JP7644151B2 - 抗ｐｄ－１抗体および融合タンパク質 - Google Patents

抗ｐｄ－１抗体および融合タンパク質 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，１１４号の、および２０２０年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１１１，４５９号の優先権の利益を主張する。
本開示は、一般に分子生物学および医薬の分野に関する。より詳しくは、本開示は、ＩＬ－１５ポリペプチドに連結された抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供し、ＩＬ－１５ポリペプチドは、次いでＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ポリペプチドに連結される。さらに、本開示は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片ならびにこのような抗ＰＤ－１抗体およびそのＰＤ－１結合断片を含む融合タンパク質を提供する。また、疾患を処置するための抗体融合物または抗体を含む治療組成物も開示される。
ＰＤ－１は、２８６個のアミノ酸の５５ＫＤのＩ型膜貫通タンパク質であり、膜近位免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＰＤ－１サイトゾルドメインは、２つのチロシンを含有し、最も近いチロシン（マウスＰＤ－１中のＶＡＹＥＥＬ）は、ＩＴＩＭ内に位置する。ヒトＰＤ－１タンパク質およびマウスＰＤ－１タンパク質は、約６０％のアミノ酸同一性を共有し、４つの潜在的なＮ－グリコシル化部位およびＩｇ－Ｖドメインを規定する残基が保存されている。細胞質領域中のＩＴＩＭの周囲のＩＴＩＭ様モチーフおよびＣ末端チロシンも、ヒトオルソログとマウスオルソログとの間で保存されている。ＰＤ－１は、受容体のＣＤ－２８ファミリーのメンバーであり、主に、末梢組織および腫瘍微小環境において成熟Ｔ細胞で発現される。ＰＤ－１はまた、Ｂ細胞、専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）および、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む他の非Ｔ細胞サブセットで発現される。
ＰＤ－１のリガンドには、Ｂ７ファミリーメンバーＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１およびＣＤ２７４としても知られる）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣおよびＣＤ２７３としても知られる）がある。ＰＤ－Ｌ１は、主に、リンパ系および非リンパ系組織の両方、例えば、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、マクロファージ系統細胞、末梢組織で、ならびに腫瘍細胞、ウイルス感染細胞および自己免疫組織細胞で発現される。しかし、ＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－Ｌ１よりも制限された発現を有し、マクロファージおよび活性化樹状細胞でのみ発現される。ＰＤ－１リガンドは、黒色腫、神経膠腫、非小細胞肺がん、頭頸部の扁平上皮癌、白血病、膵臓がん、腎細胞癌および肝細胞癌を含む多数のヒトがんにおいて発現され、ほぼすべてのがんにおいて誘導可能であり得る。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用は、Ｔ細胞キナーゼＺＡＰ７０の脱リン酸化および不活性化ならびにＳＨＰ２の動員をもたらす。ＳＨＰ２は、ＰＩ３Ｋを直接的に脱リン酸化し、Ａｋｔｉｎの下流活性化を阻害し、腫瘍浸潤性リンパ球の減少およびＴ細胞受容体媒介性増殖の減少を引き起こし、免疫回避につながる。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害することは、免疫抑制を逆転させ、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２との相互作用が同様にブロッキングされる場合に効果は相加的である場合がある。
ＰＤ－１媒介性免疫抑制が関与する疾患を処置するために、いくつかの市販の抗ＰＤ－１抗体が現在使用されている。しかし、患者のサブセットしかこれらの療法に対して十分に応答しない。適応症および他の因子に応じて、各単剤療法の患者の通常の応答率は、１０％～３０％の範囲である。この応答の欠如の１つの可能性ある理由は、活性化された抗腫瘍ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞ならびに他のエフェクター、例えば、ＮＫ細胞を含む炎症性腫瘍微小環境（ＴＭＥ）がないことである可能性がある。
種々のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）とともにＰＤ－１抗体が関与する併用療法は、がんおよび感染症の処置において何らかの有効性を有する場合がある。しかし、これらの療法は、有効性を得るために必要なサイトカインの高い血中濃度ならびに罹患細胞および組織に対する投与されるサイトカインの特異性の欠如の両方と関連する全身毒性によって制限される。
ＩＬ－１５は、１１４個のアミノ酸を有する１２．５ＫＤの糖タンパク質であり、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）およびＧＭ－ＣＳＦも含むサイトカイン４α－ヘリックスバンドルファミリーに属する。ＩＬ－１５は、マクロファージ、樹状細胞および単球によって分泌される。ＩＬ－１５は、他のＴ細胞に対する効果をモジュレートすることなく、中枢記憶ＣＤ８細胞を刺激して免疫性を発揮できる。さらに、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞およびエフェクターおよび記憶ＣＤ８Ｔ細胞を活性化でき、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって誘導されるアポトーシスからＴ細胞を救出できる。ＩＬ－１５の投与はまた、他のサイトカインと比較して、高い用量で全身毒性を誘導するリスクがより低いことと関連している。ヒトＩＬ－１５は、可溶性であるか、または膜結合型であり得る。ＩＬ－１５の主要な形態である膜結合型ＩＬ－１５は、細胞膜へのＩＬ－１５の直接的な結合によって、または膜結合型ＩＬ－１５Ｒ受容体によるＩＬ－１５の提示によって形成される。
ＩＬ－１５受容体は、３つのサブユニット：ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５ＲβおよびＩＬ－１５Ｒγから構成される。ＩＬ－１５は、通常、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上の機能的ＩＬ－１５Ｒβおよびγユニットへの結合の前に、ＡＰＣ上に発現されたＩＬ－１５受容体αと複合体を形成する。ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒα受容体単独に親和性（Ｋａ＝１．１０１１Ｍ－１）で結合できる。これはまた、ＩＬ－１５Ｒβγｃシグナル伝達複合体に、より低い親和性（Ｋａ＝１．１０９Ｍ－１）で結合できる。ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン（２９．５ＫＤ）は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒαの複合体形成において重要な役割を果たす。
全身ＩＬ－１５処置を用いる場合の制限の１つは、その極めて短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期である。したがって、免疫応答をモジュレートするその能力を保持しながら、より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαの適した免疫刺激形態を生成する必要がある。さらに、不要な全身毒性を避け、より有効な治療利益を提供するために、疾患部位に選択的に標的化できる有効なＩＬ－１５アンタゴニストが必要である。
ＰＤ－１活性をモジュレートする化合物は、がん、炎症および自己免疫疾患を含む種々の疾患および障害の処置のための治療剤としての可能性を有する。非特異的免疫活性と関連する副作用を伴わずに治療利益を提供するために、疾患部位に種々のエフェクター分子を標的化する新規戦略を開発する重要な、満たされていない必要性がある。
ＰＤ－１に結合する融合タンパク質、抗体およびそれらの抗原結合断片が、本明細書において提供される。実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む。また、ＰＤ－１に結合する抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片も開示される。また、このような融合タンパク質、抗体およびそれらの抗原結合断片の治療組成物、ならびにこれらの融合タンパク質、抗体およびそれらの抗原結合断片を使用する方法も提供される。
一態様では、本開示は、ＰＤ－１結合タンパク質、ＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）結合タンパク質（例えば、ＩＬ－１５またはそのＩＬ－１５Ｒ結合部分）およびＩＬ－１５結合タンパク質（例えば、ＩＬ－１５ＲαまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含むそのＩＬ－１５結合部分）を含む融合タンパク質を提供する。一態様では、ＰＤ－１結合タンパク質は、抗体またはそのＰＤ－１結合断片である。一実施形態では、ＩＬ－１５受容体結合部分は、ＩＬ－１５である。実施形態では、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインに直接的または間接的につなげられる。
一実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－１５ポリペプチドを含み、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端は、抗体重鎖の１つの重鎖可変領域のＮ末端に直接的にまたはポリペプチドリンカーを介して共有結合によって連結される（すなわち、抗体重鎖は、ヘテロ二量体を形成し、重鎖の１つは、ＩＬ－１５ポリペプチドに連結される）。一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドのＮ末端は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドのＣ末端に連結される。
一実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体および２つのＩＬ－１５ポリペプチドを含み、各ＩＬ－１５ポリペプチドは、抗体重鎖のＮ末端に共有結合によって連結される。
１つのみの重鎖が、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインに連結される実施形態では、抗体のＦｃドメインは、ヘテロ二量体形成を促進する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る（すなわち、重鎖融合物の融合を欠く重鎖との会合）。実施形態では、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３－１）中のアミノ酸残基は、アミノ酸をより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えるアミノ酸置換を含み、それによって、ＣＨ３ドメイン内に「ノブ」が生成し、これは、他の重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３－２）内に存在する、アミノ酸残基をより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えることによって生成された「ホール」中に配置可能である。実施形態では、アミノ酸置換は、以下の群から選択される：
（１）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ
（２）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ
（３）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ。
第１のまたは第２の重鎖のいずれかは、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインに連結される。
実施形態では、ＩＬ－１５ＲαポリペプチドおよびＩＬ－１５ポリペプチドは、第１のリンカーによってつなげられる。実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドおよび抗ＰＤ－１抗体またはそれらの抗原結合部分は、第２のリンカーによってつなげられる。実施形態では、リンカーの長さは独立に１０～４０個のアミノ酸の間であり得る。実施形態では、リンカーの長さは、２５～３５個のアミノ酸である。実施形態では、リンカー配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＧｌｎ（Ｑ）を含む群から、最も好ましくは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）およびＳｅｒ（Ｓ）を含む群において選択される近くの中性アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリンリッチであり、一部の実施形態では、リンカーは、セリンおよびグリシン残基のみを含有する。
ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインは、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５の１、４、８、３０、４５、６１、６４、６５および／または１０８位に位置する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５の４５、６５および／または１０８位に位置する。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５中のＮ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｌ４５Ａ、Ｎ６５Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｋおよび／またはＱ１０８Ｓ／Ｅ置換のうち１つまたはそれ以上である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５中のＬ４５Ａ、Ｎ６５Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｋおよび／またはＱ１０８Ｓ置換である。一実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５中のＮ６５Ｓ置換である。
