JP7620991B2 - 標的送達及び活性化した免疫刺激性複合体の調製と使用 - Google Patents
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Description
本発明は、抗腫瘍薬剤化合物に関し、具体的には、標的送達及び活性化した免疫刺激性複合体の調製及び使用に関するものである。
レグメインは、システインプロテアーゼのC13ファミリーに属するアスパラギニルエンドペプチダーゼとして、マメ科の種子から初めて同定されたものである。レグメインは、種子の発芽時に貯蔵タンパク質を処理することができる。その後、寄生虫やヒトを含む哺乳類からレグメインが発見され、このプロテアーゼが高度に保存されていることが証明された。ブタ由来のレグメインは1997年に初めてクローニングされ、同定された。レグメインは、ほとんどの固形癌で高発現している。正常組織と腫瘍組織でレグメインの発現が異なることから、腫瘍の治療標的として理想的である。レグメインは、弱酸性条件下で、ペプチド鎖のアスパラギンC末端のペプチド結合を特異的に切断するエンドペプチダーゼである。CN201210573744.3は、アスパルチラーゼ標的により活性化したペプチドドキソルビシン誘導体が、レグメインを介したテトラペプチドグループ（リンカー）の切断によって、腫瘍にLeu-ドキソルビシン化合物を放出する方法を開示している。
本発明では、さらに化合物スクリーニングと生物学における系統的な研究を通じて、化学的に修飾された活性化リンカー（chemical modified linker）を開発し、活性化効率をさらに向上させている。また、本発明の化学修飾活性化リンカーは、薬物複合体の免疫細胞に対する選択性を高め、治療における免疫療法強化特性を生み出し、PD-1抗体との併用による相乗的な効果を高める。
本発明が解決しようとする技術的課題は、高効率で特異的に選択されたリンカーの作成にある。
これまでの研究で、アスパラギニルエンドペプチダーゼは、テトラペプチドの基質ペプチド配列を優先的に認識し、Asnと他の残基との間のアミド結合を切断することが判明されている。活性化効率を向上させるための本発明のアイデアは、まずトリペプチド（例えばAAN）の両末端に構造的に異なる化合物を大量に合成し、これらの化合物を用いて、さらにアスパラギニルエンドペプチダーゼの作用機序を解明することである。アスパラギニルエンドペプチダーゼの結晶構造（図1）によると、アスパラギニルエンドペプチダーゼの活性中心は侵入口の底に位置しているため、基質ペプチドの活性化には底に近い酵素の活性中心が必要である。図では、アスパラギニルエンドペプチダーゼのS1位のC189がAsnペプチド鎖を切るように攻撃するが、隣のS2、S3、S4及びS1位が基体と結合して酵素切断の効率は決定し、S2、S3は基体ペプチドのAla-Alaアミノ酸に対応している。ドキソルビシンなどの化合物とMIグループを連結する際に起こりうる相互作用や空間的な障害を考慮し、この実験ではさらに、基質トリペプチドの両末端に化学修飾した構造の合成とスクリーニングを広範に行った。合成した異なるグループの化合物をMIとドキソルビシンに連結し、腫瘍組織又はアスパラギニルエンドペプチダーゼ条件下で活性化効率をスクリーニングすることにより、相互の立体構造関係を有する新しい化合物複合体を最適化した。この構造の模式図を図2に示すが、MIグループ、選択的グループS、アスパラギニルエンドペプチダーゼ切断トリペプチドグループC、補助グループAと薬物複合体が含まれている。本発明の付加グループは、新たな機能をもたらす。結合した薬剤化合物（D）に対するアスパラギニルエンドペプチダーゼの活性化活性を高めることに加え、薬剤化合物の物性及び生物機能を向上させる。本発明によって提供される薬剤化合物は、細胞膜透過性が変化した親水性であるため、医薬として開発するのに最適な化合物である。また、本発明の式（II）の薬剤化合物は、腫瘍関連マクロファージに特異的に貪食され、腫瘍関連マクロファージ、MDSC細胞を攻撃又は抑制することにより、腫瘍関連マクロファージの免疫抑制作用を緩和し、免疫療法を促進できる点において、細胞選択的であることが判明している。また、本発明は、ドキソルビシンを結合する場合、Sグループの長さが活性化効率に影響し、Sの鎖長が長いほど、化合物が酵素に結合しにくく、空間ブロックにより活性化効率が低下することを見出した。
ヒト血清アルブミン（HSA）は、多くの荷電残基（リジン、アスパラギン酸、補酵素や炭水化物を持たないグループなど）と少量のトリプトファンやメチオニン残基からなる585アミノ酸（66-69kd）の小さな球状タンパク質である。本発明の式（II）の化合物は、高分子薬剤として34番目のシステイン位置でヒト血清アルブミンに結合される。本発明の式（II）の化合物又はEMC-AANL-DOXに共有結合されたアルブミンは、毒性が減少し、薬剤安定性が改善し、治療効果が大幅に改善することが実験的に判明している。
要約すると、本発明の式（I）リンカー及び式（II）の薬剤化合物は、活性化効率の向上、免疫細胞に対する選択性の向上、組織選択性の向上、適切な水溶性及び脂溶性及び薬物安定性を有している。
したがって、本発明は、本明細書に記載の式（I）の化合物（リンカー）及び式（II）で示される薬剤化合物（複合体）ならびにその薬学的に許容される塩を提供するものである。
また、本発明は、下記式の構造を有する白金誘導体又はその薬学的に許容される塩を提供するものである。
また、本発明は、アルブミンに共有結合した本発明の式（II）で示される薬剤化合物又はその薬学的に許容される塩、及びアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOX；好ましくは、アルブミンは、その36位のシステイン残基を介して式（II）のMI又はEMC部分に結合していることを提供する。
本発明はまた、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の式（II）の化合物又はその薬学的に許容される塩、本明細書に記載の白金誘導体又はその薬学的に許容される塩、アルブミンに共有結合した本発明の式（II）に示す薬剤化合物又はその薬学的許容塩、あるいはアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOX、及び薬学的許容担体を含有する。
本発明はまた、式（II）の化合物又はその薬学的に許容される塩、本明細書に記載の白金誘導体又はその薬学的に許容される塩、アルブミンに共有結合した本発明の式（II）に示す薬剤化合物又はその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOX又はその薬学的許容塩が、癌、脂肪肝（アルコール性及び非アルコール性脂肪肝を含む）、脂肪肝炎、脂肪性肝疾患、肝線維症、肝炎、肝細胞障害の脂肪変性現象の治療又は防止のための医薬品の調製を提供する。好ましくは、前記癌は固形癌又は血液腫瘍であり、好ましくは膀胱、脳、乳・胸、頸部、結腸、直腸、食道、腎、肝、肺、鼻咽頭、膵、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣の腫瘍と血液の癌である。
本発明はまた、化合物薬剤の水溶性の向上、薬剤毒性の低減、薬剤効果の向上、及び／又は免疫細胞に対する薬剤の選択性の参照、あるいは水溶性の向上、薬剤毒性の低減、薬剤効果の向上、及び／又は免疫細胞に対する薬剤選択性の向上を有する薬剤の調製、又は肝臓への薬剤送達のための薬剤分子の調製における式（I）に記載の化合物の応用を提供する。
本発明はまた、肝細胞癌の治療のための薬剤の調製における、下式に示す構造を有するEMC-AANL-DOX化合物又はそれにアルブミン（好ましくはアルブミンの36位のシステイン残基を介して前記EMC部分に共有結合）を結合した薬剤の使用、及び腫瘍の複合治療のための薬剤の調製における抗PD-1抗体及び／又は抗PD-L1抗体とのそれらの使用も提供するものである。
本発明はまた、免疫抑制細胞を抑制する、腫瘍関連マクロファージを抑制する、MDSC細胞を抑制する、血管新生を抑制する、抗腫瘍免疫を促進する及び／又はTリンパ球増殖を促進する薬剤の調製における、式（II）又はその薬学的に許容できる塩、ここに記載の白金誘導体又はその薬学的に許容できる塩、アルブミン又はその薬学的許容塩に共有結合した本発明の式（II）に示す薬剤化合物の使用又はアルブミン又はその薬学的許容塩に共有結合したEMC-AANL-DOXを提供するものである。
本発明はまた、腫瘍の複合治療のための薬剤の調製において、式（II）又はその薬学的に許容される塩、本明細書に記載の白金誘導体又はその薬学的に許容される塩、アルブミン又はその薬学的許容塩に共有結合した本発明の式（II）に示す薬剤化合物、又は抗PD-1抗体とアルブミン又はその薬学的許容塩に共有結合したEMC-AANL-DOXを提供するものである。
以下、本発明の技術的解決策を具体的な実施形態に関連させてさらに説明する。
I.リンカー化合物
本発明は、下記式（I）で示される構造を有し、目的の薬剤（例えば、抗癌剤）と連結することにより、該化合物の薬剤水溶性を高め、薬剤毒性を低減し、薬剤の効果を向上させ、及び／又は免疫細胞に対する選択性に言及したリンカーとして使用可能な化合物である。
MI-S-C-A （I）
本発明は、下記式（I）で示される構造を有し、目的の薬剤（例えば、抗癌剤）と連結することにより、該化合物の薬剤水溶性を高め、薬剤毒性を低減し、薬剤の効果を向上させ、及び／又は免疫細胞に対する選択性に言及したリンカーとして使用可能な化合物である。
MI-S-C-A （I）
式中、MIはマレイミド基、Sは酵素切断の効率向上又は選択性向上グループ、Cはタンパク質分解酵素で切断可能なアミノ酸リンカー、Aは補助リンカーであることを示す。
例示的なMIは、次式で示されるマレイミドグループである。
ここで、波線はSとの接続位置を示す。
いくつかの実施形態では、式（I）中のSは、S1-S2-S3として表すことができ、ここで、S1は、以下から選択される。
ここで、Rxは存在しないか、又は以下から選択される：C1-6アルキリデン、C1-6アルキリデンアミノ、C1-6アルキリデンカルボキシル及びC1-6アルキリデンカルボニルアミノ、波線は隣接部分への接続位置を示す；S2は存在するか、又は-［（CH2）pO］q-、ここでpは1～4の整数、好ましくは2、及びqは0～15の整数、好ましくは1～15、より好ましくは2～6である;S3は存在しないか、又は以下のような極性アミノ酸残基から選択される：Glu、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glyn、Lys、Arg及びHis、好ましくはGlu及びAsp。
S1、S2、S3のうち少なくとも1つが存在することが理解されるべきである。
好ましくは、MI、S1、S2、S3、C及びAは、以下のいずれかによって互いに接続されている。
ここで、波線は隣接部位への接続部位を示す。好ましくは、Sは、以下から選択されるグループによってCと接続されている。
いくつかの実施形態では、Sは、-R1-［（CH2）pO］q-R2-R3-であり、ここでR1は、MIに連結され、存在しないか、又はC1-6アルキリデンもしくはC1-6アルキリデンカルボニルアミノから選択され；R2はC1-6アルキリデンから選択され；R3は-C（O）O-、-NH-、-O-又は-C（O）-R4から選択され、ここでR4はGlu、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg及びHisのアミノ酸残基、好ましくはGlu及びAspであり、R4はそのアミノ基を介して-C（O）-とアミド結合を形成し；pは1～4の整数；qは0～15の整数、好ましくは1～15の整数、でありより好ましくは、2～6の整数である。好ましくは、R1は存在せず、pは2又は3、qは1～15、好ましくは2～6、R2はC1-4アルキリデン、R3は-C（O）O-、-NH-及び-O-から選択される。いくつかの実施形態では、好ましくは、R1は存在せず、qは0であり、R2はC1-6アルキリデンであり、R3は-C（O）-R4であり、R4は好ましくはGlu及びAspであり、R4はそのアミノ基を介してこの-C（O）-とアミド結合を形成している。いくつかの実施形態では、好ましくは、R1はC1-6アルキリデンカルボニルアミノ基、pは2又は3、qは1～15、好ましくは2～6、R2はC1-4アルキリデン、R3は-C（O）-R4、R4はGlu及びAspが好ましく、R4はそのアミノ基を介してこの-C（O）-とアミド結合を形成している。
例示的MI-Sは、以下から選択される。
好ましくは、上記MI-Sのいずれかに接続されるCは、AANであり、Aは後述するいずれかの構造である。
好ましくは、本発明の式（I）の化合物において、Cは、腫瘍の微小環境におけるアスパラギニルエンドペプチダーゼ切断を発現するグループから選ばれ、Asn残基を含む。いくつかの実施形態では、CはX1X2X3であり、ここでX1はL又はD型Ala、Thr、Val及びAsnから選択され；X2はL又はD型Ala、Thr、Val及びIleから選択され；そしてX3はAsn、好ましくはD-Asnではない、である。例示的なCは以下から選択される：Ala-Ala-Asn、Thr-Ala-Asn、Val-Ala-Asn、Asn-Ala-Asn、Thr-Thr-Asn、Val-Thr-Asn、Asn-Thr-Asn、Ala-Val-Asn、Thr-Val-Asn、Val-Val-Asn、Asn-Val-Asn、Ala-Ile-Asn、Thr-Ile-Asn、Val-Ile-Asn、Asn-Ile-Asn、Ala-Thr-Asn、D-Thr-L-Val-L-Asn、D-Thr-L-Ala-L-Asn、D-Ala-L-Val-L-Asn、L-Thr-D-Val-L-Asn、L-Thr-D-Ala-L-Asn、L-Ala-D-Val-L-Asn、D-Thr-D-Val-L-Asn、D-Thr-D-Ala-L-Asn、D-Ala-D-Val-L-Asn。いくつかの特に好ましい実施形態では、CはAANである。
本発明の式（I）の化合物において、好ましくはAはLeu、PABC-OH及びPABC-NH2から選ばれ、その構造はそれぞれ以下の式に示される。
ここで、波線はCとの接続位置を示す。
いくつかの実施形態では、本発明の式（I）の化合物中のS及びAは、以下の基1～162［式中、-（CH2CH2O）2-は2peg、-（CH2CH2O）3-は3peg、-（CH2CH2O）4-は4peg、-（CH2CH2O）6-は6peg］などのいずれかから選択される。
好ましくは、本発明の式（I）の化合物において、MIはマレイミド基であり、S及びAは基QHL-001～QHL-162のいずれかであり、CはAANである。
本発明の式（I）の特に好ましい化合物（リンカー）は、以下から選択される：QHL-005、QHL-006、QHL-008、QHL-086、QHL-087、QHL-089、QHL-090、QHL-092、QHL-093、QHL-095、QHL-096、QHL-098、QHL-099、QHL-101、QHL-102、QHL-104、QHL-105、QHL-107、QHL-108、QHL-116、QHL-119、QHL-138、QHL-140、QHL-141、QHL-143、QHL-144、QHL-146、QHL-147、QHL-150、QHL-153、QHL-154、QHL-155、QHL-156、QHL-157、QHL-158、QHL-159、QHL-160、QHL-161及びQHL-162のいずれか1つ、より好ましくはQHL-086、QHL-087、QHL-089及びQHL-090のいずれか1つ。
ii.薬剤化合物
本発明は、下記式（II）で示される化合物（複合体）又はその薬学的に許容される塩を提供する。
MI-S-C-A-D （II）
本発明は、下記式（II）で示される化合物（複合体）又はその薬学的に許容される塩を提供する。
MI-S-C-A-D （II）
式中、MI、S、C及びAは本発明の任意の実施形態に記載のリンカー化合物を形成し、Dは薬剤、好ましくは抗癌化合物である。
式IIにおいて、Aが連結グループとして用いられる場合、以下から選択される。
ここで、波線はC及びDへの連結の位置を示す。好ましくは、Cへの接続は、-NH-を介して行われる。
好ましくは、Dはレッシモト、プレドニゾン、トリヨードサイロニン（T3）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、カンプトテシン、10-ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポジロンB、パクリタキセル、ポリインパクリタキセル、ダラフェニブ、ドビチニブ、化合物a、化合物b及び下記式で示される白金誘導体から選択される。
ここで、前記化合物a及び化合物bは、以下の構造を有する。
より好ましくは、Dはダウノルビシン、ドビチニブ、エピルビシン、化合物a、化合物b、マイトマイシン、ダラフェニブ、モテサニブ、レッシモト、プレドニゾン、及びT3から選択される。好ましくは、これらの薬物（D）に連結するための本発明の式（I）の化合物（リンカー）は、以下から選択される：QHL-005、QHL-006、QHL-008、QHL-086、QHL-087、QHL-089、QHL-090、QHL-092、QHL-093、QHL-095、QHL-096、QHL-098、QHL-099、QHL-101、QHL-102、QHL-104、QHL-105、QHL-107、QHL-108、QHL-116、QHL-119、QHL-138、QHL-140、QHL-141、QHL-143、QHL-144、QHL-146、QHL-147、QHL-150、QHL-153、QHL-154、QHL-155、QHL-156、QHL-157、QHL-158、QHL-159、QHL-160、QHL-161及びQHL-162のいずれか１つ、より好ましくはQHL-086、QHL-087、QHL-089及びQHL-090のいずれか1つ。
好ましくは、Aは以下のいずれかの手段でDと接続される。
波線は、隣接する部品との接続部分を示す。
より好ましくは、AとDとが-CO-NH-により連結されており、カルボニル基がAに連結しているか又はAの一部であり（例えば、AがLeuの場合）、アミノ基がDに連結しているか又はDの一部であることである。通常、Aに結合する薬剤化合物の位置は、薬剤化合物の活性中心から遠いなど、薬剤の生物学的活性に影響を与えない。
好ましくは、本発明に記載の式（II）の薬剤化合物は、以下のものから選択される。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明はまた、以下の構造を有する白金誘導体、その前駆体又はその薬学的に許容される塩を提供する。
本発明の医薬組成物は、アルブミンと共有結合して、新規な薬剤化合物を形成することができる。したがって、本発明は、アルブミンに共有結合した本発明の式（II）の薬剤化合物も含む。典型的には、アルブミンはリンカーのMIに連結される。いくつかの実施形態では、本発明は、アルブミンに連結されたEMC-AANL-DOX、その医薬組成物、及びその応用も含む。また、本発明の式（II）の薬剤化合物又はその薬学的に許容される塩のアルブミンに共有結合している。
本発明における薬学的に許容される塩は、当該技術分野において公知の種々の薬学的に許容される塩であってよく、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、アミグダリン酸塩及びシュウ酸塩などの無機及び有機酸塩；ならびに水酸化ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS、アミノブチロール）やN-メチルグルタミンなどの塩基と形成した無機及び有機塩基塩などを挙げることができる。
III.調製方法
本発明の式（I）及び（II）の化合物の調製のための例示的な方法は、以下を含む：
ステップ1：トリペプチド-PABC又はテトラペプチドの調製：アミノ酸残基を結合し、単離してトリペプチド-PABC又はテトラペプチド、すなわちC-Aを得る；
ステップ2：MI-Sの調製：MI-Sグループに適した化合物を選択して縮合又は環化を行って一端にカルボキシル基を有するMI-Sを得る；
ステップ3：MI-S-C-Aの調製：ステップ1で得られたC-Aとステップ2で得られたMI-Sをアミノ基とカルボキシル基で結合して中間体（MI-S-C-A）を得る；
ステップ4：ステップ3で得られた化合物MI-S-C-AのA末端のカルボキシル又はヒドロキシル活性化生成物を任意薬剤のアミノ基と共有結合させて、標的送達及び活性化した免疫刺激性ドキソルビシン複合体を形成させる。
本発明の式（I）及び（II）の化合物の調製のための例示的な方法は、以下を含む：
ステップ1：トリペプチド-PABC又はテトラペプチドの調製：アミノ酸残基を結合し、単離してトリペプチド-PABC又はテトラペプチド、すなわちC-Aを得る；
ステップ2：MI-Sの調製：MI-Sグループに適した化合物を選択して縮合又は環化を行って一端にカルボキシル基を有するMI-Sを得る；
ステップ3：MI-S-C-Aの調製：ステップ1で得られたC-Aとステップ2で得られたMI-Sをアミノ基とカルボキシル基で結合して中間体（MI-S-C-A）を得る；
