JP7640680B2 - 固相合成用の多孔質樹脂及びその製造方法 - Google Patents

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Description

本発明は多孔質樹脂及びその製造方法に関し、該担体はオリゴヌクレオチドの固相合成に用いられ、機能性高分子材料の製造分野に属する。
過去数十年の間、人工的に合成されたオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子治療に広く応用されてきた。オリゴヌクレオチドとは、約２０個の塩基を持つ短鎖ヌクレオチドの総称で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。現在、オリゴヌクレオチドは一般的に化学的方法で合成され、固相ホスホロアミダイトトリエステル法で合成されるのが最も一般的であり、具体的な方法は固相合成担体を反応カラムに充填し、反応物を溶解した溶液を一定の圧力で反応カラムに急速に流して反応を行うことである。反応効率を向上させ、不純物の発生を低減するために、溶液における反応物を固相合成担体内に速やかに拡散させて活性部位と反応させ、反応生成物を速やかに溶液中に拡散させて除去することが必要である。このため、固相合成担体には次のような要件を満たすことが求められる。１．担体は必ず、核酸分子鎖がこれらの部位に連結でき、そして合成完了後に分解できる単一の活性部位（又は反応基）を含む。２．担体は、合成中に物理的及び化学的安定性を維持しなければならない。３．担体は、増大し続ける核酸分子鎖と試薬が迅速かつ阻害されることなく接触することを容易にするのに十分な大きさの細孔径及び理想的な細孔径分布を有するべきである。４．活性部位は、核酸分子鎖間の相互干渉を減少させるために、担体に均一に分布しなければならない。５．オリゴヌクレオチド合成に使用されるホスホロアミダイト単量体が水分に敏感であり、水分の存在により反応効率が低下することから、担体骨格は一定の疎水性を示すべきである。６．担体は異なる溶媒中での膨潤度が近く、異なる溶媒の合成又は洗浄プロセスの膨潤の差によるデッドボリュームを減少させ、反応試薬の均一な拡散と反応生成物の迅速な洗浄除去に有利である。
オリゴヌクレオチド固相合成技術の発展初期では、よく使用されている固相合成担体は細孔径制御可能なガラス微小球（ＣＰＧ）、変性シリカゲルなどの無機粒子があるが、それらの欠点も明らかであり、すなわち、置換度（Ｌｏａｄｉｎｇ）が低い（一般的に１００μｍｍｏｌ／ｇより小さい）ため、オリゴヌクレオチドの単ロットの生産量が制限され、設備の利用率が低く、生産コストが高い。担体の置換度を高めるために、Ｎｉｔｔｏ Ｄｅｎｋｏ社とＩｏｎｉｓ社が共同で出願した発明特許ＷＯ２００６０２９０２３は、スチレン、ｐ-アセトキシスチレン、ジビニルベンゼンを重合単量体とし、イソオクタン、２-エチルヘキサノールを孔形成剤として有機高分子重合体を調製し、オリゴヌクレオチド固相合成担体とした。この担体は置換度が１００～３５０μｍｍｏｌ／ｇに達することができ、その欠点は担体の強い非極性によりオニウム塩類縮合系でリンカーを連結する時の反応効率が低く、また、強い非極性により合成又は洗浄過程でトルエンとアセトニトリルを使用する時に樹脂の体積が大きく変化し、反応器において大きなデッドボリュームが発生することである。その後、Ｎｉｔｔｏ Ｄｅｎｋｏ社は米国特許ＵＳ８５９２５４２において、スチレン、ｐ－アセトキシスチレン、ジビニルベンゼン、（メタ）アクリルアミド誘導体を重合単量体としている。米国特許ＵＳ８６５３１５２では、スチレン、ｐ－アセトキシスチレン、ジビニルベンゼン、（メタ）アクリロニトリルを重合単量体としている。重合時に極性単量体を添加することにより、より高い置換度（５００μｍｍｏｌ／ｇ以上）を有するオリゴヌクレオチド固相合成担体を製造する。また、極性単量体の添加は、異なる溶媒（トルエン、アセトニトリル）における担体の膨潤変動を調整するのに有利である。しかし、（メタ）アクリルアミド系単量体、（メタ）アクリロニトリルは親水性であるので、無水溶媒（無水アセトニトリル）で洗浄すると酸化ステップで加えた水分を除去することが困難であり、次のオリゴヌクレオチドの合成効率に影響する。また、溶媒法により孔を形成して得た細孔径分布が不均一で、物質移動効果が悪く、また、水分の除去と次のオリゴヌクレオチドの合成効率にも影響する。南開大学が出願した中国発明特許ＣＮ２０１２１０５６２１６５．９は、架橋ポリアクリロニトリル又は架橋ポリメタクリロニトリルを担体の基本骨格とする。活性部位の導入は、酢酸ビニル、アクリル酸エステル系又はメタクリル酸エステル系単量体を添加し、アルカリ分解又は２つの１級アミン基を有する化合物との反応によりヒドロキシ又はアミノを導入する。この特許は大量の極性単量体を使用しているので、樹脂の異なる溶媒における膨潤差の問題を解決するが、大量の親水性単量体の使用により、担体が極めて親水性であり、無水溶媒（アセトニトリル）を使用した洗浄により担体における水分を除去することが更に困難になり、次のオリゴヌクレオチドの合成効率に極めて大きな影響を与える。
近年、オリゴヌクレオチド薬物の研究が巨大な進展を得たため、ますます多くのオリゴヌクレオチド薬物が臨床段階に入り始めた。オリゴヌクレオチド合成担体に対する需要量はますます多くなり、また、上記のオリゴヌクレオチド担体に存在する物質移動、膨潤、極性の問題によりオリゴヌクレオチド合成効率が低くなり、生産コストが高くなる。そのため、オリゴヌクレオチド薬物を大規模、低コスト、高効率で合成できる多孔質樹脂を開発し、ヌクレオチド薬物の市場需要を満たすことが極めて重要なことである。
オリゴヌクレオチドを大規模かつ低コストで製造することを可能とし、物質移動効率が低く、洗浄が不十分であり、異なる溶媒中での膨潤変化が大きいような従来の担体の欠点を解決するために、本発明は固相合成用の多孔質樹脂及びその製造方法を提供する。
物質移動効率を向上させるために、本発明は、細孔径の大きさが適切で均一な細孔径分布を実現することが望ましい。本発明は、高内相エマルションをテンプレートとして孔を形成するものであり、逆相法、相分離法、溶媒孔形成法等の従来の孔形成法に比べて、この方法は、エマルション液滴の大きさによって細孔径や細孔径分布を正確に制御することができる。内相エマルション液滴の大きさは油溶性界面活性剤の分子量、ＨＬＢ値、使用量などの要素により決定され得る。本発明は、孔形成方式を変えて、担体が適切な細孔径を有し、細孔径分布が狭いようにするものであり、オリゴヌクレオチド合成プロセスにおける反応試薬の拡散に有利であり、反応効率を向上させ、不純物の生成を減少させる。
重合過程に変性単量体を添加することは以下の４つの作用がある。第一に、変性単量体の重合速度が遅く、単独重合を行うことができず、他の単量体と共重合することしかできず、活性部位の均一な分布に有利である。第二に、少量の変性単量体を添加することにより、樹脂の膨潤性を広範囲に調整することができ、異なる溶媒中での担体の膨潤体積の変化を低減させ、オリゴヌクレオチド合成における反応器内部のデッドボリュームを低減することができる。第三に、変性単量体の分子構造はオニウム塩系縮合剤をより効率的にし、リンカーの連結効率を確保することができる。第四に、変性単量体は（メタ）アクリルアミド系単量体、（メタ）アクリロニトリルと比べて疎水性であり、水の担体内での物質移動抵抗を下げ、オリゴヌクレオチド合成過程への水の影響を低減させ、反応効率と収率を高めることができる。
本発明は、重合体骨格及び機能基の構造が下記の式で表される固相合成用の多孔質樹脂を提供する。

（ただし、Ｒ１＝－Ｃ又は－Ｃ－ＣＨ２－であり、Ｒ２＝－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＯＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、又は－ＣＨ２ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨであり、Ｒ３＝－Ｈ、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～４の整数である。）、（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～２の整数である。）、（ＣＨ３）３Ｃ－、又はＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、又はＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ｎは０～４の整数である。）である。）
いくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂は、骨格に式（Ｉ）、式（II）、式（III）、式（IV）で表される繰り返し構造単位を有する共重合体である。

（ただし、Ｒ４＝－Ｃ－又は－Ｃ－ＣＨ２－である。）


（ただし、Ｒ５は、－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＯＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、又は－ＣＨ２ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨである。）

（ただし、Ｒ６は－Ｈ、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～４の整数である。）、（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～２の整数である。）、（ＣＨ３）３Ｃ－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、又はＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ｎは０～４の整数である。）である。）
いくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂において、ヒドロキシ又はアミノの含有量の範囲が１００～１０００μｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは４００～７００μｍｍｏｌ／ｇである。
いくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂において、粒径の範囲が３５～２００μｍ、好ましくは５０～１００μｍである。
いくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂において、平均細孔径が１０～２００ｎｍ、好ましくは４０～１００ｎｍである。
本発明はまた、
製造過程は、
水、分散剤、無機塩から構成される水相と、モノビニル化合物、架橋単量体、機能性単量体、変性単量体、油溶性界面活性剤、希釈剤及び開始剤から構成される油相とをそれぞれ調製するステップであって、モノビニル化合物、架橋単量体、機能性単量体及び変性単量体は重合反応に関与し、単量体と総称し、油溶性界面活性剤及び希釈剤は重合反応に関与せず、主に孔形成作用を果たし、孔形成剤と総称するステップと、油相を水相に加えて、撹拌して昇温させて、反応させて、反応終了後、孔形成剤を除去し、多孔質重合体樹脂を得るステップと、さらに多孔質重合体樹脂を反応させて、機能基としてヒドロキシ又はアミノを含有する固相合成担体ステップと、を含む上記固相合成用の多孔質樹脂の製造方法を開示する。
いくつかの実施例では、前記モノビニル化合物は芳香族モノビニル化合物であり、前記芳香族モノビニル化合物はスチレン及びそのベンゼン環置換誘導体であり、置換基が１～５個の炭素原子を含有するアルキルスチレン、例えばメチルスチレン、エチルスチレン、ノルマルプロピルスチレン、イソプロピルスチレン、ノルマルブチルスチレン、イソブチルスチレン、ｓ－ブチルスチレン、ｔ－ブチルスチレン、ｎ－ペンチルスチレン、イソペンチルスチレン、ｓ－ペンチルスチレン又はｔ－ペンチルスチレン；又は置換基が１～５個の炭素原子を含有するアルコキシスチレン、例えばメトキシスチレン、エトキシスチレン、プロポキシスチレン、ブトキシスチレン又はペンチルオキシスチレンである。好ましいモノビニル化合物はスチレンである。
いくつかの実施例では、前記架橋単量体は２つ以上の非共役ビニルを有する多官能基単量体であり、本発明では、好ましくはジビニルベンゼンである。前記ジビニルベンゼンはｏ-ジビニルベンゼン、ｍ－ジビニルベンゼン、ｐ－ジビニルベンゼン又はこれらの３つの混合物である。
いくつかの実施例では、前記機能性単量体は、ラジカル重合可能な二重結合と、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン化基又は反応を通じてヒドロキシ、アミノに転化可能な基との両方を含有するものである。オリゴヌクレオチド合成過程では、反応性ヒドロキシ又はアミノはオリゴヌクレオチドを連結する活性部位となり、アミノ、アミノアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルなどであってもよい。好ましくは、第１級アミノ、アミノメチル、ヒドロキシ、メチロールなどであってもよい。ヒドロキシスチレン及びその誘導体、例えば４－ヒドロキシスチレンなど、ヒドロキシアルキルスチレン及びその誘導体、例えば４－ヒドロキシメチルスチレンなど；アシルオキシスチレン及びその誘導体、例えば４－アセトキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレンなど；アミノスチレン及びその誘導体、例えば４－アミノスチレンなど、アミノアルキルスチレン及びその誘導体、例えば４－アミノメチルスチレンなど；ハロアルキルスチレン単量体、例えば４－（４－ブロモブチル）スチレン、４－クロロメチルスチレンなど；４－ビニルフェニルエステル単量体、例えば４－ビニル安息香酸メチル、４-エテニルベンゼン酢酸エチルエステルなどを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施例では、前記機能性単量体としては、ヒドロキシ保護基又はアミノ保護基が含有されており、保護基を直接切断することによってアミノ又はヒドロキシが形成され得る単量体があり、例えば、アシルオキシスチレンはアルカリ又は酸による加水分解によってヒドロキシに転化され、オリゴヌクレオチドを連結する活性部位となってもよく、官能化反応によって活性部位として機能し得るアミノ又はヒドロキシに転化する必要がある単量体もあり、例えば、ハロアルキルスチレンは加水分解によってヒドロキシに転化したり、Ｇａｂｒｉｅｌ反応によって第１級アミノに転化して、オリゴヌクレオチドを連結する活性部位となってもよく、アミノ又はヒドロキシを備える連結アームを活性部位として連結する必要がある単量体もあり、例えば、ハロアルキルスチレンは４－ヒドロキシ安息香酸、４－ヒドロキシフェニル酢酸と反応してヒドロキシを生成し、オリゴヌクレオチドを連結する活性部位となってもよく、また、上記の複数の反応の組み合わせにより活性部位となるアミノ又はヒドロキシを取得する必要がある単量体もあり、例えば、４－ビニルフェニルエステル単量体系の単量体の場合、まず加水分解してヒドロキシを露出し、次にハイドロキノン又はｐ－フェニレンジアミンと反応して、活性部位となるアミノ又はヒドロキシを得る。
いくつかの実施例では、前記変性単量体は、単量体においてラジカル重合に関与可能な二重結合と、２つのシアノとの両方を有するものである。このような変性単量体は単独重合ができず、他の単量体と共重合することしかできず、トランスブテンジニトリル、１,４－ジシアノ－２－ブテンなどを含むが、これらに限定されない。本発明では、好ましくはトランスブテンジニトリルである。
いくつかの実施例では、前記開始剤は有機過酸化物又はアゾ化合物であり、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、ｔ－ブチルパーオキシ２－エチルヘキサノエート、２,２'－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、２,２'－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）、２,２'－アゾビス(２,４－ジメチルバレロニトリル)などを含むが、これらに限定されない。開始剤の使用量は単量体全重量の０．５～５％である。
