JP7636448B2 - 混合レポーターを使用した核酸の多重検出 - Google Patents

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Description

本発明は一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、標的核酸の検出及び／又は鑑別におけるオリゴヌクレオチド及びそれらを使用するための方法を提供する。オリゴヌクレオチド及び方法は、複数の標的を同時に増幅、検出、識別及び／又は定量する上で特定の用途を見出す。
遺伝子分析は、疾患リスクの評価、疾患の診断、患者の予後又は治療への応答の予測、及び患者の進行の監視のために、診療所において日常的になりつつある。そのような遺伝子検査の導入は、遺伝的変異を識別するための簡便で安価かつ迅速なアッセイの開発に依存する。
インビトロ核酸増幅の方法は、遺伝学及び疾患診断において広く適用されている。そのような方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又は分岐増幅方法（ＲＡＭ）を含む。これらの標的増幅戦略の各々は、オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。増幅のプロセスは、５’末端にオリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、プライマー間に位置する配列の新たに合成されたコピーを含有する、アンプリコンの指数関数的増幅をもたらす。
アンプリコンの蓄積をリアルタイムで、又は増幅の終了時に監視するために一般的に使用される方法には、ユニバーサル基質プローブを有するＭＮＡザイムを使用する検出、標的特異的分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ若しくは加水分解プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ若しくはバイプローブ、キャッチャー／ピッチャープローブ、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、及び／又はＳｙｂＧｒｅｅｎ等の挿入色素の使用が含まれる。異なる配列を有するアンプリコンは、融解温度又はＴｍとして知られている異なる温度で変性するため、これらのプロトコルのいくつかの最中又は終了時に高分解能融解曲線分析を実行して、追加の情報を得ることができる。そのようなプロトコルは、ａ）挿入色素の存在下での二本鎖アンプリコンの２本の鎖の分離、又はｂ）アンプリコンの１本の鎖並びにフルオロフォア及びクエンチャーで標識された相補的な標的特異的プローブの分離、又はｃ）非標的関連二重構造、例えば標的の存在下でのみ生成されるキャッチャー二重構造の分離のいずれかから生じる融解曲線を測定する。融解曲線分析は、加熱中の２本のＤＮＡ鎖の解離速度に関する情報を提供する。融解温度（Ｔｍ）は、ＤＮＡの５０％が解離する温度である。Ｔｍは、対合したヌクレオチドの長さ、配列組成、及びＧ－Ｃ含有量に依存する。融解曲線分析からの標的ＤＮＡに関する情報の解明は従来、典型的には広い温度範囲にわたって小さな間隔で取得される一連の蛍光測定を伴う。融解温度は、塩基配列のみに依存するわけではない。融解温度は、オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液中のカチオン（一価（Ｎａ＋）及び二価（Ｍｇ２＋）塩の両方）、並びに／又は尿素若しくはホルムアミド等の不安定化剤の存在若しくは不在を含む多くの要因によって影響を受ける可能性がある。
一般に、個別の波長を監視することができる利用可能な蛍光チャネルの数は、蛍光リーダーで単一の反応で検出及び特異的に特定することができる標的の数を制限する。近年、「オリゴヌクレオチド切断及び伸長のタグ付け」（ＴＯＣＥ）として知られているプロト
コルがこの能力を拡張し、単一波長での複数の標的の分析を可能にしている。ＴＯＣＥ技術は、ピッチャー及びキャッチャーオリゴヌクレオチドを使用する。ピッチャーは、標的に相補的である標的化部分、及び相補的ではなく５’端に位置するタグ付け部分の、２つの領域を有する。捕捉オリゴヌクレオチドは、二重標識されており、その３’末端にピッチャーのタグ付け部分に相補的である領域を有する。増幅中、ピッチャーは、アンプリコンに結合し、プライマーの伸長時に、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が、ピッチャーからタグ付け部分を切断することができる。その後、放出されたタグ付け部分は、キャッチャーオリゴヌクレオチドに結合し、相補鎖を合成するためのプライマーとして機能する。その後、二本鎖キャッチャー分子の融解温度（キャッチャー－Ｔｍ）は、元の鋳型の代替マーカーとして作用する。異なる配列及び長さを有する複数のキャッチャーを組み込むことが可能であり、それらは全て異なる温度で融解するため、依然として単一波長で測定しながら、一連の標的を示す一連のキャッチャー－Ｔｍ値を得ることが可能である。このアプローチの制限には、固有の複雑さが含まれるが、これは、放出される断片が、人工標的に対する第２の伸長を開始及び完了することを必要とし、複数の標的の増幅後分析が、各特定の標的に関連したシグナルの割合を鑑別又は定量するための複雑なアルゴリズムを必要とするためである。
ヘアピンプローブ又はステムループプローブもまた、核酸の検出及び／又は標的増幅の監視に有用なツールであることが証明されている。フルオロフォア及びクエンチャー色素対で二重標識されているヘアピンプローブの１つの種類は、当該技術分野では一般に分子ビーコンとして知られている。一般に、これらの分子は、１）オリゴヌクレオチドの相補的な５’及び３’端のハイブリダイゼーションによって形成されるステム構造、２）検出される標的又は標的アンプリコンに相補的なループ領域、並びに３）分子ビーコンの末端に結合したフルオロフォアクエンチャー色素対の、３つの特徴を有する。ＰＣＲ中、ループ領域は、相補性のためにアンプリコンに結合し、これが、ステムの開放、及び故にフルオロフォアクエンチャー色素対の分離を引き起こす。分子ビーコンの本質的な特徴は、これらの分子のループ領域が増幅中に無傷のままであり、標的又は標的アンプリコンの存在下で分解又は切断されないことである。開放分子ビーコンの末端に結合した色素対の分離は、標的の存在を示す蛍光の変化を引き起こす。本方法は、単一のＰＣＲ検査における複数の標的の多重分析のために一般的に使用される。一般に、多重分析では、各分子ビーコンは、異なる標的特異的ループ領域及び固有のフルオロフォアを有するため、各アンプリコン種への各異なる分子ビーコンのハイブリダイゼーションを、別個のチャネルで、すなわち、別個の波長で監視することができる。
分子ビーコンの概念は、スロッピービーコンとして知られている戦略で拡張されている。このプロトコルでは、単一のビーコンのループ領域は、十分に長いため、不一致の塩基を許容し、それ故に１つ以上のヌクレオチドが異なるいくつかの密接に関連する標的に結合することができる。増幅後、融解曲線分析を実行し、標的種とスロッピービーコンのループ領域とのハイブリダイゼーションにより形成された二重構造が分離（融解）する温度に基づいて、異なる標的種を鑑別することができる。このようにして、複数の密接に関連する種を、単一波長で検出し、単一のスロッピービーコンで特定の標的の融解プロファイルを特徴付けることによって同時に識別することができる。標準的な分子ビーコン及びスロッピービーコンは、増幅中の分解又は切断が意図されないという点で、ＴａｑＭａｎ及び加水分解プローブとは異なる。スロッピービーコン及びＴＯＣＥ等のＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術の欠点は、プローブと非標的核酸配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションのために、偽陽性の結果を生成し得ることである。
多くの核酸検出アッセイは、融解曲線分析を利用して、所与の試料中の特定の標的配列の存在を特定するか、又は増幅配列に関する情報を明らかにする。融解曲線分析プロトコルは、徐々に増加する温度範囲にわたって様々な温度で蛍光を測定することを伴う。その
後、この曲線の勾配の変化を温度の関数としてプロットして、融解曲線を得る。このプロセスは、しばしば緩徐であり、典型的には完了に３０～６０分かかる。更に、融解曲線分析は、結果の解釈のために熟練した担当者による解釈及び／又は専用ソフトウェアの使用を必要とする可能性がある。したがって、融解曲線分析のより高速及び／又はより簡便な代替手段に対する高い需要が存在する。
融解曲線は、典型的には、ＰＣＲ後に分析され、したがって、試料中の標的の存在又は不在の定性的決定のみを可能にする。多くの場合、試料中に存在するゲノム材料の量の定量的又は半定量的な決定が必要である。したがって、試料に関する定量的情報も提供する、融解曲線分析の高速の代替手段に対する高い需要が存在する。
ＰＣＲによって、又は代替的な標的増幅プロトコルによって生成された複数の固有のアンプリコンの同時検出、鑑別、及び／又は定量化のための改善された組成物及び方法に対する必要性が存在する。
本発明は、現在の多重検出アッセイに存在する１つ以上の欠陥に対処する。
増幅プロトコル中に多重化する能力を拡張する方法及び組成物が、本明細書で提供される。これらの方法は、当技術分野で周知の基質及びプローブを含む「スタンダードレポーター」を、本明細書でＬＯＣＳ（ステムに接続されたループ）と称される構造と組み合わせる。標準的なレポーターとしては、直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ又は加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はバイプローブ、キャプチャー／ピッチャーオリゴヌクレオチド、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブを含むがこれらに限定されないプローブ及び基質が挙げられる。標準レポーターシステムと、１つ以上のＬＯＣＳ（全ての種は、例えば、単一の検出部分（例えば、同じフルオロフォア及びクエンチャー対）で標識され得る）との組み合わせにより、単一の反応において複数の標的を個々に識別することができる。このアプローチは、「標準レポーター」及び１つ以上のＬＯＣＳから生成されたシグナルを、１つ以上の温度で測定することを伴う。ＬＯＣＳからのシグナルの生成は、
－シグナルが測定される温度、
－ＬＯＣＳのループ部分が標的の存在に応答して切断又は分解されているかどうか、
－その「無傷」、又はその切断若しくは分解された「分割」立体構造における、特定のＬＯＣＳのステム部分の融解温度のうちのいずれか１つ以上を含むいくつかの要因に依存し得る。
分割ＬＯＣＳのステム領域の融解温度は、無傷ＬＯＣＳのループの標的依存的な切断又は分解を媒介した特定の標的の代替マーカーとして作用する。ステム－ループ構造を組み込む他の方法は、ａ）色素対間の距離を増加させる標的アンプリコン（例えば分子ビーコン及びスロッピービーコン）へのループ領域のハイブリダイゼーション後、又はｂ）色素（例えば切断可能な分子ビーコン）の物理的分離を可能にする標的媒介性切断による蛍光シグナルの変化を利用している。切断可能な分子ビーコンは、典型的には、単一波長で所与の標的に対して正又は負のシグナルを生成するために使用されている。多重標的検出は、一般に、異なる波長で放出されるシグナルを介して異なる標的を検出することを必要とする。したがって、類似又は同一の検出部分で標識され、異なる標的を検出するように設計された異なる切断可能な分子ビーコンに変異ステムを組み込むことは、標的間で異なる検出可能なシグナルを用いる必要なく、ステム融解温度の差に基づいて個々の標的を示す検出可能なシグナルを識別する能力を提供する。
本発明は、少なくとも部分的には、各ステムが異なる温度で融解し、かつシグナルを生
成するようにステムの長さ及び／又は配列組成を変化させることによって、ステム－ループ構造のステム部分の融解温度を操作することを通して生じる、既存の多重検出アッセイに対する改善を提供する。
本発明は、単一の反応において、単一のＬＯＣＳレポーター又は複数のＬＯＣＳレポーターとともに標準レポーターを使用することを含み得る。標準及びＬＯＣＳの両方のレポーターは、実質的に同じ様式で検出することができる同じ又は類似の検出部分（例えば、可視スペクトルの同じ領域で発光するフルオロフォア、比色検出又はＳＰＲ検出のための同じサイズ及び／又は種類のナノ粒子、化学発光検出のための反応性部分（例えば、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ酵素）、電気化学検出のための電気活性種（例えば、フェロセン、メチレンブルー又はペルオキシダーゼ酵素）で標識することができる。複数のＬＯＣＳが存在し、例えば同じ検出部分で標識される場合、これらは、（ａ）複数の標的の直接的若しくは間接的な同時検出をそれぞれ可能にする異なるループ配列、及び／又はｂ）個別の温度で融解し、調査される複数の標的において存在する特定の標的の特定に使用することができる異なるステム配列を含有し得る。本発明の方法は、例えば、別個のキャッチャー分子が必要とされず、故に反応混合物中の構成成分の数を低減し、費用を低減するという点で、例えば、ＴＯＣＥプロトコル等の当該技術分野で既知の方法に対する１つ以上の利点を提供するＬＯＣＳを使用する。更に、本発明の方法は、放出された断片が合成標的に対する第２の伸長を開始及び完了することを必要とするＴＯＣＥ法よりも本質的に複雑でない。
いくつかの実施形態では、ＬＯＣＳプローブは、（標的配列とは独立して）ユニバーサルであることができ、かつ／又は一連の検出技術と組み合わせることができ、故に分子診断の分野で広い適用性を送達する。追加的に、他の従来の増幅及び検出技術で使用される融解温度は、典型的には、ハイブリダイゼーション及び標的核酸によるプローブの融解に基づいている。これは、プローブと非標的核酸配列との間の非特異的ハイブリダイゼーションのために偽陽性が増加するという欠点に悩まされる。ユニバーサル基質を含有するそれらのＬＯＣＳレポータープローブは、標的配列と結合しないため、本発明の方法は、この制限を克服する。最後に、分子内結合が分子間結合よりも強いことは、当該技術分野で周知であり、故にこれらの切断されていない（無傷）ＬＯＣＳが非特異的標的とハイブリダイズし、偽陽性シグナルを生成する確率は、はるかに低い。
分子内結合が分子間結合よりも強い結果として、二重標識ＬＯＣＳは、無傷の場合は１つの温度で融解し、ＬＯＣＳを２つの断片に分割するループ領域の標的依存切断又は分解の後はより低い温度で融解する。本発明では、核酸のこの特性を利用して、機器が１つの蛍光チャネル等の単一の種類の検出器、又は比色、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、化学発光若しくは電気化学検出の特定のモードを使用して複数の標的を鑑別する能力を拡張する。
本発明のＬＯＣＳレポーターによって生成される温度依存蛍光シグナルは、明確に定義されており、標的ＤＮＡとは独立している。したがって、完全な温度勾配ではなく、選択された温度で生成される蛍光シグナルの測定から標的ＤＮＡに関する情報を解明することが可能であり、熱サイクリングデバイス（例えば、ＰＣＲデバイス）での実行時間を低減する上で利点を提供する。非限定的な例として、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ＰＣＲシステムで、０．５℃の増分での２０℃～９０℃の温度及び５秒間の保持時間の設定で従来の融解分析を行うには、１４１回の蛍光測定サイクル、及び約５０分間の実行時間を必要とする。ＬＯＣＳプローブを使用すると、標的ＤＮＡに関する情報を、同じデバイスから２～６回の蛍光測定で得ることができ、約２～５分間の実行時間を必要とする。いかなる特定の制限もなければ、実行時間の低減は、例えば、診断を含む多くの用途において有利である可能性がある。
本発明では、ＬＯＣＳプローブを標準レポーター又はプローブ又は基質を組み合わせて、複数の標的を同時に検出、鑑別、及び／又は定量化する。様々な標的を示す個々のシグナルは、同じ手段によって、例えば、単一の蛍光チャネルで発光するシグナルを介して、又は比色、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、化学発光、若しくは電気化学的検出の特定のモードによって検出可能であり得る。従来のｑＰＣＲでは、標的ＤＮＡの定量化は、各増幅サイクルで単一温度で蛍光を測定することによって得た増幅曲線からのサイクル定量化（Ｃｑ）値を使用して決定され得る。Ｃｑ値は、標的ＤＮＡの濃度の負の対数値に比例するため、実験的に決定されたＣｑ値から濃度を決定することが可能である。しかしながら、どのプローブがシグナルに寄与しているかを特定することは困難であるため、単一のチャネルに２つ以上の標的特異的プローブが存在する場合、各標的を正確に定量化することは困難である。この問題に対処するために、ＬＯＣＳレポーターを使用して、増幅中に２つ以上の温度で蛍光を測定することによって得られる増幅曲線を生成することにより、単一のチャネルにおける２つ以上の標的の正確かつ特異的な定量化を可能にすることができる。これが可能なのは、ＬＯＣＳレポーターが、異なる温度で有意に異なる量の蛍光を生成し得るためである。更に、ＬＯＣＳレポーターを使用して、リアルタイムの第１の温度（標的１）及び増幅の前後の第２の温度（標的２）で蛍光を得ることによって、単一のチャネルにおける第１の標的の正確かつ特異的な定量化及び第２の標的の同時定性的検出を可能にすることができる。後者のシナリオの利点は、増幅プロトコルの全体的な実行時間に影響を与えず、分析のための専用ソフトウェアを必要としない可能性があることである。このアプローチは、標的のうちの１つのみに定量化又はＣｑ決定が必要とされるシナリオで有用であり得る。
分析が、ＰＣＲ内の限定された数の時点、例えば、増幅開始時又はその近く、及び終点での増幅後の蛍光取得のみを必要とするいくつかの実施形態では、ＬＯＣＳ構造の使用は、各サイクルでの取得の必要性を排除する。したがって、これらの実施形態は、結果が得られるまでの時間を低減することができる非常に迅速なサイクリングプロトコルに非常に適している。
上記のように、融解曲線分析プロトコルは、徐々に増加する温度範囲（例えば、３０℃～９０℃）にわたって様々な温度で蛍光を測定することを伴う。その後、この曲線の勾配の変化を温度の関数としてプロットして、融解曲線を得ることができる。このプロセスは、しばしば緩徐であり、例えば、完了に３０～６０分かかる可能性がある。融解曲線分析の速度を増加させるには、高度に専門化された機器へのアクセスが必要であり、標準的なＰＣＲデバイスを使用して達成することはできない。したがって、標準的な機器を使用して、単一の蛍光チャネルにおける複数の標的の同時検出を提供することができる融解曲線分析のより高速な代替手段に対する高い需要が存在する。本発明のＬＯＣＳ構造の融解温度（Ｔｍ）は、所与の実験条件に対して事前に決定され、一定である（すなわち、標的配列又は濃度によって影響されない）ため、温度勾配全体を通した傾斜を必要としない。各ＬＯＣＳ構造は、その特定のＴｍでの単一の蛍光測定のみを必要とし、完全な温度勾配を実行する必要性がないため、より高速な結果が得られるまでの時間を促進するため、上記の制限を克服する。
更に、融解曲線分析は、典型的には結果の解釈のために熟練した担当者による解釈又は専用ソフトウェアの使用を必要とする。
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲの完了後の個別温度の蛍光測定の使用は、融解曲線の主観的な解釈の必要性を排除し、標的の存在又は不在の客観的な決定を促進することができる。
本発明の他の実施形態では、分析は、ＰＣＲ内の限定された数の時点、例えば、ＰＣＲ前及びＰＣＲ後の蛍光取得のみを必要としてもよく、これは、各サイクルでの取得の必要性を排除する。したがって、これらの実施形態は、結果が得られるまでの時間を低減することができる非常に迅速なサイクリングプロトコルに非常に適している。
完全に一致したプローブと不一致のプローブとの区別を促進するための２つの温度取得を含む、ＰＣＲ中の複数の温度での蛍光取得を伴ういくつかの方法が、説明されている。追加的に、２つの標的が存在し、単一のチャネルから検出される場合、いくつかのプロトコルは、各ＰＣＲサイクル後に複数の取得温度を使用して、各標的の濃度を定量化する。２つの標的を同時に定量化する他の方法は、各ＰＣＲサイクルの終了時に完全な融解曲線を実行することによって達成される。
本発明は、ＬＯＣＳを他の種類のレポーター分子と組み合わせる利点を利用する。ＬＯＣＳ構造は、リアルタイム及び終点ＰＣＲの分析の既存の方法のほとんど及び潜在的には全てと互換性があり得る。単一の反応で複数の標的を識別するためにＬＯＣＳプローブのみを使用する分析を行うことが可能であるが、単一の反応で複数の種類のプローブを使用することが有利であり得る。例として、単一のＬＯＣＳプローブは、以下の技術のうちのいずれかと組み合わせて使用することができる：直鎖ＭＮＡザイム基質、直鎖ＴａｑＭａｎプローブ、制限酵素で切断可能なプローブ、エクリプスプローブ、切断不可能な分子ビーコンプローブ、切断不可能なスロッピービーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、二重ハイブリダイゼーションプローブ対、又はキャッチャー及びピッチャー技術を利用するプローブ（例えば、ＴＯＣＥプローブ）。
本発明の様々な実施形態では、単一のＬＯＣＳプローブ及び直鎖ＭＮＡザイム基質、直鎖ＴａｑＭａｎプローブ、又は切断不可能な分子ビーコンプローブは、同じ又は類似の検出部分で標識され得る。非限定的な例として、これには、蛍光検出のための同じフルオロフォア、比色検出若しくはＳＰＲ検出のための同じサイズ及び／若しくは種類のナノ粒子（例えば、金若しくは銀）、化学発光検出のための反応性部分（例えば、アルカリホスファターゼ若しくはペルオキシダーゼ酵素）、又は電気化学的検出のための電気活性種（例えば、フェロセン、メチレンブルー若しくはペルオキシダーゼ酵素）が含まれ得る。
ある特定の実施形態では、第１の標的特異的ＭＮＡザイムによって切断され得る直鎖ＭＮＡザイム基質は、第２の標的特異的ＭＮＡザイムによって切断され得る単一のＬＯＣＳプローブと組み合わせることができる。１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブが、２つの標的を、又は例えば可視スペクトルの１つの波長で検出するために使用される実施形態は、直鎖プローブの製造が、ＬＯＣＳプローブの製造よりも単純であり、かつ低コストであるため、２つのＬＯＣＳプローブを使用する実施形態よりも有利であり得る。これは、直鎖基質が、ＬＯＣＳプローブステム領域に必要な追加の配列を必要とせず、したがって、より短いためである。同様に、直鎖ＴａｑＭａｎプローブの製造は、ＬＯＣＳプローブよりも安価であり得る。
他の種類の標準レポーターと組み合わせた単一の、又は複数のＬＯＣＳのいずれかの使用に関する追加の利点は、直鎖プローブのバックグラウンド蛍光の固有の差に関する。ここで、時間的／空間的パラメータは、フルオロフォアとクエンチャーとの間のより大きな距離をもたらし、したがって、フルオロフォア及びクエンチャーがステム部分によって近接して保持されるＬＯＣＳプローブと比較して、より高いバックグラウンド蛍光をもたらす。更に、異なる種類のプローブが、異なる機構を使用してシグナルを生成し、異なる温度で異なる蛍光及びクエンチ特性を示す。以下に例示される様々な実施形態では、蛍光及びクエンチ能力のこの差は、調査者が特定の温度で検出シグナルの大きさを操作して、単一波長で複数の標的を検出、識別及び／又は定量化することができる追加のツールを提供
する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＯＣＳプローブ及びキャッチャー－ピッチャープローブが、異なる温度で対向する蛍光／クエンチ特性を有するという事実を利用する。例えば、標的の存在又は不在にかかわらず、キャッチャー－ピッチャープローブは、二重構造の変性及びキャッチャー鎖の立体構造の変化により、高温（すなわち、キャッチャー－ピッチャー二重構造のＴｍ超）でクエンチされたままである。逆に、ハイブリダイズされたステムは、フルオロフォア及びクエンチャーを近接して保持するため、標的の存在又は不在にかかわらず、ＬＯＣＳプローブは、低温（すなわち、分割ＬＯＣＳステムのＴｍ未満）でクエンチされたままである。更に、標的の存在下では、キャッチャー－ピッチャープローブは、低温（すなわち、キャッチャー－ピッチャー二重構造のＴｍ未満）での蛍光の増加を生成するが、ＬＯＣＳプローブは、高温（すなわち、分割ＬＯＣＳステムのＴｍ超）での蛍光の増加を生成する。高温及び低温でのこれらの対向する蛍光／クエンチ特性は、２つの標的の特異的な検出を可能にし、キャッチャー－ピッチャープローブを使用して第１の低温で１つの標的を検出することができ、ＬＯＣＳプローブを使用して第２のより高い温度で別の標的を検出することができる。
本発明の様々な実施形態では、１つの直鎖基質又はプローブ、例えば、直鎖ＭＮＡザイム基質又はＴａｑＭａｎプローブをＬＯＣＳプローブと組み合わせる利点が利用される。例えば、１つの低いＴｍステム及び１つの高いＴｍステムを有する一対のＬＯＣＳプローブを使用することと比較して、利点は、切断された直鎖ＭＮＡザイム基質、及び分解されたＴａｑＭａｎプローブの両方が、広範囲の温度にわたって同様の蛍光シグナルを生成することである。同様に、未切断直鎖ＭＮＡザイム基質、及び無傷ＴａｑＭａｎプローブは、広範囲の温度にわたって同様の蛍光シグナルを生成する。したがって、両方のプローブの種類について、シグナル対雑音比は、広範囲の検出温度にわたって一定である。比較すると、分割低Ｔｍ ＬＯＣＳプローブから生じる観察されたシグナル対ノイズ比は、無傷のＬＯＣＳステムの変性によって生成されるより大きなバックグラウンド蛍光に起因して、より高い検出温度で減少し得る。これは、より制限された検出温度範囲を有する低Ｔｍ ＬＯＣＳと比較して、直鎖ＭＮＡザイム基質、又はＴａｑＭａｎプローブの切断を、より広い検出温度範囲にわたって検出することができることを意味する。これは、熱循環におけるより高い柔軟性を可能にし、より迅速かつ簡略化されたマルチプレックスアッセイの開発に有用であり得る。更なる利点は、ＴａｑＭａｎプローブ等の他の技術を使用して、１つ以上のＬＯＣＳプローブを既存の市販キットと組み合わせ、したがってそれらの多重化能力を拡大する能力に由来する。
他の実施形態では、本発明は、ＬＯＣＳプローブとＳｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はバイプローブも異なる温度で異なる挙動を示し、２つの異なる検出温度で２つの標的の特異的検出を可能にするという事実によってもたらされる利点を利用する。例えば、高検出温度では、ステムが開いていて蛍光性であり、ループが特定の標的（標的１）のアンプリコンに結合することができない場合、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブは、いずれかの標的の存在又は不在にかかわらず、常に蛍光性であり得る（ＰＣＲ前及びＰＣＲ後）。同様に、高い検出温度では、相補的なクエンチャー配列がプローブに結合することができず、プローブが特定の標的（標的１）のアンプリコンに結合することができない可能性があるため、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブは、いずれかの標的の存在又は不在にかかわらず、常に蛍光性であり得る（ＰＣＲ前及びＰＣＲ後）。両方の場合（ユニプローブ又はバイプローブ）において、同じ高温では、ＬＯＣＳプローブは、ステムの切断及び解離により、特定の標的（標的２）の存在下でのみ蛍光を生成する。逆に、低い検出温度では、両方の無傷ＬＯＣＳ及び分割ＬＯＣＳのステムのＴｍがこの温度より高いため、ＬＯＣＳプローブは、いずれかの標的の存在又は不在にかかわらず、常にクエンチされる（ＰＣＲ前及びＰＣＲ後）が、一方、この同じ温度において、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はバイプローブは、それぞれ、ループ又はプローブ領域の標的１アンプリコンへのハイブリダイゼーションにより、特定の標的の存在下でのみ蛍光を生成する。これらの高温及び低温での対向する蛍光／クエンチ特性は、２つの標的の特異的な検出を可能にし、標的１は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブのいずれかを使用して第１の低温で検出することができ、標的２は、ＬＯＣＳプローブを使用して第２のより高い温度で検出することができる。
様々な種類の標準レポーター基質及びプローブは、広範囲の温度にわたって、又は限られた範囲にわたってのみ蛍光を発する。例えば、直鎖ＭＮＡザイム基質、エクリプスプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、加水分解プローブ、及びその他を含むがこれらに限定されない、直鎖レポーター基質又はプローブは、一般に、広範囲の温度にわたって蛍光シグナルを生成する。そのようなプローブは、標的が存在する場合、一般的に、ＰＣＲ前にクエンチされ、ＰＣＲ後に蛍光を発し、この蛍光は、広範囲の温度で測定され得る。対照的に、ＬＯＣＳプローブ、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はバイプローブ、並びにピッチャー及びキャッチャー蛍光システム（例えば、ＴＯＣＥプローブ）は、それらが定義された温度範囲内で蛍光であるか、又はクエンチされるように操作され得る。
分子ビーコンは、分子ビーコンループが標的に結合し、蛍光を発する温度を下回る温度でハイブリダイズした茎ステムでクエンチされる。対照的に、無傷ＬＯＣＳプローブのステムは、分割ＬＯＣＳが融解する温度よりも高い温度でハイブリダイズされる。更に、多くのレポーターシステムは、標的の存在下での蛍光の増加を測定するが、デュアルハイブリダイゼーションプローブ等の他の技術は、標的が存在するときの蛍光の減少をもたらす。本発明は、特定のプローブの組み合わせを用いて特定の温度で検出可能なシグナルを増加又は減少させることが、改善された多重化シナリオを可能にするように、プローブを組み合わせ、パラメータを設定するための新しい方法を提供する。したがって、異なる種類の標準レポーター基質及びプローブの異なる挙動の利用は、同じ又は類似の検出部分で標識され、単一の反応内に存在するＬＯＣＳプローブと組み合わせた場合、複数の温度で、例えば蛍光又はクエンチ等のシグナルの存在又は不在の操作を可能にし、これは次いで、標的の分析のための多数の利点を提供する。
本発明は、少なくとも部分的には、以下の実施形態１～１９４に関連する。
実施形態１．試料中の第１及び第２の標的の存在又は不在を決定するための方法であって、
（ａ）第１及び第２の標的を含むと推定される試料又はその誘導体を、
－第１の標的の検出のための第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の検出可能なシグナルを生成することができる第１の検出部分を含む第１のオリゴヌクレオチド、
－第２の標的の検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、ステム部分は、第２の検出可能なシグナルを生成することができる第２の検出部分を含み、
第１及び第２の検出部分は、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない検出可能なシグナルを生成することができる、無傷ステムループオリゴヌクレオチド、並びに
－第２の標的が試料中に存在する場合にのみ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化することができる第１の酵素と接触させることにより、反応用の混合物を調製することと、
（ｂ）混合物を、
－第１の標的が、第１のオリゴヌクレオチドへの修飾を誘導し、それにより第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にするのに好適であり、
－第２の標的が試料中に存在する場合にのみ、第１の酵素により無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供するのに好適である条件下で処理することと、
（ｃ）
－混合物中、又は対照混合物中の第１及び第２の検出部分によって提供されるバックグラウンドシグナルを測定することと、
（ｄ）当該処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
－バックグラウンドシグナルとは異なり、試料中の第１の標的の存在を示す当該修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、第１の温度で生成されるかどうか、
－バックグラウンドシグナルとは異なり、試料中の第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、第２の温度で生成されるかどうかを決定することと、を含み、
－第１の温度において、第２の検出可能なシグナルがバックグラウンドシグナルと異ならず、
第２の温度において、
存在する場合、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が部分的又は完全に解離され、第２の検出部分が第２の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
存在する場合、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖は解離することができず、それにより第２の検出可能な部分が第２の検出可能なシグナルを提供することを防止する、方法。
実施形態２．パート（ｄ）における当該決定が、
－当該修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが第１の温度で任意の当該バックグラウンドシグナルと異なるかどうかを決定するために所定の閾値を使用すること、及び／又は
－第２の検出可能なシグナルが第２の温度で任意の当該バックグラウンドシグナルと異なるかどうかを決定するために所定の閾値を使用することを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３．対照混合物が、
－第１の標的、又は
－第２の標的、又は
－第１及び第２の標的
を含まないが、それ以外は混合物と同等である、実施形態１又は２に記載の方法。
実施形態４．対照混合物が、所定量の
－第１の標的、又は
－第２の標的、又は
－第１及び第２の標的
を含むが、それ以外は混合物と同等である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５．
－第１のオリゴヌクレオチドへの修飾は、第１の検出部分が、第１の温度以下で第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
－第１の検出可能なシグナルの生成は、可逆的である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６．
－パート（ｃ）が、
第１の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃以内の第１のバックグラウンドシグナル、及び第２の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、又は５℃以内の第２のバックグラウンドシグナルを測定することを含み、
これらは混合物中、又は対照混合物中の第１及び第２の検出部分によって提供され、
－パート（ｄ）が、当該処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
第１のバックグラウンドシグナルとは異なり、試料中の第１の標的の存在を示す、当該修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、第１の温度で生成されるかどうか、
第２のバックグラウンドシグナルとは異なり、試料中の第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、第２の温度で生成されるかどうかを決定することを含む、実施形態５に記載の方法。
実施形態７．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１のオリゴヌクレオチドが、対向鎖上のハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その全て又は一部が第１の標的に相補的であるハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結されたステムループオリゴヌクレオチドであり、
－第１のオリゴヌクレオチドの修飾は、相補塩基対合による、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への標的のハイブリダイゼーションから生じる立体構造の変化である、実施形態５又は６に記載の方法。
実施形態８．
－立体構造の変化は、相補塩基対合による、第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への標的の当該ハイブリダイゼーションから生じる、第１のオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖の解離である、実施形態７に記載の方法。
実施形態９．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、標的の第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への当該ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－当該二本鎖の二重構造は、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、当該二本鎖の二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、当該二本鎖の二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態７又は実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、標的の第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への当該ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満であり、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－当該二本鎖の二重構造が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ
超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、当該二本鎖の二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ当該二本鎖の二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態７又は実施形態８に記載の方法。
実施形態１１．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、標的の第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への当該ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－当該二本鎖の二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、当該二本鎖の二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、当該二本鎖の二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態７又は実施形態８に記載の方法。
実施形態１２．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、標的の第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分への当該ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－当該二本鎖の二重構造は、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分及び当該二本鎖の二重構造のＴｍ未満、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第２の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、当該二本鎖の二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度超である、実施形態７又は実施形態８に記載の方法。
実施形態１３．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、当該二本鎖の二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若
しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び／若しくは当該二本鎖の二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、実施形態７～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１のオリゴヌクレオチドが、
ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分であって、その対向鎖が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分によって連結され、その全て又は一部が、第１の標的に相補的である、二本鎖ステム部分、及び当該対向鎖のうちの１つから３’方向に延び、第１の標的の一部に相補的な配列で終端する第２の一本鎖部分と、
第１の標的の一部に相補的な、当該配列の前にあるブロッカー分子とを含む、ステムループオリゴヌクレオチドであり、
－混合物が、ポリメラーゼを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、第２の一本鎖部分を第１の標的にハイブリダイズすることと、
ポリメラーゼ及び第１の標的を鋳型配列として使用して第２の一本鎖部分を伸長して、二本鎖核酸を提供することであって、当該ブロッカー分子は、ポリメラーゼが第１のオリゴヌクレオチドのステム部分を鋳型として使用して第１の標的を伸長することを防止する、提供することと、
二本鎖核酸を変性させ、ポリメラーゼによって伸長された第２の一本鎖部分を、相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの当該修飾を提供することと、を含む、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態１５．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、シグナル伝達二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつシグナル伝達二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１７．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、シグナル伝達二重構造、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１８．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分及びシグナル伝達二重構造のＴｍ未満、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第２の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、シグナル伝達二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
第１の温度が、第２の温度超である、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１９．
－第１のオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、シグナル伝達二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、第１のオリゴヌクレオチドのステム部分、及び／若しくはシグナル伝達二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、修飾が、クエンチャー分子からのその距離を増加させる、実施形態５～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１．
－第１のオリゴヌクレオチドが、クエンチャー分子を含む、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．
－フルオロフォア及びクエンチャー分子が、第１のオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の対向鎖上に位置する、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１のオリゴヌクレオチドが、
ハイブリダイズしたヌクレオチドの第１の二本鎖部分を含み、その第１の鎖は、第１の標的の一部にハイブリダイズすることができる相補配列で終端する一本鎖部分に延び、第１の鎖は、当該相補配列の前にブロッカー分子を含み、
－混合物が、ポリメラーゼを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、一本鎖部分の当該相補配列を第１の標的の一部にハイブリダイズすることと、
ポリメラーゼ及び第１の標的を鋳型配列として使用して相補配列を伸長して、第２の二本鎖部分を提供することであって、当該ブロッカー分子は、ポリメラーゼが当該第１の二本鎖部分の第１の鎖を鋳型として使用して第１の標的を伸長することを防止する、提供することと、
第１及び第２の二本鎖部分を変性させることと、
ポリメラーゼによって第１の二本鎖部分の第１の鎖に伸長された相補配列を、相補塩基対合によってハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの当該修飾を提供することとを含む、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態２４．
－第１の二本鎖部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１の二本鎖部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、シグナル伝達二重構造、第１の二本鎖部分、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５．
－第１の二本鎖部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１の二本鎖部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、第１の二本鎖部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつシグナル伝達二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２６．
－第１の二本鎖部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、シグナル伝達二重構造、第１の二本鎖部分、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、シグナル伝達二重構造、第１の二本鎖部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２７．
－第１の二本鎖部分が、シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－シグナル伝達二重構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ記分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、第１の二本鎖部分及びシグナル伝達二重構造のＴｍ未満、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第２の温度が、第１の二本鎖部分、シグナル伝達二重構造、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度超である、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２８．
－第１の二本鎖部分のＴｍが、シグナル伝達二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、第１の二本鎖部分、及び／若しくはシグナル伝達二重構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、修飾が、クエンチャー分子からのその距離を増加させる、実施形態２３～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０．
－第１のオリゴヌクレオチドが、クエンチャー分子を含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１．
－フルオロフォア及びクエンチャー分子が、第１の二本鎖部分の対向鎖上に位置する、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２．
－第１の標的が核酸配列であり、
－混合物が、
第１の標的における第１の配列に相補的な第１のプライマーと、
第１の配列とは異なる、第１の標的における第２の配列に相補的な成分、及び第１の標的に相補的ではないタグ部分を含む、第２のオリゴヌクレオチドと、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１のポリメラーゼと、
任意選択で第２のポリメラーゼとを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
第１のプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドを第１の標的にハイブリダイズするのに好適な条件と、
第１のポリメラーゼ及び標的を鋳型として使用して第１のプライマーを伸長し、それによりタグ部分を切断することと、
相補塩基対合によって、切断されたタグ部分を第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることと、
第１又は第２のポリメラーゼ及び第１のオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して
タグ部分を伸長し、第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を生成し、それにより当該修飾を第１のオリゴヌクレオチドに提供し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることとを含む、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態３３．
－二本鎖配列が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、二本鎖配列、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、二本鎖配列、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３４．
－二本鎖配列が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、二本鎖配列、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ二本鎖配列、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３５．
－二本鎖配列が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、二本鎖配列、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、二本鎖配列、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３６．
－二本鎖配列が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、二本鎖配列のＴｍ未満、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第２の温度が、二本鎖配列、及び無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度超である、実施形態３２に記載の方法。
実施形態３７．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、二本鎖配列のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、実施形態３２～３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８．
－第１のオリゴヌクレオチドが、フルオロフォア及びクエンチャー分子を含み、
－当該タグ部分を伸長することが、フルオロフォアとクエンチャー分子との間の距離を増加させる、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１のオリゴヌクレオチドが、標的の第１の部分に相補的であり、
－混合物が、第１の標的の第２の部分に相補的な更なるオリゴヌクレオチドを更に含み、第１の標的の第１及び第２の部分は、互いに隣接するが重複せず、
－当該混合物を処理することが、
（ｉ）相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズすることによる第１の二本鎖成分、及び
（ｉｉ）相補塩基対合によって更なるオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズすることによる第２の二本鎖成分を含む二重構造構造を形成し、
それにより、第１及び更なるオリゴヌクレオチドを近接させ、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの当該修飾を提供することを含む、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態４０．
－二重構造構造が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
－第１の温度が、二重構造構造、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、二重構造構造、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第１の温度が、第２の温度未満である、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、二重構造構造のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃
～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、実施形態４０の実施形態３９に記載の方法。
実施形態４２．
－第１の検出可能な部分がフルオロフォアであり、更なるオリゴヌクレオチドがクエンチャーを含み、
－当該二重構造構造を形成することが、更にフルオロフォア及びクエンチャーを近接させ、
－当該検出可能なシグナルが、第１の検出部分によって提供される蛍光の減少である、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－当該混合物を処理することが、
第１の標的を第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、第１の検出部分が試料中の第１の標的の存在を示す第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの修飾を誘導することを含み、
第１の検出可能なシグナルは、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後に第１の検出部分から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態４４．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－当該混合物を処理することが、
第１の標的を第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、第１の検出部分が試料中の第１の標的の存在を示す第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの修飾を誘導又は促進することを含み、
第１の検出可能なシグナルは、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後の第１の検出部分から生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態５又は実施形態６に記載の方法。
実施形態４５．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態４４に記載の方法。
実施形態４６．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第１の検出可能なシグナルが、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後に第１の検出部分から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態５～１９、２３～２８、３２～３７、及び３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第１の検出可能なシグナルが、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後の第１の検出部分から生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態５～１９、２３～２８、３２～３７、及び３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９．
－第２の検出部分が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第２の検出可能なシグナルが、解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態４３～４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０．
－第２の検出部分が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第２の検出可能なシグナルが、解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖から生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態４３～４８のいずれか１ついずれか１つに記載の方法。
実施形態５１．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２．
－第２の検出部分がフルオロフォアであり、
－解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖によって提供される第２の検出可能なシグナルが、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態２０～２２、２９～３１、３８及び４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３．
－フルオロフォア及びクエンチャー分子が、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の対向鎖上に位置する、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．
－第１の検出可能なシグナルの生成は、可逆的ではなく、
－第１のオリゴヌクレオチドへの修飾は、第１の検出部分が、第１の温度以下で第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
－第１の温度以下で提供される第１の検出可能なシグナルは、第２の温度で検出可能なままである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．
－パート（ｃ）が、
（ｉ）第１の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、若しくは５℃以内の第１のバックグラウンドシグナル、及び第２の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、若しくは５℃以内の第２のバックグラウンドシグナル、かつ／又は
（ｉｉ）第３の温度での第３のバックグラウンドシグナル
を測定することを含み、これらは混合物中、又は対照混合物中の第１及び第２の検出部分によって提供され、
－パート（ｄ）が、当該処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
（ｉ）第１又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なる、当該修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、第１の温度で生成されるかどうかを決定することであって、
第１の温度において、第２の検出可能なシグナルが第１又は第３のバックグラウンドシグナルと異ならず、
第１の検出可能なシグナルと第１又は第３のバックグラウンドシグナルとの間の差の検出が、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾及び試料中の第１の標的の存在を示す、決定することと、
（ｉｉ）第２又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なり、試料中の第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、第２の温度で生成されるかどうかを決定することとを含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６．
－第１の標的が試料中に存在する場合、当該第２の検出可能なシグナルが第２の温度で生成されるかどうかを決定することが、第２の検出可能なシグナルを測定する際に存在する第１の検出可能なシグナルを補償することを含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．
－第１のバックグラウンドシグナルとは異なる第１のシグナルが生成され、
－第２のバックグラウンドシグナルとは異なる第２のシグナルが生成され、
－第１の検出可能なシグナルが第１のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、第２の検出可能なシグナルが第２のバックグラウンドシグナルと異なり、
それにより第２の標的が試料中に存在することを示す、実施形態５５又は実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８．
－第１の温度が、第２の温度、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のＴｍ、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満である、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９．