ステップ4：ステップ3で得られた化合物MI-S-C-AのA末端のカルボキシル又はヒドロキシル活性化生成物を任意薬剤のアミノ基と共有結合させて、標的送達及び活性化した免疫刺激性ドキソルビシン複合体を形成させる。
AがPABC-OHである場合、合成経路は以下の通りである。公知の化学的及び生物学的組み換え結合技術を用いて本発明に適したアミノ酸残基をPABCと結合し、続いて精製及び単離して適切なアミノ酸保護基を含むC-PABCを得る。反応は、縮合剤、塩基及び極性非プロトン性溶剤の存在下で実施することが可能である。その後、保護基を除去し、C-PABCを得る。その後、C-PABCを縮合剤、塩基、極性非プロトン性溶媒の存在下にMI-Sグループを含む酸又はエステル又は塩化物と反応させて本発明の式（I）で示されるMI-S-C-Aとし、縮合剤、塩基、極性非プロトン性溶媒の存在下に目的の薬剤化合物又はその塩と反応させて本発明の式（II）で示される薬剤化合物を形成させることができる。
この調製方法に用いられる塩基の例としては、例えば、トリエチルアミン、ピリディン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、4-ジメチルアミノピリディン、1、2、2、6、6-ペンタメチルピリディンなどの有機塩基、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム及び重炭酸カリウムのような無機塩基が挙げられる。本調製法で用いる縮合剤の例としては、例えば、HBTU、DMC、HATU、HOBT、DIC、DCC、EDCI、DEPBT等が挙げられる。本調製法で用いる溶媒は、溶媒自体が反応に不活性で反応を阻害しなければ、いかなる溶媒であってもよい。このような溶媒としては、塩化メチレン、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素溶媒、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン移動溶媒、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル溶媒、テトラヒドロフランなどのエーテル溶媒又はこれらの混合物などである。この調製法における反応は、氷冷から150℃までの範囲の温度で実施することができる。
IV.医薬組成物
本発明は、式（II）に記載の本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又は本明細書に記載の本発明の白金誘導体もしくはその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合した式（II）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOXもしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物から構成されている。
本発明は、式（II）に記載の本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又は本明細書に記載の本発明の白金誘導体もしくはその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合した式（II）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOXもしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物から構成されている。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤も含むことができる。担体又は賦形剤は、当該技術分野で知られている様々な薬学的に許容される担体又は賦形剤であってよく、薬剤の剤形又は投与様式によって異なる。
具体的な実施形態では、医薬組成物は、溶媒、可溶化剤／助溶剤、pH調整剤、凍結乾燥賦形剤及び浸透圧調整剤のうちの1つ以上を含有する。
本発明で使用するのに適した凍結乾燥賦形剤には、糖類（例えば乳糖、麦芽糖、ブドウ糖、ブドウ糖、果糖）、アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン）、マンニトール、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、塩化ナトリウム及びシクロデキストリン（例えばヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン、スルホブチルβ-シクロデキストリン）の1以上が含まれる。
本発明で好適に用いられるpH調整剤としては、塩酸、リン酸、硫酸、炭酸、硝酸、酢酸、クエン酸、DL-酒石酸、D-酒石酸、L-酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、グルコサミン、マレイン酸、エチレンジアミン、トリエチルアミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムから選ばれる1種又はそれ以上を挙げることができる。
本発明で用いるのに適した溶媒は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール300、ポリエチレングリコール400、Tert-ブチルアルコール、グリセロール、Tween、大豆油、ヒドロキシプロピルβ-シクロデキストリン溶液及びスルホブチルβ-シクロデキストリン溶液から選ばれる1種以上からなる有機溶媒であることが好ましい。
本発明で好適に用いられる浸透圧調整剤としては、グルコース、塩化ナトリウム、マンニトール、乳酸ナトリウムのうちの1種又は2種以上を挙げることができる。
本発明での使用に適した可溶化剤／助溶剤としては、Tween80、Tween60、Poloxamer、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、ポリエチレングリコール（PEG）、ドデカヒドロキシステアリン酸リチウム、スルホブチルβシクロデキストリン、PVP、グリセロール及びポリオキシエチレンヒマシ油のうちの1以上のものを挙げることができる。
一般に、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は、通常約0.0025～50mg/kg体重、好ましくは約0.01～10mg/kg体重の範囲の量で哺乳動物に毎日経口投与される。既知の抗癌剤をともにあるいは他の治療法と併用して投与する場合は、その目的を達成するために有効な投与量である必要がある。これらの公知の抗癌剤の最適な投与量は、当業者によく知られている。
単位経口投与量は、約0.01～50mg、好ましくは約0.1～10mgの本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩から構成され得る。単位用量は、1日1回又はそれ以上投与することができ、各用量は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を約0.1ないし50mg、好適には約0.25ないし10mg含有する。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、注射剤など、任意の適切な剤形で調製することができるが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内など、当分野で公知の経路で投与することができる。
V.化合物及び薬剤組成物の用途
腫瘍から分泌されるサイトカインは、単球を腫瘍関連マクロファージ（TAM）に変換させ、強い免疫抑制を刺激し、腫瘍細胞の浸潤と転移に直接的に寄与する。腫瘍関連マクロファージ（M2型）と単球や炎症性マクロファージ（M1型）を区別する確認マーカーは、アスパラギニルエンドペプチダーゼの発現である。本発明の化合物は、アスパラギン酸ペプチド鎖エンドヌクレアーゼの存在下で放出するために活性化することができる。アスパラギニルエンドペプチダーゼによる特異的に活性化した複合体の異なる部分は、ターゲティング、活性化、安定化、毒性及び有効性の面で最終的な薬物に大きな影響を与えるため、本発明のアスパラギニルエンドペプチダーゼによる特異的に活性化した複合体の使用は、連結される薬物の毒性を有効に低減し、最終薬物が新しいターゲティング、活性化及び代謝特性を担うことができ、腫瘍に対する治療の効果を高め、完全に新しい構造と機能を生み出す新しい腫瘍適応及び抗腫瘍転移を生成することができる。
腫瘍から分泌されるサイトカインは、単球を腫瘍関連マクロファージ（TAM）に変換させ、強い免疫抑制を刺激し、腫瘍細胞の浸潤と転移に直接的に寄与する。腫瘍関連マクロファージ（M2型）と単球や炎症性マクロファージ（M1型）を区別する確認マーカーは、アスパラギニルエンドペプチダーゼの発現である。本発明の化合物は、アスパラギン酸ペプチド鎖エンドヌクレアーゼの存在下で放出するために活性化することができる。アスパラギニルエンドペプチダーゼによる特異的に活性化した複合体の異なる部分は、ターゲティング、活性化、安定化、毒性及び有効性の面で最終的な薬物に大きな影響を与えるため、本発明のアスパラギニルエンドペプチダーゼによる特異的に活性化した複合体の使用は、連結される薬物の毒性を有効に低減し、最終薬物が新しいターゲティング、活性化及び代謝特性を担うことができ、腫瘍に対する治療の効果を高め、完全に新しい構造と機能を生み出す新しい腫瘍適応及び抗腫瘍転移を生成することができる。
また、本発明は、本発明の式（II）の化合物が、腫瘍関連マクロファージを殺傷し、微小環境における免疫抑制サイトカインを減衰させ、毒性CD8細胞の免疫増強を促進する能力を有することを明らかにしている。さらに重要なことは、これらの腫瘍微小環境解除化合物は、免疫系全体にダメージを与える従来の化学療法剤とは異なり、腫瘍の局所でのみ活性化されるということである。腫瘍微小環境解除化合物とPD-1（programmeddeath-1）阻害抗体（現在、市販されている抗PD-L1抗体が免疫療法効果の候補とされている）は、実験では強い相乗効果を発揮し、免疫療法が化学療法剤と併用しにくいというデメリットを解決することができる。
したがって、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、又は医薬組成物は、本領域の既知のレッシモト、プレドニゾン、T3、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、メトトレキサート、フルダラビン、ゲムシタビン、シタラビン、メルファラン、ニムスチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、カンプトテシン、10-ヒドロキシカンプトテシン、トポテカン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、エトポシド、フルダラビン、カペシタビン、ビンクリスチン、エポジロンB、パクリタキセル、ポリエンパクリタキセル、ダラフェニブ、ドビチニブ、モテサニブ、化合物a、化合物b.白金及び白金化合物(例、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン)が治療できる各種の疾患、癌、眼科疾患及び肝臓疾患などを含む。
例えば、カンプトテシンは悪性腫瘍、乾癬、いぼ、急性／慢性白血病、住血吸虫症による肝脾腫の治療又は予防に使用できること；10-ヒドロキシカンプトテシンは胃癌、肝臓癌、頭頸部癌及び白血病の治療に使用できること；パクリタキセルは主に卵巣癌及び乳癌に用いられ、肺癌、大腸癌、メラノーマ、頭頸部癌、リンパ腫及び脳腫瘍に対しても効果があること；マイトマイシンは、慢性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、乳癌、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、悪性胸腔内貯液等の治療に使用できること。
したがって、例えば、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩又は医薬組成物で治療又は予防できる疾患としては、膀胱、脳、乳・乳房、子宮頸部、結腸-直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣及び血液の癌があるが、それだけに限られるわけではない。具体的には、以下の癌から選択される：肝臓、腎臓、甲状腺、結腸直腸、膀胱、脳、乳房、頸部、直腸、食道、肺（例えば、気管支肺、未分化小細胞及び非小細胞の両方）、鼻咽頭、すい臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣、血液（例えば慢性又は急性白血病、リンパ球性白血病及び顆粒球性白血病を含む）、悪性リンパ腫、線維性肉腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽腫、甲状腺癌及び頭頸部扁平上皮癌。
特定の実施形態において、式（II）で示されるマイトマイシンとしてDを有する本発明の薬剤化合物又はその薬学的に許容される塩は、創傷治癒痕又は脈絡膜新生血管の治療もしくは予防、又はマクロファージの抑制を含む眼科疾患の治療もしくは予防に用いられることも可能である。他の実施形態において、式（II）で示されるDがマイトマイシン又はその薬学的に許容される塩である薬剤化合物は、角膜移植、緑内障、翼状片手術などの後遺症を治療又は予防するためにも使用することができる。
本発明の化合物又は医薬組成物は、腫瘍の転移を阻止するため、特に腫瘍の肺転移を阻止するために使用することも可能である。一実施形態では、本発明の化合物又は医薬組成物は、乳癌からの肺転移を阻止するために使用することができる。
本発明で説明する肝疾患としては、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝とも）、脂肪肝炎、脂肪性肝疾患、肝線維症、肝臓の炎症、肝細胞障害現象としてのステトーシスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
したがって、本発明は、治療又は予防を必要とする対象に、有効量の本発明の式（II）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又は本発明の式（II）の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む、疾患（好ましくは本発明のいずれかの実施形態に記載の癌、眼科疾患及び肝臓疾患）の治療方法又は予防方法を要旨とするものである。いくつかの実施形態では、本発明に記載の又は本発明の白金誘導体又はその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合した式（II）の化合物又はその薬学的に許容される塩、又はアルブミンに共有結合したEMC-AANL-DOX又はその薬学的許容塩、又はそれらのそれぞれの医薬組成物が、投与されている。
本発明は、有効量の本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又は本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む腫瘍転移を停止する方法も含まれる。腫瘍の転移を止めることは、腫瘍の肺転移及び/又は骨転移を止めることを含むが、これらに限定されない。
腫瘍関連マクロファージ（TAM）は、重要な炎症細胞として腫瘍関連炎症に極めて重要な役割を担っている。腫瘍の微小環境において、TAMは腫瘍の生物学の様々な側面に影響を与えることで、腫瘍の発達を促進させる。腫瘍細胞の増殖を直接促進する分子（EGFなど）を分泌して血管新生を促進し、癌細胞の浸潤・転移の条件を整えるとともに、獲得免疫運動機能を阻害する。したがって、本発明は、有効量の本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、又は本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を所望の対象に投与することを含む腫瘍関連マクロファージの抑制方法をも包含する。腫瘍関連マクロファージを抑制することにより、腫瘍の増殖抑制、血管新生、癌細胞の浸潤・転移を抑制し、抗腫瘍免疫を促進し、癌の予防及び/又は治療を行うことができる。1つの具体的な実施形態において、腫瘍関連マクロファージは、M2型のアスパラギン酸ペプチド鎖エンドヌクレアーゼを発現する。
本発明の上記方法は、当技術分野で知られている放射線療法又は免疫療法と組み合わせて使用することができる。
したがって、本発明は、上記の様々な方法又は用途において使用するための、本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、又は本発明の医薬組成物も含む。
また、本発明は、癌及び癌転移などの上記の疾患の治療又は予防のための薬剤の調製における、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩もしくは本発明の医薬組成物の使用も対象とする。また、本発明は、腫瘍関連マクロファージを阻害し、腫瘍の成長を抑制し、血管新生を抑制し、癌細胞の浸潤及び転移を抑制し、及び／又は抗腫瘍免疫を促進する薬剤の調製における本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩もしくは本発明の医薬組成物の使用も含むものである。
本発明はまた、抗癌化合物、特に本明細書に記載の抗癌化合物の毒性作用を低減する方法を提供し、前記方法は、抗癌化合物を本発明の式（I）で示されるリンカー化合物に連結することを含んでなる。
本発明の治療又は予防方法は、本発明の化合物又は医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む。投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。対象は哺乳類、特にヒトとされる。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、肝細胞癌の治療のための薬剤の調製における、以下の式で示される構造を有するEMC-AANL-DOX化合物又はそのアルブミンに結合した薬剤の使用も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、肝細胞癌の治療のための薬剤の調製における、以下の式で示される構造を有するEMC-AANL-DOX化合物又はそのアルブミンに結合した薬剤の使用も提供する。
本発明の「含む」、「含む」は、「・・・・・・からなる」、「・・・・・・からなる」も含むと理解される。すべての重量パーセント又は体積パーセントの合計は100%になるものとする。本実施の形態で使用される各種試薬及び製品は、特に断らない限り市販品であり、当該方法については、特に断らない限り従来技術に従って実施されるものである。なお、以下の実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
＜実施例1：QHL-095-DOXの合成＞
QHL-095-DOXの合成を以下に示す。
QHL-095-DOXの合成を以下に示す。
1.中間体1の合成
乾燥した清潔な2L反応フラスコにTHF500mlを加え、Fmoc-Asn(Trt)-OH80gを秤量し、フラスコに加え、撹拌溶解し、DEPBT46.6gを加え、室温で15分撹拌、PABC16gを加え、室温で30分反応し、DIPEA45mlを加えて窒素置換により保護、室温で3時間反応し、TLCにより反応終了を監視する（Fmoc-Asn(Trt)-OHは完全に反応した）。
乾燥した清潔な2L反応フラスコにTHF500mlを加え、Fmoc-Asn(Trt)-OH80gを秤量し、フラスコに加え、撹拌溶解し、DEPBT46.6gを加え、室温で15分撹拌、PABC16gを加え、室温で30分反応し、DIPEA45mlを加えて窒素置換により保護、室温で3時間反応し、TLCにより反応終了を監視する（Fmoc-Asn(Trt)-OHは完全に反応した）。
反応液を減圧蒸発で除去し、少量のDMF(180ml)を加えて溶解し、撹拌中の3Lの水に滴下して、薄黄色の固体を析出した。2～3回水洗した後、抽出ろ過し、固体を収集し、真空乾燥し、類白色固体を得た(収率90%以上)。
2.中間体2の合成
2L片口反応フラスコに前工程で得た類白色固体のTHF500mlを順に加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、ピペリジン100mlを滴下し、滴下終了後徐々に室温に戻し、1時間反応を行い、TLCによりモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、少量のDMFを加えて溶解し、撹拌中に2Lの水を滴下し、機械的に30min撹拌し、抽出ろ過し、重複して2～3回水洗し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにメチルtert-ブチルエーテル800mlを加え、30min撹拌し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにPEを加える：EA=10：1で2回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキを収集し、真空乾燥した後、類白色固体80gを得て、純度は70%である。
