JP7638005B2

JP7638005B2 - 新規芳香族プレニルトランスフェラーゼを使用したカンナビノイド前駆体の生合成

Info

Publication number: JP7638005B2
Application number: JP2022521613A
Authority: JP
Inventors: ダ―リーンコーゴー，メイベル; ジーハンリム，ケヴィン; ピンリム，ヤン; シャンユー，ウェン
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2025-03-03
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: AU2020364533A1; EP4041875A1; WO2021071437A1; EP4041875A4; KR102942540B1; MY209346A; CA3156339A1; CN114555797B; JP2022552952A; CN114555797A; KR20220081998A; US20240084337A1

Description

ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.）株ＣＬ１９０由来の芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＮｐｈＢ）の構造および機能は解明されている。Ｋｕｍａｎｏら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，１６（１７）：８１１７－２６を参照されたい。Ｚｉｒｐｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，２５９：２０４－２１２で報告された以前の研究では、ＮｐｈＢが、大麻植物由来の膜結合ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼと同じ基質を利用して、カンナビノイド前駆体カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を形成できることを示した。

ＣＢＧＡは、大麻植物に見られるカンナビノイド生合成経路の最初の分岐点として一般に知られており、野生型ＮｐｈＢは、Ｏ‐プレニル化副産物、すなわち２－Ｏ－ゲラニルオリベトール酸と同様に、ＣＢＧＡを作ることができる。

既知のカンナビノイド前駆体および新規カンナビノイド前駆体を特異性および高収率で合成するためには、さらなる酵素および方法が必要である。

カンナビノイド前駆体を生成するための方法が開示される。この方法は、基質およびゲラニルピロリン酸またはファルネシルピロリン酸をＮｐｈＢオルソログと接触させるステップを含む。基質は、例えば、２，４－ジヒドロキシ－６－ペンチル安息香酸または２，４－ジヒドロキシ－６－プロピル安息香酸であり得、ＮｐｈＢオルソログは、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓｓａｔｉｖａ）以外の生物由来である。

また、そのゲノム中にＮｐｈＢオルソログをコードする核酸を保有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え細胞が提供される。ＮｐｈＢオルソログは、カンナビス・サティバ以外の生物由来であり、組換え細胞中に発現する。
１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明および実施例に記載される。他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲から明らかであろう。

以下の発明の説明は、添付の図面を参照する。

オリベトール酸およびゲラニルピロリン酸を基質として使用するカンナビノイド生成物の構造を示す図である。すべての可能な生成物の分子式および式重量は、それぞれＣ_２２Ｈ_３１Ｏ_４および３５９．２２である。黒色：マロニル－ＣｏＡの３単位に由来するオリベトール酸部分、暗灰色：ヘキサノイル－ＣｏＡに由来するオリベトール酸部分、淡灰色：オルソログにより転移するゲラニルピロリン酸部分。ＮｐｈＢオルソログをコードする遺伝子をヤロウィア・リポリティカのゲノムに組み込むために用いられるｐＹＬＥＸ１ベクターの図である。３個のＮｐｈＢオルソログから生合成されたｍ／ｚ＝３５９．２２を有するカンナビノイド前駆体のＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。１段目＝ＣＢＧＡ標準物質、２段目＝Ｐ３Ｅ２、３段目＝酵素なしの陰性対照、４段目＝Ｐ３Ａ５、５段目＝Ｐ３Ｅ８、６段目＝ＮｐｈＢ陽性対照、７段目＝１ＢＦ１、８段目＝Ｙ１Ｃ５。ピークは、保持時間および相対ピーク下面積によって特定される。３個の追加のＮｐｈＢオルソログから生合成されたｍ／ｚ＝３５９．２２を有するカンナビノイド前駆体のＬＣ－ＭＳスペクトルを示す：１段目＝１０μｇ／ｍｌのＣＢＧＡ標準物質、２段目＝酵素なしの陰性対照、３段目＝ＮｐｈＢ陽性対照、４段目＝Ｐ３Ｆ５、５段目＝Ｐ３Ａ６、６段目＝１ＢＣ２。ピークは、保持時間および相対ピーク下面積によって特定される。オリベトール酸と比較して、２つ少ない炭素単位を有し、その結果ＣＢＧＡよりも短い２つの炭素であるＣＢＧＶＡの生成をもたらすジバリン酸（上列）を用いて、またはゲラニルピロリン酸の代わりに、新規カンナビノイド前駆体の生成をもたらすファルネシルピロリン酸（下列）を用いて生合成された、潜在的なカンナビノイド生成物の構造を示す図である。

