JP7628320B2 - 変性ｈｄｌの定量方法、及びそれに用いる分析用試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、生活習慣病リスク及びその治癒効果の判定に用いることのできる変性ＨＤＬの定量方法、及びそれに用いる分析用試薬に関するものである。
ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、高比重リポ蛋白質）は、いわゆるコレステロールの一種で、比重が高く粒子径が小さいものである。組織から肝臓へコレステロールへの輸送は、ＨＤＬが担っていることが知られている。ＨＤＬは、血中濃度が高いと動脈硬化のリスクを低減させることから、「善玉コレステロール」と通称されることもある。一方、比重が低いＬＤＬ（Ｌｏｗ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、低比重リポ蛋白質）は、「悪玉コレステロール」として知られる。ＨＤＬとＬＤＬの濃度は、健康診断の指標として用いられている。
ＨＤＬの生理的活性としては、ＬＤＬの酸化を抑制するだけでなく、ＮＯの増加などを介して酸化ＬＤＬによる細胞毒性を軽減し、抗動脈硬化効果を発揮する。しかし、冠動脈疾患患者では血中変性ＨＤＬが増えており、それがＬＯＸ－１を介して血管に作用して、動脈硬化を促進すること、ヒトの動脈硬化巣にはＨＤＬのアポタンパク質であるＡｐｏＡＩが変性したものが多量に蓄積していることが明らかになっている。これらの結果から、ＨＤＬを健康診断の指標として用いるには、単にＨＤＬの濃度を測定するだけでなく、本来の生理的活性を有するＨＤＬと、変性などによって活性の変化したＨＤＬを別に定量する必要がある。特に変性ＨＤＬを定量することができれば、上述の冠動脈疾患を含めて、循環系及び血液に関係する疾患やそのリスクの検証に用いることができると考えられている。
特許文献１は、試料中に含まれる機能不全ＨＤＬの測定方法であって、機能不全ＨＤＬの受容体に試料を接触させて、試料中の機能不全ＨＤＬを受容体に結合させ、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出するものであり、受容体は、ＬＯＸ－１又はその改変体であり、受容体は、担体に固定化されており、受容体に結合した機能不全ＨＤＬに、機能不全ＨＤＬを認識する抗体をさらに結合させる機能不全ＨＤＬの測定方法を開示している。この技術は、多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを広く検出できる機能不全ＨＤＬの測定技術を提供するとともに、当該技術を利用した生活習慣病の検出技術を提供しようとするものである。
また、本発明者らは、特許文献２において、ＬＯＸ－１へ結合するＬＯＸ－１結合タンパク配列に、ＡｐｏＡ１の全タンパク配列又は部分フラグメントタンパク配列が、直接又はスペーサを介して連結されている融合タンパク質及びそれを用いた高密度リポタンパク質の測定キットを開示している。この技術は、ＬＯＸ－１と抗ＡｐｏＡ１抗体により同時に認識されるＨＤＬを測定することにより様々な変性を受けたＨＤＬを測定でき、及びＬＯＸ－１に対する抗体（抗ＬＯＸ－１抗体）のＬＯＸ－１結合部位等のようにＬＯＸ－１に対して特異的に結合するタンパク質とＡｐｏＡ１とを融合させた融合タンパク質を用いるものである。この融合タンパク質により、様々な変性を受けたＨＤＬを同時に認識でき、受容体結合活性を測定して生理活性そのものを測定するために用いられるもので、脂質を含まず、長期保存が可能で、再現的に調整でき、測定試験間ごとのばらつきを低減して信頼性を高くすることができるリファレンスとなり得る融合タンパク質を得ようとするものである。
変性ＨＤＬは、理論上、実験室では特許文献１に記載の技術で定量が可能である。本発明者らの特許文献２の技術は、従来の技術よりさらに洗練されたものである。これらを応用して、さほど洗練されたものでなくとも変性ＨＤＬの定量に用いることができる方法を樹立することは容易と予想された。
しかしながら、特許文献１の技術も普及には至っていないのが現状である。さらに、本発明者らの特許文献２の技術を用いても、実験室以外の条件や異なる検体を用いて実施すると、変性ＨＤＬの定量の結果が一定でないことがあった。これらの差は、実験室内の条件の他、技術を実施する者の試験技術の差などの、さまざまな要因が考えられた。
本発明者らは、上述の歴史的な経緯と、臨床の実地応用には多少条件が劣悪でも測定可能とすべきことを考え、変性ＨＤＬの定量技術を、より汎用性がある定量の技術へと改良することを目標として鋭意研究を進めていった。
本発明者らは、上述の歴史的な経緯と、臨床の実地応用には多少条件が劣悪でも測定可能とすべきことを考え、変性ＨＤＬの定量技術を、より汎用性がある定量の技術へと改良することを目標として鋭意研究を進めていった。
本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、その目的は、変性ＨＤＬを従来よりも安定して正確に定量でき、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患等、又はその進行度の判定に有用な変性ＨＤＬの定量方法、及び、その定量方法に用いる分析用試薬を提供することにある。
上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
［１］試料中に含まれる変性ＨＤＬの定量方法であって、前記変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質と前記変性ＨＤＬとの結合体を定量し、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位の配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、変性ＨＤＬの定量方法。
［２］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位の配列を含む、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［３］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［４］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質である、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［５］前記Ｃ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［６］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［７］前記定量は、前記変性ＨＤＬ及び前記変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［８］前記免疫分析による定量は、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質、あるいはこれを結合する蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行う、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［９］前記定量は、前記変性ＨＤＬ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１０］前記定量では、試料として血清又は血漿を用いる、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１１］前記定量では、試料として血清を用い、前記試料に前記変性ＨＤＬ結合蛋白質を添加する工程を備える、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１２］心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、それらのリスク、又は、その進行度を判定するための変性ＨＤＬの定量に用いる分析用試薬であって、前記変性ＨＤＬと結合可能な変性ＨＤＬ結合蛋白質を含み、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、分析用試薬。
［１３］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位の配列を含む、前記の分析用試薬。
［１４］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、前記の分析用試薬。