2L片口反応フラスコに前工程で得た類白色固体のTHF500mlを順に加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、ピペリジン100mlを滴下し、滴下終了後徐々に室温に戻し、1時間反応を行い、TLCによりモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、少量のDMFを加えて溶解し、撹拌中に2Lの水を滴下し、機械的に30min撹拌し、抽出ろ過し、重複して2～3回水洗し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにメチルtert-ブチルエーテル800mlを加え、30min撹拌し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにPEを加える：EA=10：1で2回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキを収集し、真空乾燥した後、類白色固体80gを得て、純度は70%である。
3.中間体3の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にnuTHF50ml、Boc-Ala-Ala-OH5.04g、DEPBT3.89gを加え、室温で10分反応させ、窒素置換で保護し、NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC2.6gを加え、室温で15分反応させ、窒素で保護しながらDIPEA3.5mlを滴下して加える。室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体3.7gを得る。さらに、カラム精製により生成物2.0gを得た（純度94.8％、収率26.6％）。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にnuTHF50ml、Boc-Ala-Ala-OH5.04g、DEPBT3.89gを加え、室温で10分反応させ、窒素置換で保護し、NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC2.6gを加え、室温で15分反応させ、窒素で保護しながらDIPEA3.5mlを滴下して加える。室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体3.7gを得る。さらに、カラム精製により生成物2.0gを得た（純度94.8％、収率26.6％）。
4.中間体4の合成
250ml片口反応フラスコに中間体3 1.8gを入れ、TFA28.5mlを加え、水1.5mlを滴下し、室温で30分間反応させ、TLCで反応をモニターし、減圧下で溶媒を蒸発。メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過して固体を得た。ジオキサン：水=1：1液を加えて溶解し、1N水酸化ナトリウムでpH13に調整し、室温で40分間撹拌した後、水酸化ナトリウムで溶解させたものを加える。溶媒を減圧蒸発で除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物450mgを収率47.5％で得た。
250ml片口反応フラスコに中間体3 1.8gを入れ、TFA28.5mlを加え、水1.5mlを滴下し、室温で30分間反応させ、TLCで反応をモニターし、減圧下で溶媒を蒸発。メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過して固体を得た。ジオキサン：水=1：1液を加えて溶解し、1N水酸化ナトリウムでpH13に調整し、室温で40分間撹拌した後、水酸化ナトリウムで溶解させたものを加える。溶媒を減圧蒸発で除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物450mgを収率47.5％で得た。
5.MI-S中間体の合成
MI-S1(338mg、2mmol)とDEPBT(717.6mg、2.4mmol)を100ml片口フラスコに加え、DMF(15ml)を加えて溶解させ、窒素置換で保護し、室温で15分反応させ、R3-b(819mg、2mmol)を加えて溶解させ、室温で15分反応させ、DIPEAを滴下して加えた。137μl、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。R3-aの反応をTLCでモニターし、減圧蒸留で溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶解して逆相高圧カラムに通し、R3-1の中間体を得た（720mg、収率：64.3％）。
MI-S1(338mg、2mmol)とDEPBT(717.6mg、2.4mmol)を100ml片口フラスコに加え、DMF(15ml)を加えて溶解させ、窒素置換で保護し、室温で15分反応させ、R3-b(819mg、2mmol)を加えて溶解させ、室温で15分反応させ、DIPEAを滴下して加えた。137μl、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。R3-aの反応をTLCでモニターし、減圧蒸留で溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶解して逆相高圧カラムに通し、R3-1の中間体を得た（720mg、収率：64.3％）。
6.MI-Sの合成
上記の工程で得られた中間体(720mg、1.28mmol)を100ml片口フラスコに加え、ジクロロメタン15mlで溶解し、TFA5ml、水0.25mlを滴下し、室温で30分反応させ、TLCで応終了までモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出ろ過し、固体、シリカゲルを加えて逆相カラムに通して、生成物242mgを得た。収率は37.5％であった。
上記の工程で得られた中間体(720mg、1.28mmol)を100ml片口フラスコに加え、ジクロロメタン15mlで溶解し、TFA5ml、水0.25mlを滴下し、室温で30分反応させ、TLCで応終了までモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出ろ過し、固体、シリカゲルを加えて逆相カラムに通して、生成物242mgを得た。収率は37.5％であった。
7.中間体5の合成
中間体4(150mg、0.395mmol)及びEMC-6Peg-COOH(239mg、0.474mmol)を100ml片口フラスコに加え、窒素置換で保護しながらDMF(15ml)を加えて溶解し、室温で15分反応させた後、DIPEA137μlを窒素置換で保護しながら滴下し、室温で3時間反応を行い、TLCにより反応をモニターした。中間体4を反応させ、減圧下で蒸留して溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶解し、逆相高圧カラムに通し、中間体5を得た（95mg、収率：21％）。
中間体4(150mg、0.395mmol)及びEMC-6Peg-COOH(239mg、0.474mmol)を100ml片口フラスコに加え、窒素置換で保護しながらDMF(15ml)を加えて溶解し、室温で15分反応させた後、DIPEA137μlを窒素置換で保護しながら滴下し、室温で3時間反応を行い、TLCにより反応をモニターした。中間体4を反応させ、減圧下で蒸留して溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶解し、逆相高圧カラムに通し、中間体5を得た（95mg、収率：21％）。
8.中間体6の合成
順次に100mlの片口反応フラスコに、DMF25ml、中間体5(300mg、0.346mmol)、Bis-PNP(316mg、1.04mmol)を加え、窒素置換で保護しながら、室温で15分反応させた後、DIPEA258μlを滴下し、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。原料が7%残るようにと、HPLCでモニターし、そのタイミングで反応を終了させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、カラム精製により、生成物150mgを、収率42%で得た。
順次に100mlの片口反応フラスコに、DMF25ml、中間体5(300mg、0.346mmol)、Bis-PNP(316mg、1.04mmol)を加え、窒素置換で保護しながら、室温で15分反応させた後、DIPEA258μlを滴下し、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。原料が7%残るようにと、HPLCでモニターし、そのタイミングで反応を終了させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、カラム精製により、生成物150mgを、収率42%で得た。
9.最終生成物QHL-095-DOXの合成について
100mLの反応フラスコに塩酸ドキソルビシン84mg(1.0eq、0.145mmol)、中間体6、150mg(1.0eq、0.145mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分反応させた後、DIPEA75μlを滴下し、室温で4時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して、QHL-095-DOX(49mg赤固体、収率23.8%)を得た。
100mLの反応フラスコに塩酸ドキソルビシン84mg(1.0eq、0.145mmol)、中間体6、150mg(1.0eq、0.145mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分反応させた後、DIPEA75μlを滴下し、室温で4時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して、QHL-095-DOX(49mg赤固体、収率23.8%)を得た。
＜実施例2：QHL-116-DOXの合成＞
1.中間体1の合成
乾燥した清潔な2L反応フラスコにTHF500mlを加え、Fmoc-Asn(Trt)-OH80gを秤量し、フラスコに加え、撹拌溶解し、DEPBT46.6gを加え、室温で15分撹拌、PABC16gを加え、室温で30分反応し、DIPEA45mlを加えて窒素置換により保護、室温で3時間反応し、TLCにより反応終了を監視する（Fmoc-Asn(Trt)-OHは完全に反応した）。
乾燥した清潔な2L反応フラスコにTHF500mlを加え、Fmoc-Asn(Trt)-OH80gを秤量し、フラスコに加え、撹拌溶解し、DEPBT46.6gを加え、室温で15分撹拌、PABC16gを加え、室温で30分反応し、DIPEA45mlを加えて窒素置換により保護、室温で3時間反応し、TLCにより反応終了を監視する（Fmoc-Asn(Trt)-OHは完全に反応した）。
反応液を減圧蒸発で除去し、少量のDMF(180ml)を加えて溶解し、撹拌中の3Lの水に滴下して、薄黄色の固体を析出した。2～3回水洗した後、抽出ろ過し、固体を収集し、真空乾燥し、類白色固体を得た(収率90%以上)。
2.中間体2の合成
2L片口反応フラスコに前工程で得た類白色固体のTHF500mlを順に加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、ピペリジン100mlを滴下し、滴下終了後徐々に室温に戻し、1時間反応を行い、TLCによりモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、少量のDMFを加えて溶解し、撹拌中の2Lの水に滴下し、機械的に30min撹拌し、抽出ろ過し、重複して水で2～3回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキにメチルtert-ブチルエーテル800mlを加え、30min撹拌し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにPEを加える：EA=10：1で2回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキを収集し、真空乾燥した後、白色固体80gを得て、純度は70%である。
2L片口反応フラスコに前工程で得た類白色固体のTHF500mlを順に加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、ピペリジン100mlを滴下し、滴下終了後徐々に室温に戻し、1時間反応を行い、TLCによりモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、少量のDMFを加えて溶解し、撹拌中の2Lの水に滴下し、機械的に30min撹拌し、抽出ろ過し、重複して水で2～3回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキにメチルtert-ブチルエーテル800mlを加え、30min撹拌し、抽出ろ過し、ろ過ケーキにPEを加える：EA=10：1で2回洗い、抽出ろ過し、ろ過ケーキを収集し、真空乾燥した後、白色固体80gを得て、純度は70%である。
3.中間体3の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にnuTHF50ml、Boc-Ala-Ala-OH5.04g、DEPBT3.89gを加え、室温で10分反応させ、窒素置換で保護し、NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC2.6gを加え、室温で15分反応させ、窒素で保護しながらDIPEA3.5mlを滴下して加える。室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体3.7gを得る。さらに、カラム精製により生成物2.0gを得た（純度94.8％、収率26.6％）。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にnuTHF50ml、Boc-Ala-Ala-OH5.04g、DEPBT3.89gを加え、室温で10分反応させ、窒素置換で保護し、NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC2.6gを加え、室温で15分反応させ、窒素で保護しながらDIPEA3.5mlを滴下して加える。室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体3.7gを得る。さらに、カラム精製により生成物2.0gを得た（純度94.8％、収率26.6％）。
4.中間体4の合成
250ml片口反応フラスコに中間体3 1.8gを入れ、TFA28.5mlを加え、水1.5mlを滴下し、室温で30分間反応させ、TLCで反応をモニターし、減圧下で溶媒を蒸発。メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過して固体を得た。ジオキサン：水=1：1液を加えて溶解し、1N水酸化ナトリウムでpH13に調整し、室温で40分間撹拌した後、水酸化ナトリウムで溶解させたものを加える。溶媒を減圧蒸発で除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物450mgを収率47.5％で得た。
250ml片口反応フラスコに中間体3 1.8gを入れ、TFA28.5mlを加え、水1.5mlを滴下し、室温で30分間反応させ、TLCで反応をモニターし、減圧下で溶媒を蒸発。メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過して固体を得た。ジオキサン：水=1：1液を加えて溶解し、1N水酸化ナトリウムでpH13に調整し、室温で40分間撹拌した後、水酸化ナトリウムで溶解させたものを加える。溶媒を減圧蒸発で除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物450mgを収率47.5％で得た。
5.中間体5の合成
Fmoc-Glu(OAll)-COOH(1.554g、3.79mmol)を秤量し、DCMとTHFの混合溶液10mlを加えて溶解し、撹拌しながら、HOtBu2.72ml滴下して加える。N2置換で保護し、室温で16時間反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物1.4gを、収率79.5%で得た。
Fmoc-Glu(OAll)-COOH(1.554g、3.79mmol)を秤量し、DCMとTHFの混合溶液10mlを加えて溶解し、撹拌しながら、HOtBu2.72ml滴下して加える。N2置換で保護し、室温で16時間反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、シリカゲルを加えてカラムに通し、生成物1.4gを、収率79.5%で得た。
6.中間体6の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに10mlのTHF、前段階で得た中間体5(1.4g、3mmol)を加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、3mlピペリジンを滴下して加えた後、徐々に室温まで温め、2時間反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、シリカゲルで精製して、生成物を含む溶離液を収集、真空減圧で一定重量まで乾燥し、生成物583mgを収率80%で得た。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに10mlのTHF、前段階で得た中間体5(1.4g、3mmol)を加え、撹拌溶解し、氷塩浴で0～5℃に冷却し、3mlピペリジンを滴下して加えた後、徐々に室温まで温め、2時間反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、シリカゲルで精製して、生成物を含む溶離液を収集、真空減圧で一定重量まで乾燥し、生成物583mgを収率80%で得た。
7.中間体7の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体6 583mg、DEPBT 932.8mgを加え、室温で10分反応させ、マレイミドヘキサン酸506.4mgを加え、窒素置換で保護し、室温で15分反応させ、DIPEA1.3mlを滴下して加え、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回に叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体800mgを得る。さらに、カラム精製により生成物628mgを得た（純度94.8%で、収率59.9%）。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体6 583mg、DEPBT 932.8mgを加え、室温で10分反応させ、マレイミドヘキサン酸506.4mgを加え、窒素置換で保護し、室温で15分反応させ、DIPEA1.3mlを滴下して加え、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回に叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体800mgを得る。さらに、カラム精製により生成物628mgを得た（純度94.8%で、収率59.9%）。
8.中間体8の合成
乾燥した清潔な100ml片口反応フラスコに、順次にジクロロメタン10ml、中間体7 872mgを加え、均一に撹拌した後、TFA 3mlを滴下して加え、室温で2時間反応させ、TLCで反応終了までモニターした。真空減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過し、固体を得る。シリカゲルを加えて精製し、生成物を含む溶離液を収集し、恒量まで真空減圧で乾燥させ、生成物459mgを、収率60.3%で得た。
乾燥した清潔な100ml片口反応フラスコに、順次にジクロロメタン10ml、中間体7 872mgを加え、均一に撹拌した後、TFA 3mlを滴下して加え、室温で2時間反応させ、TLCで反応終了までモニターした。真空減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出、ろ過し、固体を得る。シリカゲルを加えて精製し、生成物を含む溶離液を収集し、恒量まで真空減圧で乾燥させ、生成物459mgを、収率60.3%で得た。
