａａｔｔａａｃｃからｔｇｔｇｇｔａｔｃａに置換され、Ｌ－リシン生産能が向上した、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
前記変異株は、配列番号３で表される塩基配列を含むものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
Ｌ－リシンを生産する方法であって、
ａ）請求項２に記載の前記変異株を培地で培養するステップと、
ｂ）前記変異株又は前記変異株を培養した前記培地からＬ－リシンを回収するステップと
を含む、方法。