JP7622088B2 - 組換えヒアルロニダーゼの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒアルロニダーゼ、特に、天然型ＰＨ２０又は成熟した天然型ＰＨ２０、又は天然型ＰＨ２０又は成熟した天然型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、一つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、選択的にＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸残基の一部が欠失したヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体の生産方法に関する。

ヒアルロニダーゼは、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）に位置したヒアルロン酸を分解する酵素である。このようなヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加水分解することによって細胞外基質のヒアルロン酸の粘性（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を減少させ、組織（皮膚）への透過性（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を増加させる（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ヒアルロニダーゼは、皮下注射［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２］又は筋肉内注射［Ｋｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６］によって提供される体液の吸収を向上させ、局所麻酔剤の拡散を改善するために使用されている［Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ.，２００３］。このような方式で皮下投与が促進された薬物には、モルヒネ［Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ.，２００９］、セフトリアキソン［Ｈａｒｂ ｅｔ ａｌ．，２０１０］、インスリン［Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２］及び免疫グロブリン［Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４］がある。また、ヒアルロニダーゼは、静脈注射又は血腫拡散によって組織に流出した体液又は薬物の分散を向上させるのに使用されている。ヒアルロニダーゼのうち中性ｐＨで活性を有しているヒトＰＨ２０の組換えタンパク質は、Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ社によって開発され、Ｈｙｌｅｎｅｘという商標名で販売されている（Ｂｏｏｋｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

ヒトＰＨ２０の組換えタンパク質は、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ＤＳ－２昆虫細胞、動物細胞などで発現されたことが報告された。昆虫細胞及び酵母で生産された組換えＰＨ２０タンパク質は、タンパク質の翻訳後、変形過程でＮ－糖化の様相がヒトＰＨ２０と異なるので、活性にも影響を及ぼし、体内で副作用が発生するという憂いが存在する。

バイオ医薬品の開発の場合、製品の一貫性及び長い保存可能期間は、製造及び柔軟性を提供する重要な要素である。製造する間に、酵素又は自発的分解及び変形によってサイズ及び電荷などの差によって多様な形態の微小不均一性（Ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が発生する。脱アミド化及びシアリル化などの化学的及び酵素的変形は、それぞれ抗体で正味の負電荷を増加させ、ｐＩ値を減少させることによって酸性変異体を形成する［Ｈａｒｒｉｓ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，２００４］。また、Ｃ－末端リシン切断は、正味の正電荷の損失をもたらし、酸性変異体の形成をもたらす。塩基性変異体の形成は、Ｃ－末端リシン又はグリシンアミド化（ｇｌｙｃｉｎｅ ａｍｉｄａｔｉｏｎ）、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）の形成、アミノ酸の酸化又はシアル酸の除去によって発生可能であり、これは、追加的な正電荷又は負電荷を除去し；二つの類型の変形はｐＩ値を増加させる［Ｈａｒｒｉｓ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，２００４］。

糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、細胞（真核生物）のタンパク質翻訳後の過程であって、小胞体及びゴルジ体で起こる反応である。糖化は、Ｎ－糖化とＯ－糖化とに分けられるが、これは、付着する官能基によって異なる。細胞で生成されたタンパク質にラクトースやフコースなどの糖が付着する過程を「糖化」と総称する。糖化過程で糖鎖がタンパク質に連結されると、タンパク質が「フォールディング」過程を経て立体的な構造物を形成する。これは、タンパク質が放出されずに長い間維持され得る安定性を付与する。このような糖鎖は、細胞間の意思疎通及び情報交換の役割もするので重要な過程である。

タンパク質に糖鎖が付加される反応には、Ｎ－結合或いはＯ結合糖質化（Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｏｒ Ｏ－ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の二つの形態がある。これらの二つの糖質化過程は、糖鎖合成及び付加メカニズムで差を示しており、このうちＮ－糖質化のメカニズムと役割がよりよく知られている。Ｎ－糖質化を通じて付加される糖鎖は、Ｎ－糖鎖（Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ）と呼び、小胞体で形成される。小胞体膜に存在するドリコールピロリン酸（Ｄｏｌｉｃｈｏｌ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＰ－Ｄｏｌ）にＡＬＧ（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）と命名された一連のＡＬＧ酵素が、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ、Ｍａｎ）、ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｇｌｃ）などを付加し、最終的に脂質と連結されたオリゴ糖（Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｎｋｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＬＯ）形態の複合糖鎖であるＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２－ＰＰ－Ｄｏｌを合成するようになる。このように合成されたＬＬＯは、８個以上のサブユニットで構成されたオリゴ糖転移酵素（Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって共翻訳トランスロケーション（Ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）メカニズムを通じてリボソームから小胞体に直接翻訳されるＮ－ｘ－Ｓ／Ｔを含むペプチドのＮ－糖質化配列に伝達される。このようにタンパク質に付着したＮ－糖鎖は、小胞体内に存在するグルコシダーゼ（α－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｉ、Ｇｌｓ１ｐ；αｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ＩＩ、Ｇｌｓｐ ＩＩ）によって糖鎖の末端のブドウ糖から一つずつ除去される。２番目と３番目のブドウ糖がさらにゆっくり除去されながら、レクチンシャペロン（Ｌｅｃｔｉｎ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）であるカルネキシン／カルレティキュリン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ／Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）の助けによってフォールディングが完成する。全てのブドウ糖が切り出されると、タンパク質のフォールディングが完了したと認知し、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖が付着した形態でゴルジ体に移される。ところが、小胞体からゴルジ体に移される前に、糖タンパク質のフォールディングを再検証する品質管理過程がある。適切なフォールディングが行われていない場合、ブドウ糖の一つの分子をカルネキシン／カルレティキュリンサイクル（Ｃａｌｎｅｘｉｎ／Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ Ｃｙｃｌｅ）に再び入り込ませ、フォールディングを完成できる機会を与える過程を繰り返す。

上述した小胞体で行われるＮ－糖鎖の初期生合成過程は、真核微生物である酵母から高等生物である動物に至るまでほぼ同一の過程で保存されている。しかし、ゴルジ体に移された糖鎖は、それぞれの種に特異的に多様な糖鎖修飾過程を経るようになり、その結果、酵母、昆虫、植物及び動物などで完全に異なる形態の各糖鎖が作られる。しかし、このように多様な糖鎖も、核心部位は共通的に有しているが、３つのマンノースと２つのＧｌｃＮＡｃがアスパラギンの窒素に連結された構造であって、トリマンノシルコア（Ｔｒｉｍａｎｎｏｓｙｌ Ｃｏｒｅ）と呼ばれる。このトリマンノシルコアに主にマンノースが連結された形態を高マンノース型（ｈｉｇｈ－ｍａｎｎｏｓｅ ｔｙｐｅ）と呼び、酵母及びカビなどで多く観察される。伝統酵母であるサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合は、ゴルジ体でマンノースの付加が継続され、約数十個のマンノースが付加された形態が観察されることもある。その一方で、昆虫細胞では、欠乏マンノース型（Ｐａｕｃｉ－ｍａｎｎｏｓｅ ｔｙｐｅ）の糖鎖を有する各糖タンパク質が観察される。これらは、ゴルジ体で各マンノシダーゼ（Ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ＩＡ、ＩＢ ＆ ＩＣ）により、まず、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の形態で整えられ、これにＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ）Ｉが作用し、ＧｌｃＮＡｃが一つ付加された後、マンノシダーゼＩＩが作用し、トリマンノシルコアにＧｌｃＮＡｃが一つ付加されている混合型構造が作られる。その後、付加されていたＧｌｃＮＡｃが再度切り出されながら欠乏マンノース型糖鎖構造が作られる。動物細胞は、アスパラギン残基に結合されている１番目のＧｌｃＮＡｃにα（１，６）－フコース（Ｆｕｃｏｓｅ）が時々付加される。動物では、トリマンノシルコアにＧｌｃＮＡｃが１つ付加されている構造にＧＮＴ ＩＩが作用し、ＧｌｃＮＡｃが一つさらに付加され、２つのアンテナ構造を有する糖鎖が生成される。その後、ＧＮＴ ＩＶとＶが作用し、４つのアンテナ構造が作られることもあり、一部では、ＧＮＴ ＶＩ、ＩＸ又はＶＢなどが作用し、６つのアンテナ構造まで作られる場合もある。ＧｌｃＮＡｃが付加され、アンテナの骨格が作られた後、ゴルジ体内に存在するβ－ガラクトシルトランスフェラーゼ（β－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とα－シアリルトランスフェラーゼ（α－Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などが作用し、ＧｌｃＮＡｃ上にガラクトースとシアル酸が付加された形態の複合型糖鎖構造が作られる。

Ｎ－糖化は、タンパク質のフォールディングや活性などに相当な影響を及ぼし得る。遺伝工学方法を用いて、自然界に存在するタンパク質或いはその変異体を産業的に利用するために生産する場合、宿主細胞の種類、組換え体の操作方法、培養条件によって糖質化の有無、糖鎖の構造や形態が変わり得る可能性が非常に大きい（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。すなわち、タンパク質の生産過程中に、生産条件の差によって糖鎖構造や糖鎖を構成する各糖成分に量的な差などが発生する。Ｎ－糖化に影響を及ぼす培養条件には、培養培地のグルコース又はグルタミンの濃度（Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ.１９９４）、ＤＯ（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ）の濃度（Ｒｅｓｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２００６）、培養液ｐＨ（Ｂｏｒｙｓ ｅｔ ａｌ．１９９３）、培養液のアンモニアの濃度（Ｂｏｒｙｓ ｅｔ ａｌ．１９９４；）、培養温度（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．２００４）などがある。