9.中間体9の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体8 459mg、DEPBT 434mgを加え、室温で10分反応させ、中間体4 457.8mgを加え、窒素置換で保護し、さらに室温で15分反応させ、DIPEA 627mlを滴下して加えた後、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体750mgを得る。カラム精製により、生成物655mgを、収率63.2%で得た。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体8 459mg、DEPBT 434mgを加え、室温で10分反応させ、中間体4 457.8mgを加え、窒素置換で保護し、さらに室温で15分反応させ、DIPEA 627mlを滴下して加えた後、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体750mgを得る。カラム精製により、生成物655mgを、収率63.2%で得た。
10.中間体10の合成
順次に100mlの片口反応フラスコに、DMF25ml、中間体9(655mg、0.88mmol)、Bis-PNP(804mg、2.64mmol)を加え、窒素置換で保護しながら、室温で15分反応させた後、DIPEA258μlを滴下し、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。原料が7%残るようにと、HPLCでモニターし、そのタイミングで反応を終了させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、カラム精製により、生成物335mgを、収率42%で得た。
順次に100mlの片口反応フラスコに、DMF25ml、中間体9(655mg、0.88mmol)、Bis-PNP(804mg、2.64mmol)を加え、窒素置換で保護しながら、室温で15分反応させた後、DIPEA258μlを滴下し、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させた。原料が7%残るようにと、HPLCでモニターし、そのタイミングで反応を終了させ、減圧蒸発で溶媒を除去し、カラム精製により、生成物335mgを、収率42%で得た。
11.中間体11の合成
100mL反応フラスコにドキソルビシン塩酸塩214.3mg(1.0eq,0.369mmol)と中間体10 335mg(1.0eq,、0.369mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分間反応させた。190μlのDIPEAを滴下して加え、室温で4時間反応を行い、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して中間体11を得た（115mg赤色固体、収率：23.8%）。
100mL反応フラスコにドキソルビシン塩酸塩214.3mg(1.0eq,0.369mmol)と中間体10 335mg(1.0eq,、0.369mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分間反応させた。190μlのDIPEAを滴下して加え、室温で4時間反応を行い、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して中間体11を得た（115mg赤色固体、収率：23.8%）。
12.最終生成物の合成
100mL片口反応フラスコにTHF15ml、中間体11(115mg、0.0877mmol)、トリ-n-ブチル錫水素(76mg、0.2631mmol)を順に加え、反応液を窒素で保護した。次に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（14.2mg、0.012mmol）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。変換が完了するまで、混合物をTLCでモニターした。その後、フラスコ内容物を珪藻土でろ過し、残渣をTHFで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をカラムで精製し、目的化合物100mg（収率：90%）を得た。
100mL片口反応フラスコにTHF15ml、中間体11(115mg、0.0877mmol)、トリ-n-ブチル錫水素(76mg、0.2631mmol)を順に加え、反応液を窒素で保護した。次に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（14.2mg、0.012mmol）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。変換が完了するまで、混合物をTLCでモニターした。その後、フラスコ内容物を珪藻土でろ過し、残渣をTHFで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をカラムで精製し、目的化合物100mg（収率：90%）を得た。
＜実施例3：N-CBPの合成＞
1.中間体1の合成
100ml三口フラスコに原料300mgを加え、15mlのTHF/ETOH（4：1）で溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、撹拌下、温度制御したフラスコにLiOH（5ml）水溶液210mgを滴下し、滴下後1時間自然加温、反応液をHPLCに送り原料を完全に反応し、温度制御-5℃～0℃、反応液pHを1mol/LHClで3-4に調整した。反応液のpHを3-4に調整し、温度25-30℃で溶媒を除去し、直接次の工程で使用する中間体1粗生成物を得る。
100ml三口フラスコに原料300mgを加え、15mlのTHF/ETOH（4：1）で溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、撹拌下、温度制御したフラスコにLiOH（5ml）水溶液210mgを滴下し、滴下後1時間自然加温、反応液をHPLCに送り原料を完全に反応し、温度制御-5℃～0℃、反応液pHを1mol/LHClで3-4に調整した。反応液のpHを3-4に調整し、温度25-30℃で溶媒を除去し、直接次の工程で使用する中間体1粗生成物を得る。
2.中間体2の合成
中間体1に1mol/Lジオキサン塩酸塩溶液15mlを加え、室温で1時間撹拌し、反応液をHPLCに送り、中間体1の反応を完了し、温度25-30℃で溶媒を除去し、中間体2の粗生成物を得て、次のステップに進む。
中間体1に1mol/Lジオキサン塩酸塩溶液15mlを加え、室温で1時間撹拌し、反応液をHPLCに送り、中間体1の反応を完了し、温度25-30℃で溶媒を除去し、中間体2の粗生成物を得て、次のステップに進む。
3.中間体3の合成
100ml三口フラスコに中間体2粗生成物を入れ、ジオキサン20mlを加え、氷塩浴で-5～0℃に冷却し、159mg炭酸ナトリウム水溶液（pH約8）を窒素で保護して温度制御しながらフラスコに滴下し、311mgFmoc-Cl溶液のジオキサン滴下後1時間自然に温め、HPLCで検出した。中間体2が完全に反応し、溶剤を除去して、シリカゲルを加えて逆相中圧カラムに通し中間体3 107mgを得た。
100ml三口フラスコに中間体2粗生成物を入れ、ジオキサン20mlを加え、氷塩浴で-5～0℃に冷却し、159mg炭酸ナトリウム水溶液（pH約8）を窒素で保護して温度制御しながらフラスコに滴下し、311mgFmoc-Cl溶液のジオキサン滴下後1時間自然に温め、HPLCで検出した。中間体2が完全に反応し、溶剤を除去して、シリカゲルを加えて逆相中圧カラムに通し中間体3 107mgを得た。
4.中間体4の合成
50ml片口フラスコに中間体3 107mgを加え、メタノール15mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）302ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
50ml片口フラスコに中間体3 107mgを加え、メタノール15mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）302ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
50ml片口フラスコにシスジアンミンジクロロ白金（CDDP）140.8mgを加え、超純水10mlで溶解し、50℃まで加熱した。遮光し、窒素保護下で硝酸銀水溶液49.5mgをフラスコに滴下して添加した。15分反応させてから、続けて硝酸銀水溶液49.5mgを滴下し、さらに15分反応させた後、反応液を膜ろ過し、ろ液を100ml片口フラスコに移し、室温でこれに予備液1を滴下し、3回窒素置換を行う。得られた反応液をオイルバスに移し、50℃まで加熱し、遮光して一晩（通常16時間）放置した。反応を停止させ、反応液を遠心分離して、上澄み液を直接高圧逆相カラムに通し、調製液を凍結乾燥して、中間体4 79mgを収率45.7%で得た。
5.N-CBPの合成
中間体4 5mgを10ml片口フラスコに入れ、2mlMeOH/ACN（1：1）を加えて撹拌溶解し、室温で反応液に2ulDBUを滴下し、窒素で30分保護し、HPLCで検出を行った。中間体4が完全に反応し、反応液を6mlメチルtert-ブチルエーテルに滴下し、類白色の固体を沈殿させ、遠心分離して上澄み液を取り除き、固体を水/tert-ブチルアルコールで溶解し、カラムに通して、N-CBP1.8mgを得た。
中間体4 5mgを10ml片口フラスコに入れ、2mlMeOH/ACN（1：1）を加えて撹拌溶解し、室温で反応液に2ulDBUを滴下し、窒素で30分保護し、HPLCで検出を行った。中間体4が完全に反応し、反応液を6mlメチルtert-ブチルエーテルに滴下し、類白色の固体を沈殿させ、遠心分離して上澄み液を取り除き、固体を水/tert-ブチルアルコールで溶解し、カラムに通して、N-CBP1.8mgを得た。
＜実施例4：QHL-140-N-CBPの合成＞
1.中間体1の合成
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
2.中間体2の合成
中間体1と原料Fmoc-AAN-PABC-PNP1.15gを100ml片口フラスコに加え、DMF20mlで溶解し、窒素で保護し、10分間撹拌下で活性化した後、0.87mlDIPEAを反応フラスコに滴下して加え、0.5時間反応させ、HPLCで検出を行った。反応液からDMFを除去し、粗生成物を水／DMFで溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体2 975mgを、収率：78.6％で得た。
中間体1と原料Fmoc-AAN-PABC-PNP1.15gを100ml片口フラスコに加え、DMF20mlで溶解し、窒素で保護し、10分間撹拌下で活性化した後、0.87mlDIPEAを反応フラスコに滴下して加え、0.5時間反応させ、HPLCで検出を行った。反応液からDMFを除去し、粗生成物を水／DMFで溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体2 975mgを、収率：78.6％で得た。
3.中間体3の合成
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 230mgを収率86.7%で得た。
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 230mgを収率86.7%で得た。
4.中間体4の合成
中間体3 235mgとEMC-OSU222mgを100ml片口フラスコに加え、DMF30mlを加えて撹拌溶解し、50℃に加熱して一晩（通常16時間）窒素置換し、HPLCに送って検出し、中間体3の反応を完了し、DMFを除去して粗生成物をメタノール／水で溶解し、高圧逆相カラムに通して中間体4 200mgを収率53.6％で得た。
中間体3 235mgとEMC-OSU222mgを100ml片口フラスコに加え、DMF30mlを加えて撹拌溶解し、50℃に加熱して一晩（通常16時間）窒素置換し、HPLCに送って検出し、中間体3の反応を完了し、DMFを除去して粗生成物をメタノール／水で溶解し、高圧逆相カラムに通して中間体4 200mgを収率53.6％で得た。
5.最終生成物QHL-140-N-CBPの合成
100ml片口フラスコに中間体4 200mgを加え、メタノール20mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）279ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
100ml片口フラスコに中間体4 200mgを加え、メタノール20mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）279ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
100ml片口フラスコにシスジアンミンジクロロ白金（CDDP）130mgを加え、超純水30mlで溶解し、50℃まで加熱した。遮光し、窒素保護下で硝酸銀水溶液46mgをフラスコに滴下して添加した。15分反応させてから、続けて硝酸銀水溶液46mgを滴下し、さらに15分反応させた後、反応液を膜ろ過し、ろ液を250ml片口フラスコに移し、室温でこれに予備液1を滴下し、3回窒素置換を行う。得られた反応液をオイルバスに移し、50℃まで加熱し、遮光して一晩（通常16時間）放置した。反応液を遠心分離して、上澄み液を直接高圧逆相カラムに通し、調製液を凍結乾燥して、生成物QHL-140-N-CBP、90mgを収率34.5%で得た。
＜実施例5：QHL-086-N-CBPの合成＞
1.中間体1の合成
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
2.中間体2の合成
中間体1と1.15g原料Fmoc-AAN-PABC-PNPを100ml片口フラスコに加え、20mlDMFで溶解し、窒素で保護し、撹拌しながら10min活性化させ、反応フラスコに0.87mlDIPEAを滴下し、0.5h反応させ、HPLCで検出し、原料Fmoc-AAN-PABC-PNPが完全に反応し、反応液中のDMFを除去し、粗生成物を水/DMFで溶解した後、過高圧逆相カラムに通して、中間体2 975mgを収率78.6%で得た。
中間体1と1.15g原料Fmoc-AAN-PABC-PNPを100ml片口フラスコに加え、20mlDMFで溶解し、窒素で保護し、撹拌しながら10min活性化させ、反応フラスコに0.87mlDIPEAを滴下し、0.5h反応させ、HPLCで検出し、原料Fmoc-AAN-PABC-PNPが完全に反応し、反応液中のDMFを除去し、粗生成物を水/DMFで溶解した後、過高圧逆相カラムに通して、中間体2 975mgを収率78.6%で得た。
3.中間体3の合成
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 235mgを収率88.6%で得た。
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 235mgを収率88.6%で得た。
4.中間体4の合成
89mgEMC-2Peg-OHを100ml片口フラスコに加え、DMFを溶解し、97mgDEPBTを加え、室温で1時間撹拌して活性化した後、95ulDEPBTをフラスコに滴下し、1時間撹拌を続けた後、150mg中間体3のDMF溶液を滴下し、滴下後室温で撹拌しHPLCにより検出を行った。反応後、DMFをスピンオフし、粗生成物を水/メタノールに溶解して高圧逆相カラムに通したところ、88mgの生成物を収率37.6%で得た。
89mgEMC-2Peg-OHを100ml片口フラスコに加え、DMFを溶解し、97mgDEPBTを加え、室温で1時間撹拌して活性化した後、95ulDEPBTをフラスコに滴下し、1時間撹拌を続けた後、150mg中間体3のDMF溶液を滴下し、滴下後室温で撹拌しHPLCにより検出を行った。反応後、DMFをスピンオフし、粗生成物を水/メタノールに溶解して高圧逆相カラムに通したところ、88mgの生成物を収率37.6%で得た。
5.最終生成物QHL-086-N-CBPの合成
50ml片口フラスコに中間体4 88mgを加え、メタノール10mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）106ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
50ml片口フラスコに中間体4 88mgを加え、メタノール10mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）106ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
50ml片口フラスコにシスジアンミンジクロロ白金（CDDP）49mgを加え、超純水10mlで溶解し、50℃まで加熱する。遮光し、窒素保護下で硝酸銀水溶液17mgをフラスコに滴下して添加した。15分反応させてから、続けて硝酸銀水溶液17mgを滴下し、さらに15分反応させた後、反応液を膜ろ過し、ろ液を100ml片口フラスコに移し、室温でこれに予備液1を滴下し、3回窒素置換を行う。得られた反応液をオイルバスに移し、50℃まで加熱し、遮光して一晩（通常16時間）放置した。HPLC法を実施し、約20%の中間体4が完全反応しなかった。反応を停止させ、反応液を遠心分離して、上澄み液を直接高圧逆相カラムに通し、調製液を凍結乾燥して、生成物QHL-086-N-CBP、54mgを収率48.6%で得た。
＜実施例6：QHL-095-N-CBPの合成＞
1.中間体1の合成
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
100ml三口フラスコに原料500mgを入れ、DCM10mlを加えて溶解し、-5℃～0℃に冷却し、撹拌下TFA5mlを滴下し、1時間反応後、HPLCで原料の完全反応をモニターし、反応液の溶媒を除去し、残った油状物質が中間体1である。
2.中間体2の合成
中間体1と原料Fmoc-AAN-PABC-PNP1.15gを100ml片口フラスコに加え、20mlDMFで溶解し、窒素で保護し、10分間撹拌下で活性化した後、0.87mlDIPEAを反応容器に滴下して0.5時間反応し、HPLCで検出を行った，原料Fmoc-AN-PABC-PNP反応は終了し、反応液からDMFを除去し、粗生成物を水／DMFで溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体2 975mgを収率78.6％で得た。
中間体1と原料Fmoc-AAN-PABC-PNP1.15gを100ml片口フラスコに加え、20mlDMFで溶解し、窒素で保護し、10分間撹拌下で活性化した後、0.87mlDIPEAを反応容器に滴下して0.5時間反応し、HPLCで検出を行った，原料Fmoc-AN-PABC-PNP反応は終了し、反応液からDMFを除去し、粗生成物を水／DMFで溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体2 975mgを収率78.6％で得た。
3.中間体3の合成
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 235mgを収率88.6%で得た。
250ml三口フラスコに中間体2 400mgを加え、35mlのTHF/ETOH（4：1）を加えて溶解し、氷塩浴で-5℃～0℃に冷却し、温度-5℃～0℃に制御し、LiOH水溶液202mgを滴下後、3時間温度制御反応し、HPLCに送ってモニタリングし、中間体2は完全に反応し、温度-5℃～0℃、反応液pH6～7を1mol/Lで制御する。反応液を1mol/LHCLでpH6-7に調整し、25℃-30℃で溶媒を除去した。粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回叩解し、固体をメタノール/水に溶解して高圧逆相カラムに通し、中間体3 235mgを収率88.6%で得た。
4.中間体4の合成
中間体3 180mgとEMC-6Peg-OSU240mgを100ml片口フラスコに入れ、DMF20mlを加えて撹拌溶解し、50℃に加熱して窒素で一晩（通常16時間）保護し、HPLCで検出を行った。中間体3が完全に反応し、DMFを除去し、メタノール/水で粗生成物を溶解し、高圧逆相カラムに通して、中間体4 234mgを収率69.2％で得た.
中間体3 180mgとEMC-6Peg-OSU240mgを100ml片口フラスコに入れ、DMF20mlを加えて撹拌溶解し、50℃に加熱して窒素で一晩（通常16時間）保護し、HPLCで検出を行った。中間体3が完全に反応し、DMFを除去し、メタノール/水で粗生成物を溶解し、高圧逆相カラムに通して、中間体4 234mgを収率69.2％で得た.