［１５］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質である、前記の分析用試薬。［１６］前記Ｃ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、前記の分析用試薬。
［１７］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、前記の分析用試薬。
［１８］前記心・血管系疾患は、動脈硬化又はその進行によって生じる心筋梗塞若しくは脳卒中である、前記の分析用試薬。
［１］試料中に含まれる変性ＨＤＬの定量方法であって、前記変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質と前記変性ＨＤＬとの結合体を定量し、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位の配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、変性ＨＤＬの定量方法。
［２］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位の配列を含む、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［３］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［４］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質である、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［５］前記Ｃ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［６］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［７］前記定量は、前記変性ＨＤＬ及び前記変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［８］前記免疫分析による定量は、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質、あるいはこれを結合する蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行う、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［９］前記定量は、前記変性ＨＤＬ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１０］前記定量では、試料として血清又は血漿を用いる、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１１］前記定量では、試料として血清を用い、前記試料に前記変性ＨＤＬ結合蛋白質を添加する工程を備える、前記の変性ＨＤＬの定量方法。
［１２］心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、それらのリスク、又は、その進行度を判定するための変性ＨＤＬの定量に用いる分析用試薬であって、前記変性ＨＤＬと結合可能な変性ＨＤＬ結合蛋白質を含み、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、分析用試薬。
［１３］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位の配列を含む、前記の分析用試薬。
［１４］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、前記の分析用試薬。
［１５］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質である、前記の分析用試薬。［１６］前記Ｃ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、前記の分析用試薬。
［１７］前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、前記の分析用試薬。
［１８］前記心・血管系疾患は、動脈硬化又はその進行によって生じる心筋梗塞若しくは脳卒中である、前記の分析用試薬。
本発明によれば、変性ＨＤＬを従来よりも安定して正確に定量でき、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患等、又はその進行度の判定に有用な変性ＨＤＬの定量方法、及び、その定量方法に用いる分析用試薬が得られる。
以下、本発明に係る変性ＨＤＬの定量方法及び分析用試薬について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
（第１の実施形態）
（変性ＨＤＬの定量方法）
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法は、試料中に含まれる変性ＨＤＬを定量するにあたり、変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させる。この変性ＨＤＬ結合蛋白質と変性ＨＤＬとが結合した複合体を定量する。
（変性ＨＤＬの定量方法）
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法は、試料中に含まれる変性ＨＤＬを定量するにあたり、変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させる。この変性ＨＤＬ結合蛋白質と変性ＨＤＬとが結合した複合体を定量する。
本実施形態における変性ＨＤＬとは、本来生体内で生理的活性を有するＨＤＬとはなんらかの構造の差異を有するＨＤＬを含み、特に、それらの構造の差異により生理的活性が低下しているものを指す。ＨＤＬが変性ＨＤＬとなる機序としては、例えば構成蛋白質の化学的修飾や部分的あるいは完全分解、遺伝的欠損および変異、高次構造の異常や変化、又は、活性を失わせる分子との結合などの要因が含まれる。
こうした変性ＨＤＬの例としては、例えば、ＨＤＬを構成する蛋白質又は脂質のいずれかの部位が酸化された、酸化ＨＤＬが含まれる。このような変性ＨＤＬとしては、例えば、ＨＣｌＯ－ＨＤＬ、ＨＮＥ－ＨＤＬ、Ｃａｒｂａｍｙｌａｔｅｄ ＨＤＬ及びＭＤＡ－ＨＤＬなどが挙げられる。これらの変性ＨＤＬは、血管壁の血管内皮細胞を障害し、動脈硬化や血栓形成を引き起こす心疾患や虚血疾患等の動脈硬化性疾患のような各種疾患の発症リスクを高めるものとして知られている。
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法では、変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させ、変性ＨＤＬ結合蛋白質と変性ＨＤＬとの結合体を定量する。
本実施形態の変性ＨＤＬ結合蛋白質は、変性ＨＤＬと直接相互作用し得る、例えばその蛋白質自体が変性ＨＤＬと結合し得る蛋白質を広く指す。
変性ＨＤＬは、生体にとって不利な反応を引き起こす受容体と相互作用する活性を獲得していることがある。このとき、変性ＨＤＬは変性ＨＤＬ結合蛋白質を介して受容体と結合している、すなわち変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とが直接結合し、この変性ＨＤＬ結合蛋白質が受容体に結合していることがある。
変性ＨＤＬ結合蛋白質としては、例えばＦａｃｔｏｒ Ｖ、その変異体及び一部相同性を有する蛋白質などがある。変性ＨＤＬに別蛋白質を介して結合することのある受容体としては、後述のＬＯＸ－１蛋白質がある。
本実施形態の変性ＨＤＬ結合蛋白質は、変性ＨＤＬと直接相互作用し得る、例えばその蛋白質自体が変性ＨＤＬと結合し得る蛋白質を広く指す。
変性ＨＤＬは、生体にとって不利な反応を引き起こす受容体と相互作用する活性を獲得していることがある。このとき、変性ＨＤＬは変性ＨＤＬ結合蛋白質を介して受容体と結合している、すなわち変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とが直接結合し、この変性ＨＤＬ結合蛋白質が受容体に結合していることがある。
変性ＨＤＬ結合蛋白質としては、例えばＦａｃｔｏｒ Ｖ、その変異体及び一部相同性を有する蛋白質などがある。変性ＨＤＬに別蛋白質を介して結合することのある受容体としては、後述のＬＯＸ－１蛋白質がある。