一実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン中のＮ６０置換である。一実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン中のＮ６０Ａ置換である。
実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｎ６５Ｓ、Ｎ６５ＡまたはＮ６５Ｄのうち１つを含むＩＬ－１５ポリペプチドを含む。実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸置換：（１）Ｌ４５Ａ、（２）Ｎ６５Ｓ、Ｎ６５ＡまたはＮ６５Ｄおよび（３）Ｑ１０８Ｓのうち１つまたはそれ以上を含むＩＬ－１５ポリペプチドを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ６０Ａアミノ酸置換を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドを含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）ＩＬ－１５ポリペプチドまたはその誘導体；
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたはその誘導体；および
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドと、ＩＬ－１５ポリペプチドまたはその誘導体とをつなげるリンカーポリペプチド
を含む融合タンパク質に関する。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列または配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列または配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；および
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド
を含む融合タンパク質に関する。
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質の部分は、図１に提供される、またはそうではなく本明細書において記載される対応する重および軽鎖可変領域および／またはＣＤＲを含むものを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する任意の抗体またはその抗原結合断片であり得る。実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＣＤＲ１Ｈ）の配列は、配列番号２１の配列を含む；
重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＣＤＲ２Ｈ）の配列は、配列番号２２の配列を含む；
重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＣＤＲ３Ｈ）の配列は、配列番号２３の配列を含む；
軽鎖可変領域のＣＤＲ１（ＣＤＲ１Ｌ）の配列は、配列ＲＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＩＸ１７Ｘ１８ＷＸ１９Ｘ２０（配列番号１３５）を含み；
Ｘ１３はＡまたはＶであり；
Ｘ１４はＳまたはＧであり；
Ｘ１５はＱ、ＥまたはＲであり；
Ｘ１６はＧ、Ｓ、ＤまたはＮであり；
Ｘ１７はＧ、ＳまたはＮであり；
Ｘ１８はＳ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、ＨまたはＶであり；
Ｘ１９はＬまたはＶであり；
Ｘ２０はＧまたはＡであり；
軽鎖可変領域のＣＤＲ２（ＣＤＲ２Ｌ）の配列は、配列Ｘ２１ＡＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６（配列番号１３６）を含み；
Ｘ２１はＳ、Ｄ、ＥまたはＡであり；
Ｘ２２はＳまたはＫであり；
Ｘ２３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＤであり；
Ｘ２４はＬまたはＶであり；
Ｘ２５はＱ、ＥまたはＨであり；
Ｘ２６はＳ、Ｎ、Ａ、Ｒ、ＰまたはＴであり；
軽鎖可変領域のＣＤＲ３（ＣＤＲ３Ｌ）の配列は、配列ＱＱＸ２７Ｘ２８ＳＦＰＸ２９Ｘ３０（配列番号１３７）を含み；
Ｘ２７はＡまたはＧであり；
Ｘ２８はＮ、ＤまたはＹであり；
Ｘ２９はＦまたはＬであり；
Ｘ３０はＡまたはＴである。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号９８または配列番号９８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号２１、２２および２３を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４５、４６および４７；配列番号６６、６７および６８；配列番号７０、６７および７１；配列番号７３、７４および７５；配列番号７７、７８および４７；配列番号８０、８１および８２；配列番号７７、７８および８４；配列番号７７、８６および４７；配列番号８８、８９および４７；配列番号６６、６７および４７；配列番号８０、９２および７５；配列番号８０、９４および７１；配列番号９９、１００および４７；配列番号１０２、１０３および１０４；配列番号１０６、１０３および４７；配列番号１０８、１０３および４７；配列番号１１０、１１１および７５；配列番号７７、１０３および１１３；配列番号７７、１１１および４７；配列番号１１６、６７および４７；配列番号１１８、１１９および４７；配列番号８０、７８および４７；配列番号１２２、１０３および４７；配列番号１２４、１２５および７５；配列番号１２７、３８および６８；配列番号１２９、１３０および４７または配列番号１３２、１３３および７５を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、８７、９０、９１、９３、９５、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４または配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、８７、９０、９１、９３、９５、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４のいずれか対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＳＳＸ１ＳＬＬＸ２ＳＮＧＸ３Ｘ４ＹＬＤ（配列番号６２）を含み、
Ｘ１はＱまたはＥであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＹまたはＮであり；
Ｘ４はＴまたはＮであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号６３）を含み、
Ｘ５はＬ、ＱまたはＥであり；
Ｘ６はＳ、ＡまたはＶであり；
Ｘ７はＨ、Ｎ、ＴまたはＳであり；
Ｘ８はＲまたはＬであり；
Ｘ９はＧ、ＡまたはＨであり；
Ｘ１０はＳまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＭＱＧＸ１１Ｘ１２ＷＰＹＴ（配列番号６４）を含み、
Ｘ１１はＡ、ＴまたはＳであり；
Ｘ１２はＨまたはＲである。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
軽鎖可変領域のＣＤＲ３（ＣＤＲ３Ｌ）の配列は、配列番号５０の配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２０または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号５１または配列番号５１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４１、４２および４３；配列番号４１、５２および５３；配列番号４１、５５および５６；または配列番号５８、５９および６０を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２０または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４４、５４、５７もしくは６１または配列番号４４、５４、５７もしくは６１のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
別の態様では、本開示は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片はＰＤ－１に結合し、抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、抗体重鎖は、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む定常領域を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＩＸ１７Ｘ１８ＷＸ１９Ｘ２０（配列番号１３５）を含み；
Ｘ１３はＡまたはＶであり；
Ｘ１４はＳまたはＧであり；
Ｘ１５はＱ、ＥまたはＲであり；
Ｘ１６はＧ、Ｓ、ＤまたはＮであり；
Ｘ１７はＧ、ＳまたはＮであり；
Ｘ１８は、Ｓ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、ＨまたはＶであり；
Ｘ１９はＬまたはＶであり；
Ｘ２０はＧまたはＡであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ２１ＡＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６（配列番号１３６）を含み；
Ｘ２１はＳ、Ｄ、ＥまたはＡであり；
Ｘ２２はＳまたはＫであり；
Ｘ２３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＤであり；
Ｘ２４はＬまたはＶであり；
Ｘ２５はＱ、ＥまたはＨであり；
Ｘ２６はＳ、Ｎ、Ａ、Ｒ、ＰまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＱＱＸ２７Ｘ２８ＳＦＰＸ２９Ｘ３０（配列番号１３７）を含み；
Ｘ２７はＡまたはＧであり；
Ｘ２８はＮ、ＤまたはＹであり；
Ｘ２９はＦまたはＬであり；
Ｘ３０はＡまたはＴである。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２４を含む重鎖可変領域または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号９８を含む軽鎖可変領域または配列番号９８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号２１、２２および２３を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４５、４６および４７；配列番号６６、６７および６８；配列番号７０、６７および７１；配列番号７３、７４および７５；配列番号７７、７８および４７；配列番号８０、８１および８２；配列番号７７、７８および８４；配列番号７７、８６および４７；配列番号８８、８９および４７；配列番号６６、６７および４７；配列番号８０、９２および７５；配列番号８０、９４および７１；配列番号９９、１００および４７；配列番号１０２、１０３および１０４；配列番号１０６、１０３および４７；配列番号１０８、１０３および４７；配列番号１１０、１１１および７５；配列番号７７、１０３および１１３；配列番号７７、１１１および４７；配列番号１１６、６７および４７；配列番号１１８、１１９および４７；配列番号８０、７８および４７；配列番号１２２、１０３および４７；配列番号１２４、１２５および７５；配列番号１２７、３８および６８；配列番号１２９、１３０および４７；または配列番号１３２、１３３および７５を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２４を含む重鎖可変領域または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４を含む軽鎖可変領域または配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＳＳＸ１ＳＬＬＸ２ＳＮＧＸ３Ｘ４ＹＬＤ（配列番号６２）を含み、
Ｘ１はＱまたはＥであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＹまたはＮであり；
Ｘ４はＴまたはＮであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号６３）を含み、
Ｘ５はＬ、ＱまたはＥであり；
Ｘ６はＳ、ＡまたはＶであり；
Ｘ７はＨ、Ｎ、ＴまたはＳであり；
Ｘ８はＲまたはＬであり；
Ｘ９はＧ、ＡまたはＨであり；
Ｘ１０はＳまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＭＱＧＸ１１Ｘ１２ＷＰＹＴ（配列番号６４）を含み、
Ｘ１１はＡ、ＴまたはＳであり；
Ｘ１２はＨまたはＲである。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２０を含む重鎖可変領域または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号５１を含む軽鎖可変領域または配列番号５１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４１、４２および４３；配列番号４１、５２および５３；配列番号４１、５５および５６；または配列番号５８、５９および６０を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２０を含む重鎖可変領域または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号４４、５４、５７もしくは６１を含む軽鎖可変領域または配列番号４４、５４、５７もしくは６１のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；
ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、以下：
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む；
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドまたは配列番号２１２に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドまたは配列番号２１４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む；
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一態様では、本開示は、