5.最終生成物QHL-095-N-CBPの合成
100ml片口フラスコに中間体4 234mgを加え、メタノール15mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）234ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
100ml片口フラスコに中間体4 234mgを加え、メタノール15mlで溶解し、液体窒素で-20℃まで冷却し、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（25％メタノール溶液）234ulをフラスコに滴下後、自然に1時間温め、この反応溶液を予備溶液1とする。
100ml片口フラスコにシスジアンミンジクロロ白金（CDDP）109mgを加え、超純水20mlで溶解し、50℃まで加熱した。遮光し、窒素保護下で硝酸銀水溶液38mgをフラスコに滴下して添加した。15分反応させてから、続けて硝酸銀水溶液38mgを滴下し、さらに15分反応させた後、反応液を膜ろ過し、ろ液を250ml片口フラスコに移し、室温でこれに予備液1を滴下し、3回窒素置換を行う。得られた反応液をオイルバスに移し、50℃まで加熱し、遮光して一晩（通常16時間）放置した。反応液を遠心分離して、上澄み液を直接高圧逆相カラムに通し、調製液を凍結乾燥して、最終生成物、138mgを収率48%で得た。
＜実施例7：QHL-006-DOXの合成＞
QHL-006のMI-Sグループについては、以下に合成経路を示す。
QHL-006のMI-Sグループについては、以下に合成経路を示す。
1.QHL-006-DOXのMI-S中間体-1の合成
乾燥した清潔な100ml片口反応フラスコに無水マレイン酸（245mg、2.5mmol）を秤量し、ジクロロメタン10mlを加えて撹拌して溶解し、NH2H2H2-3Peg-COOtBu（624mg、2.25mmol）を秤量、室温で6時間反応し、LC-MSにて無水マレイン酸反応完了をモニター、反応液をスピンドライ、シリカゲルを加えてカラムに通して、MI-S中間体-1（456mg、収率48.6%）を得た。
乾燥した清潔な100ml片口反応フラスコに無水マレイン酸（245mg、2.5mmol）を秤量し、ジクロロメタン10mlを加えて撹拌して溶解し、NH2H2H2-3Peg-COOtBu（624mg、2.25mmol）を秤量、室温で6時間反応し、LC-MSにて無水マレイン酸反応完了をモニター、反応液をスピンドライ、シリカゲルを加えてカラムに通して、MI-S中間体-1（456mg、収率48.6%）を得た。
2.QHL-006-DOXのMI-S中間体-2の合成
100ml片口反応フラスコに上記手順で得たMI-S中間体-1 456mgを加え、無水酢酸10mlを加えて撹拌溶解し、NaOAC(98.7mg、1.216mmol)を秤量して一括でゆっくり加え、オイルバスで110℃に昇温して3時間反応し、LC-MSでMI-S中間体-1の反応をモニターして室温まで冷却し、反応溶液をスピンドライ後、カラム精製を行った。反応液を室温まで冷却し、スピンオフした後、カラムで精製し、MI-S中間体-2（312、収率70%）を得た。
100ml片口反応フラスコに上記手順で得たMI-S中間体-1 456mgを加え、無水酢酸10mlを加えて撹拌溶解し、NaOAC(98.7mg、1.216mmol)を秤量して一括でゆっくり加え、オイルバスで110℃に昇温して3時間反応し、LC-MSでMI-S中間体-1の反応をモニターして室温まで冷却し、反応溶液をスピンドライ後、カラム精製を行った。反応液を室温まで冷却し、スピンオフした後、カラムで精製し、MI-S中間体-2（312、収率70%）を得た。
3.QHL-006-DOXに含まれるMI-Sの合成について
前工程で得られたMI-S中間体-2(312mg、0.87mmol)を100mlの片口反応フラスコに加え、ジクロロメタン10mlを加えて溶解し、TFA2mlを滴加し、0.15mlの水を滴加し、室温で30min反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出ろ過し、固体、シリカゲルを加えて逆相カラムに通して、生成物196mgを得る。収率は75%であった。
前工程で得られたMI-S中間体-2(312mg、0.87mmol)を100mlの片口反応フラスコに加え、ジクロロメタン10mlを加えて溶解し、TFA2mlを滴加し、0.15mlの水を滴加し、室温で30min反応させ、TLCで反応をモニターした。減圧蒸発で溶剤を除去し、メチルtert-ブチルエーテルを加えて叩解し、抽出ろ過し、固体、シリカゲルを加えて逆相カラムに通して、生成物196mgを得る。収率は75%であった。
最終生成物は、QHL-095-DOXの合成に用いた方法と同様の方法で、連結に異なるMI-Sを用いて調製した（MI-Sの調製についてはQHL-006-DOXのMI-Sの調製手順を参照）。
＜実施例8：QHL-096-DOXの合成＞
1)中間体1の合成
N-ベンジルオキシカルボニル-L-アラニン(100g、0.45mol)を乾燥したN,N-ジメチルホルムアミド(3L)に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(72.6g、0.54mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(103.3g、0.54mol)を加え、撹拌反応1時間後、氷浴で0°Cまで下にL-アラニンメチルエステル(46.2g、0.45mol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(173.8g、1.34mol)のN,N-ジメチルホルムアミド(1L)溶液を滴下し、滴下完了後、室温で10時間撹拌し、減圧蒸発溶剤を除去し、粗生成物をジクロロメタン(2L)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧蒸発溶剤を除去した後、粗生成物を酢酸エチル/石油エーテルで再結晶してから中間体1(101g白色固体、収率：73.1%)を得る。
N-ベンジルオキシカルボニル-L-アラニン(100g、0.45mol)を乾燥したN,N-ジメチルホルムアミド(3L)に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(72.6g、0.54mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(103.3g、0.54mol)を加え、撹拌反応1時間後、氷浴で0°Cまで下にL-アラニンメチルエステル(46.2g、0.45mol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(173.8g、1.34mol)のN,N-ジメチルホルムアミド(1L)溶液を滴下し、滴下完了後、室温で10時間撹拌し、減圧蒸発溶剤を除去し、粗生成物をジクロロメタン(2L)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧蒸発溶剤を除去した後、粗生成物を酢酸エチル/石油エーテルで再結晶してから中間体1(101g白色固体、収率：73.1%)を得る。
2)中間体2の合成
中間体1(100g、0.34mol)をテトラヒドロフラン(2L)と水(1L)の混合溶液に溶解し、0℃に冷却して1mol/L水酸化リチウム溶液(400mL)を滴下し、10時間撹拌し、濃塩酸でpH<6まで滴下中和し、減圧下で蒸発してテトラヒドロフランを除き、残りの水相はジクロロメタン(1L×3)で抽出し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させ、中間体2(88g白色固体、収率：92.2%)を得た。
中間体1(100g、0.34mol)をテトラヒドロフラン(2L)と水(1L)の混合溶液に溶解し、0℃に冷却して1mol/L水酸化リチウム溶液(400mL)を滴下し、10時間撹拌し、濃塩酸でpH<6まで滴下中和し、減圧下で蒸発してテトラヒドロフランを除き、残りの水相はジクロロメタン(1L×3)で抽出し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させ、中間体2(88g白色固体、収率：92.2%)を得た。
3)中間体3の合成
三頚（三つ首）フラスコの中にL-ロイシンtert-ブチルエステル(22.4g、0.1mol)、N-Fmoc-N’-トリフェニルメチルアスパラギン酸(59.6g、0.1mol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1000mL)の中に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(14.85g、0.11mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(23g、0.12mol)を加え、0°Cで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(25.8g、0.2mol)を加え、10時間撹拌した後、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物はクロロホルム(1000ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、減圧蒸発で溶剤を除去して得た粗生成物は再結晶(体積比で計算すると、ジクロロメタン：酢酸エチル=1：1)によって純化した後、中間体3(42.4g白色固体、収率：55.4%)を得た。
三頚（三つ首）フラスコの中にL-ロイシンtert-ブチルエステル(22.4g、0.1mol)、N-Fmoc-N’-トリフェニルメチルアスパラギン酸(59.6g、0.1mol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1000mL)の中に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(14.85g、0.11mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(23g、0.12mol)を加え、0°Cで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(25.8g、0.2mol)を加え、10時間撹拌した後、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物はクロロホルム(1000ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、減圧蒸発で溶剤を除去して得た粗生成物は再結晶(体積比で計算すると、ジクロロメタン：酢酸エチル=1：1)によって純化した後、中間体3(42.4g白色固体、収率：55.4%)を得た。
4)中間体4の合成
中間体3(7.65g、0.01mol)をジクロロメタン(100mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(100mL)の混合溶液に溶かし、ピペリジン(40ml)を加え、室温で5時間撹拌した後、溶媒を減圧で蒸発させ、その後、真空オーブンで高真空乾燥させて少量のピペリジンを除去し、中間体4を得て薄黄色の固体とし、精製することなく次のステップに用いる。
中間体3(7.65g、0.01mol)をジクロロメタン(100mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(100mL)の混合溶液に溶かし、ピペリジン(40ml)を加え、室温で5時間撹拌した後、溶媒を減圧で蒸発させ、その後、真空オーブンで高真空乾燥させて少量のピペリジンを除去し、中間体4を得て薄黄色の固体とし、精製することなく次のステップに用いる。
5)中間体5の合成
前工程で得られた中間体4の粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド(200mL)に溶解し、中間体2(2.94g、0.012mol)、ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate(HBTU)(6.07g、0.016mol)を加え、氷浴後、N,N-disopropylethylamine(2.6g、0.02mol)を0℃まで添加することにより行った。残渣をクロロホルム(100ml)に溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液及び飽和塩化ナトリウム溶液で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させ、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、中間体5(3.1g白色固体、2段階での総収率：37.8％)を得た。
前工程で得られた中間体4の粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド(200mL)に溶解し、中間体2(2.94g、0.012mol)、ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate(HBTU)(6.07g、0.016mol)を加え、氷浴後、N,N-disopropylethylamine(2.6g、0.02mol)を0℃まで添加することにより行った。残渣をクロロホルム(100ml)に溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液及び飽和塩化ナトリウム溶液で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過して蒸発させ、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、中間体5(3.1g白色固体、2段階での総収率：37.8％)を得た。
6)中間体6の合成
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g、3.65mmol)をメタノール(100mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(0.3g)を加え、水素ガスを入れ、常温常圧で4時間撹拌反応し、パラジウム炭素をろ過して除去し、メタノールで洗浄し、ろ液と洗液を合わせ、減圧蒸発で溶剤を除去して、中間体6(2.38g白色固体、収率：95.2%)を得た。
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g、3.65mmol)をメタノール(100mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(0.3g)を加え、水素ガスを入れ、常温常圧で4時間撹拌反応し、パラジウム炭素をろ過して除去し、メタノールで洗浄し、ろ液と洗液を合わせ、減圧蒸発で溶剤を除去して、中間体6(2.38g白色固体、収率：95.2%)を得た。
7)中間体7の合成
中間体6(2.38g、3.4mmol)とEMC-6Peg-OSu(2.4g、4.08mmol)を250ml片口フラスコに加え、DMF(30ml)で溶解し、50℃に加熱して6時間反応した。減圧下で蒸留して溶媒を留去し、粗生成物をメタノールに溶解して逆相高圧カラムに通し、中間体7(2.5g、収率：63.2%)を得た。
中間体6(2.38g、3.4mmol)とEMC-6Peg-OSu(2.4g、4.08mmol)を250ml片口フラスコに加え、DMF(30ml)で溶解し、50℃に加熱して6時間反応した。減圧下で蒸留して溶媒を留去し、粗生成物をメタノールに溶解して逆相高圧カラムに通し、中間体7(2.5g、収率：63.2%)を得た。
8)中間体8の合成
中間体7(1.00g、0.852mmol)をDCM(20mL)に溶かし、(10ml)を室温で滴下し、反応液を2時間撹拌し、HPLCに送ってモニターし、中間体1を完全に反応させ、減圧下で蒸留して溶剤を留去し、メチルtert-ブチルエーテルで粗生成物を2回洗浄後、固体はメタノールに溶かし、逆相高圧カラムに通して、中間体8（721mg白色固体、収率：96.8%)を得た。
中間体7(1.00g、0.852mmol)をDCM(20mL)に溶かし、(10ml)を室温で滴下し、反応液を2時間撹拌し、HPLCに送ってモニターし、中間体1を完全に反応させ、減圧下で蒸留して溶剤を留去し、メチルtert-ブチルエーテルで粗生成物を2回洗浄後、固体はメタノールに溶かし、逆相高圧カラムに通して、中間体8（721mg白色固体、収率：96.8%)を得た。
9)最終生成物QHL-096-DOXの合成
100mLの反応フラスコに、ドキソルビシン塩酸塩63mg(1.0eq)、中間体895mg(1eq)、DEPBT39mg(1.2eq)及びDMF10mLを加え、窒素保護下でDIPEA60ul(3eq)を反応混合物に加え、室温で4時間反応させた。減圧下で溶剤を蒸発させて粗生成物をメタノールに溶かし、逆相粗生成物をメタノールに溶解し、逆相カラムに通してQHL-096-DOX（52mg赤色固体、収率：34.2%）を得た。
100mLの反応フラスコに、ドキソルビシン塩酸塩63mg(1.0eq)、中間体895mg(1eq)、DEPBT39mg(1.2eq)及びDMF10mLを加え、窒素保護下でDIPEA60ul(3eq)を反応混合物に加え、室温で4時間反応させた。減圧下で溶剤を蒸発させて粗生成物をメタノールに溶かし、逆相粗生成物をメタノールに溶解し、逆相カラムに通してQHL-096-DOX（52mg赤色固体、収率：34.2%）を得た。
＜実施例9：QHL-117-DOXの合成＞
QHL-117の合成経路は以下の通りである。
QHL-117の合成経路は以下の通りである。
1)中間体1の合成
N-ベンジルオキシカルボニル-L-アラニン(100g、0.45mol)を乾燥したN,N-ジメチルホルムアミド(3L)に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(72.6g、0.54mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(103.3g、0.54mol)を加え、撹拌反応1時間後、氷浴で0°Cまで下にL-アラニンメチルエステル(46.2g、0.45mol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(173.8g、1.34mol)のN,N-ジメチルホルムアミド(1L)溶液を滴下し、滴下完了後、室温で10時間撹拌し、減圧蒸発溶剤を除去し、粗生成物をジクロロメタン(2L)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧蒸発溶剤を除去した後、粗生成物を酢酸エチル/石油エーテルで再結晶してから中間体1(101g白色固体、収率：73.1%)を得る。
N-ベンジルオキシカルボニル-L-アラニン(100g、0.45mol)を乾燥したN,N-ジメチルホルムアミド(3L)に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(72.6g、0.54mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(103.3g、0.54mol)を加え、撹拌反応1時間後、氷浴で0°Cまで下にL-アラニンメチルエステル(46.2g、0.45mol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(173.8g、1.34mol)のN,N-ジメチルホルムアミド(1L)溶液を滴下し、滴下完了後、室温で10時間撹拌し、減圧蒸発溶剤を除去し、粗生成物をジクロロメタン(2L)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、水と飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧蒸発溶剤を除去した後、粗生成物を酢酸エチル/石油エーテルで再結晶してから中間体1(101g白色固体、収率：73.1%)を得る。
2)中間体2の合成
中間体1(100g、0.34mol)をテトラヒドロフラン(2L)と水(1L)の混合溶液に溶解し、0℃に冷却して1mol/L水酸化リチウム溶液(400mL)を滴下し、10時間撹拌し、濃塩酸でpH<6まで滴下中和し、減圧下で蒸発してテトラヒドロフランを除き、残りの水相はジクロロメタン(1L×3)で抽出し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させ、中間体2(88g白色固体、収率：92.2%)を得た。
中間体1(100g、0.34mol)をテトラヒドロフラン(2L)と水(1L)の混合溶液に溶解し、0℃に冷却して1mol/L水酸化リチウム溶液(400mL)を滴下し、10時間撹拌し、濃塩酸でpH<6まで滴下中和し、減圧下で蒸発してテトラヒドロフランを除き、残りの水相はジクロロメタン(1L×3)で抽出し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発させ、中間体2(88g白色固体、収率：92.2%)を得た。
3)中間体3の合成
三頚（三つ首）フラスコの中にL-ロイシンtert-ブチルエステル(22.4g、0.1mol)、N-Fmoc-N’-トリフェニルメチルアスパラギン酸(59.6g、0.1mol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1000mL)の中に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(14.85g、0.11mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(23g、0.12mol)を加え、0°Cで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(25.8g、0.2mol)を加え、10時間撹拌した後、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物はクロロホルム(1000ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、減圧蒸発で溶剤を除去して得た粗生成物は再結晶(体積比で計算すると、ジクロロメタン：酢酸エチル=1：1)によって純化した後、中間体3(42.4g白色固体、収率：55.4%)を得た。
