JP7631485B2 - キメラポックスウイルス組成物及びその使用 - Google Patents

キメラポックスウイルス組成物及びその使用 Download PDF

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Description

本出願は、２０１６年８月９日に出願の米国仮特許出願第６２／３７２，４０８号及び２０１７年６月１３日に出願の米国仮特許出願第６２／５１９，０１０号の優先権を主張し、参照によりその全内容を全目的において本明細書に組み込む。
ファイル４８４４０－６０６００１ＷＯ＿ＳＴ２５に記載の配列表（２０１７年８月８日作成、６９６，２３９バイト、機器フォーマット：ＩＢＭ－ＰＣ、オペレーティングシステム：ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ）を、参照により本明細書に組み込む。
がんは、米国では第２位の主要な死因である。近年、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞及び腫瘍溶解性ウイルス等による、がん免疫療法が高度に進歩している。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に感染し、そこで複製し、最終的にがん細胞を殺傷する一方で、健常な細胞には影響を及ぼさない、天然の又は遺伝子改変されたウイルスである。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスを単独治療で用いることによる臨床的利益は、依然として限定されたものである。
当技術分野において、腫瘍溶解性ウイルスの有利な特徴を活かしつつ、安全性及び臨床結果を最大化する、新規な組成物が求められている。本明細書においては、とりわけ、当技術分野におけるこれらの課題、及び他の課題に対する解決手段を開示する。
（発明の要旨）
一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルス ＡＳ株、オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片を含む。
一態様において、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスをコードする単離された核酸が提供される。
一態様において、治療有効量の本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを含む医薬組成物が提供される。
他の一態様において、それを必要とする被験者のがんを治療する方法が提供され、前記方法は、被験者に、治療有効量の本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを投与することを含み、それにより被験者のがんを治療する。実施形態において、前記がんは、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫である。
他の一態様において、キメラポックスウイルスを形成する方法が提供され、前記方法は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルス ＡＳ株、オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株を含む群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成することを含む。
一態様において、細胞の細胞増殖を阻害する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを細胞に接触させることを含む。
一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルス ＡＳ株、オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は
（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルス ＡＳ株、オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルス ＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）オルフウイルス ＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス ＴＪＳ株、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
新規なキメラオルソポックスウイルス単離株＃３３（配列番号１）及び＃１７（配列番号３）が、これらの親の野生型ウイルス株、並びにコントロールウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰと比較して、優れたがん細胞殺傷能力を示す。 新規なキメラパラポックスウイルス単離株＃１８９（配列番号２）が、その親の野生型ウイルス株、並びにコントロールウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰと比較して、優れたがん細胞殺傷能力を示す。 新規なキメラオルソポックスウイルス単離株＃１７（配列番号３）及び＃３３（配列番号１）が、これらの親ウイルス株、並びにコントロールウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰと比較して、膵がん細胞株に対する強力ながん細胞殺傷能力を示す。 新規なキメラパラポックスウイルス単離株＃１８９（配列番号２）が、その親ウイルス株、並びにコントロールウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰと比較して、膵がん細胞株に対する強力ながん細胞殺傷能力を示す。 図５Ａ～５Ｃは、新規なキメラウイルス単離株＃３３（配列番号１）及び＃１８９（配列番号２）が、胃がん細胞株に対する優れた細胞殺傷活性を示す。がん細胞を、０．０１、０．１及び１．０のＭＯＩで各ウイルスにより感染させた。感染後９６時間における細胞生存率を、胃がん細胞株ＭＫＮ－４５（図５Ａ）、ＯＣＵＭ－２Ｍ（図５Ｂ）及びＫＡＴＯ－３（図５Ｃ）におけるＭＯＩに対してプロットした。 図５Ａ～５Ｃは、新規なキメラウイルス単離株＃３３（配列番号１）及び＃１８９（配列番号２）が、胃がん細胞株に対する優れた細胞殺傷活性を示す。がん細胞を、０．０１、０．１及び１．０のＭＯＩで各ウイルスにより感染させた。感染後９６時間における細胞生存率を、胃がん細胞株ＭＫＮ－４５（図５Ａ）、ＯＣＵＭ－２Ｍ（図５Ｂ）及びＫＡＴＯ－３（図５Ｃ）におけるＭＯＩに対してプロットした。 図５Ａ～５Ｃは、新規なキメラウイルス単離株＃３３（配列番号１）及び＃１８９（配列番号２）が、胃がん細胞株に対する優れた細胞殺傷活性を示す。がん細胞を、０．０１、０．１及び１．０のＭＯＩで各ウイルスにより感染させた。感染後９６時間における細胞生存率を、胃がん細胞株ＭＫＮ－４５（図５Ａ）、ＯＣＵＭ－２Ｍ（図５Ｂ）及びＫＡＴＯ－３（図５Ｃ）におけるＭＯＩに対してプロットした。 図６Ａ～６Ｄは、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）のインビトロでの細胞毒性効果が、トリプルネガティブ乳がん細胞株において、時間依存的及び用量依存的であることを示す。（図６Ａ）Ｈｓ５７８Ｔ。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．３９６（ＳＤ ０．１１３）、（図６Ｂ）ＢＴ５４９。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．６３６（ＳＤ ０．５３９）、（図６Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．１８５（ＳＤ ０．０７１）、（図６Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．７１２（ＳＤ １．２６３）。ＬＤ５０（９６時間）、半数致死量、ＭＯＩ：多重感染度、ＳＤ：標準偏差。 図６Ａ～６Ｄは、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）のインビトロでの細胞毒性効果が、トリプルネガティブ乳がん細胞株において、時間依存的及び用量依存的であることを示す。（図６Ａ）Ｈｓ５７８Ｔ。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．３９６（ＳＤ ０．１１３）、（図６Ｂ）ＢＴ５４９。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．６３６（ＳＤ ０．５３９）、（図６Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．１８５（ＳＤ ０．０７１）、（図６Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．７１２（ＳＤ １．２６３）。ＬＤ５０（９６時間）、半数致死量、ＭＯＩ：多重感染度、ＳＤ：標準偏差。 図６Ａ～６Ｄは、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）のインビトロでの細胞毒性効果が、トリプルネガティブ乳がん細胞株において、時間依存的及び用量依存的であることを示す。（図６Ａ）Ｈｓ５７８Ｔ。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．３９６（ＳＤ ０．１１３）、（図６Ｂ）ＢＴ５４９。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．６３６（ＳＤ ０．５３９）、（図６Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．１８５（ＳＤ ０．０７１）、（図６Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．７１２（ＳＤ １．２６３）。ＬＤ５０（９６時間）、半数致死量、ＭＯＩ：多重感染度、ＳＤ：標準偏差。 図６Ａ～６Ｄは、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）のインビトロでの細胞毒性効果が、トリプルネガティブ乳がん細胞株において、時間依存的及び用量依存的であることを示す。（図６Ａ）Ｈｓ５７８Ｔ。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．３９６（ＳＤ ０．１１３）、（図６Ｂ）ＢＴ５４９。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．６３６（ＳＤ ０．５３９）、（図６Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８。ＬＤ５０、ＭＯＩ ０．１８５（ＳＤ ０．０７１）、（図６Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１。ＬＤ５０、ＭＯＩ １．７１２（ＳＤ １．２６３）。ＬＤ５０（９６時間）、半数致死量、ＭＯＩ：多重感染度、ＳＤ：標準偏差。 トリプルネガティブ乳がん細胞株のＨＯＶ－１８９（配列番号２）の複製。インビトロでの効果的なウイルス複製が、低い多重感染度（ＭＯＩ ０．０１）で、ＢＴ５４９、Ｈｓ５７８Ｔ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株において生じた。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８におけるＨＯＶ－１８９の複製は、ＭＯＩ ０．０１では少なかった。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８におけるＨＯＶ－１８９複製は、ＭＯＩ １０において、その他の３本の細胞株より約２乗（ｌｏｇ）低いままだった。 ＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植へのＨＯＶ－１８９（配列番号２）の腫瘍内注入により、コントロールと比較して、腫瘍１つ当たり１０３ＰＦＵの低濃度において、相対腫瘍サイズが効果的に減少する。腫瘍に対し、約１００～１５０ｍｍ３の初期腫瘍体積の腫瘍１つ当たり、ＰＢＳ（コントロール）、腫瘍１つ当たり１０３ＰＦＵ、腫瘍１つ当たり１０４ＰＦＵ又は１０５ＰＦＵで注入した。腫瘍サイズを約３日毎に測定し、治療効果は注射後６週間持続された。 腫瘍内にＨＯＶ－１８９（配列番号２）を注入処理されたヌードマウスにおいて、ＰＢＳを注入されたコントロールと比較して、顕著な相対体重減少は観察されない。体重を約３日毎に測定した。 図１０Ａ～１０Ｃにおいて、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）をインビボでＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍により感染させる。ＯＲＦウイルスに対するポリクローナル抗体の免疫蛍光検出の結果、腫瘍内へのＨＯＶ－１８９注入の１週間後に回収したＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植腫瘍組織においてウイルス感染が示される。（図１０Ａ）コントロール腫瘍、１０×、（図１０Ｂ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、１０×、（図１０Ｃ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、６０×（ＯＲＦ及びＤＡＰＩ対比染色）。 図１０Ａ～１０Ｃにおいて、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）をインビボでＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍により感染させる。ＯＲＦウイルスに対するポリクローナル抗体の免疫蛍光検出の結果、腫瘍内へのＨＯＶ－１８９注入の１週間後に回収したＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植腫瘍組織においてウイルス感染が示される。（図１０Ａ）コントロール腫瘍、１０×、（図１０Ｂ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、１０×、（図１０Ｃ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、６０×（ＯＲＦ及びＤＡＰＩ対比染色）。 図１０Ａ～１０Ｃにおいて、ＨＯＶ－１８９（配列番号２）をインビボでＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍により感染させる。ＯＲＦウイルスに対するポリクローナル抗体の免疫蛍光検出の結果、腫瘍内へのＨＯＶ－１８９注入の１週間後に回収したＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植腫瘍組織においてウイルス感染が示される。（図１０Ａ）コントロール腫瘍、１０×、（図１０Ｂ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、１０×、（図１０Ｃ）１０５ＰＦＵ処理群の腫瘍、６０×（ＯＲＦ及びＤＡＰＩ対比染色）。 腫瘍内ＨＯＶ－１８９（配列番号２）の注入により、隔れた非注入腫瘍に対する腫瘍鎮静効果が生じる。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８異種移植で産生された第２の乳房腫瘍を、１０５ＰＦＵでＨＯＶ－１８９の単回腫瘍内注入で処理し、一方、第４の乳房腫瘍には注入を行わなかった。コントロール腫瘍にはＰＢＳを注入した。腫瘍サイズを約３日毎に測定した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１２Ａ～１２Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり３×１０３個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次に、示すウイルス２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理したＰＡＮＣ－１（図１２Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示すグラフである。また、示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｌ）における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と示される他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６（図１２Ｈ）の場合、統計分析は、各ＭＯＩにおける対応の無いｔ検定を用いて実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１３Ａ～１３Ｌにおいて、ＰＡＮＣ－１、ＭｉａＰａＣａ－２、ＢｘＰＣ－３、ＳＵ．８６．８６、Ｃａｐａｎ－１及びＡｓＰＣ－１がん細胞株について、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５個のがん細胞をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間で培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。示されるウイルスで処理したがん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ａ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、がん細胞ＰＡＮＣ－１（図１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｌ）における、各ウイルスで処理した、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１４Ａ～１４Ｃにおいて、１８匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＭｉａＰａＣａ－２を２×１０６個で移植した。腫瘍サイズが４００ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（３匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で、＃３３（５匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１４Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１４Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１４Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 図１４Ａ～１４Ｃにおいて、１８匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＭｉａＰａＣａ－２を２×１０６個で移植した。腫瘍サイズが４００ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（３匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で、＃３３（５匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１４Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１４Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１４Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 図１４Ａ～１４Ｃにおいて、１８匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＭｉａＰａＣａ－２を２×１０６個で移植した。腫瘍サイズが４００ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（３匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で、＃３３（５匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１４Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１４Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１４Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 図１５Ａ～１５Ｃにおいて、２６匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＰＡＮＣ－１を１．２５×１０６個で移植した。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（４匹のマウス）、約１×１０３ＰＦＵ／投与で、＃３３（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１５Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１５Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１５Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 図１５Ａ～１５Ｃにおいて、２６匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＰＡＮＣ－１を１．２５×１０６個で移植した。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（４匹のマウス）、約１×１０３ＰＦＵ／投与で、＃３３（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１５Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１５Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１５Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 図１５Ａ～１５Ｃにおいて、２６匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＰＡＮＣ－１を１．２５×１０６個で移植した。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（４匹のマウス）、約１×１０３ＰＦＵ／投与で、＃３３（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を５０μＬで注入した。正味の体重変化率％（図１５Ａ）、及び注入腫瘍変化率％（図１５Ｂ）、及び非注入腫瘍変化率％（図１５Ｃ）を４３日間、週２回記録した。 週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬのＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した。 図１７Ａ～１７Ｄにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＨＴ－２９（図１７Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｃ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＨＴ－２９（図１７Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｄ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１７Ａ～１７Ｄにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＨＴ－２９（図１７Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｃ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＨＴ－２９（図１７Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｄ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１７Ａ～１７Ｄにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＨＴ－２９（図１７Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｃ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＨＴ－２９（図１７Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｄ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１７Ａ～１７Ｄにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＨＴ－２９（図１７Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｃ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＨＴ－２９（図１７Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｄ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１８Ａ～１８Ｆにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭのがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。１、０．１又は０．０１のＭＯＩにて＃３３で処理したＳＷ６２０（図１８Ａ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ）における、時間経過に伴う細胞生存率（％）のグラフを示す。また、示されるウイルスで処理したＳＷ６２０（図１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｆ）がん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較する棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１９Ａ～１９Ｂにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＦ－１２Ｋ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＬｏＶｏがん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。図１９Ａは、１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理されたＬｏＶｏがん細胞における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示す。図１９Ｂは、示されるウイルスで処理されたＬｏＶｏがん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図１９Ａ～１９Ｂにおいて、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＦ－１２Ｋ培地中、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でＬｏＶｏがん細胞株をプレーティングし、細胞毒性アッセイを２４時間実施した。次にウイルス＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を各々２０μＬ、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３連で繰り返した。図１９Ａは、１、０．１又は０．０１のＭＯＩで＃３３で処理されたＬｏＶｏがん細胞における、時間経過に伴う細胞生存率（％）を示す。図１９Ｂは、示されるウイルスで処理されたＬｏＶｏがん細胞における、１２０時間後の細胞生存率（％）を比較した棒グラフを示す。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。比較バーの上の「ＮＳ」は、「有意でない」ことを意味する。 図２０Ａ～２０Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＨＴ－２９（図２０Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＨＴ－２９（図２０Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２０Ａ～２０Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＨＴ－２９（図２０Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＨＴ－２９（図２０Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２０Ａ～２０Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＨＴ－２９（図２０Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＨＴ－２９（図２０Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２０Ａ～２０Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＨＴ－２９及びＨＣＴ－１１６がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＨＴ－２９（図２０Ａ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＨＴ－２９（図２０Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２１Ａ～２１Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＳＷ６２０及びＳＷ４８０がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＳＷ６２０（図２１Ａ）及びＳＷ４８０（図２１Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＳＷ６２０（図２１Ｂ）及びＳＷ４８０（図２１Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２１Ａ～２１Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＳＷ６２０及びＳＷ４８０がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＳＷ６２０（図２１Ａ）及びＳＷ４８０（図２１Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＳＷ６２０（図２１Ｂ）及びＳＷ４８０（図２１Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２１Ａ～２１Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＳＷ６２０及びＳＷ４８０がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＳＷ６２０（図２１Ａ）及びＳＷ４８０（図２１Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＳＷ６２０（図２１Ｂ）及びＳＷ４８０（図２１Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 図２１Ａ～２１Ｄにおいて、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でＳＷ６２０及びＳＷ４８０がん細胞株をプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３連で作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。ＳＷ６２０（図２１Ａ）及びＳＷ４８０（図２１Ｃ）における、時間経過に伴うＰＦＵ／細胞１００万個を示すグラフである。また、各ウイルスの処理を受けたがん細胞ＳＷ６２０（図２１Ｂ）及びＳＷ４８０（図２１Ｄ）における、各時点でのＰＦＵ／細胞１００万個を比較した棒グラフである。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。 ウイルス＃３３又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳにより感染させたＨＣＴ－１１６がん細胞の免疫組織化学的分析。０．０１のＭＯＩによる感染後２４時間にてイメージを取得した。 ウイルス＃３３又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳにより感染させたＨＴ－２９がん細胞の免疫組織化学的分析。０．０１のＭＯＩによる感染後２４時間にてイメージを取得した。 １４匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＨＴ－２９を５×１０６細胞で移植した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３となったとき、両側の腫瘍にＰＢＳ（４匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で＃３３（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２（５匹のマウス）を５０μＬで注入した。正味の重量変化率％及び腫瘍の変化率％を４２日間にわたり週２回記録した。図２４は、時間経過に伴う腫瘍ＨＴ－２９の変化（％）を示す。ＰＢＳコントロールと、＃３３（３匹のマウス）及び＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２とを比較したときの腫瘍体積変化率％の有意差（それぞれｐ＝０．０２及びｐ＝０．０３）を強調表示した。 週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬのＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した。 １９匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＨＣＴ－１１６を５×１０６細胞で移植した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３となったとき、両側の腫瘍にＰＢＳ（２匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で＃３３（３匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を５０μＬで注入した。正味の重量変化率％及び腫瘍の変化率％を４２日間にわたり週２回記録した。図２５は、時間経過に伴うＨＣＴ－１１６腫瘍の変化（％）を示す。ＰＢＳコントロールと、＃３３（３匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ及び＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２とを比較したときの腫瘍体積変化（％）の有意差（それぞれｐ＝０．０００２、ｐ＝０．０００１及びｐ＝０．０００２）を強調表示した。 週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬのＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した。 図２８Ａ～２８Ｃにおいて、腫瘍溶解性ウイルスにより媒介される、感染後７２時間における、肺がん及び肺線維芽細胞への細胞毒性を示す。５０００個のＡ５４９、Ｈ２１９９又はＨＦ１線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、示される多重感染度（ＭＯＩ、０、０．００１、０．０１、０．１、１つのＭＯＩ）で種々のウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ）により細胞を感染させ、又は偽感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染させたＡ５４９細胞（図２８Ａ）、Ｈ２１９９細胞（図２８Ｂ）又はＨＦ１線維芽細胞（図２８Ｃ）の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。 図２８Ａ～２８Ｃにおいて、腫瘍溶解性ウイルスにより媒介される、感染後７２時間における、肺がん及び肺線維芽細胞への細胞毒性を示す。５０００個のＡ５４９、Ｈ２１９９又はＨＦ１線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、示される多重感染度（ＭＯＩ、０、０．００１、０．０１、０．１、１つのＭＯＩ）で種々のウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ）により細胞を感染させ、又は偽感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染させたＡ５４９細胞（図２８Ａ）、Ｈ２１９９細胞（図２８Ｂ）又はＨＦ１線維芽細胞（図２８Ｃ）の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。 図２８Ａ～２８Ｃにおいて、腫瘍溶解性ウイルスにより媒介される、感染後７２時間における、肺がん及び肺線維芽細胞への細胞毒性を示す。５０００個のＡ５４９、Ｈ２１９９又はＨＦ１線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、示される多重感染度（ＭＯＩ、０、０．００１、０．０１、０．１、１つのＭＯＩ）で種々のウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ）により細胞を感染させ、又は偽感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染させたＡ５４９細胞（図２８Ａ）、Ｈ２１９９細胞（図２８Ｂ）又はＨＦ１線維芽細胞（図２８Ｃ）の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。 示されるウイルスによる右の腫瘍への１０００ＰＦＵでの単回投与後（＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８又はＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、腫瘍内）、数日にわたる、Ａ５４９異種移植のＧＦＰイメージを示す。 示されるウイルスによる右の腫瘍への１０００ＰＦＵでの単回投与後（＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８又はＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、腫瘍内）、数日にわたる、Ａ５４９異種移植のＧＦＰイメージを示す。 Ａ５４９異種移植モデルの、数日にわたるマウスの体重を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％を示す。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 Ａ５４９異種移植モデルの、数日にわたるマウスの体重を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％を示す。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 図３１Ａ～３１Ｂにおいて、Ａ５４９異物移植モデルの腫瘍後退を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。注入群（図３１Ａ）及び非注入群（図３１Ｂ）の腫瘍体積を、デジタルカリパス副木を用いて週２回測定した。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 図３１Ａ～３１Ｂにおいて、Ａ５４９異物移植モデルの腫瘍後退を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。注入群（図３１Ａ）及び非注入群（図３１Ｂ）の腫瘍体積を、デジタルカリパス副木を用いて週２回測定した。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 図３１Ａ～３１Ｂにおいて、Ａ５４９異物移植モデルの腫瘍後退を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。注入群（図３１Ａ）及び非注入群（図３１Ｂ）の腫瘍体積を、デジタルカリパス副木を用いて週２回測定した。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 図３１Ａ～３１Ｂにおいて、Ａ５４９異物移植モデルの腫瘍後退を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。注入群（図３１Ａ）及び非注入群（図３１Ｂ）の腫瘍体積を、デジタルカリパス副木を用いて週２回測定した。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 Ａ５４９異種移植モデルにおける、ウイルス注入腫瘍の体積を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した。各折れ線は、腫瘍を注入された個々の処理群の、標準偏差付きの平均体積を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。 Ａ５４９異種移植モデルにおける、非注入腫瘍の体積。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて、非注入腫瘍の腫瘍体積を週２回測定した。各折れ線は、腫瘍を注入された個々の処理群の、標準偏差付きの平均体積を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。 図３４Ａ～３４Ｂは、腫瘍体積の変化倍数を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した。ウイルス注入時（すなわち０日目）に対して、種々の時点における腫瘍体積を正規化することにより、注入（図３４Ａ）、及び非注入（図３４Ｂ）腫瘍の腫瘍体積の変化倍数を算出した。図３４Ａ～３４Ｂにおいて、各折れ線は、個々の処理群の標準偏差付きの平均腫瘍体積を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。 図３４Ａ～３４Ｂは、腫瘍体積の変化倍数を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝４又は５）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を各マウスの右側の腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した。ウイルス注入時（すなわち０日目）に対して、種々の時点における腫瘍体積を正規化することにより、注入（図３４Ａ）、及び非注入（図３４Ｂ）腫瘍の腫瘍体積の変化倍数を算出した。図３４Ａ～３４Ｂにおいて、各折れ線は、個々の処理群の標準偏差付きの平均腫瘍体積を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。 図３５Ａ～３５Ｂは、注入及び非注入腫瘍（Ａ５４９モデル）のウイルスの体内分布を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝３）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ）を各マウスの右側の腫瘍内部のみに、１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３５Ａは、注入腫瘍における各ウイルスのＰＦＵ／ｇ腫瘍を示す。図３５Ｂは、非注入腫瘍における各ウイルスのＰＦＵ／ｇ腫瘍を示す。 