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５ポリペプチドであって、場合により、配列番号２１２のアミノ酸Ｎ６５がＳ、ＤまたはＡで置換されている、ＩＬ－１５ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドであって、場合により、配列番号２１４のアミノ酸Ｎ２８がＡで置換されている、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド；
を含む融合タンパク質に関し、
場合により、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、２つの重鎖：
（ａ）第１の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み；
（ｂ）第２の重鎖のＣＨ３ドメインは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、を含む。
一実施形態では、本開示によって提供される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、多重特異性または二重特異性抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する相補的領域を含む二重特異性抗体である。本開示はまた、例えば、制限するものではないが、蛍光標識、造影剤、治療剤または細胞傷害性薬剤への抗体のコンジュゲートまたは融合分子も提供する。
本開示は、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質のうち１つまたはそれ以上と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子および本明細書において開示される融合タンパク質をコードする核酸分子ならびにこのような核酸分子を含むベクターを提供する。また、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において開示される融合タンパク質をコードするベクターを含む細胞も提供される。
実施形態では、本開示は、ＰＤ－１のＰＤ－１のリガンドへの結合を阻害する方法であって、それを必要とする対象に本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法を提供する。
実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において疾患を処置する方法であって、前記対象に、薬学的に許容される形態の、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてＴ細胞活性化を増大する方法であって、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫系を刺激する方法であって、前記対象に、薬学的に許容される形態の、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてウイルスの複製を低減する方法であって、対象に、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との相互作用を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法も提供する。本開示は、それを必要とする対象においてＰＤ－１によって媒介される免疫抑制を阻害する方法であって、対象に、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。
本開示は、それを必要とする対象においてＰＤ－１を発現する細胞または組織に対する免疫応答を刺激する方法であって、対象に、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１を発現する細胞または組織は、がん性細胞またはそれだけには限らないが、ウイルスまたは細菌を含む病原体に感染した細胞である。
一態様では、本開示は、がん、免疫障害または感染をそれを必要とする患者において処置する方法であって、（ａ）本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を用いて、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで処置すること、および（ｂ）処置された細胞を患者に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。
別の態様では、本開示は、対象において抗原に応じたＴ細胞活性化を増大する方法であって、対象に本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片もしくは融合タンパク質の有効量または本明細書において開示される医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は対象の免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう対象において状態を処置する方法であって、対象に本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質の有効量を投与することを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１の上方制御された発現を有する、または対象は、ＰＤ－Ｌ１の発現について陽性と同定されている。
一実施形態では、本開示は、チェックポイント阻害剤を用いる療法に応答しない（原発性耐性）対象を処置するために、および／またはチェックポイント阻害剤処置に最初に応答するが、後に、チェックポイント阻害剤遮断に対して耐性になる（続発的または獲得耐性）対象を処置するために、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を使用する方法を提供する。このような処置するための方法は、前記対象に本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤およびＣＴＬＡ－４阻害剤のうち１つまたはそれ以上を用いる療法に対する耐性を獲得した。
一実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与する方法であって、対象に追加の治療剤または療法を投与することをさらに含み、追加の治療剤または療法は、がんワクチン、チェックポイント阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチン、細胞毒、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）阻害剤、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、抗体－薬物コンジュゲート、抗炎症薬および栄養補助食品からなる群から選択される、方法を提供する。実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２阻害剤から選択されるチェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、方法を提供する。実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＰ、ポドプラニン、プロテインＣ受容体、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２６および／またはＣＤ１６０の阻害剤のうち１つまたはそれ以上を投与することをさらに含む、方法を提供する。実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与する方法であって、追加の治療剤または療法を投与することをさらに含み、追加の治療薬または療法は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質と同時にまたは継続的に投与される、方法を提供する。実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与する方法であって、対象に追加の治療剤または療法を投与することをさらに含み、追加の治療剤または療法は、別個に、または本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片もしくは融合タンパク質との混合物として投与される、方法を提供する。一実施形態では、本開示は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質を、化学療法、放射線療法または手術と組み合わせて投与する方法を提供する。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体の重および軽鎖可変ドメイン配列ならびにＣＤＲ配列を示す図である。ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに従う（ＡｂＭ／Ｃｈｏｔｈｉａに従うＣＤＲ配列は、下線が引かれたアミノ酸を除外する）。図１Ａは、ライブラリースクリーニングによって同定された６つの抗ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）抗体の重および軽鎖可変領域を提供する。図１Ｂは、２３Ｈ９のならびに軽鎖シャッフリングによって同定された２３Ｈ９バリアントの軽鎖およびＣＤＲ配列を提供し、軽鎖のライブラリーは、２３Ｈ９重鎖配列と対を形成していた。Ｘ１はＱまたはＥであり；Ｘ２はＨまたはＹであり；Ｘ３はＹまたはＮであり；Ｘ４はＴまたはＮであり；Ｘ５はＬ、ＱまたはＥであり；Ｘ６はＳ、ＡまたはＶであり；Ｘ７はＨ、Ｎ、ＴまたはＳであり；Ｘ８はＲまたはＬであり；Ｘ９はＧ、ＡまたはＨであり；Ｘ１０はＳまたはＴであり；Ｘ１１はＡ、ＴまたはＳであり；Ｘ１２はＨまたはＲである。図１Ｃは、２４Ｈ９のならびに軽鎖シャッフリングによって同定された２４Ｈ９バリアントの軽鎖およびＣＤＲ配列を提供し、軽鎖のライブラリーは、２４Ｈ９重鎖配列と対を形成していた。Ｘ１３はＡまたはＶであり；Ｘ１４はＳまたはＧであり；Ｘ１５はＱ、ＥまたはＲであり；Ｘ１６はＧ、Ｓ、ＤまたはＮであり；Ｘ１７はＧ、ＳまたはＮであり；Ｘ１８はＳ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、ＨまたはＶであり；Ｘ１９はＬまたはＶであり；Ｘ２０はＧまたはＡであり；Ｘ２１はＳ、Ｄ、ＥまたはＡであり；Ｘ２２はＳまたはＫであり；Ｘ２３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＤであり；Ｘ２４はＬまたはＶであり；Ｘ２５はＱ、ＥまたはＨであり；Ｘ２６はＳ、Ｎ、Ａ、Ｒ、ＰまたはＴであり；Ｘ２７はＡまたはＧであり；Ｘ２８はＮ、ＤまたはＹであり；Ｘ２９はＦまたはＬであり；Ｘ３０はＡまたはＴである。図１Ｄは、抗体Ｒ３Ａ９ならびに軽鎖シャッフリングによって同定されたＲ３Ａ９誘導体と交差反応するｈＰＤ－１／ｍＰＤ－１の配列を提供し、軽鎖のライブラリーは、Ｒ３Ａ９重鎖配列と対を形成していた。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図１－３の続き。 ＥＬＩＳＡによって決定されるような抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１の、ｈＰＤ－１－Ｆｃへの（図２Ａ、図２Ｂにおけるような表示）およびｈＰＤ－１－ｈｉｓへの（図２Ｂ）結合を例示する図である。 図３は、抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１の、ｈＰＤ－１とｈＰＤ－Ｌ１の間の相互作用をブロッキングする能力を表す図である。 抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１の、それぞれ、ｈＰＤ－１－２９３細胞への（図４Ａ）、ドナー「ＥＡ」（低ＰＤ－１発現）由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの（図４Ｂ）、およびドナー「ＡＦ」（高ＰＤ－１発現）由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの（図４Ｃ）結合を例示する図である。図４Ａ：ＥＣ５０ ２３Ａ８＞２３Ｈ９＞１９Ｂ１０。ＭＦＩ ２３Ａ８＞２３Ｈ９＞１９Ｂ１０。図４Ｂ：２３Ｈ９＞２４Ｈ９および２３Ａ８。図４Ｃ：２３Ｈ９＞２４Ｈ９および２３Ａ８。 抗体２３Ａ８および２３Ｈ９（図５Ａ）ならびに１９Ｂ６および２４Ｈ９（図５Ｂ）の、ＰＤ－１とｈＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロッキングする能力を例示する図である。 抗体２３Ｈ９、３１Ｂ１、３３Ｃ４、３３Ｇ８および３４Ｃ１の、ｈＰＤ－１－Ｆｃへの結合（図６Ａ、図６Ｂと同一の表示）、ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン－ｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合（図６Ｂ）、αｈｉｓによって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合（図６Ｃ、図６Ｄと同一の表示）、およびｈＰＤ－１－Ｆｃ／ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ相互作用のブロッキング（図６Ｄ）を表す図である。親抗体２３Ｈ９とその誘導体との間に有意差は観察されなかった（図６Ａおよび図６Ｂ）。すべての誘導体は、親抗体よりも低いＥＣ５０および高い阻害値を有していた（図６Ｃおよび図６Ｄ）。 図６－１の続き。 抗体２４Ｈ９、３２Ａ１１、３２Ｄ２、３２Ｄ１１、３８Ａ６、３８Ａ１０、３８Ａ１１、３８Ｂ２、３８Ｃ１１、３９Ｂ３、３９Ｂ１１、３９Ｇ８および３８Ｈ１１の、ｈＰＤ－１－Ｆｃへの結合（第１の、最左列）、ストレプトアビジンによって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合（第２の列）、αｈｉｓによって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合（第３の列）およびｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキング（第４の列）を表す図である。 抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、２３Ｈ９、３８Ａ６、２４Ｈ９および３８Ｂ２の、ｈＰＤ－１－２９３細胞への（図８Ａ、図８Ｂと同一の表示）およびｈＰＤ－１ジャーカット細胞への（図８Ｂ）ならびにドナーＦＡ（図８Ｃ、図８Ｄと同一の表示）およびドナーＦＢ（図８Ｄ）由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの結合を表す図である。図８Ａ．ｈＰＤ１－ＨＥＫ２９３のＭＦＩ：２４Ｈ９誘導体（３８Ｂ２および３８Ａ６＞２４Ｈ９）＞２３Ｈ９誘導体（３１Ｂ１および３３Ｃ４＞２３Ｈ９）。図８Ｂ．ｈＰ０１－ジャーカットのＭＦＩ：２３Ｈ９誘導体（３３Ｃ４＞３１Ｂ１＞２３Ｈ９）＞２４Ｈ９誘導体（３８Ｂ２＞３８Ａ６＞２４Ｈ９）。