三頚（三つ首）フラスコの中にL-ロイシンtert-ブチルエステル(22.4g、0.1mol)、N-Fmoc-N’-トリフェニルメチルアスパラギン酸(59.6g、0.1mol)をN,N-ジメチルホルムアミド(1000mL)の中に溶解し、撹拌しながら1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(14.85g、0.11mol)と1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(23g、0.12mol)を加え、0°Cで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(25.8g、0.2mol)を加え、10時間撹拌した後、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物はクロロホルム(1000ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、有機相は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、減圧蒸発で溶剤を除去して得た粗生成物は再結晶(体積比で計算すると、ジクロロメタン：酢酸エチル=1：1)によって純化した後、中間体3(42.4g白色固体、収率：55.4%)を得た。
4)中間体4の合成
中間体3(7.65g、0.01mol)をジクロロメタン(100mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(100mL)の混合溶液に溶かし、ピペリジン(40ml)を加え、室温で5時間撹拌した後、溶媒を減圧で蒸発させ、その後、真空オーブンで高真空乾燥させて少量のピペリジンを除去し、中間体4を得て薄黄色の固体とし、精製することなく次のステップに用いる。
中間体3(7.65g、0.01mol)をジクロロメタン(100mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(100mL)の混合溶液に溶かし、ピペリジン(40ml)を加え、室温で5時間撹拌した後、溶媒を減圧で蒸発させ、その後、真空オーブンで高真空乾燥させて少量のピペリジンを除去し、中間体4を得て薄黄色の固体とし、精製することなく次のステップに用いる。
5)中間体5の合成
前記工程で得た中間体4粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド(200mL)に溶解し、中間体2(2.94g、0.012mol)、ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウレタンヘキサフルオロホスファート(HBTU)(6.07g、0.016mol)を加え、0°Cまで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.6g、0.02mol)を加え、室温で一晩撹拌し、減圧蒸発で溶剤を除去し、残存物をクロロホルム(100ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、溶剤を蒸発し、得た粗生成物をシリカゲルをカラムで層析して、中間体5(3.1g白色固体、二段階総収率：37.8%)を得た。
前記工程で得た中間体4粗生成物をN,N-ジメチルホルムアミド(200mL)に溶解し、中間体2(2.94g、0.012mol)、ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウレタンヘキサフルオロホスファート(HBTU)(6.07g、0.016mol)を加え、0°Cまで氷浴した後、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.6g、0.02mol)を加え、室温で一晩撹拌し、減圧蒸発で溶剤を除去し、残存物をクロロホルム(100ml)に溶解し、順次に飽和塩化アンモニウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した後、溶剤を蒸発し、得た粗生成物をシリカゲルをカラムで層析して、中間体5(3.1g白色固体、二段階総収率：37.8%)を得た。
6)中間体6の合成
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g、3.65mmol)をメタノール(100mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(0.3g)を加え、水素ガスを入れ、常温常圧で4時間撹拌反応し、パラジウム炭素をろ過して除去し、メタノールで洗浄し、ろ液と洗液を合わせ、減圧蒸発で溶剤を除去して、中間体6(2.38g白色固体、収率：95.2%)を得た。
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g、3.65mmol)をメタノール(100mL)に溶解し、10%パラジウム炭素(0.3g)を加え、水素ガスを入れ、常温常圧で4時間撹拌反応し、パラジウム炭素をろ過して除去し、メタノールで洗浄し、ろ液と洗液を合わせ、減圧蒸発で溶剤を除去して、中間体6(2.38g白色固体、収率：95.2%)を得た。
7)中間体7の合成
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体6(2.387g、3.4mmol)、DEPBT1.35gを加えて、室温で10分反応させ、EMC-Glu(OAll)-COOH(1.3g、3.4mmol)を加え、窒素置換で保護して、室温で15分反応させ、DIPEA1.8mlを滴下して加えた後、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回に叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体700mgを得る。カラム精製により、生成物2.2gを、収率63.2%で得た。
乾燥した清潔な250ml片口反応フラスコに、順次にTHF15ml、中間体6(2.387g、3.4mmol)、DEPBT1.35gを加えて、室温で10分反応させ、EMC-Glu(OAll)-COOH(1.3g、3.4mmol)を加え、窒素置換で保護して、室温で15分反応させ、DIPEA1.8mlを滴下して加えた後、窒素置換で保護しながら、室温で3時間反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、水を加えて2～3回に叩解し、抽出、ろ過して、薄黄色の固体700mgを得る。カラム精製により、生成物2.2gを、収率63.2%で得た。
8）中間体8の合成
中間体7(1.53g、1.46mmol)をDCM(20mL)に溶かし、トリフルオロ酢酸(10ml)を室温で滴下し、反応液を2時間撹拌し、HPLCに送ってモニタリングしたところ、中間体7が完全に反応し、減圧蒸留で溶媒を除去し、粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回洗浄し、固体をメタノールで溶かし、逆相系高圧カラムに通すと中間体8(928mg白色固体、収率：84.8%)を得た。
中間体7(1.53g、1.46mmol)をDCM(20mL)に溶かし、トリフルオロ酢酸(10ml)を室温で滴下し、反応液を2時間撹拌し、HPLCに送ってモニタリングしたところ、中間体7が完全に反応し、減圧蒸留で溶媒を除去し、粗生成物をメチルtert-ブチルエーテルで2回洗浄し、固体をメタノールで溶かし、逆相系高圧カラムに通すと中間体8(928mg白色固体、収率：84.8%)を得た。
9)中間体9の合成
100mL反応フラスコにドキソルビシン塩酸塩5 10.4mg(1.0eq,、0.88mmol)と中間体8 659mg(1.0eq,、0.88mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分間反応させた。78μlのDIPEAを滴下して加えた。4時間で反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して中間体9を得た（258mg赤色固体、収率：23.8%）。
100mL反応フラスコにドキソルビシン塩酸塩5 10.4mg(1.0eq,、0.88mmol)と中間体8 659mg(1.0eq,、0.88mmol)を加え、窒素保護下で室温で15分間反応させた。78μlのDIPEAを滴下して加えた。4時間で反応させ、減圧蒸発で溶剤を除去し、粗生成物をメタノールに溶かして逆相高圧カラムに通して中間体9を得た（258mg赤色固体、収率：23.8%）。
10）最終生成物の合成
100mLの反応フラスコ15mlにTHF、中間体9(258mg、0.202mmol)、n-ブチル錫水素(175.7mg、0.606mmol)を順次加え、反応液を窒素で保護した後、反応液を捨てた。次に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（32.7mg、0.028mmol）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。変換が完了するまで、混合物をTLCでモニターした。その後、フラスコ内容物を珪藻土でろ過し、残渣をTHFで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をカラム精製し、目的化合物224mg（収率：90%）を得た。
100mLの反応フラスコ15mlにTHF、中間体9(258mg、0.202mmol)、n-ブチル錫水素(175.7mg、0.606mmol)を順次加え、反応液を窒素で保護した後、反応液を捨てた。次に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（32.7mg、0.028mmol）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。変換が完了するまで、混合物をTLCでモニターした。その後、フラスコ内容物を珪藻土でろ過し、残渣をTHFで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をカラム精製し、目的化合物224mg（収率：90%）を得た。
MI、S、C、A、D画分を変えて、実施例1-2、4-9と同様の方法で、下記表1の他の化合物を得た。
これらの化合物は質量分析（MS）により確認され、その分子量は表1の通りであり、構造に基づいて計算された分子量と一致していることが確認された。
また、本発明は、以下の構造式の比較化合物を提供する。
＜実施例10：ヒトアルブミン結合HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBP薬剤の調製＞
EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPの製剤化（EMC-AANL-DOXはDMSOで、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPは滅菌水で溶解させたもの）。HSAは滅菌水に溶解した。化合物をHSAと3：1（4.8umol/mL、1.6umol/mL）の比率で混合し、37℃のウォーターバスで3時間反応させた。反応液を除去し、未結合化合物を加圧限外ろ過膜でろ過し、生理食塩水で3回希釈ろ過して半製品とした。ヒトアルブミン結合ドキソルビシン抗腫瘍薬の単離には、例えばDEAEイオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法が用いられる。半製品は速やかに小分けし、スピン凍結、凍結乾燥を行う。生成物の凍結乾燥工程は、機械の性能特性に応じて開発することができるが、生成物の調製と保存の品質が要求を満たすように保証される必要がある。実験では、レグビシンとHSAの結合を、異なる比率、異なる時間で比較した。その結果、EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPは37℃の水浴中3：1でHSAと結合し、HSA結合率はそれぞれ62％、99.6％及び99.7％であった。
EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPの製剤化（EMC-AANL-DOXはDMSOで、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPは滅菌水で溶解させたもの）。HSAは滅菌水に溶解した。化合物をHSAと3：1（4.8umol/mL、1.6umol/mL）の比率で混合し、37℃のウォーターバスで3時間反応させた。反応液を除去し、未結合化合物を加圧限外ろ過膜でろ過し、生理食塩水で3回希釈ろ過して半製品とした。ヒトアルブミン結合ドキソルビシン抗腫瘍薬の単離には、例えばDEAEイオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法が用いられる。半製品は速やかに小分けし、スピン凍結、凍結乾燥を行う。生成物の凍結乾燥工程は、機械の性能特性に応じて開発することができるが、生成物の調製と保存の品質が要求を満たすように保証される必要がある。実験では、レグビシンとHSAの結合を、異なる比率、異なる時間で比較した。その結果、EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX及びQHL-087-N-CBPは37℃の水浴中3：1でHSAと結合し、HSA結合率はそれぞれ62％、99.6％及び99.7％であった。
＜実施例11：最適化された活性化効率を得るための化学修飾リンカーの選択＞
S-C-Aは、レグメインによって分解される天然ペプチド配列の接合と比較して、化学的に修飾された接合であり、高い活性化効率を示す。AANにCを選択した場合、異なるS-C-A関節と対照関節の活性化を活性化アッセイで評価する。S-C-Aアダクトを使用して溶解し、0.1mM/mlの濃度になるように10倍に希釈した。試料化合物を100μgの酸性化ヒト乳癌（MDA-MB435）腫瘍組織ホモジネート（pH6.0）に1mg/mlの濃度で37℃にて添加した。腫瘍組織のホモジネートから酵素を遊離させ、HPLCで検出することにより、腫瘍組織による接合部の活性化効率を比較することができる。その結果を表2-1、2-2、2-3、2-4に示す。
S-C-Aは、レグメインによって分解される天然ペプチド配列の接合と比較して、化学的に修飾された接合であり、高い活性化効率を示す。AANにCを選択した場合、異なるS-C-A関節と対照関節の活性化を活性化アッセイで評価する。S-C-Aアダクトを使用して溶解し、0.1mM/mlの濃度になるように10倍に希釈した。試料化合物を100μgの酸性化ヒト乳癌（MDA-MB435）腫瘍組織ホモジネート（pH6.0）に1mg/mlの濃度で37℃にて添加した。腫瘍組織のホモジネートから酵素を遊離させ、HPLCで検出することにより、腫瘍組織による接合部の活性化効率を比較することができる。その結果を表2-1、2-2、2-3、2-4に示す。
D型トリペプチドの活性化効率への影響を、レグメインによって分解される天然ペプチド配列の接合部と比較して検討した、MI-SのS1は-CH2CH2-CONH-、S2：2pegであった。その結果を以下の表2-4に示す。
表のデータからわかるように、SとAが高活性化のために設計されている条件で変数が異なるトリペプチドの場合、アミノ酸の選択とコンフォメーションの違いが活性化効率に影響を与え、特にD-Asnは活性化能力の低下を招き、他の2位はアミノ酸をD-フォームに調整しても活性化活性を持っていることがわかる。
＜実施例12：好ましい化合物の酵素切断の動力学的速度の比較＞
C3、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-094-DOX、QHL-093-DOX、QHL-096-DOX試料をそれぞれ10mg秤り、適量の水を加えて4umol/mLの試料原液とし、水を加えて下記表3の濃度に徐々に希釈した後、試料を測定した。濃度の異なる試料溶液を20ul測定し、80ulLegumainを加え、37℃水浴；2h水浴後取り出し、10ul注入しHPLCで検出；対応する各生成物の面積を読み取り、生成物の線形方程式に従って生成物の濃度を計算し、式に代入して対応のVを得た。
C3、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-094-DOX、QHL-093-DOX、QHL-096-DOX試料をそれぞれ10mg秤り、適量の水を加えて4umol/mLの試料原液とし、水を加えて下記表3の濃度に徐々に希釈した後、試料を測定した。濃度の異なる試料溶液を20ul測定し、80ulLegumainを加え、37℃水浴；2h水浴後取り出し、10ul注入しHPLCで検出；対応する各生成物の面積を読み取り、生成物の線形方程式に従って生成物の濃度を計算し、式に代入して対応のVを得た。
V（umoL/mL/min）=C(umoL/mL)/120min
Vを［C］に対してプロットすることにより、インターセプトKm/Vmaxとする。x軸と直線の交点、-Kmの場合、[C]は各基質の濃度、すなわち試料溶液の濃度をumoL/mLで表したものである。
他の構造と同じ条件での実験結果を図3に示す。QHL-087の2PEGグループは活性化効率を著しく高めるが、その代わりにPEGの数が増えると効率が低下する。これを6PEGグループが結合している同じ条件：H2PABC-NH2H2がleuに置き換わり活性化効率が大幅に上昇した場合と比較してみる。
＜実施例13：マウス脾臓及びCD8+T細胞の分離培養、マウス骨髄単核細胞の分離培養とM2マクロファージの分化誘導＞
1.マウス脾臓細胞の単離
1) C57BL/6マウスの脾臓を採取し、40uMのふるい付きシャーレの上に置き（氷浴）、約10mLの生理食塩水を加え、滅菌済み注射器の芯で軽くすりつぶす。
2)50mL遠心管に粉砕した細胞懸濁液を移し、生理食塩水を約5mL加えて培養皿を洗浄し、50mL遠心管に移し、懸濁液を合体させる。
3)1000r/min遠心細胞懸濁液10min、上澄み液を捨て、適量の体積生理食塩水を再び懸濁し、3倍体積塩化アンモニウム赤血球溶解液を加え、均一化のためにブローを施した。氷上溶解の約10分後、生理食塩水10mLを加えて、溶解を終了させ、1000r/minで5分間遠心分離する。
4)遠心分離後、上澄み液を捨て、生理食塩水10mLを加えてよく吹き、1000r/minで5分間遠心分離し、この操作を1回繰り返した後、その後の培養には10%RMPI1640培地、その後のT細胞ソーティングには0.5%BSAに細胞を再懸濁させたものを用いる。
1.マウス脾臓細胞の単離
1) C57BL/6マウスの脾臓を採取し、40uMのふるい付きシャーレの上に置き（氷浴）、約10mLの生理食塩水を加え、滅菌済み注射器の芯で軽くすりつぶす。
2)50mL遠心管に粉砕した細胞懸濁液を移し、生理食塩水を約5mL加えて培養皿を洗浄し、50mL遠心管に移し、懸濁液を合体させる。
3)1000r/min遠心細胞懸濁液10min、上澄み液を捨て、適量の体積生理食塩水を再び懸濁し、3倍体積塩化アンモニウム赤血球溶解液を加え、均一化のためにブローを施した。氷上溶解の約10分後、生理食塩水10mLを加えて、溶解を終了させ、1000r/minで5分間遠心分離する。
4)遠心分離後、上澄み液を捨て、生理食塩水10mLを加えてよく吹き、1000r/minで5分間遠心分離し、この操作を1回繰り返した後、その後の培養には10%RMPI1640培地、その後のT細胞ソーティングには0.5%BSAに細胞を再懸濁させたものを用いる。
2.CD8+T細胞ソーティング
マウス脾臓細胞を上記のように単離し、1E8/mLに再懸濁し、100ulMiltenyibiotecCD8a(Ly-2)microBeadsを各1E8細胞に添加し、よく混合し、4℃で15分間遮光してインキュベートを行い、5-10倍量のPBSを加えて洗浄し、よく混合し、300gで5分遠心し、上澄み液除去し、繰り返し洗浄し、再懸濁した。細胞をカラム上で単離するために2E8/mLに再懸濁し、細胞懸濁液をマグネットプレート上のLSカラムに載せた（LSカラムは緩衝液（pH7.2PBS+0.5%BSA+2mMEDTA）で予め平衡化されていた）。細胞懸濁液がLSカラム内をゆっくりと流れ、CD8+T細胞がLSカラム内の磁性粒子に結合した後、3倍量の洗浄バッファーでLSカラムを洗浄し、洗浄後、マグネットプレート下からLSカラムを取り出し、15mLの遠心チューブに入れる。カラムを通過した全ての細胞を回収し、遠心分離して上澄み液を除去した後、緩衝液でもう一度洗浄し、適量の10%RMPI1640培地に再懸濁し、細胞を計数して保存した。
マウス脾臓細胞を上記のように単離し、1E8/mLに再懸濁し、100ulMiltenyibiotecCD8a(Ly-2)microBeadsを各1E8細胞に添加し、よく混合し、4℃で15分間遮光してインキュベートを行い、5-10倍量のPBSを加えて洗浄し、よく混合し、300gで5分遠心し、上澄み液除去し、繰り返し洗浄し、再懸濁した。細胞をカラム上で単離するために2E8/mLに再懸濁し、細胞懸濁液をマグネットプレート上のLSカラムに載せた（LSカラムは緩衝液（pH7.2PBS+0.5%BSA+2mMEDTA）で予め平衡化されていた）。細胞懸濁液がLSカラム内をゆっくりと流れ、CD8+T細胞がLSカラム内の磁性粒子に結合した後、3倍量の洗浄バッファーでLSカラムを洗浄し、洗浄後、マグネットプレート下からLSカラムを取り出し、15mLの遠心チューブに入れる。カラムを通過した全ての細胞を回収し、遠心分離して上澄み液を除去した後、緩衝液でもう一度洗浄し、適量の10%RMPI1640培地に再懸濁し、細胞を計数して保存した。
3.CD8+T陽性細胞の活性化と増幅
A.CD3/CD28磁気ビーズの洗浄：a.チューブ内の免疫磁気ビーズを振って懸濁させる（30秒以上ボルテックス、又は5分間傾けスピンを行う）。b.必要量の免疫磁気ビーズを1.5mlチューブに取り出し、1mlの血清入り1640を加えてよく混ぜ、30秒以上ボルテックスするか、5分以上ローリングしておく。
A.CD3/CD28磁気ビーズの洗浄：a.チューブ内の免疫磁気ビーズを振って懸濁させる（30秒以上ボルテックス、又は5分間傾けスピンを行う）。b.必要量の免疫磁気ビーズを1.5mlチューブに取り出し、1mlの血清入り1640を加えてよく混ぜ、30秒以上ボルテックスするか、5分以上ローリングしておく。
B.T細胞の活性化：a.適切な数の細胞を培養プレートに接種する（例：6ウェルプレート1E6/ml、培養液2ml、T細胞密度を約2E6/mlに維持すること。）。b.洗浄した磁性ビーズをビーズ：細胞（個数比）＝1：1になるように加える。c.インキュベーターに入れ、3日間培養する。