いくつかの実施例では、前記油溶性界面活性剤は重合反応に関与せず、水に不溶又は微溶である界面活性剤であり、トリオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビトール蜜ロウ誘導体、トリステアリン酸ソルビタン、ヘキサステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、エチレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノステアリン酸エステル、ソルビタンセスキオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールオレイン酸エステル、モノステアリン酸グリセリル、ヒドロキシラノリン、ソルビタンモノオレイン酸エステル、プロピレングリコールモノラウリン酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルのうちの１種又は複数種の組み合わせを含むが、これらに限定されない。前記希釈剤は重合反応に関与せず、水に不溶又は微溶である有機溶媒であり、芳香族炭化水素例えばベンゼン、トルエン、エチルベンゼンなど；脂肪族炭化水素例えば炭素数６～１２の直鎖、分岐鎖又は環状アルカン例えばヘキサン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、イソオクタン、イソドデカン、シクロヘキサンなど；ハロ炭化水素例えばクロロホルム、クロロベンゼンなど；炭素数４以上のエステル例えば酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジブチルなど；アルコール例えば炭素数４～１２の直鎖、分岐鎖又は環状アルカンアルコール、例えばヘキサノール、シクロヘキサノール、オクタノール、イソオクタノール、デカノール、ドデカノールなどを含むがこれらに限定されない。油溶性界面活性剤及び希釈剤はいずれも重合反応に関与せず、主に孔形成作用を果たし、孔形成剤と総称する。
いくつかの実施例では、前記水相は水、分散剤及び無機塩を含み、前記分散剤は水溶性高分子であり、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンのうちの１種又は複数種を含むが、これらに限定されない。分散剤の使用量は水相の重量の０．１～５％である。前記無機塩は、水相の密度を調整しながら、油相における各成分の水相での溶解度を下げ、油滴を水相により安定的に分散させる役割を果たす。前記無機塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム等のうちの１種又は複数種を含むがこれらに限定されない。無機塩の使用量は水相の使用量の２０％以下である。
いくつかの実施例では、樹脂間の粘着を減少させ、重合熱の電導性を高め、また、装置の利用率を向上させ、生産効率を高めるために、油相と水相との重量比は１：３～１：２０に設定されている。
本発明のいくつかの実施形態では、各成分は以下のような量で存在する。初期では、油相中に存在するモノビニル化合物は単量体全量に対して４０～９５．９重量％であり、油相中に存在する架橋単量体は単量体全量に対して２～２０重量％であり、油相中に存在する機能性単量体は単量体全量に対して２～２０重量％であり、油相中に存在する変性単量体は単量体全量に対して０．１～２０重量％であり、油相中に存在する孔形成剤の重量は単量体全重量の１５～７０％であり、油溶性界面活性剤は孔形成剤全重量の０．１～１５％を占め、希釈剤は孔形成剤全重量の８５～９９．９％を占める。
本発明のいくつかのより好適な実施形態では、各成分は以下のような量で存在する。初期では、油相中に存在するモノビニル化合物は単量体全量に対して６０～８８重量％であり、油相中に存在する架橋単量体は単量体全量に対して５～１５重量％であり、油相中に存在する機能性単量体は単量体全量に対して５～１５重量％であり、油相中に存在する変性単量体は単量体全量に対して２～１０重量％であり、油相中に存在する孔形成剤の重量は単量体全重量の２５～５０％である。
本発明のいくつかの実施形態では、重合温度は５０～９０℃、好ましくは６０～８５℃である。
本発明のいくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂の製造方法は、
反応器に一定量の精製水を加え、水相重量に対して分散剤０．１～５重量％と水相重量に対して無機塩２０重量％以下とを加え、溶解して、水相を得るステップと、油相と水相との重量比が１：３～１：２０となるように、単量体全重量に対して、モノビニル化合物４０～９５．９％と、架橋単量体２～２０％と、機能性単量体２～２０％と、変性単量体０．１～２０％と、孔形成剤重量に対して油溶性界面活性剤が０．１～１５％、希釈剤が８５～９９．９％を占める孔形成剤１５～７０％と、開始剤と、を秤取し、均一に混合して、油相を得るステップと、油相を反応器に加えて、撹拌し、５０～９０℃に昇温させて、反応させて、反応終了後、孔形成剤を除去し、篩分けして適切な粒径の樹脂を収集し、真空乾燥させ、多孔質重合体樹脂を得るステップと、を含む。さらに樹脂を反応させ、アミノ又はヒドロキシを官能基とした多孔質樹脂を得る。
本発明のいくつかの実施例では、前記固相合成用の多孔質樹脂の製造方法は、
反応器に一定量の精製水を加え、水相重量に対して分散剤０．１～５重量％と無機塩２０重量％以下とを加え、溶解して、水相を得るステップと、油相と水相との重量比が１：３～１：２０となるように、単量体全重量に対して、モノビニル化合物６０～８８％と、架橋単量体５～１５％と、機能性単量体５～１５％と、変性単量体２～１０％と、孔形成剤重量に対して油溶性界面活性剤が０．１～１５％、希釈剤が８５～９９．９％を占める孔形成剤２５～５０％と、開始剤と、を秤取し、均一に混合して、油相を得るステップと、油相を反応器に加えて、撹拌し、６０～８５℃に昇温させて、反応させて、反応終了後、孔形成剤を除去し、篩分けして適切な粒径の樹脂を収集し、真空乾燥させ、多孔質重合体樹脂を得るステップと、を含む。さらに樹脂を反応させ、官能基をアミノ又はヒドロキシとする多孔質樹脂を得る。
上記方法によれば、本発明における固相合成用の多孔質樹脂、すなわち、ヒドロキシ又はアミノを含有する多孔質樹脂が得られる。本発明では、アミノ又はヒドロキシの含有量、すなわち置換度は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨと反応した後、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、比色法により除去したＦｍｏｃの量を決定し、多孔質樹脂におけるアミノ又はヒドロキシの含有量を算出することにより得られてもよい。
いくつかの実施例では、具体的な操作は以下のとおりである。担体１．０ｇを正確に秤取し、アセトニトリル溶液７ｍｌに懸濁させた後、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ ０．５ｇ、ＨＢＴＵ ０．５ｇ及びＤＩＥＡ ０．５ｍｌを加え、室温で２ｈ撹拌反応させる。反応終了後、アセトニトリル（１回あたりの使用量１０ｍｌ、３回洗浄）、メタノール（１回あたりの使用量１０ｍｌ、３回洗浄）を用いて樹脂を順次洗浄し、その後、樹脂をベークする。樹脂０．１０００ｇを正確に秤取し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液に懸濁させ、室温で３０ｍｉｎ振とうし、濾過して、濾液を収集し、ＤＭＦを用いて樹脂を洗浄し、濾液を収集する。濾液を併合して定容し、適切な倍数だけ希釈して、３００ｎｍでの吸光度を測定する。濃度が既知の一連のＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨを用いて同様なＦｍｏｃ除去反応を行って、吸光度を測定し、検量線を作成する。検量線から多孔質樹脂中のアミノ又はヒドロキシの含有量を算出する。
多孔質樹脂の置換度は機能性単量体の単量体全量における割合により決定され、機能性単量体の使用量を調整することにより置換度の異なる一連の多孔質樹脂が得られ得る。多孔質樹脂の置換度はオリゴヌクレオチド合成量を決定し、置換度が低すぎると、１ロッドのオリゴヌクレオチドの産量が下がり、置換度が高すぎると、オリゴヌクレオチドの純度が影響を受ける。本発明では、多孔質樹脂の置換度の範囲は１００～１０００μｍｍｏｌ／ｇ、好ましくは４００～７００μｍｍｏｌ／ｇである。