図８Ｃおよび図８Ｄ．２人のドナー由来のＳＥＢ活性化ヒトＰＢＭＣへの結合のＥＣ５０値：２３Ｈ９誘導体（３１Ｂ１は３３Ｃ４と同一）＜２４Ｈ９誘導体（３８Ａ６は３１Ｂ１と同一）。ＳＥＢ活性化ヒトＰＢＭＣへの結合のＭＦＩ：２３Ｈ９誘導体（３１Ｂ１は３３Ｃ４と同一）＞２４Ｈ９誘導体（３８Ａ６は３１Ｂ１と同一）。 図８－１の続き。 Ｐｒｏｍｅｇａ結合アッセイを使用した、抗体２３Ｈ９、３１Ｂ１、３３Ｃ４、２４Ｈ９、３８Ｂ２および３８Ａ６の、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする能力を例示する図である。図９Ａ．２３Ｈ９およびその誘導体３１Ｂ１ならびに３３Ｃ４のＥＣ５０：３１Ｂ１（０．１３９μｇ／ｍｌ）＞３３Ｃ４（０．１６５μｇ／ｍｌ）＞２３Ｈ９（０．５１１μｇ／ｍｌ）。最大誘導倍数（発光）：３１Ｂ１（６．４８）＞３３Ｃ４（６．２４）＞２３Ｈ９（５．５６）。図９Ｂ．２４Ｈ９およびその誘導体３８Ａ６ならびに３８Ｂ２のＥＣ５０：３８Ｂ２（０．８５５μｇ／ｍｌ）＞３８Ａ６（０．１６４μｇ／ｍｌ）＞２４Ｈ９（０．８５５μｇ／ｍｌ）。最大誘導倍数（発光）：３８Ｂ２（６．５４）＞３８Ａ６（５．６６）＞２４Ｈ９（４．９７）。 抗体２３Ｈ９、３１Ｂ１、２４Ｈ９および３８Ｂ２の存在下でのドナーＦＡ由来のＰＢＭＣのＩＬ－２蓄積（図１０Ａ）およびドナーＥＡ ＰＢＭＣのＩＬ－２蓄積（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）を表す図である。図１０Ａ．ドナーＦＡ由来のＰＢＭＣにおけるＩＬ－２蓄積：示された抗体の存在下で用量依存的に増大したＩＬ－２濃度。図１０Ｂ．２３Ｈ９および３１Ｂ１：ＥＣ５０は、それぞれ、０．３４４および０．１０７ｎＭであり；１０ｎＭ抗体濃度でのＩＬ－２濃度は、それぞれ、３．９および５．８１μｇ／ｍｌであった。図１０Ｃ．２４Ｈ９および３８Ｂ２：ＥＣ５０は、それぞれ、＞１０ｎＭおよび０．０１９ｎＭであった；１０ｎＭ抗体濃度でのＩＬ－２濃度は、それぞれ、４．５および５．０μｇ／ｍｌであった。 図１０－１の続き。 示差走査熱量計（ＤＳＣ）によって決定された抗体７８０＿３８（３１Ｂ１）、７８０＿３９（３３Ｃ４）、７８０＿４６（３８Ａ６）および７８０＿５４（３８Ｂ２）の熱安定性測定値を例示する図である。 抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ｂ２および３８Ａ６のｈＰＤ－１ＦＣへの（図１２Ａ）、ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン標識ｈＰＤ－１ｈｉｓへの（図１２Ｂ、図１２Ａにおいてと同じ表示）および抗ｈｉｓ抗体によって捕捉されたｈＰＤ－１ｈｉｓへの結合（図１２Ｃ、図１２Ａにおいてと同じ表示）ならびにｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ１（図１２Ｄ）およびｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ２相互作用のブロッキング（図１２Ｅ）を表す図である。 図１２－１の続き。 図１２－２の続き。 抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６および３８Ｂ２の、ｈＰＤ－１－２９３細胞への（図１３Ａ）、ｈＰＤ－１－Ｊｕｒｋａｔ細胞への（図１３Ｂ）、ドナーＦＡ由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの（図１３Ｃ）およびドナーＦＢ由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの（図１３Ｄ）用量反応結合を表す図である。図１３Ａ．示されるすべての抗体誘導体は、同様のＥＣ５０値を有するが、２４Ｈ９誘導体３８Ａ６および３８Ｂ２は、より高い最大結合シグナルを示す。図１３Ｂにおいてと同一の表示。図１３Ｂ．２３Ｈ９誘導体３１Ｂ１および３３Ｃ４は、２４Ｈ９誘導体３８Ａ６および３８Ｂ２と比較してより低いＥＣ５０値およびより高い最大結合シグナルを有する。図１３Ｃ．図１３Ｄにおいてと同一の表示。図１３Ｃおよび図１３Ｄ．２３Ｈ９誘導体３１Ｂ１および３３Ｃ４は、２人の異なるドナーに由来するＰＢＭＣを使用して決定されたように、２４Ｈ９誘導体３８Ａ６および３８Ｂ２と比較してより高い最大結合シグナルおよびより低いＥＣ５０値を示す。 図１３－１の続き。 ＳＰＲによって決定されるような、抗体３８Ｂ２、３８Ａ６、３３Ｃ４および３１Ｂ１のｈＰＤ－１－ｈｉｓへの（図１４Ａ）ならびにｈＰＤ－１－Ｆｃへの（図１４Ｂ）結合について得られたＫＤ値を表す図である。 抗体３１Ｂ１および３８Ｂ２の、細胞間ｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする能力を例示する図である。３１Ｂ１および３８Ｂ２の２つの実験から平均されたＥＣ５０値は、それぞれ０．１６８および０．１５４μｇ／ｍｌであった。発光の誘導倍数もまた、２つの実験から平均された。３１Ｂ１と３８Ｂ２との間に有意差は観察されなかった。３１Ｂ１と３８Ｂ２との両方とも対照Ｂ（商品名オプジーボで販売される、ニボルマブ）より優れており、対照Ｍ（商品名キイトルーダで販売される、ペムブロリズマブ）と同様であった。図１５Ａ．実験１。図１５Ｂ．実験２。 抗ＰＤ－１抗体３１Ｂ１および３８Ｂ２の、ドナーＥＡ（図１６Ａ）およびドナーＦＡ（図１６Ｂ）に由来するＳＥＢ活性化ＰＢＭＣにおけるＩＬ－２サイトカイン産生に対する効果を例示する図である。サイトカインＩＬ－２分泌は、ドナーＥＡおよびＦＡに由来するＳＥＢ活性化ヒトＰＢＭＣ細胞において調べた。３８Ｂ２、３１Ｂ１、ｃｔＭおよびｃｔＢのＥＣ５０値は、０．１０１、０．２９７、０．２１０および０．５４８ｎＭ（ドナーＥＡ由来のＰＢＭＣ）であった。３８Ｂ２、３１Ｂ１、ｃｔＭまたはｃｔＢによって処置された細胞による最大ＩＬ－２分泌は、それぞれ、８．０５、７．７３、７．２１および６．７９ｎｇ／ｍｌであった。３８Ｂ２は、３１Ｂ１および２つの対照抗体よりも強力であった；３１Ｂ１は対照Ｂよりもより強力であり、対照Ｍと同等であった。 ＥＬＩＳＡによって決定されるような、抗体ｍ３Ａ７およびＲ３Ａ９の、可溶性ｍＰＤ－１－Ｆｃへの（図１７Ａ）、可溶性のストレプトアビジンによって捕捉されたｍＰＤ－１－Ｆｃへの（図１７Ｂ）、可溶性のストレプトアビジンによって捕捉されたｍＰＤ－１－ｈｉｓへの（図１７Ｃ）、ｍＰＤ－１を発現する細胞への（図１７Ｃ）用量依存性結合ならびに抗体ｍ３Ａ７およびＲ３Ａ９によるＰＤ－Ｌ１へのｍＰＤ－１のブロッキング（図１７Ｅ）ならびにＰｒｏｍｅｇａアッセイによって決定されるような細胞間ｍＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断（図１７Ｆ）を表す図である。 図１７－１の続き。 図１７－２の続き。 ＥＬＩＳＡによって決定されるような、抗体３８Ｂ２、ｍ２Ｃ１、ｍ２Ａ１、ｍ４Ｄ１、ｍ３Ａ７およびＲ３Ａ９の、ｈＰＤ－１への（図１８Ａ、図１８Ｂにおけるような表示）、ｍＰＤ－１への（図１８Ｂ）およびストレプトアビジンによって捕捉されたビオチンｍＰＤ－１への（図１８Ｃ、図１８Ｂにおけるような表示）結合ならびにＥＬＩＳＡによって決定されるような、抗体３８Ｂ２、ｍ２Ｃ１、ｍ２Ａ１、ｍ４Ｄ１、ｍ３Ａ７およびＲ３Ａ９によるｍＰＤ－１－ｍＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキング（図１８Ｄ、図１８Ｅにおけるような表示）およびｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキング（図１８Ｅ）を例示する図である。 図１８－１の続き。 図１８－２の続き。 抗体ｍ２Ａ１、ｍ２Ｃ１、ｍ４Ｄ１、Ｒ３Ａ９、ｍ３Ａ７および３８Ｂ２の、ｈＰＤ－１またはｍＰＤ－１を発現する細胞への結合を表す図である。ヒトＰＤ－１を発現する細胞：ｈＰＤ－２９３（図１９Ａ、図１９Ｄにおけるような表示）およびｈＰＤ－１ジャーカット（図１９Ｂ、図１９Ｄにおけるような表示）。マウスＰＤ－１を発現する細胞：図１９Ｃ（図１９Ｄにおけるような表示）および図１９Ｄ。 図１９－１の続き。 ｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングならびに抗体３８Ｂ２、ｍ４Ｄ１およびｍ２Ｃ１によるｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングを表す図である。図２０Ａ．遮断：ｍ４Ｄ１は、ｍＰＤ１－ｍＰＤＬ １相互作用のブロッキングにおいてｍ３Ａ７と同程度に強力であった。ＩＣ５０ ｍ４Ｄ１＝０．５７２４ｎＭ。ＩＣ５０ ｍ３Ａ７＝０．５６１５ｎＭ。ＩＣ５０ ｍ２Ｃ１＝１．１２７ｎＭ。図２０Ｂ．ｍ４Ｄ１は、ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ １相互作用をブロックするが、３８Ｂ２と同程度に強力ではなかった。ＩＣ５０ ３８Ｂ２＝０．７２４８ｎＭ。ＩＣ５０ ｍ４Ｄ１＝２．１２５ｎＭ。ＩＣ５０ ｍ２Ｃ１＝３１．２５ｎＭ。 例示的ＰＤ－１／ＩＬ－１５融合タンパク質の模式図を表す図である。 例示的ＰＤ－１／ＩＬ－１５融合タンパク質の模式図を表す図である。 融合タンパク質１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５の、ｍＰＤ－１への（図２２Ａ）およびｍＰＤ－１を発現する細胞への（図２２Ｂ）結合ならびに競合ＥＬＩＳＡ（図２２Ｃ）またはＰｒｏｍｅｇａブロッキングアッセイ（図２２Ｄ）を使用するｍＰＤ－１へのｍＰＤ－Ｌ１のブロッキングを表す図である。 図２２－１の続き。 、融合タンパク質１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および２Ｃ－３Ａ７／ＩＬ－１５の、ＣＴＬＬ２（図２３Ａ）およびＣ５７ＢＬ６（図２３Ｂ）の増殖に対する効果を表す図である。図２３Ｃ．総脾臓細胞中のＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞集団。融合タンパク質１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５を対照として使用した。 図２３－１の続き。 抗ＰＤ－Ｌ１／ＳＤ１５ 融合タンパク質の、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１耐性ルイス肺モデル（ＬＬ２）における、ＰＤ－１発現腫瘍を有するマウスの腫瘍成長を低減する能力を表す図である。 Ｃ末端融合物と比較して、Ｎ末端融合タンパク質は、末梢Ｔ細胞と比較してリンパ球に浸潤する腫瘍（ＴＩＬ）に対して作用するのに特に有用であることを例示する図である。これは、Ｎ末端融合構築物によって可能となるｃｉｓ提示による。 Ｃ末端融合物と比較して、Ｎ末端融合タンパク質は、末梢Ｔ細胞と比較してリンパ球に浸潤する腫瘍（ＴＩＬ）に対して作用するのに特に有用であることを例示する図である。これは、Ｎ末端融合構築物によって可能となるｃｉｓ提示による。 ｈＰＤ－１融合タンパク質（図２６Ａおよび図２６Ｂ）および突然変異ｈＰＤ－１融合タンパク質（（３８Ｂ２）／Ｎ６５Ｄ／Ｓ／Ａ突然変異ＩＬ－１５を含む）（図２６Ｃ）に対する、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用（図２６Ａおよび図２６Ｃ）およびＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２相互作用（図２６Ｂ）のブロッキングを例示する図である。 図２６－１の続き。 示された抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質によるＭ０７ｅ細胞の増殖の刺激を例示する図である。 図２７－１の続き。 図２８は、腫瘍サイズに対する異なる抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５／リンカー／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン融合タンパク質の影響を例示する図である。ＣＴ２６同系モデルを使用した。単回用量、ＩＶ。抗ＰＤ－Ｌ１抗体：Ｄ７Ａ８。 １Ｎ－融合タンパク質におけるＩＬ－１５中のＮ６５Ｓ突然変異の存在は、融合物の、ＰＤ－１に結合する能力およびＰＤ－１相互作用を撹乱する能力に影響を及ぼさないことを例示する図である。図２９Ａ．１Ｎ－融合タンパク質の、可溶性ｈＰＤ－１－Ｆｃへの結合。図２９Ｂ．ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１結合を測定するためのＥＬＩＳＡ競合アッセイ。図２９Ｃ．ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ２結合を測定するためのＥＬＩＳＡ競合アッセイ。図２９Ｄ．ｈＰＤ－１がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への１Ｎ－融合タンパク質の結合。図２９Ｅ．ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を決定するためのＰｒｏｍｅｇａ遮断アッセイ。図２９Ｆ．ＰＤ－Ｌ２のＰＤ－１への結合を決定するためのＰｒｏｍｅｇａ遮断アッセイ。抗体ＤＰ４７（非標的化対照抗体）を含む融合タンパク質が対照として働いた。ｍｕｔ＝Ｎ６５Ｓ。 図２９－１の続き。 図２９－２の続き。 １Ｎ－融合タンパク質におけるＩＬ－１５中のＮ６５Ｓ突然変異の存在は、ヒト細胞の増殖における融合タンパク質の有意な効力の低下につながることを例示する。図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、抗ＰＤ－１（３８Ｂ２）／Ｎ６５Ｄ／Ｓ／Ａ突然変異ＩＬ－１５融合によるＭ０７ｅ細胞の増殖の刺激を示す。非標的化対照抗体を含む融合タンパク質が対照として働いた（図３０Ｂ）。図３０Ｄは、示された融合タンパク質を用いる刺激の際にｈＰＢＭＣの増殖を示す。図３０Ｅは、示された融合タンパク質の、ｈＩＬ２ＲβがトランスフェクトされたＨＥＫ３０細胞への結合を示す。 図３０－１の続き。 図３０－２の続き。 １Ｎ－融合タンパク質におけるＩＬ－１５中のＮ６５Ｓ突然変異の存在が、マウス細胞の増殖における融合タンパク質の有意な効力の低下およびＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖における用量反応の増大につながることを例示する図である。図３１Ａおよび３１Ｂは、示された融合タンパク質を用いる刺激の際のマウスＣＴＬＬ２細胞（図３１Ａ）およびマウスＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞（図３１Ｂ）の増殖を示す。図３１Ｃおよび３１Ｄは、示された融合タンパク質を用いる刺激の際のマウスＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞（図３１Ｃ）およびｈＰＢＭＣ（図３１Ｄ）におけるＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞集団を示す。 図３１－１の続き。 図３１－２の続き。 