JP7635186B2 - 胃がん診断用のマイクロｒｎａバイオマーカー - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月７日に出願されたシンガポール特許出願第１０２０１４０４７４２Ｗ号の優先権の利益を主張し、この出願の内容は、あらゆる目的のため完全に参照によって本明細書中に取り込まれる。
本発明は、生化学、特にバイオマーカーに関する。特に、本発明は、がん関連バイオマーカーとそのバイオマーカーを使用して、患者ががん（例、胃がん）に罹患する尤度を決定する方法に関する。
胃がんは４番目に多いがん（一年あたり＞１００万症例）であり、全世界で、がんによる第２番目に多い死亡原因となっている。胃がんの予後は不良であり、５年生存率は１０％未満である。この主たる理由は、通常、疾患の進んだ状態で症状が呈されるからである。従って、臨床実績を改善するためには、疾患の初期検出と正確なモニタリングが必要である。現在、内視鏡検査が、唯一の確実な初期診断方法であるが、その費用とリスクが高いので、スクリーニング検査としては限定されている。侵襲性のより低い胃がんスクリーニング検査が非常に望ましく、不必要な内視鏡検査を省くことが期待されている。
従って、本発明は、胃がんを検出する代替法を提供する。
一つの観点で提供されるのは、被験者の胃がんを検出または診断する方法、あるいは、被験者が胃がんを発症する尤度を決定する方法であって、前記被験者から得られる非細胞性生体液サンプル中のｍｉＲＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、コントロールと比較する場合の前記ｍｉＲＮＡ発現の差次的発現が、胃がんを有する前記被験者の指標となり、前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐからなる群より選択される「アップレギュレートされた」ｍｉＲＮＡであるか；または、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐからなる群より選択される「ダウンレギュレートされた」ｍｉＲＮＡのいずれかである、方法である。
別の観点で提供されるのは、被験者の胃がんステージを検出または診断する方法、あるいは、被験者が胃がんのステージにある尤度を決定する方法であって、前記被験者から得られる非細胞性生体液サンプル中に、表８、表１５、表１６、および表１７からなる群より選択される表の少なくとも一つに掲載されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、コントロールと比べる場合の前記サンプル中のｍｉＲＮＡ発現の差次的発現により、前記被験者が胃がんステージ１、ステージ２、ステージ３、またはステージ４のいずれか一つにあると診断する、方法である。
さらに別の観点で提供されるのは、被験者の胃がんを検出または診断する方法であって、（ａ）非細胞性生体液サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程であって、前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８０、およびｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐからなる群より選択されるｍｉＲＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有する工程と、（ｂ）工程（ａ）で測定された前記ｍｉＲＮＡの前記発現レベルに基づくスコアを生成する工程と、（ｃ）前記スコアを使用して前記被験者が胃がんを有する尤度を予想する工程であって、前記被験者の前記発現レベルを、ポジティブコントロール（胃がん被験者由来のサンプル）またはネガティブコントロール（胃がんの無い被験者由来のサンプル）のものと比較する分類アルゴリズムによって、前記スコアが計算される工程を含み、前記スコアは、前記被験者が、ｉ．前記スコアがポジティブコントロールのスコアの範囲内に収まる、胃がんを有するか；またはｉｉ．前記スコアがネガティブコントロールのスコアの範囲内に収まる、胃がんを有しない（胃がんが無い）かのいずれかの尤度を同定する、方法である。
詳細な説明を参照し、以下の非限定例と添付した図面とを合わせて考慮すると、本発明はよりよく理解される。
図１は、胃がんを有する患者に検出されるｍｉＲＮＡを区分した模式図を示す。 図２は、臨床サンプル中に検出されるｍｉＲＮＡをハイスループットｍｉＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＴによって測定する作業フロー図の例を示す。図２は、臨床サンプル由来のトータルｍｉＲＮＡの単離から、最終データ処理および統計解析までのプロセス中に起こる工程を示す。図２に解説されるように、臨床サンプルはまず、「単離」（サンプル（例、患者の血清）からｍｉＲＮＡを単離および精製することを指す）工程に掛けられる。次に、サンプルに、スパイクイン（ｓｐｉｋｅ－ｉｎ）ｍｉＲＮＡ（人工合成ｍｉＲＮＡ模倣物（すなわち、２２～２４塩基の範囲の長さの小分子単鎖ＲＮＡ））を加える。これらのスパイクインｍｉＲＮＡをサンプル中に加えて、（単離、逆転写、増強、およびｑＰＣＲを含む）各種工程での効率をモニターする。次に、ｍｉＲＮＡを、多くの複数グループへと分割する。この工程を、「多重設計」（ｍｉＲＮＡアッセイを工夫して、複数の多重グループ（１グループ当たり４５～６５個のｍｉＲＮＡ）へとインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で分割して、ＲＴプロセスおよび増強プロセス中の非特異的増幅とプライマー－プライマー相互作用を最小限にする設計）と呼ぶ。次に、サンプルは、「多重逆転写」プロセス（各種逆転写プライマープールを組み合わせ、互いに異なる多重グループに加えて、ｃＤＮＡを合成するプロセス）を経る。ｃＤＮＡの合成に際しては、ＰＣＲプライマープールを、（ある種の多重グループ（ｃｒｏｕｐ）から）合成された各ｃＤＮＡプールと組み合わせ、そして、最適化タッチダウンＰＣＲを実行して、そのグループのトータルｃＤＮＡ量を同時に増加させる。トータル（全）ｃＤＮＡ量の増加工程を、「増強」工程と呼ぶ。増強後であって、データ処理および統計解析前に、増強されたｃＤＮＡは、一重ｑＰＣＲ（増強したｃＤＮＡプールを３８４穴プレート中のいろいろなウエルに分配し、そして、一重ｑＰＣＲ反応をその後実施する工程を指す）を経る。臨床サンプル中のｍｉＲＮＡの測定と同時に、合成ｍｉＲＮＡの検量線を一緒に測定して、全ての測定での絶対コピー数を補間して得る。従って、図２は、以下の実験セクション中に起こるｍｉＲＮＡサンプル処理の詳細な工程ごとの作業フローを提供する。 図３は、被験者から得られるサンプル中に一貫して検出されるｍｉＲＮＡのヒートマップを示す。図３は、（表４に掲載される）全ての確実に検出されるｍｉＲＮＡのヒートマップ表示を示す。ｍｉＲＮＡの発現レベル（コピー／ｍｌ）を、ｌｏｇ２スケールで提示し、平均がゼロとなるように標準化した。各点の色はその濃度に相当する。階層的クラスタリングを、ユークリッド距離に基づいて、両次元（ｍｉＲＮＡとサンプル）に関して行う。水平方向にある線に関して：黒色が胃がん被験者を表し、そして、白色は正常／コントロール被験者を表す。 図４は、制御されるｍｉＲＮＡのヒートマップを示す。特に、図４で示すヒートマップは、胃がんにおいて制御されるｍｉＲＮＡの全てを示し、それらは表６に掲載される。ｍｉＲＮＡの発現レベル（コピー／ｍｌ）を、ｌｏｇ２スケールで提示し、平均がゼロとなるように標準化した。グレイスケールはｍｉＲＮＡの濃度に相当する。階層的クラスタリングを、ユークリッド距離に基づいて、両次元（ｍｉＲＮＡとサンプル）に関して行う。水平方向にある線に関して：黒色が胃がん被験者を表し、そして、白色は正常／コントロール被験者を表す。 図５は、（サブタイプやステージに関わらず）すべての胃がん被験者におけるトップランクのアップレギュレートされるｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ）とダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ）の発現レベルを、正常／コントロール被験者と比較したものを示す箱ひげ図を示す。発現レベル（コピー／ｍｌ）を、ｌｏｇ２スケールで示す。箱ひげ図は、発現レベル分布の２５％目、５０％目、および７５％目に該当する、被験者のｍｉＲＮＡ発現レベルを示す。ＡＵＣは、受信者動作特性曲線下面積を指す。 図６は、すべての確実に検出されるｍｉＲＮＡ間の相関分析の結果を示すドットプロットを示す。ｌｏｇ２スケールの発現レベル（コピー／ｍＬ）に基づいて、ピアソンの線形相関係数を、（表４に掲載される）１９１個全ての確実に検出されるｍｉＲＮＡターゲット間で計算した。各ドットは、ｐ値（相関をゼロからの差としたものに関して）が０．０１未満であって、相関係数が０．５よりも高い（左図、正の相関がある）ｍｉＲＮＡペア、または、－０．５よりも低い（右図、負の相関がある）ｍｉＲＮＡペアを示す。 図７は、胃がんバイオマーカーの相関分析の結果を示すドットプロットを示す。ｌｏｇ２スケールの発現レベル（コピー／ｍＬ）に基づいて、ピアソンの線形相関係数を、（表６に掲載される）胃がん被験者で変化のある７５個全てのｍｉＲＮＡターゲット間で計算した。各ドットは、ｐ値（相関をゼロからの差とした場合）が０．０１未満であって、相関係数が０．５よりも高い（左図、正の相関がある）ｍｉＲＮＡペア、または、－０．５よりも低い（右図、負の相関がある）ｍｉＲＮＡペアを示す。従って、まとめると、図６と図７によると、多数のがん関連ｍｉＲＮＡと非関連ｍｉＲＮＡは正の相関があることが分かり、このことは、胃がん診断用の最適なｍｉＲＮＡの組合せの選択を難しくしている。 図８は、胃がんの各種ステージにおける各種上位評価ｍｉＲＮＡの感度と特異度を、正常／コントロールに比較してプロットしたグラフを示す。より具体的には、図８は、胃がん被験者の各種ステージにおける、（ＡＵＣ（受信者動作特性曲線下面積）に基づく）上位のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（行１）とダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡ（行２）を、正常／コントロール被験者のｍｉＲＮＡと比較した場合の受信者動作特性曲線を示す。 図９は、胃がんの各種ステージのバイオマーカー間の重なりを説明するベン図を示す。これらのベン図を、表８、９、１０、および１１に基づいて作成する。従って、図９は、胃がんの各種ステージを決定するために使用されるｍｉＲＮＡが、（ステージ３とステージ４（これらの二つのステージは臨床的に密接に関係すると考えられる）の両方に観察される大きな重複を除いて）、それらが相関するステージに特異的であるように見えることを示す。 図１０は、インシリコでの４重交差検証（ｆｏｕｒ ｆｏｌｄ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）中の発見相と検証相における、多変量バイオマーカーパネル（ｍｉＲＮＡの種類の数は３～１０）の診断力（ＡＵＣ）の箱ひげ図を示す。サンプルの発見セットに基づいていて、且つ、別の独立したサンプルセットで検証するモデルとして、線形サポートベクターマシンを使用するＳＦＦＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）を用いて、３～１０種類のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルを同定した。４重交差検証を複数回実施した。箱ひげ図は、正常／コントロールと胃がん被験者の分類に関して、ｍｉＲＮＡセットのＡＵＣの２５％目、５０％目、および７５％目を示した。図１０は、各種多変量バイオマーカーパネルから得られるデータの頑健性を示す。 図１１は、交差検証過程中の発見セット（黒色のバー）と検証セット（ネズミ色のバー）における、各種多変量バイオマーカーパネルのＡＵＣの平均を示す棒グラフを示す。エラーバーは、ＡＵＣの標準偏差を示す。パネルにより多くの種類のｍｉＲＮＡを含ませた場合の検証セットにおけるＡＵＣの改善の有意性を検定するために、右側ｔ検定を実施して全ての隣接するネズミ色のバーを比較した。＊： ｐ値＜ ０．０５； ＊＊： ｐ値＜ ０．０１； ＊＊＊： ｐ値＜ ０．００１。従って、図１１は、多変量バイオマーカーパネルセットにおける、ｍｉＲＮＡの各種類数間でのＡＵＣの差を示す。 図１２は、被験者が胃がんを有する尤度を決定するのに使用される、本明細書中に記載の方法の工程をまとめた模式図を示す。 図１３は、被験者が胃がんステージの一つにある尤度を決定するのに使用される、本明細書中に記載の方法の工程をまとめた模式図を示す。 図１４は、被験者が胃がんを有する尤度を決定する際の、本明細書中に記載の多変量解析法の工程をまとめた模式図を示す。 図１５が示すのは、（Ａ）本試験でのコントロールと胃がん被験者のがんリスクスコアの箱ひげ図表示；（Ｂ）本試験のコントロールと胃がん被験者に関して、がんリスクスコアをロジスティック分布に適用させたものの確率分布；（Ｃ）胃がんを有する未詳の被験者（ハイリスク集団に属する）の確率が、がんリスクスコアの値に依存すること（ハイリスク集団の胃がんの保有率は、国立大学病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のデータに基づくと、０．００６７であった）；（Ｄ）各種がんリスクスコアレベルでの、未詳の被験者が胃がんを有する確率（リスク）の増加倍率を、ハイリスク集団での胃がんの保有率と比較したもの、である。点線は、被験者を、がんリスクが高い群（Ｈ）、がんリスクが中程度の群（Ｍ）、またはがんリスクが低い群（Ｌ）に区分けする閾値スコアの境界である。
表の簡単な説明
詳細な説明を参照し、以下の非限定例と添付した表とを合わせて考慮すると、本発明はよりよく理解される。
表１は、胃がんに関する、血清／血漿中マイクロＲＮＡバイオマーカー試験のまとめを示す。表１は、無細胞の血清／血漿サンプル中のｍｉＲＮＡレベルを測定する各種試験をまとめる。ＲＴ－ｑＰＣＲで検証された結果だけを、この表に掲載する。「ＧＣ」は胃がん被験者を指し、そして、「Ｃ」はコントロール被験者を指す。