一般に、酵素は、基質と特異的に結合し、酵素－基質複合体（ｅｎｚｙｍｅ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成することによって反応の活性化エネルギー（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ）を低下させる触媒としての役割をし、酵素の反応を促進させる。酵素は、基質及び基質と競争する各分子を識別できるが、これは、酵素の基質結合位置に相補的な電荷の分布、相補的な構造、親水性／疎水性の分布によって基質との特異的な結合を可能にする。酵素の結合位置を説明するために、酵素と基質が互いに相補的且つ幾何学的な形態を有しており、結合しやすいという鍵と鍵穴モデルが提示されたが、これによると、酵素－基質複合体の遷移状態について説明しにくい。これを克服するために提示された誘導適合モデルにおいては、酵素タンパク質の柔軟な構造を通じて酵素－基質複合体で酵素と基質が継続して相互作用しながら構造が変化するが、この過程では、活性部位を構成するアミノ酸残基やＮ－糖鎖による周辺電荷の分布、親水性／疎水性分布によって反応がさらに促進され得る。

さらに、基質であるヒアルロン酸を加水分解するヒアルロニダーゼ酵素の反応において、電荷相互作用は必須的な要素である。Ａｒｍｉｎｇ等は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０で負電荷が多量に分布されている基質であるヒアルロン酸と結合するためには、正電荷を有しているアルギニン残基が酵素活性に必須的な要素であることを明らかにした（Ａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９７）。よって、Ｎ－糖鎖の電荷分布も、このような酵素活性に影響を及ぼすと類推することができ、負電荷が多い基質であるヒアルロン酸とヒアルロニダーゼとが結合する場合、Ｎ－糖鎖のうち負電荷を帯びるシアル酸キャッピングシュガー（Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｕｇａｒｓ）の含量、すなわち、シアリル化（Ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）の含量が酵素－基質結合体を構成したり、酵素反応の進行に影響を及ぼすか否かを立証することが重要である。シアリル化の含量を制限するためには、ガラクトース残基へのシアル酸の伝達が制限されたり、脱シアリル化（Ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）されたり、ガラクトシル化（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の含量が制限されなければならない。

したがって、組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産性及び活性は、Ｎ－糖鎖の含量変化によって影響を受けるので、これを調節して維持することによって、活性に優れると共に、生産性の高い産業的に有用に使用可能なヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法に対する研究は、効率的な大規模生産のために当業界で要求されている。

本発明の目的は、組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を生産する宿主細胞の培養方法及びこのような方法で製造されたＰＨ２０又はその変異体を提供することにあり、特に、酵素活性及び生産性が向上したヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法を提供することにある。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されなく、言及していない他の課題は、本発明の明細書の記載から通常の技術者に明確に理解され得るだろう。

本発明では、組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を生産する宿主細胞を特定の培養条件下で培養する場合、生産された組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖化特性、さらに、生産されたヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の酵素活性が著しく向上することを確認した。

具体的には、Ｎ－糖鎖の含量において、シアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化（Ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の含量、特に、シアリル化の含量を調節することによって活性を高めることが効果的であり、この含量を調節するためには、培地内のグルコースの濃度及び／又はｐＨを調節したり、培養温度の変更後、一定期間にわたって培養することによって、本発明で目的とするヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の酵素活性及び生産性を著しく増加できることを確認した。

具体的には、本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法は、
（１）組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を発現する宿主細胞を、培養温度３５℃～３８℃で累積生存細胞濃度（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を基準にして２０×１０^６～１２０×１０^６細胞x日／ｍＬになるように培養する段階；及び
（２）培養温度を２８℃～３４℃に下げた後、培養温度を維持しながら、２日～１８日間、
（ａ）培地内の残留グルコースの濃度を培養期間の間に０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌに維持する培養；及び
（ｂ）培養液のｐＨを６．８～７．２に維持する培養；
方法からなる群から選ばれた一つ以上の方法で培養する段階；
を含むことを特徴とする。

前記本発明に係る生産方法で生産されたＰＨ２０又はその変異体は、Ｎ－糖鎖の含量のうちシアリル化の含量が１％～３８％であって、酵素活性が著しく増加したことを特徴とするが、これに限定されるものではなく、前記数値は、１０％の誤差範囲を有している実験値である。これは、培養条件を設定する場合、培養に使用する機器及び試験者の業務熟達程度などの条件によって偏差が発生するので、本発明で設定した数値は、制限された意味よりは、偏差を考慮してさらに広範囲な意味で解釈しなければならないためである。

前記宿主細胞の培養は、回分培養法（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、繰り返し回分培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養法（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、繰り返し流加培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）及び灌流培養法（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群から選ばれた一つ以上の方法によって培養することができる。

図１は、天然型ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０とその変異体に対する酵素活性、等電点、Ｎ－糖鎖含量の分析結果であって、 図１のＡは、天然型ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０とその変異体に対する酵素活性、 図１のＢは、各試料の等電点電気泳動の結果、 図１のＣは、Ｎ－糖鎖の含量を示す。 図２は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体の精製分画での酵素活性と等電点分析を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理、シアリダーゼ（Ｓｉａｌｉｄａｓｅ）Ａ処理、シアリダーゼＡ ＋ガラクトシダーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）処理で比較した結果であって、 図２のＡは、各試料の等電点電気泳動の結果、 図２のＢは、酵素活性の結果、 図２のＣは、Ｎ－糖鎖の含量を示す。 図３は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン又はガラクトースの添加培養条件での細胞成長、細胞生存率、ｐＨ、ラクテートの濃度の変化を分析した結果であって、 図３のＡは、細胞成長、 図３のＢは、細胞生存率、 図３のＣは、ｐＨの変化、 図３のＤは、ラクテートの濃度の変化を示す。 図４は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン又はガラクトースの添加培養条件での培養回収液に対する活性を分析したグラフである。 図５は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン又はガラクトースの添加培養において、培養回収液に対する等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）を行って分析した結果である。 図６は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン又はガラクトースの添加培養において、培養回収液にＮ－糖鎖構造分析を行って分析した結果である。 図７は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対する培養日による細胞成長、細胞生存率、及びアンモニア濃度の変化を分析した結果であって、 図７のＡは、細胞成長、 図７のＢは、細胞生存率、 図７のＣは、累積細胞の濃度、 図７のＤは、アンモニア濃度の変化を示す。 図８は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対する培養日別の回収液に対する活性を分析したグラフである。 図９は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対する培養日別の回収液に対する等電点電気泳動を行って分析した結果である。 図１０は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対する培養日別の回収液に対するＮ－糖鎖構造及び活性を分析した結果である。 図１１は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するグルコース濃度条件での細胞成長、細胞生存率、ｐＨ変化、浸透圧変化、グルコース濃度、及びラクテート濃度を分析した結果であって、 図１１のＡは、細胞成長、 図１１のＢは、細胞生存率、 図１１のＣは、ｐＨ変化、 図１１のＤは、浸透圧変化、 図１１のＥは、グルコース濃度の変化、 図１１のＦは、ラクテート濃度の変化を示す。 図１２は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するグルコース濃度条件での活性を分析したグラフである。 図１３は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するグルコース濃度条件での等電点電気泳動を行って分析した結果である。 図１４は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するグルコース濃度条件でのＮ－糖鎖構造を分析した結果である。 図１５は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するｐＨ条件での細胞成長、細胞生存率、ｐＨ変化、及び累積細胞濃度の変化を分析した結果であって、 図１５のＡは、細胞成長、 図１５のＢは、細胞生存率、 図１５のＣは、ｐＨ変化、 図１５のＤは、累積細胞濃度の変化を示す。 図１６は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するｐＨ条件での活性を分析したグラフである。 図１７は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を生産する細胞に対するｐＨ条件での等電点電気泳動を行って分析した結果である。 図１８は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体の精製過程で得た第１次陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーによる精製クロマトグラムである。 図１９は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体の精製過程で得た第２次陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーによる精製クロマトグラムである。 図２０は、ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体の精製過程で得た陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーによる精製クロマトグラムである。

本明細書で使用した全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。

本発明は、遺伝子組換え方法でヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を産業的に有用に使用するために生産するにおいて、Ｎ－糖鎖含量のうちシアリル化、ガラクトシル化及び／又はマンノシル化の含量、特に、シアリル化の含量がヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の酵素活性及び生産性に非常に重要であるという事実を確認し、完成に至ったものである。

具体的には、ＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖鎖の含量のうちシアリル化の含量が１％～３８％、好ましくは１％～３０％、さらに好ましくは１．５％～２８％、最も好ましくは２％～２５％である場合、ヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の酵素活性及び生産性が予測できない程度に高く向上することを確認した。

より具体的には、ＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖鎖の含量のうちガラクトシル化の含量が１％～６８％、シアリル化の含量が１％～３８％、マンノシル化の含量が４０％～６３％で、好ましくは、ガラクトシル化の含量が５％～６０％、シアリル化の含量が１％～３０％、マンノシル化の含量が４２％～６２％で、さらに好ましくは、ガラクトシル化の含量が１０％～５６％、シアリル化の含量が１．５％～２８％、マンノシル化の含量が４４％～６１％で、最も好ましくは、ガラクトシル化の含量が１５％～５０％、シアリル化の含量が２％～２５％、マンノシル化の含量が４７％～６０％である場合、ヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の酵素活性及び生産性が予測できない程度に高く向上し得る。

前記数値は、実施例の表１の実験結果から導出された数値であって、９５％信頼区間の数値を適用したものであり、この数値も１０％の誤差を含むことができる。これは、タンパク質の糖含量を測定する場合、実験に使用する機器、酵素反応時間、試験温度、試験者の業務熟達程度などの条件によって偏差が発生するので、本発明で測定した糖含量は、制限された意味よりは、実験室の間の偏差を考慮してさらに広範囲な意味で解釈しなければならないためである。