ＩＬ－１５突然変異を含む１Ｎ－融合タンパク質が抗ＰＤ－１抗体耐性マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示したことを例示する図である。図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｆ、図３２Ｇ、図３２Ｉおよび図３２Ｋ．キイトルーダまたは示された１Ｎ－融合タンパク質を用いる処置後の腫瘍体積。ｍｕｔ＝Ｎ６５Ｓ突然変異。ｃｔ＝ＤＰ４７＝非標的化対照抗体。キイトルーダ＝ペムブロリズマブ（以前はランブロリズマブ、商品名キイトルーダ）。図３２Ｃ．各マウスの腫瘍成長（Ｎ６５Ｓ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５、１２ｍｇ／ｋｇ処置）。図３２Ｄ、図３２Ｈおよび図３２Ｊ．体重の変化％。図３２Ｅ．種々の用量レベルでのマウス生存。図３２Ａ、図３２Ｂ、図３２Ｃ、図３２Ｄ、図３２Ｅ、図３２Ｆ、図３２Ｇ、図３２Ｈ、図３２Ｉ：投薬は、１Ｎ－融合タンパク質についてはＱＷ＝週に１回腹膜内に、３週間とし、対照についてはＢＩＷ＝週に２回腹膜内に、３週間とした。図３２Ｊおよび図３２Ｋ：投薬はＢＩＷ＝週に２回腹膜内に３週間とした。 図３２－１の続き。 図３２－２の続き。 図３２－３の続き。 図３２－４の続き。 図３２－５の続き。 Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５およびＮ６５Ｄ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質が、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するマウスにおける再負荷を防ぐことを示す図である。 ＩＬ－１５突然変異を含む１Ｎ－融合タンパク質が、非標的化融合タンパク質および抗ＰＤ－１抗体の組合せと比較して、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ１／ＰＤＬ１マウスにおける改善された抗腫瘍活性示したことを示す図である。図３４Ａ．示されたタンパク質を用いる処置後の腫瘍体積。 ＩＬ－１５突然変異を含む１Ｎ－融合タンパク質が、非標的化融合タンパク質および抗ＰＤ－１抗体の組合せと比較して、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ１／ＰＤＬ１マウスにおける改善された抗腫瘍活性示したことを示す図である。図３４Ｂ．示されたタンパク質を用いる処置後のマウス生存。 ＩＬ－１５突然変異を含む１Ｎ－融合タンパク質が、非標的化融合タンパク質および抗ＰＤ－１抗体の組合せと比較して、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ１／ＰＤＬ１マウスにおける改善された抗腫瘍活性示したことを示す図である。図３４Ｃ．示されたタンパク質を用いる処置後の体重の変化％。 抗ＰＤ－１抗体の追加の投与は、１Ｎ－融合タンパク質の抗腫瘍活性のさらなる増大につながらないことを示す図である。図３５Ａ．示されたタンパク質を用いる処置後の腫瘍体積。 抗ＰＤ－１抗体の追加の投与は、１Ｎ－融合タンパク質の抗腫瘍活性のさらなる増大につながらないことを示す図である。図３５Ｂ．示されたタンパク質を用いる処置後のマウス生存。 抗ＰＤ－１抗体の追加の投与は、１Ｎ－融合タンパク質の抗腫瘍活性のさらなる増大につながらないことを示す図である。図３５Ｃ．示されたタンパク質を用いる処置後の体重の変化％。 Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５が処置後最大１２０時間の用量反応でＩＶ（図３６Ａ）およびＩＰ（図３６Ｂ）注射の両方において抗体３８Ｂ２と同様の血清半減期プロファイルを示したことを例示する図である。 Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５が処置後最大１２０時間の用量反応でＩＶ（図３６Ａ）およびＩＰ（図３６Ｂ）注射の両方において抗体３８Ｂ２と同様の血清半減期プロファイルを示したことを例示する図である。 ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤＬ１／ＰＤ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける作用機序研究の結果を例示する図である。図３７Ａ．０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６細胞をｈＰＤ１／ＰＤＬ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスの右下側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約１７５ｍｍ３に到達した時点で、（１）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５（それぞれ、０．０６μｍｏｌ／ｋｇおよび０．０３５μｍｏｌ／ｋｇ）、（２）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５（非標的化対照、０．０３５μｍｏｌ／ｋｇ）、（３）抗体３８Ｂ２（０．０３５μｍｏｌ／ｋｇ）ならびに（４）抗体３８Ｂ２（０．０３５μｍｏｌ／ｋｇ）およびＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５（０．０３５μｍｏｌ／ｋｇ）の組合せを用いてマウスに静脈内注射した。 ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤＬ１／ＰＤ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける作用機序研究の結果を例示する図である。図３７Ｂ．すべての群から血液および流入領域リンパ節（ＤＬＮ）を収集して、フローサイトメトリーを実施した。腫瘍を収集して、ＴＩＬ分析を実施した。 ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤＬ１／ＰＤ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける作用機序研究の結果を例示する図である。図３７Ｃ．腫瘍、血液および流入領域リンパ節におけるＣＤ８／ＣＤ４比（抗体（１）３８Ｂ２、（２）ＰＤ１に標的化される融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５、（３）非標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５または（４）３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せを用いて処置した）。 ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤＬ１／ＰＤ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける作用機序研究の結果を例示する図である。図３７Ｄ．腫瘍におけるＣＤ８およびＣＤ４サブタイプの分析（抗体（１）３８Ｂ２、（２）ＰＤ１に標的化される融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５、（３）非標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５または（４）３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せを用いて処置した）。 Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５（代替物）融合タンパク質が多数のマウス同系腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を示したことを例示する図である。例示的例として示されるようなＥＭＴ６のデータ。
本開示は、ＩＬ－１５ポリペプチドに連結された抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供し、ＩＬ－１５ポリペプチドは、次いでＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ポリペプチドに連結される。さらに、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片ならびにこのような抗ＰＤ－１抗体およびそのＰＤ－１結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原断片を含む融合タンパク質
一態様では、本開示は、ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質の部分は、図１に提供される、またはそうではなく本明細書において記載される対応する重および軽鎖可変領域またはＣＤＲを含むものを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する任意の抗体または抗体断片であり得る。
刺激性ドメインを含む融合タンパク質が、本明細書において開示される。本明細書において使用される場合、「刺激性ドメイン」とは、免疫応答を促進するドメインである。刺激性ドメインは、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞活性および／または増殖を誘導することによって媒介される免疫応答を刺激し得る。実施形態では、刺激性ドメインは、制限するものではないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のようなインターロイキンまたはインターフェロンに対して応答する細胞を刺激する。一実施形態では、刺激性ドメインは、制限するものではないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１のようなインターロイキンまたはインターフェロンに対して応答性である受容体に結合し、刺激する。刺激性ドメインはまた、互いに共有結合によって連結している２つまたはそれより多いリガンドのヘテロ複合体であるハイブリッドドメインであり得る。
実施形態では、刺激性ドメインは、ＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）のＩＬ－１５刺激を促進する配列またはドメインを含む。
一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒ刺激を促進する刺激性ドメインは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５誘導体を含む。
一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒ刺激を促進する刺激性ドメインは、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチドを含む。一実施形態では、刺激性ドメインは、ＩＬ－１５Ｒα鎖のｓｕｓｈｉドメインを含む。
一実施形態では、刺激性ドメインは、ＩＬ－１５またはその誘導体を含み、その結合は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの存在によって増強される。一実施形態では、刺激性ドメインは、ＩＬ－１５またはその誘導体およびＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒα ポリペプチドの複合体を含む。一部の実施形態では、刺激性ドメインは、ＩＬ－１５またはその誘導体およびＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチドを含み、２つのポリペプチドは、リンカー（それだけには限らないが、配列番号２１５を含むリンカーを含む）によって共有結合によって連結される。
一実施形態では、ＩＬ－１５またはその誘導体は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５ＲαポリペプチドのＮ末端に位置する。一実施形態では、ＩＬ－１５またはその誘導体は、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５ＲαポリペプチドのＣ末端に位置する。一実施形態では、刺激性ドメインは、配列番号１７７～１８０のいずれか１つによって強調されるＳＤ１５ドメインの配列を含む。
本明細書において実証されるように、（１）ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックし、免疫抑制を阻害するＰＤ－１結合ドメインおよび（２）免疫応答を促進する刺激性ドメインを含む融合タンパク質が、本明細書において提供され、融合タンパク質は、前述の機能を別々に提供する２つの別個の分子と比較して、免疫細胞活性の増大を提供する。具体的には、本明細書において開示される実験は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするＰＤ－１結合ドメインおよび刺激性ドメインＩＬ－１５またはその誘導体ならびにＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチドの両方を含有する融合タンパク質が、別々の分子中のドメインを提供することと比較して、増殖の増加、Ｔｈ１サイトカイン放出ならびにＮＫおよびＴ細胞の死滅活性関連分子を促進したことを実証する。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、可動性リンカーを介して本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に共有結合によって連結している本明細書において開示される刺激性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書において開示される刺激性ドメインが、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片に直接的に融合される融合タンパク質が、本明細書において提供される。
本明細書において使用される場合、「共有結合によって連結された」または「融合された」とは、共有結合による２つ以上のポリペプチドの会合を指す。一部の実施形態では、共有結合によって連結している２つのポリペプチドは、互いに直接的に、すなわち、第１のおよび第２のペプチド間に任意の追加のポリペプチド配列を伴わずに融合している。したがって、一部の実施形態では、第１のポリペプチドのＮ末端は、第２のポリペプチドのＣ末端に直接的に融合される、または逆の同様である。他の実施形態では、共有結合によって連結している２つのポリペプチドは、連続するポリペプチド鎖の一部であるが、互いに直接的に融合していない（すなわち、２つのポリペプチドは、１個またはそれ以上のアミノ酸、リンカーまたは別のポリペプチドによって分けられている場合がある）。「共有結合によって連結された」という用語は、互いに融合している２つ以上のポリペプチドの特定の配向を暗示しない。