図３５Ａ～３５Ｂは、注入及び非注入腫瘍（Ａ５４９モデル）のウイルスの体内分布を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝３）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ）を各マウスの右側の腫瘍内部のみに、１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３５Ａは、注入腫瘍における各ウイルスのＰＦＵ／ｇ腫瘍を示す。図３５Ｂは、非注入腫瘍における各ウイルスのＰＦＵ／ｇ腫瘍を示す。 マウス（Ａ５４９モデル）の卵巣におけるウイルスの力価を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝３）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ）を各マウスの右側の腫瘍内部のみに、１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３６は、各ウイルスのＰＦＵ／ｇ組織（卵巣）を示す。検出されない（ＮＤ）。 ウイルス注入の２０日後の血液中のウイルス力価を示す。腫瘍細胞Ａ５４９の注入後３週目に、各群同等の平均腫瘍体積となるよう（約２００ｍｍ３）、マウスを種々の処理群（ｎ＝３）に分け、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ）を各マウスの右側の腫瘍内部のみに、１０３ＰＦＵで注入した。顔面静脈穿刺によりマウス（ｎ＝３）から血液を回収した。凍結融解を３回繰り返した後、血液を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３７は、各ウイルスを注入した血液中のＰＦＵ／ｍＬを示す。検出されない（ＮＤ）。 キメラウイルス＃３３は、親のウイルスより肺がん細胞（Ａ５４９）の殺傷能力が強力である。細胞毒性アッセイ：５０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、細胞を、示される多重感染度（ＭＯＩ）で、キメラウイルス＃３３又は親のウイルスにより感染させ、又は偽感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染細胞の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。 処理後の体重変化を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％をプロットした。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 処理後の体重変化を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％をプロットした。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 腫瘍退縮を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積（注入及び非注入）を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 腫瘍退縮を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積（注入及び非注入）を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 腫瘍退縮を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積（注入及び非注入）を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 腫瘍退縮を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積（注入及び非注入）を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。 感染の７日後の、注入及び非注入腫瘍のウイルス力価を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。 ウイルスの生体内分布を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。 ウイルスの生体内分布を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。 注入されたマウスの血液中のウイルス力価を示す。血液は、１０００ｐｆｕの示されるウイルスの腫瘍内注入後、種々の時点でＡ５４９腫瘍担持マウスの顔面静脈から回収した。血液サンプル中のウイルス力価は、標準的なプラークアッセイ法を用いて測定した。注入後１０日目まで、尿中にウイルスは検出できなかった。 注入されたマウスの血液中のウイルス力価を示す。血液は、１０００ｐｆｕの示されるウイルスの腫瘍内注入後、種々の時点でＡ５４９腫瘍担持マウスの顔面静脈から回収した。血液サンプル中のウイルス力価は、標準的なプラークアッセイ法を用いて測定した。注入後１０日目まで、尿中にウイルスは検出できなかった。 ウイルス注入後のマウスの生存を示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて週２回腫瘍体積を測定し、両側の腫瘍のうちの１つが一定の腫瘍負荷（３０００ｍｍ３）を上回ったとき、又は、マウスがウイルス処理のため疾患状態（＞２０％の体重減少）となったとき、マウスを安楽死させた。 図４５Ａ～４５Ｃは、Ａ５４９におけるキメラ＃３３及び親のポックスウイルスの、細胞毒性能力の比較を示す。図４５Ａでは、Ａ５４９細胞の５０％を殺傷するのに必要なウイルスのＭＯＩ（ＬＤ５０）を全てのウイルスについて算出し、比較を行った。図４５Ｂでは、細胞をＭＯＩ ０．０３ｐｆｕで＃３３又は親ウイルスにより感染させ、感染後２４時間におけるウイルス添加量に対するウイルス力価の増加倍数を測定し、ウイルス間で比較した。図４５Ｃでは、Ａ５４９細胞を図４５Ｂと同様にウイルスにより感染させ、感染後１２時間及び感染後１８時間の感染したウェルから上清を回収した。上清のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、ウイルス間で比較した。 図４５Ａ～４５Ｃは、Ａ５４９におけるキメラ＃３３及び親のポックスウイルスの、細胞毒性能力の比較を示す。図４５Ａでは、Ａ５４９細胞の５０％を殺傷するのに必要なウイルスのＭＯＩ（ＬＤ５０）を全てのウイルスについて算出し、比較を行った。図４５Ｂでは、細胞をＭＯＩ ０．０３ｐｆｕで＃３３又は親ウイルスにより感染させ、感染後２４時間におけるウイルス添加量に対するウイルス力価の増加倍数を測定し、ウイルス間で比較した。図４５Ｃでは、Ａ５４９細胞を図４５Ｂと同様にウイルスにより感染させ、感染後１２時間及び感染後１８時間の感染したウェルから上清を回収した。上清のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、ウイルス間で比較した。 図４５Ａ～４５Ｃは、Ａ５４９におけるキメラ＃３３及び親のポックスウイルスの、細胞毒性能力の比較を示す。図４５Ａでは、Ａ５４９細胞の５０％を殺傷するのに必要なウイルスのＭＯＩ（ＬＤ５０）を全てのウイルスについて算出し、比較を行った。図４５Ｂでは、細胞をＭＯＩ ０．０３ｐｆｕで＃３３又は親ウイルスにより感染させ、感染後２４時間におけるウイルス添加量に対するウイルス力価の増加倍数を測定し、ウイルス間で比較した。図４５Ｃでは、Ａ５４９細胞を図４５Ｂと同様にウイルスにより感染させ、感染後１２時間及び感染後１８時間の感染したウェルから上清を回収した。上清のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、ウイルス間で比較した。 図４６Ａ～４６Ｂでは、Ｅｍｅｒａｌｄ（ｇｒｅｅｎ）発現カセットで置換されたＪ２Ｒ（ＴＫ）遺伝子を有する＃３３又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄにより、Ａ５４９細胞を、種々のＭＯＩで感染させた。図４６Ａでは、５０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、Ｅｍｅｒａｌｄ（ｇｒｅｅｎ）発現カセットで置換されたＪ２Ｒ（ＴＫ）遺伝子を有するキメラウイルス＃３３又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄにより、細胞を、種々のＭＯＩで感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染細胞の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。図４６Ｂでは、Ａ５４９細胞を０．０３ｐｆｕのＭＯＩで＃３３又は＃３３－（Ｈ５）により感染させ、ウイルス感染量に対するウイルス力価の増加倍数を、示す時点で測定した。 図４６Ａ～４６Ｂでは、Ｅｍｅｒａｌｄ（ｇｒｅｅｎ）発現カセットで置換されたＪ２Ｒ（ＴＫ）遺伝子を有する＃３３又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄにより、Ａ５４９細胞を、種々のＭＯＩで感染させた。図４６Ａでは、５０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、Ｅｍｅｒａｌｄ（ｇｒｅｅｎ）発現カセットで置換されたＪ２Ｒ（ＴＫ）遺伝子を有するキメラウイルス＃３３又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄにより、細胞を、種々のＭＯＩで感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染細胞の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。図４６Ｂでは、Ａ５４９細胞を０．０３ｐｆｕのＭＯＩで＃３３又は＃３３－（Ｈ５）により感染させ、ウイルス感染量に対するウイルス力価の増加倍数を、示す時点で測定した。 イメージングを示す。Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、腫瘍内部に＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）で、又はＰＢＳを注入した。週２回小動物イメージング装置（ＬａｇｏＸイメージングシステム）を使用してマウスの緑色蛍光（励起：４６５及び放出：５３０ｎｍ）を撮像し、ＡＭＩｖｉｅｗ画像処理ソフトウェアを使用してイメージング処理した。 ＡＭＩｖｉｅｗ画像処理ソフトウェアを使用して、種々の時点におけるＥｍｅｒａｌｄの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各腫瘍について算出した。注入の有無における腫瘍の平均ＭＦＩ（ｎ＝５マウス／群）を比較した。 Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝７）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、腫瘍内部に＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを１０３ＰＦＵで注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％をプロットした。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各折れ線は、個々の処理群における注入腫瘍のＳＤ付き平均体積を表す。統計手法：対応なしＴ検定、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。＊＊３３－ＧＦＰとは、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄで処理された動物を意味する。 各処理群の個々のマウスの腫瘍体積をプロットした。 両側の腫瘍のうちの１つが一定の腫瘍負荷（３０００ｍｍ３）を上回ったとき、マウスを安楽死させ、ウイルス処理群の生存曲線が、ＰＢＳ処理群の生存曲線と比較した。統計手法：Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ Ｃｏｘ）試験、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。 Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入後７及び５６日目に、ウイルス処理群の３匹のマウスを安楽死させ、それらの器官及び腫瘍を回収した。回収した器官のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、腫瘍及び器官の間で比較した。統計手法：一方向ＡＮＯＶＡ；＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＮＤ＝検出不可能。 Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入後７及び５６日目に、ウイルス処理群の３匹のマウスを安楽死させ、それらの器官及び腫瘍を回収した。回収した器官のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、腫瘍及び器官の間で比較した。統計手法：一方向ＡＮＯＶＡ；＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＮＤ＝検出不可能。 腫瘍切片（ウイルス注入後７日）をワクシニアウイルスについて染色した。暗い染色は腫瘍切片中のウイルスに感染した領域を表す。各切片は別々のマウス由来である。 腫瘍切片（ウイルス注入後７日）をワクシニアウイルスについて染色した。暗い染色は腫瘍切片中のウイルスに感染した領域を表す。各切片は別々のマウス由来である。 図４９Ｄ。Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ロシュ）を使用し、アポトーシス細胞について、ウイルス注入後７日目に得た腫瘍切片を染色した。「陽性のコントロール」として、腫瘍切片を室温で１０分間、組換え型Ｄｎａｓｅ Ｉ（３００Ｕ／ｍｌ）で処理した。灰色のシグナルはアポトーシス細胞を表す。 ＯＶＣＡＲ８細胞（感染後７２時間）のインビトロ細胞毒性を示す。５０００個のＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん）細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、細胞を、キメラウイルス＃３３、又はＴＫが欠失した＃３３（＃３３／ＴＫ）、又は、ｍｉＲ１００及びＬｅｔ－７ｃ標的配列を、必須のウイルス遺伝子Ｅ９Ｌ又はＤ４Ｒに挿入された＃３３ウイルスにより感染させた。示される多重感染度（ＭＯＩ）で感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染細胞の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。 ＯＶＣＡＲ８細胞のウイルスの増殖動態を示す。ＯＶＣＡＲ８細胞を、６ウェルプレートにて、ＭＯＩ ０．０３ｐｆｕで、示されるウイルスにより感染させた。感染後２４、４８及び７２時間において、感染させたウェルから細胞ライセートを回収した。細胞ライセートのウイルス力価をプラークアッセイで測定し、ウイルス添加量に対するウイルス力価の増加倍数をプロットした。 マウスの体重変化率％を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％をプロットした。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 マウスの体重変化率％を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。マウスを週２回体重測定し、それらの体重変化率％をプロットした。各折れ線は個々のマウスの体重を表す。 腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の個々のマウスについての、ウイルス注入及び非注入腫瘍の体積をプロットした。 腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の個々のマウスについての、ウイルス注入及び非注入腫瘍の体積をプロットした。 腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の個々のマウスについての、ウイルス注入及び非注入腫瘍の体積をプロットした。 腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の個々のマウスについての、ウイルス注入及び非注入腫瘍の体積をプロットした。 腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の個々のマウスについての、ウイルス注入及び非注入腫瘍の体積をプロットした。 図５４Ａ～５４Ｂは、注入及び非注入腫瘍の平均腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の平均腫瘍体積をＳＤ付きでプロットした。図５４Ａ及び５４Ｂは、注入及び非注入腫瘍の平均腫瘍体積をそれぞれ示す。 図５４Ａ～５４Ｂは、注入及び非注入腫瘍の平均腫瘍体積を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ＰＢＳではｎ＝８、及び他の全ての群ではｎ＝５）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで、又はＰＢＳを注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。各処理群の平均腫瘍体積をＳＤ付きでプロットした。図５４Ａ及び５４Ｂは、注入及び非注入腫瘍の平均腫瘍体積をそれぞれ示す。 感染後７日の器官におけるウイルス力価を示す。ＯＶＣＡＲ８（ヒト卵巣がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割した後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルスを腫瘍内部に１０５ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の７日後にマウスを安楽死させ、これらの器官及び腫瘍を回収した。回収した器官のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、腫瘍及び器官の間で比較した。注：ウイルスは、健常な器官（肺、肝臓、卵巣、腎臓、脾臓及び脳）及び非注入腫瘍においては検出されなかった。 ＯＶＣＡＲ８腫瘍及びマウス器官におけるｍｉＲ１００を示す。ＯＶＣＡＲ８異種移植（ｎ＝３）を担持する胸腺切除ヌードマウスを安楽死させ、これらの器官及び腫瘍を回収した。回収した組織をホモジナイズし、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡが単離された。リアルタイムｐｃｒを実施しライセート中のｍｉＲ－１００のレベルを測定した。 ＯＶＣＡＲ８腫瘍及びマウス器官におけるＬｅｔ－７ｃを示す。ＯＶＣＡＲ８異種移植（ｎ＝３）を担持する胸腺切除ヌードマウスを安楽死させ、これらの器官及び腫瘍を回収した。回収した組織をホモジナイズし、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡが単離された。リアルタイムｐｃｒを実施しライセート中のＬｅｔ－７ｃのレベルを測定した。
本明細書において、個々の野生型ウイルスより優れる新規な複合型キメラポックスウイルスを生み出すような、種々のウイルス種由来の好ましい特徴を併せ持つ、キメラポックスウイルス組成物を記載する。出願人は、種々の属由来のキメラポックスウイルスを作製した。キメラオルソポックスウイルス及びパラポックスウイルスの単離株は、これらの親である個々の野生型ウイルスと比較し、ＮＣＩ６０がん細胞株のパネルにおいて優れた殺傷能力を示した。更に、ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅファミリーの種々の属由来のメンバーが抗原性を有するという好都合な事実に基づくと、本研究において作製した有力なキメラオルソポックスウイルス及び有力なキメラパラポックスウイルスは、同じ治療法において潜在的に組み合わせることにより最大の治療効果を発揮することができる。
Ｉ．定義
本明細書において、本発明の各種の実施形態及び態様が記載されるが、かかる実施形態及び態様は、例示としてのみ提供されるものであることが、当業者にとって明らかである。当業者であれば、本発明から逸脱しない範囲で、多数の変形、変更及び置換を想起する。本明細書に記載される本発明の実施形態の各種の代替的形態が、本発明の実施の際に適用できることを理解すべきである。
本明細書において用いられるセクション見出しは、編集を目的とするものに過ぎず、記載される主題を限定するものとして解釈すべきでない。限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び論文等の、本出願に引用される全ての文書又は文書の一部は、いかなる目的においてもその全開示内容を参照により本明細書に明示的に組み込む。
特に定義されない限り、本明細書において用いられる技術的及び科学的用語は通常、当業者により理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい。本明細書に記載されるものと類似の、又は同等のいかなる方法、装置及び材料も、本発明の実施において使用できる。以下の定義は、本明細書において頻繁に使用される特定の用語の理解を促進するために提供されるものであり、本開示の範囲を制限するものでない。
用語「単離する」又は「単離された」は、核酸、ウイルス又はタンパク質に適用する場合は、当該核酸、ウイルス又はタンパク質が、天然状態において会合する他の細胞成分を本質的に含まない状態であることを意味する。それは例えば、均一な状態とすることができ、また乾燥状態又は水溶液の状態であってもよい。純度及び均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学的方法を用いて測定される。調製物中に多く存在する種のタンパク質は、実質的に精製されたものである。
本明細書において用いられる「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」又は文法的な同等物は、少なくとも２つのヌクレオチドが一緒に共有結合されたものを意味する。用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそのポリマー又はこれらの相補物を指す。用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの直鎖状配列を指す。用語「ヌクレオチド」は典型的には、ポリヌクレオチドを構成する一個の単位（すなわちモノマー）を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はその修飾されたバージョンでありうる。本明細書において想定されるポリヌクレオチドの例には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、並びに一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が含まれる。該用語はまた、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾された主鎖残基若しくは結合を含む核酸を包含し、これらは合成物、天然物及び非天然物であり、これらは参照核酸と同等の結合特性を有し、またこれらは参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。かかるアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート及び２－Ｏ－メチルリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸は、非特異的な配列を含んでもよい。本明細書において、用語「非特異的な配列」は、他の何らかの核酸配列と相補的となるように設計されていないか又は部分的にのみ相補的である一連の残基を含む、核酸配列を指す。例えば、非特異的な核酸配列は、細胞又は生物と接触するときに阻害的な核酸として機能しない、一連の核酸残基である。「阻害的な核酸」とは、標的核酸（例えばタンパク質への翻訳が可能なｍＲＮＡ）に結合し、標的核酸の（例えばＤＮＡからｍＲＮＡへの）転写を減少させ、又は標的核酸（例えばｍＲＮＡ）の翻訳を減少させ、又は転写後スプライシングを変化させる（例えば一本鎖モルホリノオリゴ）ことができる核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログのポリマー）である。
「標識された核酸又はオリゴヌクレオチド」とは、核酸に結合した検出可能な標識の有無の検出により該核酸の存在が検出されうるような標識に、リンカー若しくは化学結合を介した共有結合によって又はイオン、ファンデルワールス、静電若しくは水素結合を介した非共有結合的な結合によって、、結合しているものである。あるいは、高親和性の相互作用を用いる方法もまた、一対の結合パートナーのうちの一方が他方と結合する（例えばビオチン、ストレプトアビジン）ことで、同じ結果を達成し得る。実施形態において、ホスホロチオエート核酸又はホスホロチオエートポリマー主鎖は、本明細書に開示され、また当技術分野において一般的に公知である検出可能な標識を含む。
用語「相補的な」又は「相補性」とは、ポリヌクレオチド中の核酸の、第２のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａと相補的である。相補性は、核酸の一部のみが塩基対形成に従って整合する部分的なものであってもよく、又は全ての核酸が塩基対形成に従って整合する全体的なものであってもよい。
核酸は、別の核酸配列との機能性関係に置かれるとき、「作動可能に連結」される。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として前駆配列又は分泌リーダーが発現する場合、前駆配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡはポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコード配列に作動可能に連結され、又は、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置される場合、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結」とは、広義には、連結するＤＮＡ配列が互いに近くに位置することを意味し、分泌リーダーの場合、連続的であり、読み取り相が一致することを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、好都合な制限酵素部位におけるライゲーションにより実現される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法に従い、合成されたオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
用語「遺伝子」とは、タンパク質の産生に関連するＤＮＡの部分を意味し、コード領域（リーダー及びトレーラー）の前後の領域、並びに個々のコード部分（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。リーダー、トレーラー並びにイントロンは、遺伝子の転写及び翻訳の際に必要となる制御エレメントを含む。更に、「タンパク質遺伝子生成物」とは、特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。
遺伝子に関して本明細書において用いられる用語「発現」又は「発現される」は、その遺伝子の転写及び／又は翻訳生成物を意味する。細胞内におけるＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質の該細胞により産生される量を基に測定できる。非コード核酸分子（例えばｓｉＲＮＡ）の発現レベルは、当技術分野において周知の標準的なＰＣＲ又はノーザンブロット法により検出することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８を参照されたい。
本明細書に示す「ｓｉＲＮＡ」、「小分子干渉ＲＮＡ」、「小分子ＲＮＡ」又は「ＲＮＡｉ」とは、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、該二本鎖ＲＮＡは、遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞において発現されたときに、該遺伝子又は標的遺伝子の発現を減少させ、又は阻害する能力を有する。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成する核酸の相補性部分は、典型的には、実質的又は完全な同一性を有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉは、標的遺伝子と実質的な又は完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸のことを指す。実施形態において、ｓｉＲＮＡは、細胞内の相補的なｍＲＮＡと相互作用することにより遺伝子発現を阻害し、それにより、この相補的なｍＲＮＡの発現に干渉する。典型的には、核酸は、少なくとも約１５～５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は１５～５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５～５０塩基対長である）。他の実施形態において、該長さは、２０～３０塩基のヌクレオチド長、好ましくは約２０～２５、又は約２４～２９ヌクレオチド長であり、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡの非限定的な例には、リボザイム、ＲＮＡデコイ、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び小分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）が含まれる。
用語「組換え」とは、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターについて使用されるときは、該細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種起源の核酸若しくはタンパク質の導入、又は天然の核酸若しくはタンパク質の変更によって改変されていること、又は該細胞がそのように改変された細胞に由来することを指す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然の（非組換え）形態の細胞には存在しない遺伝子を発現するか、又は、組換え細胞でなければ異常発現されるか過小発現されるか若しくは全く発現されない天然の遺伝子を、発現する。トランスジェニック細胞及び植物は、典型的には組換え手法の結果、異種遺伝子又はコード配列を発現するものである。
用語「異種」とは、核酸の部分に関して用いるときは、該核酸が、２つ以上のサブ配列を、天然において互いに同じ関係で見出されることのない関係で含むことを指す。例えば、核酸は、典型的には、組換え的に産生され、新規な機能性核酸を作り出すように並べられた、無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば１つの供給源由来のプロモーター及び他の供給源由来のコード領域）を有する。同様に、異種タンパク質は、該タンパク質が、天然において同じ関係で見出されることのない関係の２つ以上のサブ配列を含むこと（例えば融合タンパク質）を指す。
用語「外因性」とは、所定の細胞又は生物の外部に由来する分子又は物質（例えば化合物、核酸又はタンパク質）であることを指す。例えば、本明細書において言及される「外因性プロモーター」とは、それが発現される細胞又は生物に由来しないプロモーターである。逆に、用語「内因性」又は「内因性プロモーター」とは、所定の細胞又は生物に天然に存在し、又はそれに由来する分子又は物質であることを指す。
用語「単離された」とは、核酸又はタンパク質に適用されるときは、核酸又はタンパク質が、天然状態において会合する他の細内成分を本質的に含まないことを意味する。それは、例えば、均一な状態とすることができ、また乾燥状態又は水溶液の状態であってもよい。純度及び均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学的方法を用いて測定される。調製物中に存在する主な種類のタンパク質は、実質的に精製されている。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すものとして交換可能に本明細書において用いられ、該ポリマーは、実施形態では、アミノ酸からならない部分とコンジュゲートしたものであってもよい。該用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。「融合タンパク質」とは、単一の部分として組換え的に発現される、２つ以上の別々のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
用語「ペプチジル」及び「ペプチジル部分」とは、一価のペプチドを意味する。
用語「アミノ酸」は、天然に存在する、及び合成のアミノ酸、並びに、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、並びに、これらのアミノ酸が事後的に修飾されたもの、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸及びＯ－ホスホセリン等である。「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸と同じ、すなわちα炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基が結合する、基本的な化学的構造を有する化合物を指し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。かかるアナログは、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する化学物質を指す。用語「天然に存在しないアミノ酸」及び「非天然アミノ酸」とは、アミノ酸アナログ、合成アミノ酸及び天然には存在しないアミノ酸擬態物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、一般に公知の３文字表記により表記されてもよく、又は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ委員会により推奨される１文字表記により表記されてもよい。同様に、ヌクレオチドも、一般に認められる一文字表記により表記されうる。
「保存的に改変された変異体」とは、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する「保存的に改変された変異体」とは、同一の、又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝暗号の縮重のため、幾つかの核酸配列が、いずれかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定されるいずれの位置においても、コードされるポリペプチドを変更させずに、上記の対応するコドンのいずれかにコドンを改変することができる。
かかる核酸の変異は「サイレントな変異」であり、それは保存的に改変される変異の一種である。１つのポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列に関しては、あらゆる考えられる該核酸のサイレント変異が本明細書に記載されるものとする。当業者であれば、（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）各核酸コドンを、機能的に同一の分子を得るために改変できることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載されている各配列に包含されるものとする。
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、核酸、ペプチド、ポリペチド又はタンパク質配列に対する、コードされた配列中の一個のアミノ酸若しくは数％のアミノ酸を置換する、付加する若しくは欠失させる個々の置換、欠失又は付加が、「保存的に改変された変異体」であり、該改変の結果、化学的に類似のアミノ酸を有するアミノ酸に置換されることを認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換をまとめた表が当技術分野において周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を排除するものではなく、それに追加されるものである。
以下の８つの群は、互いに保存的置換となるアミノ酸を各々含むものである：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照されたい）。
用語「同一」又はパーセント「同一性」とは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈においては、同一である、又は所定の領域において所定のパーセンテージ（すなわち、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性）で同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指し、該同一性は、比較ウインドウ又は所定の領域において、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを以下に記載のデフォルトパラメータで使用して測定し、最も適合するよう配列を整列させる、又は手動によるアラインメント及び目視評価することにより行う（ＮＣＢＩウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／等を参照されたい）。かかる配列は、「実質的に同一である」といわれる。この定義はまた、試験配列の相補物を指す場合もあり、又はそれに適用される場合もある。該定義はまた、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列を包含する。後述するように、好適なアルゴリズムによりギャップ等を設けることができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域を通じて、又は、より好ましくは、５０～１００アミノ酸又はヌクレオチド長の領域を通じて存在する。
本明細書において用いられる用語「チミジンキナーゼ遺伝子」、「ＴＫ遺伝子」、「ＴＫ」、「Ｊ２Ｒ遺伝子」又は「Ｊ２Ｒ」は、組換え形態又は天然の形態のチミジンキナーゼ遺伝子又はその変異体若しくはホモログを指し、これらはチミジンキナーゼポリペプチドの活性を（例えば、チミジンキナーゼポリペプチドと比較し、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性を）維持できるチミジンキナーゼポリペプチドをコードする。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のチミジンキナーゼ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、受託番号ＤＱ１２１３９４により同定される核酸配列８３４２２～８３９５５位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４の核酸配列を含む。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号４の核酸配列である。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、変異を有する。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、部分的に欠失している。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号５の核酸配列を含む。実施形態において、チミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号５の核酸配列を含む。
本明細書において用いられる用語「Ｆ１４．５Ｌ遺伝子」、「Ｆ１４．５Ｌ配列」、「Ｆ１４．５Ｌ」等は、Ｆ１４．５Ｌポリペプチドの活性を、（例えば、Ｆ１４．５Ｌポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるＦ１４．５Ｌポリペプチドをコードする、組換え型又は天然型のＦ１４．５Ｌ遺伝子又はその変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のＦ１４．５Ｌ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、受託番号ＫＸ７８１９５３により同定される核酸配列４４４２８～４４２７９位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号６の核酸配列を含む。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号６の核酸配列である。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、変異を有する。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、部分的に欠失している。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号７の核酸配列を含む。実施形態において、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号７の核酸配列を含む。