－第１の温度が、第２の温度、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ、及び分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも高い、実施形態５７に記載の方法。
実施形態６０．
－第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第１のシグナルが生成され、
－第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第２のシグナルが生成され、
－第１のシグナルが第３のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、第２のシグナルが第３のバックグラウンドシグナルと異なり、
それにより第２の標的が試料中に存在することを示す、実施形態５５に記載の方法。
実施形態６１．
－第２の温度が、第１の温度よりも高く、
－第３の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分のＴｍよりも低く、
－第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第１の検出可能なシグナルが生成され、
－第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第２の検出可能なシグナルが生成され、
－第１のシグナルが第３のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、第２の検出可能なシグナルが第３のバックグラウンドシグナルと異なり、
それにより第２の標的が試料中に存在することを示す、実施形態５５に記載の方法。
実施形態６２．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度未満、かつ分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満であり、
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満である、実施形態５５～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、第２の温度よりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第１の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．
－当該第３のバックグラウンドシグナルを測定することを含み、第３の温度が第２の温度未満である、実施形態６２又は実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．
－第３の温度が、第２の温度よりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、又は１０℃超だけ低い、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリ
ゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第１の温度が、第２の温度超、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超であり、
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ超、かつ無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍ未満である、実施形態５５～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍが、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、第２の温度よりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第１の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第２の温度が、分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ高い、かつ／又は
－第２の温度が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分のＴｍよりも１℃～１０℃、１℃～５℃、５℃～１０℃、若しくは１０℃超だけ低い、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．
－第１のオリゴヌクレオチドが、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の基質であり、
－混合物が、
第１の標的が試料中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドを切断することができるＭＮＡザイムを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
ＭＮＡザイムを第１の標的に結合させ、ＭＮＡザイムの基質アームを、第１のオリゴヌクレオチドの切断を促進する相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより当該修飾を第１のオリゴヌクレオチドに提供し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることを更に含む、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９．
－第１の標的が核酸配列であり、
－当該反応混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、第１の標的をＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それによりＭＮＡザイムの集合を促進することを更に含む、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．
－第１のオリゴヌクレオチドがアプタザイムの基質であり、
－第１の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－混合物が、第１の標的に結合することができるアプタマーを含むアプタザイムを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
アプタザイムを第１の標的及び第１のオリゴヌクレオチドに結合させて、第１のオリゴヌクレオチドの切断を促進し、それにより当該修飾を第１のオリゴヌクレオチドに提
供し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にすることを更に含む、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１のオリゴヌクレオチドが、第１の標的に相補的である配列を含み、
－混合物が、
第１の標的の一部に相補的なプライマー、及び
エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、プライマーを第１の標的にハイブリダイズすることと、
相補塩基対合によって、第１のオリゴヌクレオチドを第１の標的にハイブリダイズすることと、
ポリメラーゼ及び第１の標的を鋳型配列として使用してプライマーを伸長し、それにより第１のオリゴヌクレオチドを消化し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの当該修飾を提供することと、を含む、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２．
－第１の標的が核酸配列であり、
－混合物が、
第１の標的を含む二本鎖の二重構造を消化することができる制限エンドヌクレアーゼを更に含み、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、第１のオリゴヌクレオチドを第１の標的にハイブリダイズし、それにより二本鎖の二重構造を形成することと、
制限エンドヌクレアーゼを使用して二重構造を消化し、それにより当該修飾を第１のオリゴヌクレオチドに提供し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることと、を含む、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３．
－制限エンドヌクレアーゼが、当該二本鎖の二重構造の鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼであり、当該鎖は、第１のオリゴヌクレオチドの全て又は一部を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４．
－混合物が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムを更に含み、
－当該混合物の処理が、
補因子をＤＮＡザイム又はリボザイムに結合させて触媒活性化すること、
相補塩基対合によって、ＤＮＡザイム又はリボザイムを第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすること、及び
ＤＮＡザイム又はリボザイムを触媒活性化し、それにより第１のオリゴヌクレオチドを消化し、それにより第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、第１のオリゴヌクレオチドへの当該修飾を提供すること
のために好適な条件を使用することを含み、
第１の標的が補因子である、実施形態５４～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５．補因子が、金属イオン、又はＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋から選択される金属イオンである、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、第１のオリゴヌクレオチドへの修飾が、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態５４～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７．
－第１のオリゴヌクレオチドが、クエンチャー分子を含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．
－第２の検出部分がフルオロフォアであり、
－解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖によって提供される第２の検出可能なシグナルが、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態７６又は実施形態７７に記載の方法。
実施形態７９．
－フルオロフォア及びクエンチャー分子が、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の対向鎖上に位置する、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第１の検出可能なシグナルが、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後に第１の検出部分から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態５４又は実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第１の検出可能なシグナルが、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後の第１の検出部分から生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態５４～７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３．
－第２の検出部分が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第２の検出可能なシグナルが、解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態８０～８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４．
－第２の検出部分が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第２の検出可能なシグナルが、解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該鎖から生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態８０～８２のいずれか１ついずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６．無傷ステムループオリゴヌクレオチドが、第１の酵素による無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドの当該消化中に、第２の標的にハイブリダイズしていない、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７．
－第１の酵素が第１のＭＮＡザイムであり、
－当該混合物を処理することが、
第１のＭＮＡザイムを第２の標的に結合させ、当該第１のＭＮＡザイムの基質アームを無傷ステムループオリゴヌクレオチドのループ部分にハイブリダイズして、それにより、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化し、分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供することを含む、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８．
－第２の標的が核酸配列であり、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって、第２の標的を第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズして、それにより第１のＭＮＡザイムの集合を促進することを更に含む、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－第１の酵素が、第２の標的に結合することができるアプタマーを含むアプタザイムであり、
－アプタマーへの第２の標的の結合が、第１の酵素を触媒活性化することができる、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０．
－第１の酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つである、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－第１のオリゴヌクレオチドがアプタザイムの基質であり、
－第１の酵素が、第２の標的に結合することができるアプタマー部分と、無傷ステムル
ープオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化することができる核酸酵素部分とを含むアプタザイムであり、
－当該混合物を処理することが、
第２の標的をアプタザイムのアプタマー部分に結合させ、核酸酵素部分の触媒活性の活性化を促進し、無傷ステムループオリゴヌクレオチドを活性核酸酵素部分にハイブリダイズして、それにより、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化することを更に含む、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９２．
－第２の標的が核酸配列であり、
－第１の酵素が第１の制限エンドヌクレアーゼであり、当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって第２の標的を無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、第１の制限エンドヌクレアーゼが一本鎖ループ部分の１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドに会合し、それを消化するための二本鎖配列を形成して、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含む、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９３．
－第１の制限エンドヌクレアーゼが、第１の制限エンドヌクレアーゼの当該二本鎖配列の鎖と会合し、それを切断することができる第１のニッキングエンドヌクレアーゼであり、当該鎖は、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の全て又は一部を含む、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４．
－第１の酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含み、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって第２の標的を無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、
第１のプライマーオリゴヌクレオチドを第２の標的にハイブリダイズして、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列に対して上流に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、第２の標的を鋳型配列として使用してプライマーを伸長させるのに好適な条件を使用することを含み、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１のポリメラーゼは、第１の二本鎖配列の一本鎖ループ部分を消化し、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成する、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５．
－第１の酵素がエキソヌクレアーゼであり、
－当該混合物を処理することが、
相補塩基対合によって第２の標的を無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を、第２の標的を含む二本鎖配列と会合させ、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素を触媒活性化し、第２の標的を含む第１の二本鎖配列の一本鎖ループ部分を消化させ、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含む、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９６．
－第１の酵素が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムであり、当該混合物を処理することが、
－補因子を第１の酵素に結合させて触媒活性化し、
－相補塩基対合によって、ＤＮＡザイム又はリボザイムを無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
－ＤＮＡザイム又はリボザイムを触媒活性化し、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化し、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含み、
第２の標的が補因子である、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７．補因子が、金属イオン、又はＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋から選択される金属イオンである、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９８．
－第１の標的が第２の標的とは異なり、かつ／又は
－第１のオリゴヌクレオチドが、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分内にない配列を含むか、若しくはそれからなる、実施形態１～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．
－第１の酵素が第２の標的を消化しない、実施形態１～９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００．
－当該酵素のいずれも、第１の標的及び／又は第２の標的を消化しない、実施形態１～７１、７４～９１、又は９４～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．
－第１の温度が、第２の温度と１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、又は６０℃超だけ異なる、実施形態１～１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２．当該決定することが、
－当該処理中の１つ以上の時点、又は
－当該処理中の１つ以上の時点及び当該処理後の１つ以上の時点での、第１の検出可能なシグナル及び／又は任意の当該バックグラウンドシグナルの検出を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０３．当該決定することが、
－当該処理後の１つ以上の時点での、第１の検出可能なシグナル及び／又は任意の当該バックグラウンドシグナルの検出を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４．当該決定することが、
－当該処理中の１つ以上の時点、又は
－当該処理中の１つ以上の時点及び当該処理後の１つ以上の時点での、第２の検出可能なシグナル及び／又は任意の当該バックグラウンドシグナルの検出を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０５．当該決定することが、
－当該処理後の１つ以上の時点での、第２の検出可能なシグナル及び／又は任意の当該バックグラウンドシグナルの検出を含む、実施形態１～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０６．
－当該第１及び第２の標的の存在又は不在を決定することが、融解曲線分析を含む、実施形態１～１０５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０７．
－当該第１及び第２の標的の存在又は不在を決定することが、第１及び第２の検出可能なシグナル並びに任意選択で第１及び第２のバックグラウンドシグナルを含む融解曲線分析を含む、実施形態６に記載の方法。
実施形態１０８．
－当該第１及び第２の標的の存在又は不在を決定することが、第１及び第２の検出可能なシグナル並びに任意選択で第１及び第２のバックグラウンドシグナル、又は、
－第１及び第２の検出可能なシグナル並びに任意選択で第３のバックグラウンドシグナルを含む融解曲線分析を含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態１０９．
－第１の標的及び／又は第２の標的が、核酸のアンプリコンである、実施形態１～１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０．
－第１の標的が核酸であり、かつ／又は第２の標的が核酸であり、
－混合物が、当該第１及び／又は第２の標的を増幅するための試薬を更に含み、
－当該混合物を処理することが、第１及び／又は第２の標的の増幅を行うのに好適な条件を更に含む、実施形態１～１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．
－増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）若しくは分岐増幅方法（ＲＡＭ）、及び／又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）のうちのいずれか１つ以上である、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２．当該決定することが、
－当該増幅の前に、又は当該増幅の開始の１、２、３、４、若しくは５サイクル以内に生じる、かつ／又は
－当該増幅の完了後に行われる、実施形態１１０又は実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１３．当該決定することが、
－当該増幅の前に、又は当該増幅の開始から１、２、３、４、若しくは５分以内に生じる、かつ／又は
－当該増幅の完了後に行われる、実施形態１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．当該決定することが、
－当該増幅の前の第１の時点で、かつ
－当該増幅の完了後の第２の時点で行われる、実施形態１１０～１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．
－増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、
－当該決定することが、複数のサイクルで、任意選択で各サイクルで行われる、実施形態１１０～１１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１６．
－当該増幅の前及び／若しくは反応物の当該処理の前に第１の温度で生成された陽性対照シグナルを使用して、当該増幅の間若しくはその後の時点で測定された第１の温度での第１の検出可能なシグナルを正規化すること、並びに／又は
－当該増幅の前及び／若しくは反応物の当該処理の前に第２の温度で生成された陽性対照シグナルを使用して、当該増幅の間若しくはその後の時点で測定された第２の温度での第２の検出可能なシグナルを正規化することを更に含む、実施形態１１０又は実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１７．
－当該増幅の前及び／若しくは反応物の当該処理の前に第１の温度で無傷ステムループオリゴヌクレオチドによって生成された検出可能なシグナルを使用して、第１の検出可能なシグナルを正規化すること、並びに／又は
－当該増幅の前及び／若しくは反応物の当該処理の前に追加の温度で無傷ステムループオリゴヌクレオチドによって生成された検出可能なシグナルを使用して、第２の検出可能なシグナルを正規化することを更に含み、
追加の温度は、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのＴｍ超である、実施形態１１０又は実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１８．
－既知の濃度の第１の標的及び／又は既知の濃度の当該修飾後の第１のオリゴヌクレオチドを使用して、第１の標的陽性対照シグナルを生成することを更に含む、実施形態１～１１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．
－当該第１の標的を含む別個の対照試料に対して方法を反復することによって、第１の標的陽性対照シグナルを生成することを更に含む、実施形態１～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０．
－第１の標的を含む別個の対照試料が、既知の濃度の第１の標的を含む、実施形態１１９に記載の方法。
実施形態１２１．
－第１の標的を含む別個の対照試料が、第２の標的を更に含む、実施形態１１９又は実施形態１２０に記載の方法。
実施形態１２２．
－既知の濃度の第２の標的及び／又は既知の濃度の当該修飾後のステムループオリゴヌ
クレオチドを使用して、第２の標的陽性対照シグナルを生成することを更に含む、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３．
－第２の標的を含む別個の対照試料に対して当該方法を反復することによって、第２の標的陽性対照シグナルを生成することを更に含む、実施形態１～１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４．
－第２の標的を含む対照試料が、既知の濃度の第２の標的を含む、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５．
－第２の標的を含む当該対照試料が、当該第１の標的を更に含む、実施形態１２３又は実施形態１２４に記載の方法。
実施形態１２６．
－第１の標的及び第２の標的を含む別個の対照試料に対して当該方法を反復することによって、組み合わされた陽性対照シグナルを生成することを更に含む、実施形態１～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７．
－組み合わされた対照試料が、既知の濃度の第１の標的及び／又は既知の濃度の第２の標的を含む、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８．
－任意の当該陽性対照シグナルを使用して、第１の検出可能なシグナル及び／又は第２の検出可能なシグナルを正規化することを更に含む、実施形態１１６～１２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９．
（ｉ）当該第１の標的、又は
（ｉｉ）当該第２の標的、又は
（ｉｉｉ）当該第１の標的若しくは当該第２の標的を含有しない別個の陰性対照試料に対して、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の方法を反復することによって、陰性対照シグナルのレベルを評価することを更に含む、実施形態１１６～１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０．
－当該陰性対照シグナルを使用して、第１の検出可能なシグナル及び／又は第２の検出可能なシグナルを正規化することを更に含む、実施形態１２９に記載の方法。
実施形態１３１．
－任意の当該対照シグナルが、蛍光対照シグナルである、実施形態１１６～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２．第１及び／又は第２の検出可能なシグナルを閾値と比較することを更に含み、
－閾値は、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の方法に従って試験された一連の試料又はその誘導体に由来する検出可能なシグナルを使用して生成され、
（ｉ）鋳型なし対照及び第１の標的
（ｉｉ）鋳型なし対照及び第２の標的
（ｉｉｉ）鋳型なし対照、第１の標的、及び第２の標的
のうちのいずれか１つ以上を含み、それにより、試料中の第１及び第２の標的の当該存在又は不在を決定する、実施形態１～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３．
－一連の試料又はその誘導体が、既知の濃度の第１のオリゴヌクレオチド及び／又は既知の濃度の無傷ステムループオリゴヌクレオチドを使用して試験される、実施形態１３２に記載の方法。
実施形態１３４．
－試料が、対象から得られた生物学的試料である、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３５．
－方法が、インビトロで実行される、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６．
－方法が、エクスビボで実行される、実施形態１～１３３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７．
－第１及び第２の検出可能な部分が、可視スペクトルの同じ色領域で発光する、実施形態１～１３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８．
－第１の標的を検出するための第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の標的は核酸であり、第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、第１のオリゴヌクレオチドと、
－第１の検出部分であって、
第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドの修飾時に、第１の検出可能なシグナルを生成することができ、
修飾が、相補塩基対合による第１の標的の第１のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって誘導される、第１の検出部分と、
－第２の標的の検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、二本鎖ステム部分の少なくとも１つの鎖は、第２の検出部分を含む、無傷ステムループオリゴヌクレオチドと、
－第２の標的が試料中に存在する場合にのみ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供することができる、第１の酵素と
を含む組成物であって、
－第２の検出部分は、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の解離時に、第２の検出可能なシグナルを生成することができ、
－第１及び第２の検出部分は、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない検出可能なシグナルを生成することができる、組成物。
実施形態１３９．
－第１の標的に相補的である第１のオリゴヌクレオチドの領域が、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の各鎖に対して異なる融解温度（Ｔｍ）を有する、実施形態１３８に記載の組成物。
実施形態１４０．第１のオリゴヌクレオチドが、
無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の各鎖、及び
無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分とは配列が異なる、実施形態１３８又は実施形態１３９に記載の組成物。
実施形態１４１．
－第１のオリゴヌクレオチドが、対向鎖上のハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その全て又は一部が第１の標的に相補的であるハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結されたステムループオリゴヌクレオチドである、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４２．
－相補塩基対合によって、第１の標的が第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、第１のオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分における鎖の解離を引き起こし、それにより、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、実施形態１４１に記載の組成物。
実施形態１４３．
－第１のオリゴヌクレオチドが、
ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分であって、その対向鎖は、全て又は一部が第１の標的に相補的であるハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分によって連結された、二本鎖ステム部分と、
当該対向鎖のうちの１つから３’方向に延び、第１の標的の一部に相補的な配列で終端する第２の一本鎖部分と、
第１の標的の一部に相補的な、当該配列の前にあるブロッカー分子とを含むステムループオリゴヌクレオチドである、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４４．
－相補塩基対合によって、第１の標的がその第２の一本鎖部分にハイブリダイズされ、
組成物は、第１の標的を鋳型配列として使用して第２の一本鎖部分を伸長して、二本鎖核酸を提供することができるポリメラーゼを更に含み、当該ブロッカー分子は、ポリメラーゼが当該１つの対向鎖を鋳型として使用して第１の標的を伸長することを防止することができ、
二本鎖核酸を変性させると、ポリメラーゼによって伸長された第２の一本鎖部分は、相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、実施形態１４３に記載の組成物。
実施形態１４５．
－第１の検出部分がフルオロフォアである、実施形態１４１～１４４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４６．
－第１のオリゴヌクレオチドがクエンチャー分子を含み、フルオロフォア及びクエンチャー分子が、第１のオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の対向鎖上に位置する、実施形態１４５に記載の組成物。
実施形態１４７．
－第１のオリゴヌクレオチドが、
ハイブリダイズしたヌクレオチドの第１の二本鎖部分を含み、その第１の鎖は、第１の標的の一部にハイブリダイズすることができる相補配列で終端する一本鎖部分に延び、第１の鎖は、当該相補配列の前にブロッカー分子を含み、
－組成物がポリメラーゼを更に含む、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４８．
相補塩基対合によって、第１の標的の一部が一本鎖部分の当該相補配列にハイブリダイズされ、
組成物が、第１の標的を鋳型配列として使用して相補配列を伸長して、第２の二本鎖部分を提供することができるポリメラーゼを更に含み、当該ブロッカー分子は、ポリメラーゼが一本鎖部分を鋳型として使用して第１の標的を伸長することを防止し、
第１及び第２の二本鎖部分が変性すると、ポリメラーゼによって伸長された相補配列は、相補塩基対合によって第１の二本鎖部分の第１の鎖にハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることができる、実施形態１４７に記載の組成物。
実施形態１４９．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、修飾が、クエンチャー分子からのその距離を増加させる、実施形態１４７又は実施形態１４８に記載の組成物。
実施形態１５０．
－第１のオリゴヌクレオチドがクエンチャー分子を含み、フルオロフォア及びクエンチャー分子が、第１の二本鎖部分の対向鎖上に位置する、実施形態１４９に記載の組成物。
実施形態１５１．
－第１のオリゴヌクレオチドが、標的の第１の部分に相補的であり、
－組成物が、第１の標的の第２の部分に相補的な追加のオリゴヌクレオチドを更に含み、第１の標的の第１及び第２の部分は、互いに隣接するが重複せず、それぞれ、第１の標的にハイブリダイズして、
（ｉ）第１のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズすることによる、又は相補塩基対合による第１の二本鎖成分、及び
（ｉｉ）相補塩基対合によって追加のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズすることによる第２の二本鎖成分を含む二重構造構造を形成し、
それにより、第１及び追加のオリゴヌクレオチドを近接させ、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし得る、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５２．
－第１の検出可能な部分がフルオロフォアであり、追加のオリゴヌクレオチドがクエンチャーを含み、
－当該二重構造構造を形成することが、更にフルオロフォア及びクエンチャーを近接させ、
－当該検出可能なシグナルが、第１の検出部分によって提供される蛍光の減少である、
実施形態１５１に記載の組成物。
実施形態１５３．
－第１のオリゴヌクレオチドが、相補塩基対合によって第１の標的にハイブリダイズされ、
－組成物が、
相補塩基対合によって第１の標的の一部にハイブリダイズしたプライマー、及び
第１の標的を鋳型配列として使用してプライマーを伸長し、それにより第１のオリゴヌクレオチドを消化し、第１のオリゴヌクレオチドを修飾して第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし得る、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを更に含む、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４．
－第１の標的が、相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、それにより二本鎖の二重構造を形成し、
－組成物が、第１の標的を含む二本鎖の二重構造を消化し、それにより第１のオリゴヌクレオチドを修飾し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし得る制限エンドヌクレアーゼを更に含む、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５５．
－制限エンドヌクレアーゼが、当該二本鎖の二重構造の鎖と会合し、それを切断することができるニッキングエンドヌクレアーゼであり、当該鎖は、第１のオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１５４に記載の組成物。
実施形態１５６．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾が、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態１５３～１５５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５７．
－第１のオリゴヌクレオチドが、クエンチャー分子を含む、実施形態１５６に記載の組成物。
実施形態１５８．
－第１の検出部分を含む第１の標的の検出のための第１のオリゴヌクレオチドであって、
第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドの修飾時に、第１の検出可能なシグナルを生成することができ、
修飾が、第１の標的によって誘導される、第１のオリゴヌクレオチドと、
－第２の標的の検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、二本鎖ステム部分の少なくとも１つの鎖は、第２の検出部分を含む、無傷ステムループオリゴヌクレオチドと、
－第２の標的が試料中に存在する場合にのみ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供することができる、第１の酵素と
を含む組成物であって、
－第２の検出部分は、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の解離時に、第２の検出可能なシグナルを生成することができ、
－第１及び第２の検出部分は、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない検出可能なシグナルを生成することができる、組成物。
実施形態１５９．第１のオリゴヌクレオチドが、
無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の各鎖、及び
無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分とは配列が異なる、実施形態１５８に記載の組成物。
実施形態１６０．
－第１の標的が核酸配列であり、
－組成物が、
第１の標的における第１の配列に相補的な第１のプライマーと、
第１の配列とは異なる、第１の標的における第２の配列に相補的な成分、及び第１の標的に相補的ではないタグ部分を含む、第２のオリゴヌクレオチドと、
エキソヌクレアーゼ活性を含む第１のポリメラーゼと、
任意選択で第２のポリメラーゼとを更に含む、実施形態１５８又は実施形態１５９に記載の組成物。
実施形態１６１．
－第１のプライマー及び第２のオリゴヌクレオチドが、それぞれ相補塩基対合によって第１の標的にハイブリダイズされ、
第１のポリメラーゼは、標的を鋳型として使用して第１のプライマーを伸長し、それによりタグ部分を切断して、切断されたタグ部分が相補塩基対合により第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にし得、
第１のポリメラーゼ又は任意選択の第２のポリメラーゼは、第１のオリゴヌクレオチドを鋳型として使用してタグ部分を伸長し、第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を生成し、それにより第１のオリゴヌクレオチドを修飾し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし得る、実施形態１６０に記載の組成物。
実施形態１６２．
－第１のオリゴヌクレオチドが、フルオロフォア及びクエンチャー分子を含む、実施形態１６０又は実施形態１６１に記載の組成物。
実施形態１６３．
－第１のオリゴヌクレオチドが、フルオロフォア及びクエンチャー分子を含み、
－当該タグ部分を伸長することが、フルオロフォアとクエンチャー分子との間の距離を増加させる、実施形態１６２に記載の組成物。
実施形態１６４．
－第１の標的が酵素触媒活性の補因子であり、
－組成物が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムを更に含み、
－ＤＮＡザイム又はリボザイムは、第１の標的に結合し、相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより第１のオリゴヌクレオチドを消化及び修飾し、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にし得る、実施形態１５８又は実施形態１５９に記載の組成物。
実施形態１６５．補因子が、金属イオン、又はＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋から選択される金属イオンである、実施形態１６４に記載の組成物。
実施形態１６６．
－第１のオリゴヌクレオチドが、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の基質であり、
－組成物が、第１の標的が試料中に存在する場合、第１のオリゴヌクレオチドを切断することができるＭＮＡザイムを更に含み、
－ＭＮＡザイムは、第１の標的に結合し、その基質アームを介した相補塩基対合によって第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、当該ハイブリダイゼーションは、第１のオリゴヌクレオチドの切断を促進し、それによりそれを修飾し、第１の検出部分が、第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、実施形態１５８又は実施形態１５９に記載の方法。
実施形態１６７．
－第１の標的が核酸配列であり、
－第１の標的が、相補塩基対合によってＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズされ、それによりＭＮＡザイムの集合を促進する、実施形態１６６に記載の組成物。
実施形態１６８．
－第１の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－第１のオリゴヌクレオチドがアプタザイムの基質であり、
－組成物が、第１の標的に結合することができるアプタマー部分と、第１のオリゴヌクレオチドを消化し、それによりそれを修飾して第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし得る核酸酵素部分とを含むアプタザイムを更に含む、実施形態１５８又は実施形態１５９に記載の組成物。
実施形態１６９．
－第１の標的が、アプタザイムのアプタマー部分に結合し、第１のオリゴヌクレオチドが、相補塩基対合によって活性核酸酵素部分にハイブリダイズして、第１のオリゴヌクレオチドの消化を促進し、それによりそれを修飾して、第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、実施形態１６８に記載の組成物。
実施形態１７０．
－第１の検出部分がフルオロフォアであり、当該第１のオリゴヌクレオチドを修飾することが、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態１６６～１６９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７１．
－第１のオリゴヌクレオチドが、クエンチャー分子を含む、実施形態１７０に記載の組成物。
実施形態１７２．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第１の検出可能なシグナルが、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾後に第１の検出部分から生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態１３８～１４４、１４７、１４８、１５１、１５３～１５５、１５８～１６１、及び１６４～１６９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７３．
－第１の検出部分が、第１のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第１の検出可能なシグナルが、電気化学的シグナルの変化である、実施形態１７２に記載の組成物。
実施形態１７４．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態１７３に記載の組成物。
実施形態１７５．
－第２の検出部分が、第２のオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の少なくとも１つの鎖が結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
－第２の検出可能なシグナルが、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該解離時に生じる、
（ｉ）屈折率の変化、
（ｉｉ）色の変化、及び／又は
（ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
である、実施形態１７２～１７４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７６．
－第２の検出部分が、第２のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
－第２の検出可能なシグナルが、分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の当該解離時に生じる電気化学的シグナルの変化である、実施形態１７２～１７４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７７．
－電気化学的薬剤が、ナノ粒子、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋、フェロセン、及び／又はダウノマイシンのうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態１７６に記載の組成物。
実施形態１７８．
－第２の検出部分がフルオロフォアであり、
－分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の解離時に当該第２の検出部分により提供される第２の検出可能なシグナルは、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、実施形態１４５、１４６、１４９、１５０、１５２、１５６、１５７、１６２、１６３、１７０、及び１７１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１７９．
－フルオロフォア及びクエンチャー分子が、ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の対向鎖上に位置する、実施形態１７８に記載の組成物。
実施形態１８０．
－第１の酵素が第１のＭＮＡザイムであり、
－第１のＭＮＡザイムが第２の標的に結合し、
－当該第１のＭＮＡザイムの基質アームが、相補塩基対合により無傷ステムループオリゴヌクレオチドの単一ループ部分にハイブリダイズし、それにより、無傷ステムループオ
リゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドの消化を促進し、分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供する、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８１．
－第２の標的又はが核酸配列であり、
－第２の標的が、相補塩基対合によって第１のＭＮＡザイムのセンサーアームにハイブリダイズされ、それにより第１のＭＮＡザイムの集合を促進する、実施形態１８０に記載の組成物。
実施形態１８２．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－第１の酵素が、第２の標的に結合することができるアプタマーを含むアプタザイムであり、
－アプタマーが第２の標的に結合しており、それにより第１の酵素を触媒活性化する、実施形態１３８～１７９のいずれか１ついずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８３．
－第１の酵素が、アプタ－ＤＮＡザイム、アプタ－リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイムのうちのいずれか１つである、実施形態１８２に記載の組成物。
実施形態１８４．
－第２の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
－無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分が、アプタザイムの基質であり、
－組成物が、第２の標的に結合することができるアプタマー部分と、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化し、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成し得る核酸酵素部分とを含むアプタザイムを更に含む、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８５．
－第２の標的が、アプタザイムのアプタマー部分に結合し、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分が、相補塩基対合により活性核酸酵素部分にハイブリダイズされ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドの消化を促進し、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成する、実施形態１８４に記載の組成物。
実施形態１８６．
－第２の標的が核酸配列であり、
－第１の酵素が第１の制限エンドヌクレアーゼであり、
－第２の標的が、相補塩基対合によって無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズされ、第１の制限エンドヌクレアーゼが無傷ステムループオリゴヌクレオチドの１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドに会合し、それを消化するための二本鎖配列を形成して、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成する、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８７．
－第１の制限エンドヌクレアーゼが、第１の制限エンドヌクレアーゼの当該二本鎖配列の鎖と会合し、それを切断することができる第１のニッキングエンドヌクレアーゼであり、当該鎖は、無傷ステムループオリゴヌクレオチドを含む、実施形態１８６に記載の組成物。
実施形態１８８．
－第１の酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含み、
－第２の標的が、相補塩基対合によって無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズされ、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、
－組成物が、相補塩基対合によって第２の標的にハイブリダイズされて、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列に対して上流に位置する第２の二本鎖配列を形成する第１のプライマーオリゴヌクレオチドを更に含み、
－プライマーが、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、及び第２の標的を鋳型配列として使用して伸長されて、第１の二本鎖配列の一本鎖ループ部分を消化し、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成し得る、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１８９．
－第１の酵素がエキソヌクレアーゼであり、
－第２の標的が、相補塩基対合によって無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズされ、第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、それにエキソヌクレアーゼ活性を含む第１の酵素が会合し、それにより、第２の標的を含む第１の二本鎖配列の一本鎖ループ部分を消化して、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成し得る、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９０．
－第１の酵素が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムであり、
－第２の標的が補因子であり、ＤＮＡザイム又はリボザイムに結合しており、
－ＤＮＡザイム又はリボザイムは、相補塩基対合により無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分にハイブリダイズされ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドの一本鎖ループ部分の１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化させ、それにより、分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成させる、実施形態１３８～１７９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９１．補因子が、金属イオン、又はＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｐｂ２＋から選択される金属イオンである、実施形態１９０に記載の組成物。
実施形態１９２．
－第１のオリゴヌクレオチドが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（登録商標）プライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー、又はＭＮＡザイム基質のうちのいずれか１つ以上から選択される、実施形態１３８～１５０、１５３、１５６～１５８、１６６又は１６７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９３．
－第１の標的及び／又は第２の標的が、核酸のアンプリコンである、実施形態１３８～１９２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９４．試料中の第１及び第２の標的の存在又は不在を決定するための方法であって、
（ａ）第１及び第２の標的又はそれらのアンプリコンを含むと推定される試料又はその誘導体を、
－第１の標的又はそのアンプリコンの検出のための第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の検出可能なシグナルを生成することができる第１の検出部分を含む第１のオリゴヌクレオチド、
－第２の標的又はそのアンプリコンの検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、ステム部分は、第２の検出可能なシグナルを生成することができる第２の検出部分を含み、
第１及び第２の検出可能なシグナルは、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない、無傷ステムループオリゴヌクレオチド、並びに
－第２の標的又はそのアンプリコンが試料中に存在する場合にのみ、無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化することができる第１の酵素と接触させることにより、反応用の混合物を調製することと、
（ｂ）混合物を、
－第１の標的又はそのアンプリコンが、第１のオリゴヌクレオチドへの修飾を誘導し、それにより第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にするのに好適であり、
－第２の標的又はそのアンプリコンが試料中に存在する場合にのみ、第１の酵素により無傷ステムループオリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供するのに好適である条件下で処理することと、
（ｃ）
－第１の温度の５℃以内の第１のバックグラウンドシグナル、及び第２の温度の５℃以内の第２のバックグラウンドシグナル、又は
－第３の温度での第３のバックグラウンドシグナル
を測定することとを含み、これらは混合物中、又は対照混合物中の第１及び第２の検出部分によって提供され、
（ｄ）当該処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
－第１又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第１の検出可能なシグナルが、第１の温度で生成されるかどうかを決定することであって、
第１の温度で生成された第２の検出可能なシグナルが、第１又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なっておらず、
第１の検出可能なシグナルと第１又は第３のバックグラウンドシグナルとの間の差の検出が、第１のオリゴヌクレオチドの当該修飾及び試料中の第１の標的又はそのアンプリコンの存在を示す、決定することと、
－第２又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なる第２の検出可能なシグナルが、第２の温度で生成されるかどうかを決定することであって、第２の温度で、
分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖が解離して、第２の検出部分が試料中の第２の標的又はそのアンプリコンの存在を示す第２の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
無傷ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の鎖は解離することができず、それにより、第２の検出可能な部分の抑制及び試料中の第２の標的の不在を示す第２の検出可能なシグナルの不在を確実にする、決定することとを含む方法。