ＩＬ－１５は、１４～１５ＫＤのサイトカインであり、ＩＬ－２と構造的な類似性を有する。ＩＬ－１５はまた、ＭＧＣ９７２１としても知られている。さまざまな細胞種は、ＩＬ－１５ ｍＲＮＡを構成的に産生し、これらには、単球、マクロファージ、ＤＣ、ケラノサイト、上皮皮膚細胞、線維芽細胞、種々の上皮細胞、骨髄間質細胞および神経細胞が含まれる。さらに、ＩＬ－１５ ｍＲＮＡはまた、腎臓、胎盤、肺、心臓、骨格筋および脳組織において産生される。しかし、単球、ＤＣ、上皮細胞、骨髄間質細胞、線維芽細胞および極めて少ない他の細胞および組織のみが、検出可能なレベルのＩＬ－１５を分泌する。ＩＬ－１５およびＩＬ－２は、同一ヘマトポエチンサブユニットに結合し、多数の生物学的活性を共有するとわかっている。ＩＬ－１５は、ＴおよびＮＫ細胞活性化ならびに増殖を調節し、ＣＤ８＋記憶細胞数は、ＩＬ－１５とＩＬ－２との間のバランスによって影響を受ける。実施形態では、本明細書において開示されるＩＬ－１５またはＩＬ－１５誘導体は、ヒトＩＬ－１５の活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を有する。ＩＬ－１５は、哺乳動物ＩＬ－１５、好ましくは、霊長類ＩＬ－１５、およびより好ましくは、ヒトＩＬ－１５であり得る。ヒトＩＬ－１５（受託番号ＮＰ＿０００５７６）アミノ酸配列は、配列番号２１２として提供されている。
「ＩＬ－１５誘導体」という用語は、配列番号２１２、ヒトＩＬ－１５の成熟形態と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。このような誘導体を作製する技術は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５誘導体配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５の１、４、８、３０、４５、６１、６４、６５および／または１０８位に位置する（残基番号は、ＩＬ－１５タンパク質の成熟形態を指している）。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５の４５、６５および／または１０８位に位置する。一部の実施形態では、ＩＬ－１５中のアミノ酸置換は、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｌ４５Ａ、Ｎ６５Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｋおよび／またはＱ１０８Ｓ／Ｅである。一部の実施形態では、ＩＬ－１５中のアミノ酸置換は、Ｌ４５Ａ、Ｎ６５Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｋおよび／またはＱ１０８Ｓである。実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｎ６５Ｓ、Ｎ６５ＡまたはＮ６５Ｄのうち１つを含むＩＬ－１５ポリペプチドを含む。実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｌ４５Ａ、Ｎ６５Ｓ、Ｎ６５ＡまたはＮ６５ＤおよびＱ１０８Ｓのうち１つまたはそれ以上を含むＩＬ－１５ポリペプチドを含む。
ヒトＩＬ－１５Ｒαアイソフォーム１前駆体（受託番号ＮＰ＿００２１８０）のアミノ酸配列は、配列番号２１３で提供されている。ＩＬ－１５受容体、すなわち、ＩＬ－１５受容体複合体は、ＩＬ－１５に高親和性で特異的に結合し、独特のインターロイキン１５受容体αサブユニット、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβおよび共通のγ鎖／ＩＬ－２Ｒγサブユニットからなる。ＩＬ－１５Ｒαは、マイトジェン活性化マクロファージ、ＮＫ細胞ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現される。ヒトＩＬ－１５Ｒαは、７つのエクソンからなり、選択的ｍＲＮＡスプライシングは、異なる細胞外または細胞内ドメインを有する８つの分子的ＩＬ－１５Ｒαアイソフォームをもたらす可能性がある。全長アイソフォームは、保存されたタンパク質結合モチーフ（ｓｕｓｈｉドメイン）、膜貫通ドメインおよび細胞内テールを含有する細胞外部分からなる。
本明細書において使用される場合、ＩＬ－１５Ｒαの「ｓｕｓｈｉドメイン」という用語は、ＩＬ－１５Ｒαのシグナルペプチドの後の第１のシステイン残基（Ｃ１）で始まり、前記シグナルペプチドの後の第４のシステイン残基（Ｃ４）で終わるドメインを指す。ＩＬ－１５Ｒαの細胞外領域の部分に対応するｓｕｓｈｉドメインは、ＩＬ－１５への結合に関与する。本開示におけるｓｕｓｈｉドメインは、ヒトＩＬ－１５Ｒα鎖のｓｕｓｈｉドメインの活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を有する。
ヒトＩＬ－１５Ｒαアイソフォーム１前駆体のアミノ酸配列は、配列番号２１３で提供される（この配列は、シグナル配列を含む）。ヒトＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインアミノ酸配列は、配列番号２１４で提供される。
「ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン誘導体」または「ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインバリアント」という用語は、ヒトＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインの配列（配列番号２１４）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドを指す。このような誘導体またはバリアントを作製する技術は、当技術分野で公知である。すべてのこのような誘導体は、ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメインの４個のシステイン残基を含む。一部のこのような誘導体では、ポリペプチド半減期を変更するために、天然に存在するアミノ酸が、化学改変アミノ酸によって置き換えられる場合がある。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン誘導体配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－１５Ｒαの６０位に位置する（ＩＬ－１５Ｒα残基の番号付けは、シグナルペプチドを含む、例えば、配列番号２１３を参照されたい）。一部の実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン中のアミノ酸置換はＮ６０Ａである（すなわち、アミノ酸６０のアスパラギン（Ｎ）が、アラニン（Ａ）と置換される）。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαに高親和性で結合し、これは、次いで、同一標的細胞によって発現されるＩＬ－１５Ｒβ／γｃ複合体と会合する（ｃｉｓ提示）。ＩＬ－１５Ｒαはまた、ＩＬ－１５をＩＬ－１５Ｒβ／γ（ｃ）複合体を発現する異なる標的細胞に高親和性でｔｒａｎｓ提示すると知られている（ｔｒａｎｓ提示）。ＩＬ－１５ｃｉｓ－およびｔｒａｎｓ提示機序は、受容体活性化およびシグナル伝達の異なる動力学につながり、ｃｉｓ提示は、迅速な一過性の応答を誘導し、ｔｒａｎｓ提示は、より遅い、より持続性のものを誘導する。
一部の実施形態では、本明細書において開示される融合タンパク質は、リンカー（それだけには限らないが、配列番号２１５のリンカーを含む）によってＩＬ－１５に付着しているＩＬ－１５Ｒα鎖のｓｕｓｈｉドメインを含むハイブリッドドメインを含む刺激性ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において開示される刺激性ドメインは、第２のリンカー（それだけには限らないが、配列番号２１６のリンカーを含む）を介して本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に共有結合によって連結される。他の実施形態では、本明細書において例示される刺激性ドメインは、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片に直接的に融合される。
一実施形態では、刺激性ドメインが、直接的にまたはリンカーを介して（例えば、１つまたはそれ以上のペプチドを介して）、融合タンパク質の抗ＰＤ１結合部分のＮ末端（例えば、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体の重鎖のＮ末端）に連結される「Ｎ末端融合タンパク質」が提供される。
Ｎ末端融合タンパク質には、それだけには限らないが、以下の（例示的）融合タンパク質が含まれる（ＮからＣ末端に列挙される構成成分、「－」は、直接共有結合連結またはリンカーを介した（例えば、１つまたはそれ以上のペプチドを介した）連結を示した：
（１）（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）
（２）（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）
（３）（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）
（４）（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒα ポリペプチド）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）
（５）（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）－（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）
（６）（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）－（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）
Ｎ末端融合タンパク質は、１つより多い刺激性ドメインを含み得る。
一実施形態では、刺激性ドメインが、抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片の１つ（および１つのみ）のＮ末端に共有結合によって連結される、融合タンパク質が提供される。単一の刺激性ドメインを含むＮ末端融合タンパク質は、「１－Ｎ末端融合タンパク質」と呼ばれる。
（１）刺激性ドメイン（２）刺激性ドメインが第１の重鎖のＮ末端に共有結合によって連結される、抗ＰＤ－１抗体の第１の重鎖またはその抗原結合断片、および（３）第２の重鎖が刺激性ドメインに連結されない、抗ＰＤ－１抗体の第２の重鎖またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、刺激性ドメインは、（ｉ）ＩＬ－１５もしくはその誘導体、または（ｉｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインもしくはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド、または（ｉｉｉ）両方を含む。
一実施形態では、刺激性ドメインが抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片の両方のＮ末端に共有結合によって連結される融合タンパク質が提供される。２つの刺激的ドメインを含み、両方とも異なる抗体鎖に連結されたＮ末端融合タンパク質は、「２－Ｎ末端融合タンパク質」と呼ばれる。
一実施形態では、刺激性ドメインが、直接的にまたはリンカーを介して（例えば、１つまたはそれ以上のペプチドを介して）融合タンパク質の抗ＰＤ１結合部分のＣ末端（例えば、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体の重鎖のＣ末端）に連結される「Ｃ末端融合タンパク質」が提供される。
Ｃ末端融合タンパク質には、それだけには限らないが、以下の（例示的）融合タンパク質が含まれる（ＮからＣ末端に列挙される構成成分、「－」は、直接共有結合連結またはリンカーを介した（例えば、１つまたはそれ以上のペプチドを介した）連結を示した：
（１）（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）
（２）（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）
（３）（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）
（４）（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）
（５）（抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）
（６）（抗ＰＤ－１抗体の軽鎖またはその抗原結合断片）－（ＩＬ－１５またはその誘導体）－（ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインまたはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド）
Ｃ末端融合タンパク質は、１つより多い刺激性ドメインを含み得る。
一実施形態では、刺激性ドメインが、抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片の１つ（および１つのみ）のＣ末端に共有結合によって連結される融合タンパク質が提供される。単一刺激性ドメインを含むＣ末端融合タンパク質は、「１－Ｃ末端融合タンパク質」と呼ばれる。
（１）刺激性ドメイン、（２）刺激性ドメインが第１の重鎖のＣ末端に共有結合によって連結される、抗ＰＤ－１抗体の第１の重鎖またはその抗原結合断片、および（３）第２の重鎖が刺激性ドメインに連結されない、抗ＰＤ－１抗体の第２の重鎖またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、刺激性ドメインは、（ｉ）ＩＬ－１５もしくはその誘導体、または（ｉｉ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインもしくはその誘導体を含むＩＬ－１５Ｒαポリペプチド、または（ｉｉｉ）両方を含む。
一実施形態では、刺激性ドメインが抗ＰＤ－１抗体の重鎖またはその抗原結合断片の両方のＣ末端に共有結合によって連結される融合タンパク質が提供される。２つの刺激的ドメインを含み、両方とも異なる抗体鎖に連結されたＣ末端融合タンパク質は、「２－Ｃ末端融合タンパク質」と呼ばれる。
図２１は、本明細書において記載されるような例示的融合タンパク質の模式図を表す。