C.増殖：a.3日以内は培地交換の必要はない。3日目に30U/mlを添加し（適宜増量可）、培地交換を行う（48時間後に細胞数は約1倍に増殖、細胞のサイズと形態をリアルタイムで観察する）。b.4～5日間刺激した後（過活性化を避けるため）磁気ビーズを取り除き、気泡や乱流を避けるために5～10回上下に動かし、細胞と磁性ビーズを単離させる。1.5mlのチューブに集め、磁性ビーズがチューブの壁につくまで磁性ビーズの上に1分間置き、細胞を別のチューブに移して磁性ビーズをできるだけ完全に取り除き、ビーズから取り除いた細胞を30U/ml（適宜増加）を加えた培地で培養を続け、その状態、増殖及び生存率をモニターする。
4.マウス骨髄からの単一有核細胞の単離とM2マクロファージの分化誘導
C57BL/6マウス2匹を無菌状態で両大腿骨と脛骨を摘出し、超清浄台上で骨端を切り開き、骨髄腔を無血清MEM培養液5mLで4回繰り返し穏やかに洗浄し、すべての細胞懸濁液を採取した。1000r/minで10分間遠心分離し、上澄み液を捨てて細胞沈殿物を得た後、適当量の無血清MEM培地を再懸濁、ブローとホモジナイズを繰り返した後、40uMのフィルターでろ過し、3倍量の赤血球溶解液を加え、氷上で10分間溶解した；1000r/minで5分間遠心分離し、上澄みを捨てて細胞沈殿物を得、無血清MEM培地で2回洗浄して細胞沈殿物を回収した。細胞は、10%体積分画のFBS、1%PSを含む適切な量のMEM完全培養液に再懸濁し、その後の分化を待って細胞を計数した；96ウェル細胞培養プレートに20,000個/ウェルを100uL接種し、M2マクロファージ分化のために100ng M-CSFを添加、37℃、5％CO2体積分率インキュベーターで7日間培養して分化を誘導、細胞形態を観察した。誘導された細胞の形態は、図4を参照してM2マクロファージと確認され、M2マクロファージは単球、DC、GM-マクロファージと異なることがわかる。
C57BL/6マウス2匹を無菌状態で両大腿骨と脛骨を摘出し、超清浄台上で骨端を切り開き、骨髄腔を無血清MEM培養液5mLで4回繰り返し穏やかに洗浄し、すべての細胞懸濁液を採取した。1000r/minで10分間遠心分離し、上澄み液を捨てて細胞沈殿物を得た後、適当量の無血清MEM培地を再懸濁、ブローとホモジナイズを繰り返した後、40uMのフィルターでろ過し、3倍量の赤血球溶解液を加え、氷上で10分間溶解した；1000r/minで5分間遠心分離し、上澄みを捨てて細胞沈殿物を得、無血清MEM培地で2回洗浄して細胞沈殿物を回収した。細胞は、10%体積分画のFBS、1%PSを含む適切な量のMEM完全培養液に再懸濁し、その後の分化を待って細胞を計数した；96ウェル細胞培養プレートに20,000個/ウェルを100uL接種し、M2マクロファージ分化のために100ng M-CSFを添加、37℃、5％CO2体積分率インキュベーターで7日間培養して分化を誘導、細胞形態を観察した。誘導された細胞の形態は、図4を参照してM2マクロファージと確認され、M2マクロファージは単球、DC、GM-マクロファージと異なることがわかる。
＜実施例14：MTTアッセイによる薬剤の細胞増殖抑制効果の測定＞
実施例13の細胞を計数し、培養液で細胞濃度を調整し、96ウェル培養プレートに、CD8+T細胞は100,000個／ウェル、M2マクロファージは20,000個／ウェルの濃度となるように1ウェルあたり100μlの細胞懸濁液を接種した。96ウェル培養プレートを37℃、CO2（5％）インキュベーターで一晩24時間インキュベートした。24時間後、96ウェル培養プレートに異なる濃度の薬剤を含む細胞培養液100ulを加え、薬剤を含まず、対応する薬剤溶媒（0.1%DMSO）のみのコントロールウェルと、培地のみで細胞を含まないゼロ化ウェル（Blank）を設定した。各グループに3つの平行なウェルを設定し、その後、プレートをCO2（5%）インキュベーター内で37℃、48時間インキュベートした。48時間後、20μlのMTT（濃度5mg/ml）を各ウェルに加え、4時間インキュベーションを続けた。その後、培養液を静かに吸引し、溶媒として150μlDMSOを各ウェルに加え、溶解させた。溶解後、酵素マーカーを用いて490nmの吸光度を測定した。
実施例13の細胞を計数し、培養液で細胞濃度を調整し、96ウェル培養プレートに、CD8+T細胞は100,000個／ウェル、M2マクロファージは20,000個／ウェルの濃度となるように1ウェルあたり100μlの細胞懸濁液を接種した。96ウェル培養プレートを37℃、CO2（5％）インキュベーターで一晩24時間インキュベートした。24時間後、96ウェル培養プレートに異なる濃度の薬剤を含む細胞培養液100ulを加え、薬剤を含まず、対応する薬剤溶媒（0.1%DMSO）のみのコントロールウェルと、培地のみで細胞を含まないゼロ化ウェル（Blank）を設定した。各グループに3つの平行なウェルを設定し、その後、プレートをCO2（5%）インキュベーター内で37℃、48時間インキュベートした。48時間後、20μlのMTT（濃度5mg/ml）を各ウェルに加え、4時間インキュベーションを続けた。その後、培養液を静かに吸引し、溶媒として150μlDMSOを各ウェルに加え、溶解させた。溶解後、酵素マーカーを用いて490nmの吸光度を測定した。
細胞の生存率及び細胞に対する薬剤の半減期阻害濃度を算出した。細胞生存率=(ODtest-ODblankcontrol)/(ODtestcontrol-ODblankcontrol)*100%.生存率（％）はExcelソフトで計算し、細胞に対する薬剤の用量反応曲線はPrism5ソフトでプロットし、各指標は平均値で表し、データの整合性を評価するために変動係数（CV）を表示した。
被験薬の最大開始濃度を14uMとし、1：3の割合で希釈して9投与群（1群3反復）とし、すべての投与ウェルの薬剤溶媒（DMSO）濃度を0.1％に制御し、対照群として薬剤溶媒（0.1％DMSO）のみを加えた（Control）。次に、以下の方法に従って、対照群（Control）に対する各投与群の腫瘍細胞生存率（％）を算出した。
各投与群の細胞生存率（％）＝（OD投与群-ODブランク群）／（OD0.1％DMSO-ODブランク群）*100％。
実験結果を図5、図6に示す。それ以外の構造的に矛盾しない条件下では、QHL-087-DOXはC3（すなわちEMC-AANL-DOX）と比較して、M2マクロファージに対する細胞毒性が著しく増加し、CD8+T細胞に対する毒性が減少し、免疫抑制細胞に対する選択性が得られた。
＜実施例15：本発明の複数の薬剤のM2マクロファージに対する細胞毒性スクリーニング＞
実施例14の方法に従って、いくつかの化合物のM2マクロファージ阻害の細胞毒性スクリーニングアッセイを実施した。各薬剤について3ウェルを試験し、各ウェルに以下の薬剤を10uM添加し、薬剤無添加群に対する阻害率を試験し、実験結果を表4に示す。
実施例14の方法に従って、いくつかの化合物のM2マクロファージ阻害の細胞毒性スクリーニングアッセイを実施した。各薬剤について3ウェルを試験し、各ウェルに以下の薬剤を10uM添加し、薬剤無添加群に対する阻害率を試験し、実験結果を表4に示す。
＜実施例16：本発明の実施形態により調製した水溶性高効率標的活性化ドキソルビシン誘導体等の水溶性を対照化合物と比較した場合＞
本発明の実施形態に従って調製した化合物を、上記で調製した化合物及び参照化合物C1、C2、C3及びC4から凍結乾燥（-70℃）させた。化合物を異なる濃度の水に溶解し、観察及びHPLC試験により水溶性を確認した（95%以上）。その結果を表4に示す。
本発明の実施形態に従って調製した化合物を、上記で調製した化合物及び参照化合物C1、C2、C3及びC4から凍結乾燥（-70℃）させた。化合物を異なる濃度の水に溶解し、観察及びHPLC試験により水溶性を確認した（95%以上）。その結果を表4に示す。
試験の結果、2PEGグループは、それ以外の構造的に矛盾しない条件下で、水への不溶性から水溶性への溶解性を著しく高め、PEG量の増加とともに溶解性が増大することが確認された。同じ条件のPEG結合では、GluとAspの添加で水溶性が向上した。グループの変更により、薬物複合体の水溶性が変化し、血管膜からの薬剤の出口と腫瘍細胞膜の透過性の両方に劇的な影響を与え、治療効果に影響を与えることができた。水溶性が向上することで、薬物形成に必要な条件が整い、薬物複合体を調整できるようになった。
＜実施例17：HT1080のヌードマウスモデルにおけるC3、QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX、QHL-094-DOXの注射投与に関する薬効評価＞
目的：腫瘍治療中のマウスモデルにおいて、C3、QHL-085-DOX、QHL-087s-DOX、QHL-091-DOX、QHL-94-DOXの抗腫瘍効果を検討すること。
試験薬：C3、QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX、QHL-094-DOXを注射薬として用い、生理食塩水で試験に適した濃度に希釈して使用した。
目的：腫瘍治療中のマウスモデルにおいて、C3、QHL-085-DOX、QHL-087s-DOX、QHL-091-DOX、QHL-94-DOXの抗腫瘍効果を検討すること。
試験薬：C3、QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX、QHL-094-DOXを注射薬として用い、生理食塩水で試験に適した濃度に希釈して使用した。
方法と結果：
1.動物：6-8週齢のヌードマウス、すべて雌。
1.動物：6-8週齢のヌードマウス、すべて雌。
2.腫瘍モデルの作製
1)HT1080細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
1)HT1080細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
2)腫瘍の発生：HT1080細胞5×106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍の大きさが100mm3に達した時点で、無作為にグループ分けを行った。その後、治療を開始し、治療開始日を1日目と記録した。
3)治療の手順
QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX、QHL-094-DOXのC3、臨床応用による点滴静注用薬剤。C3、QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX及びQHL-094-DOXをそれぞれ低用量及び同用量の18umol/kgで投与した。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間投与した。
QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX、QHL-094-DOXのC3、臨床応用による点滴静注用薬剤。C3、QHL-085-DOX、QHL-087-DOX、QHL-091-DOX及びQHL-094-DOXをそれぞれ低用量及び同用量の18umol/kgで投与した。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間投与した。
4)結果及び考察：グループ分けと試行結果を図7に示すが、等モル低用量投与群に比べ、4peg群及び2peg群で腫瘍抑制効果が順次増強された。
＜実施例18：HT1080のヌードマウスモデルにおけるC1、C2、C3、QHL-086-DOX、QHL-092-DOX、QHL-095-DOX、QHL-087-DOX、QHL-010-DOX、QHL-117-DOXの注射投与に関する薬効評価＞
目的：上記化合物の腫瘍治療中のマウスモデルにおける抗腫瘍効果を検討する。
被験薬：C1、C2、C3、及び対応する化合物注射剤を試験用の生理食塩水で適切な濃度に希釈したもの。
目的：上記化合物の腫瘍治療中のマウスモデルにおける抗腫瘍効果を検討する。
被験薬：C1、C2、C3、及び対応する化合物注射剤を試験用の生理食塩水で適切な濃度に希釈したもの。
方法と結果：
1.動物：6-8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
1.動物：6-8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
2.腫瘍モデルの作製
1)HT1080細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
1)HT1080細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
2)腫瘍の発生：HT1080細胞5×106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍の大きさが100mm3に達した時点で、無作為にグループ分けを行った。その後、治療を開始し、治療開始日を1日目と記録した。
3)治療の手順
対応する化合物の臨床応用に応じた静脈内投与薬（IV）。表に示す化合物を低用量で投与し、36umol/kgの同用量で投与する。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間投与した。
対応する化合物の臨床応用に応じた静脈内投与薬（IV）。表に示す化合物を低用量で投与し、36umol/kgの同用量で投与する。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間投与した。
4)サブグループとテスト結果は表5に示す通りである。
5)結果及び考察：表5に示すように、等モル量のAANL-DOX投与群と比較して、QHL-086-DOX、QHL-092-DOX、QHL-095-DOX、QHL-087-DOX、QHL-010-DOX、QHL-117-DOX高量処理群は腫瘍の増殖抑制と腫瘍の消失を大きく改善し、また治癒的な効果が得られた。
＜実施例19：肝臓in situ移植CT26腫瘍におけるQHL-087-DOX及びEMC-AANL-DOXの組織分布試験＞
実験の目的：肝腫瘍における活性化剤の組織分布の検討。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
実験の目的：肝腫瘍における活性化剤の組織分布の検討。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
腫瘍モデルの作製
1)CT26細胞はATCCから購入し、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地中、37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
1)CT26細胞はATCCから購入し、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地中、37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
2)腫瘍の発生：CT26細胞5×106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍の大きさが800-1000mm3に達した時点でランダムなグループ分けを行った。その後、腫瘍組織を抽出し、100mm3のブロックに切り出し、BALB/cマウスの肝臓にin situで移植した。
3)薬剤投与：14日後、in situ移植腫瘍が成長した時点で、in situ移植腫瘍を有するマウス36匹に薬剤を投与した。その後、1、6、12、24、36、72時間後に異なる組織を採取し、異なる組織で放出されたドキソルビシンの濃度を検出した。AUClasth*nmol/gを算出し、平均値及びSEMを図8及び図9に示した。
4)結果及び考察：図8及び図9に示すように、QHL-087-DOX及びEMC-AANL-DOXの活性ドキソルビシンは、肝臓及び肝臓in situ腫瘍に優位に分布していた。先に発表したEMC-AANL-DOXの用途は乳癌治療であったが、さらなる研究の結果、QHL-087-DOXは腫瘍のin situ活性化によりアドリアマイシン曝露量が多くなる肝臓に薬剤を送達する特性があることが判明した。QHL-087-DOXはEMC-AANL-DOXと比較して、in situ肝細胞癌におけるドキソルビシン曝露の送達と活性化が促進された。
＜実施例20：in situ肝移植によるCT26腫瘍におけるQHL-087-DOXの薬効評価＞
試験目的：in situ移植されたCT26腫瘍に対するQHL-087-DOX、PD-1及びそれらの併用療法の有効性を検討すること。
被験薬：QHL-087-DOX18micromol/kg、マウスPD-1 5mg/kg。
動物：6-8週齢のBALB/cマウス、すべて雌。
試験目的：in situ移植されたCT26腫瘍に対するQHL-087-DOX、PD-1及びそれらの併用療法の有効性を検討すること。
被験薬：QHL-087-DOX18micromol/kg、マウスPD-1 5mg/kg。
動物：6-8週齢のBALB/cマウス、すべて雌。
1)腫瘍モデルの作成：CT26腫瘍細胞はATCCから入手した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。細胞は3日ごとに継代し、15世代目以内の細胞を使用した。5x105個のCT26癌細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が800-1000mm3に達した後、マウスを無作為にグループ分けした。その後、腫瘍組織を抽出し、100mm3のブロックに切り出し、BALB/cマウスの肝臓にin situで移植した。1週間後、in situ移植された腫瘍が成長した時点で、in situ移植された腫瘍を持つマウスをランダムにグループ分けした。
2)処理手順：1群6匹のマウスに薬剤を投与した。施術日は1日目。QHL-087-DOXの臨床応用に合わせ、週1回、3週間の点滴静注を実施。マウスPD-1抗体を週2回、3週間にわたり静脈内投与した。サブグループとテスト結果は添付の図10に示す通りである。
3)結果及び考察：QHL-087-DOXとPD-1の併用は、肝in situ腫瘍に対して初めて免疫相乗効果を示し、QHL-087-DOX単独と比較して優れた有効性と免疫治療特性を有することが明らかになった。
＜実施例21：EMC-AANL-DOX(レグビシン、legubicin)を用いたin situ肝癌に対するレンバチニブとPD-1の相互併用療法の効果＞
試験目的：in situ肝癌に対するEMC-AANL-DOX、レンバチニブとPD‐1の相互併用療法の効果。
治験薬：EMC-AANL-DOX18μmol/kg、PD-1 5mg/kgをマウスで投与。
動物：6-8週齢のBALB/cマウス、すべて雌。
試験目的：in situ肝癌に対するEMC-AANL-DOX、レンバチニブとPD‐1の相互併用療法の効果。
治験薬：EMC-AANL-DOX18μmol/kg、PD-1 5mg/kgをマウスで投与。
動物：6-8週齢のBALB/cマウス、すべて雌。
腫瘍モデルの作成：CT26腫瘍細胞はATCCから入手した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。細胞は3日ごとに継代し、15世代目以内の細胞を使用した。5x105個のCT26癌細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が800-1000mm3に達した後、マウスを無作為にグループ分けした。その後、腫瘍組織を抽出し、100mm3のブロックに切り出し、BALB/cマウスの肝臓にin situで移植した。1週間後、in situ移植された腫瘍が成長した時点で、in situ移植された腫瘍を持つマウスをランダムにグループ分けした。
処理手順：1群6匹のマウスに薬剤を投与した。施術日は1日目。EMC-AANL-DOXの臨床応用によれば、週1回、3週間にわたり静脈内投与が行われた。マウスPD-1抗体を週2回、3週間にわたり静脈内投与した。サブグループとテスト結果は添付の図11に示す通りである。
結果及び考察：初めてEMC-AANL-DOXとPD-1の連合治療の効果はレンバチニブとPD-1の連合治療より優れ、それとともにEMC-AANL-DOXとレンバチニブの連合治療はそれぞれの単独治療の効果より増強することを発見した。
＜実施例22：ヌードマウスにおけるヒト肝細胞癌HepG2細胞に対する本発明のいくつかの化合物の注射の有効性の検討＞
実験の目的：マウス腫瘍治療モデルにおける本発明のいくつかの化合物の抗腫瘍効果を研究すること。
被験薬：表中の対応する化合物の注射剤と対照の注射剤を、試験時に生理食塩水で適当な濃度に希釈したもの。
実験の目的：マウス腫瘍治療モデルにおける本発明のいくつかの化合物の抗腫瘍効果を研究すること。
被験薬：表中の対応する化合物の注射剤と対照の注射剤を、試験時に生理食塩水で適当な濃度に希釈したもの。
方法と結果：
1.試験動物：6～8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
1.試験動物：6～8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
2.腫瘍モデルの作製
1)ヒト肝細胞癌HepG2細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
1)ヒト肝細胞癌HepG2細胞はATCCから購入し、ATCCが提供する説明書に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
2)腫瘍の発生：HepG2細胞5×106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍の大きさが100mm3に達した時点で、ランダムなグループ分けを行った。その後、治療を開始し、治療開始日を1日目と記録した。
3)治療の手順
対応する化合物の臨床応用に応じた静脈内投与薬（IV）。化合物及び対照薬は54umol/kgの用量で投与され、DOXは毒性の制限により18umol/kgの用量でのみ利用可能であった。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、4週間投与した。
対応する化合物の臨床応用に応じた静脈内投与薬（IV）。化合物及び対照薬は54umol/kgの用量で投与され、DOXは毒性の制限により18umol/kgの用量でのみ利用可能であった。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、4週間投与した。
4)サブグループとテスト結果は表6に示す通りである。