特定のピロリン酸塩、例えば、ゲラニルピロリン酸から芳香族ポリケチド、例えば、２，４－ジヒドロキシ－６－ペンチル安息香酸、すなわち、オリベトール酸、および２，４－ジヒドロキシ－６－プロピル安息香酸にイソプレン単位を転移させることにより、カンナビノイド前駆体の生合成を触媒する酵素を開示する。これらの酵素は、カンナビス・サティバ以外の生物に由来し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）またはヤロウィア・リポリティカにおいて組換えにより発現させ、その後プレニルトランスフェラーゼ活性のために用いることができる。

上記に要約されるとおり、カンナビノイド前駆体を製造するための方法が開示される。具体的な例では、基質は、オリベトール酸であり、ピロリン酸塩は、ゲラニルピロリン酸であり、生成されたカンナビノイド前駆体は、ＬＣ／ＭＳ分析により決定した場合に、質量電荷比３５９．２２および６．１分より長い保持時間を有する。本明細書に記載されるカンナビノイド前駆体もまた、本発明の範囲に含まれる。

上記の方法において、ＮｐｈＢオルソログの例示的な供給源は、ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）亜種ｏｓｃｉｔａｎｓ、ストレプトマイセス・ルビダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・カリドウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｌｉｄｏｕｓｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）、ノカルディア・ブラジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、および難培養性細菌ｅｓｎａｐｄ１６．１であり得るが、これらに限定されない。

本方法の特定の態様では、ＮｐｈＢオルソログは、配列番号１～８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。あるいは、ＮｐｈＢオルソログは、配列番号１～８のいずれか１つと少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）のアミノ酸配列を有することができ、芳香族プレニルトランスフェラーゼ活性を有する。

例示的な方法では、ＮｐｈＢオルソログは、組換え酵素である。組換え酵素は、例えば、大腸菌およびヤロウィア・リポリティカにおいて生成され得る。

また、上記のものは、ヤロウィア・リポリティカの組換え細胞であり、そのゲノムには、ＮｐｈＢオルソログをコードする核酸が含まれる。ＮｐｈＢオルソログは、カンナビス・サティバ以外の生物由来である。

ＮｐｈＢオルソログの例示的な供給源は、ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）亜種ｏｓｃｉｔａｎｓ、ストレプトマイセス・ルビダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・カリドウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｌｉｄｏｕｓｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）、ノカルディア・ブラジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、および難培養性細菌ｅｓｎａｐｄ１６．１である。

特定の組換え細胞では、ＮｐｈＢオルソログは、配列番号１～８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。別の実施例では、ＮｐｈＢオルソログは、配列番号１～８のいずれか１つに対して、少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）のアミノ酸配列を有することができ、芳香族プレニルトランスフェラーゼ活性を有する。

さらなる詳述がなくとも、当業者は、本明細書の開示に基づいて、本開示をその最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な例は、単なる説明的なものとして解釈されるべきであり、いかなる点においても、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照によりその全体が援用される。

実施例
利用可能な配列データベースの検索により、ＮｐｈＢに対する１０５の遺伝子オルソログが同定され、これらはまた、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに潜在的芳香族プレニルトランスフェラーゼとしてアノテートされた。遺伝子を合成し、Ｔ７プロモーターおよびターミネーターを含む改変ｐＥＳ２ベクターにクローニングした。化学処理を用いて、ベクターを大腸菌Ａｃｅｌｌａ（商標）細胞に形質転換し、３７℃でＬＢ＋ストレプトマイシン選択プレート上で増殖させた。配列を確認したクローンを採取し、ＯＤ_{６００ｎｍ}が０．８になるまでＬＢ＋ストレプトマイシン培地中で増殖させた。培養物に０．１ｍＭＩＰＴＧを添加し、２５℃で２４時間インキュベートすることによりタンパク質発現を誘導した。その後細胞を回収し、タンパク質精製まで－２０℃で保存した。