ＩＬ－２の治療レベルは、ＩＬ－２受容体への結合の際の高レベルの毒性と関連している。同様に、治療レベルのＩＬ－１５を使用することもまた、ＩＬ－１５がＩＬ－２と２つの受容体サブユニットを共有するために毒性を引き起こす場合がある。しかし、ｃｉｓ位置で提示された場合に、Ｎ末端ＩＬ－１５融合タンパク質は、末梢Ｔ細胞へのより低い結合を示しながら腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に選択的に結合できるので、Ｎ末端融合タンパク質は、Ｃ末端融合タンパク質と比較して低減された毒性を実証する。ｃｉｓ位置で提示されると、Ｎ末端融合タンパク質は、ＩＬ－１５Ｒβ／γ結合を低減しながらＩＬ－１５ＲβγおよびＰＤ－１と同時に結合することができ、Ｎ末端融合タンパク質がＴＩＬに選択的に結合し、ＴＩＬ増殖を促進することを可能にする。対照的に、Ｃ末端融合タンパク質は、末梢Ｔ細胞およびＴＩＬの両方に同等に結合する場合があり、Ｎ末端融合タンパク質よりも高い毒性を示す場合がある（図２５）。１Ｎ末端融合タンパク質は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体に共有結合によって連結された２つの刺激性ドメインを含むＮ末端融合タンパク質（２Ｎ末端融合タンパク質）と比較して低減した毒性を示す。突然変異したＮ末端融合タンパク質は、末梢Ｔ細胞への一層低い結合のために毒性のさらなる低減を示す。
一態様では、本開示は、以下：
（ｉ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、抗体重鎖が、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む定常領域を含む、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列または配列番号２１２に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むインターロイキン１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列または配列番号２１４に対して少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；および
（ｉｖ）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドとＩＬ－１５ポリペプチドとをつなげる第１のリンカーポリペプチド
を含む融合タンパク質に関する。
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質の部分は、図１に提供される、またはそうではなく本明細書において記載される対応する可変領域またはＣＤＲを含むものを含む、ＰＤ－１に特異的に結合する任意のものであり得る。実施形態では、融合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＩＸ１７Ｘ１８ＷＸ１９Ｘ２０（配列番号１３５）を含み；
Ｘ１３はＡまたはＶであり；
Ｘ１４はＳまたはＧであり；
Ｘ１５はＱ、ＥまたはＲであり；
Ｘ１６はＧ、Ｓ、ＤまたはＮであり；
Ｘ１７はＧ、ＳまたはＮであり；
Ｘ１８はＳ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、ＨまたはＶであり；
Ｘ１９はＬまたはＶであり；
Ｘ２０はＧまたはＡであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ２１ＡＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６（配列番号１３６）を含み；
Ｘ２１はＳ、Ｄ、ＥまたはＡであり；
Ｘ２２はＳまたはＫであり；
Ｘ２３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＤであり；
Ｘ２４はＬまたはＶであり；
Ｘ２５はＱ、ＥまたはＨであり；
Ｘ２６はＳ、Ｎ、Ａ、Ｒ、ＰまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＱＱＸ２７Ｘ２８ＳＦＰＸ２９Ｘ３０（配列番号１３７）を含み；
Ｘ２７はＡまたはＧであり；
Ｘ２８はＮ、ＤまたはＹであり；
Ｘ２９はＦまたはＬであり；
Ｘ３０はＡまたはＴである。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号９８または配列番号９８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号２１、２２および２３を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４５、４６および４７；配列番号６６、６７および６８；配列番号７０、６７および７１；配列番号７３、７４および７５；配列番号７７、７８および４７；配列番号８０、８１および８２；配列番号７７、７８および８４；配列番号７７、８６および４７；配列番号８８、８９および４７；配列番号６６、６７および４７；配列番号８０、９２および７５；配列番号８０、９４および７１；配列番号９９、１００および４７；配列番号１０２、１０３および１０４；配列番号１０６、１０３および４７；配列番号１０８、１０３および４７；配列番号１１０、１１１および７５；配列番号７７、１０３および１１３；配列番号７７、１１１および４７；配列番号１１６、６７および４７；配列番号１１８、１１９および４７；配列番号８０、７８および４７；配列番号１２２、１０３および４７；配列番号１２４、１２５および７５；配列番号１２７、３８および６８；配列番号１２９、１３０および４７または配列番号１３２、１３３および７５を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２４または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４または配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＳＳＸ１ＳＬＬＸ２ＳＮＧＸ３Ｘ４ＹＬＤ（配列番号６２）を含み、
Ｘ１はＱまたはＥであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＹまたはＮであり；
Ｘ４はＴまたはＮであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号６３）を含み、
Ｘ５はＬ、ＱまたはＥであり；
Ｘ６はＳ、ＡまたはＶであり；
Ｘ７はＨ、Ｎ、ＴまたはＳであり；
Ｘ８はＲまたはＬであり；
Ｘ９はＧ、ＡまたはＨであり；
Ｘ１０はＳまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＭＱＧＸ１１Ｘ１２ＷＰＹＴ（配列番号６４）を含み、
Ｘ１１はＡ、ＴまたはＳであり；
Ｘ１２はＨまたはＲである。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２０または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号５１または配列番号５１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４１、４２および４３；配列番号４１、５２および５３；配列番号４１、５５および５６；または配列番号５８、５９および６０を含む。
さらなる実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで：
重鎖可変領域は、配列番号２０または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号４４、５４、５７もしくは６１または配列番号４４、５４、５７もしくは６１のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む。
表２４～２７に記載される配列を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
配列番号１７４～１８４、１８７～１９０、１９３～１９９、２０６～２１１、２２４～２４３からなる群から選択される配列を含む重鎖を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。配列番号１７０、１７３、１８６、１９２および２０５からなる群から選択される配列を含む軽鎖を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
表２６に列挙される軽鎖および重／重鎖組合せを含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
表２７に列挙される軽鎖および１つまたはそれ以上の重鎖を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２２４を含む第２の重鎖配列；
（２）配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２２５を含む第２の重鎖配列；
（３）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２２６を含む第２の重鎖配列；
（４）配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２２７を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２２８を含む第２の重鎖配列；
（２）配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２２９を含む第２の重鎖配列；
（３）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３０を含む第２の重鎖配列；
（４）配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３１を含む第２の重鎖配列；
（５）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２３６を含む第２の重鎖配列；
（６）配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２３７を含む第２の重鎖配列；
（７）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３８を含む第２の重鎖配列；
（８）配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３９を含む第２の重鎖配列；
（９）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４１を含む第２の重鎖配列；または
（１０）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４２を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２３２を含む第２の重鎖配列；
（２）配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２３３を含む第２の重鎖配列；
（３）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３４を含む第２の重鎖配列；
（４）配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３５を含む第２の重鎖配列；または
（５）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４３を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２２４を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２２５を含む第２の重鎖配列；または
（２）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２２６を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２２７を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２２８を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２２９を含む第２の重鎖配列；
（２）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３０を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３１を含む第２の重鎖配列；
（３）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２３６を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２３７を含む第２の重鎖配列；
（４）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３８を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３９を含む第２の重鎖配列；
（５）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４１を含む第２の重鎖配列；または
（６）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４２を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
実施形態では、配列番号２１９および／または配列番号９８を含む軽鎖配列ならびに：
（１）配列番号２２０を含む第１の重鎖配列および配列番号２３２を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２１を含む第１の重鎖配列および配列番号２３３を含む第２の重鎖配列；
（２）配列番号２２２を含む第１の重鎖配列および配列番号２３４を含む第２の重鎖配列；もしくは配列番号２２３を含む第１の重鎖配列および配列番号２３５を含む第２の重鎖配列；または
（３）配列番号２４０を含む第１の重鎖配列および配列番号２４３を含む第２の重鎖配列
を含む融合タンパク質が提供される。
抗体およびその抗原結合断片
抗体という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長または無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体およびグラフト化抗体（グラフト化抗体）、二重特異性抗体、特異的抗体部分（例えば、ドメイン抗体）ならびに特異的結合に対して無傷の抗体と競合するその任意の抗原結合部分、その抗原結合部分（例えば、パラトープ、ＣＤＲ）および所望の生物活性および特異性を示す限り抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変コンホメーションを含む。したがって、抗体は、免疫グロブリン分子または抗原結合部位を含み、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって標的に特異的に結合可能な任意のポリペプチドを含むその断片または誘導体である。開示される抗体は、マウス、ラット、ヒトまたは任意の他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であり得る。
ある特定の実施形態では、抗体のフレームワーク領域（またはその抗原結合断片）は、ヒト生殖系列配列と同一である場合も、天然にもしくは人為的に改変されている場合もある。