本実施形態では、変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位の配列を有する蛋白質又はその変異体を含んでいる。
Ｆａｃｔｏｒ Ｖ（第Ｖ因子）は、凝固系を構成する蛋白質として知られ、Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインから構成されているおよそ３３０ｋＤａの蛋白質であり、Ａ１－Ａ２ドメインからなるＨ鎖（重鎖）と、Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからなるＬ鎖（軽鎖）に大きく分けられる。主にＨ鎖は細胞膜と結合し、Ｌ鎖はＣ１－Ｃ２ドメインを介してリン脂質を認識、結合することが知られている。
変異体とは、一部の配列の置換が行われたものを指し、本実施形態では主にＦａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位以外の部位が置換されているものであることが好ましい。
Ｆａｃｔｏｒ Ｖ（第Ｖ因子）は、凝固系を構成する蛋白質として知られ、Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインから構成されているおよそ３３０ｋＤａの蛋白質であり、Ａ１－Ａ２ドメインからなるＨ鎖（重鎖）と、Ａ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからなるＬ鎖（軽鎖）に大きく分けられる。主にＨ鎖は細胞膜と結合し、Ｌ鎖はＣ１－Ｃ２ドメインを介してリン脂質を認識、結合することが知られている。
変異体とは、一部の配列の置換が行われたものを指し、本実施形態では主にＦａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位以外の部位が置換されているものであることが好ましい。
Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位は、変性ＨＤＬと直接結合する部位であるため、変性ＨＤＬ結合蛋白質がこの部位を含む蛋白質又はその変異体であることで、変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質を結合させ、定量に用いることができる。
また、変性ＨＤＬ結合蛋白質として、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの一部であるＬ鎖部位の配列を有する蛋白質を用いることで、変性ＨＤＬと結合する部位を有しつつ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖとは異なる構造を有する蛋白質を用いることができる。すなわち、Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも入手が容易な蛋白質や、試験の行いやすい蛋白質を用いることができる。Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも入手が容易な蛋白質としては、例えばＬ鎖部位及び最小限の配列のみ用いることで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも全長が短く、組み換え蛋白質としての製造が行いやすい蛋白質を用いることができる。試験が行いやすい蛋白質としては、Ｌ鎖以外の配列を変更することで、より保存やプレートへの固相化が行いやすい蛋白質を用いることができる。
また、変性ＨＤＬ結合蛋白質として、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの一部であるＬ鎖部位の配列を有する蛋白質を用いることで、変性ＨＤＬと結合する部位を有しつつ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖとは異なる構造を有する蛋白質を用いることができる。すなわち、Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも入手が容易な蛋白質や、試験の行いやすい蛋白質を用いることができる。Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも入手が容易な蛋白質としては、例えばＬ鎖部位及び最小限の配列のみ用いることで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖよりも全長が短く、組み換え蛋白質としての製造が行いやすい蛋白質を用いることができる。試験が行いやすい蛋白質としては、Ｌ鎖以外の配列を変更することで、より保存やプレートへの固相化が行いやすい蛋白質を用いることができる。
変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位の配列を含むことも好ましい。Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列のうち、Ｌ鎖が備えるリン脂質認識部位は、変性ＨＤＬを認識し、有効に結合することができる。
変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含むことが好ましい。ここでＦａｃｔｏｒ Ｖの配列とはＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質の全長であり、Ｆａｃｔｏｒ Ｖそのものを用いてもよく、他の蛋白質との融合体又は結合、修飾蛋白質等を用いてもよい。
変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備える蛋白質であることも好ましい。このようなＣ１－Ｃ２ドメインと一部相同性を有する部位を備えた蛋白質としては、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩが挙げられる。また、これらの蛋白質や変異体、これらの蛋白質の配列を一部に含む蛋白質であってもよい。
変性ＨＤＬ結合蛋白質は、例えば、組み換え蛋白質を用いることも好ましい。ここで組み換え蛋白質とは、遺伝子組み換えによって発現させて得られた蛋白質である。組み換え蛋白質は、必要に応じて他の構造との融合や変異を導入されていてもよい。
本実施形態では、試料中に含まれる変性ＨＤＬの定量を行う。ここで試料としては、生物から取り出した成分を含む試料を広く指す。試料は前記成分の液体のものを用いるか、又は前記成分に液体を添加して、液体の試料とすることが好ましい。試料としては、例えば、生物の体液を直接試料として用いることができる。生物の体液としては、例えばヒトの血液又は唾液を用いることができる。血液のサンプルとしては血清又は血漿などを用いることができる。本実施形態では、これらの体液を試料として、上述の定量に供する。
本実施形態では、試料として血清を用いることが好ましい。本実施形態では、変性ＨＤＬと直接結合するＦａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部分の配列を備えた変性ＨＤＬ結合蛋白質を、試料中の変性ＨＤＬと結合させる。そのため、変性ＨＤＬと直接結合する因子を含んでいない場合のある血清を試料として用いても、変性ＨＤＬを安定して正確に定量することができる。加えて血清は血漿等の他の体液試料よりも、血清の方が検体の取得・保存が容易である。実際に血液試料としては、血清の形で凍結保持されている検体が国際的に一般的であることから、有益な技術である。
本発明者らは、従来の技術においてＬＯＸ－１等の変性ＨＤＬと相互作用する蛋白質を変性ＨＤＬの定量に用いた場合、血漿を試料に用いると変性ＨＤＬが検出できるが、血清を試料に用いると変性ＨＤＬの検出が少なく、正確に定量することができないという点に着目した。そこで、血液や血漿から血清を形成する過程において分解喪失される物質を測定系に補填することにより、血清を試料に用いた測定が可能となることを予測した。
本発明者らは、前記補填する物質として、Ｆａｃｔｏｒ Ｖに着目した。生体内の反応として、変性ＨＤＬがＬＯＸ－１と結合する際には、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを介して結合する。具体的には、Ｆａｃｔｏｒ Ｖが備えるフォスファチジルセリン（ＰＳ）認識部位が変性ＨＤＬに、ＬＯＸ－１認識部位がＬＯＸ－１と結合する。