本発明において、Ｎ－糖鎖の含量のうちガラクトシル化の％含量は、Ｎ－糖鎖のうちＧ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ'、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなどの末端にガラクトースを含むものの％含量を合算したものであって、シアリル化の％含量は、Ｎ－糖鎖のうちＡ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなどの末端にシアル酸を含むものの％含量を合算したものであって、マンノシル化の％含量は、Ｎ－糖鎖のうちＭ４Ｇ０Ｆ、Ｍ５、Ｍ５Ｇ０、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９などの末端にマンノースを含むものの％含量を合算したものである。

具体的には、本発明に係るＮ－糖鎖の含量のうちシアリル化の含量が１％～３８％であるヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法は、
（１）組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を発現する宿主細胞を培養温度３５℃～３８℃で累積生存細胞濃度を基準にして２０×１０^６～１２０×１０^６細胞x日／ｍＬになるように培養する段階；及び
（２）培養温度を２８℃～３４℃に下げた後、培養温度を維持しながら、２日～１８日間、
（ａ）培地内の残留グルコースの濃度を培養期間の間に０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌに維持する培養；及び
（ｂ）培養液のｐＨを６．８～７．２に維持する培養；
方法からなる群から選ばれた一つ以上の方法で培養する段階；
を含むことを特徴とする。

前記数値は、１０％の誤差範囲を有している実験値である。これは、培養条件を設定する場合、培養に使用する機器及び試験者の業務熟達程度などの条件によって偏差が発生するので、本発明で設定した数値は、制限された意味よりは、偏差を考慮してさらに広範囲な意味で解釈しなければならないためである。

前記（１）段階から（２）段階への培養温度の低下は、累積生存細胞濃度を基準にして２０×１０^６～１２０×１０^６細胞x日／ｍＬ、好ましくは４０×１０^６～１００×１０^６細胞x日／ｍＬ、さらに好ましくは６０×１０^６～８０×１０^６細胞x日／ｍＬである場合になされ得るが、これに限定されない。

また、前記（２）段階での培養期間は、２日～１８日、好ましくは３日～１６日、さらに好ましくは４日～１４日であり得るが、これに限定されない。

例示的には、本発明に係るＰＨ２０又はその変異体の生産で流加培養法を使用する場合、本培養直前の種培養において、灌流培養法又は流加培養法で一定濃度の細胞に到逹するまで３５℃～３８℃で培養した後、本培養で接種し、３５℃未満に減少させた後、２日～１８日、好ましくは３日～１６日、さらに好ましくは４日～１４日間培養することによってＰＨ２０又はその変異体の生産性を極大化できるだけでなく、生産されたＰＨ２０又はその変異体の酵素活性も著しく増加させることができる。

前記本培養の細胞接種濃度は、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、好ましくは５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり得るが、これに限定されない。

本発明に係るＰＨ２０又はその変異体の生産で流加培養法と灌流培養法を混用する場合、培養によってＰＨ２０又はその変異体の生産性を極大化できるだけでなく、生産されたＰＨ２０又はその変異体の酵素活性も著しく増加させることができる。

本発明において、前記培地内の残留グルコースの濃度は、０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～４．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌに維持しながら培養できるが、これに限定されない。

本発明において、前記「培地内の残留グルコースの濃度を０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～４．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌに維持しながら培養」することは、培養期間の間、培地内の残留グルコースの濃度を毎１時間～３６時間、好ましくは毎３時間～３０時間、さらに好ましくは毎６時間～２４時間の間隔又はリアルタイムで測定し、培地内の残留グルコースの濃度が０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～４．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌ内で設定された基準濃度以下である場合、該当の基準濃度になるように培地にグルコース溶液（ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加して培養することを意味する。

本発明において、前記培地内の残留グルコースの濃度の基準濃度は、０．００１ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～４．０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌの範囲内で設定可能であり、培養期間の間、その基準濃度が適宜変化可能であることは通常の技術者にとって自明である。例えば、初期１日～２日目には培地内の残留グルコースの濃度の基準濃度を２ｇ／Ｌにして培養し、３日～５日目には基準濃度を１．５ｇ／Ｌに低下させて培養した後、再び基準濃度を２ｇ／Ｌにして培養することもでき、１．５ｇ／Ｌより低い濃度、すなわち、１．０ｇ／Ｌに基準濃度を設定して培養することもできる。

本発明に係る方法によって生産され、Ｎ－糖鎖の含量での特定のシアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化の含量を有するヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体は、ヒアルロニダーゼ酵素の培養液での活性が１０，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ、好ましくは１１，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１２，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ以上であることを特徴とするが、これに制限されなく、
また、本発明に係る方法によって生産され、Ｎ－糖鎖の含量での特定のシアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化の含量を有するヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体は、通常の方法によって生産された天然型ヒトＰＨ２０の活性より１０％以上、好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１５％以上酵素活性が増加したことを特徴とすることができるが、これに制限されない。

好ましくは、本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法において、前記（１）段階及び／又は（２）段階での宿主細胞の培養は、
（ｉ）培地内にアンモニアを添加したり、培地内のアンモニアの濃度を５ｍＭ以上に増加させる条件；
（ｉｉ）グルタミン、グルコサミン、ウリジン及び酪酸ナトリウムからなる群から選ばれた一つ以上の物質を培地に添加する条件；及び
（ｉｉｉ）ガラクトース及びＭａｎＮＡｃを添加しない条件；
からなる群から選ばれた一つ以上の条件下で行われ得るが、これに限定されない。

より具体的には、本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法において、前記（１）段階及び／又は（２）段階での宿主細胞の培養は、前記培地内にアンモニアを添加したり、培地内のアンモニアの濃度を５ｍＭ以上に増加させる培養、グルタミンを添加する培養、ガラクトース及びＭａｎＮＡｃを添加しない培養、ウリジン又はグルコサミンを添加する培養、酪酸ナトリウムを添加する培養を特徴とすることができるが、これに限定されない。

本発明において、ヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体は、細胞外基質に位置したヒアルロン酸を分解する酵素を意味する。

本発明に係る「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は「ＰＨ２０」は、天然型ＰＨ２０とその成熟した形態を全て含む意味で解釈され、「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は「ＰＨ２０」の「変異体」は、「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は「ＰＨ２０」のアミノ酸配列において、一つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失及び挿入を含み、選択的にＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸残基の一部が欠失したＰＨ２０変異体を意味するが、これに限定されない。

本発明に係るヒアルロニダーゼは、動物及びストレプトマイセスなどの微生物由来のものであって、ヒアルロニダーゼ活性を有する全てのものを意味し、このうち、「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は「ＰＨ２０」は、動物及びストレプトマイセスなどの微生物由来のものであって、ヒト、牛又は羊由来のものであることが好ましい。

本発明に係るヒト由来の「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は「ＰＨ２０変異体」としては、国際公開特許第２０２０／０２２７９１号及び米国登録特許第９，４４７，４０１号などに記載したものなどが例示され得るが、これに限定されなく、「ヒアルロニダーゼＰＨ２０」又は、「ＰＨ２０」のアミノ酸配列で一つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失及び挿入を含み、選択的にＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸残基の一部が欠失したものであって、ヒアルロニダーゼの酵素活性を有するものであれば全て含まれると解釈しなければならない。

本発明において、ヒアルロニダーゼタンパク質の発現に使用する宿主細胞としては、動物細胞（ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ）、酵母（ｙｅａｓｔ）、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ）などが使用され得るが、これに限定されない。

動物細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましい。さらに好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞などの一般的に使用されている動物培養細胞を使用し、大量発現を目的とする場合は、特にＣＨＯ細胞を使用することが好ましい。また、所望のタンパク質を製造するためには、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６－４２２０）やＣＨＯ Ｋ－１細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）などの所望の遺伝子を導入するのに適した細胞であることが好ましい。前記ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＧ４４株、ＤＸＢ－１１株、Ｋ－１株又はＣＨＯ－Ｓ株が好ましく、宿主細胞へのベクターの導入は、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔法、リポフェクション法などの方法で実施することが可能である。

酵母としては、サカロマイセス（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クルイベロマイセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）などが例示されてもよく、放線菌としてはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などが例示されてもよいが、これに限定されない。

本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産方法において、前記（１）段階及び／又は（２）段階での宿主細胞の培養は、回分培養法、繰り返し回分培養法、流加培養法、繰り返し流加培養法、連続培養法及び灌流培養法からなる群から選ばれた一つ以上の方法によって行われ得るが、これに限定されない。

回分培養法は、培養中に新しく培地を追加したり、又は培養液を排出することなく、細胞を増殖させる培養方法である。連続培養法は、培養中に連続的に培地を追加し、また、連続的に排出させる培養方法である。また、連続培養法には、灌流培養も含まれる。流加培養法は、回分培養法と連続培養法との中間に該当するので、半回分培養法（ｓｅｍｉ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）とも呼ばれ、培養中に連続的に又は逐次的に培地が追加されるが、連続培養法などの連続的な培養液の排出が実施され、細胞は流出しない培養方法である。本発明において、いずれの培養方法も使用可能であるが、好ましくは、流加培養法又は連続培養法が使用され、特に好ましくは、流加培養法が使用される。

以上で説明したように、本発明に係る生産方法によって生産されたヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体は、酵素の非活性が、一般的な方法によって生産されたものに比べて１０％以上増加することができ、特に、天然型ヒトＰＨ２０の活性より１０％以上向上したことを特徴とする。このような酵素活性の増加は、本発明に係る生産方法によって生産されたヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖化特性の変化及び／又は電荷変形によるものである。

特に、Ｎ－糖化中にシアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化の含量の変化によって酵素活性が増加するが、本発明に係る生産方法により、このようなＮ－糖化特性、特に、シアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化の含量が調節され得る。