表２は、本開示の実験セクションで分析された胃がん被験者の臨床情報を示す。全ての血清は、任意の治療前に２３６人の胃がん被験者から回収し、使用前まで－８０℃で保管した。ピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）感染の状態を、「Ｈ Ｐｙｌｏｒｉ」（ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を指す）と標識した列に示す。
表３は、正常被験者（コントロール）の臨床情報を示す。全ての正常／コントロール被験者（２３７人の被験者）は、サンプルが回収された時点での内視鏡検査によって胃がんが無いことが確認された。被験者は、２年ごとに内視鏡検査スクリーニングをして、３～５年間追跡調査され、その被験者がこの期間内に胃がんを発症しなかったかどうかを確認した。全ての血清を、使用前まで－８０℃で保管した。ピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ）の状態を、「Ｈ Ｐｙｌｏｒｉ」（ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）を指す）と標識した列に示す。
表４は、胃がん被験者と正常被験者（コントロール）の両者の血清サンプル中で確実に検出される１９１種類のｍｉＲＮＡの配列を示す。ｍｉＲＮＡが「確実に検出される」と考えられる場合とは、血清サンプルの少なくとも９０％が５００コピー／ｍｌより高い濃度を有していた場合である。そのｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＢａｓｅ Ｖ１８リリースに従って命名した。
表５は、胃がん被験者と健常コントロール（正常被験者／コントロール）の両者の特徴のまとめを示す。
表６は、正常被験者（コントロール）と胃がん被験者との間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡを一覧にする。正常／コントロール被験者と（サブタイプとステージに関わらず）全ての胃がん被験者との間で比較すると、７５種類のｍｉＲＮＡは、偽発見率補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）後に、ｐ値が０．０１未満であった。ＡＵＣ－受信者動作特性曲線下面積。変化倍率－がん集団でのｍｉＲＮＡの発現レベル（コピー／ｍｌ）の平均値を、正常／コントロール集団のもので割り算したもの。
表７は、本試験と他の文献リポートとの間の比較を示す。表４（即ち、≧５００コピー／ｍｌの発現レベルを有するｍｉＲＮＡ）に掲載されていないｍｉＲＮＡを、本試験の検出限界以下（Ｎ．Ｄ．）と考える。従って、表７は、当該技術分野で言われている差次的に制御されるｍｉＲＮＡの大多数が、本開示の例示的ｍｉＲＮＡとは異なることを示す。
表８は、正常被験者（コントロール）とステージ１の胃がん被験者との間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡを一覧にする。正常／コントロール被験者とステージ１の胃がん被験者との間で比較すると、２０種類のｍｉＲＮＡは、偽発見率補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）後に、ｐ値が０．０１未満であった。ＡＵＣ－受信者動作特性曲線下面積。変化倍率－がん集団でのｍｉＲＮＡの発現レベルの平均値を、正常／コントロール集団のもので割り算したもの。
表９は、正常被験者（コントロール）とステージ２の胃がん被験者との間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡを一覧にする。正常／コントロール被験者とステージ２の胃がん被験者との間で比較すると、６２種類のｍｉＲＮＡは、偽発見率補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）後に、ｐ値が０．０１未満であった。ＡＵＣ－受信者動作特性曲線下面積。変化倍率－がん集団でのｍｉＲＮＡの発現レベル（コピー／ｍｌ）の平均値を、正常／コントロール集団のもので割り算したもの。
表１０は、正常被験者（コントロール）とステージ３の胃がん被験者との間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡを一覧にする。正常／コントロール被験者とステージ３の胃がん被験者との間で比較すると、４３種類のｍｉＲＮＡは、偽発見率補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）後に、ｐ値が０．０１未満であった。ＡＵＣ－受信者動作特性曲線下面積。変化倍率－がん集団でのｍｉＲＮＡの発現レベルの平均値を、正常／コントロール集団のもので割り算したもの。
表１１は、正常被験者（コントロール）とステージ４の胃がん被験者との間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡを一覧にする。正常／コントロール被験者とステージ４の胃がん被験者との間で比較すると、７４種類のｍｉＲＮＡは、偽発見率補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）後に、ｐ値が０．０１未満であった。ＡＵＣ－受信者動作特性曲線下面積。変化倍率－がん集団でのｍｉＲＮＡの発現レベルの平均値を、正常／コントロール集団のもので割り算したもの。
表１２は、多変量バイオマーカーパネルの同定プロセスで同定されるｍｉＲＮＡを一覧にする。６、７、８、９、および１０種類のｍｉＲＮＡで組み立てるバイオマーカーパネルに関して選択されるｍｉＲＮＡの素性をまとめた。全てのパネル中でのｍｉＲＮＡの出現回数をパネルの総数で割ったものを、出現率として定義する。上位１０％と下位１０％のＡＵＣを有するパネルを除外して、交差検証分析の無作為化プロセスによって生まれた亜集団由来の不正確なデータを適用することに起因する偽発見バイオマーカーをカウントすることを避けた。その中で４以上の出現回数を有するｍｉＲＮＡだけを一覧にした。胃がんの各種ステージでのｍｉＲＮＡ変化を、表６と８～１１に基づいて定義した。
表１３は、多変量バイオマーカーパネル選択プロセスでしばしば選択されるｍｉＲＮＡの存在率の統計を示す。二つのｍｉＲＮＡグループ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐグループとｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｈｓａ－６６０－５ｐグループ）由来の様々な数のｍｉＲＮＡを使用するｍｉＲＮＡパネルのパーセンテージ。検証セット（図１０）のＡＵＣによって定義される、６、７、８、９、１０種類のｍｉＲＮＡのバイオマーカーパネルの上位１０％と下位１０％は、数から除外した。
表１４は、正常／コントロールと（ステージに関わらない）胃がんとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（（表１に一覧表示される）当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表１５は、正常／コントロールとステージ２の胃がんとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表１６は、正常／コントロールとステージ３の胃がんとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表１７は、正常／コントロールとステージ４の胃がんとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表１８は、正常／コントロールと胃がんのステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、または全てのステージとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。表１８は、表１４、表８、表１５、表１６、および表１７を合わせたものである。
表１９は、ｍｉＲＮＡの発現レベルが胃がん被験者で変化した、多変量バイオマーカーパネルに使用するためにしばしば選択されるｍｉＲＮＡ（すなわち、表１２の有意グループ）（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表２０は、ｍｉＲＮＡの発現レベルが胃がん被験者で変化しなかった、多変量バイオマーカーパネルに使用するためにしばしば選択されるｍｉＲＮＡ（すなわち、表１２の非有意グループ）（当該技術分野で過去に報告されていないもの）の一覧である。
表２１は、多変量バイオマーカーパネルの同定プロセスでしばしば選択される１２種類のｍｉＲＮＡ（それらのＫｉ係数値と伴に）であって、出現率が＞２０％のものの一覧であり、それらを組み合わせて、図１５にあるがんリスクスコア（式１）を計算する。
発明の詳細な説明
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、小分子非コードＲＮＡであって、遺伝子発現の制御に働き、そして、その発現異常は各種がん（例、胃がん）の発病に関与する。マイクロＲＮＡを使用して、被験者ががんを発症する尤度を決定することができることが知られている。
従って、一つの観点で提供されるのは、被験者が胃がんを発症するか又は有する尤度を決定する方法である。一つの例では、図１２は、被験者が胃がんを発症するか又は有する尤度を決定する方法の工程のまとめである。一つの例では、本方法は被験者の胃がんを検出または診断するためのものでもある場合がある。一つの例では、本方法はインビトロ方法である。一つの例では、本明細書中に記載される方法は、被験者から得られる非細胞性生体液サンプル中の、表１８に掲載されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定または決定する工程を含む場合があり、コントロールと比較する場合のｍｉＲＮＡ発現の差次的発現が前記被験者が胃がんを有することの指標となり、前記ｍｉＲＮＡが、表１８に「アップレギュレートされたもの」として一覧にされるｍｉＲＮＡであるか、または、表１８に「ダウンレギュレートされたもの」として一覧にされるｍｉＲＮＡであるかのいずれかである、方法である。
表１８は、患者が胃がんを発症するか又は有する尤度を決定するのに使用可能なｍｉＲＮＡを表にするが、それは以下のものである。
Figure 0007635186000001
Figure 0007635186000002
本明細書に使用される用語「ｍｉＲＮＡ」、「マイクロＲＮＡ」、または「ｍｉＲ」は、内在性非コード遺伝子産物を含むＲＮＡ（ＲＮＡアナログ）であって、その遺伝子の前駆ＲＮＡ転写産物は、小型のステムループを形成することができて、そこで、成熟型「ｍｉＲＮＡ」は、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって切断される。ｍｉＲＮＡは遺伝子によってコードされるが、ｍＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの発現を制御する。一つの例では、用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、少なくとも１０個のヌクレオチド且つ３５個以下のヌクレオチドが共有結合した短鎖ＲＮＡ分子を指す。一つの例では、本ポリヌクレオチドは、その長さが、１０～３３個のヌクレオチド、１５～３０個のヌクレオチド、１７～２７個のヌクレオチド、１８～２６個のヌクレオチド、即ち、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチドの分子であって、任意ではあるが、ラベルや配列伸長（例、ビオチンストレッチ）を含まない。本明細書中に記載のｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に提供される表４に提供され、表４は、配列番号：１～配列番号：１９１のｍｉＲＮＡを含む。当業者により理解されるであろうことは、ｍｉＲＮＡが「ＡＴＧＣ」等の文字を含む配列を有するある型のポリヌクレオチドであることである。理解され得るのは、他に注記しない限りは、ヌクレオチドが５’－＞３’の順に、左から右へとなっていて、「Ａ」がデオキシアデノシドを表し、「Ｃ」がデオキシシチジンを表し、「Ｇ」がデオキシグアノシドを表し、そして「Ｔ」がデオキシチミジンを表すことである。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを使用して、塩基それ自身、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指し、これは当該技術分野では標準的である。この用語には、天然の核酸塩基、糖、およびヌクレオチド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、似たように機能するか又は特異的に機能が改善した非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。天然ポリヌクレオチドでは、ヌクレオシド間結合は典型的にはホスホジエステル結合であって、その構成部品を「ヌクレオチド」と呼ぶ。用語「オリゴヌクレオチド」にはまた、（例えば、塩基や糖が）完全もしくは部分的に改変または置換されたオリゴヌクレオチドが含まれる場合がある。