本発明者らは、前記補填する物質として、Ｆａｃｔｏｒ Ｖに着目した。生体内の反応として、変性ＨＤＬがＬＯＸ－１と結合する際には、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを介して結合する。具体的には、Ｆａｃｔｏｒ Ｖが備えるフォスファチジルセリン（ＰＳ）認識部位が変性ＨＤＬに、ＬＯＸ－１認識部位がＬＯＸ－１と結合する。
後述するように、血清を試料として用い、試料にＦａｃｔｏｒ Ｖを添加すると、血清中の変性ＨＤＬ検出感度がほぼ添加量に応じて増加する。このため、血清等の試料にＦａｃｔｏｒ Ｖのような変性ＨＤＬ結合蛋白質を添加することで、変性ＨＤＬを定量することができる。
上述の定量には、蛋白質の定量（蛋白質量の測定）のための公知の手段を用いることができる。例えば、上述の定量には免疫学的手法を用いることができる。
免疫学的手法を用いた定量、免疫分析としては、酵素（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光物質（蛍光イムノアッセイ、ＦＩＡ）又は放射性物質（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）などを適宜用いることができる。このうち、ＥＬＩＳＡは比較的安価、簡便かつ多数のサンプルを分析できるため望ましい。
免疫学的手法を用いた定量、免疫分析としては、酵素（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光物質（蛍光イムノアッセイ、ＦＩＡ）又は放射性物質（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）などを適宜用いることができる。このうち、ＥＬＩＳＡは比較的安価、簡便かつ多数のサンプルを分析できるため望ましい。
例えば、本実施形態では前記定量に、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。具体的には、変性ＨＤＬ結合蛋白質を、ＥＬＩＳＡプレートに固相化する。変性ＨＤＬ結合蛋白質の固相化（固定化）には、既知の方法を適宜用いることができる。例えば、公知の担体（支持体）に受容体を結合させることができる。
このＥＬＩＳＡプレートに試料を添加して、試料に含まれる変性ＨＤＬを変性ＨＤＬ結合蛋白質に結合させ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して未結合物を除去し、変性ＨＤＬ又は複合体を検出できる抗体を用いて検出すると、定量する対象と、変性ＨＤＬを変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を定量することができる。
変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体としては、ＨＤＬ配列に結合する抗体を適宜用いることができる。本実施形態では、ＥＬＩＳＡプレート上の変性ＨＤＬ及び変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を検出するので、プレート上で検出されるのは変性ＨＤＬである。 なお、本実施形態において変性ＨＤＬに結合する抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
このＥＬＩＳＡプレートに試料を添加して、試料に含まれる変性ＨＤＬを変性ＨＤＬ結合蛋白質に結合させ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して未結合物を除去し、変性ＨＤＬ又は複合体を検出できる抗体を用いて検出すると、定量する対象と、変性ＨＤＬを変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を定量することができる。
変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体としては、ＨＤＬ配列に結合する抗体を適宜用いることができる。本実施形態では、ＥＬＩＳＡプレート上の変性ＨＤＬ及び変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を検出するので、プレート上で検出されるのは変性ＨＤＬである。 なお、本実施形態において変性ＨＤＬに結合する抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
本実施形態においては、さらに具体的には、変性ＨＤＬ及び変性ＨＤＬ結合蛋白質が結合した複合体を形成し、この複合体を免疫分析により定量することができる。
この免疫分析について、図１に模式図を示して説明する。例えば、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を、プレート４０に固相化させる。本実施形態では、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０は、例としてＬ鎖部位２１とＨ鎖部位２２とを備えた、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質と相同性を有する蛋白質である。プレート４０は、ＥＬＩＳＡプレートである。既知の担体で固相化を行うと、プレート４０上には、前記Ｈ鎖部位２２がプレート４０に固相化された構造が生じる。ついで、プレート４０を洗浄し、未結合の変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を除去する。
このプレート４０に、体液由来の試料を注入する。プレート４０上のＬ鎖部位２１に、試料中の変性ＨＤＬ１０が結合する。このプレート４０上の複合を、変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体３０で定量する。本実施形態では、抗体３０には抗アポリポタンパクＡＩ抗体（抗ＡｐｏＡ１）を用いている。
この免疫分析について、図１に模式図を示して説明する。例えば、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を、プレート４０に固相化させる。本実施形態では、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０は、例としてＬ鎖部位２１とＨ鎖部位２２とを備えた、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質と相同性を有する蛋白質である。プレート４０は、ＥＬＩＳＡプレートである。既知の担体で固相化を行うと、プレート４０上には、前記Ｈ鎖部位２２がプレート４０に固相化された構造が生じる。ついで、プレート４０を洗浄し、未結合の変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を除去する。
このプレート４０に、体液由来の試料を注入する。プレート４０上のＬ鎖部位２１に、試料中の変性ＨＤＬ１０が結合する。このプレート４０上の複合を、変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体３０で定量する。本実施形態では、抗体３０には抗アポリポタンパクＡＩ抗体（抗ＡｐｏＡ１）を用いている。
この実施形態では、従来技術のようなＬＯＸ－１等の変性ＨＤＬ受容体を用いず、変性ＨＤＬに直接結合する変性ＨＤＬ結合蛋白質をプレート上に固相化するので、変性ＨＤＬ受容体が不要である。例えば変性ＨＤＬ結合蛋白質として、上述するようなＦａｃｔｏｒ Ｖよりもさらに全長が短い蛋白質等、入手が容易な蛋白質を用いれば、ＬＯＸ－１等の変性ＨＤＬ受容体を定量に用いるのに比べて、より容易に定量を行うことができる。
（変性ＨＤＬ定量に用いる分析用試薬）
次に、上述の体液中の変性ＨＤＬ定量方法に用いる分析用試薬について説明する。
この分析用試薬は、体液中の変性ＨＤＬの定量に用いることで、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、又は、その進行度を判定するための体液中の変性ＨＤＬの定量に用いることができる。
分析用試薬は、上述した変性ＨＤＬ結合蛋白質を含んでいる。変性ＨＤＬ結合蛋白質を含むことで、生理的活性を有する変性ＨＤＬの定量を行うことができる。
次に、上述の体液中の変性ＨＤＬ定量方法に用いる分析用試薬について説明する。
この分析用試薬は、体液中の変性ＨＤＬの定量に用いることで、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、又は、その進行度を判定するための体液中の変性ＨＤＬの定量に用いることができる。
分析用試薬は、上述した変性ＨＤＬ結合蛋白質を含んでいる。変性ＨＤＬ結合蛋白質を含むことで、生理的活性を有する変性ＨＤＬの定量を行うことができる。
（その他の構成）