ペレット化した細胞を、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのイミダゾールを含有する１００μＬ結合緩衝液に再懸濁させた。その後、細胞を超音波処理により溶解し、細胞片を４℃で３０分間の遠心分離により除去した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を含む上清を、Ｎｉ^２＋アフィニティークロマトグラフィを用いて精製し、２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭＮａＣｌ、および１００ｍＭＬ－ヒスチジンを含む緩衝液で組換えタンパク質を溶出した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ検出キットを用いて推定し、精製ＮｐｈＢオルソログを４℃で保存した。

ＮｐｈＢオルソログを、ｉｎｖｉｔｒｏプレニルトランスフェラーゼアッセイを用いて、プレニルトランスフェラーゼについて試験した。反応容量２００μＬ中で、２０μＬの１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、２μＬの１ＭＭｇＣｌ_２、４μＬの５０ｍＭ芳香族ポリケチド基質、例えばオリベトール酸およびジバリン酸、２０μＬの１０ｍＭゲラニルピロリン酸、ならびに５０μｇの精製ＮｐｈＢオルソログを組み合わせて、３０℃でインキュベートした。酵素を含まない対照反応物も調製した。

２４時間後、反応混合物を６ＭＨＣｌでｐＨ３．０に酸性化し、酢酸エチルで３回抽出した。試料を真空乾燥させ、ネガティブイオンモードを用いるＬＣ‐ＭＳ分析のためにメタノールに再溶解した。ｍ／ｚ＝３５９．２２（オリベトール酸を用いた場合）およびｍ／ｚ＝３３１．１９（ジバリン酸を用いた場合）の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を各試料について作成し、潜在的カンナビノイド前駆体の生合成がＮｐｈＢオルソログによって触媒されるか否かを決定した。基質としてオリベトール酸およびゲラニルピロリン酸を用いて生合成できる潜在的カンナビノイド前駆体の構造を図１に示す。

ＮｐｈＢのある種のオルソログは、野生型ＮｐｈＢによって形成されたピークと比較して、ＬＣ‐ＭＳ分析において、新しいピークとして同定される新規生成物を生成した。また、特定のオルソログは、ＣＢＧＡの収率が高いことも実証した。このようなオルソログを、その後のヤロウィア・リポリティカへのクローニングのために選択する。それらを、改変ｐＹＬＥＸ１ベクター（ＹｅａｓｔｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ；図２参照）にサブクローニングし、化学処理を用いてＹ・リポリティカに形質転換する。形質転換体を、ロイシンを含まないＹＮＢ寒天上で選択し、その後の収率最適化アッセイに使用する。

試験した１０５個のオルソログのうち、８個のオルソログは、良好なタンパク質発現および新規プレニルトランスフェラーゼ活性を示した。８個のオルソログを、対応するＵｎｉｐｒｏｔＩＤおよび供給源生物と共に、以下の表１に列挙する。

Ｐ３Ｅ８は、野生型ＮｐｈＢと比較して、ＣＢＧＡの収量が同等であり、８個のオルソログはすべて、ＬＣ‐ＭＳ分析において、少なくとも１つの新しいピークを示し、それはＣ_２２Ｈ_３１Ｏ_４（ＦＷ＝３５９．２２）の分子式も有していた。

図３Ａおよび図３Ｂに示すとおり、８つのすべてのオルソログならびに野生型ＮｐｈＢは、ＣＢＧＡを生成できる（保持時間：図３Ａでは、６．４分、図３Ｂでは６．１分）。Ｐ３Ａ５を除くすべてのオルソログはまた、副産物、すなわち２‐Ｏ‐ゲラニルオリベトール酸も生成した（保持時間：図３Ａでは６．６分、図３Ｂでは６．３分）。オルソログＰ３Ａ５、Ｙ１Ｃ５、およびＰ３Ｅ２は、野生型ＮｐｈＢを用いた反応では観察されなかった保持時間７．２３～７．２４分で、ｍ／ｚ＝３５９．２２２５のかなりの量の新しいプレニル化生成物をそれぞれ生成した。