本開示の技術分野で理解されるであろうことは、本明細書中に記載の任意の方法では、ｍｉＲＮＡは、表４に掲載されるｍｉＲＮＡの配列と１００％の配列同一性を有しない場合があることである。従って、一つの例では、評価されるｍｉＲＮＡは、表８、表１５、表１６、表１７、表１８、表１９、または表２０のいずれか一つ（表４を参照する）に掲載されるｍｉＲＮＡと、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する場合がある。一つの例では、評価されるｍｉＲＮＡは、一つ、二つ、三つ、または四つのヌクレオチド置換を有してもよい。従って、本明細書中に記載の方法で使用されるｍｉＲＮＡは、表８、表１５、表１６、表１７、表１８、表１９、または表２０に掲載される配列（表４に提供される配列を参照する）に特異的にハイブリダイズまたは結合することができる場合がある試薬を使用して検出可能である。本明細書中で使用される用語「にハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」は、用語「に特異的」および「特異的に結合する」と互換して使用され、そして、相補的核酸と配列特異的に非共有結合で相互作用すること、例えば、標的核酸配列と標的に特異的な核酸配列プライマーまたはプローブとの間の相互作用を指す。一つの例では、ハイブリダイズする核酸プローブは、７０％、８０％、９０％より大きい、または１００％の選択性でハイブリダイズするものである（すなわち、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡの一つとのクロスハイブリダイゼーションが、３０％未満、２０％未満、１０％未満で起こる場合がある）。当業者に理解されるであろうことは、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡに「ハイブリダイズする」核酸プローブは、その長さと組成を考慮して決定可能であることである。一つの例では、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡにハイブリダイズする核酸プローブは、一つ、二つ、または三つの塩基ペアが対応していない場合がある。一つの例では、本明細書中に記載の用語「ｍｉＲＮＡ」には、ｍｉＲＮＡの３’端および／または５’端が、その生産中に、修飾や消化される場合があるｍｉＲＮＡが含まれる。一つの例では、ｍｉＲＮＡの３’端および／または５’端が、その生産中に、修飾や消化されたｍｉＲＮＡを、本発明のアッセイでピックアップする。一つの例では、本明細書中で開示されるｍｉＲＮＡは、表４に掲載される配列と３、４、または５個のヌクレオチドが異なる場合があるｍｉＲＮＡを含んでもよい。
本明細書中で使用される用語「がん」は、がんが生じる細胞の典型的性質（例、制御不能な増殖、不死化、転移能、早い成長および増殖速度、ならびにある種の特徴のある形態的特徴であって当該分野で既知のもの）を有する細胞の存在を指す。一つの例では、「がん」は胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃癌（ｓｔｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）である場合がある。一つの例では、「がん」には、前がん及び悪性がんを含んでもよい。従って、用語「胃がん」は、国立衛生局の国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ）によって記載される胃がんの全てのステージをカバーする。
一つの例では、当業者によって理解されるであろうことは、本明細書中に記載の方法がドクター／医師によって行われる工程を含まないことである。従って、本明細書中に記載の方法から得られる結果は、臨床データや他の臨床症状と組み合わせる必要がある場合があり、その後、医師によりなされる最終診断が被験者に提示可能である。被験者が胃がんを有するかどうかの最終診断は、医師の守備範囲にあり、本開示の一部分とは見なされない。従って、本明細書中で使用される用語「決定する」、「検出する」、および「診断する」ことは、被験者がその発症の任意のステージの疾患（例、胃がん）を有する確率または尤度の同定を指すか、あるいは、被験者がその疾患を発症する特質の決定を指す。一つの例では、「診断する」、「決定する」、「検出する」ことは症状の呈示前に起こる。一つの例では、「診断する」、「決定する」、「検出する」ことは、（他の臨床症状と合わせて）臨床医／医師が胃がんを有することが疑われる被験者の胃がんを確認することを可能とする。
本明細書中で使用される用語「差次的発現」は、一つのサンプルにおける、ｍｉＲＮＡ量として測定される一又は複数のｍｉＲＮＡ発現レベルを、第二のサンプルにおける同一の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する場合の差を指すか、あるいは、所定の基準値またはコントロールと比べた場合の差を指す。差次的発現は、当該技術分野で既知の方法（例、アレイハイブリダイゼーション、次世代シークエンシング、ＲＴ－ＰＣＲ、および当業者に理解可能な他の方法）によって、測定可能である。
差次的発現が観察されるかどうかを決定するのに使用されるコントロール群は、本明細書中に記載の方法の目的に依存して異なっていてもよい。しかしながら、一般則として、本明細書中に記載の任意の所定の方法では、コントロール群は当業者によって容易に決定可能である。他に具体的に述べない限りは、一つの例では、コントロール群は、胃がん関連疾患の全くない被験者である場合がある。一つの例では、コントロール群は、既往症の無い健常者である場合がある。一つの例では、コントロール群は、非胃がん関連疾患（例、限定はされないが、胃炎、腸上皮化生、腸の萎縮等）を有することが知られる被験者である場合がある。一つの例では、コントロールは、サンプルの性状や他の因子（例、訓練データセットを取得した被験者に基づいて、その被験者の性別、年齢、人種）についてばらつきがあってもよい。一つの例では、コントロール被験者は、アジア人またはその子孫（例、華人、華人の子孫）である場合がある。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、表１８に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、コントロールと比較すると、胃がんを有すると疑われる被験者から得られたサンプル中でアップレギュレートされることが判明した場合である。従って、一つの例では、コントロールと比べて、表１８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡのアップレギュレーションは、被験者が胃がんを有する指標となる場合があるか、または、それにより被験者が胃がんを有すると診断する。
本明細書中に記載の任意の例または方法において、本明細書中で使用される用語「アップレギュレートされる」は、コントロールと比較して、ｍｉＲＮＡ発現レベルの増加、または、より多くコピーのｍｉＲＮＡの検出を指す。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０１以上である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０２～約２．５である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表６に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０５～約１．５３である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。本明細書中で使用されるコントロールは、胃がんの無い被験者である場合がある。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、表１８に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、コントロールと比較すると、胃がんを有すると疑われる被験者から得られたサンプル中でダウンレギュレートされることが判明した場合である。従って、一つの例では、コントロールと比べて、表１８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションは、被験者が胃がんを有する指標となる場合があるか、または、それにより被験者が胃がんを有すると診断することもできる。
本明細書中に記載の任意の例または方法において、本明細書中で使用される用語「ダウンレギュレートされる」は、コントロールと比較して、ｍｉＲＮＡ発現レベルの減少、または、より少ないコピーのｍｉＲＮＡの検出を指す。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９９以下であることが示される場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９８～約０．３である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表６に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．５～約０．９２であることが示される場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡ発現は、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９５倍、約０．９０倍、約０．８５倍、約０．８０倍、約０．７５倍、約０．７０倍、約０．６５倍、約０．６０倍、約０．５５倍である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。本明細書中で使用されるコントロールは、胃がんの無い被験者である場合がある。
用語「約」を本明細書中に使用して、値が当該分野で既知の誤差（値を決定するのに採用される機器や方法の使用から生じ得るもの）の固有のばらつき、または、試験被験者間に存在するばらつきを含むことを示す。従って、一つの例では、用語「約」は、本明細書中に記載される本開示全体で使用される発現の変化倍率の文脈では、言及した値の±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、または±０．５％を意味する。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１８に掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表１８に掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、少なくとも５０種類、少なくとも５５種類、少なくとも６０種類、少なくとも６５種類、少なくとも７０種類、少なくとも７５種類、少なくとも８０種類、少なくとも８５種類、少なくとも９０種類、少なくとも９５種類、少なくとも１００種類、少なくとも１０５種類、少なくとも１０７種類、または全ての差次的発現を測定可能である。一つの例では、本方法は、表１８に掲載される１～１０８種類のｍｉＲＮＡ、または、表１８に掲載される２～１０、１１～３０、３１～５０、５０～７０、７１～９０、または９１～１０８種類のｍｉＲＮＡを測定することができる。一つの例では、本方法は、表１８に掲載される全てのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表１８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。一つの例では、本方法は、表１８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、少なくとも５０種類、少なくとも５５種類、少なくとも６０種類、少なくとも６５種類、または７０種類の差次的発現を測定可能であり、そして、表１８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、または３８種類の差次的発現を測定可能である。
一つの例では、本明細書中に記載される方法は、被験者から得られる非細胞性生体液サンプル中の、表１４に掲載されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを測定する工程を含む場合がある。
表１４は、患者が胃がんを発症するか又は有する尤度を決定するのに使用可能なｍｉＲＮＡを表にするが、それは以下のものである。
Figure 0007635186000003
当該分野で既知であるように、増殖性疾患が進行する場合（治療する場合も、しない場合もある）、その疾患の臨床症状は進行ステージ間で異なる。従って、当業者が胃がん／胃癌がどのように進行したかを決定するのを補助するために、国立衛生局の国立がん研究所は、胃がん／胃癌に観察されるステージの一般的臨床症状を公開した。胃がんのステージには、厳密にはその定義内に限定はされないが、以下に記載の次のステージが含まれる。
ステージＩ：ステージＩでは、がんは、胃壁の粘膜（最も内側の層）の内壁に既に形成される。ステージＩは、がんがどこに広がっていたかによって、ステージＩＡとステージＩＢに分割される。
ステージＩＡ：がんは、胃壁の粘膜下層（粘膜に隣接する組織層）中に既に広がっている場合がある。
ステージＩＢ：がんは、胃壁の粘膜下層（粘膜に隣接する組織層）中に既に広がっている場合があり、そして、腫瘍の近くの１または２カ所のリンパ節に見出される；あるいは、がんは胃壁の筋肉層へと既に広がっている。
ステージＩＩ：ステージＩＩの胃がんは、がんがどこに広がっていたかによって、ステージＩＩＡとステージＩＩＢに分割される。
ステージＩＩＡ：がんは、胃壁の漿膜下層（漿膜に隣接する組織層）に既に広がっているか；胃壁の筋肉層に既に広がっていて、腫瘍の近くの１または２カ所のリンパ節に見いだされるか；あるいは、胃壁の粘膜下層（粘膜に隣接する組織層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの３～６カ所のリンパ節に見いだされる。
ステージＩＩＢ：がんは、胃壁の漿膜（最も外側の層）に既に広がっているか；胃壁の漿膜下層（漿膜に隣接する組織層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの１または２カ所のリンパ節に見いだされるか；胃壁の筋肉層に既に広がっていて、腫瘍の近くの３～６カ所のリンパ節に見いだされるか；あるいは、胃壁の粘膜下層（粘膜に隣接する組織層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの７カ所以上のリンパ節に見いだされる。
ステージＩＩＩ：ステージＩＩＩの胃がんは、がんがどこに広がっていたかによって、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢ、およびステージＩＩＩＣに分割される。