本実施形態の分析用試薬は、その他免疫分析の試薬に含まれる成分を含有していてもよい。
本実施形態の分析用試薬は、その他免疫分析の試薬に含まれる成分を含有していてもよい。
また、本実施形態の分析用試薬は、上記構成を複数備えたキットとして提供されてもよい。例えば、このキットは変性ＨＤＬの定量のための変性ＨＤＬ結合蛋白質を含む分析用試薬を備えていてもよい。また、このキットは、上述した定量の操作に用いるための担体、ＥＬＩＳＡプレート、発色基質又は抗体等を含んでいてもよい。
また、上述した蛋白質が固相化されたＥＬＩＳＡプレートを含んでいてもよい。例えば、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、それらのリスク、又は、その進行度を判定するための変性ＨＤＬの定量に用いる分析用プレートであって、変性ＨＤＬと結合可能な変性ＨＤＬ結合蛋白質が固相化されたＥＬＩＳＡプレートを備え、変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、分析用プレートとして提供されていてもよい。
（本実施形態の効果）
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法は、従来技術に比して変性ＨＤＬを安定して正確に定量することができる。本実施形態が安定して正確に定量できるとは、従来の方法が試料によって検出感度自体に差がある場合や、検出感度が低かったのに対して、本実施形態の方法は試料の条件、例えば変性ＨＤＬ以外の含有物等によらず、変性ＨＤＬを一定の高い感度で定量することができる。
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法は、従来技術に比して変性ＨＤＬを安定して正確に定量することができる。本実施形態が安定して正確に定量できるとは、従来の方法が試料によって検出感度自体に差がある場合や、検出感度が低かったのに対して、本実施形態の方法は試料の条件、例えば変性ＨＤＬ以外の含有物等によらず、変性ＨＤＬを一定の高い感度で定量することができる。
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法は、変性ＨＤＬの安定かつ正確な定量を行うことができることで、疾患、それらのリスクや進行度の判定に用いることができる。疾患としては、ＨＤＬが関連すると思われる疾患が広く対象となり、例えば、心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患が挙げられる。心・血管系疾患としては特に、動脈硬化又はその進行によって生じる心筋梗塞若しくは脳卒中が挙げられる。
（本実施形態の用途）
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法及び分析用試薬は、例えば、体液中のＨＤＬの定量において、変性ＨＤＬの測定により、上述した心・血管系疾患への罹患、及び／又は、糖尿病若しくは糖尿病性疾患への罹患を診断する方法に用いることができる。
本実施形態の変性ＨＤＬの定量方法及び分析用試薬は、例えば、体液中のＨＤＬの定量において、変性ＨＤＬの測定により、上述した心・血管系疾患への罹患、及び／又は、糖尿病若しくは糖尿病性疾患への罹患を診断する方法に用いることができる。
診断方法としては、例えば、前記試料中の変性ＨＤＬの測定において、総ＨＤＬ量に対する変性ＨＤＬの比率の変化から、前記疾患への罹患のリスク、及び／又は、これらの進行度合いを診断することもできる。
この診断方法では、蛋白質の標準品、健常体液試料などを用いて標準品として用い、検量線、対比表などを作成し、診断する対象の検体試料による定量結果を検量線や対比表などと比較して診断に用いる過程なども含まれる。
また、高血圧、睡眠時無呼吸症候群といった、肥満に関連する疾患への罹患、罹患リスク、及び／又はその進行度合いの判定及び診断にも用いることができる。
この診断方法では、蛋白質の標準品、健常体液試料などを用いて標準品として用い、検量線、対比表などを作成し、診断する対象の検体試料による定量結果を検量線や対比表などと比較して診断に用いる過程なども含まれる。
また、高血圧、睡眠時無呼吸症候群といった、肥満に関連する疾患への罹患、罹患リスク、及び／又はその進行度合いの判定及び診断にも用いることができる。
（第２の実施形態）
第２の実施形態では、変性ＨＤＬ、変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を形成し、この複合体を免疫分析により定量する。
なお、第１の実施形態と同様の構成については、図面中に同符号を付して説明を省略する。
第２の実施形態では、変性ＨＤＬ、変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を形成し、この複合体を免疫分析により定量する。
なお、第１の実施形態と同様の構成については、図面中に同符号を付して説明を省略する。
本実施形態は、換言すれば、変性ＨＤＬ及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を検出することによって定量しようとしていた従来技術に対して、さらに変性ＨＤＬ結合蛋白質を介することで、より安定性、確実性を高く検出しようとするものである。この実施形態では、ＬＯＸ－１蛋白質を用いた従来技術で行っていた手法や設備等を改良することで定量を行うことができる。
ＬＯＸ－１は、本発明者が発見した分子で（Ｓａｗａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８６， ７３－７７，１９９７）、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体の１種として知られている。ＬＯＸ－１は、詳細な構造も明らかとなっており、細胞膜一回貫通型の膜タンパク質であり、レクチン様のドメインを備え、このレクチン様ドメインが酸化ＬＤＬの認識部位であること（特開平９－９８７８７号公報など）、血液中に可溶性の成分も存在していること、修飾された高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）がＬＯＸ－１のリガンドとして作用すること等が知られている（特開２０１２－１００５８５号公報、特許第６２３１３０７号公報など）。
前記ＬＯＸ－１蛋白質は、例えば、組み換えＬＯＸ－１蛋白質を用いることも好ましい。ここで組み換えＬＯＸ－１蛋白質とは、遺伝子組み換えによって発現させて得られたＬＯＸ－１蛋白質である。組み換えＬＯＸ－１蛋白質は、必要に応じて他の構造との融合や変異を導入されていてもよい。
上述の免疫分析においては、変性ＨＤＬ、変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体の定量は、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。
本実施形態の定量法の概略を図２に示す。この定量法としては、例えば、ＬＯＸ－１蛋白質５０を、プレート４０Ａに固相化させる。このプレート４０Ａ上のＬＯＸ－１蛋白質５０に、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を結合させる。このプレート４０Ａに体液由来の試料を注入することで、このＬＯＸ－１蛋白質５０と変性ＨＤＬ結合蛋白質２０の複合体に、変性ＨＤＬ１０を結合させる。ついで、プレート４０Ａ上の複合体を、上述した変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体３０で定量することができる。抗体３０には、抗Ｆａｃｔｏｒ－Ｖ抗体を用いることもできる。
本実施形態の定量法の概略を図２に示す。この定量法としては、例えば、ＬＯＸ－１蛋白質５０を、プレート４０Ａに固相化させる。このプレート４０Ａ上のＬＯＸ－１蛋白質５０に、変性ＨＤＬ結合蛋白質２０を結合させる。このプレート４０Ａに体液由来の試料を注入することで、このＬＯＸ－１蛋白質５０と変性ＨＤＬ結合蛋白質２０の複合体に、変性ＨＤＬ１０を結合させる。ついで、プレート４０Ａ上の複合体を、上述した変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体３０で定量することができる。抗体３０には、抗Ｆａｃｔｏｒ－Ｖ抗体を用いることもできる。
本実施形態では、試料として血清を用い、前記試料に前記変性ＨＤＬ結合蛋白質を添加する工程を備えていてもよい。この試料を、上述したＬＯＸ－１が固相化されたＥＬＩＳＡプレートに添加することで、ＥＬＩＳＡプレート上のＬＯＸ－１に、変性ＨＤＬ結合蛋白質及び変性ＨＤＬが結合した複合体が形成され、ＥＬＩＳＡプレート上の結合体を、上述した変性ＨＤＬ又は前記複合体に結合する抗体で定量することができる。