本明細書において用いられる用語「Ｄ４Ｒ遺伝子」、「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子」等は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼポリペプチドの活性を、（例えばウラシルＤＮＡグリコシラーゼポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるウラシルＤＮＡグリコシラーゼポリペプチドをコードする、組換え型若しくは天然型のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子、又はこれらの変異体若しくはホモログのいずれかを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ遺伝子は、受託番号ＤＱ４３９８１５により同定される核酸配列１０２７２０～１０３３７６位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ遺伝子は、配列番号８の核酸配列を含む。実施形態において、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ遺伝子は、配列番号８の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「Ｅ９Ｌ遺伝子」、「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」等は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの活性を、（例えばＤＮＡポリメラーゼポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする、組換え型若しくは天然型のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子、又はこれらの変異体若しくはホモログのいずれかを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、受託番号ＡＹ２４３３１２により同定される核酸配列５６６５６～５３６３６位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、配列番号１２の核酸配列を含む。実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、配列番号１２の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子」、「ｈＮＩＳ遺伝子」、「ＮＩＳ遺伝子」等は、ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体ポリペプチドの活性を、（例えばヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体ポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体ポリペプチドをコードする、組換え型若しくは天然型のヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子、又はこれらの変異体若しくはホモログのいずれかを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子は、受託番号ＮＭ＿０００４５３により同定される核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子は、配列番号１３の核酸配列を含む。実施形態において、ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体遺伝子は、配列番号１３の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「Ｅｍｅｒａｌｄ遺伝子」、「Ｅｍｅｒａｌｄ配列」は、Ｅｍｅｒａｌｄポリペプチドの活性を、（例えばＥｍｅｒａｌｄポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるＥｍｅｒａｌｄポリペプチドをコードする、遺伝子操作された遺伝子、又はこれらの変異体を指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、Ｅｍｅｒａｌｄ配列と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、Ｅｍｅｒａｌｄは、受託番号ＫＦ２９３６６１により同定される核酸配列３２１５～３９３１位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、Ｅｍｅｒａｌｄ遺伝子は、配列番号１４の核酸配列を含む。実施形態において、Ｅｍｅｒａｌｄ遺伝子は、配列番号１４の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「ホタルルシフェラーゼ遺伝子」又は「ホタルルシフェラーゼ配列」は、ホタルルシフェラーゼポリペプチドの活性を、（例えばホタルルシフェラーゼポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるホタルルシフェラーゼポリペプチドをコードする、組換え型若しくは天然型のホタルルシフェラーゼ遺伝子、又はこれらの変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のホタルルシフェラーゼ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、受託番号ＫＦ９９０２１４により同定される核酸配列３１２９～４７８１位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、配列番号１５の核酸配列を含む。実施形態において、ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、配列番号１５の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子」又は「ｍＣｈｅｒｒｙ配列」は、ｍＣｈｅｒｒｙポリペプチドの活性を、（例えばｍＣｈｅｒｒｙポリペプチドと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持できるｍＣｈｅｒｒｙポリペプチドをコードする、組換え型若しくは天然型の該遺伝子、又はこれらの変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子と比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、受託番号ＫＸ４４６９４９により同定される核酸配列１０７３～１７８３位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、配列番号１６の核酸配列を含む。実施形態において、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、配列番号１６の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「Ｈ５プロモーター」、「Ｈ５」等は、Ｈ５プロモーターの活性を、（例えばＨ５プロモーターと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持する、組換え型若しくは天然型のＨ５プロモーター、又はこれらの変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のＨ５プロモーターと比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、受託番号ＦＪ３８６８５２により同定される核酸配列７～７６位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の核酸配列を含む。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の核酸配列である。
本明細書において用いられる用語「ＳＥプロモーター」、「ＳＥ」等は、ＳＥプロモーターの活性を、（例えばＳＥプロモーターと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持する、組換え型若しくは天然型のＳＥプロモーター、又はこれらの変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然のＳＥプロモーターと比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、ＳＥプロモーターは、配列番号１９の核酸配列を含む。実施形態において、ＳＥプロモーターは、配列番号１９の核酸配列を含む。
本明細書において用いられる用語「１１Ｋプロモーター」、「１１Ｋ」等は、１１Ｋプロモーターの活性を、（例えば１１Ｋプロモーターと比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持する、組換え型若しくは天然型の１１Ｋプロモーター、又はこれらの変異体若しくはホモログを指す。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続する核酸部分）にわたり、天然の１１Ｋプロモーターと比較し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有する。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、受託番号ＫＦ１７９３８５により同定される核酸配列４０７３４～４０７７１位に該当する核酸配列、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の核酸配列を含む。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の核酸配列である。
抗体は、大型の（約１５０，０００の分子量又は約１３２０アミノ酸の）、複雑な内部構造を有する複合分子である。天然の抗体分子は、２対の同一のポリペプチド鎖（１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する各対）を含む。各軽鎖及び重鎖は、標的抗原との結合に関与する可変（「Ｖ」）領域、及び免疫系の他の成分と相互作用する定常（「Ｃ」）領域、の２つの連続する領域からなる。軽鎖及び重鎖可変領域は、３次元空間においては一緒になり、抗原（例えば細胞表面上の受容体）と結合する可変領域を形成する。各軽鎖又は重鎖可変領域内には、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短い部分（平均１０アミノ酸長）が存在する。抗体可変ドメインの６つのＣＤＲ（軽鎖由来が３、及び重鎖由来が３）は、３次元空間においては一緒に折り畳まれ、標的抗原上にドッキングする実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置及び長さは、正確には、Ｋａｂａｔ、Ｅ．ら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３，１９８７）により定義される。ＣＤＲに含まれない可変領域の部分は、フレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれ、これらはＣＤＲのための環境を形成する。
用語「抗体」は、当技術分野において一般に公知の意味に従い用いられる。抗体は、例えば、インタクトなイムノグロブリンとして存在する、又は種々のペプチダーゼによる消化によって産生され、十分に特徴づけられた幾つかの断片として存在する。したがって、例えばペプシンで、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化することにより、Ｆ（ａｂ）’２という、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ－ＣＨ１に連結されている軽鎖であるＦａｂのダイマーが産生される。Ｆ（ａｂ）’２は穏やかな条件下で還元されることでヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域部分を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編集、第３版、１９９３を参照されたい）。各種の抗体断片は、インタクトな抗体の消化物として定義される一方で、当業者であれば、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることにより、かかる断片を新たに合成できることを理解する。したがって、本明細書において用いられる用語「抗体」には、全長抗体の改変により産生される抗体断片、又は、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成されたもの（例えば単鎖Ｆｖ）、又は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）が包含される。
例示的な免疫クロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、２対の同一のポリペプチド鎖（１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を各対が有する）からなる。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語「可変軽鎖」（ＶＬ）及び「可変重鎖」（ＶＨ）は、各々、これらの軽鎖及び重鎖を指す。Ｆｃ（すなわち断片結晶性領域）は、免疫クロブリンの「基部」又は「尾部」であり、典型的には、抗体の種類に応じて、２つ又は３つの不変ドメインを形成する２つの重鎖からなる。Ｆｃ領域は、特定のタンパク質に結合することにより、各抗体が所定の抗原に対する適切な免疫応答を生じさせることを確実にする。Ｆｃ領域はまた、Ｆｃ受容体のような各種の細胞受容体、及び補体タンパク質のような他の免疫分子と結合する。
本明細書において提供される用語「抗原」は、本発明で提供される抗体の結合ドメインに対して結合できる分子を指す。本明細書において提供される「抗原結合ドメイン」は、抗原（エピトープ）と結合する抗体中の領域である。上記の通り、抗原結合ドメインは、広義には、各重鎖及び軽鎖の１つの不変ドメイン及び１つの可変ドメイン（それぞれＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１）からなる。パラトープ又は抗原結合部位は、抗原結合ドメインのＮ末端上に形成される。抗原結合ドメインの２つの可変ドメインは、典型的には抗原上のエピトープと結合する。
抗体は、例えばインタクトなイムノグロブリンとして存在するか、又は種々のペプチダーゼによる消化により産生されて十分に特徴づけられた幾つかの断片として存在する。したがって、例えばペプシンで、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下流で抗体を消化することにより、Ｆ（ａｂ）’２という、それ自体がジスルフィド結合によりＶＨ－ＣＨ１に連結されている軽鎖であるＦａｂのダイマーが産生される。Ｆ（ａｂ）’２は穏やかな条件下で還元されることでヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域部分を有する抗原結合部位である（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編集、第３版、１９９３を参照されたい）。各種の抗体断片は、インタクトな抗体の消化物として定義される一方で、当業者であれば、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによりかかる断片を新たに合成できることを理解する。したがって、本明細書において用いられる用語「抗体」には、全長抗体の改変により産生される抗体断片、又は、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成されたもの（例えば単鎖Ｆｖ）、又は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）が包含される。
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、典型的には、免疫クロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、１０～約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結されている。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンがリッチであり、また可溶性のためにセリン又はトレオニンがリッチでありうる。リンカーは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを連結するものであってもよく、又はその逆であってもよい。
抗体のエピトープは、その抗原中の、該抗体が結合する領域である。２つの抗体は、各々がその他の抗原の結合を競争的に阻害（ブロック）する場合には、同じ又は重複するエピトープと結合する。すなわち、１つの抗体の１×、５×、１０×、２０×又は１００×過剰は、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照されたい）で測定したとき、少なくとも３０％、好ましくは５０％、７５％、９０％又は９９％、他の抗体の結合を阻害する。あるいは、１つの抗体の結合を減少させ、又は排除する実質的に全ての抗原中のアミノ酸変異が、他の抗体の結合も減少させ、又は排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を減少させ、又は排除する幾つかのアミノ酸変異が、他の抗体の結合を減少させ、又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
本発明の適切な抗体の調製のため、また本発明に記載の使用（例えば組換え、モノクローナル又はポリクローナル抗体）のため、当技術分野において公知の多くの技術が使用できる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７、１９７５、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ．７７－９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、並びにＧｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）を参照されたい）。目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることが可能であり、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子はハイブリドーマからクローニングでき、組換え型モノクローナル抗体の産生に使用できる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子のライブラリーは、ハイブリドーマ又は形質細胞から作製することもできる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組合せにより、種々の抗原特異性を有する抗体の大規模なプールを生成できる（例えば、Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版、１９９７）を参照されたい）。単鎖抗体又は組換え型抗体の産生の技術により、本発明のポリペプチドに対する抗体の産生を最適化できる（米国特許４９４６７７８号明細書、同第４８１６５６７号明細書）。また、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物のような他の生物を用いることで、ヒト化抗体又はヒト抗体を発現させることができる（例えば、米国特許第５５４５８０７号明細書、同第５５４５８０６号明細書、同第５５６９８２５号明細書、同第５６２５１２６号明細書、同第５６３３４２５号明細書、同第５６６１０１６明細書、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい）。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いることで、選択された抗原と特異的に結合する抗体及びヘテロマーのＦａｂ断片を同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）を参照されたい）。二重特異性の、すなわち２つの異なる抗原を認識できる抗体を作製することもできる（例えば、国際公開第９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９、１９９１、及びＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照されたい）。抗体は、ヘテロコンジュゲート（例えば、２つの共有結合した抗体又は免疫毒素複合体）であってもよい（例えば、米国特許第４６７６９８０号明細書、国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号明細書を参照されたい）。
「抗体に特異的（又は選択的）に結合する」又は「特異的（又は選択的）に免疫反応性を有する」という句は、タンパク質又はペプチドに関するときは、多くの場合、タンパク質及び他の生物学的物質の不均一な集団中で、その結合反応が当該タンパク質の存在に対して決定的であることを指す。すなわち、所定の免疫学的アッセイ条件で、特定の抗体が、特定のタンパク質に対して、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍以上結合する。かかる条件での抗体との特異的な結合は、典型的には、特定のタンパク質に対するその特異性に基づき選択された抗体を必要とする。例えば、選択された抗原に対する特異的な免疫反応性を有し、他のタンパク質に対しては有さない抗体のサブセットのみを得るよう、ポリクローナル抗体を選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することにより可能となる。様々な免疫学的アッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質との特異的免疫反応性を有する抗体を選択してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫学的アッセイは、タンパク質との特異的免疫反応性を有する抗体を選択するためにルーチン的に用いられる（例えば、免疫学的アッセイフォーマット、及び特異的免疫活性の測定に使用できる条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。
「接触」とは、その明白な通常の意味に従い使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば生体分子又は細胞を含む化学的物質）を、反応させるか、相互作用させるか、又は物理的に触れさせるために、十分に近づけるプロセスを指す。しかしながら、反応生成物は、添加した試薬間の反応から直接に得られるもの、又は添加した１つ又は複数の試薬から反応混合物中で生成しうる中間体から得られるものであることを、理解すべきである。
用語「接触している」は、２つの種を反応させるか、相互作用させるか、又は物理的に接触させることを含んでもよく、その際、該２つの種は、例えば本明細書に記載される抗体ドメイン及び抗体結合ドメインであってもよい。実施形態において、該接触には、例えば、本明細書に記載される抗体ドメインを、抗体結合ドメインと相互作用させることが含まれる。
「患者」又は「それを必要とする被験者」とは、本明細書において提供される組成物又は医薬組成物の投与により治療できる疾患又は症状に罹患する、又はそのような傾向を有する、生物体のことを指す。非限定的な例には、ヒト、他の哺乳動物、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、及びその他の非哺乳動物が含まれる。幾つかの実施形態において、患者はヒトである。
用語「疾患」又は「症状」とは、本明細書において、提供される化合物又は方法で治療されうる患者又は被験者の、状態又は健康状態のことを指す。疾患は、がんでありうる。幾つかの更なる例において、「がん」とは、ヒトのがん及び癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、白血病を指し、固形がん及びリンパがん、腎臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、結腸がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、脳がん、頭頸部がん、皮膚がん、子宮がん、精巣がん、膠腫、食道がん、並びに肝臓癌等の肝がん、Ｂ急性リンパ芽球リンパ腫等のリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えばバーキット、小細胞及び大細胞リンパ腫）、ホジキンリンパ腫、白血病（ＡＭＬ、ＡＬＬ及びＣＭＬを含む）又は多発性骨髄腫が挙げられる。
本明細書において、用語「がん」は、哺乳動物（例えばヒト）で見られる全ての種類のがん、新生物又は悪性腫瘍を指し、白血病、癌腫及び肉腫が含まれる。本明細書において提供される化合物又は方法で治療されうるがんの例には、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫が含まれる。
用語「白血病」は、広義には造血器官の進行性の悪性疾患を指し、血液及び骨髄における白血球及びその前駆体の異常な増殖及び発生により主に特徴づけられる。白血病は通常、（１）疾患の期間及び特徴（急性又は慢性）、（２）関与する細胞のタイプ（骨髄（骨髄性）、リンパ球（リンパ行性）又は単核球性）、及び（３）血液中の細胞数の異常な増加又は非増加（白血球増殖又は無白血性（亜白血性））、を基礎として臨床的に区分される。本明細書において提供される化合物又は方法で治療されうる白血病の例には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血性白血病、白血球血症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛状細胞性白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性の白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞白血病、肥胖細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性の顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、Ｎａｅｇｅｌｉ型白血病、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞の白血病、前骨髄球白血病、Ｒｉｅｄｅｒ細胞白血病、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇの白血病、幹細胞性白血病、亜白血病又は未分化細胞白血病、が含まれる。
用語「肉腫」とは通常、胎生期結合組織のような物質により形成される腫瘍を意味し、通常、繊維状物質又は均質な物質に埋め込まれた密に圧縮された細胞から構成される。本明細書において提供される化合物又は方法で治療されうる肉腫には、軟骨肉腫、繊維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、Ａｂｅｍｅｔｈｙの肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、蜂窩性軟部肉腫、エナメル芽細胞の肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキンの肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽細胞肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽細胞肉腫、Ｊｅｎｓｅｎの肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球肉腫、ラウス肉腫、血清嚢胞性肉腫、滑膜肉腫又は毛細血管拡張性肉腫、が含まれる。
用語「黒色腫」は、皮膚及び他の器官の色素細胞系から生じる腫瘍を意味するものとする。例えば、本明細書において提供される化合物又は方法で治療されうる黒色腫には、肢端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、Ｃｌｏｕｄｍａｎの黒色腫、Ｓ９１黒色腫、Ｈａｒｄｉｎｇ－Ｐａｓｓｅｙ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪甲下黒色腫又は表在拡大型黒色腫、が含まれる。
用語「癌」は、周辺の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向のある上皮細胞から構成される悪性の新生増殖物を意味する。例えば、本明細書において提供される化合物又は方法で治療されうる癌の例には、髄様甲状腺癌、家族性髄様甲状腺癌、小葉癌、小葉性癌、腺様嚢胞性癌、腺様嚢胞癌、腺腫性癌、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌、基底細胞性癌、類基底細胞癌、基底鱗状細胞癌、気管支肺胞癌、細気管支癌、気管支癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様癌（ｃｏｌｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、面疱癌、体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円筒状癌、円筒細胞癌、腺管癌、緻密癌、胚性癌、脳様癌、類表皮癌、アデノイド上皮癌、外方増殖性癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｒａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠質癌、巨細胞癌、巨細胞性癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母基癌、血液様癌、肝癌、Ｈｕｒｔｈｌｅ細胞癌、硝子体癌、過剰腎癌、幼児性胚性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒの癌、Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟癌、粘液性癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液細胞性腺癌、粘液性類表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌、粘液腫様癌、上咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、髄質様癌、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、馬鈴薯様癌、スピンドル細胞癌、紡錘体細胞癌、海綿癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、紐状癌、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌、疣状癌又は絨毛癌が含まれる。
用語「関連する」又は「と関連する」とは、（例えばがん、喘息、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、関節炎、ブドウ膜炎、壊疽性膿皮症又は結節性紅斑等の）疾患と関連する物質、又は物質の活性若しくは機能の文脈においては、該物質、又は該物質の活性若しくは機能により、該症状が（全体又は一部）生じる、又は該疾患の徴候が（全体又は一部）生じることを指す。
本明細書において、用語「免疫チェックポイント」、「免疫チェックポイントタンパク質」又は「チェックポイントタンパク質」は、交換可能に用いられ、生理的免疫応答の期間及び程度を調節できる（例えば、持続的な免疫細胞活性化を減衰させ及び／又は除去する、すなわち通常の免疫ホメオスタシスを制御する）組成物（分子）を参照するものとして定義される。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫応答を刺激（増強）できる。実施形態において、チェックポイントタンパク質は、細胞の受容体である。刺激性チェックポイント分子の例には、限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー（例えばＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、糖質コルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）及びＣＤ１３７）、Ｂ７－ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバー（例えばＣＤ２８自体及び誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ））が包含される。あるいは、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫応答を阻害（低減）するものであってもよい。阻害的なチェックポイント分子の例には、限定されないが、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー免疫クロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３及びＴ細胞活性化（ＶＩＳＴＡ）タンパク質のＶ－ドメイン免疫クロブリンサプレッサー、が含まれる。
同様に、本明細書において提供される「免疫チェックポイント阻害剤」又は「チェックポイント阻害剤」は、阻害剤がない場合のチェックポイントタンパク質の活性又は機能と比較して、チェックポイントタンパク質の活性又は機能を阻害し、負の影響（例えば低下）をもたらす（例えば発現を減少させ、又はチェックポイントタンパク質の活性を低下させる）物質（例えば抗体又はその断片、小分子等の物質）を指す。チェックポイント阻害剤は、少なくとも部分的に、一部若しくは全部において、刺激をブロックし、活性化を低減、防止若しくは遅延させ、又はシグナル伝達若しくは酵素活性を不活性化し、感度を低下させ、若しくは下方制御し、又はチェックポイントタンパク質の量を減少させる。チェックポイント阻害剤は、例えば、チェックポイントタンパク質と結合し、一部若しくは全部においてブロックし、活性を低下させ、阻害し、遅延させ、不活性化し、感度を低下させ、又は下方制御することにより、チェックポイントタンパク質を阻害することができる。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗体断片である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗体変異体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ｓｃＦｖである。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＬＡＧ－３抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＩｇＧ１ｋ抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＤ２５抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、抗ＩＬ２Ｒ抗体である。実施形態において、チェックポイント阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの一部を形成する。チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、タリモゲン、ラヘルパレプベク、ドゥルバルマブ、ダクリズマブ、アベルマブ及びアテゾリズマブが含まれる。
本明細書において用いられる用語「異常な」とは、標準とは異なることを指す。異常とは、酵素活性に言及する際に使用するときは、通常のコントロール又は通常の発症していないコントロール試料の平均的なものと比較し、強い、又は弱い活性であることを指す。異常な活性とは、疾患をもたらす程度の活性を指し、その場合、（例えば本明細書に記載される方法を用いて）異常な活性を通常の、又は疾患に関連しない程度に戻すことにより、疾患又は１つ又は複数の病徴の低減がもたらされる。
「コントロール」又は「標準コントロール」とは、試験用サンプル、測定又は値の比較用の、参照（通常既知の参照物）としてのサンプル、測定又は値のことを指す。例えば、試験用サンプルは、所定の疾患（例えばがん）の疑いのある患者から採取され、公知の健常な（発症していない）個体（例えば標準的コントロール被験者）と比較することができる。標準コントロールはまた、所定の疾患がない類似の個体（例えば標準コントロール被験者）の集団、例えば、類似の医療的バックグラウンド、同じ年齢、同等の体重等を有する健常な個体（すなわち標準的なコントロール集団）から収集した測定値又は値の平均値を表すこともできる。標準コントロール値は、同じ個体から、例えば疾患が発症する前の患者から事前に得たサンプルから得ることもできる。例えば、コントロールを利用することで、薬理学的データ（例えば半減期）又は治療的手段（例えば副作用の比較）に基づく治療的利益を比較することができる。コントロールはまた、データの有意性を決定するためにも重要である。例えば、所定のパラメータ値がコントロールにおいて大きく変動する場合、試験サンプルの変動は有意であるとはみなされない。当業者であれば、標準コントロールがいかなる数値的パラメータ（例えばＲＮＡレベル、タンパク質レベル、特定の細胞型、特定の体液、特定の組織、滑膜細胞、滑液、滑液組織、線維芽細胞様の滑膜細胞、マクロファージ様の滑膜細胞等）の評価用にも設計できることを認識する。
当業者であれば、いずれの標準コントロールが所定の状況において最適かについて理解し、標準コントロール値との比較に基づきデータを分析することが可能である。標準コントロールはまた、データの有意性（例えば統計的有意差）を決定するためにも重要である。例えば、所定のパラメータ値が標準コントロールにおいて大きく変動する場合、試験サンプルの変動は有意であるとは考えられない。
用語「診断」とは、疾患（例えばがん）が被験者に存在する相対的確率を指す。同様に、用語「予後」とは、特定の将来の結果が、ある疾患状態に関して被験者に生じうるという相対的確率に関する。例えば、本発明の文脈では、予後とは、個体が疾患（例えばがん）を呈する可能性、又は疾患において予想される重症度（例えば疾患の持続期間）に関する。医療診断分野の当業者が理解するように、この用語は絶対的な意味を有するものではない。
「生体サンプル」又は「サンプル」とは、被験者又は患者から得られる材料、又はこれらに由来する材料を指す。生体サンプルには、生検及び剖検サンプルのような組織の一部、並びに組織学的目的で採取された凍結切片が含まれる。かかるサンプルには、血液及び血液分画又は製剤（例えば血清、血漿、血小板、赤血球等）のような体液、痰、組織、培養細胞（例えば初代培養、移植片及び形質転換細胞）便、尿、滑液、関節組織、滑液組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞等が含まれる。生体サンプルは、典型的には真核生物から、例えば霊長類（例えばチンパンジー又はヒト）、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類（例えばモルモット、ラット、マウス）、ウサギのような哺乳類、又は鳥類、爬虫類、若しくは魚類から得られる。
本明細書中で使用する「細胞」とは、そのゲノムＤＮＡを保存又は複製するのに十分な代謝機能、又は他の機能を実施している細胞を指す。細胞は、例えばインタクトな細胞膜の存在、特定の色素による染色、子孫細胞を産生する能力、又は（生殖細胞の場合には）第２の生殖細胞と組み合わさって生存可能な子孫を産生する能力を含む、当技術分野における周知の方法により同定することができる。細胞には、原核細胞及び真核細胞が含まれうる。原核細胞には、細菌が包含されるがこれに限定されない。真核細胞には、酵母細胞、並びに動植物に由来する細胞（例えば哺乳動物、昆虫（例えばスポドプテラ）及びヒトの細胞）が含まれるが、これらに限定されない。細胞は、これらが通常は接着性を有さない場合、又は表面上に接着させないための処理（例えばトリプシン処理）を行った場合に、使用可能となりうる。
用語「複製」とは、その明白な通常の意味に従い使用され、すなわち細胞又はウイルスが子孫を産生する能力を指す。当業者にとっては自明ではあるが、用語「複製」は、ＤＮＡに関連して使用されるとき、１つの元のＤＮＡ分子から２つの同一のＤＮＡレプリカを産生する生物学的プロセスを指す。したがって、用語「複製」には、子孫細胞に承継され、再感染することが含まれる。実施形態において、本明細書において提供されるキメラポックスウイルスは、その親ウイルスと比較し、腫瘍溶解活性が高い。実施形態において、腫瘍溶解活性（感染した細胞の細胞死を誘導する能力）は、親ウイルス（本明細書において提供されるキメラウイルスの作成に用いられるウイルスの１つ）の腫瘍溶解活性と比較し、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００、１００００、１００００倍以上高い。
本明細書において用いられる「相乗的量」とは、第１量（例えば第１キメラポックスウイルス量）と第２量（例えば第２キメラポックスウイルス量）を合計することにより、相乗効果（すなわち相加効果より高い効果）が得られることを指す。したがって、用語「相乗効果」、「相乗作用」、「相乗的」、「複合的相乗的量」及び「相乗的治療効果」は、本明細書において交換可能に使用され、キメラポックスウイルスを共投与したときの効果を測定した結果、その測定された効果が、単剤として各キメラポックスウイルスを単独で投与したときの個別的な効果の合計よりも高いことを指す。
実施形態において、相乗的量は、第２キメラポックスウイルスとは別個に使用した場合の、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の第１キメラポックスウイルス量でありうる。実施形態において、相乗的量は、第１キメラポックスウイルスとは別個に使用した場合の、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の第２キメラポックスウイルス量であってもよい。
用語「ウイルス」又は「ウイルス粒子」とは、ウイルス学上の明白な通常の意味に従い使用され、ウイルスのゲノム（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、単鎖、二本鎖）、ウイルス性キャプシド及び関連タンパク質を含むウイルス粒子を指し、エンベロープ型ウイルス（例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルス）の場合、脂質、任意の宿主細胞膜成分、及び／又はウイルスタンパク質を含むエンベロープを指す。
用語「ポックスウイルス」は、ウイルス学上その明白な通常の意味に従い使用され、脊椎動物及び無脊椎動物に感染し、これらの宿主細胞質中で複製する能力を有するポックスウイルスのファミリーのメンバーを指す。実施形態において、ポックスウイルスイルス粒子は、直径約２００ｎｍ及び長さ約３００ｎｍのサイズを有し、典型的には１３０～３７５ｋｂの、単一の、直鎖状の、二本鎖のＤＮＡセグメントの形態のゲノムを有する。用語ポックスウイルスには、全てのｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ属のウイルスが含まれる（例えば、ベタントモ（ｂｅｔａｅｎｔｏｍｏ）ポックスウイルス、ヤタ（ｙａｔａ）ポックスウイルス、セルビド（ｃｅｒｖｉｄ）ポックスウイルス、ガンマエントモ（ｇａｍｍａｅｎｔｏｍｏ）ポックスウイルス、レポリ（ｌｅｐｏｒｉ）ポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシ（ｍｏｌｌｕｓｃｉ）ポックスウイルス、クロコディリド（ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｄ）ポックスウイルス、アルファエントモ（ａｌｐｈａｅｎｔｏｍｏ）ポックスウイルス、カプリポックスウイルス、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス及びパラポックスウイルスが挙げられる）が、特に限定されない。実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ウシポックスウイルス、サルポックスウイルス）、パラポックスウイルス（例えば、羊鵞口瘡ウイルス、偽ウシポックスウイルス、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）、ヤタポックスウイルス（例えば、タナポックスウイルス、ヤバ（ｙａｂａ）サル腫瘍ウイルス）、又は、モルシポックスウイルス（例えば伝染性軟属腫ウイルス）である。実施形態において、ポックスウイルスは、オルソポックスウイルス（例えば、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株）である。実施形態において、ポックスウイルスは、パラポックスウイルス（例えばオルフウイルスＮＺ２株又は偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株）である。
キメラポックスウイルスの文脈で使用される用語「キメラ」は、ウイルス学上の明白な通常の意味に従い使用され、２つ以上の異なる微生物（例えば、同じサブファミリー由来の２つのウイルス、異なるサブファミリー由来の２つのウイルス）由来の核酸断片を連結することによって作製されるハイブリッド微生物（例えばキメラポックスウイルス）を指す。実施形態において、組み合わせる少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片は、複製に必要な必須遺伝子を含む。実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株の１つ由来の核酸断片は、複製に必要な必須遺伝子を含む。本明細書において提供されるこれらの実施形態に係るキメラポックスウイルスは、１つ又は複数の導入遺伝子（すなわち天然のウイルスゲノムには存在しない核酸配列）を含んでもよい。例えば、本明細書において提供されるこれらの実施形態に係るキメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列、核酸結合配列、検出可能部分をコードする核酸配列又はこれらの任意の組合せを含んでもよい。実施形態において、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列、核酸結合配列及び検出可能部分をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列及び検出可能部分をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、核酸結合配列及び検出可能部分をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、抗がん核酸配列及び核酸結合配列を含む核酸配列を含む。
用語「プラーク形成単位」とは、ウイルス学上の明白な通常の意味に従い使用され、ウイルス粒子の体積当たりの、細胞単層に形成されうるプラークの量を指す。幾つかの実施形態において、前記単位は、感受性細胞の単層に感染させたときに形成されうるプラークの数に基づく。例えば、実施形態において、１，０００ＰＦＵ／μｌは、ウイルス粒子を含む溶液１μｌが、細胞単層上で１０００個の感染プラークを産生するのに十分なウイルス粒子を含むことを指す。実施形態において、プラーク形成単位は「ＰＦＵ」と略記される。
用語「多重感染度」又は「ＭＯＩ」とは、ウイルス学上の明白な通常の意味に従い使用され、感染因子（例えばポックスウイルス）の、所定の面積又は体積中の標的（例えば細胞）との比を指す。実施形態において、前記面積又は体積は同種であるとみなされる。