ステージＩＩＩＡ：がんは、胃壁の漿膜（最も外側の）層に既に広がっていて、腫瘍の近くの１または２カ所のリンパ節に見いだされるか；胃壁の漿膜下層（漿膜に隣接する組織層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの３～６カ所のリンパ節に見いだされるか；あるいは、胃壁の筋肉層に既に広がっていて、腫瘍の近くの７カ所以上のリンパ節に見いだされる。
ステージＩＩＩＢ：がんは、近辺の器官（例、脾臓、横行結腸、肝臓、横隔膜、膵臓、腎臓、副腎、または小腸）に既に広がっており、腫瘍の近くの１または２カ所のリンパ節に見いだされるか；胃壁の漿膜（最も外側の層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの３～６カ所のリンパ節に見いだされるか；あるいは、胃壁の漿膜下層（漿膜に隣接する組織層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの７カ所以上のリンパ節に見いだされる。
ステージＩＩＩＣ：がんは、近辺の器官（例、脾臓、横行結腸、肝臓、横隔膜、膵臓、腎臓、副腎、または小腸）に既に広がっており、腫瘍の近くの３カ所以上のリンパ節に見いだされる場合があるか；あるいは、胃壁の漿膜（最も外側の層）に既に広がっていて、腫瘍の近くの７カ所以上のリンパ節に見いだされる。
ステージＩＶ：ステージＩＶでは、がんは身体の遠位部に既に広がっている。
当業者によって理解されるように、被験者が特定のステージにあるかどうかについてを決定することは、任意の治療または緩和ケアに如何に最適に取り組むかに関する明瞭なガイドラインを臨床医に提供するのに有用である場合がある。従って、一つの観点では、本開示は、被験者の胃がんステージを検出または診断する方法を提供する。一つの例では、本方法は、被験者が胃がんのあるステージにある尤度を決定する。この観点では、本方法は、被験者から得られる非細胞性生体液サンプル中の、表８、表９、表１５、表１０、表１６、表１１、または表１７からなる群より選択される表の少なくとも一つに掲載されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と少なくとも９０％の配列同一性を有するｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程を含み、コントロールと比べる場合の前記被験者から得られる前記サンプル中のｍｉＲＮＡ発現の差次的発現が、前記被験者が胃がんステージ１、ステージ２、ステージ３、またはステージ４のいずれか一つにある尤度の指標となる場合があるか、または、前記差次的発現により、前記被験者が胃がんステージ１、ステージ２、ステージ３、またはステージ４のいずれか一つにあると診断する場合がある。本明細書中で使用されるコントロールは、胃がんの無い被験者である場合がある。一つの例では、図１３は、被験者が胃がんのステージの一つを発症するか又は有する尤度を決定する方法の工程のまとめである。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ１にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ１にあると診断可能であり、前記ｍｉＲＮＡが、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる場合である。表８を、実験セクションにおいてさらに詳細に説明する。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０１～約２．５以上である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表８に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１１～約１．５７である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、または８種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができる。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ１にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ１にあると診断可能な場合である。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９以下である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡ発現は、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９５倍、約０．９０倍、約０．８５倍、約０．８０倍、約０．７５倍、約０．７０倍、約０．６５倍、約０．６０倍、約０．５５倍である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表８に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．６８～約０．８４である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、または１２種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、本方法は、表８中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、または８種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができ、そして、表８中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、または１２種類の差次的発現を測定することができる。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表９または表１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ２にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ２にあると診断可能な場合である。表９を、実験セクションにおいてさらに詳細に説明する。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。
表１５は、患者がステージ２の胃がんを発症（罹患）するか又は有する尤度を決定するのに使用されるｍｉＲＮＡを表にするが、それは以下のものである。
Figure 0007635186000004
Figure 0007635186000005
一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０１～約２．５以上である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表９に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１３～約２．１３である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表９または表１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表９または１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、少なくとも５０種類、または５４種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表９または表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ２にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ２にあると診断可能な場合である。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９以下である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡ発現は、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９５倍、約０．９０倍、約０．８５倍、約０．８０倍、約０．７５倍、約０．７０倍、約０．６５倍、約０．６０倍、約０．５５倍である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表９に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．５６～約０．８７である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表９または表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表９または表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、または８種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表９または表１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表９または表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。一つの例では、本方法は、表９または表１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、少なくとも５０種類、または５４種類の差次的発現を測定可能であり；そして、表９または表１５中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、または８種類の差次的発現を測定可能である。
一つの例では、被験者がステージ２の胃がんを有する可能性があるかどうかについての診断または指標を提供可能な本明細書中に記載の方法が表１５を使用する場合、本方法は、限定はされないが、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、およびｍｉＲ－２１－５ｐを含む任意の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程をさらに含んでもよい。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表１０または表１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ３にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ３にあると診断可能な場合である。表１０を、実験セクションにおいてさらに詳細に説明する。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。
表１６は、患者がステージ３の胃がんを発症（罹患）するか又は有する尤度を決定するのに使用されるｍｉＲＮＡを表にするが、それは以下のものである。
Figure 0007635186000006
一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０１～約２．５以上である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表１０に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．２０～約１．９３である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１０または表１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表１０または表１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、または３７種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。
一つの例では、差次的発現が観察される場合は、コントロールと比較する場合、表１０または表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ３にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ３にあると診断可能な場合である。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９以下である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡ発現は、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９５倍、約０．９０倍、約０．８５倍、約０．８０倍、約０．７５倍、約０．７０倍、約０．６５倍、約０．６０倍、約０．５５倍である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表１０に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．７２～約０．８８である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１０または表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表１０または表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、または６種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１０または表１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表１０または表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。一つの例では、本方法は、表１０または１６中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、または３７種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができるし、そして、表１０または表１６中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、または６種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができる。