本発明では、多孔質樹脂の粒径は粒子画像処理装置により検出される。すなわち、多孔質樹脂をスライドガラスに均一に分布させ、顕微鏡で担体粒子を拡大させながら、カメラで顕微鏡により拡大された多孔質樹脂の粒子画像を撮影し、コンピュータによって多孔質樹脂の外観特徴及び粒度を分析して計算する。
多孔質樹脂の粒径の大きさは主に水相における分散剤の種類と使用量、孔形成剤の種類と使用量、懸濁重合過程における撹拌の回転数により左右される。これらの条件を調整することにより、多孔質樹脂の粒径を調整することができる。多孔質樹脂の粒径が大きすぎると、一方では、担体の比表面積が下がり、単位面積あたり活性部位の数が増え、オリゴヌクレオチドの純度に悪影響を与え、他方では、オリゴヌクレオチドの合成過程において物質移動速度が遅くなり、不純物が増加する。多孔質樹脂の粒径が小さすぎると、合成過程における圧力が高すぎ、装置のコストが大幅に高まる。本発明では、多孔質樹脂の粒径の範囲は３５～２００μｍ、好ましくは５０～１００μｍである。
多孔質樹脂の平均細孔径は水銀圧入法により測定される。すなわち、サンプル０．１５００～０．３０００ｇを正確に秤取して全自動水銀圧入装置ＡｕｔｏＰｏｒｅ IV ９５００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）に入れ、汞の接触角を１３０°、表面張力を４８５ｄｙｎ／ｃｍに設定し、この条件で水銀圧入法により測定される。多孔質樹脂の平均細孔径の大きさは主に孔形成剤の種類と使用量、架橋剤の使用量、反応温度や時間などにより左右される。多孔質樹脂の平均細孔径はこれらの条件を調整することにより調整され得る。多孔質樹脂の平均細孔径が小さすぎると、物質移動が困難になり、合成効率が影響を受け、多孔質樹脂の平均細孔径が大きすぎると、多孔質樹脂の比表面積が低下し、単位面積あたりの活性部位が増加し、オリゴヌクレオチド合成過程で、ヌクレオシドの増加により相互作用が発生し、オリゴヌクレオチドの純度が影響を受ける。本発明では、多孔質樹脂の平均細孔径は１０～２００ｎｍ、好ましくは４０～１００ｎｍである。
従来技術に比べて、本発明は主に以下の４つの利点がある。第一に、変性単量体は重合速度を調整することができ、これは活性部位の均一な分布に有利である。第二に、樹脂の膨潤性能を調整することで、担体の異なる溶媒中での膨潤体積の変化を低減させる。第三に、単量体分子の構造における２つのシアノによりオニウム塩系縮合剤がより高性能になり、リンカーの連結効率が確保される。第四に、特許ＵＳ８５９２５４２において「変性単量体」として使用される（メタ）アクリルアミド系単量体、特許ＵＳ８６５３１５２において「変性単量体」として使用される（メタ）アクリロニトリルと比べて、本発明で使用される変性単量体は比較的に疎水的であり、洗浄過程において多孔質樹脂内に残留された微量の水分を素早く除去することができ、オリゴヌクレオチド合成過程への水の影響を低減させ、反応効率及び収率を高める。また、本発明は、油溶性界面活性剤を使用して、油中水型エマルション液滴をテンプレートとして孔を形成するものであり、担体の細孔径の大きさ及び分布を正確に制御することができ、反応試薬の拡散に有利であり、反応効率を高め、不純物の生成を減らす。
実施例１における担体の走査電子顕微鏡像である。 実施例２における担体の走査電子顕微鏡像である。 実施例６における担体の走査電子顕微鏡像である。 実施例９における担体の走査電子顕微鏡像である。 実施例１において水銀圧入法により得られる担体の細孔径分布である。 実施例２において水銀圧入法により得られる担体の細孔径分布である。 実施例６において水銀圧入法により得られる担体の細孔径分布である。 実施例９において水銀圧入法により得られる担体の細孔径分布である。
以下、特定実施例を参照して本発明の技術解決手段をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン１１０ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）１０ｇ、ｐ－クロロメチルスチレン１２ｇ、トランスブテンジニトリル８ｇ、ソルビタンモノオレイン酸エステル５ｇ、イソオクタノール４５ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、８０℃に昇温させて４ｈ重合した。反応終了後、熱水で洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、塩素含有量が５５０μｍｍｏｌ／ｇの重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５００ｍｌを投入し、撹拌した。その後、フタルイミドカリウム塩３０ｇを加え、９５℃に昇温させて１６時間反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、その後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドで２回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、樹脂をろ別して乾燥させた。反応器に無水エタノール２００ｇとヒドラジン水和物５０ｇを加え、７５℃に昇温させて１６時間反応させた。反応終了後、体積比５０：５０のエタノール／精製水溶液で３回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、洗浄液をろ別した。反応器に無水エタノール２００ｇと濃塩酸５０ｇを加え、６０℃に昇温させて６ｈ反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、アミノを含有する固相合成担体を得た。得たアミノ固相合成担体はアミノ含有量が５４３μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が４８ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。メチルスチレン７０ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）２８ｇ、ｐ－クロロメチルスチレン１４ｇ、１,４－ジシアノ－２－ブテン２８ｇ、トリオレイン酸ソルビタン６ｇ、イソオクタノール４５ｇ、トルエン３０ｇ及び過酸化ベンゾイル１ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、７０℃に昇温させて８ｈ重合した。反応終了後、熱水で洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、塩素含有量が６６０μｍｍｏｌ／ｇの重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５００ｍｌを投入し、撹拌した。その後、フタルイミドカリウム塩３５ｇを加え、９５℃に昇温させて１６時間反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、その後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドで２回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、樹脂をろ別して乾燥させた。反応器に無水エタノール２００ｇとヒドラジン水和物５０ｇを加え、７５℃に昇温させて１６時間反応させた。反応終了後、体積比５０：５０のエタノール／精製水溶液で３回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、洗浄液をろ別した。反応器に無水エタノール２００ｇと濃塩酸５０ｇを加え、６０℃に昇温させて６ｈ反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、アミノを含有する固相合成担体を得た。