本発明において、糖とタンパク質の共有結合としては、タンパク質を構成するアスパラギン残基にＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンが共有結合されたＮ－グリコシド結合（Ｎ－グリコシド結合糖鎖）、セリン又はトレオニン残基にＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンが共有結合されたＯ－グリコシド結合（Ｏ－グリコシド結合糖鎖）などがあるが、本発明の糖タンパク質における糖とタンパク質の共有結合の様式に特別な限定はなく、Ｎ－グリコシド結合糖鎖及びＯ－グリコシド結合糖鎖のうちいずれか一側及び両側を有する糖タンパク質も本発明の糖タンパク質に含まれる。

このような観点で、本発明は、Ｎ－糖鎖の含量のうちシアリル化の含量が１％～３８％、好ましくは１％～３０％、さらに好ましくは１．５％～２８％、最も好ましくは２％～２５％であるヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体に関する。

より具体的には、Ｎ－糖鎖の含量のうちガラクトシル化の含量が１％～６８％、シアリル化の含量が１％～３８％、マンノシル化の含量が４０％～６３％で、好ましくは、ガラクトシル化の含量が５％～６０％、シアリル化の含量が１％～３０％、マンノシル化の含量が４２％～６２％で、さらに好ましくは、ガラクトシル化の含量が１０％～５６％、シアリル化の含量が１．５％～２８％、マンノシル化の含量が４４％～６１％で、最も好ましくは、ガラクトシル化の含量が１５％～５０％、シアリル化の含量が２％～２５％、マンノシル化の含量が４７％～６０％であることを特徴とするヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体に関する。

前記数値は、実施例の表１の実験結果から導出された数値であって、９５％信頼区間の数値を適用したものであり、この数値も１０％の誤差を含むことができる。その理由は、タンパク質の糖含量を測定する場合、実験に使用する機器、酵素反応時間、試験温度、試験者の業務熟達程度などの条件によって偏差が発生するので、本発明で測定した糖含量は、制限された意味よりは、実験室の間の偏差を考慮してさらに広範囲な意味で解釈しなければならないためである。また、前記ＰＨ２０又はその変異体の電荷変形体は、等電点電気泳動を通じて確認され得る。

本発明に係るＮ－糖鎖の含量のうち特定のシアリル化の含量、ガラクトシル化の含量及び／又はマンノシル化の含量を有するヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体は、本発明に係る生産方法によって生産されたものであることが好ましいが、これに限定されなく、通常の技術者の常識に照らして変形可能な他の方法によっても生産され得ることは当然である。

本発明において、細胞を培養し、糖タンパク質を発現させるために用いた培地は、無血清培地であることが好ましいが、これに限定されなく、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として使用することができる。また、商業的に利用可能な無血清培地、例えば、ＨｙｃｅｌｌＣＨＯ培地、ＡｃｔｉＰｒｏ培地（以上、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、米国）、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ^ＴＭ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（以上、Ｇｉｂｃｏ社、米国）、ＩＳ ＣＨＯ－Ｖ^ＴＭ培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）などを基本培地として使用することもできるが、これに限定されない。

本発明において、細胞を培養し、糖タンパク質を発現させるために用いたフィード培地は、無血清培地であって、例えば、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ １、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ２、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ３、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ４、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ５、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ６、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ^ＴＭ ７ａ／７ｂ（以上、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、米国）、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ａ ＡＧＴ^ＴＭ、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ＡＧＴ^ＴＭ、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｃ ＡＧＴ^ＴＭ、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ａ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｃ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ（以上、Ｇｉｂｃｏ社、米国）、ＢａｌａｎＣＤ（商標登録） ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）、ＣＨＯ－Ｕ Ｆｅｅｄ Ｍｉｘ Ｕ１Ｂ７／ＣＨＯ－Ｕ Ｆｅｅｄ Ｍｉｘ Ｕ２Ｂ１３（Ｋｅｒｒｙ社、米国）などをフィード培地として使用することもできるが、これに限定されない。

本発明で使用された「フィード培地」及び「濃縮栄養物培地」という用語は、アミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、脂質及びブドウ糖などの特定の栄養素又は複数の栄養素で構成された培地であって、基本培地の濃縮産物を意味することができ、培養する細胞によってフィード培地の構成成分及び濃度を多様にして使用することができる。また、商業的に利用可能なフィード培地、例えば、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔシリーズサプリメント（Ｓｅｒｉｅｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、米国）、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄサプリメント（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）培地、ＧｌｙｃａｎＴｕｎｅフィード培地（以上、Ｇｉｂｃｏ社、米国）、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯフィード培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）、Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ（商標登録）ＣＨＯ細胞培養（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）フィード培地（Ｍｅｒｃｋ社、米国）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録）Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフィード培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）などをフィード培地として使用することもできるが、これに限定されない。

本発明で使用された植物由来の加水分解物は、動物由来の成分は含有しないと共に、エンドウ、綿の種子、小麦グルテン、大豆などから抽出された産物を言い、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、炭水化物、ヌクレオシド、ミネラル、その他の成分が豊富に含有されている補充剤であって、これも、培養する細胞によって植物由来の加水分解物の構成成分及び成分濃度を多様にして使用可能である。また、商業的に利用可能な植物由来の加水分解物、例えば、ＨｙＰｅｐ^ＴＭ ７４０４、ＵｌｔｒａＰｅｐ^ＴＭ ｃｏｔｔｏｎ、ＨｙＰｅｐ^ＴＭ ７５０４、ＨｙＰｅｐ^ＴＭ ４６０１Ｎ（以上、Ｋｅｒｒｙ社、米国）、ｃｏｔｔｏｎ １００、ｃｏｔｔｏｎ ２００、Ｐｈｙｔｏｎｅ^ＴＭ、Ｓｏｙ １００（以上、Ｇｉｂｃｏ社、米国）などを補充剤として使用することもできるが、これに限定されない。

本発明で使用される糖タンパク質のＮ－糖鎖の含量を増加又は減少させるために使用した添加物は、一般に、タンパク質の糖化に関与すると知られている成分を言う。特に、シアリル化の含量を制限するためには、ガラクトース残基へのシアル酸の伝達が制限されたり、脱シアリル化されたり、ガラクトシル化の含量が制限されなければならないが、このような添加物としては、細胞を培養するときに、培地に所定濃度のＮ－アセチル－Ｄ－マンノサミン、グルコース、マンノース、グルタミン及びガラクトース、アンモニア、酪酸などの糖化前駆体になる構成成分などがある。

ほとんどの動物細胞の培養では、主に血清が含まれた培地を使用しているが、血清が含まれた培地は、化学的に成分が明確でない複合構成物であるので、タンパク質の生産に適した培地を設計するのに困難を伴う。血清を使用するときは、費用や再現性確保の問題のみならず、分離及び精製にも否定的な影響を与え得るので、無血清培地や低血清培地を主に使用する。無血清培地では、炭素源であるグルコースの濃度が著しく低いので、細胞の成長を維持し、高い濃度の目的タンパク質を生産するためには、培地に追加的に主炭素源であるグルコースを添加して培養し、追加的にグルタミンを添加して培養することもできる。特に、タンパク質医薬品の生産で体内半減期を増加させるためには、シアリル化の含量を増加させなければならならない。このためには、培地内のグルコース及びグルタミンを枯渇させずに一定濃度以上に維持しなければならなく、培養液のｐＨも特定の値に維持しなければならない。培養液で測定されたグルコース及びグルタミンの濃度は、細胞が使用してから残っているそれぞれの残留濃度を意味する。また、シアリル化の含量を増加させるのに関連した各酵素の活性促進剤を使用したり、脱シアリル化を抑制する抑制剤を使用する。また、Ｎ－糖鎖の前駆体を添加したり、関連した酵素の活性促進剤や培養条件を調節することによって、ガラクトシル化の含量を増加させ、シアリル化の含量を増加させることもある。

しかし、ヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産では、上記のような方法ではＮ－糖鎖の含量を調節できないが、本発明に係る生産方法によって生産する場合は、目的とするヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖鎖の含量特性及びこれによる高い酵素活性を有するヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の生産が可能である。

本発明に係る生産方法には、追加的に生産されたヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の分離・精製段階が含まれ得る。

本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の分離・精製は、親和力結合特性を用いることなく、ヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体のイオン結合特性及び／又は疎水性相互作用特性を用いて行われることが好ましいが、これに限定されない。

具体的には、本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の分離・精製は、親和クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いることなく、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー（ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などのイオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）と疎水性作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて行われ得るが、これに限定されない。

また、本発明に係るヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の分離・精製段階では、酵素活性が低い酸性を帯びるヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体が除去されることを特徴とし、好ましくは、前記酸性を帯びるヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体の除去は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われることを特徴とする。

酵素の産業的な利用可能性を確認するためには、酵素の触媒反応速度に対する分析が必要である。酵素反応は、固定された反応性の活性部位を有する酵素反応と、多様な反応性を有する様々な活性部位を有する酵素反応とに分けられ得る。ヒアルロニダーゼのように固定された反応性の単一活性部位を有する酵素の触媒反応の速度は、ミカエリス・メンテン （Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ）の速度公式によるものと知られている。

ミカエリス・メンテンの酵素反応速度論は、次の式のように酵素（Ｅ）－基質（Ｓ）の複合体［ＥＳ］形成段階での可逆反応段階と、ＥＳ複合体の解離による生成物（Ｐ）が生成される非可逆反応段階の２段階反応体系として酵素反応を仮定することを前提とする。この場合、ｋｆ、ｋｒ、ｋｃａｔは、各方向への反応の速度定数である（Ａｌａｎ Ｆｅｒｓｈｔ（１９７７）Ｅｎｚｙｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）。

酵素反応は、酵素と基質との反応によってＥＳ複合体を形成する過程が迅速に平衡状態に到逹すると仮定したり、十分に高い基質の濃度を維持する反応を行うことによって酵素の濃度を十分に低下させ、ｄ［ＥＳ］／ｄｔ≒０と仮定し得る見掛けの定常状態であると言える。速い平衡を仮定したり、見掛けの定常状態を仮定する速度式はいずれも同一に誘導されるので、ほとんどの実験は、初期に酵素の濃度に比べて高い基質の濃度を維持する見掛けの定常状態であると仮定する。