ｍ／ｚ＝３５９．２２を有し、図３Ａおよび図３Ｂで同定された新規生成物を、以下の表２に要約する。これらの生成物は、野生型ＮｐｈＢ酵素で生成されたものには見られない保持時間を有する。

ある研究では、ＵｎｉｐｒｏｔＩＤ：Ｃ４ＰＷＡ１およびＱ９Ｌ９Ｆ１に対応する２つのオルソログが、微量の新規プレニル化生成物のみ生成することが示され、これらのオルソログが野生型ＮｐｈＢとは異なる部位で、オリベトール酸をプレニル化したことが示唆された。

さらに、異なる基質をＮｐｈＢオルソログと共にインキュベートして、新規カンナビノイド前駆体が生成され得るか否かを決定することができる。図４は、オリベトール酸またはゲラニルピロリン酸のいずれかまたは両方を置換したときに形成され得る生成物を示している。次いで、カンナビノイド化合物ライブラリを多様化するために、新規カンナビノイド前駆体を下流のカンナビノイドシンターゼで試験することができる。

他の実施形態
本明細書に開示される特徴はすべて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。したがって、明示的に別段の記載がない限り、開示される各特徴は、等価または類似の特徴の一般的な系列の例である。
以上の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途および条件に適合させるために種々の変更および修正を加えることができる。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims

カンナビノイド前駆体を生成するための方法であって、
（ａ）２，４－ジヒドロキシ－６－ペンチル安息香酸およびゲラニルピロリン酸を、ＮｐｈＢオルソログと接触させて、５－ゲラニルオリベトール酸、４－Ｏ－ゲラニルオリベトール酸、もしくは２－Ｏ－ゲラニルオリベトール酸を得ること、
（ｂ）２，４－ジヒドロキシ－６－プロピル安息香酸およびゲラニルピロリン酸を、ＮｐｈＢオルソログと接触させて、カンナビゲロバリン酸を得ること、または
（ｃ）２，４－ジヒドロキシ－６－ペンチル安息香酸およびファルネシルピロリン酸を、ＮｐｈＢオルソログと接触させて、
の構造を有する化合物を得ること
を含み、
前記ＮｐｈＢオルソログが、配列番号１～８のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、方法。
前記カンナビノイド前駆体が、ＬＣ／ＭＳ分析によって決定した場合に質量電荷比３５９．２２および６．１分より長い保持時間を有する、請求項１に記載の方法。
前記ＮｐｈＢオルソログが、ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）亜種ｏｓｃｉｔａｎｓ、ストレプトマイセス・ルビダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・カリドウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｌｉｄｏｕｓｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）、ノカルディア・ブラジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、または難培養性細菌ｅｓｎａｐｄ１６．１由来である、請求項２に記載の方法。
前記ＮｐｈＢオルソログが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において生成される組換え酵素である、請求項３に記載の方法。
前記ＮｐｈＢオルソログが、ストレプトマイセス・ロゼオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）亜種ｏｓｃｉｔａｎｓ、ストレプトマイセス・ルビダス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｉｄｕｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・カリドウスタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃａｌｉｄｏｕｓｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）、ノカルディア・ブラジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、または難培養性細菌ｅｓｎａｐｄ１６．１由来である、請求項１に記載の方法。
前記ＮｐｈＢオルソログが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において生成される組換え酵素である、請求項５に記載の方法。
ヤロウィア・リポリティカの組換え細胞であって、そのゲノム中にＮｐｈＢオルソログをコードする核酸を含み、前記ＮｐｈＢオルソログが、配列番号１～８のいずれか１つのアミノ酸配列を有し、前記ＮｐｈＢオルソログが、前記組換え細胞において発現される、組換え細胞。