得たアミノ固相合成担体はアミノ含有量が６５０μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が１３２ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。エチルスチレン１２７ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）４ｇ、４－（４－ブロモブチル）スチレン８．８ｇ、トランスブテンジニトリル０．２ｇ、ポリオキシエチレンソルビトール蜜ロウ誘導体１ｇ、イソオクタノール１２ｇ、フタル酸ジブチル１２ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、６５℃に昇温させて１０ｈ重合した。反応終了後、熱水で洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、臭素含有量２６５μｍｍｏｌ／ｇの重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド６００ｍｌを投入し、撹拌した。その後、４－ヒドロキシ安息香酸５．４ｇ、無水炭酸カリウム５．４ｇ、ヨウ化カリウム０．３ｇを加えた。７５℃に昇温させて、６ｈ反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が２５０μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が２３ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン１１０ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）１１ｇ、ｐ－クロロメチルスチレン９ｇ、トランスブテンジニトリル１０ｇ、トリステアリン酸ソルビタン０．５ｇ、トルエン２０ｇ、フタル酸ジブチル４０ｇ及び過酸化ベンゾイル１ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、６０℃に昇温させて７ｈ重合した。反応終了後、熱水で洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、塩素含有量が４２５μｍｏｌ／ｇの重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、無水エタノール３００ｍｌを投入し、撹拌した。ビーカーに水酸化ナトリウム３０ｇを秤取し、脱イオン水３００ｍｌで溶解して、反応器にゆっくりと加えた。６５℃に昇温させて、６ｈ反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が４２０μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が４３ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン８３ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）２５ｇ、Ｎ－（４－ビニルフェニル）－アセトアミド１８ｇ、トランスブテンジニトリル１４ｇ、トリステアリン酸ソルビタン３ｇ、イソオクタノール１６ｇ、イソドデカン８ｇ及び過酸化ベンゾイル２ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、５５℃に昇温させて１０ｈ重合した。反応終了後、熱水で洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、無水エタノール３００ｍｌを投入し、撹拌した。ビーカーに水酸化ナトリウム３０ｇを秤取し、脱イオン水３００ｍｌで溶解して、反応器にゆっくりと加えた。６５℃に昇温させて、６ｈ反応させた。反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、アミノを含有する固相合成担体を得た。得たアミノ固相合成担体はアミノ含有量が８４０μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が４３ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン１１１ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）１１ｇ、４－アセトキシスチレン１３ｇ、トランスブテンジニトリル５ｇ、ソルビタンモノオレイン酸エステル８ｇ、イソオクタノール４０ｇ、イソドデカン２０ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、７８℃に昇温させて、６ｈ重合した。反応終了後、熱水で樹脂を洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、アセトニトリル３００ｍｌを投入し、撹拌した。ヒドラジン水和物７．５ｍｌをゆっくりと加え、室温で３ｈ反応させた。反応終了後、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が５５０μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が６４ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン１３０ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）５ｇ、４－アセトキシスチレン４ｇ、トランスブテンジニトリル１ｇ、プロピレングリコール脂肪酸エステル１ｇ、イソオクタノール４０ｇ、トルエン１０ｇ及び過酸化ベンゾイル３．５ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、７０℃に昇温させて６ｈ重合した。反応終了後、熱水で樹脂を洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、アセトニトリル３００ｍｌを投入し、撹拌した。ヒドラジン水和物７．５ｍｌをゆっくりと加え、室温で３ｈ反応させた。反応終了後、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が１７５μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が５３ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン７２ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）２８ｇ、ベンゾイルオキシスチレン２７ｇ、トランスブテンジニトリル１３ｇ、ヒドロキシラノリン５ｇ、トルエン１０ｇ、フタル酸ジブチル２０ｇ及び過酸化ベンゾイル３ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、８０℃に昇温させて６ｈ重合した。反応終了後、熱水で樹脂を洗浄して、エタノールで還流して孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、アセトニトリル３００ｍｌを投入し、撹拌した。ヒドラジン水和物７．５ｍｌをゆっくりと加え、室温で３ｈ反応させた。反応終了後、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が８５２μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が４７ｎｍである。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得た。スチレン８５ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）２４ｇ、４－ビニル安息香酸メチル１８ｇ、トランスブテンジニトリル１３ｇ、ポリオキシエチレンソルビトールオレイン酸エステル４ｇ、イソドデカン４０ｇ、フタル酸ジブチル４０ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤取し、均一に混合して、油相を得た。油相を反応器に加えて、撹拌し、７０℃に昇温させて６ｈ重合した。反応終了後、熱水で樹脂を洗浄して、エタノールで還流して抽出し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得た。