なお、本実施形態の定量方法に用いる分析用試薬は、病理学的活性を有する変性ＨＤＬの定量のための、組み換えＬＯＸ－１蛋白質を含むものであってもよい。この分析用試薬は、上述したように、組み換えＬＯＸ－１蛋白質が変性ＨＤＬと相互作用するので、変性ＨＤＬ、変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１の複合体に対して免疫分析により変性ＨＤＬの定量を行うことができる。
また、本実施形態の分析用試薬は、上記構成を複数備えたキットとして提供されてもよい。例えば、このキットは変性ＨＤＬの定量のための変性ＨＤＬ結合蛋白質を含む分析用試薬及びＬＯＸ－１蛋白質を含む分析用試薬を備えていてもよい。
以下、実施例を示す。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
（試験例１）
（Ｆａｃｔｏｒ Ｖによる変性ＨＤＬ検出感度の検証）
まず、変性ＨＤＬと、変性ＨＤＬの受容体であるＬＯＸ－１との結合のＦａｃｔｏｒ Ｖの影響を調べた。
ＬＯＸ－１を固相化したプレートに変性ＨＤＬを含む血漿又は血清試料を添加して、ＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの複合体を、変性ＨＤＬの抗体（抗ａｐоＡ１抗体）で検出する試験を行う。このとき、試料にＦａｃｔｏｒ Ｖを添加することで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存して検出感度が向上し、また安定した検出感度が得られるのであれば、Ｆａｃｔｏｒ Ｖと変性ＨＤＬの結合の機序を変性ＨＤＬの定量に用いることができる。
（Ｆａｃｔｏｒ Ｖによる変性ＨＤＬ検出感度の検証）
まず、変性ＨＤＬと、変性ＨＤＬの受容体であるＬＯＸ－１との結合のＦａｃｔｏｒ Ｖの影響を調べた。
ＬＯＸ－１を固相化したプレートに変性ＨＤＬを含む血漿又は血清試料を添加して、ＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの複合体を、変性ＨＤＬの抗体（抗ａｐоＡ１抗体）で検出する試験を行う。このとき、試料にＦａｃｔｏｒ Ｖを添加することで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存して検出感度が向上し、また安定した検出感度が得られるのであれば、Ｆａｃｔｏｒ Ｖと変性ＨＤＬの結合の機序を変性ＨＤＬの定量に用いることができる。
ＥＬＩＳＡ法は以下の手順で行った。
３８４ ｗｅｌｌ プレートに組換えヒトＬＯＸ－１（６１－２７３ａａ）を０．１５μｇ／ｗｅｌｌ固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを添加した血漿又は血清試料を室温で２時間インキュベーションした。試料希釈液には１％カゼイン－Ｎａ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４， １００μＭ ＡＰＭＳＦを用いた。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。変性ＨＤＬ濃度（ｎｇ／ｍｌ）は、硫酸銅で酸化させた酸化ＨＤＬを標準品として作成した検量線を用いて算出した。
３８４ ｗｅｌｌ プレートに組換えヒトＬＯＸ－１（６１－２７３ａａ）を０．１５μｇ／ｗｅｌｌ固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを添加した血漿又は血清試料を室温で２時間インキュベーションした。試料希釈液には１％カゼイン－Ｎａ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４， １００μＭ ＡＰＭＳＦを用いた。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。変性ＨＤＬ濃度（ｎｇ／ｍｌ）は、硫酸銅で酸化させた酸化ＨＤＬを標準品として作成した検量線を用いて算出した。
ＥＬＩＳＡ法による検出結果を図３に示す。図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）は、それぞれ異なる被験者（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）より採取した血漿（ｐｌａｓｍａ）、及び血清（ｓｅｒｕｍ）についての結果を示した。縦軸のｃｏｍｐｌｅｘは、固相化されたＬＯＸ－１に対してなんらかの複合体を形成した変性ＨＤＬ（ＬＯＸ－１変性ＨＤＬの結合を他の蛋白質が介しているものを含む）に対して、抗ａｐоＡ１抗体が検出した濃度を示し、横軸は添加したＦａｃｔｏｒ Ｖの濃度を示す。
血清については、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に示すように、被験者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取した検体の５例全てにおいて、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存して変性ＨＤＬの検出感度が上昇している。血漿については、採取する検体によって、添加量による差が大きく見られない場合と、ほぼ添加量に依存して上昇する場合があった。
これらの結果は、血漿よりも含有物質の少ない血清については、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ等のＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの結合を介する蛋白質がほとんど含まれていないため、このＦａｃｔｏｒ Ｖの添加によってこの結合が介されたと考えられる。一方、血漿にはＦａｃｔｏｒ Ｖ等のＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの結合を介する蛋白質が含まれている場合があるが、含有量が検体やその採取、保存方法などによってそれぞれ異なっており、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ添加による影響が異なると考えられる。
これらの結果により、Ｆａｃｔｏｒ Ｖが変性ＨＤＬと結合すること、変性ＨＤＬとＬＯＸ－１の結合がＦａｃｔｏｒ Ｖを介して行われ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存してこの結合が行われた複合体の検出感度が向上することが示された。
血清については、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）に示すように、被験者Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取した検体の５例全てにおいて、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存して変性ＨＤＬの検出感度が上昇している。血漿については、採取する検体によって、添加量による差が大きく見られない場合と、ほぼ添加量に依存して上昇する場合があった。
これらの結果は、血漿よりも含有物質の少ない血清については、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ等のＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの結合を介する蛋白質がほとんど含まれていないため、このＦａｃｔｏｒ Ｖの添加によってこの結合が介されたと考えられる。一方、血漿にはＦａｃｔｏｒ Ｖ等のＬＯＸ－１と変性ＨＤＬの結合を介する蛋白質が含まれている場合があるが、含有量が検体やその採取、保存方法などによってそれぞれ異なっており、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ添加による影響が異なると考えられる。
これらの結果により、Ｆａｃｔｏｒ Ｖが変性ＨＤＬと結合すること、変性ＨＤＬとＬＯＸ－１の結合がＦａｃｔｏｒ Ｖを介して行われ、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加量に依存してこの結合が行われた複合体の検出感度が向上することが示された。
（試験例２）