これより、本発明の好ましい実施形態を、例としてのみ、以下に明記される添付の図を参照して説明する。
無傷及び分割立体構造における例示的なＬＯＣＳレポーター及びその融解温度（Ｔｍ）を示す。例示されるＬＯＣＳレポーターは、核酸の検出のために当該技術分野で周知の様々な標準レポータープローブ及び基質と組み合わせて使用され得る。例示的な無傷ＬＯＣＳレポーター（図１Ａ、ＬＨＳ、上及び下）は、切断又は分解され得るループ領域、ステム領域及び検出部分、例えばフルオロフォア（Ｆ）クエンチャー（Ｑ）色素対を有する。標的の存在下でのループ領域の切断又は分解は、分割ＬＯＣＳレポーター構造を生成し得る（図１Ｂ、ＲＨＳ、上及び下）。無傷ＬＯＣＳのステム領域の融解温度（Ｔｍ Ａ）は、分割ＬＯＣＳにおけるステム領域のＴｍ（Ｔｍ Ｂ）よりも高い。したがって、無傷ＬＯＣＳのステムは、Ｔｍ Ａ以上の温度で融解及び分離する。対照的に、分割ＬＯＣＳの２つの断片を保持するステムは、Ｔｍ Ｂ以上の温度で融解及び分離し、増加した蛍光をもたらす。 ユニバーサルであり、任意の標的の検出に使用することができるＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して標的を検出するための例示的な戦略を示す。このスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー色素対、及びループ領域を含有する。ループ領域は、当該技術分野でＰｌｅｘＺｙｍｅとしても知られているＭＮＡザイム等の触媒核酸のユニバーサルな基質を含む。ＭＮＡザイムは、構成成分パートザイムの標的センサーアームが標的上で隣接して整列するときに形成される。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、集合したＭＮＡザイムの基質結合アームに結合し、ＬＯＣＳループ内の基質は、ＭＮＡザイムによって切断され、分割ＬＯＣＳ構造を生成する。無傷ＬＯＣＳ及び分割ＬＯＣＳは両方とも、反応環境の温度がそれらのステムの融解温度、すなわちそれぞれＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂを上回るか又は下回るかに応じて、クエンチされるか又は蛍光を生成する。Ｔｍ ＢとＴｍ Ａとの間の温度での蛍光の存在は、切断を促進する標的の存在を示す。標的を直接的に検出しても、標的増幅プロトコルによって生成される標的アンプリコンを検出してもよい。 本発明の好ましい実施形態のための例示的な戦略を示し、直鎖ＭＮＡザイム基質は、そのループ内にＭＮＡザイム基質を含む単一のＬＯＣＳプローブと組み合わせて使用される。直鎖ＭＮＡザイム基質及び単一ＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ検出部分、例えば、特定のフルオロフォア（Ｆ）／クエンチャー（Ｑ）色素対で標識される。直鎖基質は、第１の標的１の存在下で集合する第１のＭＮＡザイムによって切断可能な第１の基質配列を含む（図３Ａ）。標的１の存在下では、直鎖基質は切断され、全ての温度で検出され得る蛍光の増加をもたらす。ＬＯＣＳプローブは、そのループ内に、第２の標的２の存在下で集合する第２のＭＮＡザイムによって切断可能な第２の基質配列を含む（図３Ｂ）。標的２の存在下では、ＬＯＣＳ基質は切断され、無傷ＬＯＣＳの融解温度（Ｔｍ Ａ）よりも低いＴｍ Ｂで融解する分割ＬＯＣＳを生成する。Ｔｍ Ｂ未満の温度では、分割ＬＯＣＳのステム部分は、ハイブリダイズ（閉鎖）されたままであり、したがって、クエンチされたままである。Ｔｍ Ｂを超える温度では、分割ＬＯＣＳのステム部分が解離（分離）し、蛍光が増加する。両方の標的が存在し、かつ蛍光がＴｍ Ｂ未満の温度で測定される場合、蛍光の増加は標的１のみに関連付けられ、蛍光がＴｍ Ｂを超えるがＴｍ Ａ未満の温度で測定される場合、蛍光の増加は標的１及び／又は標的２に関連付けられ得る。 標的に特異的なＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用した標的の検出のための例示的な戦略を示し、これは、標準ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ又は直鎖ＭＮＡザイム基質プローブ等の他の種類のレポータープローブ又は基質と組み合わせて使用され得る。無傷ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー色素対、及び標的アンプリコンに相補的な領域を含むループ領域を含有し得る。図４Ａに示されるスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的アンプリコンに相補的であり、増幅中に標的アンプリコンに結合する。プライマーの伸長中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、ループ領域を分解するが、ステム領域は無傷のまま残す。ステム領域は、互いに相補的であるが、それらの標的には相補的ではない。分解は分割ＬＯＣＳを生成し、ステムはハイブリダイゼーションされたままであり、ステムのＴｍ未満の温度でクエンチされる。ステムのＴｍ超まで温度を上げると、鎖が分離し、蛍光が放出され得る。図４Ｂに示されるスキームでは、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的アンプリコンに相補的な領域を含み、制限酵素、例えば、ニッキング酵素の認識部位を更に含有する。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、標的に結合し、ニッキング酵素は、ループ領域を切断し、標的分子を無傷のまま残す。これはＬＯＣＳを分割し、蛍光シグナルはステムの融解温度を超える温度で放出される。低温では、分割ＬＯＣＳ構造のステム領域はアニールし、蛍光をクエンチすることができる。この戦略を使用して、標的配列を直接的に検出しても、標的増幅法と組み合わせた場合に標的アンプリコンを検出してもよい。 切断不可能な分子ビーコンが、ＭＮＡザイムによって切断可能なＬＯＣＳプローブと組み合わされ得る実施形態を示す。分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じフルオロフォアで標識され得る。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する第１の標的１と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを有し得、Ｔｍ Ｂは、Ｔｍ Ａより高い。これは、Ｔｍ Ｃを有するステム領域と、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断され得るループ領域とを有し得る無傷ＬＯＣＳプローブと組み合わせることができ、したがってＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得、Ｔｍ Ｄは、Ｔｍ Ｃ未満である。標的１及び／又は標的２の存在は、リアルタイムで２つの温度で蛍光を測定するか、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅の後に取得される個別の測定値を使用することによって識別され得る。 様々な濃度の第２の標的２（ＮＧｏｐａ）の存在下又は不在下での第１の温度での第１の標的１（ＣＴｃｒｙ）の定量分析のための例示的なＰＣＲ増幅曲線を示す。プロトコルは、（標的１に対する）１つの直鎖ＭＮＡザイム基質を（標的２に対する）１つのＬＯＣＳレポーターと組み合わせた。結果は、単独で（図６Ａ）、又はＮＧｏｐａ（標的２）の２０，０００（図６Ｂ）又は３２（図６Ｃ）コピーのバックグラウンドにおいて、２０，０００（黒の点）、４，０００（黒の破線）、８００（黒の四角）、１６０（灰色の実線）又は３２（灰色の点）コピーのＣＴｃｒｙ鋳型を含有する反応について、５２℃の取得温度でＣＴｃｒｙ（標的１）を定量的に検出するためのＨＥＸチャネルで得られた。ＣＴｃｒｙを欠くが、２０，０００（黒の線）又は３２コピー（灰色の線）のＮＧｏｐａ鋳型のいずれかを含有する反応についても、５２℃で蛍光データを収集した（図６Ｄ）。標的なし対照（ヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏ）を図６Ａ～６Ｃ（黒の実線）に示す。増幅曲線は、３回反復反応からの蛍光レベルの平均である。 ＨＥＸチャネルにおける終点分析法１を使用した、２つの温度（Ｄ１及びＤ２）での標的１（ＣＴｃｒｙ）及び／又は標的２（ＮＧｏｐａ）の同時定性的検出を示す。提示された結果は、３回反復反応の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。具体的には、データは、ヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドに存在したＣＴｃｒｙ（ＣＴコピー数２０Ｋ、４、８００、１６０、３２若しくは０）及び／又はＮＧｏｐａ（ＮＧコピー数２０Ｋ、３２若しくは０）標的それぞれの検出及び識別を可能にする、１つの直鎖基質及び１つのＬＯＣＳプローブの蛍光シグナルの変化を示す。更に、ゲノムＤＮＡ中のヒトＴＦＲＣ遺伝子の存在を、キャリブレータとして使用するためにテキサスレッドチャネルで測定した。図７Ａは、シグナルの変化（ΔＳ、ここでΔＳ＝ＳＤ－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ－ＳＤ－ｐｒｅ－ＰＣＲ）を示す。温度１におけるΔＳ（ΔＳＤ１、５２℃）は白黒パターンとして示され、温度２におけるΔＳ（ΔＳＤ２、７０℃）は灰色で示される。結果は、ＣＴｃｒｙが試料内に存在する場合、温度１でのシグナル（ΔＳＤ１、黒色バー）が閾値１（Ｘ１）を超えるが、ＮＧｏｐａのみが存在する場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、温度１の閾値１より大きいΔＳＤ１は、第１の標的（ＣＴｃｒｙ）の存在を示す。図７Ａの結果はまた、温度２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ２、灰色バー）が温度１における変化より大きく（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１）、かつ閾値Ｘ１より大きい（ΔＳＤ２＞Ｘ１）場合、ＮＧｏｐａが試料中に存在することを示している。図７Ｂ及び７Ｃの結果は、ΔＳＤ１及びΔＳＤ２を較正するためのキャリブレータシグナルの使用を示している。図７Ｂは、テキサスレッドチャネルで測定されたＴＦＲＣキャリブレータシグナルの変化（ΔＣ）を示し、閾値Ｃを超える値は、ΔＣの正のシグナルを示し、閾値Ｃを下回る値は、ΔＣ（ＮＴＣ）の負のシグナルを示す。キャリブレータ鋳型（ＴＦＲＣ）は、標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を除く全ての試料のバックグラウンドにおけるヒトゲノムＤＮＡに存在した。図７Ｃは、ΔＣに対して較正された各温度でのシグナルの変化（ΔＳ／ΔＣ）を示す。温度１でのシグナルの変化（ΔＳＤ１／ΔＣ、５２℃）は白黒パターンとして示され、温度２でのシグナルの変化（ΔＳＤ２／ΔＣ、７０℃）は灰色で示され、図７ＢのΔＣで陽性の反応については結果が得られたが、ΔＣで陰性の反応については結果が得られなかった（該当なし（Ｎ／Ａ）として示されている）。更に、図７Ｃのデータは、パターンが一貫しているため、シグナルの較正が終点分析法１を使用して得られた結果（図７Ａ）を改変しないことを示している。 分析方法２を使用した、２つの温度での第１の標的（ＣＴｃｒｙ）及び／又は第２の標的（ＮＧｏｐａ）の同時定性的検出を示す。ＣＴｃｒｙ（ＣＴコピー数２０Ｋ、４、８００、１６０、３２若しくは０）及び／又はＮＧｏｐａ（ＮＧコピー数２０Ｋ、３２若しくは０）標的は、ヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドに存在した。データは、分析方法２を使用した、温度２（Ｄ２、７０℃）及び温度１（Ｄ１、５２℃）でのＨＥＸチャネルで得られた蛍光シグナルの変化の差（ΔＳＤ２マイナスΔＳＤ１＝ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）を示している。結果は、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１が、ＮＧｏｐａが試料中に存在する場合閾値２（Ｘ２）を超えるが、ＣＴｃｒｙのみが存在する場合、及び／又は試料にＮＧｏｐａが存在しない（ＮＴＣ）場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、閾値２を超える蛍光シグナルの変化の差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２）は、ＮＧｏｐａの存在を示す。 終点分析法３を使用した、第１の標的（ＣＴｃｒｙ）及び／又は第２の標的（ＮＧｏｐａ）の存在下での、２つの異なる温度（５２℃及び７０℃）でのＨＥＸチャネルにおけるＰＣＲ中に得られた蛍光シグナルの変化（ΔＳ）を示す。ＣＴｃｒｙ（ＣＴコピー数２０Ｋ、４、８００、１６０、３２若しくは０）及び／又はＮＧｏｐａ（ＮＧコピー数２０Ｋ、３２若しくは０）標的は、ヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドに存在した。図９Ａは、温度２でのΔＳ（ΔＳＤ２）を示す。ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より大きい場合、これは、ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａが試料中に存在することを示す。ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より低い場合、これは、ＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも反応中に存在しないことを示す。図９Ｂは、どの標的が反応中に存在するかを示すために使用される比率ΔＳＤ１：ΔＳＤ２を示す。この比率が閾値Ｒ１より高い場合、これは、ＣＴｃｒｙは存在するがＮＧｏｐａは存在しないことを示す。比率が閾値Ｒ２より低い場合、これは、ＮＧｏｐａは存在するがＣＴｃｒｙは存在しないことを示す。この比率が閾値Ｒ１とＲ２との間にある場合、これは、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方が存在することを示す。反応中にＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも存在しない場合（図９Ａ）、比率の計算の必要性はなくなり、図９Ｂに示されるようにＮ／Ａとして示される。 種々の標的に対する、ＨＥＸ（Ａ～Ｄ）及びＦＡＭ（Ｅ～Ｈ）チャネルにおいて５２℃で取得されたＰＣＲ増幅曲線を示す。破線で示されるＰＣＲ曲線は、反応当たり単一の遺伝子標的の存在を表し、一方実線で示されるＰＣＲ曲線は、反応当たり２０，０００コピー（黒の線）及び３２コピー（灰色の線）の標的での両方の遺伝子標的の存在を表す。ＨＥＸチャネルでは、結果は、ＣＴｃｒｙのみ（Ａ）、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ（Ｂ）、ＮＧｏｐａのみ（Ｃ）、並びに１０，０００コピーのＴＦＲＣ（ゲノムＤＮＡ内因性対照）、ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａを含む残りの全ての標的外対照（Ｄ）について示されている。ＦＡＭチャネルでは、結果は、ＴＶｂｔｕｂのみ（Ｅ）、ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ（Ｆ）、ＭｇＰａのみ（Ｇ）、並びに１０，０００コピーのＴＦＲＣ（ゲノムＤＮＡ内因性対照）又は２０，０００コピー及び３２コピーのＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａを含む残りの全ての標的外対照（Ｈ）について示されている。全ての図において、黒の破線は、鋳型なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を表す。増幅曲線は、３回反復反応からの蛍光レベルの平均である。 終点分析法１を使用して（Ａ）ＨＥＸにおけるＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ、並びに（Ｂ）ＦＡＭにおけるＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａを検出するためのシグナルの変化（ΔＳ、ここでΔＳ＝ＳＤ－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ－ＳＤ－ｐｒｅ－ＰＣＲ）を示す。結果は、ΔＳＤ１（５２℃）については白黒パターンで表され、ΔＳＤ２（７０℃）については灰色で表されている。各試料の値は、３回の反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。 終点分析法２を使用した、ＨＥＸチャネル（Ａ）でのＮＧｏｐａ及びＦＡＭチャネル（Ｂ）でのＭｇＰａの定性的な終点検出を示す（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１＝ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）。各試料の値は、３回の反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。 終点分析法３を使用して、２つの異なる温度でＨＥＸ（図１３Ａ及び１３Ｂ）並びにＦＡＭ（図１３Ｃ及び１３Ｄ）チャネルで得られた蛍光シグナルの変化を示す。（図１３Ａ）ＨＥＸチャネルでのΔＳＤ２を使用した、ＣＴｃｒｙ（ＣＴ、２０，０００（２０Ｋ）若しくは３２コピー）及び／又はＮＧｏｐａ（ＮＧ、２０，０００（２０Ｋ）若しくは３２コピー）の検出、（図１３Ｂ）比率ΔＳＤ１：ΔＳＤ２を使用したＨＥＸでのＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの鑑別。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ１の場合、ＣＴｃｒｙ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＜閾値Ｒ２の場合、ＮＧｏｐａ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ２及び＜閾値Ｒ１の場合、両方の標的を含有する共感染の検出が決定される。（図１３Ｃ）ＦＡＭチャネルでのΔＳＤ２を使用したＴＶｂｔｕｂ及び／又はＭｇＰａの検出、（図１３Ｄ）比率ΔＳＤ１：ΔＳＤ２を使用したＦＡＭでのＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの鑑別。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ１の場合、ＴＶｂｔｕｂ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＜閾値Ｒ２の場合、ＭｇＰａ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ２及び＜閾値Ｒ１の場合、両方の標的を含有する共感染の検出が決定される。各試料の値は、３回の反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。 終点分析法２を使用した、Ｃｙ５．５．チャネルにおける温度１（Ｄ１）でのＴＦＲＣ（図１４Ａ）及び温度２（Ｄ２）でのＴＰＡｐｏｌＡ（図１４Ｂ）の検出を示す。ＴＦＲＣ（図１４Ａ）の検出は、温度１におけるＰＣＲ前蛍光を、温度１におけるＰＣＲ後蛍光から減算することによって達成される（ＳＤ１）。ＴＰＡｐｏｌＡ（図１４Ｂ）の検出は、温度２におけるＰＣＲ前蛍光を、温度２におけるＰＣＲ後蛍光から減算し（ΔＳＤ２）、続いてΔＳＤ１を減算することによって達成される（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）。各試料の値は、ＮＦ Ｈ２Ｏ、１０，０００ｃｐｓ ＴＰＡｐｏｌＡ、４０ｃｐｓ ＴＰＡｐｏｌＡ、１０，０００ｃｐｓ ＴＰＡｐｏｌＡ及び１０，０００ｃｐｓ ＴＦＲＣ、４０ｃｐｓ ＴＰＡｐｏｌＡ及び１０，０００ｃｐｓ ＴＦＲＣの２回の反復の平均値である。１０，０００ｃｐｓ ＴＦＲＣの値は、ＴＦＲＣが内因性対照として使用され、ＴＰＡｐｏｌＡのみの試料を除いて、各反応ウェルで１０，０００ｃｐｓでゲノムＤＮＡに存在するため、４８回の反復の平均値である。誤差バーは、各試料の各反復間の標準偏差を表す。 （図１５Ａ）１０，０００コピーのＴＦＲＣ（黒の実線）の存在下での基質４の切断によって生成される融解特性。（図１５Ｂ）１０，０００コピーのＴＰＡｐｏｌＡ（黒の実線）及び４０コピーのＴＰＡｐｏｌＡ（灰色の実線）の存在下でのＬＯＣＳ－３の切断によって生成された融解特性。（Ｃ）１０，０００コピーのＴＰＡｐｏｌＡプラス１０，０００コピーのＴＦＲＣ（黒の実線）、及び４０コピーのＴＰＡｐｏｌＡプラス１０，０００コピーのＴＦＲＣ（灰色の実線）の存在下での基質４及びＬＯＣＳ－３の切断によって生成される融解特性。両方の標的の不在（ＮＦ Ｈ２Ｏ）から生じる融解特性は、破線を用いて（図１５Ａ～Ｃ）で表される。結果は、温度による蛍光の変化率（－ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ）を表す。 ３９℃（Ａ）及び７２℃（Ｂ）での、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ（黒の実線）、２０，０００コピーのＮＧｏｐａ（黒の破線）、２０，０００コピーの両方の標的（灰色の実線）を含有する、又はいずれの標的も含有しない（ＮＴＣ、灰色の破線）反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。閾値である閾値Ｘ及びＹは、それぞれ３９℃及び７２℃で得られた増幅プロットについて示される。ＥＸ１、ＥＸ２、ＥＹ１、及びＥＹ２と指定された終点蛍光値が示される。 示されるような様々なコピー数での標的Ｙ／ＮＧｏｐａのバックグラウンドにおける、標的Ｘ／ＣＴｃｒｙのコピー、すなわち０コピー（黒の実線）、３２コピー（灰色の線）又は２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ（黒の点線）を含有する反応から得られたＰＣＲ増幅プロットを示す。プロットＡ、Ｄ、及びＧは、ＮＧｏｐａを２０，０００コピー（Ａ）、３２コピー（Ｄ）で含有する、又はコピーなし（Ｇ）の反応についての３９℃での蛍光を示す。プロットＢ、Ｅ及びＨは、ＮＧｏｐａを２０，０００コピー（Ｂ）、３２コピー（Ｅ）で含有する、又はコピーなし（Ｈ）の反応についての７４℃での蛍光を示す。プロットＣ、Ｆ及びＩは、ＮＧｏｐａを２０，０００コピー（Ｃ）、３２コピー（Ｆ）で含有する、又はコピーなし（Ｉ）の反応についての、ＦＡＦで正規化した後の７４℃での蛍光を示す。 ＦＡＭチャネルにおける（Ｄ１）５２℃でのヒトＧＡＰＤＨの定量的検出のためのＰＣＲ増幅曲線。（図１８Ａ）曲線は、１０，０００コピー（灰色の実線）及び１００コピー（黒の破線）のＧＡＰＤＨ標的単独から生成されたシグナルを表す。（図１８Ｂ）１０，０００コピー（灰色の実線）及び１００コピー（黒の破線）のＭｇＰａ標的単独から生成された結果である。（図１８Ｃ）曲線は、１０，０００コピー（灰色の実線）及び１００コピー（黒の破線）のＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａそれぞれを含有する標的混合物から生成されたシグナルを表す。鋳型なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）は、（図１８Ａ～Ｃ）において、黒の実線として表される。増幅曲線は、３回反復反応からの蛍光レベルの平均である。 ＦＡＭチャネルにおける２つの温度での、１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを使用したそれぞれＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａの定性的検出を示す。結果は、終点分析法１～３を使用して得られた。各試料の値は、３回の反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。（図１９Ａ）終点分析法１で得られた結果は、ＰＣＲ後の蛍光測定とＰＣＲ前の蛍光測定との間のシグナルの変化（ΔＳ）を示す。結果は、ΔＳＤ１（５２℃）については白黒パターンで表され、ΔＳＤ２（７０℃）については灰色で表されている。（図１９Ｂ）終点分析法２から得られた結果を用いたＭｇＰａ単独の検出（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）。（図１９Ｃ及び１９Ｄ）終点分析法３から得られた結果（ΔＳＤ１：ΔＳＤ２）。（図１９Ｃ）ＦＡＭチャネルでのΔＳＤ２を使用したＧＡＰＤＨ（ヒト１０，０００若しくは１００コピー）及び／又はＭｇＰａ（ＭＧ１０，０００若しくは１００コピー）の検出、（図１９Ｄ）ΔＳＤ１：ΔＳＤ２の比率を使用したＦＡＭでのＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａの鑑別。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ１の場合、ＧＡＰＤＨ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＜閾値Ｒ２の場合、ＭｇＰａ単独の検出が決定される。ΔＳＤ１：ΔＳＤ２＞閾値Ｒ２及び＜閾値Ｒ１の場合、両方の標的を含有する共感染の検出が決定される。結果は比率単位で測定されている。 ５２℃（図２０Ａ）及び７４℃（図２０Ｂ）での、２５，６００コピーのＴＶｂｔｕｂ（黒の点線）、２５，６００コピーのＭｇＰａ（黒の破線）のいずれか、２５，６００コピーの両方の標的の両方を含有する混合物（灰色の実線）を含有する、又は標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ、黒の実線）の反応からＦＡＭチャネルにおいて得られたＰＣＲ増幅曲線を示す。５２℃での蛍光の増加（Ｄ１）は、分子ビーコンによって検出されるＴＶｂｔｕｂの存在を示し、７４℃での蛍光の増加（Ｄ２）は、ＬＯＣＳプローブによって検出されるＭｇＰａの存在を示す。Ｄ１及びＤ２で決定されたＣｑ値を使用して、特別な分析方法を必要とせずにそれぞれ試料中のＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの量を定量化した。曲線は、３回反復反応からの平均蛍光レベルを表す。 ＴＶｂｔｕｂの定量化に使用された５２℃（Ｄ１）で得られた標準曲線（図２０Ａ）、及びＭｇＰａの定量化に使用された７４℃（Ｄ２）で得られた標準曲線（図２０Ｂ）を示す。２５６００、６４００、１６００、４００、及び１００コピーの合成ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ Ｇ－Ｂｌｏｃｋ鋳型の３回反復を使用して、標準曲線を生成した。 デュアルハイブリダイゼーションプローブが、ＭＮＡザイムによって切断可能であり得るＬＯＣＳプローブと組み合わせられ得る実施形態を示す。デュアルハイブリダイゼーションプローブ及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じフルオロフォアで標識され得る。２つのデュアルハイブリダイゼーションプローブは、それぞれ、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂで標的１に結合可能であり得る。これらは、Ｔｍ Ｃを有するステム領域と、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断され得るループ領域とを有し得る無傷ＬＯＣＳプローブとを組み合わせることができ、したがってＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得、Ｔｍ Ｄは、Ｔｍ Ｃよりも小さい。標的１及び／又は標的２の存在は、リアルタイムで２つの温度で蛍光を測定するか、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅の後に取得される個別の測定値を使用することによって決定され得る。 ５２℃（ΔＳＤ１、図２３Ａ）及び７４℃（ΔＳＤ２、図２３Ｂ）でのＰＣＲ中の蛍光の変化を測定することによる、１つの切断不可能な分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳプローブを使用したＦＡＭチャネルにおける２つの標的（ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ）の同時終点検出を示す。プロットされた値は、グラフに指定されているように、様々な量のＴＶｂｔｕｂ及び／又はＭｇＰａを含有する３回反復反応の平均である。図２３Ａにおいて、指定された閾値を超えるΔＳＤ１は、反応におけるＴＶｂｔｕｂの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。図２３Ｂにおいて、指定された閾値を超えるΔＳＤ２は、反応におけるＭｇＰａの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。Ｙ軸は、５２℃（ΔＳＤ１、図２３Ａ）又は７４℃（ΔＳＤ２、図２３Ｂ）での蛍光の決定された増加である。 ５２℃（ΔＳＤ１／Ｃ、図２４ Ａ）及び７４℃（ΔＳＤ２／Ｃ、図２４Ｂ）でのＰＣＲ中の較正された蛍光シグナルの変化を測定することによる、１つの切断不可能な分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳプローブを使用したＦＡＭチャネルにおける２つの標的（ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ）の同時終点検出を示す。プロットされた値は、グラフに指定されているように、様々な量のＴＶｂｔｕｂ及び／又はＭｇＰａ鋳型を含有する反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。図２４Ａにおいて、閾値１を超えるΔＳＤ１／Ｃは、反応におけるＴＶｂｔｕｂの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。図２４Ｂにおいて、閾値２を超えるΔＳＤ２／Ｃは、反応におけるＭｇＰａの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。 試験された３つのＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６機器（黒色ストライプの機器１、灰色の機器２、及び白色の機器３）にわたる、５２℃（ΔＳＤ１、図２５Ａ）及び７０℃（ΔＳＤ２、図２５Ｂ）でのＰＣＲ中の蛍光シグナル、並びに５２℃（ΔＳＤ１／Ｃ、図２５Ｃ）及び７０℃（ΔＳＤ２／Ｃ、図２５Ｄ）での較正されたシグナルの変化を測定することによる、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用したＨＥＸチャネルにおける２つの標的（ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ）の同時終点検出を示す。プロットされた値は、グラフに指定されているように、様々な量のＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａ鋳型を含有する３回反復の平均であり、誤差バーは、これらの反復の間の標準偏差を表す。閾値Ｃ１を超える図２５Ａのシグナル又は図２５Ｃの較正されたシグナルは、反応におけるＣＴｃｒｙの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。図２５Ｄの較正されたシグナルは、閾値Ｃ２未満の場合はＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの不在を示し、閾値Ｃ３を超える場合はＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方の存在を示し、閾値Ｃ２とＣ３の間の場合はＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａのうちの１つのみの存在を示す。図２５Ｂは、閾値Ｃ３の値が図２５Ｄに示されるものと異なり、較正なしでは機器間で変動することを示している（閾値Ｃ２は図２５Ｂには示されていない）。 終点分析法２を使用することによる、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した、ＨＥＸチャネルにおける標的１（ＣＴｃｒｙ）及び／又は標的２（ＮＧｏｐａ）の同時終点検出を示す。実験試料からＤ１（５２℃）及びＤ２（７０℃）で取得したＰＣＲ後シグナルを測定し、４０℃（図２６Ａ～Ｂ）、５２℃（図２６Ｃ～Ｄ）及び６２℃（図２６Ｅ～Ｆ）での同じ反応ウェルからのＰＣＲ前蛍光測定値（ＳＤ３）としてバックグラウンドシグナルを決定することにより、ＮＳＤ１（ＬＨＳ）及びΔＮＳＤ２ＮＳＤ１（ＲＨＳ）を示すグラフを、それぞれＣＴｃｒｙ検出及びＮＧｏｐａ検出について決定した。図２６Ａ、２６Ｃ及び２６Ｅにおいて、ＮＳＤ１が閾値Ｘ１を超える場合、これは反応におけるＣＴｃｒｙの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。図２６Ｂ、２６Ｄ及び２６Ｆにおいて、ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１が閾値Ｘ２を超える場合、これは反応におけるＮＧｏｐａの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。 終点分析法２を使用することによる、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した、ＨＥＸチャネルにおける２つの標的（ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ）の同時終点検出を示す。Ｄ１（５２℃）及びＤ２（７０℃）で取得したＰＣＲ後シグナルを測定し、ＰＣＲの前（図２７Ａ～Ｂ）のＤ１／Ｄ３Ｂ並びにＰＣＲの前（図２７Ｃ～Ｄ）及びＰＣＲの後（図２７Ｅ～Ｆ）のＤ１及びＤ２で測定された鋳型なし対照シグナルの平均値として、バックグラウンドシグナルをＰＣＲ前蛍光測定値（ＳＤ３）として決定することにより、ＮＳＤ１（ＬＨＳ）及びΔＮＳＤ２ＮＳＤ１（ＲＨＳ）を、それぞれＣＴｃｒｙ検出及びＮＧｏｐａ検出について決定した。図２７Ａ、２７Ｃ及び２７Ｅにおいて、ＮＳＤ１が閾値Ｘ１を超える場合、これは反応におけるＣＴｃｒｙの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。図２６Ｂ、２６Ｄ及び２６Ｆにおいて、ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１が閾値Ｘ２を超える場合、これは反応におけるＮＧｏｐａの存在を示し、又はそれ未満の場合は不在を示す。
定義
この出願で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、別段文脈が明確に指示しない限り、複数の参照対象が含まれる。例えば、「ポリヌクレオチド」という語句はまた、複数のポリヌクレオチドも含む。
本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」を意味する。「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」等の「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という単語の変化形は、それに応じて様々な意味を有する。したがって、例えば、ヌクレオチドの配列を「含む」ポリヌクレオチドは、そのヌクレオチドの配列のみからなっても、１つ以上の追加のヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２つ以上を意味する。特定の具体的な態様又は実施形態では、複数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又はそれ以上、及びその中で誘導可能な任意の整数、及びその中で導出可能な任意の範囲を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類、及びげっ歯類種を含む、経済的、社会的、又は研究的に重要な任意の動物を含む。したがって、「対象」は、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物等の哺乳動物であり得る。細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物、及び線虫を含むがこれらに限定されない、微生物対象もまた包含される。本発明による「対象」には、プリオン等の感染性病原体も含まれる。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、互換的に使用することができ、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基、又はそれらの類似体、誘導体、変異体、断片、又は組み合わせの一本鎖又は二本鎖ポリマーを指し、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレ及びプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、核酸の供給源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルス、古細菌、又はそれらの任意の組み合わせを含む群から選択さ
れ得る。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡのセグメント若しくはＤＮＡ含有核酸分子、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子、又はそれらの組み合わせを指す。オリゴヌクレオチドの例には、核酸標的、基質、例えば、ＭＮＡザイムによって修飾され得るもの、ＰＣＲ等の方法によるインビトロ標的増幅に使用されるもの等のプライマー、ＭＮＡザイムの構成成分、並びに、ＴａｑＭａｎ又は加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブプライマー／プローブ、キャプチャー／ピッチャー及びデュアルハイブリダイゼーションプローブを含むがこれらに限定されない、レポータープローブの様々な他の種類が含まれる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、別段示されない限り、任意の特定の配列及びそれに相補的な配列への言及を含む。オリゴヌクレオチドは、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、ジヒドロウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、ベータＤ－ガラクトシルケオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルシュードウリジン、１－メチルグアノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、ベータＤ－マンノシルメチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－ベータ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－ベータ－リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチル－カルバモイル）スレオニン、ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウリジン、クエオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－ベータ－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、ウィブトシン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、ベータＤ－アラビノシルウリジン、ベータＤ－アラビノシルチミジンを含む群を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの付加又は置換を含み得る。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」「オリゴヌクレオチド」という用語は、別段示されない限り、任意の特定の配列及びそれに相補的な配列への言及を含む。
本明細書で使用される場合、「相補的」、「相補性」、「一致する」、及び「一致した」という用語は、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの組み合わせ）が、ワトソン－クリック塩基対合、ゆらぎ塩基対合及びフーグスティーン塩基対合（ＬＮＡ、ＰＮＡ若しくはＢＮＡ）を含む非標準的塩基対合、又は非天然塩基対合（ＵＢＰ）を介して互いにハイブリダイズする能力を指す。結合は、アデニン（Ａ）塩基とウラシル（Ｕ）塩基との間、アデニン（Ａ）塩基とチミン（Ｔ）塩基との間、シトシン（Ｃ）塩基とグアニン（Ｇ）塩基との間のワトソン－クリック塩基対合を介して形成され得る。ゆらぎ塩基対は、ポリヌクレオチド二重構造（例えば、グアニン－ウラシル、イノシン－ウラシル、イノシン－アデニン、及びイノシン－シトシン）の２つのヌクレオチド間の非標準的塩基対合である。フーグスティーン塩基対は、ワトソン－クリック塩基対と同様に、アデニン（Ａ）塩基とチミン（Ｔ）塩基との間、及びシトシン（Ｃ）塩基とグアニン（Ｇ）塩基との間で生じるが、ワトソン－クリック塩基対合と比較して、ピリミジンとの関係でプリンの立体構造が異なる対合である。非天然塩基対は、実験室で合成された製造サブユニットであり、自然界では生じない。「相補的」と称されるヌクレオチド又は互いの「相補体」であるヌクレオチドは、それらのそれぞれの塩基間のワトソン－クリック塩基対合又は非標準的塩基対合（ゆらぎ塩基対合、フーグスティーン塩基対合）又は非天然塩基対合（ＵＢＰ）のいずれかによって一緒にハイブリダイズする能力を有するヌクレオチドである。本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「相補的」であるヌクレオチドの配列は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上の領域にわたって、第２の配列の相補体と１００％同一であることを意味し得る。本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「実質的に相補的」であるヌクレオチドの配列への言及は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「非相補的」、「相補的ではない」、「不一致」、及び「不一致の」という用語は、それらのそれぞれの塩基間のワトソン－クリック塩基対合又はゆらぎ塩基対合のいずれかによって一緒にハイブリダイズする能力を欠如するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びそれらの組み合わせ）を指す。本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「非相補的」であるヌクレオチドの配列は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と０％同一であることを意味し得る。
本明細書において、ヌクレオチドの別の配列に「実質的に非相補的」であるヌクレオチド配列への言及は、第１の配列が、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％未満同一であることを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、本発明の方法を使用して検出することができる、試料中に存在する任意の分子又は分析物を指す。「標的」という用語は、核酸標的、並びに例えば、タンパク質、ペプチド、分析物、リガンド、及びイオン（例えば、金属イオン）等の非核酸標的を含むことが理解される。
本明細書で使用される場合、「酵素」は、化学反応（例えば、ポリヌクレオチドの増幅、ポリヌクレオチドの切断等）を触媒することができる任意の分子を指す。本発明での使用に好適な酵素の非限定的な例には、核酸酵素及びタンパク質酵素が含まれる。好適な核酸酵素の非限定的な例には、リボザイム、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム及びアプタザイムが含まれる。好適なタンパク質酵素の非限定的な例には、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが含まれる。酵素は一般に、本明細書に記載の方法のうちの１つ以上の実行を助ける触媒活性を提供する。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、ポリメラーゼの固有の触媒活性であり得る。非限定的な例として、エンドヌクレアーゼ活性は、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボエンドヌクレアーゼ、又は二重構造特異性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を含む制限酵素の固有の触媒活性であり得る。
本明細書で使用される場合、「アンプリコン」は、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＥＡＲ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＣＲ、ＲＡＭ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、天然又は人工の核酸増幅又は複製事象の生成物である核酸（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの組み合わせ）を指す。
本明細書で使用される場合、「ステムループオリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖ループ構成成分に接合した二本鎖ステム構成成分を含むか、又はそれからなる、ＤＮＡ若しくはＤＮＡ含有分子、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子、又はそれらの組み合わせ（すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子若しくは複合体）を意味することが理解される。二本鎖ステム構成成分は、相補塩基対合によって相補的逆方向鎖にハイブリダイズした順方向鎖を含み、順方向鎖の３’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の５’ヌクレオチドに接合し、逆方向鎖の５’ヌクレオチドは、一本鎖ループ構成成分の３’ヌクレオチドに接合する。二本鎖ステム構成成分は、一方の鎖（例えば、順方向鎖）上に１つ以上のフルオロフォアを含むがこれに限定されない検出部分、及び対向鎖（例えば、逆方向鎖）上に１つ以上のクエンチャーを更に含み得る。他の非限定的な例としては、比色検出のための両方の鎖上の金又は銀ナノ粒子、ＳＰＲ検出のための一方の鎖の金表面（例えば、順方向鎖）への、及び対向鎖（例えば、逆方向鎖）上の金ナノ粒子の固定化、並びに電気化学的検出のための一方の鎖の電極表面（例えば、順方向鎖）への、及び対向鎖（例えば、逆方向鎖）上のメチレンブルー分子の固定化が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ステムループオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では「ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド」、「ＬＯＣＳ構造」、「ＬＯＣＳレポーター」、「無傷ＬＯＣＳ」、「閉鎖ＬＯＣＳ」、及び「ＬＯＣＳプローブ」とも称される、「ＬＯＣＳ」を含むことが理解される。ＬＯＣＳの一本鎖ループ構成成分は、例えば、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム、アプタ－ＭＮＡザイム、又はアプタザイム等の触媒核酸の基質として機能することができる領域を含み得る。追加的又は代替的に、一本鎖ループ構成成分は、標的核酸（例えば、検出、定量化等のための標的）、及び／又はそれに由来するアンプリコンに相補的であり、更にエキソヌクレアーゼ酵素の基質として機能することができる領域を含み得る。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼは、ポリメラーゼ酵素の固有の活性であり得る。追加的又は代替的に、一本鎖ループ構成成分領域は、（ｉ）検出される標的に相補的であり得る領域、（ｉｉ）二本鎖制限酵素認識部位の一本鎖を含み得る領域、及び（ｉｉｉ）制限酵素、例えばニッキングエンドヌクレアーゼの基質として機能することができる領域を含み得る。本明細書で使用される場合、「分割ステムループオリゴヌクレオチド」、「分割ＬＯＣＳ」、「分割ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド」、「分割ＬＯＣＳ構造」、「分割ＬＯＣＳレポーター」、「分割ＬＯＣＳプローブ」、「切断されたＬＯＣＳ」、及び「分解されたＬＯＣＳ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ループ内の隣接するヌクレオチド間の少なくとも１つの結合が除去され、それにより、ループ領域内に不連続セクションを提供するように、一本鎖ループ構成成分が（例えば、本明細書に記載の酵素によって）切断、消化及び／又は分解された「ＬＯＣＳ」への言及であることが理解される。分割ＬＯＣＳでは、二本鎖ステム部分の順方向鎖及び逆方向鎖は、温度依存的に互いにハイブリダイズして、ステムを形成する能力を保持し得る。
ＬＯＣＳは、切断可能なループ領域を含み、分割ＬＯＣＳを生成する酵素によるループ領域の標的依存的切断を可能にするように設計される。これは一方で、無傷又は分割ＬＯＣＳのステム部分の会合（ハイブリダイゼーション）又は解離後に、特定の温度で生成された検出可能なシグナルからの標的の検出を促進し得る。対照的に、本明細書で使用される場合、分子ビーコンは、本明細書に記載の方法の間に切断可能ではないループ領域を含
むように設計されたステムループオリゴヌクレオチドを指す。分子ビーコンは、プローブのループ部分を検出する標的と会合（ハイブリダイズ）又は解離（分離）した後、特定の温度で検出可能なシグナルを生成することにより、標的検出を媒介し得る。したがって、本発明の文脈におけるこれらの２つの種類のステムループ構造の間の主な違いは、ＬＯＣＳが、無傷又は分割ＬＯＣＳのステム領域のハイブリダイゼーション又は解離に起因するシグナルの変化を測定することによって監視されるのに対し、分子ビーコンは、ループ領域及び標的のハイブリダイゼーション又は解離に起因するシグナルの変化を測定することによって監視されることである。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルステム」という用語は、任意のＬＯＣＳ構造に組み込まれ得る二本鎖配列を指す。同じ「ユニバーサルステム」を、触媒核酸基質又は対象となる標的に相補的な配列のいずれかを含むループを含有するＬＯＣＳにおいて使用することができる。単一のユニバーサルステムは、特定のＬＯＣＳの分割を促進することができる任意の標的の代替マーカーとして使用することができる。一連のユニバーサルステムは、任意の標的の組を分析するように設計した一連のＬＯＣＳに組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサルＬＯＣＳ」という用語は、「ユニバーサルステム」と、ＭＮＡザイム標的センシングアームの配列にかかわらず、相補的な基質結合アームを有する任意のＭＮＡザイムによって切断され得るユニバーサル触媒核酸基質を含む「ユニバーサルループ」とを含有する、ＬＯＣＳ構造を指す。単一のユニバーサルＬＯＣＳは、特定のＬＯＣＳの分割を促進することができる任意の標的の代替マーカーとして使用することができる。一連のユニバーサルＬＯＣＳは、任意の標的の組を分析するように設計した任意の多重アッセイに組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、及び「触媒核酸酵素」という用語は、本明細書で互換的に使用され、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断等）を触媒し得る、ＤＮＡ若しくはＤＮＡ含有分子若しくは複合体、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子若しくは複合体、又はそれらの組み合わせ（すなわち、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子若しくは複合体）を意味するものとする。触媒核酸のヌクレオチド残基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵ、並びにそれらの誘導体及び類似体を含み得る。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断等）を触媒し得るＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子である、単一のＤＮＡ若しくはＤＮＡ含有分子（当該技術分野では「ＤＮＡ酵素」、「デオキシリボザイム」、若しくは「ＤＮＡザイム」としても知られている）、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子（当該技術分野では「リボザイム」としても知られている）、又はそれらの組み合わせを含み得る単分子核酸酵素を含む。上記の用語は、少なくとも１つの基質を認識し、その少なくとも１つの基質の修飾（切断等）を触媒し得るＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド複合体である、ＤＮＡ若しくはＤＮＡ含有複合体、又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有複合体、又はそれらの組み合わせを含む核酸酵素を含む。「核酸酵素」、「触媒核酸」、「触媒活性を有する核酸」、及び「触媒核酸酵素」という用語は、それらの意味の中に、ＭＮＡザイムを含む。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ＭＮＡザイム」及び「多成分核酸酵素」という用語は、同じ意味を有し、ＭＮＡザイム集合促進剤（例えば、標的）の存在下でのみ基質を触媒的に修飾することができる活性核酸酵素を形成する、２つ以上のオリゴヌクレオチド配列（例えば、パートザイム）を指す。「ＭＮＡザイム」はまた、当該技術分野では「ＰｌｅｘＺｙｍｅ」としても知られている。ＭＮＡザイムは、基質の切断を含む一連の反応、及び基質（複数可）の他の酵素修飾を触媒することができる。エンドヌクレアーゼ又は切断活性を有するＭＮＡザイムはまた、「ＭＮＡザイム切断剤」としても
知られている。構成成分パートザイムであるパートザイムＡ及びＢは各々、塩基対合を介して集合促進剤（例えば、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列）に結合する。ＭＮＡザイムは、パートザイムＡ及びＢのセンサーアームが集合促進剤で互いに隣接してハイブリダイズする場合にのみ形成される。ＭＮＡザイムの基質アームは、基質に係合し、その修飾（例えば、切断）は、パートザイムＡ及びＢの部分触媒ドメインの相互作用によって形成されるＭＮＡザイムの触媒コアによって触媒される。ＭＮＡザイムは、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラレポーター基質を切断することができる。フルオロフォア及びクエンチャー色素対間の基質のＭＮＡザイム切断は、蛍光シグナルを生成し得る。「多成分核酸酵素」及び「ＭＮＡザイム」という用語は、２つの分子で構成される二分構造、又は３つの核酸分子で構成される三分構造、又は例えば４つ以上の核酸分子によって形成されるもの等の他の多分構造を含む。
本明細書で使用される場合、「ＭＮＡザイム」及び「多成分核酸酵素」という用語は、ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ／２００７／０４１７７４号、同第ＷＯ／２００８／０４００９５号、同第ＷＯ２００８／１２２０８４号、及び関連する米国特許公開番号第２００７－０２３１８１０号、同第２０１０－０１３６５３６号、及び同第２０１１－０１４３３３８号（これらの文書の各々の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つ以上に開示されるものを含む、全ての既知のＭＮＡザイム及び修飾ＭＮＡザイムを包含することが理解される。「ＭＮＡザイム」及び「多成分核酸酵素」という用語によって包含されるＭＮＡザイム及び修飾ＭＮＡザイムの非限定的な例には、（本明細書に例証される）切断触媒活性を有するＭＮＡザイム、１つ以上の集合阻害剤を含む解体又は部分的に集合したＭＮＡザイム、１つ以上のアプタマーを含むＭＮＡザイム（「アプタ－ＭＮＡザイム」）、１つ以上の短縮型センサーアーム及び任意選択で１つ以上の安定化オリゴヌクレオチドを含むＭＮＡザイム、１つ以上の活性阻害剤を含むＭＮＡザイム、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）が含まれ、これらの各々は、ＷＯ／２００７／０４１７７４、ＷＯ／２００８／０４００９５、ＵＳ２００７－０２３１８１０、ＵＳ２０１０－０１３６５３６、及び／又はＵＳ２０１１－０１４３３３８のうちの１つ以上において詳細に説明されている。
本明細書で使用される場合、「パートザイム」、「構成成分パートザイム」、及び「パートザイム構成成分」という用語は、ＤＮＡ含有又はＲＮＡ含有又はＤＮＡ－ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドを指し、これらのうちの２つ以上は、本明細書で定義されるＭＮＡザイム集合促進剤の存在下でのみ、一緒に「ＭＮＡザイム」を形成することができる。特定の好ましい実施形態では、１つ以上、及び好ましくは少なくとも２つの構成成分パートザイムは、３つの領域又はドメイン、つまり修飾を触媒する触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン、集合促進剤と会合する、かつ／又はそれに結合することができる「センサーアーム」ドメイン、及び基質と会合する、かつ／又はそれに結合することができる「基質アーム」ドメインを含み得る。「センサーアーム」、「標的センサーアーム」、又は「標的センシングアーム」、又は「標的アーム」という用語は、集合促進剤、例えば、標的に結合するパートザイムのドメインを説明するために互換的に使用され得る。パートザイムは、本明細書で「アプタ－パートザイム」と称されるアプタマーを含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの追加の構成成分を含み得る。パートザイムは、短縮型センサーアームを有するパートザイム構成成分、及び集合促進剤又は基質のいずれかと相互作用することによってＭＮＡザイム構造を安定化する安定化アーム構成成分を含むがこれらに限定されない、複数の構成成分を含み得る。
本明細書で使用される場合、「集合促進剤分子」、「集合促進剤」、「ＭＮＡザイム集合促進剤分子」、及び「ＭＮＡザイム集合促進剤」という用語は、ＭＮＡザイムのセンサーアームとの相互作用によって触媒活性ＭＮＡザイムを形成するための構成成分パートザイムの自己集合を促進することができる実体を指す。本明細書で使用される場合、集合促進剤は、切断又は他の酵素活性を有するＭＮＡザイムの集合を促進し得る。好ましい実施形態では、集合促進剤は、ＭＮＡザイムの自己集合に必要とされる。集合促進剤は、１つの分子で構成されていても、１つ以上のオリゴヌクレオチド「パートザイム」のセンサーアームと対合するか、又はそれに結合する２つ以上の「集合促進剤構成成分」で構成されていてもよい。集合促進剤は、ＭＮＡザイムのセンサーアームと配列相補性を共有しない１つ以上のヌクレオチド構成成分を含み得る。集合促進剤は、標的であってもよい。標的は、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレ及びプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、アンプリコン、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸であり得る。核酸は、増幅され得る。増幅は、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＥＡＲ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＲＡＭ、ＬＣＲ、３ＳＲ、又はＮＡＳＢＡのうちの１つ以上を含み得る。
ＭＮＡザイムは、直鎖基質及び／又はステムループＬＯＣＳレポータープローブ構造のループ領域内に存在する基質を切断することができる。直鎖基質の切断は、標的の検出を可能にするフルオロフォア及びクエンチャーを分離し得る。ＭＮＡザイムによるＬＯＣＳのループ領域の切断は、２つの断片で構成される分割ＬＯＣＳ構造を生成し得、この断片は、ハイブリダイズされたままであり、ステムの融解温度未満の温度で会合し得、分割ＬＯＣＳのステムの融解温度を超える温度で分離及び解離し得る。
「検出可能な効果」及び「検出可能なシグナル」という用語は、本明細書で互換的に使用され、同じ意味を有することが理解される。この用語は、典型的にはオリゴヌクレオチドを修飾してその立体構造、構造、配向、他のエンティティに対する位置等を変更した後に、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ、レポーター、又は基質）に結合するか、又は別様に会合する検出部分から生成されるシグナル又は効果を指す。修飾は、例えば、オリゴヌクレオチドが検出するように設計されている標的の存在によって誘導され得る。そのような修飾の非限定的な例（例えば、標的の存在によって誘導されるもの）としては、分子ビーコンのステムループ部分の開放、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ及びバイプローブの二本鎖部分の開放、デュアルハイブリダイゼーションプローブの標的配列への結合、キャッチャー二重構造の生成、並びに直鎖ＭＮＡザイム基質又はＴａｑＭａｎプローブの切断／消化等が挙げられる。検出可能な効果は、蛍光分光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、質量分光、ＮＭＲ、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光、円二色性分光法、免疫測定、クロマトグラフィー、放射測定、測光、シンチグラフィー、電子的方法、電気化学的方法、ＵＶ、可視光若しくは赤外線分光、酵素的方法、又はそれらの任意の組み合わせを含む、様々な方法によって検出することができる。検出可能なシグナル／効果は、検出又は定量化することができ、その大きさは、試料中に存在する標的分子の量等の入力の存在及び／又は量を示し得る。更に、検出部分によって提供される検出可能なシグナル／効果の大きさは、反応温度を含むがこれらに限定されない、検出可能な部分を含むオリゴヌクレオチドが利用される反応の条件を変更することによって調節することができる。したがって、標的依存的シグナル、及び／又は標的非依存的バックグラウンドシグナルを生成するために、オリゴヌクレオチドに結合するか、又は別様にオリゴヌクレオチドと会合する検出可能な部分の能力を調節することができる。