一つの例では、被験者がステージ３の胃がんを有する可能性があるかどうかについての診断または指標を提供する本明細書中に記載の方法は表１６を使用する。本方法は、限定はされないが、ｍｉＲ－２１－５ｐｍ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、およびｍｉＲ－４２３－５ｐを含む任意の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程をさらに含んでもよい。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表１１または表１７中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ４にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ４にあると診断可能な場合である。表１０を、実験セクションにおいてさらに詳細に説明する。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１７中に「アップレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。
表１７は、患者がステージ４の胃がんを発症（罹患）する尤度を決定するのに使用されるｍｉＲＮＡを表にするが、それは以下のものである。
Figure 0007635186000007
一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．０１～約２．５以上である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表１１に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約１．１２～約１．８６である場合に、「アップレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１１または表１７中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表１１または１５中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１７種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、または４６種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。
一つの例では、差次的発現が観察される場合とは、コントロールと比較する場合、表１１または表１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡが、被験者が胃がんステージ４にあることの指標となる可能性があるか、または、前記ｍｉＲＮＡによって、被験者が胃がんステージ４にあると診断可能な場合である。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。一つの例では、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９以下である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、その変化に関する統計検定でのｐ値は、０．０５未満である場合がある。一つの例では、当該分野で既知の統計検定（ｔ検定（ｐ値＜０．０１））を使用して、ｐ値が計算可能である。別の例では、統計検定は、ｔ検定（ｐ値＜０．０１）であって、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）に対して補正されたものである。このやり方を、以下の例で例示的に使用した。一つの例では、ｍｉＲＮＡ発現は、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．９５倍、約０．９０倍、約０．８５倍、約０．８０倍、約０．７５倍、約０．７０倍、約０．６５倍、約０．６０倍、約０．５５倍である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。一つの例では、表１１に例示されるように、ｍｉＲＮＡは、コントロールに対する発現レベルの変化倍率が少なくとも約０．４８～約０．９０である場合に、「ダウンレギュレートされる」と考えることができる。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１１または表１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される一又は複数のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。従って、一つの例では、本方法は、表１１または１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、または２８種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１１または表１７中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表１１または表１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの差次的発現を測定可能である。一つの例では、本方法は、表１１または１７中に「アップレギュレートされたもの」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、少なくとも４０種類、少なくとも４５種類、または４６種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができるし、そして、表１１または表１７中に「ダウンレギュレートされたもの」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、または２８種類の差次的発現を測定することができる。
一つの例では、被験者がステージ４の胃がんを有する可能性があるかどうかについての診断または指標を提供する本明細書中に記載の方法は表１７を使用する。本方法は、限定はされないが、ｍｉＲ－２１－５ｐｍ、ｍｉＲ－２２３－３ｐｍ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐｍ、ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、およびｍｉＲ－１７－５ｐを含む任意の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する工程をさらに含んでもよい。
さらに別の観点で提供されるのは、被験者の胃がんを検出または診断する方法、あるいは、被験者が胃がんを有する尤度を決定する方法であって、（ａ）非細胞性生体液サンプル中で、表１２または表１９中に掲載されるｍｉＲＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、（ｂ）工程（ａ）で測定されたｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいてスコアを生成する工程と、（ｃ）前記スコアを使用して、前記被験者が胃がんを有する尤度を予測する工程とを含み、前記被験者の前記発現レベルを、ポジティブコントロール（胃がん被験者由来のサンプル）またはネガティブコントロール（胃がんの無い被験者由来のサンプル）と比較する分類アルゴリズムによって、前記スコアが計算され、前記スコアは、前記被験者が、（ｉ）前記スコアが前記ポジティブコントロールのスコアの範囲内に収まる、胃がんを有するか；または（ｉｉ）前記スコアがネガティブコントロールのスコアの範囲内に収まる、胃がんを有しない（すなわち、胃がんが無い）かのいずれかの尤度を同定する、方法である。一つの例では、前記ｍｉＲＮＡには、表１９中に掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも一つを含むことができる。一つの例では、被験者の胃がんを検出または診断する方法、あるいは、被験者が胃がんを有する尤度を決定する方法は、多変量法と呼ばれる場合がある。一つの例では、多変量法は、臨床データによって決定されて、亜集団または群の代表となったｍｉＲＮＡを使用してもよい。一つの例では、多変量バイオマーカーパネルには、表１２に掲載されるバイオマーカー（胃がんと関連することが分かっているｍｉＲＮＡと胃癌と関連しないことが分かっているｍｉＲＮＡの両方を含むもの）が含まれる場合がある。一つの例では、多変量法に使用可能で、胃がんと関連するｍｉＲＮＡが、表１９中に含まれる場合がある。表１２を、実験セクションにおいてさらに詳細に説明する。一つの例では、図１４は、被験者が胃がんを発症（罹患）する尤度を決定する多変量法の工程のまとめである。
表１９は、ｍｉＲＮＡの発現レベルが胃がん被験者で変化した、多変量バイオマーカーパネルに使用するためにしばしば選択されるｍｉＲＮＡを表とし、それは以下のものである。
Figure 0007635186000008
上述したように、多変量法は、表１２に掲載されるバイオマーカー（胃がんと関連することが分かっているｍｉＲＮＡと胃癌と関連しないことが分かっているｍｉＲＮＡの両方を含むもの）を決定する工程を含んでもよい。従って、一つの例では、多変量法が表１９に掲載されるｍｉＲＮＡを使用すると、本方法は、ネガティブコントロールと比較する場合、発現レベルが被験者で変わっていない少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程をさらに含む可能性がある。一つの例では、ネガティブコントロールと比較する場合、発現レベルが被験者で変わっていないｍｉＲＮＡは、表２０に掲載される任意の一つのｍｉＲＮＡであってもよい。
表２０は、ｍｉＲＮＡの発現レベルが胃がん被験者と関連しなかった、多変量バイオマーカーパネルに使用するためにしばしば選択されるｍｉＲＮＡを表とし、それは以下のものである。
Figure 0007635186000009
一つの例では、当該分野で既知の、本明細書中に記載の多変量法では、スコアは分類アルゴリズムを使用して計算可能である。一つの例では、分類アルゴリズムには、限定はされないが、サポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、フィッシャーの線形判別アルゴリズム、二次分類アルゴリズム、パーセプトロンアルゴリズム、ｋ近傍法、人工神経回路網アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、決定木アルゴリズム、ナイーブベイズアルゴリズム、適応ベイズネットワークアルゴリズム、および複数の学習アルゴリズムを組み合わせたアンサンブル学習法が含まれる。当業者によって理解されるように、分類アルゴリズムは、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの発現レベルを使用して、プレトレーニング可能である。
本明細書中に記載の多変量法の特定の観点では、ポジティブコントロールは、胃がんを有する被験者から得られるサンプルであってもよいし、ネガティブコントロールは、胃がんの無いコントロールから得られるサンプルであってもよい。一つの例では、胃がんの無いコントロールは、上記したものである場合がある。つまり、一つの例では、胃がんの無いコントロールは、胃がん関連疾患の全くない被験者である場合がある。一つの例では、胃がんの無いコントロールは、既往症の無い健常者である場合がある。一つの例では、胃がんの無いコントロールは、非胃がん関連疾患（例、限定はされないが、胃炎、腸上皮化生、腸の萎縮等）を有することが知られる被験者である場合がある。一つの例では、コントロールは、サンプルの性状や他の因子（例、訓練データセットを取得した被験者に基づく、被験者の性別、年齢、人種）についてばらつきがあってもよい。一つの例では、コントロール被験者は、華人または華人の子孫である場合がある。
当業者によって理解されるように、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、濃度、ｌｏｇ（濃度）、Ｃｔ／Ｃｑの数値、２のＣｔ／Ｃｑ乗の数値等のいずれか一つである場合がある。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、被験者が胃がんを有する尤度を決定可能な場合のあるデータトレーニング済みの式を使用する場合がある。一つの例では、アルゴリズムは、複数のｍｉＲＮＡの測定を組み合わせて、被験者が胃がんを有するリスクの予想用のスコアを与える。そのアルゴリズムは、複数の遺伝子標的の情報を組み合わせて、単一のｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用するよりも良い予想正確性を与える。一つの例では、有用なパネルを構築するためのｍｉＲＮＡバイオマーカーの最小数は４である。例えば、図１１に示されるのは、４種類のｍｉＲＮＡを有するバイオマーカーパネルは、有用なバイオマーカーパネルとなると考えられる検証セットにおけるＡＵＣの平均値が＞０．８である。バイオマーカーパネルの性能の（ＡＵＣ値に関する）改善は、ｍｉＲＮＡの種類の数が７より大きい場合は、有意に増加しない。従って、一つの例では、性能が最大な最適パネルを構築するためのｍｉＲＮＡの最小数は、７種類のｍｉＲＮＡである。一つの例では、被験者が胃がんを有する尤度を決定するためのスコアを計算するのに使用可能な式は、以下のものである。
Ａ × ｍｉＲＮＡ１ ＋ Ｂ × ｍｉＲＮＡ２ ＋ Ｃ × ｍｉＲＮＡ３ ＋ Ｄ。