凝縮器、撹拌器及び温度計を備えた１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、アセトニトリル３００ｍｌを投入し、撹拌した。その後、ハイドロキノン８．８ｇ、ＨＢＴＵ ２３ｇ及びＤＩＥＡ １３ｍｌを加え、室温で２ｈ反応させた。反応終了後、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得た。得たヒドロキシ固相合成担体はヒドロキシ含有量が７３５μｍｍｏｌ／ｇであり、水銀圧入法によって測定された平均細孔径が１４３ｎｍである。
実施例１～９で製造した固相合成担体のそれぞれのアセトニトリル及びトルエンでの膨潤度をテストした。以下のようにテストした。１．５ｇ程度のサンプルを秤取して、栓付きメスシリンダに入れ、それぞれトルエン又はアセトニトリルを所定の目刻まで加えた。その後、ガラス棒を用いて樹脂と溶媒を撹拌して、十分に膨潤させ、栓を締め付け、２～３時間後、ガラス棒を用いて樹脂を緩やかに撹拌して気泡を除去し、樹脂を均一に分散させて、ブロッキングを回避し、撹拌棒を取り出して、メスシリンダをゴムマット付きのテーブルに叩きつけて、樹脂を密にし、２４ｈ放置後、その体積を読み取り、その膨潤度を計算した。
結果を表１に示す。
実施例で製造した固相合成担体及びＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ ＨＬ固相合成担体を利用して、樹脂の性能を評価した。本発明の優位性をより直観的に表現するために、担体充填量（ｇ）＝合成カラム体積（ｍｌ）／担体のトルエンでの膨潤度（ｍｌ／ｇ）とし、オリゴヌクレオチドの合成過程における洗浄体積は１つの合成カラム体積に限定された。
反応器に固相合成担体１０ｇ、アセトニトリル５０ｍｌを順次秤取して１０ｍｉｎ膨潤させた後、適量のＤＭＴ－ｄＴ－３’－コハク酸、ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡを加え、室温で１２ｈ反応させた。反応終了後、アセトニトリルで５回洗浄し、その後、Ｃａｐ Ａ（アセトニトリル２０ｍｌ、ピリジン７．５ｍｌ、Ｎ－メチルイミダゾール５．０ｍｌからなる）及びＣａｐ Ｂ（アセトニトリル１０ｍｌ、無水酢酸４ｍｌ）を加え、室温で３０ｍｉｎ反応させた。反応終了後、アセトニトリルで５回洗浄し、真空乾燥させ、ＤＭＴ－ｄＴを担持した担体を得た。ｐ－トルエンスルホン酸／アセトニトリル溶液を用いて担持したＤＭＴ基を除去し、分光光度法によって４１２ｎｍ波の下で担体に担持されたＤＭＴ基の担持量を測定し、結果を表２に示す。
ＤＭＴ－ｄＴを担持した担体を合成カラム（３２ｍｌ）に充填し、合成カラムをＡＫＴＡ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ １００に取り付け、配列ｄ［ＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴＡＣＧＴ］の２０塩基長のオリゴヌクレオチドを合成した。合成過程は以下のとおりである。１．ジクロロメタンを用いて樹脂を膨潤させた。２．１０％ＤＣＡ／ＤＣＭでＤＭＴ基を除去した。３．無水アセトニトリルで洗浄した。４．ホスホロアミダイト単量体及び活性化試薬を加えて縮合した。５．無水アセトニトリルで洗浄した。６．酸化剤を加えて酸化した。７．無水アセトニトリルで洗浄した。８．キャッピング試薬を加えてキャッピングした。９．無水アセトニトリルで洗浄した。１０．ステップ２を繰り返して、次のサイクルを開始させた。
合成完了後、担体を取り出して乾燥させた。その後、ガラス瓶に入れて、適量の濃アンモニア水を加え、５５℃で１６ｈ反応させ、オリゴヌクレオチドを担体から分解し取り出し、また、塩基での保護基を除去した。担体とオリゴヌクレオチドを濾過により分離し、濾液を乾燥させ、オリゴヌクレオチド粗粉を得て、ＨＰＬＣによりその純度を検出し、オリゴヌクレオチドの収率を算出した。結果を表２に示す。
表２から分かるように、本発明のオリゴヌクレオチド固相合成担体によれば、オリゴヌクレオチドの収率及び純度を向上させることができ、オリゴヌクレオチドの生産コストを削減させるのに有利である。
なお、以上は本発明の好適な実施形態に過ぎず、当業者でれば、本発明の構想から逸脱せずに、いくつかの変形や改良が可能であり、これらは全て本発明の保護範囲に属する。

Claims (21)

  1. 固相合成用の多孔質樹脂であって、前記多孔質樹脂は骨格に式（Ｉ）、式（II）、式（III）、式（IV）で表される繰り返し構造単位を有する共重合体であり、
    Figure 0007640680000008
    （ただし、Ｒ４＝－Ｃ－又は－Ｃ－ＣＨ２－である。）
    Figure 0007640680000009
    Figure 0007640680000010
    （ただし、Ｒ５は、－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＮＨ２、－ＣＨ２ＮＨ２、－ＣＨ２ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＨ２ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－（ＣＨ２）４ＯＯＣＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、－ＣＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＮＨ－Ｃ６Ｈ４－ＮＨ２、－ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨ、又は－ＣＨ２ＣＯＯ－Ｃ６Ｈ４－ＯＨである。）
    Figure 0007640680000011
    （ただし、Ｒ６は－Ｈ、ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～４の整数である。）、（ＣＨ３）２ＣＨ（ＣＨ２）ｎ－（ｎは０～２の整数である。）、（ＣＨ３）３Ｃ－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、ＣＨ３ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、又はＣＨ３（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－（ｎは０～４の整数である。）である。）
    （ただし、式（Ｉ）、式（II）、式（III）、式（IV）で表される繰り返し構造単位はそれぞれ変性単量体、架橋単量体、機能性単量体、及びモノビニル化合物に由来する。）
    （ただし、単量体全量に対して前記モノビニル化合物は４０～９５．９重量％であり、単量体全量に対して前記架橋単量体は２～２０重量％であり、単量体全量に対して前記機能性単量体は２～２０重量％であり、単量体全量に対して前記変性単量体は０．１～２０重量％である。）
    （ただし、前記多孔質樹脂はヒドロキシ又はアミノの含有量が１００～１０００μｍｏｌ／ｇであり、アミノ又はヒドロキシの前記含有量は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨと反応した後、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより得られ、比色法により除去したＦｍｏｃの量を決定し、前記多孔質樹脂におけるアミノ又はヒドロキシの前記含有量を算出される。）
    前記多孔質樹脂は、粒子画像処理装置により検出される、すなわち、前記多孔質樹脂をスライドガラスに均一に分布させ、顕微鏡で担体粒子を拡大させながら、カメラで顕微鏡により拡大された前記多孔質樹脂の粒子画像を撮影し、コンピュータによって前記多孔質樹脂の外観特徴及び粒度を分析して計算される粒径の範囲が３５～２００μｍであり、