本明細書で使用される場合、「バックグラウンドシグナル」及び「ベースラインシグナル」という用語は、互換的に使用され、同じ意味を有することが理解される。この用語は、本発明のオリゴヌクレオチドに結合するか、又は別様にオリゴヌクレオチドと会合する検出可能な部分によって生成されるシグナルを指し、オリゴヌクレオチドが特定の測定条件下で測定又は検出するように設計されている特定の標的の存在又は不在とは無関係である。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド基質」、「オリゴヌクレオチド基質」及び「基質」という用語は、触媒核酸酵素を含む酵素によって認識、作用、又は修飾され得る、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド塩基、又はそれらの類似体、誘導体、変異体、断片、若しくは組み合わせの任意の一本鎖又は二本鎖ポリマーを含む。「ポリヌクレオチド基質」又は「オリゴヌクレオチド基質」又は「基質」は、切断を含むがこれに限定されない、様々な酵素活性によって修飾され得る。「ポリヌクレオチド基質」又は「オリゴヌクレオチド基質」又は「基質」の切断又は分解は、酵素の触媒活性を監視するための「検出可能な効果」を提供し得る。「ポリヌクレオチド基質」又は「基質」は、ＭＮＡザイム、アプタＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、アプタザイム、リボザイム等の触媒核酸酵素、及び／又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼ等のタンパク質酵素を含むがこれらに限定されない、１つ以上の酵素による切断又は分解が可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「レポーター基質」は、触媒反応に関連して、基質の切断若しくは分解又は切断された生成物の出現のいずれかの測定を促進するように特に適合された基質である。レポーター基質は、溶液中に遊離していても、例えば、表面又は別の分子に結合（又は「繋留」）していてもよい。レポーター基質は、例えば、（クエンチャー等の１つ以上の追加の構成成分を有するか、若しくは有しない）フルオロフォア、放射性標識、ビオチン（例えば、ビオチン化）、又は化学発光標識を含む多種多様な手段のいずれかによって標識することができる。
本明細書で使用される場合、「直鎖ＭＮＡザイム基質」は、複数のＭＮＡザイムによって認識され、触媒的に作用される基質、例えば、レポーター基質である。「直鎖ＭＮＡザイム基質」は、その５’又は３’末端に、ハイブリダイズしてステムを形成することができる配列を含有しない。代替的に、ＭＮＡザイム基質は、ＬＯＣＳプローブのループ領域内に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「ユニバーサル基質」は、各々が異なる集合促進剤を認識することができる複数のＭＮＡザイムによって認識され、触媒的に作用される基質、例えば、レポーター基質である。そのような基質の使用は、それらの全てがユニバーサル基質を認識する、構造的に関連するＭＮＡザイムを使用して、様々な集合促進剤を検出、特定、又は定量化するための別個のアッセイの開発を促進する。これらのユニバーサル基質は各々、１つ以上の標識で独立して標識することができる。好ましい実施形態では、独立して検出可能な標識を使用して、１つ以上のユニバーサル基質を標識して、ＭＮＡザイムを使用して様々な集合促進剤を独立して又は同時に検出するための便利なシステムの作製を可能にする。いくつかの実施形態では、基質は、補因子、例えば、鉛又は水銀等の金属イオン補因子の存在下で触媒活性であるＤＮＡザイムによる触媒修飾が可能である。いくつかの実施形態では、基質は、アプタザイムのアプタマー部分に結合可能な分析物、タンパク質、化合物、又は分子の存在下で触媒活性になり、それによって核酸酵素部分の触媒能力を活性化し得るアプタザイムによる触媒修飾に適してもよい。
本明細書で使用される場合、「プローブ」及び「レポーター」という用語は、標的分子（例えば、核酸又は分析物）の検出に使用されるオリゴヌクレオチドを指す。当技術分野において周知である標準プローブ又はレポーターの非限定的な例としては、直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ又は加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブプライマー／プローブ、キャプチャー／ピッチャーオリゴヌクレオチド、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態は、標準プローブ及びＬＯＣＳプローブを組み合わせる。いくつかのＬＯＣＳプローブは、ユニバーサルであってもよいループ領域内の核酸酵素基質を含み、これは、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム及びアプタザイム等の核酸酵素による触媒切断が可能である。他のＬＯＣＳプローブは、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含むタンパク質酵素による触媒切断が可能なループ領域内に標的特異的配列を含む。
「生成物」という用語は、基質の酵素修飾の結果として生成される新たな分子（複数可）を指す。本明細書で使用される場合、「切断生成物」という用語は、酵素による切断又はエンドヌクレアーゼ活性の結果として生成される新たな分子を指す。いくつかの実施形態では、無傷ＬＯＣＳ構造の酵素切断又は分解の生成物は、集合的に分割ＬＯＣＳと称される２つのオリゴヌクレオチド断片を含み、２つのオリゴヌクレオチド断片は、反応の温度に依存してハイブリダイゼーション又は解離／分離のいずれかが可能であり得る。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの文脈における「融解温度」及び「Ｔｍ」という用語の使用は、別段具体的に示されない限り、ウォレス規則を使用して計算した融解温度（Ｔｍ）への言及であることが理解され、それにより、Ｔｍ＝２℃（Ａ＋Ｔ）＋４℃（Ｇ＋Ｃ）である（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６，３５４３を参照されたい）。配列組成が融解温度に与える効果は、以下の式、Ｔｍ（℃）＝ΔＨ°／（ΔＳ°＋Ｒ ｌｎ［ｏｌｉｇｏ］）－２７３．１５によって支配される最近傍法を使用して理解することができる。ステムの長さ及び配列組成に加えて、融解温度に影響を与えることが知られている他の因子には、イオン強度及びオリゴヌクレオチド濃度が含まれる。より高いオリゴヌクレオチド及び／又はイオン濃度は、融解温度の増加につながる二重構造形成の可能性を増加させる。対照的に、より低いオリゴヌクレオチド及び／又はイオン濃度は、融解温度の低下につながるステムの解離を支持する。
本明細書で使用される場合、「クエンチャー」という用語は、フルオロフォアへの近接時に、フルオロフォアによって生成される放出エネルギーを吸収し、このエネルギーを熱として放散するか、又はフルオロフォアの放出波長よりも長い波長の光を放出する、任意の分子を含む。クエンチャーの非限定的な例には、ダブシル、ＴＡＭＲＡ、グラフェン、ＦＲＥＴフルオロフォア、ＺＥＮクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー（ＢＨＱ）、及びＢｌａｃｋ Ｂｅｒｒｙクエンチャー（ＢＢＱ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、核酸の文脈で使用される場合の「塩基」という用語は、「ヌクレオチド」という用語と同じ意味を有することが理解される。
本明細書で使用される場合、「ブロッカー」又は「ブロッカー分子」という用語は、ポリメラーゼが相補鎖の合成のための鋳型としてオリゴヌクレオチドの一部を使用することを防止するために、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る任意の分子又は官能基を指す。非限定的な例として、ヘキサチレングリコールブロッカーを、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブに組み込んで、その５’プローブ配列をその３’プライミング配列に結合させることができ、ブロッカーは、ポリメラーゼがプローブ配列を鋳型として使用することを防止するように機能する。
本明細書で使用される場合、「正規化する」、「正規化すること」、及び「正規化される」という用語は、測定されたシグナル（例えば、検出部分によって生成される検出可能なシグナル）の、既知で反復可能な値に対する、又は対照値に対するスケールへの変換を指す。
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送
達システムを指す。そのような送達システムには、反応試薬（例えば、適切な容器内のラベル、参照試料、支持材料等）及び／又は支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実行するための説明書等）のある場所から別の場所への保管、輸送、又は送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットは、関連する反応試薬及び／又は支持材料を含有する箱等の１つ以上の同封物を含み得る。「キット」という用語には、断片化されたキット及び組み合わされたキットの両方が含まれる。
本明細書で使用される場合、「断片化されたキット」という用語は、それぞれがキット全体の構成成分の下位部分を含有する、２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図されるレシピエントに一緒に又は別個に送達され得る。各々がキット全体の構成成分の下位部分を含有する、２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、「断片化されたキット」という用語の意味に含まれる。
本明細書で使用される場合、「組み合わされたキット」は、単一の容器（例えば、所望の構成成分の各々を収容する単一の箱）内に反応アッセイの構成成分の全てを含有する送達システムを指す。
本明細書において、列挙された数値に関する「約」という用語の使用は、列挙された数値及び列挙された値の±１０パーセント以内の数値を含むことが理解される。
本明細書において、一連の数値への言及時の「間」という用語の使用は、その範囲の各終点の数値を包含することが理解される。例えば、１０残基長～２０残基長のポリペプチドは、１０残基長のポリペプチド及び２０残基長のポリペプチドを含む。
本明細書における先行技術の文書、又はそれらの文書から派生した、若しくはそれらの文書に基づく本明細書の記載のいかなる記載も、これらの文書又は派生した記載が関連する当該技術の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。
別段記載されない限り、説明の目的で、本明細書に参照される全ての文書の全体が、これにより、参照により本明細書に組み込まれる。
略語
以下の略語が、本明細書及び本明細書全体を通して使用される。
ＬＯＣＳ：ステムに接続されたループ
ＭＮＡザイム：多成分核酸酵素、
パートザイム：オリゴヌクレオチドを含有する部分酵素、
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、
ｇＤＮＡ：ゲノムＤＮＡ
ＮＴＣ：鋳型なし対照
ｑＰＣＲ：リアルタイム定量化ＰＣＲ
Ｃｔ：閾値サイクル
Ｃｑ：定量化サイクル
Ｒ２：相関係数
ｎＭ：ナノモル
ｍＭ：ミリモル
μＬ：マイクロリットル
μＭ：マイクロモル
ｄＮＴＰ：デオキシリボヌクレオチド三リン酸
ＮＦ－Ｈ２Ｏ：無ヌクレアーゼ水、
ＬＮＡ：ロックされた核酸、
Ｆ：フルオロフォア、
Ｑ：クエンチャー、
Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、又はそれらの任意の類似体、
Ｎ’＝Ｎに相補的であるか、又はＮと塩基対合することができる任意のヌクレオチド。
（Ｎ）ｘ：任意の数のＮ、
（Ｎ’）ｘ：任意の数のＮ’、
Ｗ：Ａ又はＴ、
Ｒ：Ａ、Ｇ、又はＡＡ、
ｒＮ：任意のリボヌクレオチド塩基、
（ｒＮ）ｘ：任意の数のｒＮ、
ｒＲ：Ａ又はＧ、
ｒＹ：Ｃ又はＵ、
Ｍ：Ａ又はＣ、
Ｈ：Ａ、Ｃ、又はＴ、
Ｄ：Ｇ、Ａ、又はＴ、
ＪＯＥ又は６－ＪＯＥ：６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、
ＦＡＭ又は６－ＦＡＭ：６－カルボキシフルオレセイン、
ＢＨＱ１：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー１
ＢＨＱ２：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー２
ＲＴ－ＰＣＲ：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＡ：鎖置換増幅
ＮＥＡＲ：ニッキング酵素増幅反応
ＨＤＡ：ヘリカーゼ依存的増幅
ＲＰＡ：リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
ＬＡＭＰ：ループ媒介等温増幅
ＲＣＡ：ローリングサークル増幅
ＴＭＡ：転写媒介増幅
３ＳＲ：自家持続配列複製
ＮＡＳＢＡ：核酸配列ベースの増幅
ＬＣＲ：リガーゼ連鎖反応
ＲＡＭ：分岐増幅方法
ＩＢ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ
ＩＢＲ：Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ
ｓｈＲＮＡ：低分子ヘアピン型ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ｔＲＮＡ：転移ＲＮＡ
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ
ｓｔＲＮＡ：小分子一過性ＲＮＡ
ｓｍＲＮＡ：小分子調節性調節ＲＮＡ
プレマイクロＲＮＡ：前駆体マイクロＲＮＡ
プリマイクロＲＮＡ：一次マイクロＲＮＡ
ＬＨＳ：左側
ＲＨＳ：右側
ＤＳＯ：二本鎖オリゴヌクレオチド
Ｔｍ：融解温度
ＲＦＵ：相対蛍光単位
ＣＴ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ
ＮＧ：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ
ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴
ＧＮＰ：金ナノ粒子
以下の詳細な説明は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分詳細に本発明の例示的な実施形態を伝える。記載される様々な実施形態の特徴又は制限は、本発明の他の実施形態又は本発明全体を必ずしも制限するものではない。したがって、以下の詳細な説明は、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限するものではない。
本発明は、標的（例えば、核酸、タンパク質、分析物、化合物、分子等）の改善された多重化検出のための方法及び組成物に関する。本方法及び組成物は各々、様々な他の薬剤と組み合わせて使用することができる他のオリゴヌクレオチドレポーター、プローブ又は基質との、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる。
－レポーター、プローブ及び基質
本発明によれば、標的分子の多重検出は、多重検出アッセイにおけるプローブとしての使用に好適な別のオリゴヌクレオチドと組み合わせてＬＯＣＳを使用して促進される。
核酸標的の検出のための多くのオリゴヌクレオチドが説明されており、当該技術分野で周知である。ＬＯＣＳと組み合わせて使用することができる好適なオリゴヌクレオチドとしては、ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎ若しくは加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、及びキャプチャー／ピッチャープローブが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、標的又は標的アンプリコンに直接結合してそれらの検出を促進するが、ＭＮＡザイム基質及びキャプチャー／ピッチャーオリゴヌクレオチドは、それらが普遍的であり、任意の標的の検出に好適であり得るため、例外を提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、酵素媒介性の切断又は分解、例えば、ＭＮＡザイム基質及びＴａｑＭａｎ又は加水分解プローブに起因する標的の存在下で蛍光を生成する。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的又は標的アンプリコン（例えば、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブ）への結合によって誘導される立体構造変化の結果として、異なるレベルの蛍光シグナルを提供する。
ＴＯＣＥシステムでは、キャッチャーは、標的の存在下でのみ活性化及び放出されるピッチャーの結合及び伸長によって誘導される立体構造の変化の結果として蛍光を変化させる。
これらの種類のレポーターオリゴヌクレオチドのいずれか又は全ては、単一波長で測定される蛍光の変化を含むがこれらに限定されない、単一の検出部分に関連する変化の測定によって、複数の標的の検出を媒介するためにＬＯＣＳプローブと併用するのに好適である。
ＬＯＣＳと組み合わせるためのオリゴヌクレオチドは、標準プロトコルに従って合成さ
れ得る。例えば、それらは、保護基の除去、ホスホラミダイトの結合、キャッピング及び酸化を伴う順次合成サイクルにおいて、ヌクレオシド及び非ヌクレオシドホスホラミダイトを使用して、固相又は溶液相のいずれかで、及び任意選択で自動合成器デバイス内で、ホスホラミダイト化学によって合成され得る。代替的に、それらは商業的な供給源から購入されてもよい。ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎ又は加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、及びキャプチャー／ピッチャープローブを購入できる、又はそれ以外の方法で入手できる商業的供給源の非限定的な例としては、以下が挙げられる。ＭＮＡザイム基質は、ＳｐｅｅＤｘ（ｐｌｅｘｐｃｒ．ｃｏｍ）から購入することができ、ＴａｑＭａｎ及び加水分解プローブは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｅｒｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｒｉ－ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）から購入することができ、分子ビーコン及びスロッピービーコンは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）及びＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｔｒｉｌｉｎｋｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）から購入することができ、エクリプスプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）から購入することができ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）及びＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）から購入することができ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブは、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）から購入することができ、デュアルハイブリダイゼーションプローブは、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）及びＥｕｒｏｆｉｎｓ（ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から購入することができ、キャッチャーピッチャーアッセイは、Ｓｅｅｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｓｅｅｇｅｎｅ．ｃｏｍ）から購入することができる。
－ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド
本発明における使用のための例示的なＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを、図１に示す。示された例示的な無傷ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド（図１Ａ、ＬＨＳ）は、ループ領域、ステム領域、及びフルオロフォア（Ｆ）／クエンチャー（Ｑ）色素対を有する。フルオロフォア／クエンチャー対で例示されているが、当業者は、任意の他の好適な検出部分が、同じ目的で使用され得ることを認識するであろう。ループ領域は、標的又は標的アンプリコンの存在下での酵素切断又は分解に適した基質領域を含有する。無傷ＬＯＣＳ内のループの切断又は分解は、分割ＬＯＣＳ二重構造を生成する（図１Ｂ、ＲＨＳ）。
いくつかの実施形態では、無傷ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの融解温度（「Ｔｍ」）は、分割ＬＯＣＳ構造のＴｍよりも高い。
分子内結合は分子間結合よりも強いため、無傷のＬＯＣＳ構造のステム領域は一般に、分割、切断、又は分解されたＬＯＣＳオリゴヌクレオチド構造のステムよりも高温で融解する。例えば、無傷ＬＯＣＳ Ａのステムは、分割ＬＯＣＳステムが融解する温度であるＴｍ Ｂよりも高いＴｍ Ａで融解する（図１Ｂ）。分割ＬＯＣＳの融解を可能にするが無傷のＬＯＣＳの融解を可能にしない温度での蛍光の存在は、標的又は標的アンプリコンの存在を示す。図２に示される例示的なＬＯＣＳにおいて、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域の配列は、例えば、ＭＮＡザイム又は他の触媒核酸の基質であり得る。
本発明における使用に好適な例示的なＬＯＣＳは、触媒核酸の基質を含むループ領域を含有し得、これは図２に示されている。これらの実施形態では、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、任意の標的の検出に使用することができるユニバーサル基質を含む。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、ステム領域、フルオロフォアクエンチャー／色素対（本明細書に記載の代替の検出部分が使用され得る）、及びＭＮＡザイム等の触媒核酸のユニバーサル基質を含む介在ループ領域を含有する。ＭＮＡザイムは、標的を直接的に検出しても、標的増幅中に生成されたアンプリコンの検出に使用してもよい。ＭＮＡザイムは、パートザイムの標的センサーアームが各々、相補塩基対合により標的又は標的アンプリコンにハイブリダイズし、ＭＮＡザイムの活性触媒コアを形成するときに形成される。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、相補塩基対合によりＭＮＡザイムの基質結合アームにハイブリダイズし、ループ内の基質は、ＭＮＡザイムによって切断される。これは、無傷ＬＯＣＳのＴｍ Ａよりも低いＴｍ Ｂのステムを有する分割ＬＯＣＳ構造を生成する。Ｔｍ
Ｂを超えるがＴｍ Ａ未満である温度での蛍光シグナルの測定は、反応における標的の存在を示す。当業者は、標的がリアルタイムで又は反応の終了時に検出され得ることを認識するであろう。
図３に示される例示的な実施形態を参照すると、標準的な直鎖ＭＮＡザイム基質が示され、そのループ内にＭＮＡザイム基質を含む単一のＬＯＣＳプローブと組み合わせて使用される。直鎖ＭＮＡザイム基質及び単一のＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ（又は類似の）検出部分、例えば、特定のフルオロフォア（Ｆ）／クエンチャー（Ｑ）色素対で標識されてもよい。本明細書に記載の代替の検出部分が使用されてもよい。直鎖基質は、第１の標的の存在下で集合する第１のＭＮＡザイムによって切断可能な第１の基質配列を含む（図３Ａ）。第１の標的の存在下では、直鎖基質は第１のＭＮＡザイムにより切断され、広範囲の温度にわたり検出され得る蛍光の増加をもたらす。ＬＯＣＳは、そのループ内に、第２の標的の存在下で集合する第２のＭＮＡザイムによって切断可能な第２の基質配列を含む（図３Ｂ）。第２の標的の存在下では、ＬＯＣＳは切断され、無傷ＬＯＣＳの融解温度（Ｔｍ Ａ）よりも低いＴｍ Ｂで融解する分割ＬＯＣＳを生成する。Ｔｍ Ｂ未満の温度では、分割ＬＯＣＳのステム部分はハイブリダイズされたままであり、したがって、フルオロフォアは、クエンチャー分子に近接しているためにクエンチされる。Ｔｍ Ｂを超える温度では、分割ＬＯＣＳのステム部分が解離し、クエンチャー分子からフルオロフォアを分離して、蛍光の増加をもたらす。両方の標的が存在し、かつ蛍光がＴｍ Ｂ未満の第１の温度で測定される場合、蛍光の増加は、第１の標的１のみと関連付けられる。Ｔｍ Ｂを超えるがＴｍＡ未満である第２の温度で蛍光が測定される場合、蛍光の増加は、第１の標的及び／又は第２の標的と関連付けられる。標的１及び標的２の両方が存在する場合、第２の温度での増幅中の蛍光の観察される変化は第１の温度での変化よりも大きく、したがって、標的１、若しくは標的２、若しくは標的１及び２が反応中に存在するか、又はいずれの標的も反応中に存在しないかどうかの決定が可能となる。
本発明の他の実施形態では、標準レポータープローブとの組み合わせに有用な代替のＬＯＣＳ構造を使用することができる。図４Ａ及び図４Ｂに例示されるように、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域は、検出される標的に完全に又は部分的に相補的であり、かつ二本鎖の場合、エキソヌクレアーゼによる、例えば、ポリメラーゼに固有のエキソヌクレアーゼ活性による分解のための基質（図３Ａ）として機能することができる、標的特異的配列を含み得る。図３Ｂに示される更に別の実施形態では、ループ内の標的特異的配列は、二本鎖制限酵素認識部位の一本鎖を更に含み得る。標的配列へのループ配列のハイブリダイゼーションは、機能的で切断可能な制限部位をもたらし得る。好ましい実施形態では、制限酵素は、標的を無傷のまま残しながら、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ鎖を切断することができるニッキング酵素である。
本発明の様々な実施形態では、周知のレポータープローブ又は基質の異なる組み合わせを、単一の反応でＬＯＣＳプローブと組み合わせることができる。非限定的な例として、２つの標的の検出のための反応は、直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎ又は加水分解プローブ、分子ビーコン、スロッピービーコン、エクリプスプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、キャプチャー／ピッチャーオリゴヌクレオチド、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブを含むがこれらに限定されない群１から選択される第１のプローブ、並びにユニバーサルＭＮＡザイム基質を含むＬＯＣＳプローブ、エキソヌクレアーゼのための標的特異的基質を含むＬＯＣＳプローブ、及びニッキング酵素等のエンドヌクレアーゼのための標的特異的基質を含むＬＯＣＳプローブを含むがこれらに限定されない群２から選択される第２のプローブの任意の組み合わせを含み得る。
群１のプローブと群２のプローブとの任意の組み合わせを使用して、本発明の方法による単一の反応における複数の標的を測定することができる。図３に示される実施形態は、第１のＭＮＡザイムによって切断可能な直鎖ＭＮＡザイム基質と、第２のＭＮＡザイムによって切断可能なＬＯＣＳプローブとの例示的な組み合わせを示す。本発明の他の非限定的な実施形態を図５に示すが、非切断可能な分子ビーコンは、ＭＮＡザイムによって切断可能なＬＯＣＳプローブと組み合わされてもよい。分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ（又は類似の）検出部分、例えば、同じフルオロフォア又は類似の波長で発光するフルオロフォアで標識され得る。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する第１の標的１と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを有し得、Ｔｍ ＢはＴｍ Ａより高い。これは、Ｔｍ Ｃを有するステム領域と、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断され得るループ領域とを有し得る無傷ＬＯＣＳプローブと組み合わせることができ、したがって、Ｔｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し、Ｔｍ ＤはＴｍ Ｃ未満である。標的１及び／又は標的２の存在は、リアルタイムで２つの温度で蛍光を測定するか、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅の後に取得される個別の測定値を使用することによって区別することができる。
－リバーシブルプローブを含むＬＯＣＳの組み合わせ
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、温度によって可逆的に調節され得る標的依存的な検出可能なシグナルを生成することができるＬＯＣＳ及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。更に、ＬＯＣＳ及びオリゴヌクレオチドプローブは、温度による標的非依存的シグナル生成の調節に適し得るため、バックグラウンドノイズ又はベースラインレベルの操作を可能にする。
例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なシグナルの放出が抑制される標的の不在下での第１の立体構造又は配置、及び標的の存在を示す検出可能なシグナルの放出を促進する標的の存在下での第２の立体構造又は配置を採用してもよい。このカテゴリのオリゴヌクレオチドプローブの非限定的な例には、分子ビーコン、スロッピービーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブ、及びキャプチャー／ピッチャーオリゴヌクレオチドが含まれる。
代替的に、デュアルハイブリダイゼーションプローブの場合、ＬＯＣＳに加えて２つの追加のオリゴヌクレオチドが、標的の存在下で検出可能なシグナルが抑制され、標的が存在しない場合に検出可能なシグナルが生成される配置を採用してもよい。
上記の実施形態では、無傷ＬＯＣＳは、標的依存的切断イベントを受けて分割ＬＯＣＳを提供する。分割ＬＯＣＳの二本鎖ステム部分は、第１のオリゴヌクレオチド及び関連する検出可能なシグナルの立体構造又は配置の標的依存的変化が生成される温度とは異なる温度で解離するように設計することができる。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、分子ビーコンである。以下のシナリオは、本発明の実施形態による多重検出アッセイの非限定的な例を提供する。これらのシナリオでは、分子ビーコンは、それぞれ標的１及び標的２の検出のためのＬＯＣＳと組み合わせて使用することができる。分子ビーコンは、その二本鎖ステム部分の融解温度であるＴｍ Ａと、その一本鎖ループ二重構造と標的１との間に形成される二重構造の融解温度であるＴｍ Ｂとを有してもよい。ＬＯＣＳは、無傷時のその二本鎖ステム部分の融解温度であるＴｍ Ｃと、分割時のその二本鎖ステム部分の融解温度であるＴｍ Ｄとを有してもよい。分子ビーコンの二本鎖ステム部分の対向鎖は、ＬＯＣＳのものと同様に、フルオロフォア及びクエンチャーで標識されてもよい。分子ビーコンのフルオロフォアは同じであってもよく、又はＬＯＣＳのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの領域で発光してもよい。代替の実施形態では、例えば、比色検出又はＳＰＲ検出のための同じ又は類似のサイズ及び／又は種類のナノ粒子、化学発光検出のための反応性部分（例えば、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ酵素）、電気化学検出のための電気活性種（例えば、フェロセン、メチレンブルー又はペルオキシダーゼ酵素）を含む、異なる検出部分が利用され得る。当業者は、これらの場合における分子ビーコンが、スロッピービーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ、又はＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブで置換され得ることを容易に理解するであろう。
反応が測定される温度と、レポータープローブの様々な領域の融解温度との間に、様々な関係が存在し得る。４つのシナリオを、１つの分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳプローブを含む反応の文脈内で以下に詳細に説明し、そのようなシナリオのための非限定的な例示的な温度を以下の表１に概説する。
Figure 0007636448000001
シナリオ１
第１の非限定的な例では、Ｔｍ Ａは、Ｔｍ Ｄより高くてもよく、Ｔｍ Ｂは、Ｔｍ
Ｄより高くてもよい。標的１及び／又は標的２の存在は、増幅の開始時又はその近く、及び増幅後に取得された２つの温度での蛍光を測定することによって識別することができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｄ未満であり得る第１の温度１での蛍光の測定は、標的１のみの存在を示すシグナルを生成し得る。この温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、蛍光を発するが、標的１の不在下では、そのステムは内部ハイブリダイゼーションされたままであり、したがってクエンチされる。温度１では、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれぞれのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、標的１及び／又は標的２の存在下で、温度１及びＴｍ Ｄの両方より高いが、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｃの両方より低い第２の温度２での蛍光の測定は、標的１及び／又は標的２の存在を示し得る。この第２の温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、蛍光を発するが、標的１の不在下では、そのステムは内部ハイブリダイゼーションされたままであり、したがってクエンチされる。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷でクエンチされたままであるが、標的２に特異的なＭＮＡザイム（存在する場合）によって分割され、そのステムが解離して蛍光を生成する。このシナリオでは、増幅中に温度１での蛍光が増加する場合、これは標的１が存在することを示す。更に、増幅の過程で温度２で観察された蛍光の増加が温度１で観察されたものよりも大きい場合、これは標的２が存在することを示す。
シナリオ２
第２の非限定的な例では、Ｔｍ Ａは、Ｔｍ Ｄに類似してもよく、Ｔｍ Ｂは、Ｔｍ
Ｃに類似してもよく、Ｔｍ Ｂは、Ｔｍ Ｄより高くてもよい。標的１及び／又は標的２の存在は、２つの温度での蛍光をリアルタイムで測定すること、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅後に取得された単一の測定値を使用することによって識別することができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ未満、及びＴｍ Ｂ未満、及びＴｍ Ｄ未満であり得る第１の温度１での蛍光の測定は、標的１のみの存在を示すシグナルを生成し得る。この温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、蛍光を発するが、そのステムは、標的１の不在下で内部ハイブリダイゼーションされたままであり、クエンチされる。この第１の温度１では、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのステム領域のハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、標的１及び／又は標的２の存在下で、温度１及びＴｍ Ａ及びＴｍ Ｄのいずれよりも高いが、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｃの両方より低い第２の温度２での蛍光の測定は、標的２の存在を示し得る。この第２の温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、蛍光を発するか、又はこの温度でのそのステムの解離及び開放に起因して標的非依存的に蛍光を発する。そのため、分子ビーコンは、いずれかの標的の存在又は不在にかかわらず蛍光を発し、この温度でのバックグラウンド蛍光レベルを与え、増幅中に変化しない場合がある。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷でクエンチされたままであるが、標的２に特異的なＭＮＡザイム（存在する場合）によって分割され、そのステムが解離し、したがって蛍光を生成する。このシナリオでは、増幅中に温度１での蛍光が増加する場合、これは、標的１が存在し、分子ビーコンによって検出されることを示し、増幅中の温度２での蛍光の増加は、標的２が存在し、ＬＯＣＳプローブによって検出されることを示す。定性的データは、ＰＣＲの開始時／その近く、及び終了時に離散的な温度測定値を使用して取得することができ、かつ／又は定量的データは、ＰＣＲ中に各温度で生成された２つの増幅曲線から直接読み取ることができる。代替的に、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄが類似していない場合には、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄの両方が温度１より高く、温度２より低い場合、２つの温度での蛍光レベルと、標的の存在又は不在との間の同じ関係が保持される。
上記のアプローチは、例えば、ＴＯＣＥ等の単一波長で複数の標的を区別するために、複数の温度での測定を利用する当該技術分野で知られている他の方法よりも大きな利点を提供し得る。ＴＯＣＥは、第１の温度で第１の標的からの蛍光を測定し、第２の温度で２つの標的（第１の標的＋第２の標的）からの蛍光を測定する。このデータは、複雑な分析において第２の標的を定量化するために、第２の温度での第１の標的に関連する蛍光の量を数学的に減算するように分析され、これには更に、温度自体に関連する蛍光の固有の差を考慮するための調整が必要である。本明細書に記載の本発明の実施形態は、第１の温度で生成された第１の増幅曲線からの第１の標的の直接的な定量化、及び第２の温度で生成された第２の増幅曲線からの第２の標的の直接的な定量化を可能にするため、複雑なＰＣＲ後分析の必要性をなくす方法で、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブを利用する。これらの実施形態は、各標的を個々に測定し、更に、各標的は、データ取得のために選択された２つの温度のうちの１つでバックグラウンドより上で検出可能なシグナルのみを生成するため、同じ分子の蛍光出力の差を考慮するための調整の必要はない。
シナリオ３
第３の非限定的な例では、Ｔｍ Ａは、Ｔｍ Ｄより低くてもよく、Ｔｍ Ｂは、Ｔｍ
Ｄに類似してもよく、Ｔｍ Ｃは、Ｔｍ Ｂより高くてもよい。標的１及び／又は標的２の存在は、２つの温度での蛍光をリアルタイムで測定すること、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅後に取得された単一の測定値を使用することによって識別することができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ未満、及びＴｍ Ｂ未満、及びＴｍ Ｄ未満であり得る第１の温度１での蛍光の測定は、標的１のみの存在を示すシグナルを生成し得る。この温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、蛍光を発するが、そのステムは、標的１の不在下で内部ハイブリダイゼーションされたままであり、クエンチされる。この温度１では、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれらのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、標的１及び／又は標的２の存在下で、温度１及びＴｍ Ｄ及びＴｍ
Ａ及びＴｍ Ｂのいずれよりも高いが、Ｔｍ Ｃより低い第２の温度２での蛍光の測定は、標的２の存在を示し得る。この第２の温度では、分子ビーコンは標的１にハイブリダイゼーションすることができず、常に開放された解離したステムを有し、したがって、いずれかの標的の存在又は不在にかかわらず蛍光を発し、この温度でのバックグラウンド蛍光レベルを与え、増幅中に変化しない場合がある。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷でクエンチされたままであるが、標的２に特異的なＭＮＡザイム（存在する場合）によって分割され、そのステムが解離し、したがって蛍光を生成する。このシナリオでは、増幅中に温度１での蛍光が増加する場合、これは、標的１が存在し、分子ビーコンによって検出されることを示し、温度２での蛍光の増加は、標的２が存在し、ＬＯＣＳプローブによって検出されることを示す。定性的データは、ＰＣＲの開始時／その近く、及び終了時に離散的な温度測定値を使用して取得することができ、かつ／又は定量的データは、ＰＣＲ中に各温度で生成された２つの増幅曲線から直接読み取ることができる。代替的に、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄが類似する、又はＴｍ ＡがＴｍ Ｄより高い場合には、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄの両方が温度１より高く、温度２より低い場合、２つの温度での蛍光レベルと、標的の存在又は不在との間の同じ関係が保持される。
シナリオ４
第４の非限定的な例では、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂの両方が、Ｔｍ Ｃ及びＴｍ Ｄより高くてもよい。標的１及び／又は標的２の存在は、増幅の開始時又はその近く、及び増幅後に取得された２つの温度での蛍光を測定することによって識別することができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂ未満であるがＴｍ Ｃ及びＴｍ Ｄ超であり得る第１の温度１での蛍光の測定は、標的１の存在を示すシグナルを生成し得る。この温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションさ
れ、蛍光を発するが、そのステムは、標的１の不在下で内部ハイブリダイゼーションされたままであり、それはクエンチされる。この温度では、ＬＯＣＳは、標的２の存在又は不在にかかわらず蛍光を発するため、増幅中に変化しないバックグラウンドにのみ寄与する。標的２の不在下では、無傷ＬＯＣＳのステムは解離して蛍光を発し、同様に、標的２の存在下では、分割ＬＯＣＳのステムは解離して蛍光を発する。更に、温度１未満であり、Ｔｍ Ｃ及びＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂ未満であるが、Ｔｍ Ｄより高い温度２での増幅過程中の蛍光の増加は、標的１及び／又は標的２の存在を示し得る。この第２の温度では、分子ビーコンは標的１（存在する場合）にハイブリダイゼーションされ、したがって蛍光を発するか、又は標的１の不在下でハイブリダイゼーションされたステムでクエンチされたままである。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、無傷ＬＯＣＳプローブステムはハイブリダイゼーション及びクエンチされたままであるか、又は標的２が存在する場合、ＬＯＣＳは標的２に特異的なＭＮＡザイムによって分割され、分割ＬＯＣＳのステムは解離して蛍光を発する。このシナリオでは、増幅中に温度２での蛍光が増加する場合、これは、標的１及び／又は標的２が存在することを示す。更に、温度２で増幅の過程で観察された蛍光の増加が温度１で観察されたものよりも大きい場合、これは標的２が存在することを示す。
－キャッチャー－ピッチャープローブを含むＬＯＣＳの組み合わせ
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ＬＯＣＳ及びＴＯＣＥアッセイのキャッチャー構成成分として機能する第１のオリゴヌクレオチドの組み合わせを含み得る。この組み合わせは、例えば、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを取得することによって、単一の蛍光チャネル内の２つの標的の同時検出及び定量化を可能にし得る。代替的に、リアルタイムモニタリングが存在しない場合、アプローチは、例えば、増幅の開始時の又はその近く、及び増幅後の離散的な時点で収集された蛍光データに適用することができる。
一実施形態では、キャッチャーを含む第１のオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳプローブと組み合わせることができ、これらの両方は、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識され得る。反応はまた、キャッチャーに相補的な５’タグ領域、及び第１の標的１に相補的な３’センサー領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを含むピッチャーを含んでもよい。キャッチャーは、５’末端にクエンチャーで標識された一本鎖オリゴヌクレオチド、及びクエンチャーの下流にあるフルオロフォア、及びピッチャーのタグ部分に相補的である３’領域を含んでもよい。キャッチャーが一本鎖立体構造にある場合、フルオロフォアはクエンチャーと近接し、シグナルはクエンチされる。
ＰＣＲ等の増幅反応の非限定的な例を挙げると、ピッチャーのプライマー及び３’センサー領域は、標的１にハイブリダイズし得る。標的１又はそのアンプリコンを鋳型として使用したプライマー伸長中、ピッチャーは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解され、タグ部分の放出をもたらし得る。次いで、放出されたタグは、キャッチャーの相補的な３’部分にハイブリダイズし得、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得、したがって、フルオロフォア及びクエンチャーが分離され、標的１の存在を示す増加した蛍光をもたらす、Ｔｍ Ａとの二本鎖キャッチャー二重構造を生成し得る。更に、反応は、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断され得る、Ｔｍ Ｃを有するステム領域及びループ領域を有する無傷ＬＯＣＳプローブを含有して、Ｔｍ Ａより低いＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成することができる。反応が測定される温度と、キャッチャー二重構造及びＬＯＣＳレポーターの融解温度との間に、様々な関係が存在し得る。３つのシナリオを、１つのキャッチャープローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを含む反応の文脈内で以下に詳細に説明し、そのようなシナリオのための非限定的な例示的な温度を以下の表２に概説する。
Figure 0007636448000002
第１の非限定的なシナリオでは（表２を参照されたい）、シグナルが、標的１の存在下で、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｃ、及びＴｍ Ｄより低い第１の検出温度で測定される場合、キャッチャー二重構造が形成されて蛍光を発し得るが、標的１の不在下では、一本鎖キャッチャーは、クエンチされたままである。この温度では、無傷及び分割ＬＯＣＳのステムの両方がハイブリダイズされ、したがって、標的２の存在又は不在にかかわらずクエンチされる。したがって、増幅中の蛍光の増加は、標的１を示す。更に、Ｔｍ Ｄより高いが、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｃより低い第２の検出温度での蛍光測定は、標的１及び／又は標的２の存在を示し得る。この第２の温度では、キャッチャーは、標的の不在下では一本鎖のままであり、クエンチされ、標的の存在下では二重構造を形成し、蛍光を発する。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷でクエンチされたままであるが、標的２の存在下では切断され、そのステムが解離して蛍光を生成する。このシナリオでは、増幅中に温度１での蛍光が増加する場合、これは標的１が存在することを示す。更に、増幅の過程で温度２で観察された蛍光の増加が温度１で観察されたものよりも大きい場合、これは標的２が存在することを示す。第１の温度ではなく第２の温度での蛍光の増加は、標的２のみが存在することを示す。
第２の非限定的なシナリオ（表２を参照されたい）では、第１の検出温度での第１の標的の特異的検出は、上記のシナリオ１に従って達成され得る。更に、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄより高いがＴｍ Ｃより低い第２の検出温度では、キャッチャー二重構造が形成され得る温度よりも高いため、キャッチャー二重構造は、標的１及び／又は標的２の存在又は不在にかかわらず解離され（すなわち、一本鎖）、クエンチされる。標的２の不在下では、全てのＬＯＣＳは無傷でクエンチされるが、標的２が存在する場合、分割ＬＯＣＳが生成され、それらのステムは解離し、蛍光の増加が観察され得る。したがって、第１の温度でのＰＣＲ中の蛍光の増加は、標的２の存在又は不在にかかわらず、標的１の存在を示し、逆に、第２の温度でのＰＣＲ中の蛍光の増加は、標的１の存在又は不在にかかわらず、標的２の存在を示す。したがって、ＬＯＣＳ及びキャッチャー－ピッチャープローブの組み合わせは、第１の温度でのバックグラウンドを超える蛍光の増加によって監視されるように、キャッチャー－ピッチャープローブを使用してのみ標的１の検出を可能にすることができ、また第２の温度でのバックグラウンドを超える蛍光の増加によって監視されるように、ＬＯＣＳプローブを使用してのみ標的２の検出を可能にし得る。
第３の非限定的なシナリオでは（表２を参照されたい）、シグナルが、標的１のみの存在下で、Ｔｍ Ａより低いがＴｍ Ｃ及びＴｍ Ｄより高い第１の検出温度で測定される場合、キャッチャー二重構造が形成されて蛍光を発し得るが、標的１の不在下では、一本鎖キャッチャーは、クエンチされたままである。この温度では、無傷及び分割ＬＯＣＳのステムの両方が解離され、標的２の存在又は不在にかかわらず、高レベルのバックグラウンド蛍光を生成する。したがって、増幅中のバックグラウンド蛍光を上回る蛍光の増加は、標的１のみを示す。更に、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｃより低いが、Ｔｍ Ｄより高い第２の検出温度での蛍光測定は、標的２のみの存在を示し得る。この第２の温度では、キャッチャーは、標的の不在下では一本鎖のままであり、クエンチされ、標的の存在下では二重構造を形成し、蛍光を発する。更に、この第２の温度では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷でクエンチされたままであるが、標的２の存在下では切断され、そのステムが解離して蛍光を生成する。このシナリオでは、増幅中に温度１での蛍光が増加する場合、これは標的１のみの存在を示し、増幅中に温度２での蛍光が増加する場合、これは標的２のみの存在を示す。
別の非限定的な形式、例えば、ＳＰＲによる検出では、キャッチャーは金ナノ粒子（ＧＮＰ）に結合され、溶液中で遊離し得るが、一方、ピッチャーは、金表面に結合され得る。標的１の存在下、及びＴｍ Ａ未満の温度で、キャッチャー二重構造が形成し、ＧＮＰ
を、ＳＰＲシグナルの測定可能なシフトを生成する金表面に近接させることができる。しかしながら、標的１の不在下では、キャッチャーは、一本鎖であり、かつ溶液中で遊離しており（すなわち、金表面に近接していない）、したがって、ベースラインＳＰＲシグナルを上回るＳＰＲシグナルの任意の測定可能なシフトを生成しない。したがって、この温度でのＳＰＲシグナルの任意の測定可能なシフトは、試料中の標的１の存在を示す。更に、ＬＯＣＳは、一端でＧＮＰに結合され、他端で金表面に結合されてもよい。標的２の不在下では、ＧＮＰは常に結合しているが、一方標的２の存在下では、分割ＬＯＣＳが生成され、したがってこの場合、ＧＮＰは、検出温度が分割ＬＯＣＳの温度未満である場合にのみ金表面に近接する。前述のように、上記のシナリオ２に類似するシナリオでは、第１の検出温度がＴｍ Ｂ、Ｔｍ Ｃ、及びＴｍ Ｄ未満である場合、シグナルの変化は、キャッチャー上のＧＮＰが金表面に近接するため、標的１の存在を示す。第２の検出温度がＴｍ Ｃ未満であるが、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄを上回る場合、分割ＬＯＣＳ上のＧＮＰが金表面から離れるため、シグナルの変化は、標的２の存在を示す。
更に別の形式、例えば比色検出では、キャッチャー及びＬＯＣＳプローブの両方が、両端でＧＮＰで標識されてもよい。次いで、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｃ及びＴｍ Ｄ未満の第１の温度で、標的１の存在は、標的２の存在又は不在にかかわらず、紫色（凝集したＧＮＰ）から赤色（分散したＧＮＰ）への測定可能な色変化をもたらす。次いで、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｄを上回るがＴｍ Ｃ未満である第２の温度で、標的２の存在は、標的１の存在又は不在にかかわらず、紫色（凝集したＧＮＰ）から赤色（分散したＧＮＰ）への測定可能な色変化をもたらす。
更に別の形式では、キャッチャーは、メチレンブルー又はフェロセン等の電気活性部分で標識され得、ピッチャーは電極表面に結合され得る。第１の温度（Ｔｍ Ａ未満）では、キャッチャー二重構造は、電極表面（標的１が存在する場合）上に形成され、電気活性部分を電極表面に近接させ、電気化学的シグナルの測定可能なシフト（すなわち、酸化又は還元電流）を生成する。しかしながら、標的１の不在下では、キャッチャーは、溶液中で遊離し、電極表面に近接しておらず、したがって、ベースラインシグナルを上回る電気化学的シグナルのいかなる測定可能なシフト（すなわち、酸化又は還元電流）も生成しない。したがって、この温度での電気化学的シグナルの任意の測定可能なシフトは、試料中の標的１の存在を示す。
－デュアルハイブリダイゼーションプローブと組み合わされたＬＯＣＳ
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ＬＯＣＳと２つの標的特異的構成成分を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせを含む。
デュアルハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ Ａを有する第１のオリゴヌクレオチド、及びＴｍ Ｂを有する第２のオリゴヌクレオチドを含有し得、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂは等しくてもよく、又はＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂは異なってもよい。第１のオリゴヌクレオチドは、その３’末端でフルオロフォアで標識されてもよく、第２のオリゴヌクレオチドは、その５’末端でクエンチャーで標識されてもよい。（代替的に、一方のオリゴヌクレオチドがその３’末端でクエンチャーで標識され、他方がその５’末端でフルオロフォアで標識されてもよい。）２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的１上で隣接又は実質的に隣接して（例えば、２、３、４、又は５ヌクレオチドギャップ未満で）ハイブリダイズし、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂのいずれか低い方に等しいＴｍを有する二重構造構造を形成する。このシナリオでは、データ取得のための好適な第１の温度は、Ｔｍ Ａ及びＴｍ
Ｂ未満、かつＴｍ Ｃ及びＴｍ Ｄ未満、すなわち、それぞれ、無傷ＬＯＣＳ及び分割ＬＯＣＳのステムのＴｍであり得る。この第１の温度では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、増幅前の溶液及び蛍光中、又は標的１の不在下では遊離しているが、存在する場合、標的１へのハイブリダイゼーションは、フルオロフォア及びクエンチャーを近接さ
せてクエンチを引き起こす。更に、第１の温度では、無傷及び分割ＬＯＣＳのステムの両方がクエンチされる。したがって、第１の温度で観察される蛍光の減少は、標的２の存在又は不在にかかわらず、標的１の存在を示す。
ＬＯＣＳプローブは、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断されてもよく、データ取得は、Ｔｍ Ａ及び／又はＴｍ Ｂ超、Ｔｍ Ｄ超であるがＴｍ Ｃ未満の第２の温度で行われてもよい。このシナリオでは、無傷ＬＯＣＳは、増幅前及び標的の不在下でクエンチされたままであるが、標的２の存在下では、分割ＬＯＣＳステムは解離し、蛍光の増加をもたらす。この温度では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、この温度で標的１にハイブリダイゼーションすることができないため、標的１の存在又は不在にかかわらず、蛍光を発する。この蛍光は、この温度でのバックグラウンドシグナルに寄与する。したがって、増幅後のバックグラウンドを上回る蛍光の増加は、標的１の存在又は不在にかかわらず、標的２の存在を示す。
したがって、この組み合わせは、第１の温度での蛍光の減少として決定されるデュアルハイブリダイゼーションプローブを使用した標的１の検出と、第２の温度での蛍光の増加によって決定されるＬＯＣＳプローブを使用した標的２のみの検出とを可能にする。
別の形式、例えば、ＳＰＲによる検出では、第１のオリゴヌクレオチドは金ナノ粒子（ＧＮＰ）に結合され得、第２のオリゴヌクレオチドは金表面に結合され得る。第１の温度では、２つのオリゴヌクレオチドプローブは、（存在する場合）標的１上で隣接してハイブリダイズし、二重構造構造を形成し、ＧＮＰを金表面に近接させることができ、これは、ＳＰＲシグナルの測定可能なシフトを生成し得る。しかしながら、標的１の不在下では、第１のオリゴヌクレオチドは、溶液中に遊離してもよく、金表面に近接していなくてもよく、したがって、ベースラインＳＰＲシグナルを上回るＳＰＲのシグナルのいかなる測定可能なシフトも生成しない。したがって、この温度でのＳＰＲシグナルの任意の測定可能なシフトは、試料中の標的１の存在を示し得る。
更に別の形式、例えば比色検出では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの両方が、金ナノ粒子で標識されてもよい。第１の温度では、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離し、標的１の不在下で赤色を呈してもよい。しかしながら、標的１の存在下では、２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的上で隣接してハイブリダイズし、二重構造構造を形成し、ＧＮＰを互いに近接させ、赤色から紫色への測定可能な色変化を生成し得る。したがって、赤色から紫色への測定可能な色の変化は、試料中の標的１の存在を示し得る。
更に別の形式では、第１のオリゴヌクレオチドは、メチレンブルー又はフェロセン等の電気活性部分で標識され得、第２のオリゴヌクレオチドは電極表面に結合され得る。第１の温度では、２つのオリゴヌクレオチドプローブは、（存在する場合）標的１上で隣接してハイブリダイズし、電極表面上で二重構造構造を形成し、電気活性部分を電極表面に近接させ、電気化学的シグナルの測定可能なシフト（すなわち、酸化又は還元電流）を生成し得る。しかしながら、標的１の不在下では、第１のオリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離し得、電極表面に近接しておらず、したがって、ベースラインシグナルを上回る電気化学的シグナルのいかなる測定可能なシフト（すなわち、酸化又は還元電流）も生成しない。したがって、この温度での電気化学的シグナルの任意の測定可能なシフトは、試料中の標的１の存在を示し得る。
－消化可能なプローブを含むＬＯＣＳの組み合わせ
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、温度によって可逆的に調節され得ない標的依存的な検出可能なシグナルを生成するＬＯＣＳ及びオリゴヌクレオチドプロ
ーブの組み合わせを含む。しかしながら、ＬＯＣＳは、標的非依存的方法での温度によるシグナル生成の変調に適したままであり、したがって、バックグラウンドノイズ又はベースラインレベルの操作を可能にする。
例えば、第１の標的１の第１のオリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なシグナルを提供する標的依存的修飾を受けてもよく、これは、検出温度を変更する際に抑制することができない。標的依存的修飾は、第１のオリゴヌクレオチドの切断又は消化であってもよく、それによって、標的の存在を示す検出可能なシグナルをトリガする。このカテゴリのオリゴヌクレオチドプローブの非限定的な例には、ＴａｑＭａｎプローブ、ＭＮＡザイム基質、及び標的依存的方法で制限酵素によって切断可能なプローブが含まれる。修飾後、これらのプローブによって生成されたシグナルは、広範囲の温度で測定することができる。
これらの実施形態では、第２の標的２を検出するように設計された無傷ＬＯＣＳは、この標的の存在下でのみ分割ＬＯＣＳを生成するための切断を受けることができる。標的２の測定には、無傷のＬＯＣＳのステムのＴｍ未満であるが、分割ＬＯＣＳのステムのＴｍ超の温度での検出が必要である。対照的に、第１の標的が検出される温度は、無傷及び分割ＬＯＣＳの両方のステムのＴｍ未満であるか、又は無傷及び分割ＬＯＣＳの両方のステムのＴｍ超であるかのいずれかであり得る。第１の検出温度がステムのＴｍ未満である場合、無傷及び／又は分割ステムの両方が会合及びクエンチしたままであるため、バックグラウンドシグナルは抑制され、一方、第１の検出温度がステムのＴｍ超である場合、無傷及び／又は分割ステムの両方の解離により、バックグラウンドシグナルはより高くなる。したがって、第１の温度でのシグナルの検出は、標的２の存在又は不在にかかわらず、標的１に対して特異的であり得る。第２の温度でのシグナルの検出は、標的１及び／又は標的２の存在を示すが、第２の温度で観察されるシグナルの増加が、第１の温度で観察されるものよりも大きい場合、これは、標的２が存在することを示す。シグナルの変化が第２の温度でのみ観察され、第１の温度では観察されない場合、これは、第２の標的のみの存在を示す。
以下のシナリオは、本発明の実施形態による多重検出アッセイの非限定的な例を提供し、以下の表３に要約される。これらのシナリオでは、ＬＯＣＳは、無傷時のその二本鎖ステム部分の融解温度であるＴｍ Ａと、分割時のその二本鎖ステム部分の融解温度であるＴｍ Ｂとを有してもよい。オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＭＮＡザイム基質）は、ＬＯＣＳの二本鎖ステム部分の対向鎖と同様に、フルオロフォア及びクエンチャーで標識されてもよい。オリゴヌクレオチドプローブのフルオロフォアは同じであってもよく、又はＬＯＣＳのフルオロフォアと同じ可視スペクトルの領域で発光してもよい。代替の実施形態では、例えば、比色検出若しくはＳＰＲ検出のための同じ若しくは類似のサイズ及び／若しくは種類のナノ粒子、化学発光検出のための反応性部分（例えば、アルカリホスファターゼ若しくはペルオキシダーゼ酵素）、又は電気化学検出のための電気活性種（例えば、フェロセン、メチレンブルー若しくはペルオキシダーゼ酵素）を含む、異なる検出部分が利用され得る。当業者は、オリゴヌクレオチドプローブが、例えば、ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ、加水分解プローブ、又は標的依存的に制限酵素によって切断可能なプローブ（ＲＥプローブ）であり得ることを容易に理解するであろう。