用語「ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、又はウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、又はウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株のゲノムに対して配列同一性（例えばウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株と比較し増減）する。ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－３０２ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。実施形態において、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号２６５８７２により同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、又はアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、又はアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株のゲノムに対して配列同一性（例えばアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株と比較し増減）する。アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－８３８ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。実施形態において、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、参照番号ＮＣ＿０２７２１３の核酸配列によりコードされるウイルス株を指す。
用語「ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、又はウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、又はウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株のゲノムに対して配列同一性（例えばウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株と比較し増減）する。ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１５９１ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。実施形態において、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号４５４１７により同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「ワクシニアウイルスＷＲ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＷＲ株、又はワクシニアウイルスＷＲ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＷＲ株、又はワクシニアウイルスＷＲ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＷＲ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ワクシニアウイルスＷＲ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＷＲ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＷＲ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＷＲ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１３５４ＴＭにより同定されるウイルス株、変異体又はそのホモログを指す。実施形態において、ワクシニアウイルスＷＲ株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号１０２５４により同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「ワクシニアウイルスＩＨＤ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＩＨＤ株、又はワクシニアウイルスＩＨＤ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＩＨＤ株、又はワクシニアウイルスＩＨＤ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＩＨＤ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＩＨＤ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＩＨＤ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１５６ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。実施形態において、ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号１０２５１により同定されるウイルス株、その変異体又はそのホモログを指す。
用語「ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、又はワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、又はワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１５４９ＴＭ変異体又はそのホモログにより同定されるウイルス株を指す。
用語「ワクシニアウイルスＣＬ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＣＬ株、又はワクシニアウイルスＣＬ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＣＬ株、又はワクシニアウイルスＣＬ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＣＬ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ワクシニアウイルスＣＬ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＣＬ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＣＬ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＣＬ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＣＬ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１７７４ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、又はワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、又はワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有する変異体を包含する。ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１１８ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「ワクシニアウイルスＡＳ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＡＳ株、又はワクシニアウイルスＡＳ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のワクシニアウイルスＡＳ株、又はワクシニアウイルスＡＳ株のゲノムに対して配列同一性（例えばワクシニアウイルスＡＳ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有するその変異体を包含する。ワクシニアウイルスＡＳ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、ワクシニアウイルスＡＳ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばワクシニアウイルスＡＳ株と比較し増減）する。ワクシニアウイルスＡＳ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＡＳ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－２０１０ＴＭにより同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「オルフウイルスＮＺ２株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型のオルフウイルスＮＺ２株、又はオルフウイルスＮＺ２株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型のオルフウイルスＮＺ２株、又はオルフウイルスＮＺ２株のゲノムに対して配列同一性（例えばオルフウイルスＮＺ２株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有する変異体を包含する。オルフウイルスＮＺ２株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、オルフウイルスＮＺ２株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えばオルフウイルスＮＺ２株と比較し増減）する。オルフウイルスＮＺ２株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、オルフウイルスＮＺ２株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－１５４８ＴＭ変異体又はそのホモログにより同定されるウイルス株を指す。実施形態において、オルフウイルスＮＺ２株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号１０２５９により同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
用語「偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株」は、一般的な、通常の意味に従い使用され、それと同じ若しくは類似の名称のウイルス株、並びにその機能性断片及びホモログを指す。前記用語は、組換え型又は天然型の偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株、又は偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株の活性を（例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以内で）維持するその変異体を包含する。前記用語は、組換え型又は天然型の偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株、又は偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株のゲノムに対して配列同一性（例えば偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株ゲノムに対して約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性）を有する変異体を包含する。偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株は、アミノ酸残基が変異した変異体を指すこともあり、それにより、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株の活性、発現、細胞ターゲティング又は感染性が変調（例えば偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株と比較し増減）する。偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株は、本明細書に記載されるように改変できる。実施形態において、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ＡＴＣＣ参照番号ＡＴＣＣ ＶＲ－６３４ＴＭ変異体又はそのホモログにより同定されるウイルス株を指す。
実施形態において、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－３０２ＴＭである。実施形態において、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－８３８ＴＭである。実施形態において、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１５９１ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＷＲ株は、ワクシニアウイルスＷＲ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１３５４ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＩＨＤ株は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１５６ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１５４９ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＣＬ株は、ワクシニアウイルスＣＬ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１７７４ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１１８ＴＭである。実施形態において、ワクシニアウイルスＡＳ株は、ワクシニアウイルスＡＳ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－２０１０ＴＭである。実施形態において、オルフウイルスＮＺ２株は、オルフウイルスＮＺ２株 ＡＴＣＣ ＶＲ－１５４８ＴＭである。実施形態において、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株 ＡＴＣＣ ＶＲ－６３４ＴＭである。実施形態において、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株は、Ｔａｘｏｎｏｍｙ参照番号２６５８７２により同定されるウイルス株、その変異体又はホモログを指す。
本開示において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法に規定する意味を有し、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「～を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる。「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法に規定する意味を有し、当該用語は、記載されるものの基礎的又は新規な特徴が、記載されるもの以外のものの存在により変化しない限りにおいて、記載される以外の他の要素の存在を許容する、オープンエンドな表現であるが、但し先行技術の実施形態を除くものである。
ＩＩ．ウイルス組成物
一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片を含む。
本明細書に記載されるキメラポックスウイルスは、導入遺伝子を含んでもよい。本明細書において、「導入遺伝子」とは、所定の細胞、生物又はウイルスの外部に由来する核酸配列を指す。したがって、本明細書において提供される導入遺伝子は、天然でないか、又はポックスウイルスの内部に由来するものではない。提供される導入遺伝子は、タンパク質をコードするものでも、又はコードしない核酸配列であってもよい。本明細書において提供される導入遺伝子は、抗がん核酸配列（例えばがんの治療のために有用なポリペプチドをコードする、核酸結合配列及び核酸配列）、又は検出可能部分をコードする核酸配列を含んでもよい。したがって、実施形態において、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスは、１つ又は複数の抗がん核酸配列又は検出可能部分をコードする核酸配列を含む。実施形態において、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスは、１つ又は複数の抗がん核酸配列及び検出可能部分をコードする核酸配列を含む。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して９９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１の配列である。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して９９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１の配列である。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号１に対して約９９％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約７９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約８９％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９０％の配列同一性を有する。
実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９１％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９２％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９３％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９４％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９５％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９６％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９７％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９８％の配列同一性を有する。実施形態において、核酸配列は、配列番号２に対して約９９％の配列同一性を有する。
核酸配列は、少なくとも７０％の配列同一性を有し、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列は、連続的であってもよい。実施形態において、核酸配列は、少なくとも７０％の配列同一性を有し、少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列は、非連続的配列であってもよい。本明細書において提供される「非連続的配列」とは、配列番号１又は配列番号２との配列同一性を有しない１つ又は複数の配列断片を含む配列を意味する。実施形態において、非連続的配列は、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する第１の配列断片、及び配列番号１又は配列番号２に対する配列同一性を有しない配列断片を介して連結した、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する第２の配列断片を含む配列である。実施形態において、非連続的配列は、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する複数の配列断片を、配列番号１又は配列番号２に対する配列同一性を有しない複数の配列断片により連結された形で含む配列である。実施形態において、キメラポックスウイルスは、ヌクレオチドの挿入、欠失又は変異を更に含む。
実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。
実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＡＳ株及びオルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、ワクシニアウイルスＡＳ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＩＨＤ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＣＬ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株又はワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、オルフウイルスＮＺ２株由来の核酸断片を含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列は、偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。本明細書において使用される腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞を標的とし、排除できるウイルスである。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、肺がん細胞を標的とする。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、卵巣がん細胞を標的とする。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、膵臓がん細胞を標的とする。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、非がん細胞と関連してがん細胞を優先して標的とする。
実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部を形成する。実施形態において、ポックスウイルスは、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む。実施形態において、ポックスウイルスは、複数のｍｉＲＮＡ結合配列を含む。実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合配列は、独立して異なる。実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合配列は、同一である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、約２２ヌクレオチド長である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、少なくとも２２ヌクレオチド長である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、２２ヌクレオチド長である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、約２２ヌクレオチド長である。実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合配列は、各々少なくとも２２ヌクレオチド長である。実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合配列は、各々約２２ヌクレオチド長である。実施形態において、複数のｍｉＲＮＡ結合配列は、各々２２ヌクレオチド長である。
一態様において、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスをコードする単離された核酸が提供される。実施形態において、単離された核酸は、配列番号１の核酸配列である。実施形態において、単離された核酸は、配列番号２の核酸配列である。
ＩＩＩ．導入遺伝子を含むウイルス組成物
本明細書において提供されるキメラポックスウイルスは、その実施形態において、導入遺伝子を含みうる。本明細書において提供されるキメラポックスウイルスに含まれる前記導入遺伝子は、それを欠くキメラポックスウイルスと比較し、キメラポックスウイルスの腫瘍溶解活性を増強することができる。導入遺伝子は更に、健常な（非がん）細胞よりもがん細胞において、キメラポックスウイルスの差別的な発現／複製を行う能力を増強することができる。キメラポックスウイルスが導入遺伝子を含むとき、キメラポックスウイルスの核酸は、抗がん核酸配列、核酸結合配列、検出可能部分をコードする核酸配列又はこれらの任意の組合せを含む。したがって、一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
一態様において、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルス ＷＲ株、ワクシニアウイルス ＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルス ＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルス ＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
一態様において、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスは提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
一態様において、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。
本明細書において、用語「抗がん核酸配列」又は「抗がん核酸配列」は、抗新生物特性、並びに／又は、がん細胞の成長若しくは増殖を阻害し、及び／若しくは、本明細書において提供される実施形態に係るキメラポックスウイルスを、健常細胞と比較して、がん細胞において、選択的に発現させる能力を有する核酸配列を指す。抗がん核酸配列は、がんの進行を阻害するものであっても、又は、該進行を一時的若しくは永久に減速させるものであってもよい。抗がん核酸配列の例には、発現されることにより、直接的又は間接的にがん細胞増殖を阻害するタンパク質をコードする配列が含まれる。例えば、本明細書において提供される抗がん核酸配列は、健常細胞と比較して、がん細胞において、高発現されるタンパク質（例えばヨウ化ナトリウムトランスポーター）をコードしてもよい。他の非限定的な例において、抗がん核酸配列は、抗腫瘍免疫応答の抑制を解除できるポリペプチド（抗体）（例えば抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその断片）をコードしてもよい。実施形態において、抗がん核酸配列は、健常細胞と比較して、がん細胞において、キメラポックスウイルスの発現／複製を増強できる核酸配列を含む。したがって、実施形態において、抗がん核酸配列を含むキメラポックスウイルスの発現（例えば転写、翻訳）速度は、がん細胞と比較して、健常細胞においては低い。実施形態において、抗がん核酸配列を含むキメラポックスウイルスは、健常細胞において、検出可能な量で発現されない。実施形態において、抗がん核酸配列は、核酸結合配列である。実施形態において、抗がん核酸配列は、核酸結合配列を含む。
本明細書において、「核酸結合配列」とは、細胞内の相補的な核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）と少なくとも部分的に結合（ハイブリダイズ）できる核酸配列を指し、該細胞内の核酸の量は、がん細胞よりも健常細胞において高い。本明細書において提供される核酸結合配列は、キメラポックスウイルスが有する核酸の一部であってもよく、またキメラポックスウイルスの遺伝子に作動可能に連結されてもよい。核酸結合配列に対する細胞内の核酸の結合により、キメラポックスウイルス遺伝子は分解（加水解離）のための標的とされ、それにより、キメラポックスウイルスの発現／複製が減少する。実施形態において、核酸結合配列は、ＤＮＡ結合配列である。実施形態において、核酸結合配列は、ＲＮＡ結合配列である。実施形態において、核酸結合配列は、ｍｉＲＮＡ結合配列である。したがって、実施形態において、抗がん核酸配列は、核酸結合配列である。実施形態において、抗がん核酸配列は、ＤＮＡ結合配列である。実施形態において、抗がん核酸配列は、ＲＮＡ結合配列である。実施形態において、抗がん核酸配列は、ｍｉＲＮＡ結合配列である。
本明細書において用いられる「検出可能部分をコードする核酸配列」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な組成物をコードする核酸配列を指す。検出可能部分をコードする核酸配列は、蛍光部分をコードしてもよい。蛍光部分の非限定的な例は、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｅｍｅｒａｌｄ及びホタルルシフェラーゼである。
一態様において、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスは提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
他の一態様において、配列番号３に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスが提供され、前記核酸配列は以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列、又は（ｉｖ）検出可能部分をコードする核酸配列。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列。実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。実施形態において、核酸断片は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片である。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列。実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。実施形態において、核酸断片は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片である。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。実施形態において、核酸断片は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片である。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、及び（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列。実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。実施形態において、核酸断片は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片である。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、及び（ｉｉｉ）１つ又は複数の核酸結合配列。実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。実施形態において、核酸断片は、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片である。
抗がん核酸配列（導入遺伝子）は、本明細書において提供される実施形態に係るキメラポックスウイルスのゲノムの一部を形成してもよい。キメラポックスウイルスゲノムは、ポックスウイルスの発現及び複製のために必要とされる遺伝子を含む。キメラポックスウイルスの発現及び複製のために必要とされる遺伝子は、本明細書において「必須遺伝子」と称される。キメラポックスウイルスの発現及び複製のために必要とされない遺伝子は、本明細書において「非必須遺伝子」と称される。抗がん核酸配列は、遺伝子への挿入によりキメラポックスウイルスゲノムに組み込まれてもよく、又は遺伝子に作動可能に連結されてもよい。抗がん核酸配列のキメラポックスウイルス遺伝子への挿入により、遺伝子（例えば非必須遺伝子）又はその一部を欠失させてもよい。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列は、キメラポックスウイルスの非必須遺伝子の一部を形成する。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列は、キメラポックスウイルスの非必須遺伝子に挿入される。実施形態において、非必須遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子である。実施形態において、非必須遺伝子は、Ｊ２Ｒ遺伝子である。実施形態において、非必須遺伝子は、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子である。
上記のように、抗がん核酸配列は、がんの治療に有用なポリペプチドをコードしうる。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はヨウ化ナトリウム共輸送体を独立にコードする。実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖである。実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖは、配列番号１７の配列を含む。実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖは、配列番号１７の配列である。実施形態において、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を含む。実施形態において、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列である。
本明細書に記載する「ＰＤ－Ｌ１」又は「ＰＤ－Ｌ１タンパク質」には、組換え型又は天然型のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、別名分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）、又は、ＰＤ－Ｌ１活性を（例えばＰＤ－Ｌ１と比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持するその変異体又はホモログが含まれる。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、天然のＰＤ－Ｌ１プロモーターと比較し、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続するアミノ酸部分）にわたり、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態において、ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９ＮＺＱ７、又はそれと実質的な同一性を有する変異体若しくはホモログにより同定されるタンパク質と実質的に同一である。
本明細書に記載の用語「ＰＤ－Ｌ１阻害剤」とは、コントロールと比較し、ＰＤ－Ｌ１の発現又はその活性レベルを検出可能な程度で低下させることができる物質（例えば、抗体、抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を指す。ＰＤ－Ｌ１の発現又は活性の阻害は、コントロールに対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の阻害であってもよい。特定の例において、前記阻害は、コントロールと比較し１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上の阻害である。ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤がない場合と比較し、例えば、少なくとも部分的に、部分的に若しくは全体的に、刺激をブロックし、活性化を減少、防止若しくは遅延させ、又はシグナル伝達を不活性化若しくは感受性を低下させ、又はＰＤ－Ｌ１の活性若しくは量を下方制御することにより、ＰＤ－Ｌ１を阻害する。
本明細書において記載する用語「ヨウ化ナトリウム共輸送体」、「ＮＩＳ」又は「ｈＮＩＳ」には、組換え型又は天然型のヨウ化ナトリウム共輸送体、又は、ヨウ化ナトリウム共輸送体活性を、（例えばヨウ化ナトリウム共輸送体と比較し少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％以内の活性で）維持するその変異体若しくはホモログが含まれる。幾つかの態様において、変異体又はホモログは、天然のヨウ化ナトリウム共輸送体と比較し、全部の配列又は一部の配列（例えば５０、１００、１５０又は２００の連続するアミノ酸部分）にわたり、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実施形態において、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９２９１１により同定されるタンパク質、又はそれと実質的な同一性を有するその変異体若しくはホモログと、実質的に同一である。実施形態において、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を含む。実施形態において、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列である。
本明細書において提供される抗がん核酸配列の発現は、プロモーターにより制御されうる。したがって、実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列は、プロモーターに各々作動可能に連結されている。実施形態において、プロモーターは、ワクシニアウイルス初期プロモーターである。実施形態において、プロモーターは、合成された初期プロモーターである。実施形態において、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を含む。実施形態において、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列である。実施形態において、プロモーターは、ワクシニアウイルス後期プロモーターである。実施形態において、プロモーターは、Ｈ５プロモーター又は１１Ｋプロモーターである。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を含む。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列である。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列を含む。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列である。
本明細書において提供される抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、特定のポックスウイルス遺伝子と機能的（作動可能に連結された）関係となるように、キメラポックスウイルスゲノムに組み込まれうる。例えば、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、ポックスウイルス遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす場合、ポックスウイルス遺伝子に作動可能に連結されている場合がある。通常、抗がん核酸配列（核酸結合配列）及びポックスウイルス遺伝子は、これらが連続的であり、及び／又は読み取り相が一致するときに、作動可能に連結されている。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、キメラポックスウイルスの必須遺伝子に作動可能に連結されている。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている。実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列（１つ又は複数の核酸結合配列）は、ｍｉＲＮＡ結合配列を独立にコードする。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、ｍｉＲ１００結合配列又はｌｅｔ７ｃ結合配列である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、ｍｉＲ１００結合配列である。実施形態において、ｍｉＲ１００結合配列は、配列番号９の配列を含む。実施形態において、ｍｉＲ１００結合配列は、配列番号９の配列である。実施形態において、ｍｉＲ１００結合配列は、配列番号１０の配列を含む。実施形態において、ｍｉＲ１００結合配列は、配列番号１０の配列である。実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合配列は、ｌｅｔ７ｃ結合配列である。実施形態において、ｌｅｔ７ｃ結合配列は、配列番号１１の配列を含む。実施形態において、ｌｅｔ７ｃ結合配列は、配列番号１１の配列である。
実施形態において、１つ又は複数の抗がん核酸配列は、第１の抗がん核酸配列及び第２の抗がん核酸配列である。本明細書において提供されるように、第１の抗がん核酸配列は、第１の核酸結合配列であってもよく、第２の抗がん核酸配列は、第２の核酸結合配列であってもよい。
実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、前記第２の抗がん核酸配列（第２核酸結合配列）は、ｍｉＲＮＡ結合配列をコードする。実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（第２核酸結合配列）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている。実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（第２核酸結合配列）は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている。
実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、第２の抗がん核酸配列は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする。実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列は、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子の一部を形成する。
実施形態において、核酸配列は、以下を含む：（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）前記検出可能部分をコードする核酸配列。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、蛍光部分をコードする。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、キメラポックスウイルスの非必須遺伝子の一部を形成する。実施形態において、非必須遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子である。実施形態において、非必須遺伝子の部分は欠失している。
実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。実施形態において、プロモーターは、ワクシニアウイルス初期プロモーターである。実施形態において、プロモーターは、合成された初期プロモーターである。実施形態において、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を含む。実施形態において、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列である。実施形態において、プロモーターは、ワクシニアウイルス後期プロモーターである。実施形態において、プロモーターは、Ｈ５プロモーター又は１１Ｋプロモーターである。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を含む。実施形態において、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列である。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列を含む。実施形態において、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列である。