    前記多孔質樹脂は、水銀圧入法により測定される、すなわち、サンプル０．１５００～０．３０００ｇを正確に秤取して全自動水銀圧入装置ＡｕｔｏＰｏｒｅ IV ９５００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）に入れ、汞の接触角を１３０°、表面張力を４８５ｄｙｎ／ｃｍに設定し、この条件で水銀圧入法により測定される平均孔径が１０～２００ｎｍである、ことを特徴とする固相合成用の多孔質樹脂。
  2. ヒドロキシ又はアミノの含有量が４００～７００μｍｏｌ／ｇであり、アミノ又はヒドロキシの前記含有量は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨと反応した後、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより得られ、比色法により除去したＦｍｏｃの量を決定し、前記多孔質樹脂におけるアミノ又はヒドロキシの前記含有量を算出される、ことを特徴とする請求項１に記載の固相合成用の多孔質樹脂。
  3. 前記多孔質樹脂は、粒子画像処理装置により検出される、すなわち、前記多孔質樹脂をスライドガラスに均一に分布させ、顕微鏡で担体粒子を拡大させながら、カメラで顕微鏡により拡大された前記多孔質樹脂の粒子画像を撮影し、コンピュータによって前記多孔質樹脂の外観特徴及び粒度を分析して計算される粒径の範囲が５０～１００μｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の固相合成用の多孔質樹脂。
  4. 前記多孔質樹脂は、水銀圧入法により測定される、すなわち、サンプル０．１５００～０．３０００ｇを正確に秤取して全自動水銀圧入装置ＡｕｔｏＰｏｒｅ IV ９５００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）に入れ、汞の接触角を１３０°、表面張力を４８５ｄｙｎ／ｃｍに設定し、この条件で水銀圧入法により測定される平均孔径が４０～１００ｎｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の固相合成用の多孔質樹脂。
  5. 固相合成用の多孔質樹脂の製造方法であって、水、分散剤、無機塩から構成される水相と、モノビニル化合物、架橋単量体、機能性単量体、変性単量体、油溶性界面活性剤、希釈剤及び開始剤から構成される油相とをそれぞれ調製するステップと、
    前記油相を前記水相に加えて、撹拌して昇温させて、重合反応させて、前記重合反応の終了後、孔形成剤を除去し、多孔質重合体樹脂を得るステップと、を含み、
    前記モノビニル化合物、前記架橋単量体、前記機能性単量体及び前記変性単量体は重合反応に関与し、前記油溶性界面活性剤及び前記希釈剤は重合反応に関与せず、主に孔形成作用を果たし、
    前記変性単量体はトランスブテンジニトリル、１,４－ジシアノ－２－ブテンを含み、
    前記モノビニル化合物はスチレン及びそのベンゼン環置換誘導体を含み、置換基は１～５個の炭素原子を含有するアルキル又はアルコキシであり、
    前記架橋単量体はジビニルベンゼンであり、
    前記機能性単量体は、４－ヒドロキシスチレン、４－ヒドロキシメチルスチレン、４－アセトキシスチレン、ベンゾイルオキシスチレン、４－アミノスチレン、４－アミノメチルスチレン、４－（４－ブロモブチル）スチレン、ｐ－クロロメチルスチレン、４－ビニル安息香酸メチル、４-エテニルベンゼン酢酸エチルエステルを含み、
    前記希釈剤は重合反応に関与しない有機溶媒であり、
    前記分散剤は水溶性高分子であり、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンのうちの１種又は複数種を含み、
    前記油相において、単量体全量に対して前記モノビニル化合物は４０～９５．９重量％であり、
    前記油相において、単量体全量に対して前記架橋単量体は２～２０重量％であり、
    前記油相において、単量体全量に対して前記機能性単量体は２～２０重量％であり、
    前記油相において、単量体全量に対して前記変性単量体は０．１～２０重量％であり、
    さらに前記多孔質重合体樹脂を反応させて、機能基としてヒドロキシ又はアミノを含有する多孔質樹脂を得て、
    前記多孔質樹脂はヒドロキシ又はアミノの含有量が１００～１０００μｍｏｌ／ｇであり、アミノ又はヒドロキシの前記含有量は、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨと反応した後、Ｆｍｏｃ保護基を除去することにより得られ、比色法により除去したＦｍｏｃの量を決定し、前記多孔質樹脂におけるアミノ又はヒドロキシの前記含有量を算出され、
    前記多孔質樹脂は、粒子画像処理装置により検出される、すなわち、前記多孔質樹脂をスライドガラスに均一に分布させ、顕微鏡で担体粒子を拡大させながら、カメラで顕微鏡により拡大された前記多孔質樹脂の粒子画像を撮影し、コンピュータによって前記多孔質樹脂の外観特徴及び粒度を分析して計算される粒径の範囲が３５～２００μｍであり、
    前記多孔質樹脂は、水銀圧入法により測定される、すなわち、サンプル０．１５００～０．３０００ｇを正確に秤取して全自動水銀圧入装置ＡｕｔｏＰｏｒｅ IV ９５００（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）に入れ、汞の接触角を１３０°、表面張力を４８５ｄｙｎ／ｃｍに設定し、この条件で水銀圧入法により測定される平均孔径が１０～２００ｎｍである、ことを特徴とする固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  6. 前記開始剤は有機過酸化物又はアゾ化合物である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  7. 前記開始剤は過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、ｔ－ブチルパーオキシ２－エチルヘキサノエート、２,２'－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、２,２'－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）、２,２'－アゾビス(２,４－ジメチルバレロニトリル)を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  8. 前記油溶性界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビトール蜜ロウ誘導体、トリステアリン酸ソルビタン、ヘキサステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、エチレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノステアリン酸エステル、ソルビタンセスキオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールオレイン酸エステル、モノステアリン酸グリセリル、ヒドロキシラノリン、ソルビタンモノオレイン酸エステル、プロピレングリコールモノラウリン酸エステルのうちの１種又は複数種の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  9. 前記希釈剤は、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ドデカン、イソオクタン、イソドデカン、シクロヘキサン、クロロホルム、クロロベンゼン、酢酸エチル、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、ヘキサノール、シクロヘキサノール、オクタノール、イソオクタノール、デカノール、ドデカノールを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  10. 前記水相において、前記分散剤は０．１～５重量％、前記無機塩は２０重量％以下であり、
    前記油相と前記水相との重量比は１：３～１：２０であり、
    前記油相において、前記孔形成剤の重量は単量体全重量の１５～７０％であり、
    前記孔形成剤中、前記油溶性界面活性剤は孔形成剤全重量の０．１～１５％を占め、