第１の標的の存在又は不在によるシグナルの変化は、第１の温度でのＰＣＲへの増幅の開始時又はその近く（ＰＣＲ前）で取得されたバックグラウンド蛍光に対して正規化された、その同じ第１の温度での増幅後（ＰＣＲ後）の蛍光を測定することにより得ることができ、一方、第２の標的の存在又は不在によるシグナルの変化は、第２の温度でＰＣＲ前に測定されたバックグラウンド蛍光に対して正規化された、その第２の温度でのＰＣＲ後の全蛍光を取得することによって得ることができる。代替的に、第１及び第２の標的のそ
れぞれの存在又は不在によるシグナルの変化は、第１及び第２の温度での増幅後の全蛍光を測定することによって得ることができ、これらは両方とも、同じ反応のＰＣＲ前に、又は同等であるが標的を欠くことが知られている対照反応での任意の時点に取得された第３の温度でのバックグラウンド蛍光に対して正規化され得る。バックグラウンドの測定は、第１の温度が第２の温度未満であり、かつ第３の温度が無傷ステムのＴｍ未満である場合、第３の温度で行われ得る。
全てのシナリオにおいて、第１の標的を示すシグナルの存在又は不在は、例えば、ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ又はＲＥプローブであり得る第１のプローブを使用して、第１の温度で測定される。増幅の前に、このプローブはクエンチされるが、標的１が存在する場合、プローブは増幅中に切断され、第１及び第２の温度の両方で検出可能な蛍光の増加をもたらす。第２の標的の存在又は不在は、ＬＯＣＳプローブを使用して第２の温度で決定され、第２の温度は、常に分割ＬＯＣＳのＴｍ（Ｔｍ Ｂ）超であるが、無傷ＬＯＣＳのＴｍ（Ｔｍ Ａ）未満である。
Figure 0007636448000003
シナリオ１．
第１の非限定的な例では、表３に記載されるように、第１の温度は、第２の温度より低く、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂより低い。第１の温度での蛍光の増加は、標的１の存在を示し、バックグラウンドシグナルは、クエンチされたＬＯＣＳの存在を反映しており、無傷及び／又は分割ステムの両方が会合したままである。第１の温度及び第２の温度におけるバックグラウンドは、それぞれ、各温度においてＰＣＲの前に測定されてもよい。代替的に、バックグラウンド測定は第３の温度で測定されてもよく、第３の温度は、第１及び第２の温度の両方を下回る。
シナリオ２
第２の非限定的な例では、表３に記載されるように、第１の温度は、第２の温度より高く、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂより高い。第１の温度での蛍光の増加は、標的１の存在を示し、バックグラウンドシグナルは、解離されたステムを有する無傷及び／又は分割ＬＯＣＳからの蛍光を反映している。第１の温度及び第２の温度におけるバックグラウンドは、それぞれ、各温度においてＰＣＲの前に測定されてもよい。
シナリオ３
第３の非限定的な例では、表３に記載されるように、第１の温度は、第２の温度より低く、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂより低い。第１の温度での蛍光の増加は、標的１の存在を示し、バックグラウンドシグナルは、クエンチされたＬＯＣＳの存在を反映しており、無傷及び／又は分割ステムの両方が会合したままである。第１の温度及び第２の温度におけるバックグラウンドは、それぞれ、各温度においてＰＣＲの前に測定されてもよい。代替的に、バックグラウンド測定は、第３の温度で測定されてもよく、第３の温度は、第２の温度未満であるが、第１の温度を超える。
他の形式、例えば、ＳＰＲによる検出では、第１のオリゴヌクレオチド及びＬＯＣＳプローブは、一端で金ナノ粒子（ＧＮＰ）に結合され得、他端で金表面に結合され得る。標的の不在下では、第１のオリゴヌクレオチドは無傷のままであり得、ＧＮＰは金表面に近接しており、ベースラインレベルのＳＰＲシグナルを生成する。標的１の存在下では、第１のオリゴヌクレオチドを切断することができ、ＧＮＰを金表面から分離し、ＳＰＲシグナルの測定可能なシフトを生成し、試料中の第１の標的の存在を示す。これは、無傷又は分割ＬＯＣＳのいずれかに結合又は会合したＧＮＰが表面上に残留し得るように、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂ未満の第１の温度で測定され得る。分割ＬＯＣＳのＴｍを超える第２の温度でのＳＰＲシグナルの変化の測定は、第１及び／又は第２の標的の存在を示し得る。更に、第１の温度でシグナルの変化が観察され、第２の温度でより大きな変化が観察された場合、これは標的２の存在を示す。代替的に、第２の温度でシグナルが検出されたが、第１の温度では検出されなかった場合、これもまた第２の標的のみを示す。
別の形式、例えば比色検出では、第１のオリゴヌクレオチドプローブ及びＬＯＣＳは、両端で金ナノ粒子で標識されてもよい。Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂ未満の第１の温度では、第１のオリゴヌクレオチドは標的１の不在下で無傷のままであり得、ＧＮＰは互いに近接した凝集状態にあり得、紫色を呈し得る。しかしながら、第１のオリゴヌクレオチドは、標的１の存在下で切断され得、ＧＮＰを分離し、紫から赤への測定可能な色の変化を示し得る。したがって、紫色から赤色への測定可能な色の変化は、試料中の標的１の存在を示し得る。第１の温度を超え、Ｔｍ Ｂを超えるがＴｍ Ａ未満である第２の温度では、第２の標的の存在下でのみ、ＬＯＣＳが分割され得、ＧＮＰは分散状態であり、色は紫色から赤色に変化する。両方の標的が存在する場合、色のシフトはより激しくなり得る。
更に別の形式では、第１のオリゴヌクレオチドは、一端でメチレンブルー又はフェロセン等の電気活性部分で標識され、他端で電極表面に結合されてもよい。第１の温度及び標
的１の不在下では、第１のオリゴヌクレオチドは無傷のままであり得、電気活性種は電極表面に近接しており、ベースラインレベルの電気化学的シグナル（すなわち、酸化又は還元電流）を生成する。しかしながら、標的１の存在下では、第１のオリゴヌクレオチドは切断され得、電気活性部分は溶液に放出され得、ベースラインシグナルのものを上回る電気化学的シグナル（すなわち、酸化又は還元電流）の測定可能なシフトを生成する。したがって、この温度での電気化学的シグナルの任意の測定可能なシフトは、試料中の標的１の存在を示し得る。
－更なる例示的実施形態
特定の実施形態では、本発明のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含むレポーターオリゴヌクレオチドを使用して、標的を直接的に検出することができる。他の例示的な実施形態では、レポータープローブ又は基質を使用して、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＮＥＡＲ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、ＬＣＲ、ＲＡＭ又はＮＡＳＢＡを含むがこれらに限定されない、標的増幅技術によって生成される標的アンプリコンを検出することができる。ＬＯＣＳの分割をもたらす切断又は分解は、標的増幅中にリアルタイムで生じても、増幅に続いて、反応の終点で実行されてもよい。ループ領域は、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイムを含むがこれらに限定されない、触媒核酸の酵素活性によって、又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼを含むタンパク質酵素の酵素活性によって媒介される標的依存切断又は分解によって分割することができる。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼ活性は、例えば、ポリメラーゼの固有の触媒活性であり得る。非限定的な例として、エンドヌクレアーゼ活性は、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボエンドヌクレアーゼ、又は二重構造特異性ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を含む制限酵素の固有の触媒活性であり得る。
本発明の反応は、単一のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを他の種類のレポータープローブと組み合わせて使用して、複数の標的を同時に検出するように設計される。当業者には明らかなように、標準レポータープローブは、更に追加のＬＯＣＳと組み合わされてもよく、例えば、各ＬＯＣＳは、そのループ内の異なるユニバーサル基質、及び異なるＭＮＡザイムによる基質／ループの切断後に異なる温度で融解することができる異なるステム領域を含み得る。
反応混合物は、異なるフルオロフォア及びクエンチャー対で標識されたＬＯＣＳと組み合わされた追加のレポータープローブ又は基質を更に含み得る。限定されない例として、レポーターオリゴヌクレオチド１及び無傷ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド２は、フルオロフォアＡで標識することができ、レポーターオリゴヌクレオチド３及び無傷ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド４は、フルオロフォアＢで標識することができる。レポーターオリゴヌクレオチド１及び３が直鎖ＭＮＡザイム基質である一実施形態において、ＭＮＡザイム１は、標的１の存在下で形成され、レポーターオリゴヌクレオチド１を切断して全ての温度で蛍光を生成することができ、ＭＮＡザイム２は、標的２の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド２内の基質２を切断して、温度Ｘで融解するステム２を含有する切断された分割ＬＯＣＳ構造２をもたらすことができる。ＭＮＡザイム３は、標的３の存在下で形成され、レポーターオリゴヌクレオチド３を切断して、全ての温度で蛍光を生成することができる。ＭＮＡザイム４は、標的４の存在下で形成され、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチド４内の基質４を切断して、温度Ｙで融解するステム４を含有する分割ＬＯＣＳ構造４をもたらすことができる。
蛍光がＸ及びＹの両方を下回る温度で分析される場合、フルオロフォアＡの波長での励起は標的１を示し、フルオロフォアＢの波長での励起は標的３の存在を示す。蛍光が、Ｘ及びＹの両方を上回るが、無傷ＬＯＣＳのオリゴヌクレオチド２及び４の両方の融解温度未満の温度で分析される場合、フルオロフォアＡの波長での励起は、標的１及び／又は標
的２を示し、フルオロフォアＢの波長での励起は、標的３及び／又は標的４の存在を示す。
反応の融解プロファイルをフルオロフォアＡの励起波長で分析すると、第１の温度Ｘでのピークの存在、及び温度Ｘを超える第２の温度２でのピークの不在は、ＬＯＣＳレポーター２が標的２の存在下でＭＮＡザイムによって分割／切断されていることを示す。代替的に、温度Ｘでのピークの不在及び温度２でのピークの存在は、ＬＯＣＳレポーター２が無傷のままであり、試料中の標的２の不在のためにＭＮＡザイムによって切断されていないことを示す。反応の融解プロファイルをフルオロフォアＢの励起波長で分析すると、第３の温度Ｙでのピークの存在、及び温度Ｙを超える第４の温度４でのピークの不在は、標的４の存在下でのＭＮＡザイムによるＬＯＣＳレポーター４の切断を示し、一方温度Ｙでのピークの不在及び温度４でのピークの存在は、ＬＯＣＳレポーター４が無傷のままであり、試料中の標的４の不在のためにＭＮＡザイムによって切断されていないことを示す。したがって、機器の２つのチャネルで読み取られた２つの波長での分析は、残りの２つの標的の存在が、リアルタイム検出等の他の検出手段を使用して決定されることを条件に、標的を検出及び鑑別するための確認ツールとして使用することができる。当業者は、戦略を拡張して、１つの特定の波長で３つ以上の標的の切断を監視することができ、更に分析されるフルオロフォアの数を、個々の波長の識別に利用可能な機器の最大容量によって決定される数まで増加させることができることを認識する。
更なる例示的な実施形態では、直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳオリゴヌクレオチドが組み合わされてもよく、両方とも同じフルオロフォア／クエンチャー色素対を含有し、基質領域は、ＤＮＡザイム又はリボザイム、例えば、特定の金属イオンの存在下でのみ触媒活性であり得るＤＮＡザイム又はリボザイムに特異的である。特定のＤＮＡザイム及びリボザイムは、触媒活性を可能にするのに金属カチオン補因子を必要とすることが当該技術分野で知られている。例えば、いくつかのＤＮＡザイム及びリボザイムは、例えば、鉛又は水銀の存在下でのみ触媒活性であり得る。そのような金属は、例えば、環境試料中に存在し得る。反応は、例えば水銀に依存するＤＮＡザイムの１つの直鎖ＭＮＡザイム基質を含んでもよく、試料中の水銀の存在は、直鎖ＭＮＡザイム基質の切断及び蛍光シグナルの生成をもたらし得る。また、同反応は、例えば鉛に依存するＤＮＡザイムの基質を含むループを含有するＬＯＣＳレポーターを含んでもよく、試料中の鉛の存在は、分割ＬＯＣＳのＴｍより高い温度でのＬＯＣＳの切断及び蛍光シグナルの生成をもたらし得る。分割ＬＯＣＳのＴｍ未満である第１の温度での蛍光の増加は、水銀の存在を示す。分割ＬＯＣＳのＴｍを超え、無傷ＬＯＣＳのＴｍ未満である第２の温度での蛍光の増加は、水銀及び／又は鉛の存在を示す。第１の温度で水銀が検出された場合、第２の温度での蛍光の更なる増加は、鉛の存在を示す。これは、切断された分割ＬＯＣＳ構造のステムが再アニールされるように反応を冷却し、次いで融解曲線分析を実行して、分割ＬＯＣＳ構造の存在を示すピークの存在又は不在を決定することによって確認され得る。当業者は、特定の金属補因子の存在下で切断可能な複数のプローブが、単一の反応において組み合わされ得、リアルタイムで又は反応の終了時に検出され得ることを容易に認識するであろう。
他の周知のプローブの種類と組み合わせてＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して検出することができる標的核酸（すなわち、ポリヌクレオチド）の非限定的な例には、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレ及びプリマイクロＲＮＡ、他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、それらの誘導体、それらのアンプリコン、又はそれらの任意の組み合わせ（デオキシリボヌクレオチド塩基とリボヌクレオチド塩基との混合ポリマーを含む）が含まれる。
検出可能なシグナルの生成
本発明の方法及び組成物は、検出可能なシグナルを提供するために検出部分を利用する。部位が生成することができる検出可能なシグナルの性質は、検出部分の種類及び／又はそれが会合するオリゴヌクレオチドの立体構造に依存する。
任意の好適な検出可能な部分を、それが会合するオリゴヌクレオチドの修飾時に検出可能なシグナルを提供することができるように利用することができる。好適な検出可能な部分の非限定的な例には、蛍光シグナル生成のためのフルオロフォア、比色又はＳＰＲシグナル生成のためのナノ粒子、化学発光シグナル生成のための反応性部分（例えば、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ酵素）、電気化学的シグナル生成のための電気活性種、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。非限定的な例として、好適な電気活性種としては、メチレンブルー、トルエンブルー、オラセットブルー、フェロセン、ヘキスト３３２５８、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］２＋又はダウノマイシンが挙げられ、最も一般的な電極材料としては、金、ガラス状炭素、鉛筆の黒鉛又は炭素のイオン液体が挙げられ、蛍光、化学発光、比色、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び電気化学的シグナルの検出及び測定のための方法は、当業者に周知である。
非限定的な例として、ＬＯＣＳを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上のフルオロフォアが結合してもよい。フルオロフォアによって本来生成される検出可能なシグナルは、１つ以上のクエンチャー分子への近接性のためにクエンチされ得る。例えば、限定するものではないが、フルオロフォアは、分子ビーコン又はＬＯＣＳの二本鎖ステム部分（例えば５’又は３’末端）の一本鎖に結合することができ、クエンチャーは、二本鎖ステム部分（例えば５’又は３’末端）の対向鎖に結合することができる。代替的に、フルオロフォアによって本来生成される検出可能なシグナルがクエンチされ得るように、クエンチャーは、オリゴヌクレオチドが結合する別の実体（例えば、表面又は別のオリゴヌクレオチド）に結合することができる。標的の存在下で、オリゴヌクレオチドは、クエンチャー分子からフルオロフォアを遠ざけ、したがって検出可能なシグナルを生成する修飾を受けてもよい。
追加的又は代替的に、オリゴヌクレオチド（ＬＯＣＳを含む）は、比色検出のためにＧＮＰに結合され得る。金ナノ粒子が互いに近接して凝集する場合、それらは紫色（すなわち、より長い波長での吸光度）を示し、金ナノ粒子が分離される場合、それらは赤色（すなわち、より短い波長での吸光度）を示し、紫色から赤色への（例えば、ＬＯＣＳ、直鎖ＭＮＡザイム基質、キャッチャー－ピッチャープローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、及び制限酵素プローブ）、又は代替的に、赤色から紫色への（例えば、二重ハイブリダイゼーションプローブ）測定可能な色の変化は、試料中の特定の標的の存在を示す。
追加的又は代替的に、オリゴヌクレオチド（ＬＯＣＳを含む）及び／又はオリゴヌクレオチド構成成分は、試料中の標的のＳＰＲ検出のために、ＧＮＰ及び／又は金表面に結合されてもよい。ＧＮＰが近接するように移動する場合、又は代替的に、それらが金表面から離れるように移動する場合、それらは、測定可能なＳＰＲシグナルの変化を生成することができ、いくつかのアプローチ（例えば、ＬＯＣＳ、直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ、及び制限酵素プローブ）を使用したＳＰＲシグナルの減少は、試料中の特定の標的の存在を示し得、又は代替的に、他のアプローチ（例えば、キャッチャー－ピッチャープローブ、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブ）を使用したＳＰＲシグナルの増加は、試料中の特定の標的の存在を示し得る。
追加的、又は代替的に、オリゴヌクレオチドレポーター及びプローブ（ＬＯＣＳを含む）及び／又はオリゴヌクレオチド構成成分は、電気化学的検出のために電気活性種及び／又は電極表面に結合され得る。電気活性種に結合したオリゴヌクレオチドが電極表面に近接するように移動する場合、又は代替的に電極表面から離れるように移動する場合、それらは酸化又は還元電流の測定可能な変化を生成し得る。いくつかの実施形態（例えば、ＬＯＣＳ、直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ、及び制限酵素プローブ）では、電極表面から離れるように移動する電気活性種から生じる得られた測定可能なシグナルは、試料中の特定の標的の存在を示す。代替的に、他の実施形態（例えば、キャッチャー－ピッチャープローブ、及びデュアルハイブリダイゼーションプローブ）では、電極表面に近接するように移動する電気活性種から生じる得られた測定可能なシグナルは、試料中の特定の標的の存在を示す。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、同じ検出部分、又はＬＯＣＳの検出可能な部分によって生成されたシグナルと同時に検出され得る検出可能なシグナルを生成する類似の検出部分に結合された別のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて、特定の検出部分に結合されたＬＯＣＳを利用する（例えば、１つの蛍光チャネル等の単一の種類の検出器、又は比色、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、化学発光、若しくは電気化学的検出の特定のモードを使用して）。
蛍光シグナルの分析
限定されることなく、単なる例として、本発明に従って使用される検出可能な部分は、修飾後にこれらの検出可能な部分により生成される蛍光シグナルを含み、それらが結合、分割ＬＯＣＳ構造の解離を含む、カップリング又は別様に会合するオリゴヌクレオチドプローブの切断又は消化は、本発明の方法に従って、標的分子を検出、鑑別、及び／又は定量化するための任意の好適な方法で分析することができる。
標準的な融解曲線分析を使用することができるが、様々なアッセイ形式の分析に容易に採用され得る様々な他のアプローチが、本明細書に開示及び例証されている（実施例を参照されたい）。関連する
非限定的な例として、単一の温度又は複数の温度での蛍光シグナルの測定は、ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドのループ領域の切断又は分解の検出に好適な反応における様々な時点で得ることができる。非限定的な例として、これらの時点は、（ｉ）反応の開始時若しくはその近くの時点、及び／又は（ｉ）反応過程における単一の時点若しくは複数の時点、及び／又は（ｉｉｉ）反応の終結の時点若しくは終点を含み得る。
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの測定は、ＰＣＲ増幅等の増幅反応中の各サイクルでの２つ以上の温度で得ることができる。分析は、第１及び／若しくは第２の温度で、並びに／又は更なる温度で得られた蛍光のレベルを比較することによって実行することができる。
いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの測定は、同じ波長で２つの標的を測定するように調整された反応における２つの温度で得ることができる。
いくつかの実施形態では、第１の標的は、第１のオリゴヌクレオチドレポータープローブ又は基質を使用して検出することができ、蛍光シグナルは、複数の時点で、又は複数のサイクル、例えば、ＰＣＲ中の各サイクルで測定することができる。同じ反応において、ＰＣＲ前及びＰＣＲ後の蛍光レベルを比較することによって、ＬＯＣＳプローブを使用して第２の標的を検出してもよい。そのような実施形態では、定量的データは、第１の標的について決定されてもよく、一方で定性的データは、第２の標的について生成されてもよい。非限定的な例として、第１のオリゴヌクレオチドプローブは、第１の標的の存在下で第１のＭＮＡザイムによって切断され、リアルタイムで監視されるＭＮＡザイム基質であってもよいが、ＬＯＣＳプローブは、第２の存在下で第２のＭＮＡザイムによって切断され、終点検出分析を使用して監視されてもよい。リアルタイム定量分析及び終点定性分析を組み合わせる例としては、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを利用する実施例１、並びに１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを利用する実施例６が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第１の温度での蛍光の増加は、第１の標的の存在を示し、第２の温度での蛍光の増加は、第１の標的及び／又は第２の標的の存在を示す。他の実施形態では、第１の温度での蛍光の増加は、第１の標的の存在を示し、第２の温度での蛍光の増加は、第２の標的の存在を示す。更に他の実施形態では、第１の温度での蛍光の減少は、第１の標的の存在を示し、第２の温度での蛍光の増加は、第２の標的の存在を示す。他の実施形態では、蛍光シグナルの測定は、ＰＣＲ中の各サイクルでの２つ以上の温度で得ることができ、増幅曲線を、各温度で得られた各一連の測定についてプロットすることができる。閾値蛍光値は、特定の各温度について各増幅プロットに割り当てることができ、Ｃｑ値は、増幅プロットが閾値を超えるサイクル数として測定することができる。第１のプローブが標的１の検出のための標準直鎖ＭＮＡザイム基質であり、第２のプローブが標的２の検出のためのＬＯＣＳレポーターであり、蛍光シグナルの測定が、ＰＣＲ中の各サイクルで２つの温度で得られる実施形態では、分割ＬＯＣＳ Ｔｍ未満であるより低い温度での直鎖ＭＮＡザイム基質からの蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑが、第１の標的の開始濃度の直接的な定量化を可能にすることができ、分割ＬＯＣＳのＴｍを超えるが無傷ＬＯＣＳのＴｍ未満であるより高い温度での直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳレポーターの両方からの全蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑが、実施例４に例示されるように分析され、したがって第２の標的の開始濃度の定量化を可能にすることができる。
他の実施形態では、蛍光シグナルの測定は、ＰＣＲ中の各サイクルでの２つ以上の温度で得ることができ、増幅曲線を、各温度で得られた各一連の測定についてプロットすることができる。閾値蛍光値は、特定の各温度について各増幅プロットに割り当てることができ、Ｃｑ値は、増幅プロットが閾値を超えるサイクル数として測定することができる。標準分子ビーコン又はキャッチャー／ピッチャープローブ又はＳｃｏｒｐｉｏｎユニプローブ又はＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブである第１の標的の検出のための第１のプローブが、ＬＯＣＳレポーターであってもよい第２の標的の検出のための第２のプローブと組み合わされ、蛍光シグナルの測定が、ＰＣＲ中の各サイクルで２つの温度で得られる実施形態では、分割ＬＯＣＳのＴｍ未満であるより低い温度での第１のプローブからの蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑが、第１の標的の開始濃度の直接的な定量化を可能にすることができ、分割ＬＯＣＳのＴｍを超えるが無傷ＬＯＣＳのＴｍ未満であるより高い温度でのＬＯＣＳレポーターからの蛍光シグナルを使用して測定されたＣｑが、第２の標的の開始濃度の直接的な定量化を可能にすることができる。第１の標準プローブと第２のＬＯＣＳプローブとの特定の組み合わせは、実施例５及び７の分子ビーコン、実施例９のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ、及び実施例１１のキャッチャーピッチャーオリゴヌクレオチドについて上で概説したように、第１のプローブの特定の領域のＴｍ、及びデータが取得される２つの温度に対する追加の要件を有し得る。
非限定的な例として、ベースライン蛍光シグナルは、反応の開始時又はその近くの時点で、例えばＰＣＲ前に、選択された温度、例えば第１及び第２の温度で蛍光を測定することによって得ることができる。ＰＣＲの前に、第１の温度で、標準レポータープローブ、例えば直鎖ＭＮＡザイム基質、ＴａｑＭａｎプローブ又は分子ビーコン、及び無傷ＬＯＣＳがクエンチされ、この温度が無傷ＬＯＣＳ（及び存在する場合は分子ビーコン）のステムのＴｍ未満の温度であれば、有意な蛍光シグナルは生成されない。分析は、反応の開始時（例えばＰＣＲ前）の時点で第１及び第２の温度で得られた蛍光のレベルと、反応中及び／又は反応後の時点（例えば、ＰＣＲ中又はＰＣＲ後）で第１及び第２の温度で得られた蛍光のレベルとを比較することによって、実行することができる。
実施例１で実証されるように、第１の温度及びＰＣＲ後の時点で測定された直鎖ＭＮＡザイムの切断は、第１の温度及びＰＣＲ前の時点で測定された無傷の直鎖ＭＮＡザイム基質のシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルを生成する。この相対シグナル（ΔＳＤ１）は、試料中の第１の標的の存在を示す第１の所定の閾値を超える。この第１の温度では、無傷ＬＯＣＳ及び／又は切断された分割ＬＯＣＳは、両方のＬＯＣＳ構造のステムのＴｍのために、ＰＣＲ前に得られたシグナルと比較して有意な蛍光シグナルの生成に寄与しない。第１の温度よりも高い第２の温度及びＰＣＲ後の時点では、ＬＯＣＳの切断は、第２の温度でＰＣＲ前の時点で得られたシグナルと比較して、有意な蛍光シグナルを生成する。この相対的なシグナル（ΔＳＤ２）は、直鎖ＭＮＡザイム基質が切断されるか否かにかかわらず、実施例１（終点分析法１）で実証されるように、第２の所定の閾値を超え、第１の温度（ΔＳＤ１）での相対的なシグナルよりも大きく、したがって分割ＬＯＣＳの検出、ひいては第２の標的の存在を示す。この第２の温度及びＰＣＲ後の時点では、無傷ＬＯＣＳは、同じ第２の温度でのＰＣＲ前の時点と比較して、有意な蛍光シグナルの生成に寄与せず、事前に決定された閾値を超えない。代替的に、第２の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルと、第１の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルとの間の差（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１）を、事前に決定された閾値と比較して、切断された分割ＬＯＣＳの存在を決定することができる。実施例１（終点分析法２）で実証されるように、差が所定の閾値より大きい場合（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１＞閾値）、試料中の第２の標的の存在を示す切断された分割ＬＯＣＳの存在が決定され得る。差分値が所定の閾値より低い場合（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１＜閾値）、試料中の第２の標的の不在が決定され得る。更に、第２の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルと、第１の温度でＰＣＲ前後に得られた相対的なシグナルとの間の差（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１）が所定の閾値を超える場合、温度１対温度２での蛍光変化の固有比（ΔＳＤ１：ΔＳＤ２）、又は逆比（ΔＳＤ２：ΔＳＤ１）を使用して、標的１、標的２、又は標的１及び２の両方が試料内に存在するかどうかを決定することができる。実施例１（終点分析法３）で実証されるように、ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ１より大きい場合、これは標的１のみが存在することを示し、ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ２より小さい場合、これは標的２のみが存在することを示し、ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ１より小さいが、閾値Ｒ２より大きい場合、これは標的１及び標的２の両方が存在することを示す。
他の標準レポーター／プローブと組み合わされた場合のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの例示的な用途
－標的増幅中又は増幅後の標的の検出
本発明のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用して、増幅された標的核酸配列の存在を決定することができる。ＬＯＣＳレポーターが適用され得る増幅技術に関して、具体的な制限は存在しない。標的アンプリコンの存在が、ＬＯＣＳレポーターの切断又は分解を促して、分割ＬＯＣＳ構造を生成することができることを条件として、様々な反応によって生成されるアンプリコンは、ＬＯＣＳレポーターによって検出することができる。ＬＯＣＳ構造内に含有されるループ領域の切断又は分解に有用な方法の非限定的な例には、ＭＮＡザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム、制限酵素、エンドヌクレアーゼによる切断、又はポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を含むがこれらに限定されない、エキソヌクレアーゼによる分解が含まれる。
一般に、核酸増幅技術は、酵素（例えば、ポリメラーゼ）を利用して、１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーが特異的に結合する標的核酸のコピーを生成する。ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを使用することができる増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存的増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介増幅（Ｔ
ＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）又は分岐増幅方法（ＲＡＭ）のうちの１つ以上が含まれる。
当業者は、上記のＬＯＣＳオリゴヌクレオチドの用途が、非限定的な例示の目的でのみ提供されることを容易に理解するであろう。開示されるＬＯＣＳオリゴヌクレオチドは、任意のプライマーベースの核酸増幅技術で使用することができ、本発明は、具体的に記載されるそれらの実施形態にそれほど限定されない。
－ＬＯＣＳレポーターを使用して生成されるアンプリコンの検出
上記に考察したように、本発明のＬＯＣＳレポーターは、任意のポリヌクレオチド増幅技術で利用することができ、その非限定的な例には、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＲＡＭ、ＬＣＲ、３ＳＲ、又はＮＡＳＢＡが含まれる。
これらの技術によって生成されるアンプリコンは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して切断又は分解され得るＬＯＣＳレポーターを利用して検出され得る。非限定的な例には、触媒核酸、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ等の使用が含まれる。
ＭＮＡザイムを利用して、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰ、ＲＣＡ、ＬＣＲ、ＲＡＭ、３ＳＲ、及びＮＡＳＢＡ等の方法を通して生成されるアンプリコンを検出することによって分割ＬＯＣＳレポーターを生成することができる。ＭＮＡザイムは、１つ以上のパートザイムを含み得る。ＭＮＡザイムは、集合し、かつ例えば、集合促進剤（プライマーを使用してポリヌクレオチド配列から生成されるアンプリコン等の検出される標的であり得る）の存在下でのみ触媒活性である、多成分核酸酵素である。ＭＮＡザイムは、１つ以上の集合促進剤の存在下で自己集合し、かつ基質を触媒的に修飾する活性ＭＮＡザイムを形成する、複数の部分酵素又はパートザイムで構成される。基質及び集合促進剤（標的）は、別個の核酸分子である。パートザイムは、（ｉ）集合促進剤（標的核酸等）に結合するセンサーアーム、（ｉｉ）基質に結合する基質アーム、及び（ｉｉｉ）集合時に組み合わされて、完全な触媒コアを提供する部分触媒コア配列を含む、複数のドメインを有する。ＭＮＡザイムは、例えば、異なる標的核酸配列を含む広範囲の集合促進剤を認識するように設計することができる。集合促進剤の存在に応じて、ＭＮＡザイムは、それらの基質を修飾する。この基質修飾は、シグナル生成に関連付けることができ、故にＭＮＡザイムは、酵素的に増幅された出力シグナルを生成することができる。集合促進剤は、生物学的試料又は環境試料中に存在する標的核酸（例えば、プライマーを使用してポリヌクレオチド標的から生成されるアンプリコン）であり得る。そのような場合、ＭＮＡザイム活性による基質の修飾の検出は、標的の存在を示す。核酸基質を切断することができるいくつかのＭＮＡザイムが、当該技術分野で知られている。ＭＮＡザイム及びそれらの修飾形態は、当該技術分野で知られており、ＰＣＴ特許公開番号第ＷＯ／２００７／０４１７７４号、同第ＷＯ／２００８／０４００９５号、同第ＷＯ２００８／１２２０８４号、及び関連する米国特許公開番号第２００７－０２３１８１０号、同第２０１０－０１３６５３６号、及び同第２０１１－０１４３３３８号（これらの文書の各々の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
－機器間変動又はウェル間変動のための内部キャリブレータとしてのＬＯＣＳレポーターの使用
実施例１２で実証されるキャリブレータ法は、それが反応に追加される追加的な試薬の使用を必要とせず、他のウェルから得られたデータの使用を必要としないことを含む、いくつかの利点を有する。この方法は、存在し得るウェル間変動を較正及び補正するように機能する。更に、較正は、同じチャネルで取得されたデータを使用して処理され、したが
って、機器間に存在し得るいかなるチャネル間変動の影響も受けない。多重反応のために複数のチャネルが利用される場合、各チャネルは、各チャネルのＬＯＣＳ較正シグナルに対して独立して較正され得る。これは、チャネル間の予測シグナル強度の比が機器間で有意に異なり、チャネル間変動を引き起こす場合、較正が悪影響を受けるため、内部対照又は内因性対照からのもの等、異なるチャネル内のシグナルに対してシグナルが較正されるシナリオに有利である。
－診断用途
ＬＯＣＳオリゴヌクレオチドと組み合わせて標準レポータープローブを使用する方法は、本明細書に記載の方法に従って、診断及び／又は予後の目的で使用することができる。診断及び／又は予後の方法は、エクスビボ又はインビトロで実行することができる。しかしながら、本発明の方法は、必ずしも診断及び／又は予後の目的で使用される必要はなく、それ故に診断又は予後ではない用途もまた、企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、対象における感染を診断することができる。例えば、これらの方法を使用して、対象における細菌、ウイルス、真菌／酵母、原生生物、及び／又は線虫による感染を診断することができる。一実施形態では、ウイルスは、エンテロウイルスであり得る。対象は、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類、鳥類、又はげっ歯類種であり得る。例えば、対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又はウシ等の哺乳動物であり得る。対象は、感染から生じる疾患に苦しんでいる可能性がある。例えば、対象は、エンテロウイルス感染から生じる髄膜炎を患っている可能性がある。したがって、特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、髄膜炎を診断することができる。
本発明の方法は、試料に対して実行することができる。試料は、任意の供給源に由来し得る。例えば、試料は、環境源、産業源から、又は化学合成によって得ることができる。
本明細書で企図される場合、「試料」は、例えば、精製、希釈、又は任意の他の構成成分の添加によって、元の状態から修飾された試料を含むことが理解される。
診断及び／又は予後の方法を含むがこれらに限定されない、本発明の方法は、生物学的試料に対して実行することができる。生物学的試料は、対象から採取することができる。保管された生物学的試料もまた、使用することができる。好適な生物学的試料の非限定的な例には、全血又はその構成成分（例えば、血液細胞、血漿、血清）、尿、便、唾液、リンパ液、胆汁液、痰、涙、脳脊髄液、気管支肺胞上皮洗浄液、滑液、精液、腹水腫瘍液、母乳、及び膿が含まれる。
キット
本発明は、本発明の方法を実行するための１つ以上の薬剤を含むキットを提供する。典型的には、本発明の方法を実行するためのキットは、本方法の実行に必要な全ての試薬を含有する。
いくつかの実施形態では、キットは、適切な集合促進剤（例えば、本明細書に記載のアンプリコン）の存在下でＭＮＡザイムを形成することができるオリゴヌクレオチド構成成分を含み得る。例えば、キットは、第１及び第２のパートザイムを含む少なくとも第１及び第２のオリゴヌクレオチド構成成分、並びに基質を含む第２の容器を含むことができ、ＭＮＡザイムへの、第１及び第２のパートザイム並びに基質の自己集合は、試験試料中に存在する集合促進剤（例えば、アンプリコン）の会合を必要とする。したがって、そのような実施形態では、第１及び第２のパートザイム、並びにループ領域内の基質を含むＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを、試験試料に適用して、１つ以上の標的アンプリコンの存在を
決定することができる。一般に、キットは、本明細書で提供される少なくとも１つのＬＯＣＳオリゴヌクレオチドを含む。
典型的には、本発明のキットはまた、ＰＣＲ又は他の核酸増幅技術等の本発明の方法の実行に必要とされる他の試薬、洗浄試薬、酵素、及び／又は他の試薬を含む。
キットは、本明細書で定義される、断片化されたキット又は組み合わされたキットであり得る。
断片化されたキットは、別個の容器内に収容された試薬を含み、小さなガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック若しくは紙のストリップを含んでもよい。そのような容器は、試料及び試薬の相互汚染を回避しながら、ある区画から別の区画への試薬の効率的な移動、並びに定量的な様式でのある区画から別の区画への各容器の薬剤又は溶液の添加を可能にし得る。
そのようなキットはまた、試験試料を受容する容器、アッセイで使用される試薬を含有する容器、洗浄試薬を含有する容器、及び検出試薬を含有する容器も含み得る。
組み合わされたキットは、反応アッセイの構成成分の全てを単一の容器（例えば、所望の構成成分の各々を収容する単一の箱）内に含む。
本発明のキットはまた、キット構成成分を使用して、適切な方法を行うための説明書も含み得る。本発明のキット及び方法は、例えば、リアルタイムＰＣＲ機器を含むがこれに限定されない、自動化分析装置及びシステムと組み合わせて使用することができる。
異なる標的の増幅、検出、特定、又は定量化に対する用途には、本発明の単一のキットが適用可能である場合も、又は代替的に例えば、各標的に特異的な試薬を含有する異なるキットが必要とされる場合もある。本発明の方法及びキットは、任意の実体を検出、特定、又は定量化することが望ましい任意の状況で用途を見出す。
特定の実施形態に開示されるように、広範に説明される本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明に対して多数の変形及び／又は修正を行うことができることが、当業者によって理解される。したがって、本実施形態は、全ての観点において例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
これより、本発明を、以下の特定の実施例を参照することによって更に詳細に説明するが、これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例１第２の標的の定性的終点検出と組み合わせた１つの標的の同時リアルタイム定量化、又は１チャネル当たり２つの標的の同時定性的終点分析のいずれかを可能にする形式での、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した単一波長での複数の標的の分析方法。
以下の実施例は、１つの直鎖基質及び１つのＬＯＣＳレポーターが、融解曲線分析を必要としない単一の蛍光チャネルにおける２つの標的（ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ）の検出及び鑑別のために、並びに１つの標的（ＣＴｃｒｙ）の定量化のために組み合わせて使用されるアプローチを実証する。アッセイは、直鎖ＭＮＡザイム基質を使用してＣＴｃｒｙが検出及び定量化され得、またＮＧｏｐａが、そのループ内に異なるＭＮＡザイム基質を含むＬＯＣＳレポーターを使用して終点で検出及び鑑別され得るように設計されている。
ＰＣＲの間、ＭＮＡザイム１は、ＣＴｃｒｙの存在下で直鎖基質１を切断して、フルオロフォア及びクエンチャーを分離し、広範囲の温度にわたって検出され得るシグナルの増加をもたらすことができる。この実施例では、ＣＴｃｒｙのリアルタイム検出及び定量化は、温度１（Ｄ１）（５２℃）でのＰＣＲ中の各サイクルでの蛍光を取得することによって達成される。無傷及び分割構成の両方のＬＯＣＳ－１のステムは、温度１（５２℃）より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、したがって、ＬＯＣＳ－１は、試料中のＮＧｏｐａの存在又は不在にかかわらず、温度１でのシグナルに寄与しない。
ＮＧｏｐａの存在下で、ＭＮＡザイム２は、ＰＣＲ中にＬＯＣＳ－１を切断することができる。ＮＧｏｐａの終点検出は、増幅（ΔＳＤ２）の前後に、より高い温度２（７０℃）で蛍光シグナルを比較することによって達成することができる。無傷ＬＯＣＳ－１ステムのＴｍが温度２より高く（Ｔｍ＞７０℃）、分割ＬＯＣＳ－１ステムのＴｍが温度２より低い（Ｔｍ＜７０℃）ため、この温度での切断直鎖基質１（存在する場合）に関連するものを上回るＰＣＲ中の蛍光の増加は、解離したステムを伴う分割ＬＯＣＳ－１に関連し、ＮＧｏｐａの存在を示す。
この実施例では、標的１（ＣＴｃｒｙ）のリアルタイム定量化が、標的２（ＮＧｏｐａ）の終点検出と組み合わせて実証される。また、この実施例では、標的１（ＣＴｃｒｙ）及び標的２（ＮＧｏｐａ）の両方の終点検出が、これらのデータの複数の代替分析方法とともに実証される。
以下の終点分析法（１～３）は、離散的な時点、すなわち、増幅反応の開始時又はその近く（ＰＣＲ前蛍光）及び増幅後（終点又はＰＣＲ後蛍光）でのみ、蛍光の測定を必要とする。読み取りは、これらの時点で複数の温度（Ｄ１及びＤ２）で行われ、分析は、標的１、若しくは標的２、若しくは標的１及び２の存在、又は標的１及び標的２の両方の不在を明らかにすることを可能にする。
終点分析法１
温度１（Ｄ１）では、基質１の標的媒介性切断は、ＰＣＲ中の蛍光シグナルの有意な増加（ΔＳＤ１）をもたらし、これは、Ｄ１におけるＰＣＲ後蛍光（ＳＤ１－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ）と、Ｄ１におけるＰＣＲ前蛍光（ＳＤ１－ｐｒｅ－ＰＣＲ）との間の差として測定され、これは、ＳＤ１－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ－ＳＤ１－ｐｒｅ－ＰＣＲ＝ΔＳＤ１＞Ｘ１となるように第１の閾値（Ｘ１）を超える。対照的に、この温度では、ＬＯＣＳ－１の切断が生じた場合、これは蛍光シグナルの有意な増加をもたらさず、したがって閾値（Ｘ１）を超えない。これは、分割ステムのＴｍがＤ１より高く、構造がクエンチされたままであるために生じる。したがって、温度１での蛍光のＰＣＲ前及びＰＣＲ後測定の比較は、切断された基質１、ひいては標的１の特異的な検出を可能にする。
温度１（Ｄ１）より高い温度２（Ｄ２）では、ＬＯＣＳ－１の標的媒介性切断は、増幅中に蛍光シグナルの有意な増加をもたらす。分割ＬＯＣＳ－１の存在下では、Ｄ２におけるシグナルの増加（ΔＳＤ２）は、閾値Ｘ１より大きい。更に、基質１が切断されているか否かにかかわらず、Ｄ２におけるシグナルの増加（ΔＳＤ２）は、Ｄ１におけるシグナルの増加（ΔＳＤ１）より大きい。したがって、Ｄ２におけるＰＣＲ後の蛍光（ＳＤ２－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ）とＤ２におけるＰＣＲ前の蛍光（ＳＤ２－ｐｒｅ－ＰＣＲ）との間の差として測定される、Ｄ２における蛍光の増加（ΔＳＤ２）の大きさ（ＳＤ２－ｐｏｓｔ－ＰＣＲ－ＳＤ２－ｐｒｅ－ＰＣＲ＝ΔＳＤ２のように）が、Ｄ１における蛍光（ΔＳＤ１）及び閾値Ｘ１の両方を超える場合（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１及びΔＳＤ２＞閾値Ｘ１のように）、これは、分割ＬＯＣＳ－１の検出、ひいては標的２の存在を示す。
終点分析法２
温度１（Ｄ１）では、基質１の切断は、ＰＣＲ中にΔＳＤ１＞Ｘ１のような第１の閾値（Ｘ１）を超える蛍光シグナル（ΔＳＤ１）の有意な増加をもたらすが、ＬＯＣＳ－１の切断は、Ｄ１での蛍光シグナルの有意な増加をもたらさず、無傷又は分割のいずれかの場合、Ｄ１を超えるステムの高いＴｍのために閾値（Ｘ１）を超えない。したがって、Ｄ１でのＰＣＲ前及びＰＣＲ後蛍光測定の比較（ΔＳＤ１）は、切断された基質１、ひいては標的１の特異的な検出を可能にする。
温度１（Ｄ１）より高い温度２（Ｄ２）では、ＰＣＲ全体にわたるＬＯＣＳ－１の切断は、温度１で観察される変化（ΔＳＤ１）より大きい蛍光シグナルの変化（ΔＳＤ２）をもたらし、ΔＳＤ２とΔＳＤ１との間の差（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１）は、第２の閾値（Ｘ２）を超え、ΔＳＤ２－ΔＳＤ１＝ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２となる。対照的に、基質１の切断のみで同様のΔＳＤ２及びΔＳＤ１値が生成され、これらの２つの値の間の差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）は有意ではなく、第２の閾値（Ｘ２）を超えない。したがって、この様式での温度２での蛍光の分析は、標的２の存在を示す切断された分割ＬＯＣＳ－１の特異的な検出を可能にする。
終点分析法３
標的１及び／又は標的２のいずれかが試料中に存在する場合、温度２での増幅中のシグナルの増加（ΔＳＤ２）は有意であり、閾値Ｘ１を超える。したがって、ΔＳＤ２＞Ｘ１である場合、これは、ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａのいずれかが試料中に存在することを示す。更に、ΔＳＤ２＜Ｘ１である場合、これは、ＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも試料中に存在しないことを示す。
更に、ΔＳＤ２＞Ｘ１である場合、温度１対温度２での蛍光変化の固有比（ΔＳＤ１：ΔＳＤ２）、又は逆比（ΔＳＤ２：ΔＳＤ１）を使用して、標的１、標的２、又は標的１及び２の両方が試料内に存在するかどうかを決定することができる。
ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ１より大きい場合、これは標的１のみが存在することを示し、ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ２より小さい場合、これは標的２のみが存在することを示し、ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が閾値Ｒ１より小さいが、閾値Ｒ２より大きい場合、これは標的１及び標的２の両方が存在することを示す。
終点分析法１、２及び３
更に、上記終点分析法１～３において、温度１及び２でのシグナルの変化（ΔＳＤ１及びΔＳＤ２）を、キャリブレータからのシグナル（Ｃ）、又はキャリブレータからのＰＣＲ後のシグナルとＰＣＲ前のシグナルとの差（ΔＣ）に対してキャリブレーションすることもできる。非限定的な例として、キャリブレータは、内因性対照、内部対照、又は指定されたキャリブレータオリゴを含むことができ、これは、同じ又は異なるチャネルにおいて所定の温度（複数可）で測定され得る。温度１及び２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ１及びΔＳＤ２）は、キャリブレータからのシグナルの変化に対する比として（例えば、ΔＳＤ２／ΔＣ、ΔＳＤ１／ΔＣ）、又は代替的に逆比（例えば、ΔＣ／ΔＳＤ２、ΔＣ／ΔＳＤ１）で表現され得、ΔＣは、ΔＣが閾値Ｃより大きい（ΔＣ＞閾値Ｃ）ように正のシグナルとして決定される。
Figure 0007636448000004
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー１（配列番号１）、逆方向プライマー１（配列番号２、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、順方向プライマー２（配列番号５）、逆方向プライマー２（配列番号６）、パートザイムＡ２（配列番号７）、パートザイムＢ２（配列番号８）、順方向プライマー３（配列番号９）、逆方向プライマー３（配列番号１０）、パートザイムＡ３（配列番号１１）、パートザイムＢ３（配列番号１２）、直鎖ＭＮＡザイム基質１（配列番号１３）、ＬＯＣＳ－１（配列番号１４）及び直鎖ＭＮＡザイム基質２（配列番号１５）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
標的１（ＣＴｃｒｙ）の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１（ＭＮＡザイム１）、順方向プライマー１、及び逆方向プライマー１である。標的２（ＮＧｏｐａ）の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２（ＭＮＡザイム２）、順方向プライマー２、及び逆方向プライマー２である。キャリブレータ遺伝子（ＴＦＲＣ）の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質２、パートザイムＡ３、パートザイムＢ３（ＭＮＡザイム３）、順方向プライマー３、及び逆方向プライマー３である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積でリアルタイム増幅及び検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（
ＤＡ）点は、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間（ＤＡ）、７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０サイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、９５℃で５秒間及び５２℃で４０秒間の４０サイクル（各サイクルでのＤＡ）、並びに７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクルであった。全ての反応は、３回反復で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各基質、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１、及び１×ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＣＴｃｒｙ（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）、若しくはＮＧｏｐａ遺伝子（２０，０００若しくは３２コピー）、若しくはＮＧｏｐａ遺伝子（２０，０００及び３２コピー）のバックグラウンドでの様々な濃度のＣＴｃｒｙ遺伝子（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）の合成Ｇブロックを含有した。標的なし対照（ＮＦ
Ｈ２Ｏ）を除く全ての反応は、３４．５ｎｇ（１０，０００コピー）のヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを更に含有した。最後に、追加の対照は、いかなるＣＴｃｒｙ又はＮＧｏｐａ Ｇブロックも含まないゲノムＤＮＡのみを含有した。
結果
この実施例では、３つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１～３）を単一のＰＣＲで使用して、２つの蛍光チャネル（ＨＥＸ及びテキサスレッド）のみを使用して、３つの標的核酸（それぞれＣＴｃｒｙ、ＮＧｏｐａ、及びヒトＴＦＲＣ）を同時に検出及び鑑別した。ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａの存在又は不在は、ＨＥＸチャネルで検出及び鑑別され、ＴＦＲＣ遺伝子の存在は、テキサスレッドチャネルで検出された。ＣＴｃｒｙ及びＴＦＲＣ遺伝子の存在は、それぞれＨＥＸ及びテキサスレッドチャネルの５２℃（Ｄ１）での蛍光シグナルの増加によってリアルタイムで検出され、また５２℃での終点で検出された。ＮＧｏｐａの存在は、ＬＯＣＳ－１の切断を監視するＨＥＸチャネルで７０℃（Ｄ２）での個別の測定値を使用して検出された。
図６に示される結果は、単独で（図６Ａ）、又は２０，０００（図６Ｂ）又は３２（図６Ｃ）コピーのＮＧｏｐａ鋳型のバックグラウンドにおいて、２０，０００（黒の点）、４，０００（黒の破線）、８００（黒の四角）、１６０（灰色の実線）又は３２（灰色の点）コピーのＣＴｃｒｙ鋳型を含有する反応からの、５２℃の取得温度でＨＥＸチャネルで得られたＰＣＲ増幅曲線を示す。ＣＴｃｒｙを欠くが、２０，０００（黒の線）又は３２コピー（灰色の線）のＮＧｏｐａ鋳型のいずれかを含有する反応についても、５２℃で蛍光データを収集した（図６Ｄ）。標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を図６Ａ～６Ｃ（黒の実線）に示す。増幅曲線は、３回反復反応からの蛍光レベルの平均である。上記反応の各々についてのＣＴｃｒｙの計算コピー数を表５に示すが、該当なし（Ｎ／Ａ）は、これらの反応におけるＣＴｃｒｙの不在と一致して５２℃で決定されるＣｑ値が存在しない場合を指す。Ｃｑ値は、ＢｉｏＲａｄソフトウェア（ベースライン減算曲線フィット）の回帰モードを使用して決定された。
表５の結果は、ＣＴｃｒｙ標準曲線が０．９９を超えるＲ２値を有し、ＰＣＲ効率が高かった（１００～１０６％）ことを示している。反応中の２０，０００又は３２コピーのＮＧｏｐａの存在は、ＣＴｃｒｙの計算遺伝子コピー数を有意に変化させず（対応のあるスチューデントｔ検定、それぞれｐ値０．１４４及び０．３１５）、したがって、５２℃でのリアルタイム検出を、試料中のＣＴｃｒｙの直接的な定量分析に使用することができることを実証した。
Figure 0007636448000005
図７の結果は、終点分析法１を使用して２つの異なる温度でＨＥＸチャネルで測定したＰＣＲ中の蛍光シグナルの変化を示す。図７Ａにおいて、温度１におけるシグナルの変化（ΔＳＤ１、５２℃）は白黒パターンで示され、温度２における変化シグナル（ΔＳＤ２、７０℃）は灰色で示されている。結果は、ＮＧｏｐａの存在又は不在に関わらず、ＣＴｃｒｙが試料内に存在する場合、温度１におけるシグナルの変化（ΔＳＤ１、白黒パターンのバー）が閾値１（Ｘ１）を超えるが、ＮＧｏｐａのみの存在下、及び／又はＣＴｃｒｙが試料に存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、温度１での閾値１を超える終点のシグナル変化は、ＣＴｃｒｙの存在を示す。図７Ａの結果はまた、温度２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ２、灰色バー）が温度１におけるシグナルの変化より大きく（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１）、かつ閾値Ｘ１より大きい（ΔＳＤ２＞Ｘ１）場合、ＮＧｏｐａが試料中に存在することを示している。
代替的に、温度１及び２でのシグナルの変化は、キャリブレータシグナルの変化（ΔＣ）に対して較正され得る。図７Ｂは、テキサスレッドチャネルで測定されたＴＦＲＣキャリブレータシグナルの変化（ΔＣ）を示し、閾値Ｃを超える値は、ΔＣの正のシグナルを示し、閾値Ｃを下回る値は、ΔＣの負のシグナルを示す。図７Ｃでは、ΔＣに対して較正された温度１でのシグナルの変化（ΔＳＤ１／ΔＣ、５２℃）は白黒パターンで示され、ΔＣに対して較正された温度２での変化シグナル（ΔＳＤ２／ΔＣ、７０℃）は、図７ＢのΔＣに対して陽性とみなされる反応について灰色で示され、該当なし（Ｎ／Ａ）は、図７ＢのΔＣに対して陰性とみなされる反応を指す。図７Ｃの結果は、標的１及び２の検出に関する同じ結論を明らかにする図７Ａと同じ様式で分析され得る。
図８の結果は、終点分析法２を使用して、温度２（ΔＳＤ２）及び温度１（ΔＳＤ１）でＨＥＸチャネルで得られた蛍光シグナルの変化の差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）を示す。結果は、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１が、ＮＧｏｐａが試料中に存在する場合閾値２（Ｘ２）を超えるが、ＣＴｃｒｙのみが試料中に存在する場合、及び／又は試料中にＮＧｏｐａが存在しない（ＮＴＣ及びゲノムＤＮＡのみ）場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、閾値２を超える終点蛍光シグナルの差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２）は、Ｎ
Ｇｏｐａの存在を示す。
図９の結果は、終点分析法３を使用して２つの異なる温度でＨＥＸチャネルで得られた蛍光シグナルの変化を示す。図９Ａにおいて、ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より大きい場合、これは、ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａが試料中に存在することを示す。ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より低い場合、これは、ＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも反応中に存在しない（ＮＴＣ及びゲノムＤＮＡのみ）ことを示す。図９Ｂは、どの標的が反応中に存在するかを示すために比率ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が使用され得ることを示している。この比率が閾値Ｒ１より高い場合、これは、ＣＴｃｒｙは存在するがＮＧｏｐａは存在しないことを示す。比が閾値Ｒ２よりも低い場合、これは、ＮＧｏｐａが存在するが、ＣＴｃｒｙが存在しないことを示す。この比率が閾値Ｒ１とＲ２との間にある場合、これは、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方が存在することを示す。反応中にＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも存在しない場合（図９Ａ）、比率の計算の必要性はなくなり、図９Ｂに示されるようにＮ／Ａとして示される。
全体として、この実施例は、リアルタイムかつ離散的な時点（ＰＣＲ前及びＰＣＲ後）で蛍光を監視することによって、２つの異なる温度で単一の蛍光チャネルにおいて２つの標的を検出することができることを実証している。この方法では、直鎖ＭＮＡザイム基質を用いて一方の標的を定量化し、ＬＯＣＳプローブを用いて他方の標的を検出することができる。単純な方法は、ＰＣＲ後の融解曲線分析を必要としない。この実施例はまた、複数の温度でのＰＣＲ前及びＰＣＲ後の蛍光値の比較によって、単一波長で複数の標的について定性的データを得ることができることを実証している。更に、このデータの解析にはいくつかの解析方法を適用することができる。
実施例２：２つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び２つのＬＯＣＳレポーターを使用して、２つの標的の同時リアルタイム定量化及び２つの蛍光チャネルのそれぞれにわたる２つの標的の定性的検出のための方法。
以下の実施例は、４つの標的の同時検出及び鑑別のための２つの蛍光チャネル、ＨＥＸ及びＦＡＭの使用を実証し、Ｃｑ決定は、単一の反応でこれらの標的のうちの２つについて行うことができる。ＨＥＸチャネルでは、１つの標的（ＣＴｃｒｙ）のリアルタイム検出及びＣｑ決定、並びに第２の標的（ＮＧｏｐａ）の終点検出が、それぞれ１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用して達成された。同様に、ＦＡＭチャネルでは、第３の標的（ＴＶＫ）のリアルタイム検出及びＣｑ決定、並びに第４の標的（ＭｇＰａ）の終点検出が、それぞれ第２の直鎖ＭＮＡザイム基質及び第２のＬＯＣＳレポーターを使用して達成された。最後に、第５の標的、テキサスレッドチャネルで読み取った第３の直鎖ＭＮＡザイム基質を使用して、ヒトＴＦＲＣ遺伝子をバックグラウンドヒトゲノムＤＮＡで検出した。