このような仮定下で、「酵素の量は反応前後で一定である。」と「化学反応で化学平衡点に到逹する場合、生成物が作られる反応速度と、この物質が再び分解される速度とは同じである。」という条件を用いると、最終生成物の反応速度は、次のようなミカエリス・メンテン速度公式で表現することができる。このとき、Ｋ_Ｍ＝（ｋ_ｒ＋ｋ_ｃａｔ）／ｋ_ｆで、Ｖ_ｍａｘ＝ｋ_ｃａｔ［Ｅ］_０である。

このようなミカエリス・メンテン速度公式を用いて酵素反応速度の分析を実験的に行うために、ラインウィーバー・バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ）方程式を用いる。この方程式は、実験で与えられた基質の濃度の逆数１／［Ｓ］と、実験的に測定した反応速度の逆数１／Ｖの値との関係を示す方程式である。この方程式が１次方程式であることを統計的に確認すると、酵素反応がミカエリス・メンテンの速度公式による反応であることを確認することができ、この方程式を用いてＫ_ＭとＶ_ｍａｘを求めることができる。

酵素は、化学反応を触媒するにおいて、活性部位で基質と結合した後、遷移状態を有するようになるが、高いエネルギーを有する遷移状態に到逹するための活性化エネルギーは、基質との多くの結合を通じて低くなる。このような遷移状態に到逹するための平衡定数は、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍに比例するようになる。ここで、１／Ｋ_Ｍは、酵素と基質との結合によって酵素－基質複合体を作る程度と、酵素－基質複合体が分解されずに維持される程度とを合わせた指標であって、ｋ_ｃａｔは、酵素－基質複合体から生成物が得られる平衡定数であるので、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍは、基質と酵素からどれほどの生産物が得られるのかに対する指標、すなわち、酵素の触媒効率を示すものであると言える。

ヒアルロニダーゼの産業的な利用可能性は、酵素触媒効率と比例する。特に、単クローン抗体などの高分子薬理活性物質と共に皮下に注射する場合は、ヒアルロニダーゼの酵素触媒効率が重要な役割をする。本発明に係る変異体が天然型ＰＨ２０より高いｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍを有する場合は、高分子薬理活性物質に含まれたヒアルロニダーゼが皮下に投与されるとき、皮下内に存在するヒアルロン酸をさらに速く分解することによって、薬理活性物質が速く分散できるようにする優れた効果を与える。また、本発明に係る変異体が野生型ＰＨ２０より大きいｋ_ｃａｔを有する場合は、同一の酵素の濃度では最大反応速度であるＶ_ｍａｘが増加し、同一の時間にさらに多い量のヒアルロン酸を分解するようになり、より広い範囲に薬理活性物質を分散できるようにする優れた効果を与える。

したがって、本発明に係るＰＨ２０変異体の酵素学的特性を確認するために、各変異体の酵素反応速度を分析し、そのＫ_Ｍ（５０％Ｖ_ｍａｘ条件での基質の濃度）、ｋ_ｃａｔ（基質転換率）、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ（酵素触媒効率）の結果を実施例４で比較した。この結果を見ると、野生型ＰＨ２０に比べて、本発明に係るＰＨ２０変異体が優秀であることを立証することができる。

以下、本発明の実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されることはない。

実施例１．ヒアルロニダーゼの活性、Ｎ－糖鎖、及び等電点の関係

天然型ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０とその変異体ＨＭ４６に対して、活性、等電点、及びＮ－糖鎖の含量を分析した結果を図１に提示した。二つのヒアルロニダーゼの活性単位の差が２倍以上であるが、等電点の範囲とＮ－糖鎖の含量は特に異なっていなかった。

ヒアルロニダーゼＰＨ２０でのＮ－糖鎖含量、等電点、及び活性の関係に対して確認する実験を行った。ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を精製する過程で塩基性分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎ １）と酸性分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２）とを分離できた。また、これらの各分画を試料としてＰＮＧａｓｅ Ｆで処理し、Ｎ－糖鎖を全て除去した試料と、シアリダーゼＡで処理し、末端のシアル酸を除去した試料と、シアリダーゼＡ及びガラクトシダーゼを処理し、末端のシアル酸とガラクトースを除去した試料に対して等電点及び酵素活性を分析した結果を図２に提示した。二つの分画は、等電点の範囲において差を有しており、酸性分画で酵素活性が減少する結果を示した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理時には、二つの分画の活性が全てなくなり、等電点の範囲は類似する範囲になった。このような結果を通じて、Ｎ－糖鎖の含量が酵素活性と密接な関係を有することが分かった。さらに、末端のシアル酸を除去する場合は、酸性分画の等電点の範囲や酵素活性が塩基性分画のものと類似になる現象を通じて末端のシアル酸の含量と酵素活性とが関連していることが分かった。しかし、末端のシアル酸の含量が低い塩基性分画は、シアル酸の含量が高い酸性分画に比べてヒアルロニダーゼの酵素活性が増加した結果を示した。

このような酵素活性とＮ－糖鎖の含量との関係は、培養のためのセルソース（Ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ）を異ならせた天然型や多様な変異体での調査結果（表１）によって関連性をさらに確認できた。

相対活性：（試料の活性）／（天然型ヒトＰＨ２０の活性）を百分率で表示した活性
ガラクトシル化％含量：Ｎ－糖鎖のうちＧ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ'、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなどの末端にガラクトースを含むものの％含量を合算する。
シアリル化％含量：Ｎ－糖鎖のうちＡ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなどの末端にシアル酸を含むものの％含量を合算する。
マンノシル化％含量：Ｎ－糖鎖のうちＭ４Ｇ０Ｆ、Ｍ５、Ｍ５Ｇ０、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９などの末端にマンノースを含むものの％含量を合算する。
天然型ヒトＰＨ２０とＨＭ４６は、国際公開特許第２０２０／０２２７９１号に配列が提示されている。
羊ＰＨ２０、ボノボＰＨ２０は、実施例１０に提示された方法で製造した試料であり、配列は表３に提示されている。

表１のように、多様なヒアルロニダーゼＰＨ２０及び変異体タンパク質を製造し、Ｎ－糖鎖の含量を調査した。このために、組換え遺伝子を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を用いてＥｘｐｉＣＨＯ細胞に培養時ごとに形質導入して生産する臨時発現培養、組換え遺伝子を用いて製造した細胞株クローンを用いた細胞株クローン培養、及び生産性の高い単一クローンを選別して用いた細胞株培養などの多様なセルソースを使用した培養を行った。ここで、細胞株クローン培養とは、組換え遺伝子を形質導入した動物細胞のクローンで選択マーカー（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒ）を使用して選別した、生産性が高い細胞株クローンを用いた培養を言い、これは、多クローン細胞株を用いて行われ、単一クローン細胞株を生産するためのものである。細胞株は、研究用細胞株（ＲＣＢ）、生産用マスター細胞株（ＭＣＢ）、及び生産用細胞株（ＷＣＢ）で構成されている。また、培養方法にも、生産の最適化のために多様な組み合わせの試験培養を試みており、この場合にも、活性とＮ－糖鎖の含量に対して差が発生したことを発見した。

細胞株クローン培養＃１は、ＨｙｃｅｌｌＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、米国）を使用し、２Ｌ規模で培養温度を変更せずに３７℃で回分培養した条件である。細胞株クローン培養＃２ 精製分画＃１と細胞株クローン培養＃２ 精製分画＃２は、８Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ １００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＢａｌａｎＣＤ（商標登録）ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、温度を変更せずに３７℃で培養した培養液を対象にして陰イオン交換クロマトグラフィー精製分画を区分したもので、精製分画＃１は低塩溶出（Ｌｏｗ Ｓａｌｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ）分画で、精製分画＃２は高塩溶出（Ｈｉｇｈ Ｓａｌｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ）分画で、細胞株試験培養＃１は、２Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ １００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＢａｌａｎＣＤ（商標登録）ＣＨＯ Ｆｅｅｄ ４（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、培養温度３７℃で培養した後、一定の累積細胞濃度に到逹するときに３２℃に変更した条件である。細胞株試験培養＃２は、１０Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、培養温度３７℃で培養した後、一定の累積細胞濃度に到逹するときに３２℃に変更し、１２日培養した条件である。細胞株試験培養＃３は、５０Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、培養温度３７℃で培養した後、一定の累積細胞濃度に到逹するときに３２℃に変更した条件であって、細胞株試験培養＃４は、１０Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、培養温度３７℃で培養した後、一定の累積細胞濃度に到逹するときに３２℃に変更し、１３日培養した条件である。細胞株培養＃１、細胞株培養＃２、細胞株培養＃３、及び細胞株培養＃４は、それぞれ研究用細胞株（ＲＣＢ）、生産用マスター細胞株（ＭＣＢ）、及び生産用細胞株（ＷＣＢ）を対象にして、２００Ｌ規模でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、ＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加する流加培養方法を用いて、培養温度３７℃で培養した後、一定の累積細胞濃度に到逹するときに３２℃に変更し、１２日培養した条件である。このような内容に基づいて実施例２～５の培養条件に対する実験を行い、Ｎ－糖鎖の含量を維持する培養方法を確立した。