    前記孔形成剤中、前記希釈剤は孔形成剤全重量の８５～９９．９％を占める、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  11. 前記重合温度は５０～９０℃である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  12. 前記製造過程は、
    反応器に一定量の精製水を加え、水相重量に対して前記分散剤を０．１～５重量％と水相重量に対して前記無機塩を２０重量％以下とを加え、溶解して、前記水相を得るステップと、
    前記油相と前記水相との重量比が１：３～１：２０となるように、単量体全重量に対して、前記モノビニル化合物を４０～９５．９％、前記架橋単量体を２～２０％、前記機能性単量体を２～２０％、前記変性単量体を０．１～２０％、孔形成剤重量に対して前記油溶性界面活性剤が０．１～１５重量％を占め、前記希釈剤が８５～９９．９％を占める前記孔形成剤１５～７０％、前記開始剤と、を秤量し、均一に混合すると、前記油相を得るステップと、
    前記油相を前記反応器に加えて、撹拌して５０～９０℃に昇温させ、反応させて、反応終了後、前記孔形成剤を除去し、篩分けして適切な粒径の樹脂を収集し、真空乾燥させ、多孔質重合体樹脂を得て、さらに樹脂を反応させ、アミノ又はヒドロキシ官能基とした多孔質樹脂を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項５から１１のいずれか１項に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  13. 前記多孔質アミノ樹脂の製造プロセスは、
    凝縮器、撹拌器及び温度計を装備した３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入して、溶解して、水相を得て、
    スチレン１１０ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）１０ｇ、ｐ－クロロメチルスチレン１２ｇ、トランスブテンジニトリル８ｇ、ソルビタンモノオレイン酸エステル５ｇ、イソオクタノール４５ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤量し、均一に混合すると、油相を得て、油相を反応器に加えて、撹拌し、８０℃に昇温させて４ｈ重合し、反応終了後、熱水で洗浄して、エタノール還流により孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、塩素含有量が５５０μｍｏｌ／ｇの重合体多孔質樹脂を得るステップと、
    凝縮器、撹拌器及び温度計を装備した１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５００ｍｌを投入し、撹拌し、その後、フタルイミドカリウム塩３０ｇを加え、９５℃に昇温させて１６時間反応させ、反応終了後、室温に冷却させ、その後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドで２回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、樹脂をろ別して乾燥させ、反応器に無水エタノール２００ｇとヒドラジン水和物５０ｇを加え、７５℃に昇温させて１６時間反応させ、反応終了後、体積比５０：５０のエタノール／精製水溶液で３回洗浄し、精製水で中性となるまで洗浄し、次に、無水エタノールで３回洗浄し、洗浄液をろ別して除去し、反応器に無水エタノール２００ｇと濃塩酸５０ｇを加え、６０℃に昇温させて６ｈ反応させ、反応終了後、室温に冷却させ、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、アミノ含有量が５４３μｍｏｌ／ｇの、水銀圧入法により測定した平均孔径が４８ｎｍの固相合成担体を得るステップと、を含み、或いは、
    前記多孔質ヒドロキシ樹脂の製造プロセスは、
    凝縮器、撹拌器及び温度計を装備した３Ｌ反応器に精製水２Ｌ、ポリビニルアルコール２０ｇ、塩化ナトリウム６０ｇを投入し、溶解して、水相を得て、
    スチレン１１１ｇ、ジビニルベンゼン（含有量８０重量％）１１ｇ、４－アセトキシスチレン１３ｇ、トランスブテンジニトリル５ｇ、ソルビタンモノオレイン酸エステル８ｇ、イソオクタノール４０ｇ、イソドデカン２０ｇ及び過酸化ベンゾイル２．５ｇを秤量し、均一に混合すると、油相を得て、油相を反応器に加えて、撹拌して７８℃に昇温させ、６ｈ重合し、反応終了後、熱水で樹脂を洗浄して、エタノール還流により孔形成剤を抽出して除去し、篩分けして粒径５０～１００μｍの樹脂を収集し、真空乾燥させ、重合体多孔質樹脂を得るステップと、
    凝縮器、撹拌器及び温度計を装備した１Ｌ反応器に重合体多孔質樹脂５０ｇ、アセトニトリル３００ｍｌを投入し、撹拌し、ヒドラジン水和物７．５ｍｌをゆっくりと加え、室温で３ｈ反応させ、反応終了後、中性となるまで水洗し、その後、真空乾燥させ、ヒドロキシの含有量が５５０μｍｏｌ／ｇ、水銀圧入法により測定した平均孔径が６４ｎｍの、ヒドロキシを含有する固相合成担体を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項５から１２のいずれか１項に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  14. 請求項５から１３のいずれか１項に記載の方法で製造した請求項１に記載の固相合成用の多孔質樹脂、のオリゴヌクレオチドの固相合成への使用。
  15. 前記油相において、単量体全量に対して前記モノビニル化合物は６０～８８重量％である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  16. 前記油相において、単量体全量に対して前記架橋単量体は５～１５重量％である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  17. 前記油相において、単量体全量に対して前記機能性単量体は５～１５重量％である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  18. 前記油相において、単量体全量に対して前記変性単量体は２～１０重量％である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  19. 前記油相において、前記孔形成剤の重量は単量体全重量の２５～５０％である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  20. 前記重合温度は６０～８５℃である、ことを特徴とする請求項５に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
  21. 前記製造過程は、
    反応器に一定量の精製水を加え、前記水相重量に対して前記分散剤を０．１～５重量％と水相重量に対して前記無機塩を２０重量％以下とを加え、溶解して、前記水相を得るステップと、
    前記油相と前記水相との重量比が１：３～１：２０となるように、単量体全重量に対して、前記モノビニル化合物が６０～８８重量％と、前記架橋単量体が５～１５重量％と、前記機能性単量体が５～１５重量％と、前記変性単量体が２～１０重量％と、孔形成剤重量に対して前記油溶性界面活性剤が０．１～１５重量％を占め、前記希釈剤が８５～９９．９％を占める前記孔形成剤が２５～５０重量％と、前記開始剤と、を秤量し、均一に混合すると、前記油相を得るステップと、
    前記油相を前記反応器に加えて、撹拌して６０～８５℃に昇温させ、反応させて、前記反応の終了後、前記孔形成剤を除去し、篩分けして適切な粒径の樹脂を収集し、真空乾燥させ、多孔質重合体樹脂を得て、さらに、この樹脂を反応させ、アミノ又はヒドロキシ官能基とした多孔質樹脂を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項５から１１のいずれか１項に記載の固相合成用の多孔質樹脂の製造方法。
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