式中、ｍｉＲＮＡ１、ｍｉＲＮＡ２、ｍｉＲＮＡ３はｍｉＲＮＡの発現レベルと関連する値であって、それは、コピー数、ｌｏｇ（コピー数）、Ｃｔ／Ｃｑの数値、または他の数値であってもよい。そして、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは係数であって、正でも負でもよい。例えば、被験者が胃がんを有する尤度を決定するためのスコア（すなわち、がんリスクスコア）は、以下の実施例と図１５に記載されるように、多変量バイオマーカーパネル同定プロセスにおいてしばしば選択される１２種類のｍｉＲＮＡ（表２１）で出現率が＞２０％のものを組み合わせて計算可能である。一つの例では、スコアを前記式から得る場合、スコアが高／低ければ高／低いほど、被験者が胃がんを有する確率がより高い。一つの例では、その範囲が明確に規定されていない場合がある理由は、係数が調整される場合があるからだ。例えば、全ての係数（すなわち、Ａ、Ｂ、またはＣ）は、半量であってもよいか、または、Ｄの値が訓練データセットによるトレーニングに依存して変化してもよい。一つの例では、スコアの値は、胃がんを有するリスクと正または負に相関する場合がある。実際の相関は、訓練データセットに依存する可能性があり、そして、当業者は、訓練データセットの樹立に際して要求される必要な調整に精通している。
一つの例では、その範囲が明確に規定されていない場合がある理由は、係数が調整される場合があるからだ。例えば、全ての係数（すなわち、Ａ、Ｂ、またはＣ）は、倍量であってもよいか、または、Ｄの値が訓練データセットによるトレーニングに依存して変化してもよい。一つの例では、スコアの値は、胃がんを有するリスクと正または負に相関する場合がある。実際の相関は、訓練データセットに依存する可能性があり、そして、当業者は、訓練データセットの樹立に際して要求される必要な調整に精通している。
一つの例では、全ての係数（すなわち、Ａ、Ｂ、またはＣ）は、半量に故意に調製可能であり、および／または、Ｄの値も、故意に変更して、ほどんどの被験者用の式に基づいて計算された値の範囲を０～１００に調整可能である。一つの例では、スコアの値は、胃がんを有するリスクと正または負に相関する場合がある。実際の相関は、訓練データセットに依存する可能性があり、そして、当業者は、訓練データセットの樹立に際して要求される必要な調整に精通している。
一つの例では、本明細書中に記載の方法は、表１２または表１９中に「有意」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡおよび表１２または表２０中に「非有意」として掲載される少なくとも一つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定可能である。一つの例では、本方法は、表１２中に「有意」として掲載される少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、または４２種類のｍｉＲＮＡの差次的発現を測定することができるか、あるいは、表１９中に掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、少なくとも１０種類、少なくとも１１種類、少なくとも１２種類、少なくとも１３種類、少なくとも１４種類、少なくとも１５種類、少なくとも２０種類、少なくとも２５種類、少なくとも３０種類、少なくとも３５種類、または３８種類の差次的発現を測定することができるか；および、表１２中に「非有意」として掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、または１２種類の差次的発現を測定することができるか、あるいは、表２０中に掲載されるｍｉＲＮＡの少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類、少なくとも６種類、少なくとも７種類、少なくとも８種類、少なくとも９種類、または１０種類の差次的発現を測定することができる。
一つの例では、本明細書中に記載の多変量法が表１９に掲載される胃がん関連ｍｉＲＮＡを使用する場合、本方法は、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐｍ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、およびｍｉＲ－２２３－３ｐからなる群より選択される任意の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程をさらに含んでもよい。
本明細書中に記載の多変量法が表２０に掲載される非関連ｍｉＲＮＡを使用する一つの例では、本明細書中に記載の方法は、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐおよびｍｉＲ－２７ｂ－３ｐからなる群より選択される任意の一又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程をさらに含んでもよい。
胃がんと相関するｍｉＲＮＡセットを想到する例示的アプローチを以下にまとめる。また、一般的作業フローを、図１、２、および１４に示す。
工程１：トータルＲＮＡ（又は、そのサブフラクション）を、胃がんを有する被験者（複数可）のサンプル（例、血漿、血清、またはその他の血液画分）から、適切なキットおよび／または精製方法を使用して、抽出する。
工程２：各サンプルから、一つのｍｉＲＮＡ、または、配列番号：１～配列番号：１９１からなる群より選択される少なくとも一つのｍｉＲＮＡのセットの量（発現レベル）を、実験的手法を使用して測定する。一つの例では、少なくとも一つのｍｉＲＮＡは、表１２、１９、および２０に掲載される群から選択可能である。これらの手法は、当該分野で既知の手法であって、限定はされないが、アレイに基づくアプローチ、増幅方法（ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、もしくはｑＰＣＲ）、シークエンシング、次世代シークエンシング、および／または質量分析を含む。
工程３：各単一ｍｉＲＮＡバイオマーカーの診断値と重複に関する情報を集めるため、数学的方法を適用する。これらの方法は、当該技術分野での既知の方法であり、限定はされないが、基本的な数学的アプローチ（例、商（ｆｏｌｄ ｑｕｏｔｉｅｎｔｓ）、シグナル・ノイズ比、相関）、統計法（仮説検定（例、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）としてのもの）、受信者動作特性曲線下面積、情報理論アプローチ（例、相互情報量、クロスエントロピー）、確率理論（例、結合確率と条件付き確率）、または、これまでに述べた方法の組合せと改変を含む。
工程４：工程３）で得られた情報を使用して、各ｍｉＲＮＡバイオマーカーに関して、診断内容または診断値を推測する。しかしながら、通常、この診断値は小さすぎて、８０％の壁を超える正確な率、特異度、および感度を有する非常に正確な診断を得ることができない。胃癌の診断に適するｍｉＲＮＡの診断内容を、図１に掲載する。この図には、表１２、１９、および２０に掲載されるｍｉＲＮＡが含まれる。
工程５：胃癌に罹患する個人の診断成績を向上するために、一より多いｍｉＲＮＡバイオマーカーを採用してもよい。従って、胃がんの検出用に適合させたｍｉＲＮＡバイオマーカーセット（表１２または、表１９および２０に掲載されるｍｉＲＮＡを含む場合があるもの）を選択／定義するために、統計学的学習／機械学習／バイオインフォマティクス／コンピューター的アプローチをセットの選択に適用する。これらの手法には、限定はされないが、ラッパー部分集合選択手法（例、前進ステップワイズ法、後進ステップワイズ法、組合せ法、最適化法）、フィルター部分集合選択方法（例、工程３に述べた方法）、主成分分析、または、そのような方法の組合せと改変（例、ハイブリッド法）が含まれる。
工程６：工程５で選択／定義された部分集合（少数のみ（少なくとも一つ、少なくとも二つ、またはそれ以上のセット）～全ての測定ｍｉＲＮＡの範囲にある場合があるもの）を、その後使用して、胃がんの診断を実施する。この目的のために、統計学的学習／機械学習／バイオインフォマティクス／コンピューター的アプローチを適用し、それらには、限定はされないが、任意の型の目的変数ありの分析または目的変数なしの分析（分類手法（例、ナイーブベイズ法、線形判別分析、二次判別分析用神経ネットワーク、ツリーに基づくアプローチ、サポートベクターマシン、近傍法）、回帰手法（例、線形回帰、重回帰、ロジスティック回帰、プロビット回帰、順序ロジスティック回帰、順序プロビット回帰、ポアソン回帰、負の二項回帰、多項ロジスティック回帰、切断回帰）、クラスタリング手法（例、ｋ平均法、階層クラスタリング、ＰＣＡ）、これまでに述べたアプローチの改造、拡張、および組合せ）が含まれる。
工程７：部分集合選択（工程５）と機械学習アプローチ（工程６）を組み合わせることによって、胃がんを診断するアルゴリズムまたは数学的関数を得る。このアルゴリズムまたは数学的関数を、個人（被験者）のｍｉＲＮＡプロフィール（ｍｉＲＮＡ発現プロフィールデータ）に適用して、胃がんの診断を実施する。
本明細書中に記載の方法のいずれにおいても、非細胞性生体液には、体液の細胞成分を全く含まない任意の体液を含んでもよい。従って、一つの例では、被験者から抽出する際に、生体液または体液は、被験者の体液または生体液に一般的に見られる細胞性成分を含む場合がある。しかしながら、この生体液または体液は、当該分野で既知の方法を用いて処理されて、その生体液または体液内に含有される任意の細胞性成分を除去することもできる。例えば、体液または生体液の細胞性成分を除去する遠心分離または精製プロセスを実施する場合があり、その後、本開示の方法を実行してもよい。従って、一つの例では、体液または非細胞性生体液には、限定はされないが、羊水、母乳、気管支洗浄液、脳脊髄液、初乳、間質液、腹腔液、胸水、唾液、精液、尿、涙、全血（血漿、赤血球、白血球、および血清を含むもの）の非細胞性成分が含まれる。一つの例では、非細胞性生体液は、血清または血漿であってもよい。
本明細書中に記載の方法のいずれにおいても、本明細書中で使用される用語「被験者」および「患者」は、互換的に使用されて、動物（例、哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および昆虫）を指すことができる。一つの例では、被験者は、哺乳類（例、非ヒト哺乳類（例、イヌ、ネコ、または霊長類）およびヒト）である場合がある。一つの例では、被験者は、霊長類（例、チンパンジーおよびヒト）であってもよい。一つの例では、被験者はヒトである場合がある。一つの例では、被験者は胃がん（胃癌）を有するか、又は、有しないヒトである場合がある。本開示の実験セクションでは、訓練データセットを、華人または華人の子孫である被験者から得た。従って、一つの例では、被験者はアジア人の子孫である場合がある。一つの例では、被験者は、華人または華人の子孫である場合がある。
一つの例では、本明細書中に記載される方法は、キットとして提供可能である。キットは、必要な構成要素または本明細書中に記載のｍｉＲＮＡを検出する構成要素を含んでもよい。構成要素には、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡとハイブリダイズ可能なプライマー／プローブ、試薬、容器、および／または本明細書中に記載のｍｉＲＮＡとプライマー／プローブを検出するように構成された機器が含まれる場合がある。一つの例では、キット内の容器には、本明細書中に記載のｍｉＲＮＡのレベルを検出または測定可能なプライマー／プローブセットであって、使用前に放射性元素で標識されるものが含まれる場合がある。キットは、一又は複数のｍｉＲＮＡを逆転写および増幅するための物質の容器（例、ｄＮＴＰ（４種類の各デオキシ核酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、バッファー、逆転写酵素、およびＤＮＡポリメラーゼを含む複数の容器）を含んでもよい。キットはまた、ポジティブコントロール反応および／またはネガティブコントロール反応用の核酸鋳型（複数可）を含む場合がある。キットは、被験者から得られるサンプル由来のｍｉＲＮＡの単離に必要な、任意の反応構成要素またはバッファーをさらに含んでもよい。
本明細書中で解説的に記載される発明は、本明細書中では具体的に開示されない任意の要素（複数可）、制限（複数可）が無くても適切に実施可能である。従って、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、広くおよび制限なしに読解されたい。また、本明細書中で採用される用語および表現は、説明のための用語として使用され、限定するためのものではない。そして、示され且つ記載される特徴またはその部分の任意の等価物を除外するような用語および表現を使用する意図はない。しかし、請求項の発明の範囲内で各種改変が可能であることが認識される。従って、理解されるべきは、本発明が好ましい実施形態と任意選択の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書中やその他の開示中で実体化された発明の改変および変形は当業者によって復元可能であって、そして、そのような改変および変形が本発明の範囲内であると考えられることである。
本発明を、本明細書中で広く且つ一般的に記載した。本一般開示内に収まるそれより狭い種および下位属のグループもまた、本発明の部分を形成する。これは、取り上げた材料が本明細書中に具体的に記載されているか否かに関わらず、その属から任意の主題要素を除去する仮定的または否定的限定を有する本発明の一般的記載を含む。
他の実施形態は、以下の請求項と非限定的実施例内である。また、本発明の特徴または観点がマーカッシュ群の言葉で記載されている場合、当業者は、本発明がまた、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群に関してそれにより記載されていることを認識する。
実験セクション
方法
分析前処理（サンプル回収とマイクロＲＮＡ抽出）：正常被験者（すなわち、胃がんの無いコントロール）と胃がん被験者由来の血清サンプルを、シンガポール胃がん協会のメンバーが遠心分離して回収し、処理し、そして、－８０℃で凍結保存した。２００μｌの血清由来のトータルＲＮＡを、半自動化ＱｉａＣｕｂｅシステム上で、十分に確立されたカラムベースのｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して単離した。血清には、少量のＲＮＡが含まれている。ＲＮＡのロスを削減し、抽出効率をモニターするために、合理的設計の単離増強剤（ＭＳ２）とスパイクインコントロールＲＮＡ（ＭｉＲＸＥＳ）を、単離前に検体に加えた。