表１の天然型ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０及び変異体、そして、哺乳動物のヒアルロニダーゼＰＨ２０のＮ－糖鎖の含量は、ガラクトシル化：１５％～５０％、シアリル化：２．５％～２８％、マンノシル化：４７％～６０％の範囲を有しており、各試験結果の９５％信頼区間を適用すると、ガラクトシル化：１％～６８％、シアリル化：１％～３８％、マンノシル化：４０％～６３％の範囲を有したときに、産業的に有用なヒアルロニダーゼの活性を有し得ることが分かった。産業的に有用なヒアルロニダーゼの活性は、天然型ヒトＰＨ２０の活性の５０％以上を意味する。前記数値は１０％の誤差を含むことができる。その理由は、タンパク質の糖含量を測定する場合、実験に使用する機器、酵素反応時間、試験温度、試験者の業務熟達程度などの条件によって実験室ごとに偏差が発生するので、本発明で測定する糖含量は、制限された意味よりは、実験室の間の偏差を考慮してさらに広範囲な意味で解釈しなければならないためである。

そして、特に、活性とシアリル化との関係を見ると、シアリル化は、約３０％以下に制限されたときに、天然型ヒトＰＨ２０の活性以上に産業的な効率が高いヒアルロニダーゼを生産できることが分かる。前記数値は、実験結果から導出された数値であって、１０％の誤差を含むことができる。

このようなＮ－糖鎖の含量を維持する高品質のヒアルロニダーゼは、臨時発現培養を通じて確認し、これに対する安定的な商業生産のために生産性が高い単一クローン菌株を選定することによって細胞株を製造した。このような細胞株を使用し、実施例２、３、４、５の結果を適用した培養方法によって得られた表１の細胞株試験培養＃２、＃３、＃４、細胞株培養＃１、＃２、＃３、＃４の場合は、いずれも１０，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ以上の酵素発現量を示したので、高品質のヒアルロニダーゼを低費用で生産できるという効率を証明した。

実施例２．添加物の調整培養
ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ＰＨ２０変異体は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を添加した後、２０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン（ＮＺＰ社、オランダ）又は５０ｍＭガラクトース（Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ社、米国）を追加的に添加したり又は添加していない培地が入っている３個の１２５ｍＬ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に同一に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種し、３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で回分培養で成長させた後、累積生存細胞濃度（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＩＶＣＤ）が変更範囲に到逹したとき、３２℃に温度を下げて流加培養した。フィード培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）は、フラスコ内の培養開始体積の１．８８％で毎日供給した。細胞サンプルは、培養液から毎日採取し、生存細胞数、細胞生存率、ｐＨ、及びラクテートのレベルを測定し、培養の終了後、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって培養上清液を確保した。前記条件で培養された試料は、ＨＰＬＣ及び濁度分析で活性を確認し、等電点電気泳動及び糖化分析を行うことによってタンパク質パターン及びＮ－糖鎖のレベルを確認した。５０ｍＭガラクトースを添加した培地は、未添加の培地に比べてガラクトシル化が２４％増加した一方で、活性は２％減少し、２０ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミンを添加した培地は、未添加の培地に比べてシアリル化が３５％増加した一方で、活性は２０％減少したことが確認された（図３、図４、図５、図６）。

実施例３．培養日条件培養
ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を過剰発現する細胞を、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）２００Ｌ生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）内でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種した。培養２日目にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）及び濃縮栄養物培地であるＣＤ ＣＨＯＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を供給物培地として使用する流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行い、ｐＨ７．２±０．４及びＤＯ４０％に設定し、４７ｒｐｍの速度で撹拌した。３７℃条件で初期培養を行った後、累積生存細胞濃度が変更範囲に到逹すると、温度を３２℃に変化させて流加培養した。フィード培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）は、生物反応器内の培養開始体積の１．８８％で毎日供給した。細胞生存率が４０％以下になる条件まで培養を行い、培養１９日に終了し、細胞の多様な状態は、培養液から毎日採取し、生存細胞数、細胞生存率、累積生存細胞濃度、及びアンモニウムイオンのレベルを測定し、培養の終了後、デプスフィルター（Ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）を使用して培養液を回収した。前記条件で培養された試料は、ＨＰＬＣ及び濁度分析で活性を確認し、等電点電気泳動及び糖化分析を行うことによってタンパク質パターン及びＮ－糖鎖のレベルを確認した。培養日が増加するほどガラクトシル化及びシアリル化の含量が減少し、活性は増加する傾向を確認した（図７、図８、図９、図１０）。

実施例４．培養液グルコースの濃度調節培養
ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を過剰発現する細胞を、ザルトリウス２Ｌ生物反応器内でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種した。培養２日目にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）及び濃縮栄養物培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を供給物培地として流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行い、ｐＨ７．２±０．４及びＤＯ４０％に設定し、１２０ｒｐｍの速度で撹拌した。３７℃条件で初期培養を行った後、累積生存細胞濃度が変更範囲に到逹すると、温度を３２℃に変化させて流加培養した。フィード培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）は、生物反応器内の培養開始体積の１．８８％で毎日供給した。細胞の多様な状態は、培養液から毎日採取し、生存細胞数、細胞生存率、ｐＨ、浸透圧、グルコース、及びラクテートのレベルを測定した。

グルコースの濃度調節は、培養液内のグルコースの濃度を毎日測定し、培地に含まれたグルコースの濃度が細胞成長によって消耗され、基準濃度である２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ又は６ｇ／Ｌ以下で測定された時点から濃度を調節した。測定されたグルコースの濃度がそれぞれの基準濃度である２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ又は６ｇ／Ｌ以下であるとき、２００ｇ／Ｌグルコースストック溶液を基準濃度に達する量で３時間以内に添加し、基準濃度以上に測定されると添加しない方式でそれぞれの濃度条件を維持した。一般に、動物細胞培養において、３時間以内には、グルコースの含量の変化が細胞成長に及ぼす影響が微々たるものとなる。

この場合、２ｇ／Ｌを基準濃度として維持する条件を１ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）濃度条件と言い、４ｇ／Ｌを基準濃度として維持する条件を３ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）濃度条件と言い、６ｇ／Ｌを基準濃度として維持する条件を５ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）濃度条件と言う。例えば、グルコースの濃度維持条件である１ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）濃度は、グルコースの濃度調節範囲の下限線を０ｇ／Ｌに設定し、グルコースの濃度調節範囲の上限線を２ｇ／Ｌに設定することを意味し、実際の培養では、培養液の測定されたグルコースの濃度が下限線である０ｇ／Ｌに到逹するとき、最大２ｇ／Ｌのグルコースの濃度になるように追加的に２００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液を添加し、培養液内のグルコースの濃度が上限線である２ｇ／Ｌに到逹するとき、２００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液を添加しないことを意味する。よって、１ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）の濃度と３ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）の濃度の２つの濃度条件において、２ｇ／Ｌの濃度条件は、１ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）の濃度では上限線条件を言い、３ｇ／Ｌ（±１ｇ／Ｌ）の濃度では下限線条件を言うので、全く異なる作用が働く条件であって、重複した条件であるとは見なされない。

培養の終了後、４℃及び１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによって培養上清液を確保した。前記条件で培養された試料は、ＨＰＬＣ及び濁度分析で活性を確認し、等電点電気泳動及び糖化分析を行うことによってタンパク質パターン及びＮ－糖鎖のレベルを確認した。培養液内のグルコースの濃度が増加するほど、ガラクトシル化及びシアリル化の含量が増加し、活性は減少する結果を確認した（図１１、図１２、図１３、図１４）。

実施例５．培養ｐＨ調節培養
ヒアルロニダーゼＰＨ２０変異体を過剰発現する細胞を、ザルトリウス２Ｌの生物反応器内でＥＸ－ＣＥＬＬ（商標登録） Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯフェドバッチ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種した。培養２日目にｃｏｔｔｏｎ ２００ＵＦ（Ｇｉｂｃｏ社、米国）及び濃縮栄養物培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）を使用する流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行い、ＤO４０％に設定し、１２０ｒｐｍの速度で撹拌した。３７℃条件で初期培養を行った後、累積生存細胞濃度が変更範囲に到逹すると、温度を３２℃に変化させて流加培養した。フィード培地であるＣＤ ＣＨＯ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ^ＴＭ Ｂ ｐｌｕｓ ＡＧＴ^ＴＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社、米国）は、生物反応器内の培養開始体積の１．８８％で毎日供給した。培養温度の変更後、既存の条件であるｐＨ７．２±０．４より改善された条件を探すために、培養ｐＨをｐＨ６．８±０．１、ｐＨ７．０±０．１、ｐＨ７．２±０．１、ｐＨ７．４±０．１の４つの条件に分けて行った。このような４つの条件は、ｐＨの調節機能が含まれた通常の培養器を使用した培養のｐＨの調節範囲を設定したものであって、例えば、ｐＨ７．０±０．１は、ｐＨの調節範囲の下限線をｐＨ６．９に設定し、ｐＨの調節範囲の上限線をｐＨ７．１に設定することを意味し、実際の培養では、培養液のｐＨが下限線であるｐＨ６．９に到逹するとき、ｐＨを上昇させる塩基が追加され、培養液のｐＨが上限線であるｐＨ７．１に到逹するとき、ｐＨを減少させる二酸化炭素が追加されることを意味する。よって、ｐＨ６．８±０．１とｐＨ７． ０±０．１の２つの条件において、ｐＨ６．９の条件は、ｐＨ６．８±０．１では上限線条件を言い、ｐＨ７．０±０．１では下限線条件を言うので、全く異なる作用が働く条件であって、重複した条件であるとは見なされない。細胞生存率が４０％以下になる条件まで培養を行い、細胞の多様な状態は、培養液から毎日採取し、生存細胞数、細胞生存率、ｐＨ、及び累積生存細胞濃度のレベルを測定し、培養の終了後、４℃及び１０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離することによって培養上清液を確保した。前記条件で培養された試料は、ＨＰＬＣ及び濁度分析で活性を確認し、等電点電気泳動分析を行うことによってタンパク質パターンを確認した。培養液ｐＨによって活性が変化する様相が観察され、既存の条件より改善された条件であるｐＨ７．０±０．１で最も高い活性及び最も低いシアリル化の含量が観察された。（表２、図１５、図１６、図１７）