それぞれのＭＮＡザイムによる直鎖基質の標的媒介性切断は、フルオロフォア及びクエンチャーの分離を引き起こし、広範囲の温度にわたるシグナルの増加を生じさせる。この実施例では、直鎖基質からのシグナルは、温度１でのＰＣＲ中の各サイクルでの蛍光（Ｄ１＝５２℃）を取得することによってリアルタイムで、又は標的が存在する場合のＰＣＲ中に生じる蛍光の増加を測定することによって終点で蛍光を取得することにより検出することができる。この温度では、ＮＧｏｐａ及びＭｇＰａの分割及び無傷ＬＯＣＳレポーターは両方とも、それらのステム領域のＴｍが温度１よりも高いため、検出可能なシグナルを生成しない。したがって、ＰＣＲ中に各波長で温度１で得られたＣｑ値は、（他の標的の存在又は不在にかかわらず）標的Ｃｔｃｒｙ、ＴＶＫ、及びＴＦＲＣの開始量を反映し、したがって定量化に使用することができる。
それぞれのＭＮＡザイムによるＬＯＣＳレポーターの標的媒介性切断は、特定範囲の温度にわたるシグナルの増加を生じさせる。この実施例では、この蛍光シグナルは、温度２
（Ｄ２＝７０℃）で測定され、これは分割ＬＯＣＳレポーターの両方のＴｍよりも高いが、無傷ＬＯＣＳレポーターの両方のＴｍよりも低く（無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍ＞温度２＞分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍ）、したがって無傷ＬＯＣＳレポーターは、温度２で有意なシグナルに寄与しない。したがって、温度２でのシグナルの増加は、分割ＬＯＣＳレポーターの存在を反映し、これはＨＥＸチャネル及びＦＡＭチャネルにおける特定の標的ＮＧｏｐａ及びＭｇＰａの存在をそれぞれ裏付けている。
この実施例は、リアルタイムモニタリング及び３つの標的のＣｑ決定を伴う単一の反応における混合された定量的及び定性的データの同時生成を、ＰＣＲ前及びＰＣＲ後の蛍光読み取り値の比較によって解明される他の２つの標的の単純検出と組み合わせて実証している。更に、この実施例は、終点分析法１～３と結合した２つの蛍光チャネルにおける４つの標的の定性的検出を実証している（実施例１に概説されているとおり）。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー１（配列番号１）、逆方向プライマー１（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、順方向プライマー２（配列番号５）、逆方向プライマー２（配列番号６）、パートザイムＡ２（配列番号７）、パートザイムＢ２（配列番号８）、順方向プライマー３（配列番号９）、逆方向プライマー３（配列番号１０）、パートザイムＡ３（配列番号１１）、パートザイムＢ３（配列番号１２）、直鎖ＭＮＡザイム基質１（配列番号１３）、ＬＯＣＳ－１（配列番号１４）、直鎖ＭＮＡザイム基質２（配列番号１５）、順方向プライマー４（配列番号１６）、逆方向プライマー４（配列番号１７）、パートザイムＡ４（配列番号１８）、パートザイムＢ４（配列番号１９）、順方向プライマー５（配列番号２０）、逆方向プライマー５（配列番号２１）、パートザイムＡ５（配列番号２２）、パートザイムＢ５（配列番号２３）、直鎖ＭＮＡザイム基質３（配列番号２４）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２５）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
ＣＴｃｒｙの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１（ＭＮＡザイム１）、順方向プライマー１、及び逆方向プライマー１である。ＮＧｏｐａの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２（ＭＮＡザイム２）、順方向プライマー２、及び逆方向プライマー２である。ＴＦＲＣの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質２、パートザイムＡ３、パートザイムＢ３（ＭＮＡザイム３）、順方向プライマー３、及び逆方向プライマー３である。ＴＶＫの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質３、パートザイムＡ４、パートザイムＢ４（ＭＮＡザイム４）、順方向プライマー４、及び逆方向プライマー４である。ＭｇＰａの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－２、パートザイムＡ５、パートザイムＢ５（ＭＮＡザイム５）、順方向プライマー５、及び逆方向プライマー５である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積でリアルタイム増幅及び検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間（ＤＡ）、７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０サイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、９５℃で５秒間及び５２℃で４０秒間の４０サイクル（各サイクルでのＤＡ）、並びに７０℃で１５秒間（ＤＡ）であった。全ての反応は、２回反復で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各基質、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１、３００ｎＭのＬＯＣＳ－２及び１×ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、ＣＴｃｒｙの合成Ｇブロック（２０，０００若しくは３２コピー）、ＮＧｏｐａ遺伝子（２０，０００若しくは
３２コピー）、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方（それぞれ２０，０００若しくは３２コピー）、ＴＶＫ（２０，０００若しくは３２コピー）、ＭｇＰａ遺伝子（２０，０００若しくは３２コピー）、又はＴＶＫ及びＭｇＰａの両方（それぞれ２０，０００若しくは３２コピー）のいずれかを含有した。標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を除く全ての反応は、１０，０００コピーのヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを含有した。追加の対照は、ゲノムＤＮＡのみを含有した。
結果
この実施例では、５つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１～５）を単一のＰＣＲ反応で使用して、３つの蛍光チャネル（ＨＥＸ、テキサスレッド及びＦＡＭ）のみを使用して、５つの標的核酸（それぞれＣＴｃｒｙ、ＮＧｏｐａ、ＴＦＲＣ、ＴＶＫ及びＭｇＰａ）を同時に検出及び鑑別した。ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａの存在又は不在は、ＨＥＸチャネルで検出及び鑑別され、ゲノムＤＮＡ中のＴＦＲＣ遺伝子の存在は、テキサスレッドチャネルで検出され、ＴＶＫ及び／又はＭｇＰａの存在又は不在は、ＦＡＭチャネルで検出及び鑑別された。ＣＴｃｒｙ、ＴＦＲＣ、及びＴＶＫ遺伝子の存在は、それぞれＨＥＸ、テキサスレッド及びＦＡＭチャネルの５２℃での蛍光シグナルの増加によってリアルタイムで検出され、また５２℃での終点でも検出された。ＮＧｏｐａ及びＭｇＰａの存在は、それぞれＬＯＣＳ－１及びＬＯＣＳ－２の切断を監視するそれぞれＨＥＸチャネル及びＦＡＭチャネルで７０℃の終点で検出された。
図１０に示される結果は、ＨＥＸ（図１０Ａ～Ｄ）及びＦＡＭ（図１０Ｅ～Ｈ）チャネルで５２℃の取得温度で得られたＰＣＲ増幅曲線を示す。作成された増幅曲線は、ＨＥＸチャネル（図１０Ａ）で得られた２０，０００コピー及び３２コピーのＣＴｃｒｙ鋳型のみ、又はＦＡＭチャネルで得られたＴＶＫのみ（図１０Ｅ）を表す。ＨＥＸチャネルで得られたそれぞれ２０，０００コピー及び３２コピーのＣＴｃｒｙ鋳型及びＮＧｏｐａ鋳型の両方を含有する鋳型混合物（図１０Ｂ）、又はＦＡＭチャネルで得られたそれぞれ２０，０００コピー及び３２コピーのＴＶＫ鋳型及びＭｇＰａ鋳型の両方を含有する鋳型混合物（図１０Ｆ）についても、増幅曲線を作成した。２０，０００コピー及び３２コピーのＮＧｏｐａのみを含有する試料については、ＨＥＸチャネルで増幅は見られず（図１０Ｃ）、ＴＶＫ、ＭｇＰａ及びＴＦＲＣ（内因性対照）を含む残りの標的の任意の濃度については、いかなる増幅も記録されなかった（図１０Ｄ）。同様に、ＦＡＭチャネルでは、２０，０００コピー及び３２コピーのＭｇＰａ鋳型を含有する試料については増幅は記録されず（図１０Ｇ）、ＣＴｃｒｙ、ＮＧｏｐａ及びＴＦＲＣを含む残りの標的の任意の濃度についても増幅は記録されなかった（図１０Ｈ）。全ての標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）反応についてシグナルの増加はなく、結果は黒の点線として示されている（図１０Ａ～Ｈ）。増幅曲線は、３回反復反応の平均であり、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットされた。Ｃｑ値は、１００ＲＦＵ（ベースライン減算曲線フィット）に設定した単一閾値法を使用して決定された。
上記反応の各々についてのＣｑ値を表６に示すが、該当なし（Ｎ／Ａ）は、これらの反応におけるＣＴｃｒｙ及びＴＶＫの不在と一致して５２℃で決定されるＣｑ値が存在しない場合を指す。結果は、ＣＴｃｒｙ及びＴＶＫのＣｑ値が、それぞれ、ＦＡＭチャネル内のＮＧｏｐａ鋳型又はＨＥＸチャネル内のＭｇＰａ鋳型の存在によって影響されないことを示す。また、標的なし反応の各々は、検出可能な増幅曲線又はＣｑ値を生成しなかった。したがって、ＨＥＸチャネル及びＦＡＭチャネルから得られたＣｑ値は、それぞれ、試料中のＣＴｃｒｙ及びＴＶＫの直接的な定量分析に使用され得る。
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図１１の結果は、終点分析法１を使用して２つの異なる温度でＨＥＸ（図１１Ａ）及びＦＡＭチャネル（図１１Ｂ）で得られた増幅中の蛍光シグナルの変化（ＰＣＲ後からＰＣＲ前を引いたもの）を示す。温度１におけるシグナルの変化（ΔＳＤ１、５２℃）は白黒パターンとして示され、温度２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ２、７０℃）は灰色で示されている。図１１Ａは、ΔＳＤ１が、ＣＴｃｒｙが試料中に存在する場合閾値Ｘ１を超えるが、試料中にＣＴｃｒｙが存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、ΔＳＤ１＞Ｘ１は、ＣＴｃｒｙの存在を示す。図１１Ａの結果はまた、温度２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ２）が温度１における変化より大きく（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１）、かつ閾値Ｘ１より大きい（ΔＳＤ２＞Ｘ１）場合、ＮＧｏｐａが試料中に存在することを示している。ΔＳＤ２が閾値Ｘ１を超えるが、ΔＳＤ１が超えない場合、これはＮＧｏｐａのみの存在を示す。同様に、図１１Ｂは、温度１でのシグナルの変化（ΔＳＤ１）が、ＴＶＫが試料中に存在する場合は閾値Ｘ１を超えるが、ＴＶＫが試料に存在しない場合にはこの閾値を超えないことを示している。したがって、ΔＳＤ１＞Ｘ１は、ＴＶＫの存在を示す。図１１Ｂの結果はまた、温度２におけるシグナルの変化（ΔＳＤ２）が温度１におけるシグナルの変化より著しく大きく（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１）、かつ閾値Ｘ１より大きい（ΔＳＤ２＞Ｘ１）場合、ＭｇＰａが試料中に存在することを示している。ＳＤ２が閾値Ｘ１を超えるが、ＳＤ１が超えない場合、これはＭｇＰａのみの存在を示す。
図１２の結果は、終点分析法２を使用して、温度２及び温度１でＨＥＸ（図１２Ａ）及びＦＡＭ（図１２Ｂ）チャネルで得られた終点蛍光シグナルの増加の差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）を示す。図１２Ａの結果は、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１が、ＮＧｏｐａが試料中に存在する場合閾値Ｘ２を超えるが、試料にＮＧｏｐａが存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。同様に、図１２Ｂの結果は、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１が、ＭｇＰａが試料中に存在する場合閾値Ｘ２を超えるが、試料にＭｇＰａが存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、ＨＥＸ及びＦＡＭチャネルにおいてΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２である場合、これはそれぞれＮＧｏｐａ及びＭｇＰａの存在を示す。
図１３の結果は、終点分析法３を使用して２つの異なる温度でＨＥＸ（図１３Ａ、Ｂ）及びＦＡＭ（図１３Ｃ、Ｄ）チャネルで得られた蛍光シグナルの変化を示す。図１３Ａにおいて、ＨＥＸチャネルにおけるΔＳＤ２が閾値Ｘ１より大きい場合、これは、ＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａが試料中に存在することを示す。ＨＥＸチャネルにおけるΔＳＤ２が閾値Ｘ１より低い場合、これは、ＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも反応中に存在しないことを示す。図１３Ｂは、ＨＥＸチャネルにおけるΔＳＤ２：ΔＳＤ１の比率を示し、これは、どの標的が反応に存在するかを示す。この比率が閾値Ｒ１より高い場合、これは、ＣＴｃｒｙは存在するがＮＧｏｐａは存在しないことを示す。比率が閾値Ｒ２より低い場合、これは、ＮＧｏｐａは存在するがＣＴｃｒｙは存在しないことを示す。この比率が閾値Ｒ１とＲ２との間にある場合、これは、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方が存在することを示す。図１３Ａは、反応中にＣＴｃｒｙもＮＧｏｐａも存在しない場合を示し、したがって図１３Ｂの比率計算の必要性はなくなり、Ｎ／Ａとして示される。図１３Ｃでは、ＦＡＭチャネルのΔＳＤ２は閾値Ｘ１より大きく、ＴＶＫ及び／又はＭｇＰａが試料中に存在することを示している。ＦＡＭチャネルにおけるΔＳＤ２が閾値Ｘ１より低い場合、これは、ＴＶＫもＭｇＰａも反応中に存在しないことを示す。図１３Ｄは、ＦＡＭチャネルにおけるΔＳＤ２：ΔＳＤ１の比率を示し、これは、どの標的が反応に存在するかを示す。この比率が閾値Ｒ１より高い場合、これは、ＴＶＫは存在するがＭｇＰａは存在しないことを示す。比率が閾値Ｒ２より低い場合、これは、ＭｇＰａは存在するがＴＶＫは存在しないことを示す。この比率が閾値Ｒ１とＲ２との間にある場合、これは、ＭｇＰａ及びＴＶＫの両方が存在することを示す。図１３Ｃは、ＴＶＫもＭｇＰａも反応に存在しない場合を示し、したがって図１３Ｄの比率計算の必要性はなくなり、Ｎ／Ａとして示される。
実施例３－１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用した単一チャネルにおける２つの標的の終点検出及び鑑別、並びに融解曲線分析を使用した追加の確認。
以下の実施例は、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターが、終点分析及び融解曲線分析を使用した単一の蛍光チャネルにおける２つの標的（ＴＰＡｐｏｌＡ及びＴＦＲＣ）の検出及び鑑別のために組み合わせて使用されるアプローチを実証する。アッセイは、直鎖ＭＮＡザイム基質を使用してＴＦＲＣが終点で検出及び鑑別され得、ＬＯＣＳレポーターを使用してＴＰＡｐｏｌＡが終点で検出及び鑑別され得るように設計されている。連動した融解曲線分析を使用して、ＴＰＡｐｏｌＡの確認的検出を達成することもできる。
この実施例では、ＴＦＲＣは、１反応当たり１０，０００コピーの単一濃度で、内因性対照として含まれる。ＴＰＡｐｏｌＡを、１反応当たり１０，０００コピー、及び１反応当たり４０コピーの２つの異なる濃度で試験した。ＴＰＡｐｏｌＡ及びＴＦＲＣの両方の同時検出を、１反応当たり１０，０００コピーのＴＦＲＣ及び１０，０００コピーのＴＰＡｐｏｌＡ、並びに１反応当たり１０，０００コピーのＴＦＲＣ及び４０コピーのＴＰＡｐｏｌＡの濃度で試験した。このアッセイは、ＣＴｃｒｙ、ＬＧＶ、ＮＧｏｐａ、ＮＧｐｏｒＡ、ＭｇＰａ、ＴＶｂｔｕｂ、ＨＳＶ－１、及びＨＳＶ－２を含む８つの他の標的の増幅及び検出のためのプライマー、パートザイム及びＬＯＣＳも含有する、１０標的多重化である。
ＰＣＲの間、ＭＮＡザイム６は、ＴＦＲＣの存在下で直鎖基質４を切断して、フルオロフォア及びクエンチャーを分離し、広範囲の温度にわたって検出され得るシグナルの増加をもたらすことができる。この実施例では、ＴＦＲＣの終点検出は、温度１（４８℃）でのＰＣＲサイクルの前後に蛍光を取得することによって達成される。
ＰＣＲの間、ＭＮＡザイム７は、ＴＰＡｐｏｌＡの存在下でＬＯＣＳ－３を切断することができる。アッセイは、無傷及び分割構成の両方のＬＯＣＳ－３のステムが、温度１（
４８℃）より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、したがって、試料中のＴＰＡｐｏｌＡの存在又は不在にかかわらず、温度１でのシグナルに寄与しないように設計される。更に、アッセイは、無傷ＬＯＣＳ－３が温度２より大きいＴｍ（Ｔｍ＞６８℃）を有し、分割構成が温度２以下のＴｍ（Ｔｍ≦６８℃）を有するように設計される。したがって、ＴＰＡｐｏｌＡの終点検出及び鑑別は、温度２（６８℃）でのＰＣＲサイクルの前後に蛍光を取得することによって達成される。
この実施例では、ＴＦＲＣ及びＴＰＡｐｏｌＡの検出及び鑑別は、それぞれ、温度１（４８℃）及び温度２（６８℃）でのＰＣＲサイクルの前後の蛍光測定を行うことによって達成される。ＰＣＲサイクル前に取得した蛍光値を、各温度でのＰＣＲサイクル後に取得した蛍光値から差し引いて、ＭＮＡザイム６又はＭＮＡザイム７の標的開始切断とは無関係のバックグラウンド蛍光を除去する。次いで、以下のように更なる分析を行う。
分析方法２（実施例１）において前述したように、温度１（Ｄ１）では、基質４の切断は、ＰＣＲ中にΔＳＤ１＞Ｘ１であるように第１の閾値（Ｘ１）を超える蛍光シグナル（ΔＳＤ１）の有意な増加をもたらすが、ＬＯＣＳ－３の切断は、Ｄ１での蛍光シグナルの有意な増加をもたらさず、無傷又は分割のいずれかの場合、Ｄ１を超えるステムの高いＴｍのために閾値（Ｘ１）を超えない。したがって、Ｄ１でのＰＣＲ前及びＰＣＲ後蛍光測定の比較（ΔＳＤ１）は、切断された基質４、ひいてはＴＦＲＣ標的の特異的な検出を可能にする。
温度１（Ｄ１）より高い温度２（Ｄ２）では、ＰＣＲ全体にわたるＬＯＣＳ－３の切断は、温度１で観察される変化（ΔＳＤ１）より大きい蛍光シグナルの変化（ΔＳＤ２）をもたらし、ΔＳＤ２とΔＳＤ１との間の差（ΔＳＤ２－ΔＳＤ１）は、第２の閾値（Ｘ２）を超え、ΔＳＤ２－ΔＳＤ１＝ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２となる。対照的に、基質４の切断のみで同様のΔＳＤ２及びΔＳＤ１値が生成され、これらの２つの値の間の差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）は有意ではなく、第２の閾値（Ｘ２）を超えない。したがって、この様式でのＤ２での蛍光の分析は、ＴＰＡｐｏｌＡの存在を示す切断された分割ＬＯＣＳ－３の特異的な検出を可能にする。
融解曲線分析を使用して、ＴＰＡｐｏｌＡの検出及び鑑別を達成することもできる。固有の融解曲線特性は、ＴＰＡｐｏｌＡが試料中に存在する場合に作成され、ＴＰＡｐｏｌＡが試料中に存在しない反応とは異なる。これにより、ＴＰＡｐｏｌＡが試料中に存在するかどうかを視覚的に確認することができる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー３（配列番号９）、逆方向プライマー３（配列番号１０）、パートザイムＡ６（配列番号２６）、パートザイムＢ６（配列番号２７）、基質４（配列番号２８）、順方向プライマー６（配列番号２９）、逆方向プライマー６（配列番号３０）、パートザイムＡ７（配列番号３１）、パートザイムＢ７（配列番号３２）、ＬＯＣＳ－３（配列番号３３）、順方向プライマー１（配列番号１）、順方向プライマー２（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、ＬＯＣＳ－４（配列番号３４）、順方向プライマー２（配列番号５）、順方向プライマー３（配列番号６）、パートザイムＡ８（配列番号３５）、パートザイムＢ８（配列番号３６）、ＬＯＣＳ－５（配列番号３７）、順方向プライマー７（配列番号３８）、逆方向プライマー７（配列番号３９）、パートザイムＡ９（配列番号４０）、パートザイムＢ９（配列番号４１）、ＬＯＣＳ－６（配列番号４２）、順方向プライマー８（配列番号４３）、逆方向プライマー８（配列番号４４）、パートザイムＡ１０（配列番号４５）、パートザイムＢ１０（配列番号４６）、ＬＯＣＳ－７（配列番号４７）、順方向プライマー９（配列番号４８）、逆方向プライマー９（配列番号４９）、
パートザイムＡ１１（配列番号５０）、パートザイムＢ１１（配列番号５１）、ＬＯＣＳ－８（配列番号５２）、順方向プライマー１０（配列番号５３）、逆方向プライマー１０（配列番号５４）、パートザイムＡ１２（配列番号５５）、パートザイムＢ１２（配列番号５６）、ＬＯＣＳ－９（配列番号５７）、順方向プライマー１１（配列番号５８）、逆方向プライマー１１（配列番号５９）、パートザイムＡ１３（配列番号６０）、パートザイムＢ１３（配列番号６１）、ＬＯＣＳ－１０（配列番号６２）、順方向プライマー１２（配列番号６３）、逆方向プライマー１２（配列番号５６）、パートザイムＡ１４（配列番号６５）、パートザイムＢ１４（配列番号６６）、ＬＯＣＳ－１１（配列番号６７）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
ＴＦＲＣの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質４、パートザイムＡ６、パートザイムＢ６（ＭＮＡザイム６）、順方向プライマー３、及び逆方向プライマー３である。ＴＰＡｐｏｌＡの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－３、パートザイムＡ７、パートザイムＢ７（ＭＮＡザイム７）、順方向プライマー６、及び逆方向プライマー６である。ＣＴｃｒｙの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－４、順方向プライマー１、逆方向プライマー１、パートザイムＡ１及びパートザイムＢ１（ＭＮＡザイム１）である。ＬＧＶの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－６、順方向プライマー７、逆方向プライマー７、パートザイムＡ９及びパートザイムＢ９（ＭＮＡザイム９）である。ＮＧｏｐａの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－５、順方向プライマー２、逆方向プライマー２、パートザイムＡ８及びパートザイムＢ８（ＭＮＡザイム８）である。ＮＧｐｏｒＡの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－７、順方向プライマー８、逆方向プライマー８、パートザイムＡ１０及びパートザイムＢ１０（ＭＮＡザイム１０）である。ＭｇＰａの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１０、順方向プライマー１１、逆方向プライマー１１、パートザイムＡ１３及びパートザイムＢ１３（ＭＮＡザイム１３）である。ＴＶｂｔｕｂの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１１、順方向プライマー１２、逆方向プライマー１２、パートザイムＡ１４及びパートザイムＢ１４（ＭＮＡザイム１４）である。ＨＳＶ－１の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－８、順方向プライマー９、逆方向プライマー９、パートザイムＡ１１及びパートザイムＢ１１（ＭＮＡザイム１１）である。ＨＳＶ－２の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－９、順方向プライマー１０、逆方向プライマー１０、パートザイムＡ１２及びパートザイムＢ１２（ＭＮＡザイム１２）である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積でリアルタイム増幅及び検出を実行した。サイクリングパラメータ、及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、４２℃で２０秒間（ＤＡ）、４８℃で２０秒間（ＤＡ）、６５℃で２０秒間（ＤＡ）、６８℃で２０秒間（ＤＡ）、及び９５℃で２分間の各Ｉサイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０サイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間及び６５℃で５秒間の４０サイクル（各サイクルでＤＡ）、並びに３０℃で２０秒間（ＤＡ）、４２℃で２０秒間（ＤＡ）、４８℃で２０秒間（ＤＡ）、６５℃で２０秒間（ＤＡ）、６８℃で２０秒間（ＤＡ）の各１サイクルであった。融解曲線パラメータは、２０℃から９５℃まで０．５℃の増分で、５秒間保持した（ＤＡは保留）。全ての反応は、２回反復で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの基質４、各々３００ｎＭのＬＯＣＳ－３、ＬＯＣＳ－４、ＬＯＣＳ－７、ＬＯＣＳ－８、各々２００ｎＭのＬＯＣＳ－５、ＬＯＣＳ－６、ＬＯＣＳ－９、２４０ｎＭのＬＯＣＳ－１０、１２０ｎＭのＬＯＣＳ－１１、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、２単位のＭｙＴａｑポリメラーゼ
（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、及び１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、ＴＰＡｐｏｌＡ、ＮＧｏｐａ及び／若しくはｐｏｒＡ、ｇｐｄ及び／若しくはｇｐｄ３、ＴＶ－Ｂｔｕｂ及び／若しくはＭｇＰａ、ＣＴｃｒｙ及び／若しくはＬＧＶ遺伝子に相同な合成Ｇブロック鋳型（１０，０００コピー若しくは４０コピー）を含有するか、又は標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ）のいずれかであった。ＴＰＡｐｏｌＡのみの反応を除く全ての反応は、内因性対照として機能するＴＦＲＣ遺伝子標的を有する１０，０００コピーのヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを含有した。ＴＦＲＣ遺伝子の検出は、Ｃｙ５．５チャネルの蛍光の増加による内部対照として全ての反応（ＴＰＡｐｏｌＡのみの反応を除く）で監視した。
結果
この実施例では、２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム６及び７）を単一のＰＣＲ反応で使用して、１つの蛍光チャネル（Ｃｙ５．５）を使用して２つの標的核酸（それぞれＴＦＲＣ及びＴＰＡｐｏｌＡ）を同時に検出及び鑑別した。ＴＰＡｐｏｌＡ及び／又はＴＦＲＣの存在又は不在を検出し、終点分析を使用してＣｙ５．５チャネルで鑑別した。ＴＰＡｐｏｌＡは、ＬＯＣＳ－３の切断及び融解によって引き起こされる蛍光の増加により６８℃（Ｄ２）で検出され、ＴＦＲＣは、基質４の切断により４８℃（Ｄ１）で検出された。試料中のＴＰＡｐｏｌＡの存在は、切断及び分割されたＬＯＣＳ－３により生成された蛍光を表す６８℃（Ｄ２）での融解ピークの存在によって、融解曲線分析において確認された。試料中のＴＰＡｐｏｌＡの不在は、未切断のＬＯＣＳ－３により生成された蛍光を表す８５℃での融解ピークの存在によって、融解曲線において確認された。
この実施例では、融解曲線分析を使用して、８つの追加の標的（チャネル当たり２つの標的）の増幅、検出、及び鑑別に成功した（データは示さず）。ＴＦＲＣ及びＴＰＡｐｏｌＡはＣｙ５．５チャネルで検出及び鑑別され、ＣＴｃｒｙ及びＬＧＶはＣｙ５チャネルで検出及び鑑別され、ＮＧｏｐａ及びＮＧｐｏｒＡはＦＡＭチャネルで検出及び鑑別され、ＭｇＰａ及びＴＶｂｔｕｂはテキサスレッドチャネルで検出及び鑑別され、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２はＪＯＥチャネルで検出及び鑑別された（データは示さず）。
図１４の結果は、終点分析を使用して温度１（Ｄ１）及び温度２（Ｄ２）でＣｙ５．５チャネルで得られた終点蛍光シグナルの差（それぞれΔＳＤ１及びΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）を示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした２回反復反応の平均である。結果は、ΔＳＤ１が、ＴＦＲＣが試料中に存在する場合閾値１（Ｘ１）を超えるが、ＴＰＡｐｏｌＡのみが存在する場合、並びに／又はＴＦＲＣ（及びＴＰＡｐｏｌＡ）が存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している（図１４Ａ）。同様に、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１は、ＴＰＡｐｏｌＡが試料中に存在する場合閾値２（Ｘ２）を超えるが、ＴＦＲＣのみが試料中に存在する場合、並びに／又はＴＰＡｐｏｌＡ（及びＴＦＲＣ）が存在しない場合には、この閾値を超えない（図１４Ｂ）。したがって、閾値１より大きい終点蛍光シグナル（ΔＳＤ１＞Ｘ１）はＴＦＲＣの存在を示し、閾値２より大きいΔＳＤ２とΔＳＤ１との間の終点蛍光シグナルの差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１＞Ｘ２）は、反応中にＴＰＡｐｏｌＡが単独で存在するか、又はＴＦＲＣとともに存在するかにかかわらず、ＴＰＡｐｏｌＡの存在を示す。
この実施例では、ＰＣＲ増幅及び終点分析に続いて、ＰＣＲ後の融解サイクルを行い、それにより、ＴＰＡｐｏｌＡの存在又は不在を、それぞれ６８℃（分割ＬＯＣＳ）又は８５℃（無傷ＬＯＣＳ）のいずれかにおけるＬＯＣＳの融解ピークに基づいて確認した。図１５に示される結果は、１０，０００コピーのＴＦＲＣを含有する反応（図１５Ａ）、１０，０００コピー及び４０コピーのＴＰＡｐｏｌＡを含有する反応（図１５Ｂ）、並びに、１０，０００コピーのＴＰＡｐｏｌＡと１０，０００コピーのＴＦＲＣ、及び４０コピーのＴＰＡｐｏｌＡと１０，０００コピーのＴＦＲＣを含有する共感染（図１５Ｃ）から
増幅後に得られたそれぞれの融解曲線特性を示す。結果は、ＴＰＡｐｏｌＡを含有する全ての試料について、及び標的（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を含有しなかった反応の２回反復反応の平均であり、ＴＦＲＣのみ結果は、１０，０００コピーのＴＦＲＣを内因性対照として使用した４８回の反復の平均である。曲線は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした。結果は、ＴＦＲＣ遺伝子標的の存在下で、又は標的なしで基質４により生成された融解特性（Ｔｍ ８５℃でのピーク）が、ＴＰＡｐｏｌＡの存在下で、又はＴＦＲＣ及びＴＰＡｐｏｌＡの両方の存在下でＬＯＣＳ－３によって生成される融解特性（Ｔｍ ６８℃でのピーク）とは異なることを実証している。結果を表７に要約する。
Figure 0007636448000007
この実施例では、融解曲線は、２０℃～９０℃の広い温度範囲にわたって実行され、０．５℃毎に測定が行われたが、これはＬＯＣＳレポーターを使用する場合には必要ではない。未切断及び切断された分割ＬＯＣＳのＴｍは、異なる標的濃度では変化しないため、より狭い温度範囲を用いて確認用融解曲線を作成することができる。切断された分割ＬＯＣＳ－３及び未切断の無傷ＬＯＣＳ－３のＴｍは、それぞれ６８℃及び８５℃であるため、融解曲線分析を約５０℃～９０℃で実行して両方のピークを捕捉し、結果を得るまでの時間を低減することができる。同様に、融解曲線分析を単純化し、理論的に融解曲線を生成するのに必要な時間を半分にするために、データ収集点を例えば０．５℃毎ではなく１℃毎の取得に限定することができる。これは、融解曲線分析が、終点分析を補助するための確認ツールとして使用されている場合に有利である。
この実施例は、任意選択の融解曲線分析とともに終点分析を用いて、２つの標的を２つの異なる温度で単一の蛍光チャネルで検出することができることを実証し、１つの標的は直鎖ＭＮＡザイム基質を用いて検出され、他方の標的はＬＯＣＳレポーターを用いて検出される。全ての標的シナリオは、終点分析を使用して検出することができ、ＴＰＡｐｏｌＡの存在又は不在は、融解ピーク特性によって更に確認することができた。この実施例は、単一の蛍光チャネルで複数の標的を検出するための２つの方法を提供し、終点蛍光測定法は、結果確認のために独立して、又は融解曲線分析と併せて使用することができる。
実施例４：１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用して単一の蛍光チャネルでの２つの標的を同時に検出及び定量化するための方法
以下の実施例は、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターの組み合わせが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを収集することによって、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の同時検出及び定量化を可能にするアプローチを実証する。更に、この実施例は、試料中に存在する場合、いずれかの、及び／又は両方の標的の量を定量化するための方法を説明する。
この実施例では、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用して、各ＰＣＲサイクル中に２つの異なる温度（Ｄ１及びＤ２）でリアルタイムで蛍光を測定することによって、２つの標的（評定Ｘ及び標的Ｙ）をＪＯＥチャネルで同時に検出、鑑別、及び定量化した。アッセイは、標的Ｘを、直鎖基質Ｘ（標的Ｘの存在下でのみＭＮＡザイムＸによって切断可能）を使用して監視し、標的Ｙを、ＬＯＣＳ－Ｙ（標的Ｙの存在下でのみＭＮＡザイムＹによって切断可能）を使用して監視するように設計されている。更に、アッセイは、分割ＬＯＣＳ－Ｙが、より低い検出温度（Ｄ１）より高いＴｍを有するように設計されている。
切断された直鎖基質Ｘが蛍光を発するように、より低い検出温度（Ｄ１）を選択したが、一方、切断されていない直鎖基質Ｘ、分割ＬＯＣＳ－Ｙ及び無傷ＬＯＣＳ－Ｙは全てクエンチされたままである。分割ＬＯＣＳ－Ｙのステムが融解（解離）し、増加した蛍光をもたらす一方、無傷ＬＯＣＳ－Ｙのステムが会合及びクエンチしたままであるように、より高い温度（Ｄ２）を選択する。
Ｄ１及びＤ２温度で取得した蛍光測定を使用して、２つのＰＣＲ増幅曲線をプロットすることができる。標的Ｘ及び／又はＹの存在を決定するための閾値を、Ｄ１プロット（閾値Ｘ）及びＤ２プロット（閾値Ｙ）の両方について設定する。閾値（閾値Ｘ及び閾値Ｙ）、並びに反応が定常に達することが知られている様々な終点は、先行実験に基づいて事前に決定することができ、この先行実験では、標的Ｘのみを含有する反応が、Ｄ１で終点Ｘ１（ＥＸ１）で、又はＤ２で終点Ｘ２（ＥＸ２）で定常に達し、標的Ｙのみを含有する反応が、Ｄ２で終点Ｙ１（ＥＹ１）で定常に達し、標的Ｘ及び標的Ｙの両方を含有する反応が、Ｄ２で終点Ｙ２（ＥＹ２）で定常に達する。任意選択で、終点ＥＸ１、ＥＸ２、ＥＹ１及びＥＹ２は、実験試料と並行して実行した陽性対照から誘導してもよい。
Ｄ１増幅プロットに関して、ＰＣＲが、閾値Ｘを超え、閾値Ｘを超過する終点ＥＸ１で定常に達する増幅曲線を生成する場合、この結果は、標的Ｘに関連する切断された直鎖基質Ｘの存在を示す。標的Ｙもまた存在する場合、切断されたＬＯＣＳ－Ｙは、Ｄ１で蛍光を生成しないため、増幅曲線は、影響されないはずである。したがって、閾値Ｘを超える増幅曲線から得られたＣｑ値は、試料中の標的Ｘの定量化を可能にする。
Ｄ２増幅プロットに関して、ＰＣＲが、閾値Ｙを超え、ＥＹ１又はＥＹ２のいずれかで定常に達する増幅曲線を生成する場合、これは、標的Ｙの存在を示す。閾値Ｙは、値ＥＸ２を超えるように設定されているため、標的Ｘのみを含有する反応からの増幅曲線は、この閾値を超えない。標的Ｘ及びＹの両方が存在する場合、直鎖基質Ｘ及びＬＯＣＳ－Ｙの切断は、閾値Ｙを超え、終点ＥＹ１よりも大きい終点ＥＹ２で定常に達する増幅曲線を生成し、これは、標的Ｙのみの存在下で切断されたＬＯＣＳ－Ｙに関連する。ＥＸ２＜閾値Ｙ＜ＥＹ１＜ＥＹ２かつＥＸ２≠閾値Ｙ≠ＥＹ１≠ＥＹ２であるため、増幅曲線が定常に達する終点は、標的Ｘ、Ｙ、又はその両方の存在を示し得る。しかしながら、閾値Ｙを超えるＤ２増幅曲線から得られたＣｑ値は、標的Ｘ及びＹの両方の量によって影響されるため、更なるデータ操作なしでは、結果は標的Ｙについては半定量的である。標的Ｘもまた存在する試料中に存在する標的Ｙの量を計算するための分析方法を、以下に説明する。
標的Ｙの定量化方法
Ｄ１（３９℃）及びＤ２（７２℃）で切断された直鎖ＭＮＡザイム基質Ｘのみからから生じる２つの増幅曲線は、同じ効率及びＣｑを有するが、それぞれ異なる終点ＥＸ１及びＥＸ２で定常に達する。したがって、７２℃（ＳＸＤ２）での切断された基質Ｘから生じる蛍光シグナル（ＳＸ）は、蛍光調整係数（ＦＡＦ）を適用することによって、３９℃（ＳＸＤ１）での切断された基質Ｘから生じるシグナルを使用して外挿することができる。ＦＡＦは、終点ＥＸ１及びＥＸ２の比率である（ＦＡＦ＝ＥＸ２／ＥＸ１）。７２℃での
増幅曲線における合計蛍光シグナル（ＳＸＹＤ２）は、存在する場合切断された直鎖基質Ｘ（ＳＸＤ２）、及び存在する場合分割されたＬＯＣＳ－Ｙ（ＳＹＤ２）の両方から生じるシグナルを含む。このことから、ＬＯＣＳ－Ｙのみから生じる７２℃でのシグナル（ＳＹＤ２）は、以下のように外挿することができる。
ＳＸＹＤ２＝ＳＸＤ２＋ＳＹＤ２＝（ＳＸＤ１＊ＦＡＦ）＋ＳＹＤ２
ＳＹＤ２＝ＳＸＹＤ２－（ＳＸＤ１＊ＦＡＦ）
したがって、各サイクルでの計算されたＳＹＤ２値から構築された増幅曲線から得られたＣｑ値は、標的Ｙに関する定量的データを提供し得る。試料が標的Ｘ、Ｙ、若しくはＸ及びＹの両方を含有するか、又は標的を含有しないかにかかわらず、この式を適用して、試料中の標的Ｙの量を正確に決定することができる。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、直鎖ＭＮＡザイム基質１（配列番号１３）、ＬＯＣＳ－１（配列番号１４）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、パートザイムＡ２（配列番号７）、パートザイムＢ２（配列番号８）、順方向プライマー１（配列番号１）、逆方向プライマー１（配列番号２）、順方向プライマー２（配列番号５）及び逆方向プライマー２（配列番号６）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。標的Ｘ（ＣＴｃｒｙ）の増幅及び定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質１、パートザイムＡ１及びＢ１（ＭＮＡザイム１、ＭＮＡザイムＸ）、順方向プライマー１及び逆方向プライマー１である。標的Ｙ（ＮＧｏｐａ）の増幅及び定量化に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ２及びＢ２（ＭＮＡザイム２、ＭＮＡザイムＹ）、順方向プライマー２及び逆方向プライマー２である。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、続いて９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０タッチダウンサイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、並びに９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間、３９℃で５秒間及び７２℃で５秒間の４０サイクル（データは３９℃及び７２℃のステップの両方で収集）であった。全ての反応は、２回反復で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、１００ｎＭの直鎖ＭＮＡザイム基質１、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１及び１×ＰｌｅｘＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又は合成ＧブロックＣＴｃｒｙ（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）、ＮＧｏｐａ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）、ＮＧｏｐａ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）のバックグラウンドでのＣＴｃｒｙ遺伝子の様々な濃度の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）、若しくはＣＴｃｒｙ遺伝子の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）のバックグラウンドでのＮＧｏｐａ遺伝子の様々な濃度の合成Ｇブロック（２０，０００、４，０００、８００、１６０、若しくは３２コピー）のいずれかを含有した。
結果
ＰＣＲ中、２つのＭＮＡザイム（ＭＮＡザイム１及びＭＮＡザイム１２）を使用して、それぞれ直鎖ＭＮＡザイム基質１及びＬＯＣＳ１の切断を介して標的核酸の増幅をリアルタイムで監視する。ＭＮＡザイム１は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出のためにＣＴｃｒｙ（標的Ｘ）に相同な配列を検出し、基質１を切断するように設計した。ＭＮＡザイム２は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出のために
ＮＧｏｐａ（標的Ｙ）に相同な配列を検出し、ＬＯＣＳ－１を切断及び分割するように設計した。
図１６に示される結果は、それぞれ３９℃（Ｄ１）（図１６Ａ）及び７２℃（Ｄ２）（図１６Ｂ）で測定した、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ若しくはＮＧｏｐａ、又は２０，０００コピーの両方の遺伝子標的のいずれかを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた比較増幅曲線を示す。増幅曲線は、２回反復反応の平均であり、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットされた。Ｃｑ値は、それぞれＤ１（３９℃）及びＤ２（６８℃）に対して４００ＲＦＵ及び５００ＲＦＵ（ベースライン減算曲線フィット）に設定した単一閾値法を使用して決定された。３９℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ鋳型（黒実線）を含有する試料は、閾値Ｘ（黒の水平線）を超え、終点ＥＸ１（ＥＸ１と表される黒の水平線）に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示す。３９℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ鋳型及びＮＧｏｐａ鋳型の両方を含有する試料（灰色の実線）もまた、閾値Ｘを超え、ＥＸ１に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示す。３９℃では、ＮＧｏｐａ鋳型のみを含有する試料（黒の破線）又はＣＴｃｒｙ鋳型を含有しない試料（ＮＴＣ、灰色の破線）は、閾値Ｘを超えず、ＥＸ１に達しない。したがって、ＥＸ１で３９℃で定常に達する増幅曲線は、試料中のＣＴｃｒｙの存在を確認する。このグラフは、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙのみ（黒実線）並びに２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方（灰色実線）を含有する試料が、同等のＣｑ値を有することを示す。ＮＧｏｐａのみを含有する反応（黒の破線）、又は標的なしの反応（灰色の破線）は、ＰＣＲ中に蛍光の増加を示さなかった。
３９℃でのＣｑ値は、ＮＧｏｐａの存在によって影響されないため、それを、試料中のＣＴｃｒｙの量の定量化に使用することができる。０、３２、１６０、８００、４，０００、及び２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、並びに０、３２、１６０、８００、４，０００、及び２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料中のＣＴｃｒｙの定量化の結果を、表８に要約するが、Ｎ／Ａは、３９℃で決定されるＣｑ値が存在せず、したがって試料中にＣＴｃｒｙは存在しないことを指す。
Figure 0007636448000008
図１６Ｂは、閾値Ｙ（黒の水平線）を超え、第１の終点Ｙ（ＥＹ１）（ＥＹ１と表される黒の水平線）で定常に達する蛍光レベルを有する、２０，０００コピーのＮＧｏｐａ鋳型（黒の点線）を含有する試料の７２℃での増幅曲線を示す。７２℃では、２０，０００
コピーのＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方を含有する試料（灰色の実線）は、閾値Ｙを超え、第２の終点Ｙ（ＥＹ２）（ＥＹ２と表される黒の水平線）で定常に達する蛍光レベルを有する増幅曲線を示す。７２℃では、ＮＧｏｐａ鋳型（黒の実線）を含有しないがＣＴｃｒｙを含有する試料は閾値Ｙを超えず、ＥＹ１及びＥＹ２に達しないが、その代わり終点ＥＸ２（終点ＥＸ２と表される黒の水平線）で定常に達する。７２℃では、ＮＧｏｐａ鋳型もＣＴｃｒｙ鋳型も含有しない試料（ＮＴＣ、灰色の破線）は、いかなる増幅曲線も示さず、したがって閾値Ｙを超えず、ＥＹ１及びＥＹ２に達しない。したがって、ＥＸ２で７２℃で定常に達する増幅曲線は、試料中の標的ＣＴｃｒｙの存在は確認するが、ＮＧｏｐａの存在は確認せず、ＥＹ１で定常に達する増幅曲線は、試料中のＮＧｏｐａの存在は確認するが、ＣＴｃｒｙの存在は確認せず、ＥＹ２で定常に達する増幅曲線は、試料中のＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方の存在を確認する。
７２℃では、２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方を含有する試料のＣｑ値（灰色の実線）は、２０，０００コピーのＮＧｏｐａ鋳型のみを含有する試料のＣｑ値（黒の破線）と同じではない。したがって、正規化せずに７２℃でのＣｑ値を使用して、ＣＴｃｒｙも存在する場合に、試料中のＮＧｏｐａの濃度を正確に決定することはできない。
図１７に示される結果は、それぞれ３９℃（図１７Ａ，１７Ｄ及び１７Ｇ）並びに７２℃（図１７Ｂ、１７Ｅ及び１７Ｈ）で測定した、０、３２、及び２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、並びに０、３２、及び２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての可能な組み合わせを含有する反応からＪＯＥチャネルで得られた比較増幅曲線を示す。結果は、２回反復反応の平均としてプロットされており、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（バージョン１４）を使用してプロットした。Ｃｑ値は、それぞれＤ１（３９℃）及びＤ２（７２℃）に対して４００ＲＦＵ及び５００ＲＦＵ（ベースライン減算曲線フィット）に設定した単一閾値法を使用して決定された。２０，０００コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、黒の破線で示し、３２コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、灰色の実線で示し、０コピーのＣＴｃｒｙを含有する試料を、黒の実線で示す。
図１７Ａ、１７Ｄ及び１７Ｇは、ＮＧｏｐａ（黒の実線）を２０，０００コピー（図１７Ａ）、３２コピー（図１７Ｄ）で含有する、又はコピーなし（図１７Ｇ）の反応についての３９℃（Ｄ１）での蛍光を示す。結果は、ＮＧｏｐａの存在下での３９℃でのシグナルの増加はなく（図１７Ａ及び１７Ｄ）、シグナルは、ＮＧｏｐａ又はＣＴｒｙを含有しない反応（ＮＴＣ、図１７Ｇ）と同等であることを示し、したがって、３９℃（Ｄ１）でのリアルタイム検出を、試料中のＣＴｃｒｙの存在を決定するために使用することができることを示している。
図１７Ｂ、１７Ｅ及び１７Ｈは、ＮＧｏｐａ（黒の実線）を２０，０００コピー（図１７Ｂ）、３２コピー（図１７Ｅ）で含有する、又はコピーなし（図１７Ｈ）の反応についての７４℃（Ｄ２）での蛍光を示す。結果は、正規化されていないＮＧｏｐａ増幅曲線（図１７Ｂ及び１７Ｅ）が、２０，００コピー（黒の線）又は３２コピー（灰色の線）のＣＴｃｒｙが試料内に存在するときにシフトされることを示している。
図１７Ｃ、１７Ｆ及び１７Ｉは、ＮＧｏｐａ（黒の実線）を２０，０００コピー（図１７Ｃ）、３２コピー（図１７Ｆ）で含有する、又はコピーなし（図１７Ｉ）の反応についてのＦＡＦでの正規化後の７４℃（Ｄ２）での蛍光を示す。結果は、７２℃（Ｄ２）での正規化された増幅曲線が、同様のＣｑ値を示し、ここで試料中のＣＴｃｒｙの量に関係なく、同じ数のＮＧｏｐａ鋳型が存在する（図１７Ｃ及び１７Ｆ）。図１７Ｉは、７２℃での外挿された増幅曲線が、試料がいかなるＮＧｏｐａ鋳型も含有しない場合に、いかなる有意な増幅も示さないことを示す。上述のＦＡＦ正規化方法の効果は、表９（ＳＹＤ２ Ｃｑ値、ＳＹＤ２＝ＳＸＹＤ２－ ＳｘＤ２ＦＡＦ）及び表１０（ＳＹＤ２＝ＳＸＹＤ２－ＳｘＤ２ＦＡＦ正規化後のＮＧｏｐａの定量化）において更に実証され、これらは、ＳＹＤ２＝ＳＸＹＤ２－ＳｘＤ２ＦＡＦによる減算によって正規化した後の、０、３２、１６０、８００、４，０００、及び２０，０００コピーのＣＴｃｒｙ遺伝子標的、並びに０、３２、１６０、８００、４，０００、及び２０，０００コピーのＮＧｏｐａ遺伝子標的の全ての組み合わせの試料の７２℃（Ｄ２）での増幅の分析である。該当なし（Ｎ／Ａ）は、７２℃で決定されるＣｑ値が存在しないため、試料中にＮＧｏｐａが存在しない場合である。
Figure 0007636448000009
Figure 0007636448000010
予言的な実施例５：分子ビーコン及びＬＯＣＳの組み合わせを使用した、単一波長での複数の標的の検出及び識別。
切断不可能な分子ビーコンを、ＭＮＡザイムによって切断可能なＬＯＣＳプローブと組み合わせて、単一波長で複数の標的を検出及び識別することができる。図５に示されるように、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ検出部分、例えば同じフルオロフォアで標識され得る。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する第１の標的１と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを有し得、Ｔｍ ＢはＴｍ Ａより高い（Ｔｍ Ｂ＞Ｔｍ Ａ）。これは、Ｔｍ Ｃを有するステム領域と、第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断され得るループ領域とを有し得る無傷ＬＯＣＳプローブと組み合わせることができ、したがって、Ｔｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得、Ｔｍ Ｄは、Ｔｍ Ｃ未満である（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。標的１及び／又は標的２の存在は、２つの温度（Ｄ１及びＤ２）での蛍光をリアルタイムで測
定するか、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅後に取得された単一の測定値を使用して識別することができる。蛍光出力の終点、又はリアルタイム測定の選択肢、及び結果の解釈のための戦略は、互いに、並びにＤ１及びＤ２に関して、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｂ、Ｔｍ Ｃ、Ｔｍ Ｄの相対温度に依存する。
以下のシナリオは、表１に要約される。表１は、分子ビーコン及びＬＯＣＳの例示的なＴｍ、並びにシナリオ１～４の取得温度、及び予想される結果を提供する。
シナリオ１
第１のプロトコルでは、Ｔｍ Ａは６５℃であり得、Ｔｍ Ｂは７０℃であり得、Ｔｍ
Ｃは６５℃であり得、Ｔｍ Ｄは５５℃であり得る（Ｔｍ Ａ＞Ｔｍ ＤかつＴｍ Ｂ＞Ｔｍ Ｃ、＞Ｔｍ Ｂ＞Ｔｍ Ｄ）。ＰＣＲ増幅は、存在する場合、標的１及び／又は標的２を増幅するために実行することができ、蛍光測定は、増幅の開始時又はその近く、及び再び増幅後に２つの温度で行うことができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｄ未満である第１の温度（Ｄ１ ５０℃）（Ｄ１＜Ｔｍ Ａ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１のみの存在を示す。この温度では、分子ビーコンは、標的１へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又はその不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。同じ温度Ｄ１では、反応における標的１又は標的２のいずれかの存在又は不在にかかわらず、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれぞれのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、第１の温度Ｄ１及びＴｍ Ｄの両方より高いが、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｃの両方より低い第２の温度（Ｄ２ ６０℃）（Ｄ２＞Ｄ１、Ｄ２＞Ｔｍ Ｄ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｃ）での蛍光の増加は、標的１及び／又は標的２の存在を示す。この第２の温度では、分子ビーコンは、標的１へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又は標的１の不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。分子ビーコンは、標的２の存在又は不在によって影響を受けることはない。更に、Ｄ２では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷のままであり、クエンチされる。標的２が存在する場合、標的２に特異的なＭＮＡザイムによる切断が、この温度で解離するステム領域を有する分割ＬＯＣＳを生成するため、蛍光が増加する。したがって、温度１で観察される蛍光の増加より大きい、ＰＣＲ中の温度２での蛍光の増加は、標的２の存在を示す（ΔＦ Ｄ２＞ΔＦ Ｄ１）。
シナリオ２
第２のプロトコルでは、Ｔｍ Ａは６０℃であり得、Ｔｍ Ｂは７０℃であり得、Ｔｍ
Ｃは７０℃であり得、Ｔｍ Ｄは６０℃であり得る（Ｔｍ Ａ≒Ｔｍ Ｄ、Ｔｍ Ｂ≒Ｔｍ Ｃ、及びＴｍ Ｂ＞Ｔｍ Ｄ）。ＰＣＲ増幅は、存在する場合、標的１及び／又は標的２を同時に増幅するために実行することができ、蛍光測定は、リアルタイムで、又は増幅の開始時／その近く、及び再び増幅後に２つの温度で行うことができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｄ未満である第１の温度（Ｄ１
５０℃）（Ｄ１＜Ｔｍ Ａ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ１＞Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１のみの存在を示す。この温度では、分子ビーコンは、標的１へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又はその不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。同じ温度Ｄ１では、反応における標的１又は標的２のいずれかの存在又は不在にかかわらず、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれぞれのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、第１の温度Ｄ１及びＴｍ Ａ及びＴｍ Ｄのいずれよりも高いが、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｃより低い第２の温度（Ｄ２ ６５℃）（Ｄ２＞Ｄ１、Ｄ２＞Ｔｍ Ａ、Ｄ２＞Ｔｍ Ｂ、Ｄ２＞Ｔｍ Ｃ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１及び／又は標的２の存在を示す。この第２の温度では、分子ビーコンは、反応における標的２の存在又は不在にかかわらず、標的１へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、この温度でのそのステムの解
離に起因して蛍光を発する。したがって、分子ビーコンの蛍光は、この温度で、増幅の前、増幅の間、及び増幅の後に、バックグラウンド蛍光レベルを提供する。更に、Ｄ２では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷のままであり、クエンチされる。標的２が存在する場合、標的２に特異的なＭＮＡザイムによる切断が、この温度で解離したステム領域を有する分割ＬＯＣＳを生成するため、ＰＣＲ中バックグラウンドレベルを超えて蛍光が増加する。したがって、ＰＣＲ中の温度２での蛍光の増加は、標的２の存在を示す。全体的に、ＰＣＲ中のＤ１における蛍光の増加は、分子ビーコンによって検出される標的１の存在を示し、ＰＣＲ中のＤ２における蛍光の増加は、ＬＯＣＳプローブによって検出される標的２の存在を示す。
シナリオ３
第３のプロトコルでは、Ｔｍ Ａは６０℃であり得、Ｔｍ Ｂは７０℃であり得、Ｔｍ
Ｃは８０℃であり得、Ｔｍ Ｄは７０℃であり得る（Ｔｍ Ａ＜Ｔｍ Ｄ、Ｔｍ Ａ＜Ｔｍ Ｃ及びＴｍ Ｂ≒Ｔｍ Ｄ）。ＰＣＲ増幅は、存在する場合、標的１及び／又は標的２を増幅するために実行することができ、蛍光測定は、リアルタイムで、又は増幅の開始時／その近く、及び再び増幅後に２つの温度で行うことができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂ及びＴｍ Ｃ及びＴｍ Ｄ未満である第１の温度（Ｄ１ ５０℃）（Ｄ１＜Ｔｍ Ａ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｃ、Ｄ１＜Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１のみの存在を示す。この温度では、分子ビーコンは、標的１へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又はその不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。同じ温度Ｄ１では、反応における標的１又は標的２のいずれかの存在又は不在にかかわらず、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれぞれのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。更に、第１の温度Ｄ１及びＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂ及びＴｍ Ｄのいずれよりも高いが、Ｔｍ Ｃより低い第２の温度（Ｄ２ ７５℃）（Ｄ２＞Ｄ１、Ｄ２＞Ｔｍ Ａ、Ｄ２＞Ｔｍ Ｂ、Ｄ２＞Ｔｍ Ｄ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｃ）での蛍光の増加は、標的２の存在を示す。この第２の温度では、分子ビーコンは、標的１にハイブリダイズできないが、反応における標的１又は標的２の存在又は不在にかかわらず、この温度でのそのステムの解離に起因して蛍光を発する。したがって、分子ビーコンの蛍光は、この温度で、増幅の前、増幅の間、及び増幅の後に、バックグラウンド蛍光レベルを提供する。更に、Ｄ２では、標的２が存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷のままであり、クエンチされる。標的２が存在する場合、標的２に特異的なＭＮＡザイムによる切断が、この温度で解離したステム領域を有する分割ＬＯＣＳを生成するため、ＰＣＲ中バックグラウンドレベルを超えて蛍光が増加する。したがって、ＰＣＲ中の温度２での蛍光の増加は、標的２の存在を示す。全体的に、ＰＣＲ中のＤ１における蛍光の増加は、分子ビーコンによって検出される標的１の存在を示し、ＰＣＲ中のＤ２における蛍光の増加は、ＬＯＣＳプローブによって検出される標的２の存在を示す。
シナリオ２と同様に、この実施形態は、複数の温度での測定を利用する当該技術分野で知られている他の方法よりも大きな利点を提供する。この特定の実施形態は、複雑なＰＣＲ後分析の必要性をなくす方法で、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブを組み合わせる。この形式は、第１の温度で生成された第１の増幅曲線からの第１の標的の直接的な定量化、及び第２の温度で生成された第２の増幅曲線からの第２の標的の直接的な定量化を可能にする。
シナリオ４
第４のプロトコルでは、Ｔｍ Ａは７５℃であり得、Ｔｍ Ｂは８０℃であり得、Ｔｍ
Ｃは６５℃であり得、Ｔｍ Ｄは５５℃であり得る（Ｔｍ Ａ＞Ｔｍ Ｃ、Ｔｍ Ａ＞Ｔｍ Ｄ及びＴｍ Ｂ＞Ｔｍ Ｃ）。ＰＣＲ増幅は、存在する場合、標的１及び／又は標的２を増幅するために実行することができ、蛍光測定は、増幅の開始時／その近く、及び
再び増幅後に２つの温度で行うことができる。標的１及び／又は標的２の存在下で、Ｔｍ
Ａ及びＴｍ Ｂ未満であるがＴｍ Ｃ及びＴｍ Ｄより高い第１の温度（Ｄ１ ７０℃）（Ｄ１＜Ｔｍ Ａ、Ｄ１ ＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ１＞Ｔｍ Ｃ、Ｄ１＞Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１の存在を示す。この温度では、分子ビーコンは、標的１のハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又は標的１の不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。同じ温度Ｄ１では、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳの両方が、この温度でのそれぞれのステム領域の解離に起因して蛍光を発する。更に、Ｔｍ Ｄより高いが第１の温度、Ｔｍ Ａ、Ｔｍ Ｂ及びＴｍ Ｃより低い第２の温度（Ｄ２ ６０℃（Ｄ２＜Ｄ１、Ｄ２＜Ｔｍ Ａ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｂ、Ｄ２＜Ｔｍ Ｃ、Ｄ２＞Ｔｍ Ｄ）での蛍光の増加は、標的１及び／又は標的２の存在を示す。この第２の温度では、無傷ＬＯＣＳ種が、この温度でのそれらのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。標的２が存在する場合、標的２に特異的なＭＮＡザイムによる切断が、この温度で解離したステム領域を有する分割ＬＯＣＳを生成するため、ＰＣＲ中蛍光が増加する。分子ビーコンは、標的１の存在下での標的１のハイブリダイゼーションに応答してこの温度で蛍光を発するか、又は標的１の不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。分子ビーコンは、標的２の存在又は不在によって影響を受けることはない。したがって、温度１での観察される蛍光の増加より大きい、ＰＣＲ中の温度２での観察される蛍光の増加（ΔＳＤ２ ＞ ΔＳＤ１）は、標的２の存在を示す。