一実施形態において、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１０の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
一実施形態において、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号９の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
一実施形態において、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１１の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
一実施形態において、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号９の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
一実施形態において、抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１１の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている。
一実施形態において、キメラポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子は、配列番号５の配列を有する。
一実施形態において、抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部をなし、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１４の配列を有する蛍光部分をコードし、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１５の配列を有する蛍光部分をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１５の配列を有する蛍光部分をコードし、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１５の配列を有する蛍光部分をコードし、１１Ｋプロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１６の配列を有する蛍光部分をコードし、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を有する。
一実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、配列番号１６の配列を有する蛍光部分をコードし、１１Ｋプロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、１１Ｋプロモーターは、配列番号２０の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１０の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結され、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号９の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結され、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１１の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結され、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号９の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結され、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列（核酸結合配列）は、配列番号１１の配列を有するｍｉＲＮＡ結合配列をコードし、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結され、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、キメラポックスウイルスのＦ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号７の配列を有する。
一実施形態において、抗がん核酸配列は、抗ＰＤ－Ｌ１のｓｃＦｖをコードし、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結され、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子の一部を形成し、抗ＰＤ－Ｌ１のｓｃＦｖは、配列番号１７の配列を有し、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を有する。
一実施形態において、抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子は、配列番号７の配列を有し、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有する。
一実施形態において、第１の抗がん核酸配列は、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、合成された初期プロモーターに作動可能に連結され、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列は、抗ＰＤ－Ｌ１のｓｃＦｖをコードし、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結され、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子の一部を形成し、ヨウ化ナトリウム共輸送体は、配列番号１３の配列を有し、合成された初期プロモーターは、配列番号１９の配列を有し、抗ＰＤ－Ｌ１のｓｃＦｖは、配列番号１７の配列を有し、Ｈ５プロモーターは、配列番号１８の配列を有する。
ＩＶ．キメラポックスウイルスの形成方法
他の一態様において、キメラポックスウイルスを形成する方法が提供され、前記方法は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株を含む群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成することを含む。
本明細書において提供されるキメラポックスウイルスの形成方法は、本明細書に記載される導入遺伝子（例えば抗がん核酸配列、核酸結合配列、検出可能部分をコードする核酸配列）を含むキメラポックスウイルスの形成に使用できる。
実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株は、約１．０未満の多重感染度で各々存在する。実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株は、約０．５未満の多重感染度で各々存在する。実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株は、約０．１未満の多重感染度で各々存在する。実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株は、約０．０５未満の多重感染度で各々存在する。実施形態において、少なくとも２つのポックスウイルス株は、約０．０１未満の多重感染度で各々存在する。
実施形態において、キメラポックスウイルスは、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株を含む群から選択される少なくとも２つのポックスウイルスにより細胞を感染させること、並びに少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成させることを含む方法により、形成される。
実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。
実施形態において、核酸断片は、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である。
実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びアライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びウサギポックスウイルス株Ｕｔｒｅｃｈｔにより感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＷＲ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＣＬ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＷＲ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＣＬ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＩＨＤ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＣＬ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＷＲ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＣＬ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＩＨＤ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＣＬ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＣＬ株及びワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＣＬ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＣＬ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＣＬ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＡＳ株及びオルフウイルスＮＺ２株により感染させる。実施形態において、細胞を、ワクシニアウイルスＡＳ株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。実施形態において、細胞を、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染させる。
実施形態において、細胞は腎臓線維芽細胞である。実施形態において、細胞は上皮細胞である。実施形態において、細胞はＣＶ－１細胞である。実施形態において、細胞はウシ腎臓上皮細胞である。
Ｖ．医薬組成物
一態様において、治療有効量の、実施形態を含む本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを含む、医薬組成物が提供される。実施形態において、キメラポックスウイルスは、導入遺伝子（例えば抗がん核酸配列、核酸結合配列、検出可能部分をコードする核酸配列又はこれらの任意の組合せ）を含む。
「薬学的に許容される賦形剤」及び「薬学的に許容される担体」とは、被験者への活性薬剤の投与及び吸収を補助し、患者に対する顕著な毒性的な副作用を生じさせずに本発明の組成物に含めることができる物質のことを指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、水、ＮａＣｌ、生理食塩液、乳酸添加リンガー液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑油、コーティング、甘味料、風味剤、塩溶液（例えばリンガー液）、アルコール、油脂、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はデンプンのような炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン及び色素等が含まれる。かかる調製物は殺菌することができ、必要に応じて、助剤（例えば潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、色素、及び／又は本発明の化合物と有害な反応をしない芳香剤等）と混合することができる。当業者であれば、他の医薬賦形剤が本発明に有用であることを認識する。
本明細書において提供される実施形態に係るキメラポックスウイルス組成物は、経口的に、胃腸内に、又は直腸内に投与されうる。投与は、単回のボーラス投与の形式で行ってもよく、又は、例えば連続的に灌流ポンプにより行ってもよい。実施形態において、本明細書において提供されるキメラポックスウイルスは、１つ又は複数の賦形剤（例えば崩壊剤、充填剤、流動促進剤又は防腐剤）と組み合わされる。実施形態において、本明細書において提供されるキメラポックスウイルスは、カプセルの一部を形成する。好適なカプセルには、ハードシェルカプセル又はソフトシェルカプセルが含まれる。いかなる脂質ベースの、又はポリマーベースのコロイドを用いてカプセルを形成してもよい。コロイド状調製物のために有用な例示的なポリマーには、カラゲナン及び修飾型デンプン及び修飾型セルロース、例えばヒプロメロースのようなゼラチン、植物性多糖類又はこれらの誘導体が含まれる。任意選択的に、その他の成分として、ゲル化剤溶液に対し、例えばカプセルの硬度を低下させるためのグリセリン及び／又はソルビトールのような可塑剤や、着色剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤及び表面処理剤を添加してもよい。
キメラポックスウイルス組成物は、用量当たり最小のウレアーゼ活性を有する、例えば約０．００５ｍｇ～約２０００ｍｇの所定のキメラポックスウイルスを各々含む単位投与形態で製剤化することができる。用語「単位投与形態」は、ヒト被験者やその他の哺乳動物への単位投与に適する単位に物理的に分離したものを指し、各単位は、適切な薬剤担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含有する。錠剤のような固体組成物を調製するためには、主な活性成分を医薬賦形剤と混合し、本発明の化合物の均質混合物を含む固体状の製剤化前組成物を形成する。これらの製剤化前組成物が均質であるということは、典型的には活性成分が組成物の全体にわたって均一に分散していることにより、組成物が、錠剤、ピル及びカプセルのような等しい効果を有する単位投与形態に直ちに再分割できるということを指す。
幾つかの実施形態において、本発明の錠剤又はピルはコーティングすることができ、又は、その他の形態として、長時間持続型の投与形態に製剤化することができる。例えば、錠剤又はピルは、内側薬剤層と、それに対するエンベロープを形成する外側薬剤層とを有することができる。２つの成分を腸溶性層により分離することにより、胃内での分解への耐性を付与し、それにより内側の成分をインタクトな状態で十二指腸内を通過させ、又は遅延放出させることが可能となる。かかる腸溶性層又はコーティングには各種の物質が使用され、かかる物質としては、複数のポリマー性の酸、並びにポリマー性の酸とシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロース等の物質との混合物が挙げられる。
本発明の組成物が、経口投与又は注入投与用に取り込まれる液体の形態としては、水溶液、適切に香味を付与されたシロップ、水性又は油性懸濁液、並びに綿実油、ゴマ油、ココナッツ油若しくはピーナッツ油のような食用油を使用し香味を付与されたエマルション、並びにエリキシル剤及び同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
ＶＩ．治療方法
他の一態様において、がんの治療を必要とする被験者のがんを治療する方法が提供され、前記方法は、被験者に、治療有効量の、実施形態を含む本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを投与することにより、被験者のがんを治療することを含む。実施形態において、前記がんは、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫である。実施形態において、がんは乳がんである。実施形態において、がんは結腸がんである。実施形態において、がんは腎臓がんである。実施形態において、がんは白血病である。実施形態において、がんは肺がんである。実施形態において、がんは黒色腫である。実施形態において、がんは卵巣がんである。実施形態において、がんは前立腺がんである。実施形態において、がんは膵がんである。実施形態において、がんは脳がんである。実施形態において、がんは肝がんである。実施形態において、がんは胃がんである。実施形態において、がんは肉腫である。実施形態において、がんはトリプルネガティブ乳がんである。
実施形態において、投与することは、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスを投与することを含む。実施形態において、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスは、組み合わせた相乗的な量で投与される。実施形態において、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスは、同時に投与される。実施形態において、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスは、順次投与される。
実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０５プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０６プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０７プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、少なくとも１０８プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。
実施形態において、ポックスウイルスは、１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０５プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０６プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０７プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０８プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。
実施形態において、ポックスウイルスは、約１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、約４×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、４×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、約５×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。実施形態において、ポックスウイルスは、５×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される。
一態様において、細胞の細胞増殖を阻害する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載されるキメラポックスウイルスを細胞に接触させることを含む。実施形態において、細胞はがん細胞である。実施形態において、がん細胞は乳がん細胞、結腸がん細胞、腎臓がん細胞、白血病細胞、肺がん細胞、黒色腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、膵がん細胞、脳がん細胞、肝がん細胞、胃がん細胞又は肉腫細胞である。実施形態において、がん細胞は乳がん細胞である。実施形態において、がん細胞は結腸がん細胞である。実施形態において、がん細胞は腎臓がん細胞である。実施形態において、がん細胞は白血病細胞である。実施形態において、がん細胞は肺がん細胞である。実施形態において、がん細胞は黒色腫である。実施形態において、がん細胞は卵巣がん細胞である。実施形態において、がん細胞は前立腺がん細胞である。実施形態において、がん細胞は膵がん細胞である。実施形態において、がん細胞は脳がん細胞である。実施形態において、がん細胞は肝がん細胞である。実施形態において、がん細胞は胃がん細胞である。実施形態において、がん細胞は肉腫細胞である。実施形態において、がん細胞はトリプルネガティブ乳がん細胞である。
本明細書において提供される方法によれば、被験者は、本明細書において提供される１つ又は複数の薬剤を有効量で投与される。用語「有効量」及び「有効投与量」は交換可能に用いられる。用語「有効量」は、所望の生理的反応（例えばがんの治療）を得るのに必要ないずれかの量として定義される。有効量及び薬剤を投与するためのスケジュールは、経験的に当業者により決定できる。投与量の範囲は、疾患又は障害の１つ又は複数の症状が影響を受ける（例えば軽減され、又は遅延する）という所望の効果を得るのに十分な範囲である。投与量は、不必要な交叉反応、アナフィラキシー反応等のような実質的に有害な副作用を引き起こすほどの過多量であってはならない。通常、投与量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患又は障害の程度、投与経路、又は他の薬物がレジメンに含まれるか否かにより変化し、それを基に当業者より決定されうる。投与量は、あらゆる禁忌事象において、個々の医師により調節することができる。投与量を適宜変化させ、１日１回～複数回で、１日～数日にわたり投与することができる。所定の種類の医薬製品ごとの適切な投与量に関するガイダンスは、文献に記載されている。例えば、有効量は、所定のパラメータに応じて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、又は少なくとも１００％増加又は減少する。有効性は、「～倍」の増加又は減少として表すこともできる。例えば、治療有効量は、コントロールに対して少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍又はそれ以上の効果を示しうる。実際の投与量及び製剤化は、治療目的に依存し、公知の技術を使用して当業者により決定される（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ、Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）、及びＰｉｃｋａｒ、Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。
予防的使用の場合、治療有効量の、本明細書に記載されるキメラポックスウイルス組成物は、発症前又は発症初期（例えばがんの最初の徴候及び症状）に被験者に投与される。治療的処置では、診断後又は疾患の発症後に、治療有効量の本明細書に記載される薬剤を被験者に投与する。したがって、別の態様においては、疾患（例えば、がん）の治療を必要とする被験者における該疾患の治療方法が提供される。
用語「被験者」、「患者」、「個体」等は、限定を目的とせず、通常交換可能に用いられる。すなわち、「患者」と記載される個体は、所定の疾患を必ずしも有するわけではなく、単に医療的アドバイスを求めているだけの個体である場合もある。
本明細書において、症状、疾患若しくは障害、又は症状、疾患若しくは障害に関連する徴候「を治療すること」又は「の治療」は、臨床結果を含む有益な、又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。有益な、又は所望の臨床結果には、限定されないが、１つ又は複数の徴候又は症状の緩和又は改善、症状、障害又は疾患の程度の軽減、症状、障害又は疾患の状態の安定化、症状、障害又は疾患の進行の防止、症状、障害又は疾患の拡散の防止、症状、障害又は疾患の進行の遅延又は減速、症状、障害又は疾患の開始の遅延又は減速、症状、障害又は疾患の状態の改善又は緩和、部分的又は全体的な鎮静、が含まれる。「治療」とは、治療がない場合に予想される期間を越えて被験者の生存を長期化することを意味する場合もある。「治療」とは、症状、障害又は疾患の進行を阻害すること、一時的に症状、障害又は疾患の進行を減速させること、を意味する場合もあるが、幾つかの場合では、永久的に症状、障害又は疾患の進行を停止させることを含む場合もある。本明細書における用語「治療」、「治療する」又は「治療すること」とは、プロテアーゼの発現により特徴づけられる１つ又は複数の疾患又は症状の徴候の効果を、又はプロテアーゼの発現により特徴づけられる疾患又は症状の徴候を、低減する方法を指す。したがって、開示される方法では、治療とは、確立された疾患、症状、又は疾患若しくは症状（例えば、がん）の徴候の重症度を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低減することを指す。例えば、被験者の疾患の１つ又は複数の症状は、コントロールと比較し１０％低減される場合、その疾患を治療する方法は「治療」であると考えられる。したがって、低減とは、天然又はコントロールのレベルと比較し、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は、１０％～１００％のいずれかのパーセントでの低減でありうる。治療とは、必ずしも疾患、症状又は疾患若しくは症状の徴候の治癒又は完全な消失を指すものではないものと理解される。更に、本明細書において用いられる「減少」、「低下」又は「阻害」とは、コントロールのレベルと比較し、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の変化を含むが、該用語は、完全な除去を必ずしも含むわけではない。
キメラポックスウイルス組成物を製剤化する方法に関係なく、必要とされる投与量は、投与経路、製剤の性質、被験者の症状の性質（例えば免疫系の成熟度又は胃腸障害）、被験者の身体のサイズ、体重、対表面積、年齢及び性別、投与を受けている他の薬物及び主治医の判断に依存する。あるいは、又はそれに加えて、投与量は、Ｐｆｕ／ｋｇ（乾燥重量）として表すことができる。
投与は、単回、又は複数回（例えば２回、又は３、４、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０回又はそれ以上）で行ってもよい。本明細書において提供される組成物による治療期間は、１日という短い期間から、宿主のライフスパンという長い期間（例えば何年もの間）のいかなる期間とすることもできる。例えば、組成物は、週１回（例えば４週間～数ヶ月又は数年）、月１回（例えば３ヶ月から１２ヶ月、又は多年）、又は、年１回を５年間、１０年、又はそれ以上にわたり、投与することができる。治療頻度が可変的でありうる点にも、留意すべきである。例えば、本組成物は、１日、１週、１月又は１年に１回（又は２回、３回等）投与することができる。
組成物は、他の治療薬との組合せで投与することもできる。実施形態において、組成物は、抗がん剤との組合せで投与することもできる。他の治療薬としては、具体的な障害により異なるが、例えば食事の変更、血液透析、安息香酸ナトリウム、フェニル酢酸、アルギニンのような治療薬又は外科手術治療が挙げられる。２つ以上の治療薬の同時投与は、薬剤がこれらの治療効果を発揮する時間の重複がある限り、薬剤が同時に、又は同じ経路により投与されることを必要としない。同時の、又は異なる日若しくは週における投与のような順次投与が企図される。
本明細書に記載される化合物は、相互に組み合わせて使用することも、また本明細書に記載される疾患（例えば乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫）を治療する際に有用であることが知られている他の活性薬剤（例えば抗がん剤）と組み合わせ使用することも、又は、単独では効果を示さないが活性薬剤の効果に寄与できる補助剤と組み合わせて使用することもできる。
実施形態において、本方法は、治療薬を投与することを含む。実施形態において、治療薬は、チェックポイント阻害タンパク質である。実施形態において、治療薬は、イピリムマブである。実施形態において、治療薬は、ペムブロリズマブである。実施形態において、治療薬は、ニボルマブである。実施形態において、治療薬は、タリモゲン ラヘルパレプベクである。実施形態において、治療薬は、ドゥルバルマブである。実施形態において、治療薬は、ダクリズマブである。実施形態において、治療薬は、アベルマブである。実施形態において、治療薬は、アテゾリズマブである。実施形態において、キメラポックスウイルス及び治療薬は、組み合わせた相乗的な量で投与される。実施形態において、キメラポックスウイルス及び治療薬は、同時に投与される。実施形態において、キメラポックスウイルス及び治療薬は、順次投与される。
幾つかの実施形態において、同時投与は、１つの活性薬剤の投与から０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０又は２４時間以内に、第２の活性薬剤（例えば抗がん剤）を投与することを含む。同時投与は、２つの活性薬剤を同時に、ほぼ同時に（例えば、各々約１、５、１０、１５、２０又は３０分以内に）又は、順次、任意の順序で投与することを含む。幾つかの実施形態において、同時投与は、同時製剤化、すなわち、両方の活性薬剤を含む単一の医薬組成物を調製することにより、実現することができる。他の実施形態において、活性薬剤は別個に製剤化することができる。他の実施形態では、活性薬剤及び／又は補助剤は、互いに混合又はコンジュゲートさせることができる。
「抗がん剤」は、その明白な、通常の意味に従い使用され、抗新生物特性又は細胞の増殖若しくは成長を阻害する能力を有する組成物（例えば化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、モジュレーター）を指す。幾つかの実施形態において、抗がん剤は化学療法剤である。幾つかの実施形態において、抗がん剤は、がんの治療方法における有用性を有するものとして本明細書において同定される薬剤である。幾つかの実施形態において、抗がん剤は、がんの治療用に、ＦＤＡ又は米国以外の国の同様の監督機関の承認を得ている薬剤である。抗がん剤の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ＭＥＫ（例えばＭＥＫ１、ＭＥＫ２又はＭＥＫ１及びＭＥＫ２）阻害剤（例えばＸＬ５１８、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３５９０１、セルメチニブ／ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２／トラメチニブ、ＧＤＣ－０９７３、ＡＲＲＹ－１６２、ＡＲＲＹ－３００、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＴＡＫ－７３３、ＰＤ３１８０８８、ＡＳ７０３０２６、ＢＡＹ８６９７６６）、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード（例えばメクロエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン）、エチレンイミン及びメチルメラミン（例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えばブスルファン）、ニトロソウレア（例えばカルマスティン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン）、トリアゼン（デカルバジン））、代謝拮抗剤（例えば５－アザチオプリン、ロイコボリン、カペシタビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、葉酸アナログ（例えばメトトレキセート）、又はピリミジンアナログ（例えばフルオロウラシル、フロキソウリジン、シタラビン）、プリンアナログ（例えばメルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）等）、植物アルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばイリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシド等）、抗腫瘍抗生物質（例えばドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、プラチナ系化合物又はプラチナ含有薬剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン）、置換された尿素（例えばヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えばミトタン、アミノグルテチミド）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド）、抗生物質（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン）、酵素（例えばエルアスパラギナーゼ）、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達の阻害剤（例えばＵ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ０３２５９０１、ＡＲＲＹ－１４２８８６、ＳＢ２３９０６３、ＳＰ６００１２５、ＢＡＹ４３－９００６、ワートマニン又はＬＹ２９４００２、Ｓｙｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗体（例えばリツキサン）、ゴシフォール、ゲナセンス、ポリフェノールＥ、クロロフォシン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ブリオスタチン、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、５－アザ－２’－デオキシシチジン、オールトランスレチノイン酸、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲルダナマイシン、１７－Ｎ－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、フラボピリドール、ＬＹ２９４００２、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ＢＡＹ１１－７０８２、ＰＫＣ４１２、ＰＤ１８４３５２、２０－ｅｐｉ－１、２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５－エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ－ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリックス、抗背側化形態形成性タンパク質－１、抗アンドロゲン剤、前立腺癌、抗エストロゲン剤、抗新生物剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アフィディコリングリシネイト、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシス調節因子、アプリン酸、ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、βアレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシイミン、カルシポトリオール、カルフォスチンＣ、カンプトセシン誘導体、カナリポックス ＩＬ－２、カペシタビン、カルボキサミド－アミノトリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロリン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シスポルフィリン、クラドリビン、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチンアナログ、コナゲニン、クラムベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタンスラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビン オクフォスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ－５－アザシチジン、９－ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステライド、エストラムスチンアナログ、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エクセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、フルオロダウノルニシン塩酸塩、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミドアゾアクリドン、イミキモド、免疫賦活薬ペプチド、インスリン様増殖因子－１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４－、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモカリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病抑制因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミゾール、リアロゾール、直鎖状ポリアミンアナログ、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解性ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストーン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンアナログ、ミトナフィド、マイトトキシン線維芽細胞成長因子－サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多重腫瘍サプレッサー１ベースの治療剤、マスタード抗がん剤、ミカペルオキシドＢ、マイコバクテリウム細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチプ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネムルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレーター、窒素酸化物抗酸化剤、ニトルリン、Ｏ６－ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカインインデューサー、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸塩ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、プラチナ複合体、白金化合物、プラチナ－トリアミン複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピル二アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡベースの免疫調節剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質キナーゼＣ阻害剤（微細藻類）、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化されたヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ １８６エチドロン酸、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチンアミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメクス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ １擬晶、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、単鎖抗原結合性タンパク質、シゾフラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパ
ク質、ソネルミン、スパルホス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分割阻害剤、スチピアミド、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン、超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン擬態物、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセン二塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、泌尿生殖洞由来の増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリロリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子治療剤、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビンタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、ジノスタチン スチマラマー、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アムボマイシン、アメタントロン酢酸塩、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゼトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルマスティン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジクオン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドゥアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブルゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロキシウリジン、フルダラビンリン酸塩、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イイモフォシン、インターロイキンＩ１（組換えインターロイキンＩＩ又はｒＩＬ－２．ｓｕｂ．２を含む）、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－ｎ１、インターフェロンα－ｎ３、インターフェロンβ－１ａ、インターフェロンγ－１ｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、メゲストロールアセテート、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メタウレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、マイトジリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、トレストロン酢酸塩、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート、硫酸ビンリューロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩、Ｇ２－Ｍ期の細胞を抑制し、及び／又は微小管の形成又は安定性を調節する薬剤、（例えばＴａｘｏｌ（商標）（すなわちパクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）タキサン骨格を含んでいる化合物、エルブロゾール（すなわちＲ－５５１０４）、ドラスタチン１０（すなわちＤＬＳ－１０及びＮＳＣ－３７６１２８）、ミボブリンイセチオネート（すなわちＣＩ－９８０として）、ビンクリスチン、ＮＳＣ－６３９８２９、ジスコデルモリド（すなわちＮＶＰ－ＸＸ－Ａ－２９６として）、ＡＢＴ－７５１（アボット、すなわちＥ－７０１０）、アルトルヒルチン（例えばアルトルヒルチンＡ及びアルトルヒルチンＣ）、スポンジスタチン（例えばスポンジスタチン１、スポンジスタチン２、スポンジスタチン３、スポンジスタチン４、スポンジスタチン５、スポンジスタチン６、スポンジスタチン７、スポンジスタチン８及びスポンジスタチン９）、塩酸セマドチン（すなわちＬＵ－１０３７９３及びＮＳＣ－Ｄ－６６９３５６）、エポチロン（例えばエポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ（すなわちデスオキシエポチロンＡ又はｄＥｐｏＡ）、エポチロンＤ（すなわちＫＯＳ－８６２、ｄＥｐｏＢ及びデスオキシエポチロンＢ）、エポチロンＥ、エポチロンＦ、エポチロンＢ Ｎ－オキシド、エポチロンＡ Ｎ－オキシド、１６－アザ－エポチロンＢ、２１－アミノエポチロンＢ（すなわちＢＭＳ－３１０７０５）、２１－ヒドロキシエポチロンＤ（すなわちデスオキシエポチロンＦ及びｄＥｐｏＦ）、２６－フルオロエポチロン、アウリスタチンＰＥ（すなわちＮＳＣ－６５４６６３）、ソブリドチン（すなわちＴＺＴ－１０２７）、硫酸ビンクリスチン、クリプトフィシン５２（すなわちＬＹ－３５５７０３）、ビチレブアミド、ツブリシンＡ、カナデンソール、センタウレイジン（すなわちＮＳＣ－１０６９６９）、オンコシジンＡ１（すなわちＢＴＯ－９５６及びＤＩＭＥ）、フィジアノリドＢ、ラウリマリド、ナルコシン（別名ＮＳＣ－５３６６）、ナスカピン、ヘミアステルリン、バナドセンアセチルアセトネート、モンサトロール、イナノシン（すなわちＮＳＣ－６９８６６６）、エリュテロビン（例えばデスメチルエリュテロビン、デスアセチルエリュテロビン、イソエリュテロビンＡ及びＺ－エリュテロビン）、カリベオシド、カリベオリン、ハリコンドリンＢ、ジアゾナミドＡ、テカロノリドＡ、ジオゾスタチン、（－）－フェニルアヒスチン（すなわちＮＳＣＬ－９６Ｆ０３７）、ミオセベリンＢ、レスベラスタチンリン酸ナトリウム、ステロイド（例えばデキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤、生殖腺刺激ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、例えばゴセレリン又はロイプロリド、副腎皮質ステロイド（例えばプレドニゾン）、プロゲスチン（例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メゲストロールアセテート、メドロキシプロゲステロンアセテート）、エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール）、抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン）、アンドロゲン（例えばプロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン）、抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド）、免疫賦活薬（例えばバチルス・カルメット・グエリン（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン－２、α－インターフェロン等）、モノクローナル抗体（例えば抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ－ＤＲ及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、イムノトキシン（例えば抗ＣＤ３３モノクローナル抗体－カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－シュードモナスエンドトキシンコンジュゲート等）、ラジオイムノセラピー（例えば抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の１１１Ｉｎ、９０Ｙ又は１３１Ｉ等へのコンジュゲート）、トリプトリド、ホモハリントニン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イトラコナゾール、ビンデシン、セリバスタチン、ビンクリスチン、デオキシアデノシン、セルトラリン、ピタバスタチン、イリノテカン、クロファジミン、５－ノニルオキシトリプタミン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ阻害剤、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）－標的治療又は治療剤（例えばゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｒｖａ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（商標））、アファチニブ／ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ－１０３３／カネルチニブ、ネラチニブ／ＨＫＩ－２７２、ＣＰ－７２４７１４、ＴＡＫ－２８５、ＡＳＴ－１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＲＲＹ－３８０、ＡＧ－１４７８、ダコミチニブ／ＰＦ２９９８０４、ＯＳＩ－４２０／デスメチルエルロチニブ、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８、ペリチニブ／ＥＫＢ－５６９、ＣＵＤＣ－１０１、ＷＺ８０４０、ＷＺ４００２、ＷＺ３１４６、ＡＧ－４９０、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＢＭＳ－５９９６２６。
ＶＩＩ．検出方法
他の一態様において、被験者のがんを検出する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載される実施形態に係るキメラポックスウイルスをがん細胞に接触させること、及びキメラポックスウイルスを複製させ、それによりがん細胞を検出することを含む。実施形態において、キメラポックスウイルスは、検出可能部分をコードする核酸配列を含む。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、蛍光部分をコードする。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、Ｅｍｅｒａｌｄをコードする。実施形態において、検出可能部分をコードする核酸配列は、ホタルルシフェラーゼをコードする。実施形態において、がん細胞は被験者に存在する。実施形態において、被験者は哺乳動物である。実施形態において、被験者はヒトである。
以下の実施例は例示として示され、特許請求された本発明を限定するものではない。
［実施例１］ がんの腫瘍溶解的免疫治療に用いられる新規かつ強力なキメラポックスウイルス
がんは、米国では第２位の主要な死因である。近年、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞及び腫瘍溶解性ウイルス等によるがん免疫療法が高度に進歩している。
腫瘍溶解性ウイルスは、健常な細胞を無傷のままにすると共に、がん細胞に感染し、複製し、最終的にこれを殺傷する、天然の、又は遺伝子改変されたウイルスである（１、２）。４３６人の切除不能なステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ又はＩＶの黒色腫患者を対象とする、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＴ－ＶＥＣに関する最近完了したフェーズＩＩＩ臨床試験は、ＧＭ－ＣＳＦを受容した患者の２．１％と比較し、Ｔ－ＶＥＣを受容した患者の１６．３％の耐性応答率を示し、その主要エンドポイントを満たすことが報告されている（３）。この試験結果に基づき、ＦＤＡは、２０１５年１０月２７日にＴ－ＶＥＣを承認した。ＦＤＡによる初の腫瘍溶解性ウイルスの承認は、当分野における可能性の道を開いた。
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１、ニューキャッスル病ウイルス、レオウイルス、はしかウイルス、コクサッキーウイルス、セネカバレーウイルス及びワクシニアウイルスを含む少なくとも８つの異なる種由来の腫瘍溶解性ウイルス構築物を用い、臨床試験の各種フェーズにおいて試験した。腫瘍溶解性ウイルスががん患者において十分許容できることが明らかとなった。しかしながら、スタンドアロン治療としての腫瘍溶解性ウイルスの臨床的利益は、限定されたままである（５）。腫瘍溶解性ウイルスの安全性に関する配慮により、高度減弱化（天然において無発症性であるか、又は遺伝子工学的に減弱させた）腫瘍溶解性ウイルスのみを、前臨床試験及び治験に使用した。腫瘍溶解性ウイルスの安全性が本発明において確立されたため、更に、最大の抗腫瘍効果を有する腫瘍溶解性ウイルスの設計及び試験を試みることとする。強力な腫瘍溶解効果を有する腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原を多量に放出し、それにより、強力な免疫治療効果をもたらすと考えられる。
１９及び２０世紀において５００，０００，０００人の生命を奪ったと推定される天然痘を根絶した天然痘ワクチンである、ワクシニアウイルス（ポックスウイルスファミリーのプロトタイプメンバー）を使用した。したがって、最も有効な生物学的治療的因子と考えられる。ワクシニアウイルスの安全性は、世界的に知られている。ワクシニアウイルスはまた、実験室においてウイルス性の腫瘍溶解が示されている最初の腫瘍溶解性ウイルスでもある。腫瘍溶解性ウイルスとしてのワクシニアウイルスは、多くの臨床試験において試験され、末期がん患者においても十分許容されることが示されている（２）。幾つかの研究では、腫瘍溶解活性に関して、ワクシニアウイルスがアデノウイルスより優れており（６）、腫瘍溶解性ウイルス種として十分に研究された腫瘍溶解性ウイルスの１つが、中国においてがん治療用に承認されている（７）。ワクシニアウイルスの他に、ポックスウイルスファミリー以外の、アライグマポックスウイルス（８）、オルフウイルス（９）及び粘液腫ウイルス（１０）等のメンバーについても腫瘍溶解性ウイルスとして試験が行われた。
キメラポックスウイルスは、種々のウイルス種由来の好ましい特徴を組み合わせる能力を有し、個々の野生型ウイルスよりも優れている。オルソポックスウイルス及びパラポックスウイルスは明らかな抗原を有するため、本試験において作製した有力なキメラオルソポックスウイルス及び有力なキメラパラポックスウイルスは、同じ治療法において組み合わせることで最大の治療効果を奏する能力を有する。出願人は、キメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルスのプールを作製した。幾つかのキメラオルソポックスウイルス及びパラポックスウイルスの単離株は、これらの親の個々の野生型ウイルスと比較し、ＮＣＩ６０がん細胞株のパネルよりも優れた殺傷能力を示した。
キメラウイルスのプールの作製及び個々のキメラウイルスの単離。ＣＶ－１細胞をウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ、ＩＨＤ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ及びＡＳ株により、各ウイルス０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で共感染させることにより、キメラオルソポックスウイルスのプールを作製した。キメラパラポックスウイルスのプールを作製するため、ＭＤＢＫ細胞を、０．１のＭＯＩで、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルス株ＴＪＳにより共感染させた。出願人のパイロット試験では、ＣＶ－１の細胞が本試験において使用した全てのオルソポックスウイルスに感受性であり、またオルフウイルス及び偽ウシポックスウイルスのいずれもＭＤＢＫ細胞に感染し、プラークを形成することが示されている。
キメラオルソポックスウイルスのプールにより感染させたＣＶ－１細胞、及びキメラパラポックスウイルスのプールにより感染させたＭＤＢＫ細胞から、それぞれ、１００のキメラオルソポックスウイルスのプラーク及び１００のキメラパラポックスウイルスのプラークを採取した。これらの２００のプラークをそれぞれの細胞において更に２回以上プラーク精製し、２００のクローンとして精製された個々のキメラウイルスとして単離した。ウイルス＃１１４－１１３は、キメラオルソポックスウイルスの単離株であるのに対し、ウイルス＃２１４－１１３は、キメラパラポックスウイルスの単離株である。
ＮＣＩ－６０細胞株におけるハイスループットスクリーニングによる、新規かつ強力なキメラポックスウイルス単離株の同定。２００のキメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルス単離株の腫瘍細胞殺傷活性を、ＮＣＩ－６０細胞株（表１）のパネルにおいて、１１の親のウイルス株及び２つのコントロール腫瘍溶解性ウイルス（ＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰ）と共に評価し、比較した。ＧＬＶ－１ｈ６８は、十分に研究がなされた腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの１つであり、現在臨床開発中である。ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス－１であるＴ－ＶＥＣと同じ基本構成を有し、ＦＤＡの承認をはじめて得た腫瘍溶解性ウイルスである。各細胞株を、０．０１のＭＯＩで各ウイルスにより感染させた。ＭＴＳアッセイを用い、感染後９６時間の細胞生存率を測定した。このハイスループットスクリーニング実験において、ウイルスの使用量を意図的に低く維持し（ＭＯＩ ０．０１）、接着型の細胞株（ＮＣＩ－６０パネルの大多数の細胞株は接着型の細胞である）における細胞殺傷能力の比較のために最適化し、有力かつ新規なウイルスの単離を試みた。しかしながら、このウイルス量は、懸濁型の細胞株においては、顕著かつ一定の細胞殺傷能力を観察するには低過ぎた。したがって、６種の白血病細胞株から得た結果は、ウイルスを比較する目的の分析には含めなかった。
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Figure 0007631485000002
１００の新規なキメラオルソポックスウイルス単離株のうち、単離株＃１７（配列番号３）及び＃３３（配列番号１）は、９つの親のオルソポックスウイルス株及び２つのコントロールウイルスより顕著に良好なＮＣＩ－６０固体腫瘍細胞株の細胞殺傷能力を示した（図１）。１００の新規なパラポックスウイルス単離株から単離した株＃１８９（配列番号２）は目立った特徴を示し、２つの親パラポックスウイルス株及びコントロールウイルスより顕著に優れた細胞殺傷能力を示した（図２）。全３つの新規なキメラウイルス単離株（＃１７、＃３３及び＃１８９）は、０．０１の低いＭＯＩであっても、大部分のＮＣＩ－６０固形がん細胞株において顕著に細胞死を生じさせた。一般に、オルソポックスウイルス及びキメラオルソポックスウイルスの単離株は、０．０１の低いＭＯＩでがん細胞の殺傷能力が、パラポックスウイルス株及びキメラパラポックスウイルスの単離株よりも強力であった。
＃３３及び＃１８９のゲノムシークエンシング。
新規なポックスウイルス単離株＃３３及び＃１８９のゲノムＤＮＡを精製されたウイルス粒子から単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００を使用して１０００倍以上のカバレージで次世代シークエンシングを行った。ギャップをＰＣＲで増幅し、サンガーシークエンシング法によりシークエンシングした。＃３３ゲノムの１８９，４１５塩基対（ｂｐｓ）を完全にシークエンシングし、１３８，２０３ｂｐｓの１８９のゲノムを得た。ＧｅｎＢａｎｋに対するＩｎｔｉｔｉａｌ ＢＬＡＳＴ解析の結果、＃３３及び＃１８９のゲノム配列がＧｅｎＢａｎｋのいかなるゲノム配列とも同一でないことが示された。＃３３は、他のいかなるオルソポックスウイルスよりもワクシニアウイルス株と近縁の関係であった。＃１８９は、オルフウイルスＮＺ２株（親のパラポックスウイルスの１つ）と非常に近縁の関係であった。オルフウイルスＮＺ２株において、同定された全てのＯＲＦの核酸配列は、＃１８９のそれと同一である。オルフウイルスＮＺ２と比較し、＃１８９のゲノムでは６７５５位に１つの「Ｇ」が挿入されている。逆向きの末端反復領域において、＃１８９ゲノムでは１コピーの繰り返しエレメントが欠失し、また１コピーの他の繰り返しエレメントが挿入されている。全体として、＃３３及び＃１８９は新規でユニークなポックスウイルス単離株を表す。
方法及び材料：
細胞株：全てのがん細胞株は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において増殖させた。アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞（ＣＶ－１）及びウシ腎臓上皮細胞（ＭＤＢＫ）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）から得、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）において増殖させた。全ての培地には、１０％のＦＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を補充した。細胞を５％のＣＯ２下、３７℃で培養した。
ウイルス：
ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ、ＩＨＤ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ及びＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株は、ＡＴＣＣから購入した。全てのオルソポックスウイルス株はＣＶ－１細胞において増殖させ、力価測定し、またパラポックスウイルス株はＭＤＢＫ細胞において増殖させ、力価測定した。
キメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルスのプールの作成、並びに個々のクローン性キメラウイルス単離株の単離：
ＣＶ－１細胞を、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ、ＩＨＤ、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＣＬ、Ｌｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ及びＡＳ株により、各ウイルス０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で共感染させることにより、キメラオルソポックスウイルスのプールを作製した。キメラパラポックスウイルスのプールを作製するため、ＭＤＢＫ細胞を、０．１のＭＯＩで、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により共感染させた。感染細胞を感染後３日目に回収した。最初のキメラオルソポックスウイルスのプールを更に０．１のＭＯＩでＣＶ－１細胞において３回通過させ、また最初のキメラパラポックスウイルスのプールを更に０．１のＭＯＩでＭＤＢＫ細胞において３回通過させた。最後のキメラオルソポックスウイルスプールにより感染させたＣＶ－１細胞、及び最後のキメラパラポックスウイルスプールにより感染させたＭＤＢＫ細胞から、それぞれ、１００のキメラオルソポックスウイルスのプラーク、及び１００のキメラパラポックスウイルスのプラークを採取した。これらの２００のプラークをそれぞれの細胞において更に２回以上プラーク精製して、２００の単クローンとして精製されたキメラウイルス単離株を得た。
ハイスループットスクリーニング：
ＮＣＩ－６０がん細胞株、並びにＰＡＮＣ－１、ＭＩＡ－ＰａＣａ２、ＢｘＰＣ３、ＦＧ、Ｃａｐａｎ－２及びＳｕ．８６．８６を含む膵がん細胞株のパネルを、ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７５リキッドハンドラー（エッペンドルフ）を用い、９６ウェルプレートに分注し（固体腫瘍細胞株の場合３０００細胞／ウェル、白血病細胞株の場合５０００細胞／ウェル）、無菌条件下、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２の下、３７℃で一晩インキュベートした。次に細胞を、１１個の親ウイルス株、及び２つコントロール腫瘍溶解性ウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰと共に、２００のキメラオルソポックスウイルス及びキメラパラポックスウイルス単離株により、０．０１のＭＯＩで感染させた。ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、感染後９６時間における細胞生存率を測定した。自動ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて４９０ｎｍの吸収度を測定した。各実験は２回実施した。偽感染細胞の細胞生存率を１００％と設定した。
胃がん細胞株に対するウイルスの細胞毒性：
ＭＫＮ－４５、ＯＣＵＭ－２Ｍ及びＫＡＴＯ－３細胞を、１ウェルあたり３，０００細胞の濃度で９６ウェルプレートに播種し、５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。０．０１、０．１及び１のＭＯＩで、＃３３、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰにより細胞を感染させた。５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２下、３７℃でＭＴＳアッセイを用い、４日間毎日、細胞生存率をモニターした。
ゲノムシークエンシング：
Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、＃３３及び＃１８９のゲノムＤＮＡを精製されたウイルス粒子から抽出し、超音波処理により断片化した。ＫＡＰＡ ＬＴＰ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００を用いてシークエンシングした。
［実施例２］ 膵がん細胞株のハイスループットスクリーニング
ＮＣＩ－６０がん細胞株は、８つの異なる器官由来の固形がんのみ含有する（表１を参照されたい）。ＮＣＩ－６０がん細胞株による結果が、異なる由来器官の固形がんにおいても再現されるか否かを調べた。ＮＣＩ－６０がん細胞株のハイスループットスクリーニングにおいて、同じウイルスを０．１のＭＯＩで用い、６つの膵がん細胞株（ＢｘＰＣ３、ＦＧ、ＭＩＡ ＰａＣａ－２、Ｃａｐａｎ－２、ＰＡＮＣ－１及びＳＵ．８６．８６）を感染させた。ＭＴＳアッセイを用い、感染後９６時間における細胞生存率を再度測定した。キメラオルソポックスウイルスの単離株＃１７及び＃３３は、全てのキメラオルソポックスウイルス単離株の中で最も良好な細胞殺傷能力を示し、一方、キメラパラポックスウイルス単離株＃１８９は、全てのキメラパラポックスウイルス単離株の中で最も良好な細胞殺傷能力を示した。表２及び図３及び図４に示すように、これらはいずれも、これらの各親ウイルス株並びにコントロールウイルスＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰよりも膵がん細胞株の殺傷能力が優れていた。このように、ＮＣＩ－６０がん細胞株の結果は、膵がん細胞株のパネルにおいて非常に再現性が高かった。
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［実施例３］ 新規なキメラオルソポックスウイルス単離株＃３３及びキメラパラポックスウイルス単離株＃１８９は、胃がん細胞株において強力な細胞殺傷能力を示す
ＮＣＩ－６０がん細胞株及び膵がん細胞株のパネルを用いたハイスループットスクリーニング結果に基づき、新規なキメラオルソポックスウイルス単離株＃３３及びキメラパラポックスウイルス単離株＃１８９を選択し、更なる特徴解析に供した。単離株＃３３及び＃１８９の腫瘍細胞殺傷活性を、３種の胃がん細胞株において更に解析した。ＭＫＮ－４５、ＯＣＵＭ－２Ｍ及びＫＡＴＯ－３細胞を、０．０１、０．１及び１のＭＯＩで、＃３３、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰにより感染させた。ＭＴＳアッセイを用い、４日間毎日、細胞生存率を毎日モニターした。ＭＫＮ－４５及びＯＣＵＭ－２Ｍの細胞株は＃３３に対し最も感受性が高く、ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰに対しては中程度の感受性で、ＧＬＶ－１ｈ６８に対する感受性が最も低かった。ＫＡＴＯ－３は、０．０１の低いＭＯＩにおいてＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰに対し最も感受性が高い一方、＃３３、＃１８９及びＯｎｃｏＶＥＸ ＧＦＰは、より高いＭＯＩ（０．１及び１）において同様にＫＡＴＯ－３細胞への殺傷能力を示した。ＫＡＴＯ－３細胞は、ＧＬＶ－１ｈ６８に対する感受性が最も低かった。全体的に、＃３３は最も効果的に胃がん細胞株を殺傷し、一方ＧＬＶ－１ｈ６８は胃がん細胞株の殺傷効果が最も低かった（図５Ａ～５Ｃ）。
表３に報告されるように、全てのシークエンシングされたＣｈＰＶに存在する９０の遺伝子を、これらの公知の機能と共に列記する。遺伝子の名称は、対応するＶＡＣＶ－ＣＯＰを基に付与する。星印＊は、該遺伝子が２つのＥｎＰＶに存在することを示す。表３は、Ｇｕｂｓｅｒらを基に作成し（Ｇｕｂｓｅｒ，Ｃ．，Ｈｕｅ，Ｓ．，Ｋｅｌｌａｍ，Ｐ．，及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．（２００４）．Ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８５，１０５－１１７）、参照によりその全内容を全目的において本明細書に組み込む。
Figure 0007631485000004
Figure 0007631485000005
本明細書に記載する実施例及び実施形態は、単に例示のみを目的とするものであり、各種の修飾又は変更は、当業者であれば示唆されるところであり、また本出願の技術思想及び添付の特許請求の範囲に含まれるものであることを理解すべきである。本明細書において引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全内容を全目的において本明細書に組み込む。
［実施例４］ トリプルネガティブ乳がんの腫瘍溶解免疫療法としての、新規なキメラパラポックスウイルスＨＯＶ－１８９
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、高い再発率及び予後不良を特徴とする乳がんの悪性サブタイプである。本出願にて出願人は、ＴＮＢＣを効率的に殺傷する遺伝子操作された新規なパラポックスウイルスを説明する。
方法：
相同組換えにより新規なキメラパラポックスウイルス（ＨＯＶ－１８９）を作製し、ハイスループットスクリーニングにより同定した。４種のＴＮＢＣ細胞株において細胞毒性をインビトロで解析した。標準的なプラークアッセイによりウイルスの複製を試験した。胸腺切除ヌードマウスの第２及び第４乳房脂肪パッドに、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８インプラントによりオルソトロピックなＴＮＢＣ異種移植片を形成させ、ウイルスで処理した。
結果：
ＨＯＶ－１８９は、低い多重感染度（ＭＯＩ）で用量依存的に細胞毒性を示し、処理の６日後に＞９０％の細胞死を示した。腫瘍サイズの著しい削減は、コントロール（Ｐ＜０．０１）と比較して、１０３ＰＦＵの低用量で、腫瘍内注入の２週後に観察された。更に、遠達効果（非注入遠隔腫瘍の収縮）が明らかに示された。
結論：
ＨＯＶ－１８９は、１０３ＰＦＵの低用量で、効率的なインビトロ細胞毒性及び強力なインビボ抗腫瘍効果を示した。これらは、ＴＮＢＣに対するこの非常に強力な薬剤の臨床開発を奨励するデータである。
はじめに：
世界的に、毎年新規に診断される１００万件の乳がん症例の約１２～２０％がトリプルネガティブであり１１、これらはエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現を欠くことを意味する。トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、その本質的に悪性の挙動及び有効な標的治療の欠如の両方により、臨床結果が低いことを示す。ＴＮＢＣに罹患する患者は、非ＴＮＢＣ患者と比較し、診断の後５年以内に、再発及び転移性疾患の発症のリスクが高い１２。
現在では、ＴＮＢＣのアジュバント療法のメインステイは細胞毒性化学療法であるが、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤等の研究を含む、標的治療に対する研究開発が積極的に行われている１１、１３。
免疫療法は長きにわたり、乳がんを含む多くのがん種において研究が行われていた。ＴＮＢＣは、高い遺伝的不安定性、高い新生抗原の発生率を示し、また微細環境における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在頻度が高く、それによりＴＮＢＣは非トリプルネガティブの疾患よりも免疫原性が高い１４。これらの要因により、ＴＮＢＣは、免疫療法の良好な候補となる。出願人は、以前に、ＴＮＢＣモデルにおいて、抗腫瘍効果を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスについて研究を行った１５。本出願において出願人は、インビトロ及びインビボのいずれの場合も、ＴＮＢＣモデルにおいて効果的である新規なキメラパラポックスウイルスに関するデータを示す。
方法：
細胞培養及び細胞株。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍｌのストレプトマイシン及びペニシリンを補充したＲＰＭＩ１６４０（コーニング、コーニングＮＹ）中で、ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｓａｎｇｋｉｌ Ｎａｍ博士（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）により提供）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（Ｊｏｈｎ Ｙｉｍ博士（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ）により提供）、ＢＴ５４９（Ｙｉｍ博士）及びＨｓ５７８Ｔ（Ｙｉｍ博士）を培養した。全てのＴＮＢＣ株を、Ｇｅｎｅｔｉｃａの細胞株試験（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）により試験し、真正を認証した。アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞（ＣＶ－１）及びＭＤＢＫ細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎｎａｓｓｕｓ、ＶＡ）から得、１０％のＦＢＳ及び１００ＩＵ／ｍｌのストレプトマイシン及びペニシリンで補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、コーニング、コーニングＮＹ）で培養した。全ての細胞を、３７℃、５％のＣＯ２条件の加湿インキュベーター内で増殖させた。
キメラパラポックスウイルスの開発及び選択
キメラパラポックスウイルスのプールを作製するために、ＭＤＢＫ細胞をオルフウイルスＮＺ２株（ＡＴＣＣ）及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株（ＡＴＣＣ）により共感染させた。感染させた細胞を、感染後３日目に回収した。キメラパラポックスウイルスプールで感染させたＭＤＢＫ細胞から、１００のキメラパラポックスウイルスのプラークを採取した。これらの１００のプラークをＭＤＢＫ細胞において更に２回以上プラーク精製し、単クローンのキメラウイルス単離株を各々１００個得、それを親ウイルスと共にＮＣＩ－６０細胞株におけるハイスループットスクリーニングに供した。ＮＣＩ－６０細胞株に対して最も強力な殺腫瘍性特性を示した単離株ＨＯＶ－１８９を、この試験のために選択した。
細胞毒性アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＢＴ５４９及びＨｓ５７８Ｔの場合は１０００細胞／ウェルで、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の場合は３０００細胞／ウェルで、細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の場合は各ウイルス０．１、１及び１０のＭＯＩで、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＢＴ５４９及びＨｓ５７８Ｔの場合は０．０１、０．１及び１のＭＯＩで、細胞を感染させた。分光光度計（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、４９０ｎｍで３回、１～６日にわたり、２４時間毎に細胞生存率を測定した。
ウイルス複製アッセイ
ＴＮＢＣのウイルス複製を、標準的なプラークアッセイを用いて定量化した。２ｍｌの増殖培地中、６ウェルプレートにおいて細胞がコンフルエントに達した後、０．０１のＭＯＩの各ウイルスにより感染させた。細胞を、３日間連続して３回回収した。ＨＯＶ－１８９で処理したサンプルの系列希釈法により、ＭＤＢＫ細胞を２４ウェルプレート中で感染させた。
オーソトピック異種移植モデル
２６匹のＨｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ雌ヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、生後１２週目で第２及び第４乳房脂肪パッドに、６ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（コーニング）と共に１０７個のＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を注入した。腫瘍が約１００～１５０のｍｍ３のサイズに到達したとき、マウスを無作為に分け、腫瘍内にＰＢＳのみ（ｎ＝４）、５０μｌのＰＢＳ中１０３ＰＦＵ（ｎ＝６）、１０４ＰＦＵ（ｎ＝６）若しくは１０５ＰＦＵ（ｎ＝７）を注入した。腫瘍サイズは、処理前には群間で顕著な相違がなかった。次に、腫瘍サイズを６週間にわたり３日毎に測定した。腫瘍体積をＶ（ｍｍ３）＝（４／３）×（π）×（ａ／２）２×（ｂ／２）に従って算出した。式中、ａは最小直径であり、ｂは最大直径である。腫瘍内注入から７日後、１群当たり２～４匹のマウスを屠殺し、腫瘍及び器官（肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、卵巣、脳）を液体窒素中で急速凍結させ、更に組織病理染色、免疫組織化学染色及びウイルスプラークアッセイに用いた。残りの３匹のマウスについては、第２の乳房腫瘍のみを１０５ＰＦＵ／５０ｕｌ ＰＢＳで処理し、第４の非注入乳房腫瘍に対する効果の有無を観察した。処理の２週間後、両腫瘍を回収し、各ウイルスの力価を測定した。
結果：
ＨＯＶ－１８９は、時間依存的及び用量依存的にインビトロでＴＮＢＣを効果的に殺傷する。
ＴＮＢＣの不均一な性質を考慮し、２種の転移性がん由来の細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８）及び非転移性がん由来の２種の細胞株（Ｈｓ５７８Ｔ及びＢＴ５４９）を用い、６日にわたり、０．０１～１０のＭＯＩで、ＨＯＶ－１８９により処理した。ＨＯＶ－１８９は、ＭＯＩ＝１で処理したとき、Ｈｓ５７８Ｔ（９６時間目のＬＤ５０：ＭＯＩ ０．３９６）、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＬＤ５０：ＭＯＩ ０．１８５）を最も効率的に殺傷し、その際、６日目に＞８０％の細胞死をもたらした（図６Ａ及び６Ｃ）。ＬＤ５０はＢＴ５４９及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１では高かったが（それぞれＬＤ５０：ＭＯＩ １．６３６及びＭＯＩ １．７１２）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１データは、ＨＯＶ－１８９の濃度増加により、６日後において、ＭＯＩ １０で＞９０％の細胞死をもたらしたことを示す（図６Ｄ）。
ＨＯＶ－１８９は、インビトロでＴＮＢＣにおいて複製する。
３日にわたり回収した感染細胞を用いた標準的なプラークアッセイにより、ウイルス複製を全４種のＴＮＢＣ細胞株において評価した。ＭＯＩ ０．０１で効率的なウイルス複製がＢＴ５４９、Ｈｓ５７８Ｔ及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１で生じ、最大の複製は２４～４８時間目の間で生じた（図７）。しかしながら、低ＭＯＩでも有効な細胞毒性は示したものの、ＭＯＩ ０．０１ではＭＤＡ－ＭＢ－４６８におけるＨＯＶ－１８９の複製は低かった。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８株では、ＭＯＩ １０に濃度を増加させることにより、ウイルス複製が改善された（図７）。
腫瘍内へのＨＯＶ－１８９注入は、顕著なウイルス毒性を伴わずに、オーソトピックＴＮＢＣ異種移植の腫瘍サイズを効果的に減少させる。
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を胸腺切除ヌードマウスの第２及び第４の乳房脂肪パッドに挿入することにより、オーソトピック異種移植を作製した。両方の腫瘍に対し、ＰＢＳ又はＨＯＶ－１８９（１０３ＰＦＵ、１０４ＰＦＵ又は１０５ＰＦＵ）を、単回腫瘍内注入した。ＰＢＳ処理を受けたコントロールと比較し、ＨＯＶ－１８９で処理した全ての群において、処理後１３日目に相対腫瘍サイズが顕著に減少し、この治療効果は注入後６週間にわたり持続した（図８）。コントロールと比較し、処理群では顕著な体重減量がないことが示されたため、腫瘍内注入はマウスにおいて顕著なウイルス毒性を生じさせず、許容されるものであった（図９）。
処理後１週及び６週目におけるＨＯＶ－１８９生体内分布は、インビボでの固有の腫瘍特異性を示す。
ＨＯＶ－１８９注入後１週及び６週目に、各群の２～４匹のマウスを屠殺し、ウイルス体内分布の解析に供した。感染した腫瘍組織のウイルス力価を測定した結果、両時点において他の器官と比較し２桁高いＨＯＶ－１８９力価を示しており、正常細胞と比較しがん細胞に対するＨＯＶ－１８９の自然な向性を反映している（表４）。注入腫瘍組織から離れた部位としては、ＨＯＶ－１８９は注入後１週目に心肺組織において、また注入後６週目に肺組織において検出されただけであり、これは、観察された有意な全身毒性の欠如と相関するものである。
免疫蛍光イメージングにより確認される、オーソトピック異種移植モデルにおけるＨＯＶ－１８９の感染及び複製。
ＨＯＶ－１８９注入後１週目に、オルフウイルスに対するポリクローナル抗体の免疫蛍光検出を行った結果、コントロールと比較し、腫瘍１つ当たり１０５ＰＦＵでＨＯＶ－１８９により処理した腫瘍組織において、ウイルス感染が示された（図１０Ａ及び１０Ｂ）。更に、ＤＡＰＩ対比染色とマージした抗体検出のパターンは、オルフウイルス抗体が核（図１０Ｃ）の外側領域に局在化していることから、ウイルス工場での活発な複製と整合するものである。
腫瘍内ＨＯＶ－１８９注入は、離れた非注入腫瘍に対する腫瘍鎮静効果を発揮する。
３匹の動物を第２乳房腫瘍にのみ１０５ＰＦＵでＨＯＶ－１８９処理する一方で、第４乳房腫瘍は未処理のままとした。腫瘍サイズを、ＰＢＳ処理コントロールとの比較において３日毎に測定し、ウイルス力価を２週目の終わりに標準的なプラークアッセイにより定量化した。注入腫瘍群では、相対腫瘍サイズが最初に増加したものの（注入による外傷によると考えられる）、腫瘍サイズは６日目以降には減少し、１３日目にはコントロールと比較し有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。非注入腫瘍群の相対腫瘍サイズは、ＨＯＶ－１８９で直接処理されていないにもかかわらず安定なままであった（図１１）。２週目の終わりのウイルス力価測定の結果、注入腫瘍の平均力価が３．３７×１０３ＰＦＵ／ｇ組織である一方、非注入腫瘍では平均１．１５×１０３ＰＦＵ／ｇ組織であることを示した。
考察
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、全ての乳がん診断ケースの１５～２０％を占める。それは悪性の生物学的性質を示し、しばしば若い女性が罹患し、高い再発率及び全体的な生存率の低下をもたらす傾向がある１６、１７。ホルモン受容体陽性疾患とは反対に、ＴＮＢＣには、有効な標的治療の開発及び投与のための公知の生物学的マーカーがない。したがって、ネオアジュバント及びアジュバント療法のメインステイは細胞毒性化学療法のままであり、それは多くの全身性効果をもたらしうる１１、１３。
２０１５年１０月において、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ヒト用の最初腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）として、Ｔ－ＶＥＣ（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）と呼ばれる単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）を承認した１８。この承認はウイルス学及び免疫薬物療法学の分野におけるランドマーク的な出来事であり、ＴＮＢＣを含む他のがんの治療用のＯＶの更なる開発をより強力に刺激した。ＯＶは、菌体内シグナル伝達経路の変化、及び優先的にがん細胞に感染するための細胞表面受容体の過剰発現のような、がん細胞の病理学的混乱を利用することにより、正常細胞よりもがん細胞への固有の指向性を示す１９－２１。更に、ＯＶにより媒介される感染細胞の破壊により、がん細胞に対する固有の、及び適応免疫系をプライミングするサイトカイン、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）及び病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）分子を放出する２０、２２－２６。ＴＮＢＣは、遺伝的不安定性の増大、新生抗原の数の増加、微細環境での腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）数の増加を示す１４。これにより、非トリプルネガティブ疾患よりも免疫原性の高いＴＮＢＣとなり、またＯＶベースの治療が魅力的な候補であることがアピールされることとなる。
この研究は、新規なキメラパラポックスウイルス（ＨＯＶ－１８９）が４種の異なるＴＮＢＣ細胞株（転移性及び非転移性癌の両方に由来）においてインビトロ細胞毒性を示すことを立証するものである。胸腺切除ヌードマウスのＴＮＢＣ異種移植に対するＨＯＶ－１８９の単回腫瘍内注入により、顕著な毒性の徴候なく、腫瘍サイズを顕著に減少させた。更に、離れた非注入腫瘍部位においてもウイルスが検出され、また腫瘍サイズを安定化させていた。このように、ＨＯＶ－１８９は全身を移動して離れた疾患部位をターゲティングする能力を示すため、それはネオアジュバント治療、更には転移への対処における応用が考えられる。
なお、インビボにおける腫瘍サイズの減少が、腫瘍１つ当たり１０３ＰＦＵの低いＨＯＶ－１８９の用量で観察されている。ＨＯＶ－１８９はインビトロでは複製が少ないため、これは、かかる抗腫瘍効果がウイルス複製による直接的な腫瘍崩壊の結果ではないことを示唆する。ＨＯＶ－１８９の遺伝子のシークエンシングの結果、その親ウイルスの１つである、パラポックスウイルスオルフウイルス（ＯＲＦＶ）との近縁の関係が明らかとなっている。ＯＲＦＶに関する従来の研究は、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関連して、ＯＲＦＶ治療が強い免疫調節性効果を誘導することを示している２７、２８。紫外線（ＵＶ）不活化ＯＲＦＶによる処理を行っても、やや弱いが同等の応答を誘導することから、ウイルス自体が、その実際の複製とは無関係に、免疫応答を誘導できる抗原性の構造成分をおそらく有しているであろうことが、明らかとなった。ＨＯＶ－１８９の遺伝子配列がＯＲＦＶ ＮＺ２ウイルスと非常に近縁の関係であることを考慮すると、ＨＯＶ－１８９の抗腫瘍作用機構は免疫細胞の媒介（おそらくＮＫ細胞の媒介）であり、このことが、低用量の効果及びインビトロでの複製の少なさを説明すると、出願人は仮定している。