実施例６．動物細胞培養上清液を用いたヒアルロニダーゼ精製
段階１：培養上清液の緩衝液交換／界面活性剤処理
培養液は、第１次陰イオン交換カラム平衡化条件まで調整されるように、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜フィルターを使用したＵＦ／ＤＦによってｐＨ及び伝導度の調整で再調整された。再調整された溶液にウイルス不活性化のために溶媒／界面活性剤を適切な濃度で処理し、室温の条件下で約６０分間反応した。

段階２：第１次陰イオン交換（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）カラムクロマトグラフィー
ろ過したタンパク質溶液は、陰イオン交換樹脂によってヒアルロニダーゼを捕獲するように第１次陰イオン交換カラムに通過させ、引き続いて、高い塩濃度でそのカラムから溶出させた。ローディング前に、そのカラムは、３０ｍＭの塩濃度でｐＨ８．０のトロメタミン緩衝液を用いて平衡化された。ローディング後、そのカラムを同一の緩衝液（第１洗浄）を用いて洗浄した。第１洗浄段階の次に、そのカラムは、ｐＨ８．０の同一の緩衝液で、しかし、伝導度が第１洗浄段階の塩濃度より高い６０ｍＭの塩濃度で洗浄した。第２洗浄段階後に、所望のタンパク質であるヒアルロニダーゼの溶出を、図１８に示したように２００ｍＭの塩濃度でｐＨ８．０の適切な緩衝剤を用いて行った。

段階３：第２次陰イオン交換（Ｃａｐｔｏ Ｑ）カラムクロマトグラフィー
ろ過したタンパク質溶液は、陰イオン交換樹脂によってヒアルロニダーゼの酸性変異体（ａｃｉｄｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）を除去するために第２次陰イオン交換カラムに通過させ、引き続いて、高い塩濃度でそのカラムから溶出させた。ローディング前に、カラムは、塩のないｐＨ６．０のビストリス緩衝液を用いて平衡化された。ローディング後、そのカラムを同一のｐＨ６．０のビストリス緩衝液（第１洗浄）を用いて洗浄した。第１洗浄段階の次に、そのカラムは、ビストリス緩衝液で、しかし、伝導度が第１洗浄段階の塩濃度より高い２０ｍＭの塩濃度で洗浄した。第２洗浄段階後に、所望のタンパク質であるヒアルロニダーゼの溶出を、図１９に示したように塩濃度でビストリス緩衝液を用いて行った。

段階４：陽イオン交換（Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ）カラムクロマトグラフィー
再調整したタンパク質溶液は、陽イオン交換樹脂によってヒアルロニダーゼの酸性変異体を除去するためにカラムに通過させ、引き続いて、高いｐＨ及び塩濃度でそのカラムから溶出させた。ローディング前に、カラムは、８０ｍＭの塩濃度でｐＨ５．５のクエン酸緩衝液を用いて平衡化された。ローディング後、そのカラムを同一の緩衝液（第１洗浄）を用いて洗浄した。第１洗浄段階の次に、そのカラムをｐＨ７．５の適切なビストリス緩衝液で洗浄した。第２洗浄段階後に、所望のタンパク質であるヒアルロニダーゼの溶出を、図２０に示したように４００ｍＭの塩濃度でｐＨ８．０のビストリス緩衝液を用いて行った。

段階５：ナノ－ろ過／製剤（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）
陽イオン交換カラム段階後に、所望のヒアルロニダーゼを含むタンパク質溶液は１μｍフィルターでろ過し、ナノ－ろ過段階を行った。ナノろ過を通過したタンパク質溶液は、１０ｍｇ／ｍＬの高濃度で濃縮し、１４５ｍＭの塩が含有されたｐＨ７．０のヒスチジン緩衝剤に交換するために８ｋＤａ ＭＷＣＯ膜フィルターを使用したＵＦ／ＤＦによって再調整した。

実施例７．ヒアルロニダーゼの酵素活性分析
ヒアルロニダーゼＰＨ２０及びその他のヒアルロニダーゼの酵素活性は、次のような濁度アッセイ（Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）を用いて測定した。

濁度アッセイは、ヒアルロン酸とアルブミン（ＢＳＡ）との混合時に生成される沈澱を吸光度を用いて測定する方法であって、ＰＨ２０によってヒアルロン酸が加水分解されると、アルブミンとの混合時に吸光度が減少する。一般には次のように行った。ヒアルロニダーゼＰＨ２０（Ｓｉｇｍａ）を１、２、５、７．５、１０、１５、２０、３０、５０、６０ｕｎｉｔｓ／ｍＬになるように希釈した後、各チューブに準備した。精製されたタンパク質サンプルを酵素希釈緩衝液（ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．０、７７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ））に溶解し、１００Ｘ、３００Ｘ、６００Ｘ、１２００Ｘ、２４００Ｘになるように希釈した後、各チューブに準備した。新しいチューブに、３ｍｇ／ｍＬであるヒアルロン酸溶液の濃度が０．３ｍｇ／ｍＬになるように１０倍希釈し、各チューブの体積が１８０μｌになるようにした。希釈したヒアルロン酸溶液に酵素を６０μｌ入れて混合し、これを３７℃で４５分間反応させた。反応が終了すると、９６－ウェルプレートに反応させた酵素５０μｌと酸性アルブミン溶液（ａｃｉｄｉｃ ａｌｂｕｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２５０μｌを各ウェルに入れて１０分間振盪した後、６００ｎｍで分光光度計を用いて吸光度を測定した。この活性単位を知っている標準品の試験結果と試料の試験結果を用いて試料の活性単位を求めた。

実施例８．ヒアルロニダーゼの等電点電気泳動分析
ヒアルロニダーゼの等電点電気泳動は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプレキャストゲル（Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ）（ｐＨ３－７）と等電点電気泳動用緩衝溶液を使用して分析した。プレキャストゲルに、精製したヒアルロニダーゼ試料をローディングした後、Ｎｏｖｅｘ社の電気泳動装置を用いて１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、５００Ｖで３０分間展開した。展開の完了したゲルは精製水で洗浄し、１２％ＴＣＡ溶液でタンパク質を固定した後、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）Ｒ－２５０染色溶液で染色した後、酢酸－メタノール溶液で脱色し、ゲルに表れたタンパク質バンドを分析した。

実施例９．ヒアルロニダーゼのＮ－糖鎖含量分析
ヒアルロニダーゼのＮ－糖鎖の含量は、ヒアルロニダーゼをＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎ－グリコシダーゼ（ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）Ｆで処理して分離したＮ－糖鎖試料を２－ＡＢ（２－アミノベンズアミド）で標識し、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣグリカン（Ｇｌｙｃａｎ）ＢＥＨアミドカラム（Ａｍｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ）（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いてＵＰＬＣ（Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を実施して分析した。精製したヒアルロニダーゼ試料は、脱塩した後、ＰＮＧａｓｅ Ｆで３７℃で１６時間～１８時間にわたって反応することによってＮ－糖鎖を分離した。また、これを乾燥した後、２－ＡＢ標識（Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）を６５℃で３時間反応し、過量の２－ＡＢを除去した。標識されたＮ－糖鎖試料は、７２％－２０％アセトニトリル勾配（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）でＨＰＬＣを行って分離した。分離された試料は、ＦＬＤ（Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）で検出し、Ｎ－糖鎖の含量を分析した。分離された各Ｎ－糖鎖を分類し、Ｎ－糖鎖の末端にガラクトースを含むＮ－糖鎖（Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ'、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなど）の各含量を全て合わせることによってガラクトシル化％含量を求め、Ｎ－糖鎖の末端にシアル酸を含むＮ－糖鎖（Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、Ａ２Ｆなど）の各含量を全て合わせることによってシアリル化％含量を求め、Ｎ－糖鎖の末端にマンノースを含むＮ－糖鎖（Ｍ４Ｇ０Ｆ、Ｍ５、Ｍ５Ｇ０、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９など）の各含量を全て合わせることによってマンノシル化％含量を求めた。

実施例１０．動物由来のヒアルロニダーゼの製造及びＮ－糖鎖の含量分析
（１）ボノボと羊のヒアルロニダーゼＰＨ２０の遺伝子製造
動物由来、すなわち、類人猿であるボノボと偶蹄類である羊のヒアルロニダーゼＰＨ２０の活性及びＮ－糖鎖の含量を調査するために、次のようにそれぞれヒアルロニダーゼＰＨ２０を製造した。それぞれの天然型遺伝子からｃＤＮＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターのＸｈｏ ＩとＮｏｔ Ｉ制限酵素サイトに挿入した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞での発現のために、ＰＨ２０の固有の信号ペプチドの代わりに、ヒト成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、及びヒトＨｙａｌ１の信号ペプチドのうち一つを信号ペプチドとして使用した。ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いたタンパク質の精製のために、ＰＨ２０ ｃＤＮＡの３'－末端にＨｉｓ－タグのＤＮＡ配列を位置させた。各配列の確認にはＤＮＡシーケンシングを用いた。表３は、動物由来のヒアルロニダーゼの配列を提示した。

（２）ボノボと羊のヒアルロニダーゼＰＨ２０の発現
発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを使用して行った。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞の細胞数が６×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになったとき、ヒアルロニダーゼＰＨ２０のｃＤＮＡがｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターに挿入されたプラスミドでＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬を用いてＥｘｐｉＣＨＯ細胞を形質導入させた。細胞培養液としては、ＥｘｐｉＣＨＯ発現媒体（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（１００ｍＬ～５００ｍＬ）を用いた。形質導入後、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を合計６日間１３０ｒｐｍで振盪・培養し、この期間の間に３７℃で１日培養し、温度を３２℃に下げてから５日間さらに培養した。培養の完了時、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって細胞上清液を回収した。