プレートに対するＬＯＸ－１の固相化の有無で検出感度を調べることで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖによる検出感度の上昇がＬＯＸ－１、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ及び変性ＨＤＬの複合体に対して起こっているかを調べた。
図４に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血漿を用いて、１μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合（ｐｌａｓｍａ＋ＦＶ）及び加えない場合（ｐｌａｓｍａ）、プレートとしてＬＯＸ－１を固相化したもの（ＬＯＸ－１ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）及び固相化を行わないもの（ｎｏｎ ｃｏａｔ）を用い、その他は試験例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法により検出を行った結果を示す。
図５に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血清を用いて１μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合（ｓｅｒｕｍ＋ＦＶ）及び加えない場合（ｓｅｒｕｍ）、他は図４と同様に検出を行った結果を示す。
図６に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血漿を用いて、１０μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合及び加えない場合について、他は図４と同様に検出を行った結果を示す。
図７に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血清を用いて、１０μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合及び加えない場合について、他は図５と同様に検出を行った結果を示す。
プレートに対するＬＯＸ－１の固相化の有無で検出感度を調べることで、Ｆａｃｔｏｒ Ｖによる検出感度の上昇がＬＯＸ－１、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ及び変性ＨＤＬの複合体に対して起こっているかを調べた。
図４に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血漿を用いて、１μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合（ｐｌａｓｍａ＋ＦＶ）及び加えない場合（ｐｌａｓｍａ）、プレートとしてＬＯＸ－１を固相化したもの（ＬＯＸ－１ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）及び固相化を行わないもの（ｎｏｎ ｃｏａｔ）を用い、その他は試験例１と同様に、ＥＬＩＳＡ法により検出を行った結果を示す。
図５に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血清を用いて１μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合（ｓｅｒｕｍ＋ＦＶ）及び加えない場合（ｓｅｒｕｍ）、他は図４と同様に検出を行った結果を示す。
図６に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血漿を用いて、１０μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合及び加えない場合について、他は図４と同様に検出を行った結果を示す。
図７に、試料として前記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅより採取したそれぞれの血清を用いて、１０μｇ／ｍＬとなるようＦａｃｔｏｒ Ｖ蛋白質を加えた場合及び加えない場合について、他は図５と同様に検出を行った結果を示す。
図４～図７によれば、ＬＯＸ－１を固相化しないプレートを用いると、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを試料に加えた場合も加えない場合も検出量に差が見られない。この結果から、Ｆａｃｔｏｒ ＶはＬＯＸ－１、Ｆａｃｔｏｒ Ｖ及び変性ＨＤＬが結合し、複合体を形成したものの検出量を増加させることが示されている。
図４と図５、図６と図７を比較すると、血漿を用いた図４、図６に対し、血清を用いた図５、図７では、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを添加することによって検出量が高くなっている。この結果も試験例１と同様、血清に含まれていないと思われる物質が、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加によって補われると考えられる。
図４と図５、図６と図７を比較すると、血漿を用いた図４、図６に対し、血清を用いた図５、図７では、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを添加することによって検出量が高くなっている。この結果も試験例１と同様、血清に含まれていないと思われる物質が、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの添加によって補われると考えられる。
（試験例３）
Ｆａｃｔｏｒ Ｖが変性ＨＤＬに結合することから、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを直接プレートに固相化させ、変性ＨＤＬの定量を行うことができるかを試みた。
Ｆａｃｔｏｒ Ｖが変性ＨＤＬに結合することから、Ｆａｃｔｏｒ Ｖを直接プレートに固相化させ、変性ＨＤＬの定量を行うことができるかを試みた。
まず、ＰＢＳ（－）に０～１０μｇ／ｍＬとなるよう溶解したＦａｃｔｏｒ Ｖをプレートに添加し、抗Ｆａｃｔｏｒ Ｖ抗体によるＥＬＩＳＡ法で、プレートへの固相化が可能かを試みた。条件は以下のように行った。
固相化：Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ 各濃度
ブロッキング：１％カゼイン－Ｎａ中、２ｈｒ 室温
検出：一次抗体 ａｎｔｉ－ＦＶ－ＬＣ （ＡＨＶ－５１０１） １μｇ／ｍｌ、１ｈｒ、室温
二次抗体 ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ、１：４０００、 １％ カゼイン－Ｎａ中、１ｈｒ 室温
固相化：Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｖ 各濃度
ブロッキング：１％カゼイン－Ｎａ中、２ｈｒ 室温
検出：一次抗体 ａｎｔｉ－ＦＶ－ＬＣ （ＡＨＶ－５１０１） １μｇ／ｍｌ、１ｈｒ、室温
二次抗体 ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ、１：４０００、 １％ カゼイン－Ｎａ中、１ｈｒ 室温
結果を図８に示す。プレートに対し、ほぼ濃度依存でＦａｃｔｏｒ Ｖの固相化が可能であることが示されている。
続いて、このＦａｃｔｏｒ Ｖ固相化ＥＬＩＳＡプレートに対して、変性していないＨＤＬ（ｎＨＤＬ）及び変性ＨＤＬの結合の試験を行った。変性ＨＤＬは、ＨＤＬを硫酸銅によって酸化させた酸化ＨＤＬである、Ｃｕ２＋－оｘＨＤＬを用いた。
３８４ｗｅｌｌプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にＦａｃｔｏｒ Ｖを固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、試料希釈液（１％カゼイン－Ｎａ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４， １００μＭ ＡＰＭＳＦ）にて１μｇ／ｍｌに調製したｎＨＤＬ又はＣｕ２＋－оｘＨＤＬ を室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
３８４ｗｅｌｌプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にＦａｃｔｏｒ Ｖを固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、試料希釈液（１％カゼイン－Ｎａ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４， １００μＭ ＡＰＭＳＦ）にて１μｇ／ｍｌに調製したｎＨＤＬ又はＣｕ２＋－оｘＨＤＬ を室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図９に示す。プレートへのＦａｃｔｏｒ Ｖ固相化量に依存して、変性ＨＤＬの検出量は高くなっている。一方、ｎＨＤＬの検出量は大きく変化しない。この結果より、このプレートが変性ＨＤＬの検出に用いることができる旨が示されている。