実施例６：１つの標的の同時リアルタイム定量化及び第２の標的の定性的終点検出、又は１チャネル当たり２つの標的の同時定性的終点分析のいずれかを可能にする形式での、１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した単一波長での複数の標的の分析方法。
以下の実施例は、１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳレポーターが、２つの遺伝子標的（ＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａ）の検出及び鑑別及び融解曲線分析を必要としない単一の蛍光チャネルにおける１つの標的（ＧＡＰＤＨ）のＣｑ決定のために一緒に使用されるアプローチを実証する。アッセイは、ＴａｑＭａｎプローブを使用してＧＡＰＤＨ遺伝子がリアルタイムで検出され得、ＬＯＣＳレポーターを使用してＭｇＰａ遺伝子が終点で検出及び鑑別され得るように設計されている。
ＰＣＲの間、ＴａｑＭａｎプローブは、ＧＡＰＤＨの存在下で切断され、フルオロフォア及びクエンチャーを分離して、広範囲の温度にわたって検出され得るシグナルの増加をもたらすことができる。この実施例では、ＧＡＰＤＨのリアルタイム検出及びＣｑ決定は、温度１（５２℃）でのＰＣＲ中の各サイクルでの蛍光を取得することによって達成される。無傷及び分割構成の両方のＬＯＣＳプローブのステムは、温度１（５２℃）より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、したがって、ＬＯＣＳレポーターは、試料中のＭｇＰａの存在又は不在にかかわらず、温度１でのシグナルに寄与しない。
ＭｇＰａの存在下で、ＭＮＡザイム５は、ＰＣＲ中にＬＯＣＳプローブを切断することができる。ＭｇＰａの定性的検出は、増幅の前後の両方で、より高い温度２（７０℃）で蛍光を測定することによって達成される。無傷ＬＯＣＳステムのＴｍが温度２より高く（Ｔｍ＞７０℃）、分割ＬＯＣＳのステムのＴｍが温度２より低い（Ｔｍ＜７０℃）ため、蛍光の増加は、分割及び解離ＬＯＣＳに関連し、ＭｇＰａの存在を示す。この蛍光の増加は、この温度での分解されたＴａｑＭａｎプローブによって引き起こされる任意のバックグラウンド蛍光を上回っているはずであり、ＭｇＰａ標的の存在を示すとみなされる。
この実施例は、単一の蛍光チャネル（ＦＡＭ）における第２の標的の定性的な別個の温度検出を伴う、第１の標的の混合定量的リアルタイム測定を実証する。更に、この実施例は、実施例１で説明したように、終点分析法１～３を使用した離散蛍光測定値の測定によって、同じ２つの標的の定性分析を実証する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー５（配列番号２０）、逆方向プライマー５（配列番号２１）、パートザイムＡ５（配列番号２２）、パートザイムＢ５（配列番号２３）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２５）が含まれ、これらはＭｇＰａの増幅及び検出に特異的である。ＧＡＰＤＨの増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、独自のＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイ（ＦＡＭ）ヒトＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に含まれる。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積でリアルタイム増幅及び検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間（ＤＡ）、７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間（１サイクル当たり０．５℃の減衰）の１０サイクル、９５℃で５秒間及び５２℃で４０秒間（５２℃での各サイクルでのＤＡ）の４０サイクル、並びに７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクルであった。全ての反応は、３回反復で実行し、４０ｎＭの順方向プライマー５、２００ｎＭの逆方向プライマー５、２００ｎＭのパートザイムＡ５、２００ｎＭのパートザイムＢ５、３００ｎＭのＬＯＣＳ－２、１×ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイ（ＦＡＭ）、ヒトＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１×ＳｅｎｓｉＦａｓｔ緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はヒトゲノムＤＮＡ（１０，０００若しくは１００コピー）若しくはＭｇＰａ遺伝子の領域を含有する合成Ｇブロック（１０，０００若しくは１００コピー）若しくはヒトゲノムＤＮＡ及び合成ＭｇＰａ Ｇブロック（それぞれ１０，０００若しくは１００コピー）の両方を含有した。
結果
この実施例では、ＭＮＡザイム５によって切断可能な１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを単一のＰＣＲ反応で組み合わせて、単一の蛍光チャネル（ＦＡＭ）のみを使用して２つの標的ＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａをそれぞれ同時に検出及び鑑別した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の存在は、ＦＡＭチャネルにおける５２℃での蛍光シグナルの増加によってリアルタイムで検出され、ＰＣＲサイクルの前後の５２℃での離散的な時点での蛍光の分析によっても検出された。ＭｇＰａの存在は、同じチャネルでのＰＣＲサイクルの前後の７０℃での離散的な時点での蛍光の分析を通じてＬＯＣＳ－２の切断を監視することによって検出された。
図１８Ａに示される結果は、１０，０００（灰色の線）及び１００（破線）コピーのヒトＧＡＰＤＨ鋳型のみ（図１８Ａ）、１０，０００（灰色の線）及び１００（破線）コピーのＭｇＰａのみ（図１８Ｂ）、並びに１０，０００（灰色の線）及び１００（破線）コピーのヒトＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａ鋳型のそれぞれ（図１８Ｃ）を含有する反応混合物から、５２℃の取得温度でＦＡＭチャネルで得られたＰＣＲ増幅曲線を示す。標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を、図１８Ａ～Ｃ（黒の実線）に示す。
上記の反応から得られるＣｑ値を表１１に示すが、該当なし（Ｎ／Ａ）は、ヒトＧＡＰＤＨの不在と一致して５２℃で決定されるＣｑ値が存在しない場合を指す。Ｃｑ値は、２００ＲＦＵの単一の閾値を使用して決定された。結果は、ヒトＧＡＰＤＨのＣｑ値が、ＭｇＰａの存在又は不在にかかわらず同等であることを示している。したがって、ＦＡＭチャネルで得られたＣｑ値は、試料中のヒトＧＡＰＤＨの直接的な定量分析に使用され得る。
Figure 0007636448000011
図１９の結果は、ＦＡＭチャネルにおけるＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａ遺伝子の定性的検出の結果を示す。終点分析法１の結果は、２つの異なる温度で得られた蛍光シグナルの変化を示す図１９Ａに示されている。ΔＳＤ１（５２℃で測定）は、白黒パターンで示され、ΔＳＤ２（７０℃で測定）は、灰色で示されている。結果は、ΔＳＤ１が、ＧＡＰＤＨが反応中に存在する場合閾値Ｘ１を超えるが、ＧＡＰＤＨが存在しない場合には閾値を超えないことを示している。したがって、閾値Ｘ１より大きいΔＳＤ１は、ＧＡＰＤＨの存在を示す。結果はまた、ＭｇＰａが存在する場合、ΔＳＤ２が閾値Ｘ１を超え、反応においてΔＳＤ１より大きいことを示している（ΔＳＤ２＞ΔＳＤ１）。
図１９Ｂの結果は、ＭｇＰａのみの検出に終点分析法２を使用して、温度２及び温度１でＦＡＭチャネルで得られた蛍光シグナルの差（ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１）を示す。結果は、ΔΔＳＤ２ΔＳＤ１が、ＭｇＰａが反応中に存在する場合閾値Ｘ２を超えるが、試料にＭｇＰａが存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、閾値Ｘ２より大きいΔΔＳＤ２ΔＳＤ１は、ＭｇＰａの存在を示す。
図１９Ｃ及び１９Ｄの結果は、終点分析法３を使用して２つの異なる温度でＦＡＭチャネルで得られた蛍光シグナルの変化を示す。図１９Ｃにおいて、ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より大きい場合、これは、ＧＡＰＤＨ及び／又はＭｇＰａが反応中に存在することを示す。ΔＳＤ２が閾値Ｘ１より低い場合、これは、ＧＡＰＤＨもＭｇＰａも反応中に存在しないことを示す。図１９Ｄは、どの標的が反応中に存在するかを示すために比率ΔＳＤ１：ΔＳＤ２が使用され得ることを示している。この比率が閾値Ｒ１より高い場合、これは、ＧＡＰＤＨは存在するがＭｇＰａは存在しないことを示す。比率が閾値Ｒ２より低い場合、これは、ＭｇＰａは存在するがＧＡＰＤＨは存在しないことを示す。この比率が閾値Ｒ１とＲ２との間にある場合、これは、ＧＡＰＤＨ及びＭｇＰａの両方が存在することを示す。反応中にＧＡＰＤＨもＭｇＰａも存在しない場合（図１９Ｃから決定される）、比率の計算の必要性はなくなり、図１９Ｄに示されるようにＮ／Ａとして示される。
全体として、この実施例は、２つの標的を２つの異なる温度で単一の蛍光チャネルで検出することができることを実証し、それぞれ１つのＴａｑＭａｎプローブ及び１つのＬＯＣＳプローブを使用して、１つの標的は定量化され得、他方の標的は終点で検出され得る。この単純な方法は、融解曲線分析を必要としない。この実施例はまた、複数の別個の温度でのＰＣＲ前及びＰＣＲ後の蛍光値の比較によって、単一波長で複数の標的について定性的データを得ることができること、並びにいくつかの代替方法をこのデータの分析に適用することができることを実証している。この実施例は、更なる利点、すなわち、ＴａｑＭａｎプローブ等の他の技術を使用して、１つ以上のＬＯＣＳプローブを既存の市販キットと組み合わせ、したがって、それらの多重化能力を拡大する能力を実証している。
実施例７：分子ビーコン及びＬＯＣＳの組み合わせを使用した、単一波長での２つの標的のリアルタイム検出及び定量化。
以下の実施例は、１つの切断不可能な分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーターの組み合わせが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを収集することによって、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の同時検出及び定量化を可能にするアプローチを実証する。この戦略は、実施例４で実証されたように、特別な事後増幅分析法の必要性を排除する。図５に示されるように、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識される。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する標的１（ＴＶｂｔｕｂ）と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを含み、Ｔｍ ＢはＴｍ Ａより高い（Ｔｍ Ｂ＞Ｔｍ Ａ）。この実施例では、無傷ＬＯＣＳプローブは、Ｔｍ Ｃ（８２℃）を有するステム領域と、第２の標的２（ＭｇＰａ）の存在下でＭＮＡザイムによって切断されるとＴｍ Ｄ（６２℃）を有する分割ＬＯＣＳを生成するループ領域とを有し、Ｔｍ ＤはＴｍ Ｃより低い（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び／又は標的２（ＭｇＰａ）の存在は、２つの温度（Ｄ１及びＤ２、５２℃及び７４℃）での蛍光を各ＰＣＲサイクル後にリアルタイムで測定するか、又は増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅後に取得された単一の測定値を使用して識別することができる。以下の実施例では、Ｔｍ Ａは約６０℃であり、Ｔｍ Ｂは約６８℃であり、Ｔｍ Ｃは約８２℃であり、Ｔｍ Ｄは約６２℃であり、これはＤ１＜Ｔｍ Ａ＜Ｔｍ Ｂ＜Ｄ２及びＤ１＜Ｔｍ Ｄ＜Ｄ２＜Ｔｍ Ｃである実施例５に記載のシナリオ３と一致する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる。標的１（ＴＶｂｔｕｂ）の増幅及び定量化のための順方向プライマー１２（配列番号６３）、逆方向プライマー１２（配列番号６４）、及び分子ビーコン１（配列番号６８）。標的２（ＭｇＰａ）の増幅及び定量化のための順方向プライマー５（配列番号２０）及び逆方向プライマー５（配列番号２１）、パートザイムＡ５（配列番号２２）、パートザイムＢ５（配列番号２３）、並びにＬＯＣＳ－２（配列番号２５）。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータは、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間、７４℃で１５秒間（データは５２℃及び７４℃のステップで収集）、続いて９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０タッチダウンサイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、並びに９５℃で５秒間、５２℃で４０秒間、及び７４℃で５秒間の４０サイクル（データは５２℃及び７４℃のステップの両方で収集）であった。各反応は、２０ｎＭの順方向プライマー１２、４０ｎＭの順方向プライマー５、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、２００ｎＭの分子ビーコン１、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１レポーター、及び１×ＰｌｅｘＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。
反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＴＶｂｔｕｂ遺伝子の領域を含有する合成Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００、若しくは１００コピー）、ＭｇＰａ遺伝子の領域を含有する合成Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００、若しくは１００コピー）、合成ＭｇＰａ Ｇブロック（２５６００コピー）のバックグラウンドでの様々な濃度の合成ＴＶｂｔｕｂ Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００、若しくは１００コピー）、若しくは合成ＭｇＰａ Ｇブロック（
２５６００コピー）のバックグラウンドでの様々な濃度の合成ＴＶｂｔｕｂ Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００、若しくは１００コピー）のいずれかを含有した。４つの反応は、２００コピーのＭｇＰａを有する１２８００コピーのＴＶｂｔｕｂ、１２８００コピーのＭｇＰａを有する２００コピーのＴＶｂｔｕｂ、８００コピーのＭｇＰａを有する３２００コピーのＴＶｂｔｕｂ、及び３２００コピーのＭｇＰａを有する８００コピーのＴＶｂｔｕｂの異なる濃度で両方の標的を含有した。
結果
ＰＣＲ増幅中、蛍光を２つの温度でリアルタイムで測定し、標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び／又は標的２（ＭｇＰａ）の存在を検出及び定量化した。分子ビーコンは、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ＴＶ）の検出のためにＴＶｂｔｕｂに相同な配列を検出するように設計した。ＭＮＡザイムは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出のために、ＭｇＰａに相同な配列の存在下でＬＯＣＳ－２を切断するように設計された。ＰＣＲ中の特定のシグナルの存在又は不在は、表１２に要約され、全体的なスキームは、実施例５のシナリオ３（表１）に記載されるものに類似する。
Figure 0007636448000012
図２０に示される結果は、２５６００コピーのＴＶｂｔｕｂ（黒の点線）若しくはＭｇＰａ（黒の破線）のいずれか、２５６００コピーの両方の遺伝子標的の混合物（灰色の実線）を含有する、又は遺伝子標的なし（ＮＦ Ｈ２Ｏ、黒の実線）の反応からＦＡＭチャネルで測定された５２℃（Ｄ１、図２０Ａ）及び７４℃（Ｄ２、図２０Ｂ）での蛍光の比較増幅曲線を示す。結果を、３回反復反応の平均としてプロットする。
図２０Ａは、５２℃（Ｄ１）で、ＴＶｂｔｕｂ（黒の点線）の存在下での蛍光の増加、又は反応におけるＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの両方（灰色の実線）の増加を示すが、ＭｇＰａのみを含有する反応（黒の破線）を含む、ＴＶｂｔｕｂの不在下での蛍光の増加はな
い。この温度では、分子ビーコンは、存在する場合にはＴＶｂｔｕｂ遺伝子標的へのハイブリダイゼーションに応答して蛍光を発するか、又はその標的の不在下でクエンチされ、内部ハイブリダイズされたステムを維持する。同じ温度Ｄ１では、反応におけるＴＶｂｔｕｂ又はＭｇＰａのいずれかの存在又は不在にかかわらず、無傷及び／又は分割ＬＯＣＳ種の両方が、この温度でのそれぞれのステムのハイブリダイゼーションに起因してクエンチされる。蛍光が指数関数的に増加し始めるサイクル数は、ＴＶｂｔｕｂのみ、及びＴＶｂｔｕｂ＋ＭｇＰａを含有する反応において同等であり、ＭｇＰａの存在が、Ｄ１でのＴＶｂｔｕｂの定量化に影響しないことを示す。したがって、５２℃（Ｄ１）での蛍光の増加は、ＴＶｂｔｕｂの存在を示し、Ｄ１で得られたＣｑ値は、反応におけるＭｇＰａの存在又は不在にかかわらず、ＴＶｂｔｕｂの直接的な定量化に使用することができる。
図２０Ｂは、７４℃（Ｄ２）で、ＭｇＰａ（黒の破線）の存在下での蛍光の増加、又は反応におけるＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの両方（灰色の実線）の増加を示すが、ＴＶｂｔｕｂのみを含有する反応（黒の点線）を含む、ＭｇＰａの不在下での蛍光の増加はない。Ｄ２では、分子ビーコンは、存在する場合であってもＴＶｂｔｕｂにハイブリダイズできず、反応におけるいずれかの標的の存在又は不在にかかわらず、この温度でのそのステムの解離に起因して常に蛍光を発する。したがって、分子ビーコンの蛍光は、この温度で、増幅の前、増幅の間、及び増幅の後に、バックグラウンド蛍光レベルを提供する。更に、Ｄ２では、ＭｇＰａが存在しない場合、ＬＯＣＳプローブは無傷のままであり、クエンチされる。ＭｇＰａが反応中に存在する場合、ＭｇＰａに特異的なＭＮＡザイムによる切断が、この温度で解離したステム領域を有する分割ＬＯＣＳを生成するため、ＰＣＲ中バックグラウンドレベルを超えて蛍光が増加する。したがって、ＰＣＲ中のＤ２での蛍光の増加は、ＭｇＰａの存在を示す。蛍光が指数関数的に増加し始めるサイクル数は、ＭｇＰａのみの存在下、並びにＭｇＰａ及びＴＶｂｔｕｂの両方を含有する共感染の存在下において同等であり、ＴＶｂｔｕｂの存在が、Ｄ２でのＭｇＰａの定量化に影響しないことを示す。したがって、７２℃（Ｄ２）での蛍光の増加は、ＭｇＰａの存在を示し、Ｄ２で得られたＣｑ値は、反応におけるＴＶｂｔｕｂの存在にかかわらず、ＭｇＰａの直接的な定量化に使用することができる。
２５６００、６４００、１６００、４００及び１００コピーのＴＶｂｔｕｂを含有する標準反応を使用して、ＭｇＰａの存在下又は不在下でＴＶｂｔｕｂを含有する試料中の５２℃（Ｄ１）でのＴＶｂｔｕｂの開始濃度を定量するために使用される標準曲線（図２１Ａ）を構築した。表１３は、２５６００コピーのＭｇＰａの存在が、５２℃で検出されたＴＶｂｔｕｂの定量化に有意に影響を及ぼさなかったことを示す（対応のあるスチューデントｔ検定、ｐ値＝０．４１８）。同様に、２５６００、６４００、１６００、４００及び１００コピーのＭｇＰａを含有する標準を使用して、ＴＶｂｔｕｂの存在下又は不在下でＭｇＰａを含有する試料中の７４℃（Ｄ２）でのＭｇＰａの開始濃度を定量するために使用される標準曲線（図２１Ｂ）を構築した。表１３は、２５６００コピーのＴＶｂｔｕｂの存在が、７４℃で検出されたＭｇＰａの定量化に有意に影響を及ぼさなかったことを示す（対応のあるスチューデントｔ検定、ｐ値＝０．１５０）。無作為な濃度のＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ遺伝子標的を含有する試料も定量化し、得られた推定コピー数は、試料に添加された既知のＴＶｂｔｕｂの濃度と同等であった（表１４）。これは、ＴＶｂｔｕｂが、ＭｇＰａの存在にかかわらず、Ｄ１（５２℃）で正確に定量することができ、同様に、ＭｇＰａが、ＴＶｂｔｕｂの存在にかかわらず、Ｄ２（７４℃）で正確に定量することができることを示している。
Figure 0007636448000013
Figure 0007636448000014
この方法は、単一波長で複数の標的を区別するために、複数の温度での測定を利用し、続いて蛍光調整因子（ＦＡＦ）（例えばＴＯＣＥ）を使用して分析する、当該技術分野で知られている他の方法よりも大きな利点を提供する。この実施例における実施形態は、同じ分子の蛍光出力の温度関連の差を考慮するための調整を必要としない。第１の温度で１つの標的を検出し、第２の温度で２つの標的を検出する他の方法とは異なり、ＬＯＣＳ及び分子ビーコンを組み合わせたここで示される実施例は、１つの温度での１つの標的の検出及び定量化、並びに第１の標的の干渉のない第２の温度での第２の標的の検出及び定量化（並びにその逆）を可能にする。同様に、リアルタイム監視の不在下では、離散的な時点で測定された蛍光の観察される増加（ＰＣＲ後－ＰＣＲ前）は、第１の温度で標的１のみの存在を示し、第２の温度で標的２のみの存在を示す。
予言的な実施例８：デュアルハイブリダイゼーションプローブ及びＬＯＣＳの組み合わせを使用した、単一波長での２つの標的のリアルタイム検出及び定量化。
以下の実施例は、１対のデュアルハイブリダイゼーションプローブ及び１つのＬＯＣＳレポーターの組み合わせが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを取得することによって、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の同時検出及び定量化を可能にし得るアプローチを示す。代替的に、リアルタイムモニタリングが存在しない場合、アプローチは、例えば、増幅の開始時の又はその近く、及び増幅後の離散的な時点で収集された蛍光データに適用することができる。この戦略は、実施例４で概説されたように、特別な事後増幅分析法の必要性を排除する。
図２２に示されるように、デュアルハイブリダイゼーションプローブ及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネル内での同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識され得る。デュアルハイブリダイゼーションプローブは、Ｔｍ Ａを有する第１のプローブ、及びＴｍ Ｂを有する第２のプローブを含有し得、Ｔｍ Ａ及びＴｍ Ｂは等しくてもよく、又はＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂは異なり得る。一方のプローブがその３’末端でフルオロフォアで標識されてもよく、他方のプローブがその５’末端でクエンチャーで標識されてもよい。（代替的に、一方のプローブがその３’末端でクエンチャーで標識されてもよく、他方のプローブがその５’末端でフルオロフォアで標識されてもよい）。デュアルハイブリダイゼーションプローブは、例えば６０℃のＴｍ Ａ、及び例えば６０℃のＴｍ Ｂで標的１上で隣接してハイブリダイゼーションするように設計され得る。このシナリオでは、デュアルハイブリダイゼーションプローブは、増幅の前は蛍光性であるが、標的１が存在し、検出温度がＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂ未満である場合、増幅の後にクエンチされる。したがって、第１の温度（Ｄ１）、例えば５０℃で観察される蛍光の減少は、標的１の存在を示す。
更に、反応は、例えば８０℃のＴｍ Ｃを有するステム領域、及び第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断されると例えば６０℃のＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得るループ領域を有する無傷ＬＯＣＳプローブを含有し得る（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。このシナリオでは、無傷ＬＯＣＳは、増幅の前にクエンチされるが、標的２が存在し、検出温度がＴｍ Ｄを超えるがＴｍ Ｃ未満であり、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂを超える場合にのみ、増幅後に蛍光が増加する。したがって、第２の温度（Ｄ２）、例えば７０℃での観察される蛍光の増加は、標的２の存在を示す。
したがって、この組み合わせは、第１の温度（Ｄ１）での蛍光の減少として決定されるデュアルハイブリダイゼーションプローブを使用した標的１のみの検出と、第２の温度（Ｄ２）での蛍光の増加によって決定されるＬＯＣＳプローブを使用した標的２のみの検出とを可能にする。
Figure 0007636448000015
予言的な実施例９：Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ及びＬＯＣＳプローブの組み合わせを使用した、単一波長での２つの標的のリアルタイム検出及び定量化。
以下の実施例は、１つのＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ及び１つのＬＯＣＳレポーターの組み合わせが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを取得することによって、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の同時検出及び定量化を可能にし得るアプローチを示す。代替的に、リアルタイムモニタリングが存在しない場合、アプローチは、例えば、増幅の開始時の又はその近く、及び増幅後の離散的な時点で収集された蛍光データに適用することができる。この戦略は、実施例４で説明されたように、特別な事後増幅分析法の必要性を排除する。
この実施形態では、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプローブ及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識され得る。この戦略には２種類のＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ、すなわちＳｃｏｒｐｉｏｎユニプローブとＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブが使用され得る。Ｓｃｏｒｐｉｏｎユニプローブは、ブロッカーを介してＰＣＲプライマーの５’末端に直接結合した５’末端レポーター及び内部クエンチャーを有するステムループ構造で保持された一本鎖二重標識蛍光プローブ配列から構成され得る。ＰＣＲの間、プライマー部分は、標的１にハイブリダイズして伸長するように設計され得、ステムループのステム領域は、例えば５５℃のＴｍ Ａを有し得、ステムループのループ領域は、例えば６０℃のＴｍ Ｂを有する標的１アンプリコンに結合し得る。ＰＣＲの間、ヘアピン－ループが展開され得、ユニプローブのループ領域が、新たに合成された標的１配列に分子内でハイブリダイズし得、したがってフルオロフォア及びクエンチャーを分離し得る。したがって、ＰＣＲの間、第１の温度（Ｄ１
）、例えば５０℃での蛍光の観察される増加は、標的１の存在を示すであろう。
更に、反応は、例えば８０℃のＴｍ Ｃを有するステム領域、及び第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断されると例えば６０℃のＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得るループ領域を有する無傷ＬＯＣＳプローブを含有し得る（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。このシナリオでは、無傷ＬＯＣＳは、増幅の前にクエンチされるが、標的２が存在し、検出温度がＴｍ Ｄを超えるがＴｍ Ｃ未満であり、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂを超える場合にのみ、増幅後に蛍光が増加する。したがって、第２の温度（Ｄ２）、例えば６５℃での観察される蛍光の増加は、標的２の存在を示す。
したがって、この組み合わせは、第１の温度（Ｄ１）での蛍光の増加により監視されるＳｃｏｒｐｉｏｎユニプローブを使用した標的１のみの検出と、第２の温度（Ｄ２）での蛍光の増加によって監視されるＬＯＣＳプローブを使用した標的２のみの検出とを可能にする。
Figure 0007636448000016
同様に、ＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブをＬＯＣＳプローブと組み合わせることができる。Ｓｃｏｒｐｉｏｎバイプローブは、ブロッカーを介してＰＣＲプライマーの５’末端に直接結合した一本鎖蛍光プローブ配列から構成され得る。更に、プローブに相補的であり、クエンチャーで標識される配列は、Ｔｍ Ａでプライマー／プローブ分子に結合して
、ＰＣＲの前に又は標的の不在下でクエンチされる二重構造を形成し得る。ＰＣＲの間、プライマー部分は、標的１にハイブリダイズして伸長するように設計され得、プローブ領域及び相補的クエンチャー配列は、例えば５５℃のＴｍ Ａを有し得、プローブ領域は、例えば６０℃のＴｍ Ｂを有する標的１アンプリコンに結合し得る。ＰＣＲの間、相補的クエンチャー配列が解離し得、バイプローブのプローブが、新たに合成された標的１配列に分子内ハイブリダイズし得、したがって相補的クエンチャー配列の結合をブロックし、したがって蛍光を生成し得る。したがって、ＰＣＲの間、第１の温度（Ｄ１）、例えば５０℃での蛍光の観察される増加は、標的１の存在を示すであろう。
更に、反応は、例えば８０℃のＴｍ Ｃを有するステム領域、及び第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断されると例えば６０℃のＴｍ Ｄを有する分割ＬＯＣＳを生成し得るループ領域を有する無傷ＬＯＣＳプローブを含有し得る（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。このシナリオでは、無傷ＬＯＣＳは、増幅の前にクエンチされるが、標的２が存在し、検出温度がＴｍ Ｄを超えるがＴｍ Ｃ未満であり、かつＴｍ Ａ及びＴｍ Ｂを超える場合にのみ、増幅後に蛍光が増加する。したがって、第２の温度（Ｄ２）、例えば６５℃での観察される蛍光の増加は、標的２の存在を示す。
したがって、この組み合わせは、第１の温度（Ｄ１）での蛍光の増加により監視されるＳｃｏｒｐｉｏｎバイプローブを使用した標的１のみの検出と、第２の温度（Ｄ２）での蛍光の増加によって監視されるＬＯＣＳプローブを使用した標的２のみの検出とを可能にする。
Figure 0007636448000017
実施例１０：内部蛍光較正あり及びなしで、分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーターのうちの１つを使用して、単一波長で複数の標的を分析するための方法。
以下の実施例は、２つの温度で増幅前及び増幅後の蛍光読み取り値を取得することによって、１つの切断不可能な分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用して、単一波長で複数の標的を分析するための方法を実証する。この戦略は、実施例１で実証された特別な終点分析法の必要性を排除する。更に、この戦略は、リアルタイム検出に必要な全てのサイクルのデータ取得の必要性をなくし、したがって、結果が得られるまでの全体的な時間を低減するのに役立つ。図５に示されるように、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識される。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する標的１（ＴＶｂｔｕｂ）と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを含み、Ｔｍ ＢはＴｍ Ａより高い（Ｔｍ Ｂ＞Ｔｍ Ａ）。この実施例では、無傷ＬＯＣＳプローブは、Ｔｍ Ｃ（８２℃）を有するステム領域と、標的２（ＭｇＰａ）の存在下でＭＮＡザイムによって切断されるとＴｍ Ｄ（６２℃）を有する分割ＬＯＣＳを生成するループ領域とを有し、Ｔｍ ＤはＴｍ Ｃより低い（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び／又は標的２（ＭｇＰａ）の存在は、増幅の開始時若しくはその近く、及び増幅後に取得された単一の測定値を使用して、２つの温度（Ｄ１及びＤ２、５２℃及び７４℃）での蛍光の増加を測定することによって鑑別することができる。以下の実施例では、Ｔｍ Ａは約６０℃であり、Ｔｍ Ｂは約６８℃であり、Ｔｍ Ｃは約８２℃であり、Ｔｍ Ｄは約６２℃であり、これはＤ１＜Ｔｍ Ａ＜Ｔｍ Ｂ＜Ｄ２及びＤ１＜Ｔｍ Ｄ＜Ｄ２＜Ｔｍ Ｃである実施例５に記載のシナリオ３と一致する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる。標的１（ＴＶｂｔｕｂ）の増幅及び定量化のための順方向プライマー１２（配列番号６３）、逆方向プライマー１２（配列番号６４）及び分子ビーコン１（配列番号６８）、標的２（ＭｇＰａ）の増幅及び定量化のための順方向プライマー５（配列番号２０）、逆方向プライマー５（配列番号２１）、パートザイムＡ５（配列番号２２）、パートザイムＢ５（配列番号２３）、基質３（配列番号２４）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２５）。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間（ＤＡ）及び７４℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間の５０サイクル、並びに５２℃で５分間（ＤＡ）及び７４℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクルであった。全ての反応は、６回の反復を使用した１０コピーの鋳型を含有する反応を除いて、３回反復で行われた。各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、２００ｎＭの分子ビーコン１、３００ｎＭのＬＯＣＳ－２レポーター、及び１×ＰｌｅｘＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。第１のプレート上の反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＴＶｂｔｕｂの合成Ｇブロック（１００００若しくは２００コピー）、ＭｇＰａ遺伝子の合成Ｇブロック（１００００若しくは２００コピー）、若しくはＭｇＰａ遺伝子の合成Ｇブロック（１００００若しくは２００コピー）のバックグラウンドでの様々な組み合わせのＴＶｂｔｕｂ遺伝子の合成Ｇブロック（１００００若しくは２００コピー）のいずれかを含有した。第２のプレート上の反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＴＶｂｔｕｂの合成Ｇブロック（２００、１００、５０、２５若しくは１０コピー）、ＭｇＰａ遺伝子の合成Ｇブロック（２００、１００、５０、２５若しくは１０コピー）、若しくはＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａ遺伝子の合成Ｇブロックの両方（それぞれ２００、１００、５０、２５若しくは１０コピー）のいずれかを含有した。
結果
蛍光の増加は、２つの温度（Ｄ１及びＤ２、５２℃及び７４℃）でのＰＣＲ前及びＰＣＲ後の測定値（ΔＳ）の間の差を計算して、標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び標的２（ＭｇＰａ）のそれぞれの存在を決定することによって決定した。分子ビーコンは、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ＴＶ）の検出のためにＴＶｂｔｕｂに相同な配列を検出するように設計した。ＭＮＡザイムは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出のために、ＭｇＰａの存在下でＬＯＣＳ－１を切断するように設計された。ＰＣＲ中の特定のシグナルの存在又は不在は、実施例５のシナリオ３に記載されるものに類似する。
図２３は、第１の９６ウェルプレートを使用して測定した３回反復反応の平均として、それぞれ５２℃（（ΔＳＤ１、図２３Ａ）及び７４℃（ΔＳＤ２、図２３Ｂ）での蛍光の増加を測定することによる、ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの終点検出の要約を示す。ΔＳＤ１が図２３Ａにおいて指定された閾値（閾値１）を上回る場合、これは反応におけるＴＶｂｔｕｂの存在を示す。反応中のＭｇＰａの存在又は不在にかかわらず、１０，０００又は２００コピーのいずれかのＴＶｂｔｕｂを含有する全ての反応が、ＴＶｂｔｕｂについて正しく陽性であると決定された。ＴＶｂｔｕｂが存在しない全ての反応において、ΔＳＤ１は指定された閾値未満に留まり、鋳型なし対照（ＮＴＣ）と同様である。同様に、ΔＳＤ２が図２３Ｂの特定の閾値（閾値２）を超える場合、これは反応におけるＭｇＰａの存在を示す。反応中のＴＶｂｔｕｂの存在又は不在にかかわらず、１０，０００又は２００コピーのいずれかのＭｇＰａを含有する全ての反応が、ＭｇＰａについて正しく陽性であると決定された。ＭｇＰａが存在しない全ての反応において、ΔＳＤ２は指定された閾値未満に留まり、鋳型なし対照（ＮＴＣ）と同様である。
図２４は、第２の９６ウェルプレート上で測定されたＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａの終点検出の要約を示す。結果は、反復の平均であり、５２℃（ΔＳＤ１／Ｃ、図２４Ａ）及び７４℃（ΔＳＤ２／Ｃ、図２４Ｂ）での較正されたシグナルの増加を示す。較正係数は、閉じた、及び開いた立体構造でのビーコンのステムの解離から生じる蛍光を示す、５２℃と７４℃との間のＰＣＲ前蛍光の差（Ｃ＝ＳＤ２－Ｐｒｅ－ＰＣＲ－ＳＤ１－Ｐｒｅ－ＰＣＲ）として決定された。Ｄ２で分子ビーコンから生じるこのシグナルは、全ての反応において同じ量で存在し、いずれの標的の存在にも影響されない。したがって、ウェル間のＤ１及びＤ２でのシグナルのＰＣＲ前の分散（Ｃ）は、使用されるチャネルにおける真のウェル間分散を反映する。測定されたシグナルΔＳＤ１及びΔＳＤ２を、それぞれ較正係数（Ｃ）で除すことにより較正した（ΔＳＤ１／Ｃ及びΔＳＤ２／Ｃ）。図２４Ａは、ＴＶｂｔｕｂが存在する全ての反応において、較正されたシグナルΔＳＤ１／Ｃが指定された閾値（閾値１）を超えていること、又はＴＶｂｔｕｂが存在しない場合はそれ未満であることを示している。ＴＶｂｔｕｂが存在しない全ての反応において、ΔＳＤ１／Ｃは指定された閾値未満に留まり、鋳型なし対照（ＮＴＣ）と同様である。図２４Ｂは、ＭｇＰａが存在する全ての反応において、較正されたシグナルΔＳＤ２／Ｃが指定された閾値（閾値２）を超えていること、又はＭｇＰａが存在しない場合はそれ未満であることを示している。ＭｇＰａが存在しない全ての反応において、ΔＳＤ２／Ｃは指定された閾値未満に留まり、鋳型なし対照（ＮＴＣ）と同様である。図２４は、１反応当たり１０コピーで検出可能であったことから、両方の標的に対するアッセイの高い感度を実証している。
この実施例は、ΔＳＤ１（標的１のみを示す）及びΔＳＤ２（標的２のみを示す）を決定することによる、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の迅速な定性的終点検出のための１つの分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーターの使用を実証している。このアプ
ローチは、特別な終点分析法の必要性をなくす。この実施例では、式ΔＳＤ１／Ｃ及びΔＳＤ２／Ｃを使用して、追加のキャリブレータ試薬を必要とせずに、シグナルΔＳＤ１及びΔＳＤ２を同じチャネルで較正することができることも実証された。このアプローチは、実行間及び機器間の分散をより一貫した蛍光出力のために正規化することができるという点で有利である。更に、この実施例では、リアルタイム取得が必要ではなく、これは実行時間を低減し、この実施例では合計５４分測定された。
予言的な実施例１１：キャッチャー及びピッチャー並びにＬＯＣＳプローブの組み合わせを使用した、単一波長での２つの標的のリアルタイム検出及び定量化。
以下の実施例は、１つのキャッチャー及びピッチャー対及び１つのＬＯＣＳレポーターの組み合わせが、ＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを取得することによって、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の同時検出及び定量化を可能にし得るアプローチを示す。代替的に、リアルタイムモニタリングが存在しない場合、アプローチは、例えば、増幅の開始時の又はその近く、及び増幅後の離散的な時点で収集された蛍光データに適用することができる。この戦略は、実施例４で実証されたもの等の特別な増幅後分析法の必要性を排除する。
この実施形態では、キャッチャー及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識され得る。ピッチャーは、キャッチャーに相補的な５’タグ付け領域、及び第１の標的１に相補的な３’センサー領域を含む一本鎖オリゴヌクレオチドからなってもよい。キャッチャーは、５’末端にクエンチャーで標識された一本鎖オリゴヌクレオチド、及びクエンチャーの下流にあるフルオロフォアからなってもよく、またピッチャーに相補的である３’タグ付け領域を含んでもよい。キャッチャーが一本鎖立体構造状態にある場合、フルオロフォアはクエンチャーに近接しており、クエンチされたままである。ＰＣＲ中、プライマー及びピッチャーの３’センサー領域は、標的にハイブリダイズし得る。プライマー伸長中、ピッチャーは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって分解され得、ピッチャーのタグ付け部分を放出し得る。次いで、放出されたタグ付け部分は、キャッチャーの相補的な３’タグ付け部分にハイブリダイズし得る。ＰＣＲ中のＤＮＡポリメラーゼによるタグ付け部分の伸長は、フルオロフォア及びクエンチャーが分離された二本鎖キャッチャー二重構造を生成し得る。フルオロフォア及びクエンチャーの分離は、標的１の存在を示し得る蛍光の増加をもたらし得る。二本鎖キャッチャー二重構造のＴｍ（Ｔｍ Ａ、６０℃）未満、例えば５０℃の第１の検出温度（Ｄ１）では、キャッチャー二重構造立体構造時にフルオロフォア及びクエンチャーが分離されるため、蛍光の増加が観察され得る。二本鎖キャッチャー二重構造のＴｍ（Ｔｍ Ａ、６０℃）を超える、例えば７０℃の第２の検出温度（Ｄ２）では、キャッチャー及びピッチャーは、両方が一本鎖立体構造にあるように解離し得る。これは、フルオロフォア及びクエンチャーがもはや分離されないため、蛍光の減少をもたらし得る。したがって、Ｄ１でのＰＣＲ中の蛍光の増加は、二本鎖キャッチャー二重構造の存在、したがって標的１の存在を示すために使用され得る。標的１の不在下では、キャッチャーは一本鎖のままでクエンチされてもよく、したがってＤ１での蛍光の増加に寄与しない。キャッチャーは、二本鎖キャッチャー二重構造のＴｍ（Ｔｍ Ａ、６０℃）を超える温度で常に一本鎖のままであり、クエンチされるため、Ｄ２での蛍光は、標的１の存在又は不在によって影響を受けることはない。
更に、反応は、例えば８０℃のＴｍ Ｂを有するステム領域、及び第２の標的２の存在下でＭＮＡザイムによって切断されると例えば６０℃のＴｍ Ｃを有する分割ＬＯＣＳを生成し得るループ領域を有し得る無傷ＬＯＣＳプローブを含有し得る（Ｔｍ Ｃ＜Ｔｍ Ｂ）。このシナリオでは、無傷ＬＯＣＳは、増幅の前にクエンチされるが、標的２が存在し、検出温度がＴｍ Ｃ及びＴｍ Ａを超えるがＴｍ Ｂ未満である場合、増幅後に蛍光が増加する。したがって、第２の温度（Ｄ２）、例えば７０℃での観察される蛍光の増加
は、標的２の存在を示す。無傷ＬＯＣＳ及び分割ＬＯＣＳは両方とも、第１の検出温度（Ｄ１）では、Ｔｍがより高い（Ｄ１＜Ｔｍ Ｂ及びＤ１＜Ｔｍ Ｃ）ためクエンチされたままであり、標的２の存在は、第１の温度でのシグナルの変化に寄与しない。
したがって、ＬＯＣＳ及びキャッチャー－ピッチャープローブの組み合わせは、第１の温度での蛍光の増加によって監視されるように、キャッチャー－ピッチャープローブを使用してのみ標的１の検出を可能にすることができ、また第２の温度での蛍光の増加によって監視されるように、ＬＯＣＳプローブを使用してのみ標的２の検出を可能にし得る。
Figure 0007636448000018
実施例１２：機器間変動を最小限に抑えるために、同じＬＯＣＳプローブをキャリブレータとして使用して、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用して、単一波長で複数の標的の終点分析を行う方法。
以下の実施例は、１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターが、融解曲線分析を必要としない単一の蛍光チャネルにおける２つの遺伝子標的（ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ）の検出及び鑑別のために使用されるアプローチを実証する。ここで、較正係数は、２つの異なる温度でのＬＯＣＳレポーターからの増幅前シグナルから決定され、データを正規化して実行間及び機器間の変動を最小限に抑えるために使用される。
ＰＣＲの間、直鎖ＭＮＡザイム基質は、ＣＴｃｒｙの存在下で切断され、フルオロフォア及びクエンチャーを分離して、広範囲の温度にわたって検出され得るシグナルの増加をもたらすことができる。この実施例では、ＣＴｃｒｙのリアルタイム検出及びＣｑ決定は、温度１（５２℃、Ｄ１）でのＰＣＲ中の各サイクルでの蛍光を取得することによって達成される。ＣＴｃｒｙの定性的検出もまた、増幅の前後の両方でＤ１で蛍光を測定することによって達成される。無傷及び分割構成の両方のＬＯＣＳプローブは、Ｄ１（５２℃）より高い融解温度（Ｔｍ）を有し、したがって、ＬＯＣＳレポーターは、試料中のＮＧｏｐａの存在又は不在にかかわらず、Ｄ１でのシグナルに寄与しない。
ＮＧｏｐａの存在下で、ＭＮＡザイム２は、ＰＣＲ中にＬＯＣＳプローブを切断することができる。ＮＧｏｐａの定性的検出は、増幅の前後の両方で、より高い温度２（７０℃、Ｄ２）で蛍光を測定することによって達成される。無傷ＬＯＣＳステムのＴｍがＤ２より高く（Ｔｍ＞７０℃）、分割ＬＯＣＳのステムのＴｍがＤ２より低い（Ｔｍ＜７０℃）ため、蛍光の増加は、分割及び解離ＬＯＣＳに関連し、ＮＧｏｐａの存在を示す。この蛍光の増加は、この温度での直鎖ＭＮＡザイム基質の切断によって引き起こされる任意のバックグラウンド蛍光を上回っているはずであり、ＮＧｏｐａ標的の存在を示すとみなされる。
この実施例では、蛍光シグナル（ΔＳ）を、２つの異なる温度での増幅前の蛍光シグナル（ＳＤ１－ｐｒｅ－ＰＣＲ及びＳＤ３－ｐｒｅ－ＰＣＲ）に対して較正し、これは、無傷ＬＯＣＳの２つの異なる立体構造状態（すなわち、Ｄ１における無傷のハイブリダイズされたＬＯＣＳ及びＤ３における無傷の解離されたＬＯＣＳ）から生じるシグナルの差を説明する。この実施例では、無傷ＬＯＣＳの解離は、無傷ＬＯＣＳのＴｍ（Ｔｍ＜８５℃）よりも高い温度３（Ｄ３、８５℃）で生じる。較正係数（Ｃ）は、無傷ＬＯＣＳのステムが解離されて蛍光を発するＤ３における増幅前シグナル（ＳＤ３－ｐｒｅ－ＰＣＲ）と、無傷ＬＯＣＳのステムがハイブリダイズされてクエンチされるＤ１におけるシグナル（ＳＤ１－ｐｒｅ－ＰＣＲ）との差として計算される（Ｃ＝ＳＤ３－ｐｒｅ－ＰＣＲ－ＳＤ１－ｐｒｅ－ＰＣＲ）。較正係数（Ｃ）は、任意の標的の存在によって影響されないはずの各反応の負のシグナルと正のシグナルとの間の相対関係（すなわち、ダイナミックレンジ）を表す。較正係数（Ｃ）で観察される任意の変動は、次いで、各特定のチャネルにおける任意のウェル間の変動を反映し得る。したがって、この較正係数（Ｃ）を使用して、実行間及び機器間の変動を最小限に抑えることができる。この実施例では、各反応から得られる蛍光シグナルが、各温度でのΔＳ（ΔＳＤ１及びΔＳＤ２）を、較正係数で除すことによって較正される（ΔＳＤ１／Ｃ及びΔＳＤ２／Ｃ）。
この実施例は、実行間及び機器間の変動を最小限に抑えるためのキャリブレータとして機能するＬＯＣＳの追加機能を実証する。本実施例は、ＬＯＣＳレポーターから生じるＰＣＲ前の測定値をキャリブレータとして使用する一方で、ＰＣＲの前後に取られた離散的な温度での蛍光の測定、及び１つの標的のＣｑ決定による、単一のチャネルにおける２つの標的の同時定性分析を実証する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、順方向プライマー１（配列番号１）、逆方向プライマー１（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、順方向プライマー２（配列番号５）、逆方向プライマー２（配列番号６）、パートザイムＡ２（配列番号７）、パートザイムＢ２（配列番号８）、基質１（配列番号１３）、及びＬＯＣＳ－１（配列番号１４）が含まれる。配列は、配列表に列挙する。
標的１（ＣＴｃｒｙ）の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、基質１、パートザイムＡ１、パートザイムＢ１（ＭＮＡザイム１）、順方向プライマー１、及び逆方向プライマー１である。標的２（ＮＧｏｐａ）の増幅及び検出に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＬＯＣＳ－１、パートザイムＡ２、パートザイムＢ２（ＭＮＡザイム２）、順方向プライマー２、及び逆方向プライマー２である。
反応条件
３つのプレートにおいて３つの異なるＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーデバイス（機器１～３）を使用して、２０μＬの合計反応体積でリアルタイムＰＣＲ増幅及び検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９５℃で２分間、５２℃で１５秒間（ＤＡ）、７０℃で１５秒間（ＤＡ）、８５℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０サイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、９５℃で５秒間及び５２℃で４０秒間の４０サイクル（各サイクルでのＤＡ）、並びに７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクルであった。各プレートにおける全ての反応は、３回反復で実行し、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイムＡ、２００ｎＭの各パートザイムＢ、２００ｎＭの各基質、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１、及び１×ＳｅｎｓｉＦＡＳＴ緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＣＴｃｒｙの合成Ｇブロック（１０，０００若しくは４０コピー）、若しくはＮＧｏｐａ（１０，０００若しくは４０コピー）、若しくはＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ遺伝子の両方（それぞれ１０，０００若しくは４０コピー）のいずれかを含有した。標的なし対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を除く全ての反応は、３４．５ｎｇ（１０，０００遺伝子コピー）のヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを更に含有した。
結果
この実施例では、ＭＮＡザイム１によって切断可能な１つの直鎖ＭＮＡザイム基質、及びＭＮＡザイム２によって切断可能な１つのＬＯＣＳプローブを単一のＰＣＲ反応で組み合わせて、単一の蛍光チャネル（ＨＥＸ）のみを使用して２つの標的ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａをそれぞれ同時に検出及び鑑別した。ＣＴｃｒｙ遺伝子の存在は、ＨＥＸチャネルでのＰＣＲサイクルの前後の５２℃での離散的な時点での蛍光の分析を通じて直鎖基質１の切断を監視することによって検出された（ΔＳＤ１）。また、５２℃でのリアルタイムデータ取得から得られたＣｑ値は、反応におけるＣＴｃｒｙ量を示す（データは示さず）。ＮＧｏｐａの存在は、同じチャネルでのＰＣＲサイクルの前後の７０℃での離散的な時点での蛍光の分析を通じてＬＯＣＳ－１の切断を監視することによって検出された（ΔＳＤ２）。５２℃（Ｄ１）及び８５℃（Ｄ３）でのＰＣＲ前の蛍光シグナル間の差として、較正係数（Ｃ）を決定した。
３つのＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６機器にわたって、様々な量のＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａ鋳型を含有する３回反復反応からの平均ΔＳＤ１及びΔＳＤ２を、それぞれ表１９及び表２０に示す。更に、これらの値を、表２１（ΔＳＤ１／Ｃ）及び表２２（ΔＳＤ２／Ｃ）に示されるように、較正係数を使用して正規化した。結果は、３回反復反応の平均である。表１９及び表２０は、高い変動係数（ＣＶ）値（ＣＶ≧２３．０５％）で明らかなように、試験した３つの機器にわたる同じ鋳型を含有する反応のΔＳＤ１及びΔＳＤ２値の大きな変動を示している。これらの実行間及び／又は機器間の変動により、３つの機器のそれぞれについて標的の存在又は不在を決定するための単一の閾値を配置することが困難となる。しかしながら、較正係数を使用して正規化した後は、表２１及び表２２に示されるＣＶ値（ＣＶ≦４．１３％）の低下によって明らかなように、３つの異なる機器から得られた結果の変動ははるかに少ない。この結果は、Ｃを使用した正規化が、実行間又は機器間の変動を低減するための効果的な方法であることを示している。
Figure 0007636448000019
Figure 0007636448000020
Figure 0007636448000021
Figure 0007636448000022
Ｃを使用した正規化は、全ての機器で使用される固定された閾値で、試料中のＣＴｃｒｙ、ＮＧｏｐａ、又はＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方の存在又は不在を正確に決定するための代替方法を可能にする。図２５は、試験した３つのＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６機器（３回反復の平均、機器１は黒のストライプ、機器２は灰色、及び機器は白色）にわたるΔＳＤ１（図２１Ａ）、ΔＳＤ２（図２５Ｂ）、ΔＳＤ１／Ｃ（図２５Ｃ）、及びΔＳＤ２／Ｃ（図２５Ｄ）を示す。図２５Ｃは、０．４（閾値Ｃ１）を超えるΔＳＤ１／Ｃを示し、３つの機器全てにおける反応中のＣＴｃｒｙの存在を示す。図２５Ｄは、０．４（閾値Ｃ２）～０．９（閾値Ｃ３）のΔＳＤ２／Ｃ値が、３つの機器全てにおいて反応に存在するＣＴｃｒｙ又はＮＧｏｐａのうちの１つのみの存在を示す。ΔＳＤ２／Ｃが０．９（閾値Ｃ３）を超える場合、これは、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａの両方が３つの機器の全てにおいて反応に存在することを示す。ΔＳＤ２／Ｃが０．４未満である場合、３つの機器の全てにおいて反応にＣＴｃｒｙ又はＮＧｏｐａのいずれも存在しないことを示す。これらの結果を、表２１及び表２２に要約する。次いで、ΔＳＤ１／Ｃ及びΔＳＤ２／Ｃからの組み合わされた情報を使用して、反応におけるＣＴｃｒｙ及び／又はＮＧｏｐａの存在を正しく決定することができる。正規化されていないΔＳＤ１値について、図２５Ａは
、表１９に要約されるように、機器間の変動にもかかわらず、ＣＴｃｒｙの存在の決定に同じ閾値Ｃ１（２０００ＲＦＵ）を使用することが可能であることを示している。しかしながら、ΔＳＤ２で実行間又は機器間の変動が観察されたため、図２５Ｂは、異なる機器に異なる閾値Ｃ３が必要であり、固定した閾値を使用して更なる分析を行うことはできないことを示している。したがって、Ｃを使用した正規化によって、機器間又は実行間の変動にかかわらず、標的の存在又は不在の正確な決定のための固定された閾値の使用が可能となる。
この実施例は、実行間及び機器間の変動を最小限に抑えるためのキャリブレータとしての役割を果たすＬＯＣＳの追加機能を実証し、これにより、固定された閾値及び１つの標的のＣｑ決定を使用して、ＰＣＲの前後に取られた離散的な蛍光の測定によって、単一のチャネルにおける２つの標的の存在又は不在を正確に決定することができる代替の分析方法が可能となる。
この実施例で実証されるキャリブレータ法は、それが反応に追加される追加的な試薬の使用を必要とせず、他のウェルから得られたデータの使用を必要としないことを含む、いくつかの利点を有する。この方法は、存在し得るウェル間変動を較正及び補正するように機能する。更に、較正は、同じチャネルで取得されたデータを使用して処理され、したがって、機器間に存在し得るいかなるチャネル間変動の影響も受けない。多重反応のために複数のチャネルが利用される場合、各チャネルは、各チャネルのＬＯＣＳ較正シグナルに対して独立して較正され得る。これは、チャネル間の予測シグナル強度の比が機器間で有意に異なり、チャネル間変動を引き起こす場合、較正が悪影響を受けるため、内部対照又は内因性対照からのもの等、異なるチャネル内のシグナルに対してシグナルが較正されるシナリオに有利である。
予言的な実施例１３：１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した２つの標的の同時比色検出のための方法。
以下の実施例は、１つの温度（Ｄ１）で検出された１つの直鎖ＭＮＡザイム基質、及び第２の温度（Ｄ２）で検出された１つのＬＯＣＳレポーターを使用して達成され得る、単一の反応における２つの標的の同時比色検出及び鑑別のための金ナノ粒子の使用を実証する。
直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳレポーターは両方とも、両端を金ナノ粒子（ＧＮＰ）で標識することができるが、ＧＮＰは、基質及びＬＯＣＳレポーターが無傷のままで切断されていない場合凝集状態にある。凝集状態では、ＧＮＰは、個々の局在化プラズモンのカップリングに起因して、より長い波長で吸光度を示し、紫色として視覚化される。この紫色は、肉眼でも、ＵＶ／ＶＩＳ吸光度領域での分光法でも観察することができる。特定の標的１の存在下でのそれらのそれぞれのＭＮＡザイムによる直鎖基質の切断は、ＧＮＰの分離を引き起こし、これが広範囲の温度にわたって観察され得る紫色から赤色への色の変化を生じさせる。この実施例では、直鎖ＭＮＡザイム基質からの色の変化は、温度１（Ｄ１＝５２℃）における増幅の前後での吸光度のＵＶ／ＶＩＳ分光シフトを測定することによって検出することができ（ΔＳＤ１）、より短い波長での吸光度は、標的１の存在を示す。温度１（Ｄ１）では、第２の標的（標的２）の分割及び無傷ＬＯＣＳレポーターは両方とも、そのステム領域のＴｍが温度１（Ｄ１）より高いため、任意の色の変化又は吸光度の検出可能な分光シフトを生成しない。したがって、ＰＣＲ後の温度１（Ｄ１）で得られた任意の色の変化又は吸光度の分光シフトは、標的２の存在又は不在にかかわらず、反応における標的１の存在を反映する。
それぞれのＭＮＡザイムによるＬＯＣＳレポーターの標的媒介性切断もまた、色の変化（紫色から赤色）及び／又は吸光度の分光学的シフトを生成するが、これは、ＬＯＣＳス
テム領域のＴｍより高い特定の温度範囲内でのみ生じる。この実施例では、分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍより高いが、無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍより低い増幅の前後の温度２（Ｄ２＝７０℃）で（無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍ＞温度２＞分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍ）、色の変化及び／又は吸光度の分光シフトを測定することができる（ΔＳＤ２）。したがって、無傷ＬＯＣＳレポーターは、温度２（Ｄ２）で吸光度のいかなる色の変化及び／又は分光シフトも生じず、したがって、この温度での切断された直鎖基質１（存在する場合）に関連するいずれかを上回るＰＣＲ中の吸光度の増加したシフトは、分割ＬＯＣＳ－１と関連し、標的２の存在を示す。
予言的な実施例１４：１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した２つの標的の同時表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出のための方法。
以下の実施例は、１つの温度（Ｄ１）で検出された１つの直鎖ＭＮＡザイム基質、及び第２の温度（Ｄ２）で検出された１つのＬＯＣＳレポーターを使用して達成され得る、単一の反応における２つの標的の同時表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出及び鑑別のための金ナノ粒子の使用を実証する。
直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳレポーターは両方とも、一端を金表面に結合させ、他端を金ナノ粒子（ＧＮＰ）で標識することができる。直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳが切断されず、無傷である場合、ＧＮＰは金表面に近接したままであり、測定可能なベースラインＳＰＲシグナルを示す。特異的な標的１の存在下での直鎖基質のそれぞれのＭＮＡザイムによる切断は、ＳＰＲシグナルの測定可能なシフトを生じさせる金表面からのＧＮＰの分離を引き起こす。この実施例では、直鎖ＭＮＡザイム基質からのＳＰＲシグナルのシフトは、増幅の前後で第１の温度１（Ｄ１＝５２℃）で検出することができ（ΔＳＤ１）、測定可能なＳＰＲシグナルのシフトは、標的１の存在を示す。温度１（Ｄ１）では、第２の標的（標的２）の分割及び無傷ＬＯＣＳレポーターは両方とも、そのステム領域のＴｍが温度１（Ｄ１）より高く、ＧＮＰが金表面にハイブリダイズしたままであるため、ＳＰＲシグナルの任意の測定可能なシフトを生成しない。したがって、ＰＣＲ後の温度１（Ｄ１）で得られた任意の測定可能なＳＰＲシフトは、標的２の存在又は不在にかかわらず、反応における標的１の存在を反映する。
例えばＭＮＡザイムによるＬＯＣＳレポーターの標的媒介性切断もまた、ＳＰＲシグナルの測定可能なシフトを生成し得るが、これは、ＬＯＣＳステム領域のＴｍより高い特定の温度範囲内でのみ生じる。この実施例では、分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍより高いが、無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍより低い増幅の前後の温度２（例えばＤ２＝７０℃）で（無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍ＞温度２＞分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍ）、ＳＰＲシグナルの更なる測定可能なシフトを測定することができる（ΔＳＤ２）。したがって、無傷ＬＯＣＳレポーターは、温度２（Ｄ２）でＳＰＲシグナルのいかなる測定可能なシフトも生じず、したがって、この温度での切断された直鎖基質１（存在する場合）に関連するいずれかを上回るＰＣＲ中のＳＰＲシグナルの増加した測定可能なシフトは、分割ＬＯＣＳ－１と関連し、標的２の存在を示す。