他のＯＶと比較して、ＯＲＦＶは、臨床薬物療法剤の開発において十分には研究されていない。その疾患履歴に関して公知であることの多くは、獣医学の分野から拾い集めたものである。しかしながら、ＯＲＦＶには、ヒトのがん治療用のＯＶとして開発するための幾つかの有利な特性が存在する。第１に、ＯＲＶＦ感染はヒトにおいて重篤な疾患を生じさせない２９。第２に、ＯＲＦＶ感染は強力な免疫系刺激（Ｔｈ１優性）を誘導し、不活化ウイルス粒子であっても免疫応答を誘導する能力を保持している３０，３１。第３に、中和抗体はまれであり、ＯＲＦに対する抗体が産生されるにもかかわらず再感染が発生しうる。これは、反復投与を同じ患者に行うことが可能であり２８、また臨床開発において、連続的な応答を得るために血清型の切換え又は抗原的に特有な第２のウイルスの投与を必要とする他のＯＶと比較し、ロジスティックな改善であることを意味する。最後に、ＯＶの製造は困難であり、コスト及び時間集約型であり、また注入１回当たり典型的には１０６～１０９ＰＦＵの範囲の力価を必要とするため、低ウイルス力価のＯＲＦＶを用いた臨床応答は、ＯＶ開発におけるもう一つの実際的な進歩である。
要約すると、ＨＯＶ－１８９は、インビトロ及びインビボで、ＴＮＢＣに対して効果的な、新規な野生型キメラパラポックスウイルスである。ＴＮＢＣの治療においては標的特異的治療が存在しないため、ＨＯＶ－１８９は、この分野の免疫薬物療法のための有望な選択肢と考えられる。将来の方向性に関して、出願人は、他の異種移植モデルにおける更なる前臨床試験コース、並びに腫瘍選択性及び全体的効力を強化するための、野生型ウイルスへの遺伝子修飾を計画している。
Figure 0007631485000006
［実施例５］ 組換えキメラポックスウイルスの構築
＃３３キメラポックスウイルスのゲノムへの外来遺伝子発現カセット挿入のためのシャトルベクターの構築
チミジンキナーゼ（ＴＫ）シャトルベクターを構築するため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用い、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＴＫ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000007
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した３２。得られた断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐＧＰＴにクローニングし、ｐ３３ＮＣ－ＴＫを構築した。シャトルベクター中のＴＫの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣ－ＴＫは、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより分離されたＴＫの左右の隣接配列と、トランジェントかつドミナントな選択可能マーカーとして、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子とを含む。
Ｆ１４．５Ｌシャトルベクターを同様に構築した。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＦ１４．５Ｌ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000008
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した。得られた断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐＧＰＴにクローニングし、ｐ３３ＮＣ－Ｆ１４．５Ｌを構築した。シャトルベクター中のＦ１４．５Ｌの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣ－Ｆ１４．５Ｌは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩにより分離されたＦ１４．５Ｌの左右の隣接配列と、トランジェントなドミナント選択可能マーカーとして、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリｇｐｔ遺伝子とを含む。
＃３３キメラポックスウイルスの必須遺伝子と、マイクロＲＮＡ標的配列との融合のためのシャトルベクターの構築
＃３３キメラポックスウイルスのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ワクシニアウイルスの遺伝子Ｄ４Ｒによりコードされる）の３’末端にｍｉＲ－１００の標的配列を融合させるため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＤ４Ｒ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000009
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した。得られた断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐＧＰＴにクローニングして、ｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－ｍｉＲ１００ｔ及びｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－ｍｉＲ１００ｔ－２を得た。シャトルベクター中のＤ４Ｒの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－ｍｉＲ１００ｔは、予想通りにＤ４Ｒの３’末端に融合したｍｉＲ－１００標的配列の４つのコピーを含む一方で、ｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－ｍｉＲ１００ｔ－２は、ｍｉＲ－１００標的配列が２つのコピーが欠失した自発的な変異体である。両ベクターは、トランジェントかつドミナントな選択可能マーカーとして、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリｇｐｔを含む。
＃３３キメラポックスウイルスのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ワクシニアウイルスの遺伝子Ｄ４Ｒによりコードされる）の３’末端にＬｅｔ７ｃの標的配列を融合させるため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＤ４Ｒ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000010
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した。得られた断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐＧＰＴにクローニングし、ｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－Ｌｅｔ７ｃを構築した。シャトルベクター中のＤ４Ｒの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣＤ４Ｒ－Ｌｅｔ７ｃは、予想通りにＤ４Ｒの３’末端に融合したＬｅｔ－７ｃ標的配列の４つのコピーを含む。該ベクターは、トランジェントかつドミナントな選択可能マーカーとして、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリｇｐｔを含む。
＃３３キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ（ワクシニアウイルスの遺伝子Ｅ９Ｌによりコードされる）の３’末端にｍｉＲ－１００の標的配列を融合させるため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＥ９Ｌ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000011
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した。得られた断片をＮａｒＩ及びＭｆｅＩで切断し、ＮａｒＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたプラスミドｐＧＰＴにクローニングし、ｐ３３ＮＣＥ９Ｌ－ｍｉＲ１００ｔを構築した。シャトルベクター中のＥＬＬの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣＥ９Ｌ－ｍｉＲ１００ｔは、予想通りにＥ９Ｌの３’末端に融合したｍｉＲ１００標的配列の４つのコピーを含む。該ベクターはまた、トランジェントかつドミナントな選択可能マーカーとして、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリｇｐｔを含む。
＃３３キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ（ワクシニアウイルスの遺伝子Ｅ９Ｌによりコードされる）の３’末端にＬｅｔ７ｃの標的配列を融合させるため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、＃３３ゲノムＤＮＡから、＃３３キメラポックスウイルスのＥ９Ｌ遺伝子の左右の隣接配列をＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000012
 。２つの断片を、オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング法を用いて連結した。得られた断片をＮａｒＩ及びＭｆｅＩで切断し、ＮａｒＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたプラスミドｐＧＰＴにクローニングし、ｐ３３ＮＣＥ９Ｌ－Ｌｅｔ７ｃｔを構築した。シャトルベクター中のＥ９Ｌの隣接配列をシークエンシングにより確認した。ｐ３３ＮＣＥ９Ｌ－Ｌｅｔ７ｃは、予想通りにＥ９Ｌの３’末端に融合したＬｅｔ－７ｃ標的配列の４つのコピーを含む。該ベクターはまた、トランジェントかつドミナントな選択可能マーカーとして、ＶＡＣＶ初期プロモーターｐ７．５Ｅにより発現誘導されるエッシェリチア・コリｇｐｔを含む。
外来遺伝子発現カセットの、ＴＫ及びＦ１４．５Ｌシャトルベクターへの挿入
ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体（ｈＮＩＳ）発現カセット。合成ＶＡＣＶ初期プロモーター（ＳＥ）を有するｈＮＩＳ発現カセットを、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000013
 。ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐ３３ＮＣ－ＴＫにクローニングし、ｐ３３ＮＣＴＫ－ＳＥ－ｈＮＩＳを構築した。ｈＮＩＳ発現カセットの配列を、シークエンシングにより確認した。
エメラルド（ＧＦＰの変異体）発現カセット。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、プラスミドＥｍｅｒａｌｄ－ｐＢＡＤ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から、ＶＡＣＶ Ｈ５初期／後期プロモーターを有するＥｍｅｒａｌｄ発現カセットをＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000014
 。ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく切断しプラスミドｐ３３ＮＣ－ＴＫにクローニングし、ｐ３３ＮＣＴＫ－Ｈ５－Ｅｍｅｒａｌｄを構築した。Ｅｍｅｒａｌｄ発現カセットの配列を、シークエンシングにより確認した。
ホタルルシフェラーゼ発現カセット。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｌｕｃ２＝ｔｄＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から、ＶＡＣＶ １１Ｋの後期プロモーターを有するホタルルシフェラーゼ発現カセットをＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000015
 。ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐ３３ＮＣ－ＴＫにクローニングし、ｐ３３ＮＣＴＫ－１１Ｋ－Ｆｌｕｃ２を構築した。ホタルルシフェラーゼ発現カセットの配列を、シークエンシングにより確認した。ＶＡＣＶ ＳＥ及びＨ５プロモーターを有するホタルルシフェラーゼ発現カセットを含むプラスミドを構築するため、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｌｕｃ２＝ｔｄＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から、ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000016
 。ＰＣＲ断片を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩにより切断し、同じく切断したプラスミドｐ３３ＮＣＴＫ－ＳＥ－ｈＮＩＳと、ｐ３３ＮＣＴＫ－Ｈ５－Ｅｍｅｒａｌｄとにクローニングし、ｈＮＩＳ及びＥｍｅｒａｌｄを置換し、それぞれｐ３３ＮＣＴＫ－ＳＥ－Ｆｌｕｃ２及びｐ３３ＮＣＴＫ－Ｈ５－Ｆｌｕｃ２を構築した。両ベクター中のホタルルシフェラーゼｃＤＮＡの配列を、シークエンシングにより確認した。
ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセット。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２× Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）及び以下のプライマーを用いて、プラスミドｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から、ｍＣｈｅｒｒｙのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した：
Figure 0007631485000017
 。ＰＣＲ断片を、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩにより切断し、同じく切断したプラスミドｐ３３ＮＣＴＫ－Ｈ５－Ｅｍｅｒａｌｄと、ｐ３３ＮＣＴＫ－１１Ｋ－Ｆｌｕｃ２とにクローニングし、Ｅｍｅｒａｌｄ及びホタルルシフェラーゼを置換し、それぞれｐ３３ＮＣＴＫ－Ｈ５－ｍＣｈｅｒｒｙ及びｐ３３ＮＣＴＫ－１１Ｋ－ｍＣｈｅｒｒｙを構築した。両ベクター中のｍＣｈｅｒｒｙのｃＤＮＡの配列を、シークエンシングにより確認した。
抗ＰＤ－Ｌ１単鎖抗体発現カセット。ＶＡＣＶ Ｈ５プロモーター、Ｉｇκ軽鎖リーダー配列、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列により分離されたアテゾリズマブのＶＨ及びＶＬ鎖配列、及びＣ末端ＦＬＡＧタグ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１単鎖抗体発現カセットの合成は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）により行われた。断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく切断したプラスミドｐ３３ＮＣ－Ｆ１４．５Ｌにクローニングし、ｐ３３ＮＣＦ１４．５Ｌ－Ｈ５－抗ＰＤ－Ｌ１を構築した。抗ＰＤ－Ｌ１単鎖抗体発現カセットの配列をシークエンシングにより確認した。
組換えキメラポックスウイルスの作製
ＣＶ－１細胞を、０．１の多重感染度（ＭＯＩ）で１時間親ウイルスに感染させ、次にｊｅｔＰＲＩＭＥインビトロＤＮＡ＆ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクション、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を用いて導入ベクター（表５）と共にトランスフェクションした。感染後の２日目に、感染／トランスフェクション細胞を回収し、組換え型ウイルスを選択し、以前に記載の通りプラーク精製した３３。
Figure 0007631485000018
Figure 0007631485000019
［実施例６］ キメラポックスウイルス組成物及びその使用
出願人は最近、ウイルスキメラの生成のための特有の方法論を用いて新規な腫瘍溶解性キメラポックスウイルスを開発し、ＮＣＩ－６０細胞株及び膵細胞株におけるハイスループットスクリーニングを行った。これらの新規なキメラポックスウイルスは、複数の親ウイルスの最良のターゲティング能力を利用するもので、これらの親ウイルス及び現在ヒト臨床試験中の腫瘍溶解性ウイルスと比較し、７０以上のがん細胞株において優れた殺腫瘍性活性を示すものである。ヒトのトリプルネガティブ乳がん、膵がん及び肺がんの異種移植モデルにおいて、新規なキメラポックスウイルスは、目立った副作用なく、１０００プラーク形成単位でのウイルスの単回腫瘍内注入により腫瘍を縮小できる。これは、臨床試験中のほとんどの腫瘍溶解性ウイルスより２～５桁低い。加えて、キメラポックスウイルスは注入腫瘍から非注入腫瘍まで効率的に拡散し、より強い遠達効果（非注入遠隔腫瘍の収縮）をもたらした。
インビトロ及びインビボでのウイルス感染及び複製をモニターするため、Ｅｍｅｒａｌｄ（ＧＦＰの変異体）、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質）及びホタルルシフェラーゼ発現カセットをキメラポックスウイルスに挿入した。これらの光学的イメージング遺伝子の発現は容易に検出可能であり、それにより、顕著にウイルスの複製及び効力に影響を与えずに、インビボでウイルスの複製及び拡散のモニタリングが大いに補助される。
治療的遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを作動状態にすることは、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を改善するための広く受け入れられているストラテジーである。全ての試験した治療的遺伝子の中で、ヒトナトリウム及びヨウ素共輸送体（ｈＮＩＳ）は、前臨床試験及び治験において非常に良好な結果を得ている。ｈＮＩＳは、甲状腺胞状細胞の基底面に存在する膜結合糖タンパク質である。それは細胞質へのヨウ素の輸送を促進し、甲状腺ホルモンの合成プロセスに組み込まれる。この分子を用いることにより、分化した甲状腺がんのイメージング及び治療において放射性ヨウ素の蓄積が良好になされ、高い反応性及び治療率（＞９０％）が得られている。ｈＮＩＳ発現カセットを、キメラポックスウイルスに挿入することで、非甲状腺がんを、放射性ヨウ素又はレニウム－１８８治療に応答すると考えられる「甲状腺様」がんに変換する。このように、「甲状腺様」がんへの転換後の非甲状腺がんは、放射性ヨウ素を用いることでイメージングが可能となり、少なくとも以下の３つの機構により潜在的に破壊される：腫瘍溶解性ウイルスの固有の腫瘍溶解活性、標的特異的な放射線治療、並びに腫瘍溶解性ウイルス及び放射線治療により媒介される抗腫瘍免疫応答。出願人は、ｈＮＩＳ発現キメラポックスウイルスによる感染後、腫瘍細胞の細胞膜にｈＮＩＳが適切に発現されることを示している。更に、最初の実験結果は、ｈＮＩＳ発現カセットの挿入が、インビトロ及び動物モデルにおいて、親ウイルスの固有の腫瘍溶解活性に影響を及ぼさないことを示している。加えて、出願人は、ｈＮＩＳ発現キメラポックスウイルスが腫瘍担持マウスにおいて安全であることを示している。
免疫チェックポイント阻害剤は、固形腫瘍の治療を飛躍的に高めた薬物であり、黒色腫、非小細胞肺癌及び腎細胞癌の治療用に承認されている。これらの薬物は、既存の抗腫瘍免疫応答を必要とする。腫瘍溶解性ウイルスによる免疫系のプライミングは、患者の免疫レパートリーを刺激し、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＴＬＡ－４療法をより強力にする。腫瘍溶解性ウイルスを免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせることにより、免疫寛容を誘導する複数の免疫経路を回避できる。加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、感染した腫瘍における細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤を促進し、ＩＦＮ－γ産生細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化を通じてＣＴＬＡ－４又はＰＤ－Ｌ１の上方制御を誘導し、抗ＣＴＬＡ－４及び抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法の最大の治療効果の実現を可能にする。幾つかの前臨床試験データは、腫瘍溶解性ウイルス治療とチェックポイント遮断との組合せをサポートしている。最初にＦＤＡ承認された腫瘍溶解性ウイルスＴ－ＶＥＣと、抗ＣＴＬＡ－４及び抗ＰＤ－１抗体との組合せを評価する臨床試験が現在進行中である。最初の結果は肯定的なものである。キメラポックスウイルス、特にｈＮＩＳ発現キメラポックスウイルスにより開始される抗腫瘍免疫応答を強化するため、キメラポックスウイルス又はｈＮＩＳ発現キメラポックスウイルスに、抗ＰＤ－Ｌ１発現カセットを挿入する。出願人の予想では、ｈＮＩＳの腫瘍溶解性ウイルスへの挿入が、放射性ヨウ素による相乗的な腫瘍細胞の殺傷と、感染した腫瘍細胞の核医学イメージングを可能にする一方で、同じベクター中の抗ＰＤ－Ｌ１のような免疫賦活性導入遺伝子の発現が、抗腫瘍免疫応答を非常に強化しつつ、標的特異的な自己免疫性の毒性を低下させると考える。
［実施例７］ 腫瘍溶解性ウイルス療法による膵がんのターゲティング
細胞毒性アッセイ
５％のＦＢＳ及び１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む１００μＬのＲＰＭＩ中の、がん細胞株Ｐａｎｃ－１（図１２Ａ～１２Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１２Ｃ～１２Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１２Ｅ～１２Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１２Ｇ～１２Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１２Ｉ～１２Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１２Ｋ～１２Ｌ）を、ウェル１つ当たり３×１０３がん細胞でプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス（＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９のいずれか）２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３回繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。ＳＵ．８６．８６の場合、統計分析は各ＭＯＩにおいて対応のないｔ検定を用いて実施した。
ウイルスの増殖曲線
１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む２ｍＬのＲＰＭＩ中の、がん細胞株Ｐａｎｃ－１（図１３Ａ～１３Ｂ）、ＭｉａＰａＣａ－２（図１３Ｃ～１３Ｄ）、ＢｘＰＣ－３（図１３Ｅ～１３Ｆ）、ＳＵ．８６．８６（図１３Ｇ～１３Ｈ）、Ｃａｐａｎ－１（図１３Ｉ～１３Ｊ）及びＡｓＰＣ－１（図１３Ｋ～１３Ｌ）を、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭＩ中、＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩを１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
インビボでの膵がん腫瘍の治療
１８匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＭｉａＰａＣａ－２を２×１０６個で移植した。腫瘍サイズが４００ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳ（３匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で、＃３３（５匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）を５０μＬで注入した。ＨＯＶ－３３の実際の投与量は７．８×１０４であった。ＨＯＶ－３３－ＳＥ／ｈＮＩＳの実際の投与量は４．５×１０４であった。ＨＯＶ－３３－ＳＥ／ｈＮＩＳ－Ｅ９Ｌ－ｍｉＲ１００ｔの実際の投与量は１．６×１０５であった。注入腫瘍及び非注入腫瘍の正味の重量変化率％及び変化率％を、４３日間にわたり、週２回記録した（図１４Ａ～１４Ｃ）。全てのマウスを４３日目に屠殺し、マウスの器官に対してウイルス力価測定を行った。ＰＢＳのコントロールと比較した、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ及び＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔで注入腫瘍の有意差を強調した（図１４Ｂ、それぞれｐ＝０．０１、ｐ＝０．０１及びｐ＝０．０００１）。非注入腫瘍群では、有意差は、ＰＢＳコントロールと＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳとの間にみられるだけだった（図１４Ｃ、ｐ＝０．０３）。
２６匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍Ｐａｎｃ－１を１．２５×１０６個で移植した。腫瘍サイズが約２５０ｍｍ３となったとき、左側の腫瘍にＰＢＳを５０μＬ（４匹のマウス）、並びに約１×１０５ＰＦＵ／投与で、＃３３（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ（６匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔ（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を注入した。ＨＯＶ－３３の実際の投与量は８．６×１０２であった。ＨＯＶ－３３－ＳＥ／ｈＮＩＳの実際の投与量は６．３×１０２であった。ＨＯＶ－３３－Ｈ５Ｆｌｕｃの実際の投与量は１×１０４であった。ＨＯＶ－３３－ＳＥ／ｈＮＩＳ－Ｅ９Ｌ－ｍｉＲ１００ｔの実際の投与量は１．０×１０３であった。注入腫瘍及び非注入腫瘍の正味の重量変化率％及び変化率％を、４３日間にわたり、週２回記録した（図１５Ａ～１５Ｃ）。全てのマウスを４５日目に屠殺した。ＰＢＳコントロールと比較した、全ての群における注入腫瘍体積変化率％の有意差を強調した（図１５Ｂ、ｐ＝０．０００１）。ＰＢＳのコントロールと比較した、＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２及び＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ－Ｅ９ＬｍｉＲ１００ｔで非注入腫瘍の有意差を強調した（図１５Ｃ、それぞれｐ＝０．００３、ｐ＝０．００８及びｐ＝０．００２）。
週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬのＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した（図１６）。
［実施例８］ 腫瘍溶解性ウイルス療法による結腸がんのターゲティング
細胞毒性アッセイ
１００μＬのＭｃＣｏｙ ５Ａ培地、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液中、ＨＴ－２９（図１７Ａ～１７Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図１７Ｃ～１７Ｄ）がん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス（＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９のいずれか）溶液２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３回繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
１００μＬのＲＰＭＩ、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液中、ＳＷ６２０（図１８Ａ～１８Ｂ）、ＳＷ４８０（図１８Ｃ～１８Ｄ）及びＣＯＬＯ ３２０ＤＭ（図１８Ｅ～Ｆ）のがん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス（＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９のいずれか）溶液２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３回繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
１００μＬのＦ－１２Ｋ培地、５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液中、ＬｏＶｏ（図１９Ａ～１９Ｂ）がん細胞株を、ウェル１つ当たり３×１０３細胞でプレーティングし、２４時間にわたり細胞毒性アッセイを実施した。次にウイルス（＃３３、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９のいずれか）溶液２０μＬを、１、０．１及び０．０１の多重感染度（ＭＯＩ）で添加した。全てのウェルにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを２０μＬ添加し、１時間のインキュベート後に比色分析し、日々の細胞生存率アッセイを実施した。実験結果は、培地のみ及びＭＯＩゼロのコントロールに関し標準化した。この実験をそれぞれ３回繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
ウイルスの増殖曲線
２ｍＬのＭｃＣｏｙ ５Ａ培地（１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液）中、ＨＴ－２９（図２０Ａ～２０Ｂ）及びＨＣＴ－１１６（図２０Ｃ～２０Ｄ）がん細胞株を、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間おいた。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
２ｍＬのＲＰＭＩ（１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液）中、ＳＷ６２０（図２１Ａ～２１Ｂ）及びＳＷ４８０（図２１Ｃ～２１Ｄ）がん細胞株を、ウェル１つ当たり５×１０５細胞でプレーティングし、２４時間にわたりウイルス増殖曲線を３回作成した。次に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含む５００μＬのＲＰＭ中、＃３３、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、ＧＬＶ－１ｈ６８又は＃１８９を多重感染度（ＭＯＩ）０．０１で添加し、２０分毎に振とうしながら１時間インキュベートした。１時間後に培地を吸引し、２．５％のＦＢＳ、１％の抗生物質（抗真菌剤）溶液を含むＲＰＭＩ培地を１．５ｍＬ添加した。２４、４８及び７２時間で細胞及び上清を回収し、３回の凍結及び解凍サイクルの後、２連で連続希釈を実施した。この実験を２連で繰り返した。各時点で、一方向ＡＮＯＶＡを用い、＃３３と他の実験群とを比較し、統計分析を実施した。
ＨＣＴ－１１６＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ免疫組織化学
＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳのインビトロイメージングを、１、０．１及び０．０１のＭＯＩで、２４、４８及び７２時間にＨＣＴ－１１６において実施した。２×１０５のＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ ＭｃＣｏｙの５Ａ培地の５００μＬ中、８チャンバースライドの各ウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後に培地を吸引し、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳを適切なＭＯＩで２．５％のＦＢＳ ＭｃＣｏｙの５Ａ培地２００μＬで各ウェルに添加した。１時間後に培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地（＋１０％のＦＢＳ）で培地を交換した。２４、４８又は７２時間後に培地を吸引した。４％のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定した。これを次にＰＢＳで２回洗浄した。氷上で５分間、０．１％のトリトンＸ－１００／ＰＢＳにより透過化処理を実施した。細胞をＰＢＳで再び洗浄した。次に、３７℃で、３０分間のＴＮＢブロッキングバッファーにおいて、スライドをインキュベートした（ＴＮＢブロッキングバッファー：０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５のＮａＣｌ及び０．５％のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログＦＰ１０２０）。ＴＮＢブロッキングバッファーのマウス抗ヒトナトリウムヨウ素輸送体（ｈＮＩＳ）抗体の１：５０希釈液を添加し、４℃で一晩インキュベートした（ａｂ１７７９５）。次にスライドをＰＢＳにより２回洗浄し、次にＴＮＢブロッキングバッファー中のヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）（ａｂ１５０１１３）の１：１００希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＮＢ中のウサギ抗ワクシニア抗体（ａｂ３５２１９）の１：２００希釈液を添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＮＢで３０分間ブロッキングした。次に、ヤギ抗ウサギ二次抗体の１：１００の希釈液を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩの１：１０００希釈液を室温で５分間添加した。ＰＢＳで再度洗浄した。ＥＶＯＳ自動細胞イメージングシステムを用いて画像を撮影した（図２２）。
ＨＣＴ－２９＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ免疫組織化学
＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳのインビトロイメージングを、１、０．１及び０．０１のＭＯＩで、２４、４８及び７２時間にＨＣＴ－２９において実施した。２×１０５のＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ ＭｃＣｏｙの５Ａ培地の５００μＬ中、８チャンバースライドの各ウェルに添加した。２４時間のインキュベーション後に培地を吸引し、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳを適切なＭＯＩで２．５％のＦＢＳ ＭｃＣｏｙの５Ａ培地２００μＬで各ウェルに添加した。１時間後に培地を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。１ｍＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地（＋１０％のＦＢＳ）で培地を交換した。２４、４８又は７２時間後に培地を吸引した。４％のパラホルムアルデヒドを用いて室温で１５分間固定した。これを次にＰＢＳで２回洗浄した。氷上で５分間、０．１％のトリトンＸ－１００／ＰＢＳにより透過化処理を実施した。細胞をＰＢＳで再び洗浄した。次に、３７℃で、３０分間のＴＮＢブロッキングバッファーにおいて、スライドをインキュベートした（ＴＮＢブロッキングバッファー：０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５のＮａＣｌ及び０．５％のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログＦＰ１０２０）。ＴＮＢブロッキングバッファーのマウス抗ヒトナトリウムヨウ素輸送体（ｈＮＩＳ）抗体の１：５０希釈液を添加し、４℃で一晩インキュベートした（ａｂ１７７９５）。次にスライドをＰＢＳにより２回洗浄し、次にＴＮＢブロッキングバッファー中のヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）（ａｂ１５０１１３）の１：１００希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＮＢ中のウサギ抗ワクシニア抗体（ａｂ３５２１９）の１：２００希釈液を添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＴＮＢで３０分間ブロッキングした。次に、ヤギ抗ウサギ二次抗体の１：１００の希釈液を添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩの１：１０００希釈液を室温で５分間添加した。ＰＢＳで再度洗浄した。ＥＶＯＳ自動細胞イメージングシステムを用いて画像を撮影した（図２３）。
インビボでの結腸がん腫瘍の治療
１４匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＨＴ－２９を５×１０６細胞で移植した。腫瘍サイズが２００ｍｍ３となったとき、両側の腫瘍にＰＢＳを５０μＬ（４匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で＃３３（５匹のマウス）又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２（５匹のマウス）で注入した。正味の重量変化率％及び腫瘍の変化率％を４２日間にわたり週２回記録した。各群から２匹のマウスを１０日後に屠殺し、器官ごとのウイルス力価測定及びＩＨＣを実施した。全ての残存マウスを４２日目に屠殺し、マウスの器官に対してウイルス力価測定を行った。ＰＢＳコントロールと、＃３３（３匹のマウス）及び＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２とを比較したときの腫瘍体積変化率％の有意差（それぞれｐ＝０．０２及びｐ＝０．０３）を強調表示した（図２４）。
週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬ ＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した（図２５）。
１９匹の雌の胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の両脇腹に、腫瘍ＨＣＴ－１１６を５×１０６細胞で移植した。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３となったとき、両側の腫瘍にＰＢＳを５０μＬ（２匹のマウス）、約１×１０５ＰＦＵ／投与で＃３３（３匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ又は＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２を注入した。正味の重量変化率％及び腫瘍の変化率％を４２日間にわたり週２回記録した。各群から２匹のマウスを１０日後に屠殺し、器官ごとのウイルス力価測定及びＩＨＣを実施した。全ての残存マウスを４２日目に屠殺し、マウスの器官に対してウイルス力価測定を行った。ＰＢＳコントロールと、＃３３（３匹のマウス）、＃３３－（ＳＥ）ｈＮＩＳ及び＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２とを比較したときの腫瘍体積変化率％の有意差（図２６、それぞれｐ＝０．０００２、ｐ＝０．０００１及びｐ＝０．０００２）を強調表示した。
週２回、１匹のＰＢＳコントロールマウス及び３匹の＃３３－（Ｈ５）Ｆｌｕｃ２注入マウスの腹膜内に、４．２８ｍｇのルシフェリン／１５０μＬ ＰＢＳを注入した。７分後、標準的な露光でルシフェラーゼイメージングを得た。相対単位を各時点で記録し、バックグラウンドとしてのＰＢＳコントロールマウスとの比較で分析した（図２７）。
［実施例９］ 腫瘍溶解性ウイルス療法による肺がんのターゲティング
細胞毒性アッセイ
肺がん及び肺線維芽細胞における、感染後７２時間目における、腫瘍溶解性ウイルスにより媒介される細胞毒性。５０００個のＡ５４９、Ｈ２１９９又はＨＦ１線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。翌日、示される多重感染度（ＭＯＩ、０、０．００１、０．０１、０．１、１のＭＯＩ）で、種々のウイルスにより細胞を感染させ、又は偽感染させた。＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、＃１８９、ＧＬＶ－１ｈ６８及びＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰウイルスを使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）を用いて感染後７２時間における細胞生存率を測定した。感染細胞Ａ５４９（図２８Ａ）、Ｈ２１９９（図２８Ｂ）及びＨＦ１線維芽細胞（図２８Ｃ）の生存率を、偽感染細胞の生存率との比較により算出した。
インビボでの肺がん腫瘍の治療
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、腫瘍内部に＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ１ｈ６８又はＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰを１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）で注入した。３つのウイルス全ては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子をコードする。週２回小動物イメージング装置（ＬａｇｏＸイメージングシステム）を使用してマウスの緑色蛍光（励起：４６５及び放出：５３０ｎｍ）を撮像し、ＡＭＩｖｉｅｗ画像処理ソフトウェアを使用してイメージング処理した（図２９）。
マウスの体重
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８又はＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）で注入した。マウスを週２回体重測定し、これらの体重変化率％を測定した（図３０）。図３０において、各折れ線は個々のマウスの体重を表す。
腫瘍退縮
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて、注入（図３１Ａ）及び非注入（図３１Ｂ）腫瘍の体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。図３１Ａ及び３１Ｂにおいて、各折れ線は個々のマウスの腫瘍体積を表す。
Ａ５４９異種移植モデルにおける、ウイルス注入腫瘍の体積
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。図３２において、各折れ線は、個々の処理群の標準偏差付きの経時的な平均腫瘍体積（注入あり）を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。
Ａ５４９異種移植モデルにおける、ウイルス非注入腫瘍の体積
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。図３３において、各折れ線は、個々の処理群の標準偏差付きの経時的な平均腫瘍体積（注入なし）を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。
注入及び非注入腫瘍の体積の変化倍数
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝４又は５）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ、＃１８９、ＰＢＳコントロール）を腫瘍内部に、又は＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄを腹膜内（ｉ．ｐ）に、１０３ＰＦＵで注入した。デジタルカリパス副木を用いて腫瘍体積を週２回測定した（体積＝｛（長さ）２×幅／２｝。ウイルス注入時（すなわち０日目）の腫瘍体積に対して、種々の時点における腫瘍体積を正規化することにより、腫瘍体積の変化倍数を算出した。各折れ線は、注入（図３４Ａ）、及び非注入（図３４Ｂ）腫瘍における、個々の処理群の標準偏差付きの平均腫瘍体積の変化倍数を表す。統計分析：２４日目の一方向ＡＮＯＶＡ（＊＝ｐ＜０．０５）。