（３）ボノボと羊のヒアルロニダーゼＰＨ２０の精製
ＥｘｐｉＣＨＯ細胞で生産したＣ－末端Ｈｉｓ－タグが付いた動物由来のヒアルロニダーゼＰＨ２０の組換えタンパク質は、ＡＫＴＡプライム装備（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて２段階のカラムクロマトグラフィーで精製したが、このボノボＰＨ２０の場合は、ｐＩが６であるので、陰イオン交換クロマトグラフィーであるＱセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用し、羊ＰＨ２０の場合は、ｐＩが８以上であるので、陽イオン交換クロマトグラフィーであるＣａｐｔｏ Ｓカラムを使用して１段階の精製を実施し、各タンパク質は、Ｈｉｓ－タグ親和クロマトグラフィーであるＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムで２段階の精製を実施した。

Ｑセファロースカラムを用いたタンパク質の精製のためにバッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐＨ７．５）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を製造した。タンパク質をＱセファロースカラムに結合させ、バッファーＡを５ＣＶで流すことによって非特異的に結合したタンパク質を除去した後、０％～１００％の濃度勾配でバッファーＢを５ＣＶで流すことによってタンパク質を溶出した。

Ｃａｐｔｏ Ｓカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）をそれぞれ製造した。培養液のｐＨ及び伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）をバッファーＡと同一に合わせ、０．２２μｍのポアサイズの膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に培養液をろ過した。次に、Ｃａｐｔｏ Ｓカラムにタンパク質を結合させた後、バッファーＡを３ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）で流し、非特異的（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に結合したタンパク質を除去した。バッファーＢを４ＣＶで順次流し、ターゲットタンパク質を溶出した。

ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを用いたタンパク質の精製のために、バッファーＡ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）とバッファーＢ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）をそれぞれ製造した。タンパク質試料をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムに結合させた後、非特異的に結合されたタンパク質を除去するために７％バッファーＢを７ＣＶで流し、ターゲットタンパク質の溶出のために４０％バッファーＢを３ＣＶで流した。カラム溶出液は、透析バッファー（Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いて透析した。

（４）ボノボと羊のＰＨ－２０ヒアルロニダーゼの分析
活性分析は、実施例７と同一の方法で測定し、Ｎ－糖鎖の含量分析は、実施例９と同一の方法で測定した。結果は表１に提示した。

実施例１１．Ｎ－糖鎖の含量による変異体の酵素反応速度（Ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）分析
本発明に係る変異体の酵素反応速度を分析するために、モルガン・エルソン（Ｍｏｒｇａｎ－Ｅｌｓｏｎ）方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２２：２５７－２６３）で酵素活性を測定した。モルガン・エルソン方法は、ヒアルロン酸がヒアルロニダーゼによって加水分解されたとき、生成されたＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の還元末端と エールリッヒ試薬（Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）であるパラ－ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐａｒａ－ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ（ＤＭＡＢ））との反応によって生成される赤色物質を定量（５４５ｎｍ）する比色分析法である。Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、Ｓｉｇｍａ）を希釈緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＰｉ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭサッカリン酸（Ｓａｃｃｈａｒｉｃ Ａｃｉｄ）１，４－ラクトン（ｌａｃｔｏｎｅ）、ｐＨ５．３５）で０．２５ｍＭ、０．５０ｍＭ、０．７５ｍＭ、１．００ｍＭ、１．２５ｍＭになるように希釈し、準備した各試験管に四ホウ酸（Ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ）を処理して還元した後、ＤＭＡＢを添加して発色反応させた。反応後、５４５ｎｍで吸光度を測定し、ＧｌｃＮＡｃの標準反応曲線を作成した。基質であるヒアルロン酸を希釈緩衝溶液で０．５４μＭ、０．６５μＭ、０．８７μＭ、１．２３μＭ、２．１７μＭになるように希釈し、準備した各試験管にヒアルロニダーゼを添加した後で３７℃で５分間反応させ、１００℃で５分間加熱することによって酵素反応を終了させ、四ホウ酸を処理して還元した後、ＤＭＡＢを添加して発色反応させた。反応後、５４５ｎｍで吸光度を測定し、上記のＧｌｃＮＡｃの標準反応曲線を用いて酵素活性を測定した。この方法を使用して配列番号１の野生型ＰＨ２０及び本発明に係るＰＨ２０変異体の酵素反応速度を分析すると、ラインウィーバー・バーク曲線の直線性が確認され、本発明に係るＰＨ２０変異体は、ミカエリス・メンテン酵素反応の中も公式によることを確認した。

表４は、実施例１の表１の試料のうち細胞株クローン試験培養＃２で製造して得られた分画＃１、＃２の酵素反応速度を分析した。その結果、ガラクトシル化の含量とマンノシル化の含量が類似する範囲にあると共に、シアリル化の含量が低い場合は、酵素の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が大きいので、組換えヒアルロニダーゼの酵素活性が増加することが分かる。

この実験結果は、同一のアミノ酸の構造を有する酵素の場合にも、糖化の変化、さらに、シアリル化の含量の変化によっても酵素の活性が影響を受けることを確認できることを証明する。よって、組換え方法で天然型ＰＨ２０或いは天然型ＰＨ２０の変異体ヒアルロニダーゼを大量生産し、産業的に有用なヒアルロニダーゼを生産しようとする場合、シアル化の含量を調整することによって、産業上の利用可能性がさらに大きい酵素を開発できることを確認した。

本発明に係る組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０タンパク質又はその変異体の生産方法によると、高い生産性と共に、高い酵素活性を有する組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０タンパク質又はその変異体の生産が可能であり、組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０タンパク質又はその変異体の大量製造及び供給が可能である。

以上で記述した本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解できるだろう。そのため、以上で記述した各実施例は、全ての面で例示的なものであって、限定的なものではないことを理解しなければならない。

参考文献
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Claims (12)

1. （１）組換えヒアルロニダーゼＰＨ２０又はその変異体を発現する宿主細胞を培養温度３５℃～３８℃で累積生存細胞濃度を基準にして２０×１０^６～１２０×１０^６細胞x日／ｍＬまでになるように培養する段階；及び
   （２）培養温度を２８℃～３４℃に下げた後、培養温度を維持しながら、２～１８日間、
   （ａ）培地内の残留グルコース濃度を培養期間の間に０．００１ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌに維持する培養；及び
   （ｂ）培養液のｐＨを６．８～７．２に維持する培養；
   方法からなる群から選ばれた一つ以上の方法で培養する段階；
   を含むＰＨ２０又はその変異体の生産方法であって、
   前記生産されたＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖鎖の含量のうちシアリル化の含量が１％～２１．７％であり、シアリル化の含量は、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、及びＡ２Ｆを含む、末端にシアル酸を含むＮ－糖鎖の含量の合計であり、そして、ヒアルロニダーゼ酵素の培養液での活性が１０，０００ｕｎｉｔ／ｍＬ以上であることを特徴とするＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
2. 前記生産されたＰＨ２０又はその変異体のＮ－糖鎖の含量のうちガラクトシル化の含量が１０％～４９．６％で、シアリル化の含量が１％～２１．７％で、マンノシル化の含量が４０％～５８．３％であり、
   ガラクトシル化の含量は、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ'、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ａ１、Ａ１Ｆ、Ａ２、及びＡ２Ｆを含む、末端にガラクトースを含むＮ－糖鎖の含量の合計であり、
   マンノシル化の含量は、Ｍ４Ｇ０Ｆ、Ｍ５、Ｍ５Ｇ０、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、及びＭ９を含む、末端にマンノースを含むＮ－糖鎖の含量の合計であり、そして、
   ガラクトシル化の含量とマンノシル化の含量との合計が、１００％以下であることを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
3. 生産されたＰＨ２０又はその変異体の酵素比活性は、天然型ヒトＰＨ２０の比活性より１０％以上向上したことを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
4. 前記（１）段階及び／又は（２）段階での宿主細胞の培養は、回分培養法（batch culture）、繰り返し回分培養法（repeated batch culture）、流加培養法（fed-batch culture）、繰り返し流加培養法（repeated fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）及び灌流培養法（perfusion culture）からなる群から選ばれた一つ以上の方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
5. 前記（１）段階及び／又は（２）段階での宿主細胞の培養は、
   （ｉ）培地内にアンモニアを添加したり、培地内のアンモニアの濃度を５ｍＭ以上に増加させる条件；
   （ｉｉ）グルタミン、グルコサミン、ウリジン、グルコサミン、及び酪酸ナトリウムからなる群から選ばれた一つ以上の物質を培地に添加する条件；及び
   （ｉｉｉ）ガラクトース及びＭａｎＮＡｃを添加しない条件；
   からなる群から選ばれた一つ以上の条件下で行われることを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
6. ＰＨ２０の変異体は、天然型ＰＨ２０のアミノ酸配列において、一つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、選択的にＮ－末端及び／又はＣ－末端のアミノ酸残基の一部が欠失したことを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
7. 前記宿主細胞は、動物細胞、酵母、放線菌又は昆虫細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
8. さらに生産されたＰＨ２０又はその変異体を分離・精製する段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
9. 前記ＰＨ２０又はその変異体の分離・精製は、親和力結合特性を用いることなく、ＰＨ２０又はその変異体のイオン結合特性及び／又は疎水性相互作用特性を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
10. 前記ＰＨ２０又はその変異体の分離・精製は、アフィニティークロマトグラフィーを用いることなく、イオン交換クロマトグラフィーと疎水性作用クロマトグラフィーを用いて行われることを特徴とする、請求項９に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
11. 酸性を帯びるＰＨ２０又はその変異体が除去されることを特徴とする、請求項８に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。
12. 前記酸性を帯びるＰＨ２０又はその変異体の除去は、イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われることを特徴とする、請求項１１に記載のＰＨ２０又はその変異体の生産方法。