予言的な実施例１５：１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳプローブを使用した２つの標的の同時電気化学的検出のための方法。
以下の実施例は、１つの温度（Ｄ１）で検出された１つの直鎖ＭＮＡザイム基質、及び第２の温度（Ｄ２）で検出された１つのＬＯＣＳレポーターを使用して達成され得る、単一の反応における２つの標的の同時電気化学的検出及び鑑別のための、メチレンブルー等の酸化還元活性種の使用を実証する。
直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳレポーターは両方とも、一端を電極表面上に、例えば金電極にＡｕ－Ｓ結合により固定し、他端を電気化学的活性分子であるメチレンブルー
で標識することができる。直鎖ＭＮＡザイム基質及びＬＯＣＳが切断されず、無傷である場合、メチレンブルー分子は電極表面に近接して制限され、電気化学的リーダーによって検出され得る大きな電流を生成する。
特異的な標的１の存在下での直鎖基質のそれぞれのＭＮＡザイムによる切断は、電流の有意な減少を生じさせる電極表面からのメチレンブルー分子の分離を引き起こす。この実施例では、切断された直鎖ＭＮＡザイム基質からの電流の減少は、増幅の前後で第１の温度１（Ｄ１＝５２℃）で検出することができ（ΔＳＤ１）、この電流の減少を使用して標的１の存在を示すことができる。温度１（Ｄ１）では、第２の標的（標的２）の分割及び無傷ＬＯＣＳレポーターは両方とも、そのステム領域のＴｍが温度１（Ｄ１）より高く、メチレンブルー分子が電極表面にハイブリダイズし近接したままであるため、電流の任意の測定可能な減少を生成しない。したがって、ＰＣＲ後の温度１（Ｄ１）で得られた任意の測定可能な電流の減少は、標的２の存在又は不在にかかわらず、反応における標的１の存在を反映する。
そのそれぞれのＭＮＡザイムによるＬＯＣＳレポーターの標的媒介性切断もまた、電流の測定可能な減少を生成し得るが、これは、ＬＯＣＳステム領域のＴｍより高い特定の温度範囲内でのみ生じる。この実施例では、分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍより高いが、無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍより低い増幅の前後の温度２（Ｄ２＝７０℃）で（無傷ＬＯＣＳレポーターのＴｍ＞温度２＞分割ＬＯＣＳレポーターのＴｍ）、電流の更なる測定可能な減少を測定することができる（ΔＳＤ２）。したがって、無傷ＬＯＣＳレポーターは、温度２（Ｄ２）で電流のいかなる測定可能な減少も生じず、したがってこの温度での切断された直鎖基質１（存在する場合）に関連するいずれかを上回るＰＣＲ中の電流の更なる減少は、分割ＬＯＣＳ－１と関連し、標的２の存在を示す。
実施例１６：１つの分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーター、並びに５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ポリメラーゼを使用して、単一波長で複数の標的を同時に検出及び定量化するための方法。
以下の実施例は、１つの切断不可能な分子ビーコン及び１つのＬＯＣＳレポーターを使用してＰＣＲ中にリアルタイムで２つの温度で蛍光読み取りを取得することによって、単一の蛍光チャネルにおいて２つの標的を同時検出及び定量化するための方法を実証する。この実験は、標的の存在下での分子ビーコンの分解を排除するための、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換ポリメラーゼの使用を実証する。この戦略は、実施例４で実証された特別な分析法の使用を必要としない。図５に示されるように、分子ビーコン及びＬＯＣＳプローブは両方とも、同じ蛍光チャネルでの同時検出のために、同じフルオロフォア及びクエンチャー部分で標識される。分子ビーコンは、Ｔｍ Ａを有するステム領域と、Ｔｍ Ｂを有する標的１（ＴＶｂｔｕｂ）と特異的にハイブリダイズすることができるループ領域とを含み、Ｔｍ ＢはＴｍ Ａより高い（Ｔｍ Ｂ＞Ｔｍ Ａ）。この実施例では、無傷ＬＯＣＳプローブは、Ｔｍ Ｃ（８２℃）を有するステム領域と、標的２（ＭｇＰａ）の存在下でＭＮＡザイムによって切断されるとＴｍ Ｄ（６２℃）を有する分割ＬＯＣＳを生成するループ領域とを有し、Ｔｍ ＤはＴｍ Ｃより低い（Ｔｍ Ｄ＜Ｔｍ Ｃ）。標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び／又は標的２（ＭｇＰａ）の存在は、２つの温度（Ｄ１及びＤ２、５０℃及び７２℃）での蛍光を各ＰＣＲサイクル後にリアルタイムのいずれかで測定することにより識別することができる。以下の実施例では、Ｔｍ Ａは約６０℃であり、Ｔｍ Ｂは約６８℃であり、Ｔｍ Ｃは約８２℃であり、Ｔｍ Ｄは約６２℃であり、これはＤ１＜Ｔｍ Ａ＜Ｔｍ Ｂ＜Ｄ２及びＤ１＜Ｔｍ Ｄ＜Ｄ２＜Ｔｍ Ｃである実施例５に記載のシナリオ３と一致する。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる。標的１（ＴＶｂｔｕｂ
）の増幅及び定量化のための順方向プライマー１２（配列番号６３）、逆方向プライマー１２（配列番号６４）及び分子ビーコン１（配列番号６８）、標的２（ＭｇＰａ）の増幅及び定量化のための順方向プライマー５（配列番号２０）、逆方向プライマー５（配列番号２１）、パートザイムＡ５（配列番号２２）、パートザイムＢ５（配列番号２３）、ＬＯＣＳ－２（配列番号２５）。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９２℃で２分間、５０℃で１５秒間（ＤＡ）及び７２℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９２℃で５秒間、５０℃で４０秒間（ＤＡ）及び７２℃で５秒間（ＤＡ）の５０サイクルであった。全ての反応は、３回反復で行われた。各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、２００ｎＭの分子ビーコン１、２００ｎＭのＬＯＣＳ－２レポーター、２単位のＳＤポリメラーゼＨｏｔｓｔａｒｔ（Ｂｉｏｒｏｎ）、８００μＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、８ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏｒｏｎ）及び１×ＮＨ４緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。第１のプレート上の反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、様々な濃度の、０若しくは２５６００コピーのＭｇＰａ遺伝子のバックグラウンドでのＴＶｂｔｕｂの合成Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００若しくは１００コピー）、又は０若しくは２５６００コピーのＴＶｂｔｕｂ遺伝子のバックグラウンドでのＭｇＰａ遺伝子の合成Ｇブロック（２５６００、６４００、１６００、４００若しくは１００コピー）のいずれかを含有した。
結果
ＰＣＲ増幅中、蛍光を２つの温度でリアルタイムで測定し、標的１（ＴＶｂｔｕｂ）及び／又は標的２（ＭｇＰａ）の存在を検出及び定量化した。分子ビーコンは、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（ＴＶ）の検出のためにＴＶｂｔｕｂに相同な配列を検出するように設計した。ＭＮＡザイムは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出のために、ＭｇＰａの存在下でＬＯＣＳ－２を切断するように設計された。蛍光が動的閾値（最大蛍光の２０％に設定）を超えるサイクル数（Ｃｑ）を、ＴＶｂｔｕｂ及びＭｇＰａを検出及び定量化するためのそれぞれ５０℃及び７２℃でのリアルタイム蛍光取得から決定した。ＰＣＲ中の特定のシグナルの存在又は不在は、実施例５のシナリオ３に記載されるものに類似する。
２５６００、６４００、１６００、４００及び１００コピーのＴＶｂｔｕｂを含有する標準反応を使用して、ＭｇＰａの存在下又は不在下でＴＶｂｔｕｂを含有する試料中の５０℃（Ｄ１）でのＴＶｂｔｕｂの開始濃度を定量するために標準曲線（Ｒ２＝０．９８９、Ｅ＝１３９．１４％）を構築した。表２３は、５０℃で取得されたリアルタイムデータから得られた標準曲線から決定されたＴＶｂｔｕｂのコピー数を要約している。ＴＶｂｔｕｂの計算コピー数は、０．２９７のｐ値が統計的に有意でないことを裏付けているため（スチューデントの対応のあるｔ検定）、反応における２５，６００コピーのＭｇＰａの存在によって影響を受けない。同様に、２５６００、６４００、１６００、４００及び１００コピーのＭｇＰａを含有する標準を使用して、ＴＶｂｔｕｂの存在下又は不在下でＭｇＰａを含有する試料中の７２℃（Ｄ２）でのＭｇＰａの開始濃度を定量するために標準曲線（Ｒ２＝０．９９０、Ｅ＝１１６．４９％）を構築した。表２４は、７２℃で取得されたリアルタイムデータから得られた標準曲線から決定されたＭｇＰａのコピー数を要約している。ＭｇＰａの計算コピー数は、０．３１９のｐ値が統計的に有意でないことを裏付けているため（スチューデントの対応のあるｔ検定）、反応における２５，６００コピーのＴＶｂｔｕｂの存在によって影響を受けない。
Figure 0007636448000023
Figure 0007636448000024
実施例１７：バックグラウンドシグナルが実験反応又は標的を欠く同等の対照反応のいずれかで測定される、増幅の前又は後に取得された１つ以上の測定値を使用してバックグラウンドシグナルを決定するための方法。
以下の実施例は、単一波長における複数の標的の定性分析を可能にする様々な戦略を実証する。本実施例に示される分析法は、実施例１に示される終点分析法２に類似しているが、本実施例は、同じ反応ウェルにおいて、Ｄ１及びＤ２における増幅前の読み取り値のみを使用するのではなく、異なる方法によってバックグラウンドシグナルが決定され得ることを実証する。
アッセイは、直鎖ＭＮＡザイム基質を使用して標的１（ＣＴｃｒｙ）が検出及び鑑別され得、また標的２（ＮＧｏｐａ）が、そのループ内に異なるＭＮＡザイム基質を含むＬＯＣＳレポーターを使用して検出及び鑑別され得るように設計されている。ＰＣＲの間、ＭＮＡザイム１は、ＣＴｃｒｙの存在下で直鎖基質１を切断して、フルオロフォア及びクエンチャーを分離し、広範囲の温度にわたって検出され得るシグナルの増加をもたらすことができる。この実施例では、ＣＴｃｒｙの終点検出は、実施例１のΔＳＤ１と同様の機能を果たす正規化された蛍光シグナル（ＮＳＤ１）を決定することによって達成することができ、温度１（Ｄ１、５２℃）でのＰＣＲ後のシグナルと、以下の表２５に要約されるい
くつかの異なるアプローチを使用して決定されたバックグラウンドシグナルとの間の差として決定される。無傷及び分割構成の両方のＬＯＣＳ－１のステムは、Ｄ１を超えるＴｍを有し、したがって、ＮＳＤ１は、ＬＯＣＳ－１の切断の影響を受けない、ひいては試料中のＮＧｏｐａの存在又は不在の影響を受けないままである。したがって、ＮＳＤ１が閾値（Ｘ１）より大きい場合、これは、切断された直鎖ＭＮＡザイム基質１、ひいては標的１、ＣＴｃｒｙの存在を示す。
ＮＧｏｐａの存在下で、ＭＮＡザイム２は、ＰＣＲ中にＬＯＣＳ－１を切断することができる。温度２（Ｄ２、７０℃）における正規化された蛍光シグナル（ＮＳＤ２）は、温度２におけるＰＣＲ後シグナルと、同じく表２５に従って測定されるバックグラウンドシグナルとの間の差として計算され得る。ＮＳＤ２は、実施例１のΔＳＤ２と同様の機能を有する。ＰＣＲ中のＬＯＣＳ－１の切断は、温度２での正規化された蛍光シグナル（ＮＳＤ２）の増加に寄与するが、ＮＳＤ１に影響を及ぼさないため、ＮＳＤ２とＮＳＤ１との間の差（ＮＳＤ２－ＮＳＤ１）が第２の閾値（Ｘ２）を超える、したがってＮＳＤ２－ＮＳＤ１＝ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１＞Ｘ２である場合、これは分割ＬＯＣＳ－１の存在を示す。対照的に、基質１のみの切断は、ＮＳＤ２及びＮＳＤ１値の両方の増加に寄与し、これら２つの値の間の差（ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１）は、第２の閾値（Ｘ２）未満である。したがって、ＮＳＤ２とＮＳＤ１との間の差（ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１＝ＮＳＤ２－ＮＳＤ１）が第２の閾値（Ｘ２）より大きい場合、これは、分割ＬＯＣＳ－１、ひいては標的２、ＮＧｏｐａの特異的な検出を示す。
Figure 0007636448000025
以下の実施例は、同じウェル内の第３の温度（Ｄ３）でのＰＣＲの前に測定されたバッ
クグラウンドシグナル（ＳＤ３）を使用して、ＮＳＤ１及びＮＳＤ２を計算することができることを実証する。３つの異なるＰＣＲ前温度、すなわち、Ｄ３Ａ＝４０℃、Ｄ３Ｂ／Ｄ１＝５２℃、及びＤ３Ｃ＝６０℃を試験した（表２５）。この戦略は、複数のＰＣＲ前データ取得ポイントの必要性をなくし（すなわち、Ｄ１及びＤ２で２回ではなく、Ｄ３で１回）、実験の時間及び複雑性を低減する。更に、以下の実施例は、バックグラウンドシグナルを、鋳型を欠く別個の陰性対照反応で測定することができることを実証する。ある場合においては、Ｄ３Ｂ＝５２℃＝Ｄ１で取られた単一のＰＣＲ前バックグラウンド測定値を使用して、ＮＳＤ１及びＮＳＤ２の両方を計算し、他の場合においては、別個の陰性対照反応からのＰＣＲの前又は後のいずれかで、Ｄ１（５２℃）及びＤ２（７０℃）で２つのバックグラウンド読み取り値を取った。
オリゴヌクレオチド
この実験に特異的なオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる。標的１（ＣＴｃｒｙ）の増幅及び検出のための順方向プライマー１（配列番号１）、逆方向プライマー１（配列番号２）、パートザイムＡ１（配列番号３）、パートザイムＢ１（配列番号４）、及び直鎖ＭＮＡザイム基質１（配列番号１３）、標的２（ＮＧｏｐａ）の増幅及び検出のための順方向プライマー２（配列番号５）、逆方向プライマー２（配列番号６）、パートザイムＡ５（配列番号７）、パートザイムＢ５（配列番号８）、及びＬＯＣＳ－１（配列番号１４）。配列は、配列表に列挙する。
反応条件
ＢｉｏＲａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６熱サイクラーを使用して、２０μＬの合計反応体積で標的配列のリアルタイム検出を実行した。サイクリングパラメータ及び蛍光データ取得（ＤＡ）点は、９５℃で２分間、４０℃で１５秒間（ＤＡ）、５２℃で１５秒間（ＤＡ）、６２℃で１５秒間（ＤＡ）、及び７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクル、９５℃で５秒間及び６１℃で３０秒間の１０サイクル（１サイクル当たり０．５℃の減衰）、９５℃で５秒間及び５２℃で４０秒間の４０サイクル、並びに５２℃で１５秒間（ＤＡ）及び７０℃で１５秒間（ＤＡ）の１サイクルであった。全ての反応は３回反復で行われ、各反応は、４０ｎＭの各順方向プライマー、２００ｎＭの各逆方向プライマー、２００ｎＭの各パートザイム、２００ｎＭの直鎖ＭＮＡザイム基質１、２００ｎＭのＬＯＣＳ－１レポーター、及び１×ＰｌｅｘＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有した。反応は、標的を含有しない（ＮＦ Ｈ２Ｏ）か、又はＣＴｃｒｙ（１０，０００若しくは４０コピー）、若しくはＮＧｏｐａ遺伝子（１０，０００若しくは４０コピー）、若しくはＮＧｏｐａ遺伝子（１０，０００及び４０コピー）のバックグラウンドでの様々な濃度のＣＴｃｒｙ遺伝子（１０，０００若しくは４０コピー）の合成Ｇブロックを含有した。陰性（標的なし）対照（ＮＦ Ｈ２Ｏ）を除く全ての反応は、３４．５ｎｇ（１０，０００コピー）のヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドを更に含有した。
結果
図２６の結果は、４０℃（図２６Ａ～Ｂ）、５２℃（図２６Ｃ～Ｄ）、及び６２℃（図２６Ｅ～Ｆ）での同じ反応ウェル内からのＰＣＲ前の蛍光測定（ＳＤ３）を使用して決定されたバックグラウンドシグナルを使用した、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａそれぞれの検出のためのＮＳＤ１（ＬＨＳ）及びΔＮＳＤ２ＮＳＤ１（ＲＨＳ）の計算値を示す。図２７の結果は、別個の陰性対照反応から決定されたバックグラウンドシグナル値を使用した、ＣＴｃｒｙ及びＮＧｏｐａそれぞれの検出のためのＮＳＤ１（ＬＨＳ）及びΔＮＳＤ２ＮＳＤ１（ＲＨＳ）の計算値を示す。バックグラウンドシグナルは、ＰＣＲ前（図２７Ａ～Ｂ）にＤ３Ｂ／Ｄ１で、並びにＰＣＲ前（図２７Ｃ～Ｄ）及びＰＣＲ後（図２７Ｅ～Ｆ）にＤ１及びＤ２で測定された鋳型なし対照シグナルの平均値として決定した。
図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、図２７Ａ、図２７Ｃ及び図２７Ｅの結果は、全てのシ
ナリオにおいて、ＮＧｏｐａの存在又は不在にかかわらず、ＣＴｃｒｙが試料内に存在する場合、温度１における正規化されたシグナル（ＮＳＤ１）が閾値１（Ｘ１）を超えるが、ＮＧｏｐａのみの存在下、及び／又はＣＴｃｒｙが試料に存在しない場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、温度１での閾値１を超える正規化された終点のシグナルは、ＣＴｃｒｙの存在を示す。図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、図２７Ｂ、図２７Ｄ、及び図２７Ｆの結果は、６つ全てのシナリオにおいて、ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１が、ＮＧｏｐａが試料中に存在する場合閾値２（Ｘ２）を超えるが、ＣＴｃｒｙのみが試料中に存在する場合、及び／又は試料中にＮＧｏｐａが存在しない（ＮＴＣ）場合には、この閾値を超えないことを示している。したがって、閾値２を超える正規化された終点蛍光シグナル、ＮＳＤ２及びＮＳＤ１の差（ΔＮＳＤ２ＮＳＤ１＞Ｘ２）は、ＮＧｏｐａの存在を示す。
この実施例は、第３の温度で測定される、及び／又は別個の陰性対照反応のデータからバックグラウンドシグナルを決定する柔軟性を有する、単一の蛍光チャネルにおける２つの標的の終点検出及び鑑別のための１つの直鎖ＭＮＡザイム基質及び１つのＬＯＣＳレポーターの使用を実証する。
Figure 0007636448000026

Figure 0007636448000027
Figure 0007636448000028
Figure 0007636448000029
表２６のオリゴ配列の説明
オリゴヌクレオチド配列は、５’～３’に列挙される。大文字の塩基はＤＮＡを表し、小文字の塩基はＲＮＡを表す。／５６－ＦＡＭ／はＦＡＭフルオロフォアの位置を示し、／５６－ＪＯＥＮ／はＪＯＥフルオロフォアの位置を示し、／５ＲＨＯ１０１Ｎ／はＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１フルオロフォアの位置を示し、／５Ａｔｔｏ６８０Ｎ／はＡＴＴＯ ６８０フルオロフォアの位置を示し、／５Ｃｙ５／はｃｙ５．５フルオロフォアの位置を示す。／３ＩＡＢｋＦＱ／は、４２０～６２０ｎｍの範囲内の蛍光を吸収することができるＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱクエンチャーの位置を表し、／３ＩＡｂＲＱＳｐ／は、５００～７００ｎｍの範囲内の蛍光を吸収するために使用されるＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱクエンチャーの位置を表す。／３Ｐｈｏｓ／は、３’リン酸基を示す。

Claims (21)

  1. 試料中の第１及び第２の標的の存在又は不在を決定するための方法であって、
    （ａ）前記第１及び第２の標的を含むと推定される前記試料又はその誘導体を、
    －前記第１の標的の検出のための第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の検出可能なシグナルを生成することができる第１の検出部分を含む第１のオリゴヌクレオチド、
    －前記第２の標的の検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、前記ステム部分は、第２の検出可能なシグナルを生成することができる第２の検出部分を含み、
    前記第１及び第２の検出部分は、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない検出可能なシグナルを生成することができる、無傷ステムループオリゴヌクレオチド、並びに
    －前記第２の標的が前記試料中に存在する場合にのみ、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化することができる第１の酵素と接触させることにより、反応用の混合物を調製することと、
    （ｂ）前記混合物を、
    －前記第１の標的が、前記第１のオリゴヌクレオチドへの修飾を誘導し、それにより前記第１の検出部分が第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にするのに好適であり、
    －前記第２の標的が前記試料中に存在する場合にのみ、前記第１の酵素により前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより前記一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供するのに好適である条件下で処理することと、
    （ｃ）
    －前記混合物中、又は対照混合物中の前記第１及び第２の検出部分によって提供されるバックグラウンドシグナルを測定することと、
    （ｄ）前記処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
    －前記バックグラウンドシグナルとは異なり、前記試料中の前記第１の標的の存在を示す前記修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、第１の温度で生成されるかどうか、
    －前記バックグラウンドシグナルとは異なり、前記試料中の前記第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、第２の温度で生成されるかどうかを決定することと、を
    含み、
    －前記第１の温度において、前記第２の検出可能なシグナルが前記バックグラウンドシグナルと異ならず、
    前記第２の温度において、
    前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖は、存在する場合、部分的又は完全に解離され、前記第２の検出部分が前記第２の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
    前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖は、存在する場合、解離することができず、それにより前記第２の検出可能な部分が前記第２の検出可能なシグナルを提供することを防止する、方法。
  2. パート（ｄ）における前記決定が、
    －前記修飾から生じる前記第１の検出可能なシグナルが前記第１の温度で任意の前記バックグラウンドシグナルと異なるかどうかを決定するために所定の閾値を使用すること、及び／又は
    －前記第２の検出可能なシグナルが前記第２の温度で任意の前記バックグラウンドシグナルと異なるかどうかを決定するために所定の閾値を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. －前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾は、前記第１の検出部分が、前記第１の温度以下で前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
    －前記第１の検出可能なシグナルの生成は、可逆的であり、
    －パート（ｃ）が、
    第１の温度の５℃以内の第１のバックグラウンドシグナル、及び第２の温度の５℃以内の第２のバックグラウンドシグナルを測定することを含み、
    これらは前記混合物中、又は前記対照混合物中の前記第１及び前記第２の検出部分によって提供され、
    －パート（ｄ）が、前記処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
    前記第１のバックグラウンドシグナルとは異なり、前記試料中の前記第１の標的の存在を示す、前記修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、前記第１の温度で生成されるかどうか、
    前記第２のバックグラウンドシグナルとは異なり、前記試料中の前記第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、前記第２の温度で生成されるかどうかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、対向鎖上のハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その全て又は一部が前記第１の標的に相補的であるハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結されたステムループオリゴヌクレオチドであり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記修飾は、相補塩基対合による、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記標的のハイブリダイゼーションから生じる立体構造の変化であり、
    －前記立体構造の変化は、相補塩基対合による、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記標的の前記ハイブリダイゼーションから生じる、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の鎖の解離であり、
    （ａ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記標的の前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの
    前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記二本鎖の二重構造は、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖の二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記二本鎖の二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｂ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記標的の前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満であり、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記二本鎖の二重構造が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖の二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドのステム部分の前記Ｔｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記二本鎖の二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｃ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記標的の前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記二本鎖の二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖の二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記二本鎖の二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、又は
    （ｄ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記標的の前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分への前記ハイブリダイゼーションから形成される二本鎖の二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記
    ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記二本鎖の二重構造は、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分及び前記二本鎖の二重構造のＴｍ未満、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第２の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記二本鎖の二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度超である、請求項３に記載の方法。
  5. －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、
    ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分であって、その対向鎖が、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの一本鎖ループ部分によって連結され、その全て又は一部が、前記第１の標的に相補的である、二本鎖ステム部分、及び前記対向鎖のうちの１つから３’方向に延び、前記第１の標的の一部に相補的な配列で終端する第２の一本鎖部分と、
    前記第１の標的の前記一部に相補的な、前記配列の前にあるブロッカー分子とを含む、ステムループオリゴヌクレオチドであり、
    －前記混合物が、ポリメラーゼを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって、前記第２の一本鎖部分を前記第１の標的にハイブリダイズすることと、
    前記ポリメラーゼ及び前記第１の標的を鋳型配列として使用して前記第２の一本鎖部分を伸長して、二本鎖核酸を提供することであって、前記ブロッカー分子は、前記ポリメラーゼが前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分を鋳型として使用して前記第１の標的を伸長することを防止する、提供することと、
    前記二本鎖核酸を変性させ、前記ポリメラーゼによって伸長された前記第２の一本鎖部分を、相補塩基対合によって前記第１のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を提供することと、を含み、
    （ａ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前
    記ステム部分、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｂ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記シグナル伝達二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｃ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、又は
    （ｄ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分及び前記シグナル伝達二重構造のＴｍ未満、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第２の温度が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、前記シグナル伝達二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未
    満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度超である、請求項３に記載の方法。
  6. －前記第１の検出部分がフルオロフォアであり、前記修飾が、クエンチャー分子からのその距離を増加させ、
    －前記第２の検出部分がフルオロフォアであり、
    －解離する分割ステムループオリゴヌクレオチドの二本鎖ステム部分の前記鎖によって提供される第２の検出可能なシグナルが、クエンチャー分子からのフルオロフォアの距離を増加させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、
    ハイブリダイズしたヌクレオチドの第１の二本鎖部分を含み、その第１の鎖は、前記第１の標的の一部にハイブリダイズすることができる相補配列で終端する一本鎖部分に延び、前記第１の鎖は、前記相補配列の前にブロッカー分子を含み、
    －前記混合物が、ポリメラーゼを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって、前記一本鎖部分の前記相補配列を前記第１の標的の一部にハイブリダイズすることと、
    前記ポリメラーゼ及び前記第１の標的を鋳型配列として使用して前記相補配列を伸長して、第２の二本鎖部分を提供することであって、前記ブロッカー分子は、前記ポリメラーゼが前記第１の二本鎖部分の前記第１の鎖を鋳型として使用して前記第１の標的を伸長することを防止する、提供することと、
    前記第１及び第２の二本鎖部分を変性させることと、
    前記ポリメラーゼによって前記第１の二本鎖部分の前記第１の鎖に伸長された前記相補配列を、相補塩基対合によってハイブリダイズして、シグナル伝達二重構造を生成し、それにより、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を提供することとを含み、
    （ａ）
    －前記第１の二本鎖部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１の二本鎖部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１の二本鎖部分、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｂ）
    －前記第１の二本鎖部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１の二本鎖部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記第１の二本鎖部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記シグナル伝達二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｃ）
    －前記第１の二本鎖部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１の二本鎖部分、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記シグナル伝達二重構造、前記第１の二本鎖部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、又は
    （ｄ）
    －前記第１の二本鎖部分が、前記シグナル伝達二重構造の融解温度（Ｔｍ）未満、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記シグナル伝達二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記第１の二本鎖部分及び前記シグナル伝達二重構造のＴｍ未満、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第２の温度が、前記第１の二本鎖部分、前記シグナル伝達二重構造、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度超である、請求項３に記載の方法。
  8. －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記混合物が、
    前記第１の標的における第１の配列に相補的な第１のプライマーと、
    前記第１の配列とは異なる、前記第１の標的における第２の配列に相補的な成分、及び前記第１の標的に相補的ではないタグ部分を含む、第２のオリゴヌクレオチドと、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む第１のポリメラーゼを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記第１のプライマー及び前記第２のオリゴヌクレオチドを前記第１の標的にハイブリダイズするのに好適な条件と、
    前記第１のポリメラーゼ及び前記標的を鋳型として使用して前記第１のプライマーを伸長し、それにより前記タグ部分を切断することと、
    相補塩基対合によって、前記切断されたタグ部分を前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることと、
    前記第１又は第２のポリメラーゼ及び前記第１のオリゴヌクレオチドを鋳型として使用して前記タグ部分を伸長し、前記第１のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖配列を生成し、それにより前記修飾を前記第１のオリゴヌクレオチドに提供し、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることとを含み、
    （ａ）
    －前記二本鎖配列が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖配列、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記二本鎖配列、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｂ）
    －前記二本鎖配列が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖配列、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記二本鎖配列、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、
    （ｃ）
    －前記二本鎖配列が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖配列、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記二本鎖配列、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であるか、又は
    （ｄ）
    －前記二本鎖配列が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二本鎖配列のＴｍ未満、かつ前記無傷ステムループオリゴヌ
    クレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第２の温度が、前記二本鎖配列、及び前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度超である、請求項３に記載の方法。
  9. －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的の第１の部分に相補的であり、
    －前記混合物が、前記第１の標的の第２の部分に相補的な更なるオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第１の標的の前記第１及び第２の部分は、互いに隣接するが重複せず、
    －前記混合物を前記処理することが、
    （ｉ）相補塩基対合によって前記第１のオリゴヌクレオチドを前記標的にハイブリダイズすることによる第１の二本鎖成分、及び
    （ｉｉ）相補塩基対合によって前記更なるオリゴヌクレオチドを前記標的にハイブリダイズすることによる第２の二本鎖成分
    を含む二重構造を形成し、
    それにより、前記第１及び更なるオリゴヌクレオチドを近接させ、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を提供することを含み、
    －前記二重構造が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるＴｍを有し、
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であるＴｍを有し、
    －前記第１の温度が、前記二重構造、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記二重構造、及び前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満であり、
    －前記第１の検出可能な部分がフルオロフォアであり、前記更なるオリゴヌクレオチドがクエンチャーを含み、
    －前記二重構造を前記形成することが、更に前記フルオロフォア及びクエンチャーを近接させ、
    －前記検出可能なシグナルが、前記第１の検出部分によって提供される蛍光の減少である、請求項３に記載の方法。
  10. （ａ）
    －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１の検出部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドが結合している、ナノ粒子、金属ナノ粒子、貴金属ナノ粒子、アルカリ金属ナノ粒子、金ナノ粒子、又は銀ナノ粒子であり、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記第１の標的を前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、前記第１の検出部分が前記試料中の前記第１の標的の存在を示す第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を誘導することを含み、
    前記第１の検出可能なシグナルは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記修飾後に前記第１の検出部分から生じる、
    （ｉ）屈折率の変化、
    （ｉｉ）色の変化、及び／又は
    （ｉｉｉ）吸収スペクトルの変化
    であるか、又は
    （ｂ）
    －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１の検出部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドが結合している電気化学的薬剤であり、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記第１の標的を前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより、前記第１の検出部分が前記試料中の前記第１の標的の存在を示す第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を誘導又は促進することを含み、
    前記第１の検出可能なシグナルは、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記修飾後の前記第１の検出部分から生じる電気化学的シグナルの変化である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  11. －前記第１の検出可能なシグナルの生成は、可逆的ではなく、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾は、前記第１の検出部分が、前記第１の温度以下で前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にし、
    －前記第１の温度以下で提供される前記第１の検出可能なシグナルは、前記第２の温度で検出可能なままであり、
    －パート（ｃ）が、
    （ｉ）第１の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、若しくは５℃以内の第１のバックグラウンドシグナル、及び第２の温度の１℃、２℃、３℃、４℃、若しくは５℃以内の第２のバックグラウンドシグナル、並びに／又は
    （ｉｉ）第３の温度での第３のバックグラウンドシグナル
    を測定することを含み、これらは混合物中、又は対照混合物中の第１及び第２の検出部分によって提供され、
    －パート（ｄ）が、前記処理中又は処理後の１つ以上の時点で、
    （ｉ）前記第１又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なる、前記修飾から生じる第１の検出可能なシグナルが、前記第１の温度で生成されるかどうかを決定することであって、
    前記第１の温度において、前記第２の検出可能なシグナルが前記第１又は第３のバックグラウンドシグナルと異ならず、
    前記第１の検出可能なシグナルと前記第１又は第３のバックグラウンドシグナルとの間の差の検出が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記修飾及び前記試料中の前記第１の標的の存在を示す、決定することと、
    （ｉｉ）前記第２又は第３のバックグラウンドシグナルとは異なり、前記試料中の前記第２の標的の存在を示す第２の検出可能なシグナルが、前記第２の温度で生成されるかどうかを決定することとを含む、請求項１に記載の方法。
  12. （ａ）
    －前記第１のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第１のシグナルが生成され、
    －前記第２のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第２のシグナルが生成され、
    －前記第１の検出可能なシグナルが前記第１のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、前記第２の検出可能なシグナルが前記第２のバックグラウンドシグナルと異なり、
    それにより前記第２の標的が前記試料中に存在することを示すか、
    （ｂ）
    －前記第３のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第１のシグナルが生成され、
    －前記第３のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第２のシグナルが生成され、
    －前記第１のシグナルが前記第３のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、前記第２のシグナルが前記第３のバックグラウンドシグナルと異なり、
    それにより前記第２の標的が前記試料中に存在することを示すか、又は
    （ｃ）
    －前記第２の温度が、前記第１の温度よりも高く、
    －前記第３の温度が、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分のＴｍよりも低く、
    －前記第３のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第１の検出可能なシグナルが生成され、
    －前記第３のバックグラウンドシグナルとは異なる前記第２の検出可能なシグナルが生成され、
    －前記第１のシグナルが前記第３のバックグラウンドシグナルと異なるよりも大きい程度まで、前記第２の検出可能なシグナルが前記第３のバックグラウンドシグナルと異なり、
    それにより前記第２の標的が前記試料中に存在することを示す、請求項１１に記載の方法。
  13. （ａ）
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍが、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度未満、かつ前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であり、
    －前記第２の温度が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満であるか、又は
    （ｂ）
    －前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍが、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第１の温度が、前記第２の温度超、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超であり、
    －前記第２の温度が、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ超、かつ前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ステム部分のＴｍ未満である、請求項１１に記載の方法。
  14. （ａ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の基質であり、
    －前記混合物が、
    前記第１の標的が前記試料中に存在する場合、前記第１のオリゴヌクレオチドを切断することができるＭＮＡザイムを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記ＭＮＡザイムを前記第１の標的に結合させ、前記ＭＮＡザイムの基質アームを、前記第１のオリゴヌクレオチドの切断を促進する相補塩基対合によって前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより前記修飾を前記第１のオリゴヌクレオチドに提供し、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることを更に含むか、
    （ｂ）
    －前記第１のオリゴヌクレオチドがアプタザイムの基質であり、
    －前記第１の標的が、分析物、タンパク質、化合物、又は分子であり、
    －前記混合物が、前記第１の標的に結合することができるアプタマーを含むアプタザイムを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記アプタザイムを前記第１の標的及び前記第１のオリゴヌクレオチドに結合させて、前記第１のオリゴヌクレオチドの切断を促進し、それにより前記修飾を前記第１のオリゴヌクレオチドに提供し、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にすることを更に含むか、
    （ｃ）
    －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の標的に相補的である配列を含み、
    －前記混合物が、
    前記第１の標的の一部に相補的なプライマー、及び
    エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって、前記プライマーを前記第１の標的にハイブリダイズすることと、
    相補塩基対合によって、前記第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の標的にハイブリダイズすることと、
    前記ポリメラーゼ及び前記第１の標的を鋳型配列として使用して前記プライマーを伸長し、それにより前記第１のオリゴヌクレオチドを消化し、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを生成することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を提供することと、を含むか、
    （ｄ）
    －前記第１の標的が核酸配列であり、
    －前記混合物が、
    前記第１の標的を含む二本鎖の二重構造を消化することができる制限エンドヌクレアーゼを更に含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって、前記第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の標的にハイブリダイズし、それにより二本鎖の二重構造を形成することと、
    前記制限エンドヌクレアーゼを使用して前記二重構造を消化し、それにより前記修飾を前記第１のオリゴヌクレオチドに提供し、前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にすることと、を含むか、又は
    （ｅ）
    －前記混合物が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムを更に含み、
    －前記混合物の前記処理が、
    前記補因子を前記ＤＮＡザイム又はリボザイムに結合させて触媒活性化すること、
    相補塩基対合によって、前記ＤＮＡザイム又はリボザイムを前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすること、及び
    前記ＤＮＡザイム又はリボザイムを触媒活性化し、それにより前記第１のオリゴヌクレオチドを消化し、それにより前記第１の検出部分が前記第１の検出可能なシグナルを提供することを可能にする、前記第１のオリゴヌクレオチドへの前記修飾を提供すること
    のために好適な条件を使用することを含み、
    前記第１の標的が前記補因子である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. －前記第１の酵素が第１のＭＮＡザイムであり、
    －前記混合物を前記処理することが、
    前記第１のＭＮＡザイムを前記第２の標的に結合させ、前記第１のＭＮＡザイムの
    基質アームを前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ループ部分にハイブリダイズして、それにより、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化し、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供することを含み、
    －前記第２の標的が核酸配列であり、
    －前記混合物を前記処理することが、
    －相補塩基対合によって、前記第２の標的を前記第１のＭＮＡザイムの前記センサーアームにハイブリダイズして、それにより前記第１のＭＮＡザイムの集合を促進することを更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. （ａ）
    －前記第２の標的が核酸配列であり、
    －前記第１の酵素が第１の制限エンドヌクレアーゼであり、前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって前記第２の標的を前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、前記第１の制限エンドヌクレアーゼが前記一本鎖ループ部分の前記１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドに会合し、それを消化するための二本鎖配列を形成して、それにより、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含むか、
    （ｂ）
    －前記第１の酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含み、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって前記第２の標的を前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、
    第１のプライマーオリゴヌクレオチドを前記第２の標的にハイブリダイズして、前記第２の標的の前記一部を含む前記第１の二本鎖配列に対して上流に位置する第２の二本鎖配列を形成し、
    エキソヌクレアーゼ活性を有する前記ポリメラーゼを使用し、前記第２の標的を鋳型配列として使用して前記プライマーを伸長させるのに好適な条件を使用することを含み、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１のポリメラーゼは、前記第１の二本鎖配列の前記一本鎖ループ部分を消化し、それにより、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するか、
    （ｃ）
    －前記第１の酵素がエキソヌクレアーゼであり、
    －前記混合物を前記処理することが、
    相補塩基対合によって前記第２の標的を前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズして、前記第２の標的の一部を含む第１の二本鎖配列を形成し、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素を、前記第２の標的を含む前記二本鎖配列と会合させ、
    エキソヌクレアーゼ活性を含む前記第１の酵素を触媒活性化し、前記第２の標的を含む前記第１の二本鎖配列の前記一本鎖ループ部分を消化させ、それにより、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含むか、又は
    （ｄ）
    －前記第１の酵素が、触媒活性に補因子を必要とするＤＮＡザイム又はリボザイムであり、前記混合物を前記処理することが、
    －前記補因子を前記第１の酵素に結合させて触媒活性化し、
    －相補塩基対合によって、前記ＤＮＡザイム又はリボザイムを前記無傷ステムループオ
    リゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分にハイブリダイズし、
    －前記ＤＮＡザイム又はリボザイムを触媒活性化し、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記一本鎖ループ部分の１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオチドを消化し、それにより、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドを形成するのに好適な条件を使用することを含み、
    前記第２の標的が前記補因子である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. －前記第１及び第２の標的の存在又は不在を前記決定することが、融解曲線分析を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  18. －既知の濃度の前記第１の標的及び既知の濃度の前記修飾後の前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、第１の標的陽性対照シグナルを生成すること、
    －前記第１の標的を含む別個の対照試料に対して前記方法を反復することによって、第１の標的陽性対照シグナルを生成すること、
    －既知の濃度の前記第２の標的及び既知の濃度の前記修飾後の前記ステムループオリゴヌクレオチドを使用して、第２の標的陽性対照シグナルを生成すること、
    －前記第２の標的を含む別個の対照試料に対して前記方法を反復することによって、第２の標的陽性対照シグナルを生成すること、及び／又は
    －前記第１の標的及び前記第２の標的を含む別個の対照試料に対して前記方法を反復することによって、組み合わされた陽性対照シグナルを生成すること
    を更に含み、
    －前記組み合わされた対照試料が、既知の濃度の前記第１の標的及び／又は既知の濃度の前記第２の標的を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  19. （ａ）
    （ｉ）前記第１の標的、又は
    （ｉｉ）前記第２の標的、又は
    （ｉｉｉ）前記第１の標的若しくは前記第２の標的を含有しない別個の陰性対照試料に対して、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を反復することによって、陰性対照シグナルのレベルを評価すること、
    －前記陰性対照シグナルを使用して、前記第１の検出可能なシグナル及び／又は前記第２の検出可能なシグナルを正規化すること、及び／又は
    （ｂ）
    前記第１及び／又は第２の検出可能なシグナルを閾値と比較することを更に含み、
    －前記閾値は、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法に従って試験された一連の試料又はその誘導体に由来する検出可能なシグナルを使用して生成され、
    （ｉ）鋳型なし対照及び前記第１の標的
    （ｉｉ）鋳型なし対照及び前記第２の標的
    （ｉｉｉ）鋳型なし対照、前記第１の標的、及び前記第２の標的
    のうちのいずれか１つ以上を含み、それにより、前記試料中の前記第１及び第２の標的の前記存在又は不在を決定し、
    －前記一連の試料又はその誘導体が、既知の濃度の前記第１のオリゴヌクレオチド及び／又は既知の濃度の前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドを使用して試験される、請求項１８に記載の方法。
  20. －前記第１及び第２の検出可能な部分が、可視スペクトルの同じ色領域で発光する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  21. －第１の標的を検出するための第１のオリゴヌクレオチドであって、前記第１の標的は核酸であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、第１のオ
    リゴヌクレオチドと、
    －第１の検出部分であって、
    前記第１の検出部分が、前記第１のオリゴヌクレオチドの修飾時に、第１の検出可能なシグナルを生成することができ、
    前記修飾が、相補塩基対合による前記第１の標的の前記第１のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって誘導される、第１の検出部分と、
    －第２の標的の検出のための無傷ステムループオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイズしたヌクレオチドの二本鎖ステム部分を含み、その対向鎖は、ハイブリダイズしていないヌクレオチドの破壊されていない一本鎖ループ部分によって連結され、前記二本鎖ステム部分の少なくとも１つの鎖は、第２の検出部分を含む、無傷ステムループオリゴヌクレオチドと、
    －前記第２の標的が前記試料中に存在する場合にのみ、前記無傷ステムループオリゴヌクレオチドの前記ハイブリダイズしていないヌクレオチドのうちの１つ以上を消化し、それにより前記一本鎖ループ部分を破壊して分割ステムループオリゴヌクレオチドを提供することができる、第１の酵素と
    を含む組成物であって、
    －前記第２の検出部分は、前記分割ステムループオリゴヌクレオチドの前記二本鎖ステム部分の解離時に、第２の検出可能なシグナルを生成することができ、
    －前記第１及び第２の検出部分は、単一の種類の検出器を使用して、単一の温度では鑑別できない検出可能なシグナルを生成することができる、組成物。
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