ＲＴ－ｑＰＣＲ：阻害剤の存在を検出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ効率をモニターするための第二のセットのスパイクインコントロールＲＮＡを加えた最適化多重逆転写反応物中で、単離されたトータルＲＮＡと合成ＲＮＡ標準をｃＤＮＡに変換した。Ｉｍｐｒｏｎ ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））逆転写酵素を使用して、製造事業者の取扱説明書に従って、逆転写反応を実行した。合成ｃＤＮＡを、その後、多重増強工程に供し、そして、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ系一重ｑＰＣＲアッセイ（ＭＩＱＥ対応）（ＭｉＲＸＥＳ（登録商標））を使用して定量した。ＡＢＩ（登録商標）ＶｉｉＡ－７ ３８４装置を、ｑＰＣＲ反応のために使用した。ｍｉＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ測定の作業フローの概説と詳細を図２にまとめる。
データ処理：未処理の閾値までのサイクル数（Ｃｔ）を処理して、そして、各サンプル中の標的ｍｉＲＮＡの絶対コピー数を、合成ｍｉＲＮＡの検量線を補間することによって決定した。ＲＮＡ単離とＲＴ－ｑＰＣＲの処理中に導入された技術的ばらつきを、スパイクインコントロールＲＮＡによって標準化した。単一ｍｉＲＮＡの解析に関しては、生物学的ばらつきを、全てのコントロールと疾患サンプルに渡って安定的に発現される検証済み内在性基準ｍｉＲＮＡセットによって、さらに標準化した。
試験設計
十分に設計された臨床試験（症例コントロール試験）を実施して、胃がんの診断用バイオマーカーの正確な同定を保証した。平均年齢が６８．０±１０．９歳の胃がん（ステージ１～４）を有する合計２３７名の華人患者を、この試験に用いた。そして、コントロール群として機能する、年齢と性別が合った正常な（健康／胃がんの無い）別の２３６名の華人被験者と比較した。全てのがん被験者は、内視鏡検査と生検により確認され、そして、血清サンプルを任意の治療前に回収した。全ての正常（健康な）被験者は、胃がんが無いことをサンプル回収時に内視鏡検査によって確認し、そして、二年ごとに内視鏡検査スクリーニングして３～５年間追跡調査し、被験者がこの期間内に胃がんを発症しなかったことを確認した。被験者の詳細な臨床情報を、表２および３に表にする。全ての血清サンプルを、使用前まで－８０℃で保管した。試験した被験者の特性を、表５にまとめる。多数のコントロール被験者（正常／健常／胃がんの無い被験者）が、胃の疾患（例、胃炎、腸上皮化生、および腸の萎縮）を有していた。従って、コントロール群は、胃がんに関するハイリスク集団に相当した。ピロリ菌を有する胃がん患者のパーセンテージ（７８．８％）は、コントロール群のもの（５５．７％）よりも多いけれども、その差がわずかなので、ピロリ菌を胃がんのバイオマーカーとして使用することを支持するには不十分であった。
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血液中に循環する、細胞から遊離したｍｉＲＮＡが様々な組織源を起源とする場合があることが知られている。その結果、固形胃腫瘍の存在が原因のｍｉＲＮＡレベルの変化は、他の供給源由来の同じｍｉＲＮＡの存在によって複雑化している場合がある。従って、がんとコントロール群に見られるｍｉＲＮＡの発現レベルの差を決定することは、難しく、そして、予想としては差ははっきりとしない。また、血液の容量が大きいこと（成人では５Ｌ）による希釈効果のため、細胞から遊離したｍｉＲＮＡのほとんどは、血液中でものすごく量が少ないことが知られている。従って、限定量の血清／血漿サンプル由来の複数のｍｉＲＮＡ標的の正確な測定は、重要であって、そして、非常に大きな難題を提示する。低感度または半定量的スクリーニング方法（マイクロアレイ、シークエンシング）を使用する代わりに、ｍｉＲＮＡの発現が有意に変化することの発見および胃がんの診断用の多変量ｍｉＲＮＡバイオマーカーパネルの同定を最も容易にするために、本実験的試験では、図２にまとめられた作業フローを用いてｑＰＣＲに基づくアッセイを実行するように選択した。
本実験セクションで使用される作業フローでは、全ての反応を、ｍｉＲＮＡ標的に関して一重態様で少なくとも２回実施し、合成ＲＮＡ「スパイクイン」コントロールに関しては少なくとも４回実施した。そのようなハイスループットｑＰＣＲ試験の結果の正確性を保証するために、何回も繰り返した後に、本試験を、循環バイオマーカーを発見するための強力な作業フローへと設計／確立した（「方法」セクションと図２を参照されたい）。この作業フローでは、各種人工設計「スパイクイン」コントロールを使用して、単離、逆転写反応、増強、およびｑＰＣＲプロセスの技術的ばらつきを監視および補正した。全てのスパイクインコントロールは、非天然合成ｍｉＲＮＡ模倣物（２２～２４塩基長の範囲の小分子単鎖ＲＮＡ）であって、それらは、全ての既知ヒトｍｉＲＮＡに配列相同性が極めて低いようにインシリコで設計されて、従って、アッセイで使用するプライマーへのクロスハイブリダイゼーションが最小限になっていた。また、ｍｉＲＮＡアッセイを工夫して多数の多重群にインシリコで分けて、非特異的な増幅とプライマー－プライマー相互作用を最小限とした。合成ｍｉＲＮＡを使用して、全ての測定における絶対コピー数の補間用の検量線を作成し、従って、技術的ばらつきをさらに補正した。複数レベルのコントロールを有するこの作業フローを用いる場合、予想では、発現レベルが低い循環するｍｉＲＮＡであっても、確実に且つ再現性良く検出可能である。
ｍｉＲＮＡバイオマーカー
バイオマーカーの同定に向けた工程では、正常（コントロール）状態と疾患状態での各ｍｉＲＮＡの発現レベルを比較する。４７２個の血清サンプル（胃がんと正常／コントロールのもの）全ての５７８種類（ｍｉＲＢａｓｅバージョン１０リリース）のヒトｍｉＲＮＡの発現レベルを、強力な作業フローと高感度ｑＰＣＲアッセイ（ＭｉＲＸＥＳ、シンガポール）を使用して定量的に測定した。
本実験設計では、２００μｌの血清を抽出し、トータルＲＮＡを逆転写し、そして、タッチダウン増幅によって増強して、ｃＤＮＡの量を増加させるが、ｍｉＲＮＡの発現レベルの比率は変化させない（図２）。増強ｃＤＮＡを、その後、ｑＰＣＲ測定用に希釈した。希釈効果に基づく単純計算で明らかになったのは、ｍｉＲＮＡ（血清中で、≦５００コピー／ｍｌのレベルで発現するもの）が一重ｑＰＣＲアッセイの検出限界（≦１０コピー／ウエル）に近いレベルで定量されることである。そのような濃度では、測定は、技術限界（ピペッティングとｑＰＣＲでの誤差）に起因して非常に困難なものとなる。従って、≦５００コピー／ｍｌの濃度で発現するｍｉＲＮＡを、解析から除外し、本試験では検出できないものと見なした。
アッセイした総ｍｉＲＮＡ（合計５７８種類のｍｉＲＮＡをアッセイした）の約３３％が高発現であることが分かった。これら１９１種類のｍｉＲＮＡ（発現レベル≧５００コピー／ｍｌ；表４）は、血清サンプルの９０％より多くで確実に検出された。そして、これらは他の技術を使用して以前報告されたものよりもずっと多かった。このことは、強力な実験設計とコントロールをしっかり取った作業フローを使用することの重要性を強調する。
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ヒートマップを、その後、作成して、全ての検出された血清中ｍｉＲＮＡ（１９１種類の検出ｍｉＲＮＡ、図３）の発現レベルを表した。各種亜集団のｍｉＲＮＡを一緒にクラスタリングしたが、検出されたｍｉＲＮＡの総数に基づく目的変数なしの階層クラスタリングによっては、がん群とコントロール群の間に明らかな違いはないように見えた。従って、特徴選択を全くしなければ、両群に関するｍｉＲＮＡプロフィール全体は類似して見えた。
１９１種類の血清中ｍｉＲＮＡの発現を、その後、比較した。
・Ａ］正常／コントロールと胃がん（ステージまたはサブタイプに関わらず）との間。
・Ｂ］胃がんの各種ステージ（ステージ１～４）間、および
・Ｃ］正常／コントロールと胃がんの各種ステージとの間。
二群間の差次的発現の有意性は、当該分野で既知のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ型多重比較法を使用する偽発見率（ＦＤＲ）推測値に対して補正されたｔ検定（ｐ値＜０．０１）に基づいて計算された。
Ａ］正常／コントロールと胃がん（ステージまたはサブタイプに関わらず）で差次的に発現されたｍｉＲＮＡの同定
胃がんのびまん型、腸型、または混合型のいずれかを有することが臨床的に確認された患者由来のサンプルを、一緒にグループ分けし、そして、正常／コントロールドナー由来のサンプルと比較した。コントロール群とがん群との間で有意な差次的発現を示した７５種類のｍｉＲＮＡのプールを同定した（ｐ値＜０．０１、表６）。この推定上のバイオマーカーの発現のほとんどが、胃がん被験者でより高いことが見出された他のレポート（表１）と違っていて、本試験は、がん被験者では５１種類のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされるが、２４種類はダウンレギュレートされることを実証した（表６）。従って、本実験設計は、より多くの制御されるバイオマーカーを同定した。
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本試験の結果（表６）を、他の報告において血液中で差次的に発現されると同定された３０種類のｍｉＲＮＡ（表１）と比較すると、たった６つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）が、共通してアップレギュレートされることが判明した（表７）。従って、文献中で差次的に制御されるといわれるｍｉＲＮＡの大半は、本試験では確認されなかった。興味深いことに、胃がんの潜在的バイオマーカーである６９種類の新規ｍｉＲＮＡをここに同定した。
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この７５種類のバイオマーカーのセットを使用すると、胃がん被験者と正常／コントロール被験者との間のより差のあるクラスタリングが、ｍｉＲＮＡのプロフィールのヒートマップにおいて観察された（図４）。水平方向にある線を見ると、胃がん被験者（黒色）の大多数が、ある集中した領域にクラスタリングされ、正常／コントロール被験者の大多数は、マップ中の残りの空間に残されていた。トップランクのアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ）とダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ）に関するＡＵＣ値は、それぞれ、ほんの０．７１と０．６７であった（図５）。７５種類の差次的なｍｉＲＮＡの各々またはその数個の組合せは、胃がんの診断用のバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルとして役立つことができる。
そのｍｉＲＮＡの発現は、ヒートマップ（図３、４）に説明されるように、サブグループにクラスタリングされることが判明した。各クラスターは、約１０～２０種類のｍｉＲＮＡ（図３、４；点線間）を有する。全ての検出可能なｍｉＲＮＡの分析は、これらの多くのものが正に相関する（ピアソン相関係数＞０．５）（図６）ことを明らかにした。同じ観察が、胃がん特異的ｍｉＲＮＡにも見られた（図７）。これらの結果は、ある群のｍｉＲＮＡが全ての被験者の間で同様に制御されることを示した。その結果、診断成績を向上するために一又は複数の差のあるｍｉＲＮＡを別のものと置換することによって、ｍｉＲＮＡのパネルが組立て可能である。そして、７５種類の有意に変化するｍｉＲＮＡ全てが、胃がんに関する多変量インデックス診断アッセイの開発に重要であった。
Ｂ］正常／コントロールと胃がんの各種ステージとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡの同定。
胃がんの各種ステージ間のｍｉＲＮＡの発現を、その後、比較した。ステージとサブタイプを考慮に入れる二方向ＡＮＯＶＡを用いると、３６種類のｍｉＲＮＡ（１９１種類の血清中ｍｉＲＮＡのプール由来のもの）が、胃がん被験者の各種ステージ間で差次的に発現されることが判明した（偽発見率補正後のＡＮＯＶＡ検定のｐ値は＜０．０１であった。データ未発表）。
各種ステージ間の差異を知ったので、次に取り組んだのは、正常／コントロールとがんの各ステージとの間で差次的に発現されるｍｉＲＮＡの同定であった。この新規検索過程で見つかった差のあるｍｉＲＮＡの総数は１１３であった（表８～１１；それら表中、プロフィールは重複していた）。これらの中では、２０種類のｍｉＲＮＡ（８種類のアップレギュレートされるものと１２種類のダウンレギュレートされるもの）、６２種類のｍｉＲＮＡ（５４種類のアップレギュレートされるものと８種類のダウンレギュレートされるもの）、４３種類のｍｉＲＮＡ（３７種類のアップレギュレートされるものと６種類のダウンレギュレートされるもの）、または、７４種類のｍｉＲＮＡ（２８種類のアップレギュレートされるものと４６種類のダウンレギュレートされるもの）のプールが、正常／コントロールと、それぞれ、対応するステージ１、２，３、および４、との間での差次的発現を示した（ＦＤＲ補正後のｐ値は＜０．０１；表８～１１）。
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３種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１１－５ｐ）は例外ではあるが、がんの全てのステージをまとめて使用する解析から発見された７５種類のｍｉＲＮＡ（表６）の残りは、がんの各ステージを独立して解析した際に同定されたこれら１１３種類のｍｉＲＮＡの部分集合であることが判明した。胃がんの各種ステージ間で差次的に制御されることが分かった（一つを除く）３６種類のｍｉＲＮＡのほとんどが、正常／コントロール（Ｎ）と胃がんの各ステージ（Ｓ１～Ｓ４）を比較した際に差次的に発現されることが判明した（表８～１１）。各ステージ間の差異は、胃がんの検出に有用となる互いに異なるｍｉＲＮＡプールを生じた。従って、正常／コントロールに対する互いに異なるステージにおける発現レベルを比較した結果により、有益なｍｉＲＮＡのプールがより大きくなった。