注入及び非注入腫瘍（Ａ５４９モデル）におけるウイルスの生体内分布
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、示されるウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８又はＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ）を腫瘍内部に１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３５Ａは、各ウイルス注入腫瘍のＰＦＵ／ｇ腫瘍で表すウイルス力価を示し、図３５Ｂは、各ウイルス非注入腫瘍のＰＦＵ／ｇ腫瘍で表すウイルス力価を示す。
マウス（Ａ５４９モデル）の卵巣におけるウイルス力価
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右側の腫瘍にのみ、腫瘍内部に示すウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ）を１０３ＰＦＵで注入した。ウイルス注入の６日後に、腫瘍及び健常な臓器を回収した。回収された組織を秤量し、小片に切り刻み、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｇｏｌｄホモジナイザーを用いて１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ホモジネートに対し、凍結融解サイクルを３回施し、更に１分間超音波処理した。ホモジネートを３分間の１０００ｒｐｍでスピンダウンし、上清を回収した。上清を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した。図３６は、各ウイルスのＰＦＵ／ｇ組織（卵巣）で表すウイルス力価を示す。＊＊ＮＤは、ウイルスが検出されなかったことを意味する。
ウイルス注入の２０日後における血液中ウイルス力価
Ａ５４９（ヒト肺がん細胞）を培養し、トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳ及びマトリゲル＝１：１中に再懸濁し、１００μＬ当たり５×１０６細胞に調製した。細胞懸濁液１００μＬを胸腺切除ヌードマウスの上部両横腹に皮下注入し、マウス１匹当たり２つの腫瘍を発生させた。腫瘍細胞注入後３週目に、各群が同等の平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）となるよう、種々の処理群（ｎ＝３）にマウスを分けた。分割の後、各マウスの右の腫瘍にのみ、腫瘍内部に示すウイルス（＃３３、＃３３－（Ｈ５）Ｅｍｅｒａｌｄ、ＧＬＶ－１ｈ６８、ＯｎｃｏＶＥＸＧＦＰ、Ｔ－ＶＥＣＴＭ）を１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）で注入した。顔面静脈穿刺によりマウス（ｎ＝３）から血液を回収した。凍結融解を３回繰り返した後、血液を連続希釈し、標準的なプラークアッセイを用いてウイルス力価を測定した（図３７）。＊＊ＮＤは、ウイルスが検出されなかったことを意味する。
Figure 0007631485000020
Figure 0007631485000021
Figure 0007631485000022
Ｐ実施形態
実施形態Ｐ１． 配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスであって、前記核酸配列が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルスＮＺ２株及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片を含む、キメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ２． 前記核酸配列が、少なくとも８０％の配列同一性を有する、実施形態Ｐ１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ３． 前記核酸配列が、少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態Ｐ１又はＰ２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ４． 前記核酸配列が、少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態Ｐ１～Ｐ３のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ５． 前記核酸配列が、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ６． 前記核酸配列が、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ７． 前記核酸断片が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ８． 前記核酸断片が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来である、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ９． 前記キメラポックスウイルスが、
（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに
（ｉｉ）前記少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成させること
を含む方法により形成される、実施形態Ｐ１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１０． 前記細胞が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染される、実施形態Ｐ９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１１． 前記細胞が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染される、実施形態Ｐ９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１２． 前記キメラポックスウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１３． 前記ポックスウイルスが、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１２のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１４． 前記ｍｉＲＮＡ結合配列が、前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部を形成する、実施形態Ｐ１３に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態Ｐ１５． 実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルスをコードする単離された核酸。
実施形態Ｐ１６． 治療有効量の実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルスを含む医薬組成物。
実施形態Ｐ１７． それを必要とする被験者のがんを治療する方法であって、前記被験者に、治療有効量の実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つのキメラポックスウイルスを投与し、それにより前記被験者のがんを治療することを含む前記方法。
実施形態Ｐ１８． 前記がんが、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫である、実施形態Ｐ１７に記載の方法。
実施形態Ｐ１９． 投与することが、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスを投与することを含む、実施形態Ｐ１７又はＰ１８に記載の方法。
実施形態Ｐ２０． 前記第１のキメラポックスウイルスが、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である核酸断片を含む、実施形態Ｐ１９に記載の方法。
実施形態Ｐ２１． 前記第２のキメラポックスウイルスが、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む、実施形態Ｐ１９又はＰ２０に記載の方法。
実施形態Ｐ２２． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、組み合わせた相乗的な量で投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２３． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、同時に投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２４． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、順次投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２５． 前記ポックスウイルスが、少なくとも１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２６． 前記ポックスウイルスが、少なくとも１０６プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２７． 前記ポックスウイルスが、約１０８プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態Ｐ１９～Ｐ２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２８． キメラポックスウイルスを形成する方法であって、
（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに
（ｉｉ）前記少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それにより前記キメラポックスウイルスを形成させること
を含む、方法。
実施形態Ｐ２９． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約１未満の多重感染度で各々存在する、実施形態Ｐ２８に記載の方法。
実施形態Ｐ３０． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約０．１未満の多重感染度で各々存在する、実施形態Ｐ２８又はＰ２９に記載の方法。
実施形態Ｐ３１． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約０．０１の多重感染度で各々存在する、実施形態Ｐ２８～Ｐ３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ３２． 前記細胞が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染される、実施形態Ｐ２８に記載の方法。
実施形態Ｐ３３． 前記細胞が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染される、実施形態Ｐ２８に記載の方法。
実施形態Ｐ３４． 前記キメラポックスウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態Ｐ２８～Ｐ３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ３５． 前記ポックスウイルスが、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、実施形態Ｐ２８～Ｐ３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ３６． 細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つのキメラポックスウイルスを細胞に接触させることを含む、前記方法。
実施形態Ｐ３７． 前記細胞ががん細胞である、実施形態Ｐ３６に記載の方法。
実施形態Ｐ３８． 前記がん細胞が、乳がん細胞、結腸がん細胞、腎臓がん細胞、白血病細胞、肺がん細胞、黒色腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、膵がん細胞、脳がん細胞、肝がん細胞、胃がん細胞又は肉腫細胞である、実施形態Ｐ３７に記載の方法。
実施形態
実施形態１． 配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスであって、前記核酸配列が、（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列を含む、キメラポックスウイルス。
実施形態２． 前記核酸配列が、（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルス株Ｈｅｒｍａｎ、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列を含む、実施形態１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、前記キメラポックスウイルスの非必須遺伝子の一部を形成する、実施形態１又は２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４． 前記非必須遺伝子が、チミジンキナーゼ遺伝子である、実施形態３に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態５． 前記非必須遺伝子が、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子である、実施形態３に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態６． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はヨウ化ナトリウム共輸送体を独立にコードする、実施形態１～５のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態７． 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖである、実施形態６に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態８． 前記非必須遺伝子の部分が欠失している、実施形態１～７のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態９． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、プロモーターに各々作動可能に連結されている、実施形態１～８のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１０． 前記プロモーターが、ワクシニアウイルス初期プロモーターである、実施形態９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１１． 前記プロモーターが、合成された初期プロモーターである、実施形態９又は１０に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１２． 前記プロモーターが、ワクシニアウイルス後期プロモーターである、実施形態９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１３． 前記プロモーターが、Ｈ５プロモーター又は１１Ｋプロモーターである、実施形態９又は１２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１４． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、前記キメラポックスウイルスの必須遺伝子に作動可能に連結されている、実施形態１～８のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１５． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１６． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１７． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１８． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子の３’末端に作動可能に連結されている、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態１９． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、ｍｉＲＮＡ結合配列を独立にコードする、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２０． 前記ｍｉＲＮＡ結合配列が、ｍｉＲ１００結合配列又はｌｅｔ７ｃ結合配列である、実施形態１９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２１． 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列が、第１の抗がん核酸配列及び第２の抗がん核酸配列である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２２． 前記第１の抗がん核酸配列が、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、前記第２の抗がん核酸配列が、ｍｉＲＮＡ結合配列をコードする、実施形態２１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２３． 前記第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、前記第２の抗がん核酸配列が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、実施形態２２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２４． 前記第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、前記第２の抗がん核酸配列が、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、実施形態２２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２５． 前記第１の抗がん核酸配列が、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、前記第２の抗がん核酸配列が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする、実施形態２１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２６． 前記第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、前記第２の抗がん核酸配列が、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子の一部を形成する、実施形態２５に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２７． 前記核酸配列が、（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片、並びに（ｉｉ）前記検出可能部分をコードする核酸配列を含む、実施形態１に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２８． 前記検出可能部分をコードする核酸配列が、蛍光部分をコードする、実施形態２７に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態２９． 前記検出可能部分をコードする核酸配列が、前記キメラポックスウイルスの非必須遺伝子の一部を形成する、実施形態２７又は２８に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３０． 前記非必須遺伝子が、チミジンキナーゼ遺伝子である、実施形態２９に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３１． 前記非必須遺伝子の部分が欠失している、実施形態２９又は３０に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３２． 前記検出可能部分をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２７～３１のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３３． 前記プロモーターが、ワクシニアウイルス初期プロモーターである、実施形態３２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３４． 前記プロモーターが、合成された初期プロモーターである、実施形態３３に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３５． 前記プロモーターが、ワクシニアウイルス後期プロモーターである、実施形態３２に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３６． 前記プロモーターが、Ｈ５プロモーター又は１１Ｋプロモーターである、実施形態３５に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３７． 前記核酸配列が、少なくとも８０％の配列同一性を有する、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３８． 前記核酸配列が、少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態３９． 前記核酸配列が、少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４０． 前記核酸配列が、少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４１． 前記核酸配列が、少なくとも９８％の配列同一性を有する、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４２． 前記核酸断片が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来である、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４３． 前記核酸断片が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来である、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４４． 前記キメラポックスウイルスが、（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに（ｉｉ）前記少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成させることを含む方法により形成される、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４５． 前記細胞が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染される、実施形態４４に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４６． 前記細胞が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染される、実施形態４４に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４７． 前記キメラポックスウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１～４６のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４８． 前記ポックスウイルスが、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、実施形態１～４７のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルス。
実施形態４９． 前記ｍｉＲＮＡ結合配列が、前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部を形成する、実施形態４８に記載のキメラポックスウイルス。
実施形態５０． 実施形態１～４９のいずれか１つに記載のキメラポックスウイルスをコードする単離された核酸。
実施形態５１． 治療有効量の実施形態１～４９のいずれか１つのキメラポックスウイルスを含む医薬組成物。
実施形態５２． それを必要とする被験者のがんを治療する方法であって、前記被験者に、治療有効量の実施形態１～４９のいずれか１つのキメラポックスウイルスを投与し、それにより前記被験者のがんを治療することを含む前記方法。
実施形態５３． 前記がんが、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４． 前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、実施形態５２又は５３に記載の方法。
実施形態５５． 投与することが、第１のキメラポックスウイルス及び第２のキメラポックスウイルスを投与することを含む、実施形態５２～５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６． 前記第１のキメラポックスウイルスが、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株由来の核酸断片を含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７． 前記第２のキメラポックスウイルスが、配列番号２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含み、核酸配列が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株由来の核酸断片を含む、実施形態５５又は５６に記載の方法。
実施形態５８． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、組み合わせた相乗的な量で投与される、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、同時に投与される、実施形態５５～５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０． 前記第１のキメラポックスウイルス及び前記第２のキメラポックスウイルスが、順次投与される、実施形態５５～５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１． 前記ポックスウイルスが、少なくとも１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２． 前記ポックスウイルスが、約１０３プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３． 前記ポックスウイルスが、少なくとも１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４． 前記ポックスウイルスが、約４×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５． 前記ポックスウイルスが、約５×１０４プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６． 前記ポックスウイルスが、少なくとも１０６プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７． 前記ポックスウイルスが、約１０８プラーク形成単位（Ｐｆｕ）／ｋｇで投与される、実施形態５２～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８． キメラポックスウイルスを形成する方法であって、
（ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、ワクシニアウイルスＡＳ株、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに（ｉｉ）前記少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それにより前記キメラポックスウイルスを形成させることを含む、方法。
実施形態６９． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約１未満の多重感染度で各々存在する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約０．１未満の多重感染度で各々存在する、実施形態６８又は６９に記載の方法。
実施形態７１． 前記少なくとも２つのポックスウイルス株が、約０．０１の多重感染度で各々存在する、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２． 前記細胞が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株及びワクシニアウイルスＡＳ株により感染される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７３． 前記細胞が、オルフウイルス株ＮＺ２及び偽ウシポックスウイルスＴＪＳ株により感染される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７４． 前記キメラポックスウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態６８～７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５． 前記ポックスウイルスが、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む、実施形態６８～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６． 細胞の細胞増殖を阻害する方法であって、実施形態１～４９の１つのキメラポックスウイルスを細胞に接触させることを含む前記方法。
実施形態７７． 前記細胞ががん細胞である、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８． 前記がん細胞が、乳がん細胞、大腸がん細胞、腎臓がん細胞、白血病細胞、肺がん細胞、黒色腫細胞、卵巣がん細胞、前立腺がん細胞、膵がん細胞、脳がん細胞、肝がん細胞、胃がん細胞又は肉腫細胞である、実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９． 前記がん細胞が、トリプルネガティブ乳がん細胞である、実施形態７７又は７８に記載の方法。

Claims (42)

  1. 配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株由来の核酸断片を含み、
    前記核酸配列が、（ｉ）１つ又は複数の抗がん核酸配列、又は（ｉｉ）検出可能部分をコードする核酸配列をさらに含む、キメラポックスウイルス。
  2. 核酸配列が、１つ又は複数の抗がん核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  3. 前記１つ又は複数の抗がん核酸配列または前記検出可能な部分をコードする配列が、前記キメラポックスウイルスの非必須遺伝子に挿入される、請求項１又は２に記載のキメラポックスウイルス。
  4. 非必須遺伝子が、チミジンキナーゼ遺伝子またはＦ１４．５Ｌ遺伝子である、請求項３に記載のキメラポックスウイルス。
  5. １つ又は複数の抗がん核酸配列が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤又はヨウ化ナトリウム共輸送体を独立にコードする、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  6. ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖである、請求項５に記載のキメラポックスウイルス。
  7. １つ又は複数の抗がん核酸配列または検出可能な部分をコードする配列が、プロモーターに各々作動可能に連結されている、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  8. プロモーターが、ワクシニアウイルス初期プロモーター、合成された初期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーター、Ｈ５プロモーター又は１１Ｋプロモーターである、請求項７に記載のキメラポックスウイルス。
  9. １つ又は複数の抗がん核酸配列が、キメラポックスウイルスの必須遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  10. １つ又は複数の抗がん核酸配列が、キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子又はウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  11. １つ又は複数の抗がん核酸配列が、ｍｉＲＮＡ結合配列を独立にコードする、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  12. ｍｉＲＮＡ結合配列が、ｍｉＲ１００結合配列又はｌｅｔ７ｃ結合配列である、請求項１１に記載のキメラポックスウイルス。
  13. １つ又は複数の抗がん核酸配列が、第１の抗がん核酸配列及び第２の抗がん核酸配列である、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  14. 第１の抗がん核酸配列が、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、第２の抗がん核酸配列が、ｍｉＲＮＡ結合配列をコードする、請求項１３に記載のキメラポックスウイルス。
  15. 第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１４に記載のキメラポックスウイルス。
  16. 第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子の一部を形成し、第２の抗がん核酸配列が、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に作動可能に連結されている、請求項１４に記載のキメラポックスウイルス。
  17. 第１の抗がん核酸配列が、ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードし、第２の抗がん核酸配列が、ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする、請求項１３に記載のキメラポックスウイルス。
  18. 第１の抗がん核酸配列が、チミジンキナーゼ遺伝子に挿入されており、第２の抗がん核酸配列が、Ｆ１４．５Ｌ遺伝子に挿入されている、請求項１７に記載のキメラポックスウイルス。
  19. 核酸配列が、検出可能部分をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  20. 検出可能部分をコードする核酸配列が、蛍光部分をコードする、請求項１９に記載のキメラポックスウイルス。
  21. 核酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  22. （ｉ）ウシポックスウイルスＢｒｉｇｈｔｏｎ株、アライグマポックスウイルスＨｅｒｍａｎ株、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からなる群から選択される少なくとも２つのポックスウイルス株により細胞を感染させること、並びに
    （ｉｉ）前記少なくとも２つのポックスウイルス株を複製させ、それによりキメラポックスウイルスを形成させること
    を含む方法により形成される、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  23. 腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  24. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスをコードする単離された核酸。
  25. 治療有効量の請求項１のキメラポックスウイルスを含む医薬組成物。
  26. がんの治療を必要とする被験者のがんを治療する方法を使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、治療有効量の請求項１に記載のキメラポックスウイルスを含有し、前記方法は、被験者に、前記医薬組成物を投与し、それにより前記被験者のがんを治療することを含む、医薬組成物。
  27. がんが、乳がん、結腸がん、腎臓がん、白血病、肺がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、膵がん、脳がん、肝がん、胃がん又は肉腫である、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  29. 前記核酸配列が、配列番号１を含む、請求項１に記載のキメラポックスウイルス。
  30. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記キメラポックスウイルスが、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含み；
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのＦ１４．５Ｌ遺伝子に挿入されたＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする抗がん核酸配列をさらに含み；
    前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする前記抗がん核酸配列が、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結されている、前記キメラポックスウイルス。
  31. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し；
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする抗がん核酸配列をさらに含み；
    前記ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする前記抗がん核酸配列が、合成初期プロモーターに作動可能に連結されている、前記キメラポックスウイルス。
  32. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し、
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、
    （ｉ）前記キメラポックスウイルスのＦ１４．５Ｌ遺伝子に挿入されたＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする第１の抗がん核酸配列であって、前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする前記第１の抗がん核酸配列が、Ｈ５プロモーターに作動可能に連結されている第１の抗がん核酸配列；及び
    （ｉｉ）前記キメラポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする第２の抗がん核酸配列であって、前記ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする前記第２の抗がん核酸が、合成初期プロモーターに作動可能に連結されている第２の抗がん核酸配列
    をさらに含む、前記キメラポックスウイルス。
  33. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し、
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子又はウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ結合配列を含む抗がん核酸配列をさらに含む、前記キメラポックスウイルス。
  34. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し、
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、
    （ｉ）前記キメラポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入されたヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする第１の抗がん核酸配列であって、前記ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする前記第１の抗がん核酸配列が、合成初期プロモーターに作動可能に連結されている前記第１の抗がん核酸配列、及び
    （ｉｉ）前記キメラポックスウイルスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子又はウラシルＤＮＡグリコシラーゼ遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ結合配列を含む第２の抗がん核酸配列
    をさらに含む、前記キメラポックスウイルス。
  35. 請求項１に記載のキメラポックスウイルスであって、
    前記核酸配列が、配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有し、
    前記核酸配列が、ウサギポックスウイルスＵｔｒｅｃｈｔ株、ワクシニアウイルスＷＲ株、ワクシニアウイルスＩＨＤ株、ワクシニアウイルスＥｌｓｔｒｅｅ株、ワクシニアウイルスＣＬ株、ワクシニアウイルスＬｅｄｅｒｌｅ－Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ株、及びワクシニアウイルスＡＳ株からの核酸断片を含み；
    前記核酸配列が、前記キメラポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入された検出可能部分コード配列をさらに含み；
    前記検出可能部分をコードする配列が、１１Ｋプロモーター、合成初期プロモーター、又はＨ５プロモーターに作動可能に連結されている、前記キメラポックスウイルス。
  36. 前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤をコードする前記抗癌核酸配列が、配列番号１７の配列を含む、請求項３０または３２に記載のキメラポックスウイルス。
  37. 前記ヨウ化ナトリウム共輸送体をコードする前記抗癌核酸配列が、配列番号１３の配列を含む、請求項３１、３２、または３４のいずれか１項に記載のキメラポックスウイルス。
  38. 前記ｍｉＲＮＡ結合配列が、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列を含む、請求項３３または３４に記載のキメラポックスウイルス。
  39. 前記検出可能部分をコードする配列が、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６の配列を含む、請求項３５に記載のキメラポックスウイルス。
  40. 前記Ｈ５プロモーターが、配列番号１８の配列を含む、請求項３０、３２、または３５に記載のキメラポックスウイルス。
  41. 前記合成初期プロモーターが、配列番号１９の配列を含む、請求項３１、３２、３４、または３５のいずれか１項に記載のキメラポックスウイルス。
  42. 前記１１Ｋプロモーターが、配列番号２０の配列を含む、請求項３５に記載のキメラポックスウイルス。
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