（試験例４）
試験例３と同様に調整したＦａｃｔｏｒ Ｖ固相化プレートを用いて、ヒト血漿及び血清中の変性ＨＤＬを検出した。被験者Ｘ，Ｙから採取した血漿及び血清の検体を用い、ＥＬＩＳＡ法により変性ＨＤＬの定量を行った。
３８４ｗｅｌｌプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にＦａｃｔｏｒ Ｖを固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、血漿又は血清試料を室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
試験例３と同様に調整したＦａｃｔｏｒ Ｖ固相化プレートを用いて、ヒト血漿及び血清中の変性ＨＤＬを検出した。被験者Ｘ，Ｙから採取した血漿及び血清の検体を用い、ＥＬＩＳＡ法により変性ＨＤＬの定量を行った。
３８４ｗｅｌｌプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にＦａｃｔｏｒ Ｖを固相化した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１％カゼイン－Ｎａでブロッキングを行った。ＰＢＳで３回洗浄後、血漿又は血清試料を室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄度、１μｇ／ｍｌに調製した抗ａｐоＡ１抗体（ｃｈｉｃｋｅｎ ＃１）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄度、４０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。抗体反応後、ＰＢＳで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）をプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図１０に示す。被験者Ｘから採取した検体について図１０（ａ）、被験者Ｙから採取した検体について図１０（ｂ）に示した。
従来技術におけるＬＯＸ－１固相化の場合と異なり、血漿と血清で測定値にほとんど違いはなく、すなわち、血漿に対しても検体によらず、安定した検出感度の高さが見られた。この技術は、ＬＯＸ－１を固相化した技術よりも感度が高く、またＬＯＸ－１及びＦａｃｔｏｒ Ｖを用いたサンドイッチ法よりも容易に定量を行うことができるだけでなく、血漿及び血清の両方に対して安定して確実に高い感度で定量を行うことができることが示された。
従来技術におけるＬＯＸ－１固相化の場合と異なり、血漿と血清で測定値にほとんど違いはなく、すなわち、血漿に対しても検体によらず、安定した検出感度の高さが見られた。この技術は、ＬＯＸ－１を固相化した技術よりも感度が高く、またＬＯＸ－１及びＦａｃｔｏｒ Ｖを用いたサンドイッチ法よりも容易に定量を行うことができるだけでなく、血漿及び血清の両方に対して安定して確実に高い感度で定量を行うことができることが示された。
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
本発明によれば、変性ＨＤＬを従来よりも安定して正確に定量できる変性ＨＤＬの定量方法、及び、その定量方法に用いる分析用試薬が得られる。この定量方法及び分析用試薬は、特に心・血管系疾患への罹患、糖尿病及び糖尿病性疾患への罹患のリスク又は進行度合いの判定等に用いることができる。
１０ 変性ＨＤＬ
２０ 変性ＨＤＬ結合蛋白質
２１ Ｌ鎖部位
２２ Ｈ鎖部位
３０ 抗体
４０、４０Ａ プレート
５０ ＬＯＸ－１蛋白質
２０ 変性ＨＤＬ結合蛋白質
２１ Ｌ鎖部位
２２ Ｈ鎖部位
３０ 抗体
４０、４０Ａ プレート
５０ ＬＯＸ－１蛋白質
Claims (16)
- 試料中に含まれる変性ＨＤＬの定量方法であって、
前記試料に前記変性ＨＤＬと結合可能な変性ＨＤＬ結合蛋白質を添加し、
前記変性ＨＤＬと変性ＨＤＬ結合蛋白質とを結合させ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質と前記変性ＨＤＬとの結合体を定量し、
前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位の配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、変性ＨＤＬの定量方法。 - 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインの配列を含む、請求項１に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、請求項１又は２に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、請求項２に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、請求項１から４のいずれか１項に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記定量は、前記変性ＨＤＬ及び前記変性ＨＤＬ結合蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、請求項１から５のいずれか１項に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記免疫分析による定量は、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質、又は前記変性ＨＤＬ結合蛋白質と結合する蛋白質を固相化したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行う、請求項６に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記定量は、前記変性ＨＤＬ、前記変性ＨＤＬ結合蛋白質及びＬＯＸ－１蛋白質の複合体を形成し、前記複合体を免疫分析により定量する、請求項１から７のいずれか１項に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記定量では、試料として血清又は血漿を用いる、請求項１から８のいずれか１項に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 前記定量では、試料として血清を用いる、請求項１から９のいずれか１項に記載の変性ＨＤＬの定量方法。
- 心・血管系疾患、糖尿病若しくは糖尿病性疾患、それらのリスク、又は、その進行度を判定するための変性ＨＤＬの定量に用いる分析用試薬であって、
前記変性ＨＤＬと結合可能な変性ＨＤＬ結合蛋白質を含み、
前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ ＶのＬ鎖部位配列を有する蛋白質又はその変異体を含む、分析用試薬。 - 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖのリン脂質認識部位であるＣ１－Ｃ２ドメインの配列を含む、請求項１１に記載の分析用試薬。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｖの配列を含む、請求項１１又は１２に記載の分析用試薬。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、ＭＦＧ－Ｅ８、Ｄｅｌ－１又はＦａｃｔｏｒ ＶＩＩＩである、請求項１２に記載の分析用試薬。
- 前記変性ＨＤＬ結合蛋白質は、組み換え蛋白質である、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の分析用試薬。
- 前記心・血管系疾患は、動脈硬化又はその進行によって生じる心筋梗塞若しくは脳卒中である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の分析用試薬。
Applications Claiming Priority (3)
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