5)結果及び考察：表6に示すように、EMC-AANL-DOXは肝細胞癌に対して優れた効果を示し、本発明の好ましい化合物は、同じモル量のEMC-AANL-DOXの使用と比較して腫瘍の成長に対する治療効果の増加を示した。
＜実施例23：CT26腫瘍免疫モデルの治療におけるQHL-096-DOX、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-117-DOXの薬効評価＞
試験の目的：CT26腫瘍モデルを用いた免疫療法において、上記化合物の抗腫瘍効果を検討する。
被験薬：QHL-096-DOX、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-117-DOX及びコントロール、用量36umol/k、マウスPD-1抗体、5mg/kg。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
試験の目的：CT26腫瘍モデルを用いた免疫療法において、上記化合物の抗腫瘍効果を検討する。
被験薬：QHL-096-DOX、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-117-DOX及びコントロール、用量36umol/k、マウスPD-1抗体、5mg/kg。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
腫瘍モデルの作製
1)CT26細胞はATCCから購入し、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
1)CT26細胞はATCCから購入し、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5%CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。
2）腫瘍の発生：対応する細胞5x106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が少なくとも100mm3に達した後、マウスを無作為にグループ分けした。その後、治療が始まり、その日が初日となる。
3)治療の経過：36umol/kgの等モル量で投与される。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間にわたって投与された。
4)腫瘍CD8+T細胞解析。腫瘍組織をホモジナイズし、腫瘍内の個々の細胞をろ過して単離し、緩衝液で2回洗浄した後、白血球共通抗原CD45-PEとCD8-FITCで標識した抗体と室温で1時間インキュベートした。細胞は1%ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝液で2回洗浄し、白血球共通抗原（CD45）陽性細胞中のTリンパ球抗原（CD8）陽性細胞の割合についてフローサイトメトリーで分析した。この比率の増加は、Tリンパ球の増加、つまり腫瘍に対する動物の免疫力の向上を示していた。
5)グループ分けと試験結果を表7に示す。
6)結果及び考察：C3、QHL-096-DOX、QHL-087-DOX、QHL-090-DOX、QHL-093-DOX、QHL-117-DOXとPD-1の併用は単剤よりも治療効果を高め、腫瘍を治癒させることがわかった。QHL-090-ダラフェニブ、QHL-090-ダラフェニブは、PD-1との併用でもある程度の相乗効果を発揮するとのこと。
＜実施例24：様々な腫瘍モデルにおけるQHL-087-DOX注射剤の有効性試験＞
試験目的：マウスの様々な腫瘍モデルにおいて、QHL-087の抗腫瘍スペクトルを検討する。
試験薬：QHL-087-DOXを注射し、生理食塩水で試験に適した濃度に希釈した。
試験目的：マウスの様々な腫瘍モデルにおいて、QHL-087の抗腫瘍スペクトルを検討する。
試験薬：QHL-087-DOXを注射し、生理食塩水で試験に適した濃度に希釈した。
方法と結果：
1.動物：6-8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
1.動物：6-8週齢のヌードマウス（すべて雌）。
2.腫瘍モデルの作製
1)対応する腫瘍細胞は、AmericanTypicalCultureCollection(ATCC)から購入し、ATCCが提供する仕様に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5%CO2で培養した。細胞は3日ごとに継代し、15世代目以内の細胞を使用した。
1)対応する腫瘍細胞は、AmericanTypicalCultureCollection(ATCC)から購入し、ATCCが提供する仕様に従って同定した。細胞は10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5%CO2で培養した。細胞は3日ごとに継代し、15世代目以内の細胞を使用した。
2）腫瘍の発生：対応する細胞5x106個をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が少なくとも100mm3に達した後、マウスを無作為にグループ分けした。その後、治療が始まり、その日が初日となる。
3)治療の経過：QHL-087-DOXの臨床応用に合わせ、36umol/kgの用量で投与された。対照群には生理食塩水が投与された。週1回、3週間にわたって投与された。
4)グループ分けと試験結果は表8の通りである。
5)結果及び考察：QHL-087-DOXは様々な腫瘍モデルで優れた有効性を示し、本薬剤が幅広い抗腫瘍スペクトラムを有することが示された。
＜実施例25：HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX、及びHSA-QHL-087-N-CBPの溶解度をコントロール化合物と比較した場合＞
本発明の本実施形態により調製された凍結乾燥EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPを無菌室で分注し、注射用水で再溶解させた。HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPは、表9に示すように、すべて完全に溶解することができた。
本発明の本実施形態により調製された凍結乾燥EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPを無菌室で分注し、注射用水で再溶解させた。HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPは、表9に示すように、すべて完全に溶解することができた。
表9からわかるように、化合物をヒトアルブミン結合化合物させると溶解性がさらに向上し、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPはEMC-AANL-DOXを溶解するのに必要な厳しい有機溶媒を必要とせずに注射用水又は生理食塩水を用いて直接高濃度に溶解できる大きなタンパク質医薬品となり得る。EMC-AANL-DOXのような水に溶けない低分子化合物とは異なり、溶解性の特性の変化は、薬物の分布や代謝、薬物の作用機序の両方に劇的な影響を与える。
＜実施例26：本発明の実施形態により調製された水溶性高効率標的活性化ドキソルビシン誘導体の溶液安定性と対照化合物との比較＞
化合物EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPを正確に計量して、無菌室で各5.0mgずつ分注、滅菌水0.5mlを加えて10mg/mlのマスターミックスを作るには、EMC-AANL-DOXの溶解に50%エタノールが必要であった。母液30ulを取り、異なるpH5.5の緩衝液570ulを加えて0.5mg/mlの試料溶液とする。清澄化後、25℃/37℃のウォーターバスで8H静置し、HPLCと電気泳動で相対的な0h含量を測定し、各化合物の安定性データを得た。その結果を表10に示す。
化合物EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPを正確に計量して、無菌室で各5.0mgずつ分注、滅菌水0.5mlを加えて10mg/mlのマスターミックスを作るには、EMC-AANL-DOXの溶解に50%エタノールが必要であった。母液30ulを取り、異なるpH5.5の緩衝液570ulを加えて0.5mg/mlの試料溶液とする。清澄化後、25℃/37℃のウォーターバスで8H静置し、HPLCと電気泳動で相対的な0h含量を測定し、各化合物の安定性データを得た。その結果を表10に示す。
上表のデータからわかるように、アルブミン結合化合物の安定性は25℃、pH=5.5で上昇し、QHL-087-N-CBPとHSA-QHL-087-N-CBPでより顕著であった。
＜実施例27：HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPの活性化効率試験＞
EMC-AANL-DOXは溶媒（注射用水50％＋アルコール50％）を用いて溶解し、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPは注射用水を用いて均一に溶解し、水で10倍に希釈して1mg/mlとした。本発明の実験では、試料化合物1mg/mlを37℃で酸性化した腫瘍組織ホモジネート100μg（pH6.0）に加え、腫瘍組織ホモジネート中の酵素によりドキソルビシンを遊離させ、腫瘍組織における薬物活性化効率を、化合物の減少及びドキソルビシンの増加を検出できるHPLCにより比較した。EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-N-CBP結合は、スクリーニングした化合物の中で最も活性化効率が高いことが判明した。その結果を表11に示す。
EMC-AANL-DOXは溶媒（注射用水50％＋アルコール50％）を用いて溶解し、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPは注射用水を用いて均一に溶解し、水で10倍に希釈して1mg/mlとした。本発明の実験では、試料化合物1mg/mlを37℃で酸性化した腫瘍組織ホモジネート100μg（pH6.0）に加え、腫瘍組織ホモジネート中の酵素によりドキソルビシンを遊離させ、腫瘍組織における薬物活性化効率を、化合物の減少及びドキソルビシンの増加を検出できるHPLCにより比較した。EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-N-CBP結合は、スクリーニングした化合物の中で最も活性化効率が高いことが判明した。その結果を表11に示す。
＜実施例28：EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPの毒性判定＞
試験の目的：マウスを用いた静脈内MTD試験の測定により、本発明の薬物生物の急性毒性を把握すること。
試験薬：EMC-AANL-DOXは溶媒（注射用水50%、アルコール50%）に、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPは注射用水で溶解し、試験用の生理食塩水に適当量に薄めながら使用した。
動物：グレード1のBALB/Cマウス（上海スレイク実験動物有限責任会社より購入）、体重19～21g、すべて雌。
試験の目的：マウスを用いた静脈内MTD試験の測定により、本発明の薬物生物の急性毒性を把握すること。
試験薬：EMC-AANL-DOXは溶媒（注射用水50%、アルコール50%）に、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPは注射用水で溶解し、試験用の生理食塩水に適当量に薄めながら使用した。
動物：グレード1のBALB/Cマウス（上海スレイク実験動物有限責任会社より購入）、体重19～21g、すべて雌。
方法と結果：体重19-21gのBALB/Cマウス70匹（すべて雌）を、体重に応じて10匹ずつの7群に無作為に分けた。EMC-AANL-DOX、HSA-EMC-AANL-DOX、QHL-087-DOX、HSA-QHL-087-DOX、QHL-087-N-CBP及びHSA-QHL-087-N-CBPは表12のように単回で静脈内に投与された。生理食塩水群及びパクリタキセル群注射（市販品、北京越康）の対照試験も行い、各マウスに薬剤量0.2mlを投与した。17日間連続で観察し、立毛、乱れ、艶なし、嗜眠、前かがみ、過剰反応などを毎日観察し、体重と死亡率を記録した。3日目、5日目、14日目に血液を採取して全血球計算を行い、14日目に動物を解剖して心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、膵臓を採取し、HE染色して観察した。
結果及び考察：本発明のHSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOX及びHSA-QHL-087-N-CBPを注射した場合、動物は立毛勃起、乱雑で光沢のない状態、嗜眠、しゃがみ込み、過剰反応及び死亡を示さず、アルブミン複合体の毒性が複合体でない薬物と比較して著しく低減されていることが示された。
＜実施例29：HSA-EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOXと抗PD-1抗体との併用療法による効果＞
試験目的：EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOXと抗PD-1抗体との併用療法の効果を比較検討する。
試験薬：HSA-EMC-AANL-DOX及びHSA-QHL-087-DOX、各18μmol/kg；マウスPD-1抗体、5mg/kg。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
試験目的：EMC-AANL-DOX、HSA-QHL-087-DOXと抗PD-1抗体との併用療法の効果を比較検討する。
試験薬：HSA-EMC-AANL-DOX及びHSA-QHL-087-DOX、各18μmol/kg；マウスPD-1抗体、5mg/kg。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
腫瘍モデルの準備：CT26細胞はATCCから購入し、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5％CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。5x106個のCT26癌細胞をマウスに皮下注射した。マウスには、薬剤を週3回、抗PD-1抗体を週2回、合計8回注射した。
結果及び考察：本試験の結果を図12に示す。抗PD-1抗体と組み合わせたHSA-QHL-087-DOXは、HSA-EMC-AANL-DOXと比較して治療効果の向上と高い治癒率が確認された。
＜実施例30．MTT法によるN-CBP及びHSA-QHL-095-N-CBPの腫瘍細胞増殖抑制作用の検討＞
分離培養した細胞を数え、培養液で細胞濃度を調整した。96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり100μlの細胞懸濁液を、CD8+T細胞は100,000個/ウェル、CT26腫瘍細胞は20,000個/ウェルで植え付けた。96ウェル培養プレートを37℃、CO2（5％）インキュベーターで一晩24時間インキュベートした。24時間後、96ウェルプレートに異なる濃度の薬剤を含む細胞培養液100ulを加え、対照ウェル（0.1%DMSO）は薬剤を含まず対応する薬剤溶媒のみ、ゼロイングウェル（Blank）は培地のみで細胞を含まず設定した。各グループに3つの平行なウェルを設定し、その後、プレートをCO2（5%）インキュベーター内で37℃、48時間インキュベートした。48時間後、20μlのMTT（濃度5mg/ml）を各ウェルに加え、4時間インキュベーションを続けた。その後、培養液を静かに吸引し、溶媒として150μlDMSOを各ウェルに加え、溶解させた。溶解後、酵素マーカーを用いて490nmの吸光度を測定した。
分離培養した細胞を数え、培養液で細胞濃度を調整した。96ウェル培養プレートに、1ウェルあたり100μlの細胞懸濁液を、CD8+T細胞は100,000個/ウェル、CT26腫瘍細胞は20,000個/ウェルで植え付けた。96ウェル培養プレートを37℃、CO2（5％）インキュベーターで一晩24時間インキュベートした。24時間後、96ウェルプレートに異なる濃度の薬剤を含む細胞培養液100ulを加え、対照ウェル（0.1%DMSO）は薬剤を含まず対応する薬剤溶媒のみ、ゼロイングウェル（Blank）は培地のみで細胞を含まず設定した。各グループに3つの平行なウェルを設定し、その後、プレートをCO2（5%）インキュベーター内で37℃、48時間インキュベートした。48時間後、20μlのMTT（濃度5mg/ml）を各ウェルに加え、4時間インキュベーションを続けた。その後、培養液を静かに吸引し、溶媒として150μlDMSOを各ウェルに加え、溶解させた。溶解後、酵素マーカーを用いて490nmの吸光度を測定した。
結果及び考察：試行の結果を図13及び図14に示す。N-CBPのinvitro細胞毒性はカルボプラチン及びオキサリプラチンより強く、シスプラチンより弱かった（図13）。HSA-QHL-095-N-CBPはN-CBP及びカルボプラチンに比べてinvitro細胞毒性が減少していた（図14）。
＜実施例31：HSA-QHL-095-N-CBPの単独及び抗PD-1抗体との併用による効果＞
試験目的：カルボプラチン、HSA-QHL-095-N-CBP、及び抗PD-1抗体との併用療法の効果を比較検討すること。
治験薬：カルボプラチン、HSA-QHL-095-N-CBP（18μmol/kg）、マウス由来PD-1抗体（5mg/kg）を投与。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
試験目的：カルボプラチン、HSA-QHL-095-N-CBP、及び抗PD-1抗体との併用療法の効果を比較検討すること。
治験薬：カルボプラチン、HSA-QHL-095-N-CBP（18μmol/kg）、マウス由来PD-1抗体（5mg/kg）を投与。
試験動物：6～8週齢のBALB/cマウス（すべて雌）。
腫瘍モデルの準備：CT26細胞はATCCから購入し、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地にて37℃、5％CO2で培養した。継代は3日おきに行い、15世代までの細胞を使用した。5x106個のCT26癌細胞をマウスに皮下注射した。
治療経過：対応する薬剤を週1回、3週間注射し、抗PD-1抗体を週1回、4週間投与する。
結果及び考察：本試験の結果を図15に示す。HSA-QHL-095-N-CBPの等モル量はカルボプラチンに対して有意に優れており、抗PD-1抗体との併用により、治癒効果は単剤に比べて向上していることがわかる。
＜実施例32：非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）モデルマウスにおける炎症反応の影響＞
実験方法：C57マウスを通常群（標準飼料）、モデル群（高脂肪飼料）、シンバスタチン群（陽性対照、3mg/kg）、薬剤群投与群（50mg/kg）にランダムに分け、各群に6匹のマウスを配置した。正常群のマウスには標準飼料を、残りの群のマウスには高脂肪飼料を与え、NAFLDモデルを誘発した。それとともに、各群のマウスに適量の48umol/kgを週2回、合計8週間静脈内投与した。血清生化学的パラメータ：HDL-CとLDL-Cは最終投与から12時間後に自動生化学分析装置で測定された。その結果を表13に示す。
実験方法：C57マウスを通常群（標準飼料）、モデル群（高脂肪飼料）、シンバスタチン群（陽性対照、3mg/kg）、薬剤群投与群（50mg/kg）にランダムに分け、各群に6匹のマウスを配置した。正常群のマウスには標準飼料を、残りの群のマウスには高脂肪飼料を与え、NAFLDモデルを誘発した。それとともに、各群のマウスに適量の48umol/kgを週2回、合計8週間静脈内投与した。血清生化学的パラメータ：HDL-CとLDL-Cは最終投与から12時間後に自動生化学分析装置で測定された。その結果を表13に示す。
結果：正常群と比較して、モデル群の血清HDL-C値は66.2%有意に減少し、LDL-C値は135.6%有意に増加した（P<0.05)。QHL-158-T3及びQHL-159-T3治療群のHDL-C及びLDL-C値はよりよく正常値に復元された。
Claims (7)
- 以下から選択されることを特徴とする、複合体又はその薬学的に許容される塩。
- 請求項１に記載の複合体とアルブミンとの共有結合により形成される複合体又はその薬学的に許容される塩。
- 請求項１に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項２に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 癌、脂肪肝（アルコール性及び非アルコール性脂肪肝を含む）、脂肪肝炎、脂肪性肝疾患、肝線維症、肝臓の炎症、肝細胞障害の脂肪変性現象の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項１に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項２に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩の使用。
- 化合物薬剤の水溶性の増強、薬剤毒性の低減、薬剤効果の向上、及び／又は免疫細胞に対する薬剤の選択性の参照、あるいは水溶性の向上、薬剤毒性の低減、薬剤効果の向上、及び／又は免疫細胞に対する薬剤選択性の向上を有する薬剤の調製、又は肝臓に薬剤を送達するための薬剤分子の調製における請求項１に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩の使用。
- 免疫抑制細胞抑制剤、腫瘍関連マクロファージ抑制剤、MDSC細胞抑制剤、血管新生抑制剤、抗腫瘍免疫促進剤及び／又はTリンパ球増殖促進剤の調製における請求項１に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項２に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩の使用。
- 腫瘍の複合治療薬の調製における、請求項１に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩、又は請求項２に記載の複合体若しくはその薬学的に許容される塩と、抗PD-1抗体と、の使用。
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