明らかに、後期のステージよりも前期のステージ１で同定されたｍｉＲＮＡの数が少なかった。ＡＵＣ値が最も高くランクされたｍｉＲＮＡの素性は、全てのステージでいつも同じではなかった（図８）。より多くの数のｍｉＲＮＡが制御されていた（表８～１１）。そして、似た素性が、複数のステージに渡って繰り返して見いだされた（図１０）。たった一つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ）が、４つのステージ全ての間で共通であったことが判明した。これらの差のあるｍｉＲＮＡ（表８～１１）は、個々に使用可能であり、そして、複数のｍｉＲＮＡの結果を集めることが、がんのステージが診察時に未知である臨床設定において胃がんの診断に有用である場合がある。
上記試験から、各ステージに特異的なｍｉＲＮＡリスト由来の少なくとも一つのｍｉＲＮＡからなるバイオマーカーパネルは、被験者が胃がんを有する尤度を決定する代替方法を提供可能である。
ＩＩＩ多変量バイオマーカーパネルの探索
多変量パネルを組立てるための重要な評価基準は、がんの各ステージ用の特異的リストから少なくとも一つのｍｉＲＮＡを含ませて、全てのがんサブグループをカバーすることを保証することである。しかしながら、がんの４つのステージを定義するｍｉＲＮＡは、完全に異なるものではなかった。というのも、同じｍｉＲＮＡがそれらステージ間に同様に見出されるからだ（図９）。同時に、多数のがん関連ｍｉＲＮＡと非関連ｍｉＲＮＡは正の相関があることが分かり（図６，７）、このことは、胃がん診断用の最適なｍｉＲＮＡの組合せの選択を難しくしている。
この課題の複雑さを見て、本試験では、ＳＦＦＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｓｅａｒｃｈ）アルゴリズムを使用して最も高いＡＵＣを有するｍｉＲＮＡパネルを同定する必要があることを決断した。最先端の線形サポートベクターマシン（変数パネルを構築することに関する、よく利用され且つ認識されているモデリングツール）を、当該分野で使用して、ｍｉＲＮＡの組合せの選択の補助をすることも知られていた。このモデルは、各メンバーの発現レベルとその加重値を説明する一次式に基づくスコアを生成する。この線形モデルは、臨床実務で容易に受け入れられて適用される。
このような過程の成功の重要要件は、質の高いデータの利用可能性である。多数のよく規定された臨床サンプル中の全ての検出されるｍｉＲＮＡの定量的データは、結果の正確性と精密性を改善するのみならず、さらに、ｑＰＣＲを使用する臨床応用のための同定されたバイオマーカーパネルの一貫性をも保証した。
臨床サンプルの数が多い（５００＋）状況では、モデリングにおけるデータの過剰なフィッティングの問題が最小化された。というのは、選択されるべきなのは１９１個の特徴候補しかないからだ。また、結果の正確度を保証するために、４重交差検証を複数回実施して、発見セット（各重においてサンプルの３／４）に基づく、検証サンプルの独立セット（各重においてサンプルの残りの１／４）における同定済みバイオマーカーパネルの性能を検定した。交差検証プロセス中、サンプルを、性別、サブタイプ、およびステージに関して適合させた。
結果（発見相と検証相の両方のバイオマーカーパネルのＡＵＣ）の箱ひげ図を、図１０に示した。予想通り、各探索に関する検証セットのＡＵＣ値の減少があった（０．０４～０．０６）。箱のサイズは、検証相のデータではより大きくなったが（値の幅が広がったことを示している）、ＡＵＣ値の差は≦０．１であった。この値の幅の広がりは、分析に含まれるバイオマーカー数が６より多い場合には、より狭くさえあった（＜０．０５）。この観察は、より強固な結果がｍｉＲＮＡの数が６以上で得られたことを示していた。
結果をより定量的に表したものを、図１１に示した。そこでは、分析に含まれるバイオマーカー数が７より大きい場合には、ＡＵＣ値の改善は観察されなかった。６種類のｍｉＲＮＡからなるバイオマーカーパネルと７種類のｍｉＲＮＡからなるバイオマーカーパネルとの間の差は統計学的に有意であるが、そのＡＵＣ値の改善はほんの０．０２であった。従って、６種類のｍｉＲＮＡからなるパネルを使用して得たＡＵＣ値０．８５５は、臨床で使用するために十分である。
ＩＶ多変量ｍｉＲＮＡバイオマーカーパネルの組成
多変量バイオマーカーパネルの組成を調べるために、６～１０種類のｍｉＲＮＡを含む全てのパネルにおけるｍｉＲＮＡの存在率をカウントしたが、上位１０％と下位１０％のＡＵＣを有するパネルは除外した。上位１０％と下位１０％のＡＵＣを有するものを除外して、交差検証分析の無作為化プロセスによって生まれた亜集団由来の不正確なデータを適用することに起因する偽発見バイオマーカーをカウントすることを避けた。カウントが４未満である場合のこれらｍｉＲＮＡを除外する場合、総数で５５種類のｍｉＲＮＡを、発見プロセスで選択した（表１２）。そこでは、これらの内４３種類の発現ががんで有意に変化していたことも判明した。他の１２種類（がんでは変化が無かったが）を含めると、ＡＵＣ値が有意に改善することが分かった。全てのｍｉＲＮＡ標的を直接的かつ定量的に測定せずには、これらのｍｉＲＮＡは、ハイスループットスクリーニング法（マイクロアレイ、シークエンシング）では決して選択されなかっただろうし、ｑＰＣＲ検証用には除外されていたであろう。これらのｍｉＲＮＡは無作為に選択されたものではない。というのも、上位二つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ）は、これらパネルの５７．８％と４８．４％に一貫して見られたからだ。
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多変量パネルを形成するように選択されるｍｉＲＮＡ（表１２）は、各種ステージのがんを検出する際には、違いを示した（表８～１１）。上位１０個のしばしば選択されるｍｉＲＮＡであって、存在率が２０％より高いものとしてリストにあるものに関しては、それらの内たった３つ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ）しか、がんの二つより多い異なるステージにおいて共通して制御されていないことが判明した。一方、残りのものに関しては、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐがステージ１のみに有意であり、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐがステージ４のみに有意であり、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐがステージ１＆４に有意であり、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５とｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐがステージ２＆４に有意であり、そして、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６－５ｐとｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ－５ｐがステージ３＆４に有意であった。多くの数のｍｉＲＮＡが他の３つのステージのリストと重複していたステージ４（図９）を除外して、ステージ１～３の各々に特異的な２種類のｍｉＲＮＡが、しばしば選択された。
診断マーカーとして多変量パネル用に選択された複数のｍｉＲＮＡと単一ｍｉＲＮＡの素性を比較する場合、それらは必ずしも同一ではなかった。例えば、全てのがんに関して（図５）最も上位のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ）とダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ）の両者は、リストには含まれなかった。従って、各種ステージ用に同定されたベストバイオマーカーを単に組み合させて最適なバイオマーカーパネルを形成することはできなかったし、むしろ、マーカーパネルは、最良の結果を与える相補的情報を提供した。
興味深いことに、５種類のｍｉＲＮＡ（＞４８％の出現率を有するもの、表１２を参照されたい）が、多変量パネルにしばしば選択された。これらの内三つ（ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）はがん特異的であり、そして、二つ（非有意群；ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ）は他の群に由来した。全ての多変量パネルでこれら５種類のｍｉＲＮＡが同時に存在する率を解析した（表１３）。すると、８５．９％のパネルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐまたはｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐのいずれかを有していた。従って、これら二種類のｍｉＲＮＡのいずれか一つの使用が、多変量インデックスパネルにおけるＡＵＣ値を増加させるのに十分有用である可能性がある。
全体では、ｍｉＲＮＡバイオマーカーパネルの９３．８％が、各群からの少なくとも一つのｍｉＲＮＡを有していた。従って、一つの例では、被験者が胃がんを有する尤度を決定する多変量法は、これら二つのしばしば選択されるｍｉＲＮＡ群の各々由来の少なくとも一つのｍｉＲＮＡを含む場合がある。
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がんリスクスコアの計算
ｍｉＲＮＡを組み合わせて、バイオマーカーパネルを形成して、がんリスクスコアを計算することができる（式１）。例えば、出現率が＞２０％であって、多変量バイオマーカーパネル同定プロセスでしばしば選択される１２種類のｍｉＲＮＡ（表２１）を、組み合わせてバイオマーカーパネルを形成して、がんリスクスコアを計算することができる。ここの式は、胃がんリスク予測のための線形モデルの使用を示し、（各被験者に対してユニークな）がんリスクスコアは、被験者が胃がんを有する尤度を示す。この計算は、１２種類のｍｉＲＮＡの測定値に加重したものと定数５０とを合計することにより行う。
式１－
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 ｌｏｇ２コピー数＿ｍｉＲＮＡｉ－１２種類の個々のｍｉＲＮＡのコピー数をｌｏｇ変換したもの。Ｋｉ－表２１に見ることができる、複数のｍｉＲＮＡ標的を加重するのに使用される係数。Ｋｉの値を、サポートベクターマシン法を用いて最適化し、０～１００の範囲になるように調整した。０より低いがんリスクスコアを有する被験者は０と見なし、そして、１００より高いがんリスクスコアを有する被験者は１００と見なす。
Figure 0007635186000043
本試験のコントロール被験者とがん被験者は、前記式に基づいて計算された互いに異なるがんリスクスコア値を有する（図１５Ａ）。コントロール被験者とがん被験者のがんリスクスコアを確率分布に適合させたものは、図１５Ｂに見ることができて、この二群間で明らかに分離していることが見出され得る。本試験では、コントロール被験者は、ハイリスク集団から選択された非がん被験者であった。そして、胃がんを有する確率は０．００６７である。この事前確率と図１５Ｂの確率分布に適合させたものに基づいて、未詳の被験者ががんを有する確率（リスク）を、それらのがんリスクスコア値に基づいて計算することができる（図１５Ｃ）。スコアが高いほど、被験者は胃がんを有するリスクがより高くなる。さらにまた、ハイリスク集団の胃がん発生率と比較すると、がんリスクスコアによって、未詳の被験者が胃がんを有する確率（リスク）の変化倍率を見分けることができる（図１５Ｄ）。例えば、未詳のハイリスク被験者であって、がんリスクスコアが７０のものは、胃がんを有する確率が１４．６％であり、これは、ハイリスク集団の平均リスクよりも約２２倍高い。
二つの閾値４０および７０をさらに適用することによって、被験者を、がんリスクスコアに基づく３つのカテゴリーへと定義することができる（図１５Ｃ、Ｄ）。がんリスクスコアが０～４０の範囲の被験者は、がんリスクが低い群に属し、その群が胃がんを有する確率は０．０５２％である。これは、ハイリスク集団の平均がん発生率よりも１３倍低い。がんリスクスコアが４０～７０の範囲の被験者は、がんリスクが中程度の群に属し、その群が胃がんを有する確率は１．４％である。これは、ハイリスク集団の平均がん発生率よりも２倍高い。がんリスクスコアが７０～１００の範囲の被験者は、がんリスクが高い群に属し、その群が胃がんを有する確率は１２．２％である。これは、ハイリスク集団の平均がん発生率よりも１８倍高い。

Claims (1)

  1. 被験者の胃がんを検出する方法であって、
    前記被験者から得られる血清または血漿サンプル中の少なくとも４つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを決定する工程であって、少なくとも４つのｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－１０３a－３ｐであり、コントロールと比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐとｈｓａ－ｍｉＲ－１０３a－３ｐのダウンレギュレーションおよびｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐとｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐのアップレギュレーションが胃がんを有する被験者を示し、コントロールは胃がんのない被験者である、方法。
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