１つの好ましい実施形態では、開示される抗体構造は、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに属する。標準ＩｇＧ免疫グロブリン分子は、２つの同一軽鎖ポリペプチドおよび２つの同一重鎖ポリペプチドを含む。軽鎖ポリペプチドの分子量は、およそ２３，０００ダルトンであり、重鎖ポリペプチドの分子量は、５３，０００～７０，０００ダルトンの間で変わる。４つの鎖は通常、「Ｙ」配置でジスルフィド結合によってつながっている。
免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合には、免疫グロブリン分子の２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）は、互いに共有結合によって結合しており、２つの重鎖の末端部分は、共有結合的ジスルフィド結合または非共有結合的連結によって互いに結合している。軽および重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域を含有する。「可変」および「定常」という用語は、機能的に使用される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
可変領域によって、抗体は、抗原上に位置するエピトープを認識し、特異的に結合することが可能になる。軽（ＶＬ）および重（ＶＨ）鎖部分両方の可変ドメインによって、抗原認識および特異性が決定される。抗体の抗原結合部位は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインまたはＣＤＲのサブセットから構成される。より詳しくは、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖各々上の１つ、２つまたは３つのＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって定義される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤性移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような生物学的特性を与える。慣習により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれ増大する。
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、（通常）抗原結合に関与する抗体可変ドメインの部分を指す。各可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として知られる３つの非連続ＣＤＲを有する。ＣＤＲは、可変ドメインの表面上にこれらのループを提示する「コア」β－シート構造を形成するフレームワーク領域と呼ばれる構造的に保存された領域（ＦＲ－１、－２、－３および－４）によって分離されている。各抗原結合ドメインに存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境においてその３次元立体配置をとるときに、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置される、アミノ酸の短い、非連続配列である。ＣＤＲ配列の長さおよび組成は、特に、ＣＤＲ３において高度に可変性である。抗原結合ドメインまたは「フレームワーク」領域中に位置するアミノ酸の残部は、より少ない分子間可変性を示す。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的である表面を規定する。この相補的表面が、抗体の、その同族エピトープへの非共有結合を促進する。各ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔによって規定されるようなＣＤＲに由来するアミノ酸残基（すなわち、およそ軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７、１９９１））を含み得る。各ＣＤＲはまた、「超可変ループ」に由来するアミノ酸残基（すなわち、およそ軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（ＬＩ）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ １９６ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９０１（１９８７））を含み得る。一部の例では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔおよび超可変ループに従って規定される両ＣＤＲ領域に由来するアミノ酸を含み得る。Ｋａｂａｔ番号付けは、基本可変ドメイン構造のフレームワークであろうがＣＤＲであろうが、構造成分の短縮化またはそれへの挿入のためにアミノ酸残基での線形番号付けに常に対応するわけではない。所与の抗体またはその抗原結合断片の、残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体またはその抗原結合断片の配列中の相同性の残基を、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とアラインメントすることによって決定できる、またはＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）システム（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．－Ｐ．ら、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５～７７頁（２００３））に従って規定できる。
本明細書において使用される場合、「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（サメおよびラクダ抗体のようなｄＡｂ）、ＳｃＦｖ、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ－ＮＡＲおよびｂｉｓ－ｓｃＦｖまたは特異的抗原結合をポリペプチドに付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくともある特定の部分を含有するポリペプチドを含む断片であり得る。
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそのサブクラス）のような任意のクラスの抗体である場合があり、抗体は、任意の特定のクラスである必要はなく、必要な特異性の抗原認識部位、他の改変された立体配置を含む免疫グロブリン分子のいずれも（抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアントおよび共有結合によって改変された抗体を含む）包含される。これらのクラスおよびアイソタイプ各々の改変バージョンは、当業者に公知であり、したがって、本開示の範囲内である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、軽鎖の可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）ドメインならびに重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、または本質的にからなるＦａｂ断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたはそれ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片を指すＦａｂ’断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む、または本質的にからなるＦｄ断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインおよびＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたはそれ以上のシステイン残基を含むＦｄ’断片である。
単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で存在するようにこれらのドメインを含む、または本質的にからなる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによってｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することが可能となる。したがって、本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含む、または本質的にからなるＦｖ断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を含むダイアボディーである。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、ＶＨドメインを含む、または本質的にからなるｄＡｂ断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片を含むＦ（ａｂ’）２断片である。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体断片は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む線形抗体である。
当業者ならば、抗体断片の生成のために開発され、利用可能である種々の技術を使用できる。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解的消化によって導かれた。しかし、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離できる。抗体断片を生成するための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、最適の抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＷＯ９３／１６１８５を参照されたい。あるいは、これらの断片はまた、組換え宿主細胞によって直接的に生成できる。例えば、抗体断片は、本明細書において論じられる抗体ファージライブラリーから単離できる。別のアプローチでは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接的に回収でき、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的にカップリングできる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２）。
一実施形態では、抗体は、ＰＤ－１に結合する相補性領域を含む二重特異性抗体である。
企図される抗体または抗原結合断片は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むすべての種類の定常領域ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプを有し得る。一実施形態では、アイソタイプは、ヒトＩｇＧ１である。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４が使用される。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。抗体またはその抗原結合断片は、１つより多いクラスまたはアイソタイプからの配列を含み得る。
抗ＰＤ－１抗体およびそのＰＤ－１結合断片
本開示は、ＰＤ－１に結合する抗体およびＰＤ－１に結合するその抗原結合断片ならびにこのような抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質を記載する。「ＰＤ－１」という用語は、プログラム死－１タンパク質（ＣＤ２７９としても知られる）、Ｔ細胞共阻害剤を指す。ＰＤ－１という用語は、組換えＰＤ－１および／またはその断片を包含する。この用語はまた、例えば、マウスまたはヒトＦｃ、ヒスチジンタグおよび／またはシグナル配列にカップリングされたＰＤ－１またはその断片も含む。この用語は、ＰＤ－１を含む融合タンパク質をさらに包含し得る。全長ＰＤ－１のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００５００９．２としてＧｅｎＢａｎｋにおいて提供される。ＰＤ－１のリガンドは、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を含む。全長ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１としてＧｅｎＢａｎｋにおいて提供される。全長ＰＤ－Ｌ２のアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿０７９５１５．２としてＧｅｎＢａｎｋにおいて提供される。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ－１に特異的に結合し、ＰＤ－１媒介性免疫抑制をアンタゴナイズする。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、ＰＤ－１によって媒介される下流事象を含むＰＤ－１生物活性を妨げ、阻害し、低減し得る。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、以下の機能：（ａ）ＰＤ－１への結合および下流シグナル伝達事象のブロッキング；（ｂ）ＰＤ－１へのブロッキングＰＤ－Ｌ１－結合；（ｃ）Ｔ細胞増殖の増大；（ｄ）Ｔ細胞媒介性免疫応答の上方制御；（ｅ）ＴＮＦ分泌の刺激；（ｆ）ＰＤ－１による阻害性シグナル伝達の低減；および／または（ｇ）ＩＦＮγ分泌の刺激のうち任意の１つまたはそれ以上を示し得る。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、強力な結合および阻害活性を示し、治療的および診断的使用にとって有用である。
一態様では、本開示は、ＰＤ－１に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＤ－１および少なくとも１つの他の分子に特異的に結合する二重特異性抗体および結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本開示は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片はＰＤ－１に結合し、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、抗体重鎖は、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む定常領域を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＩＸ１７Ｘ１８ＷＸ１９Ｘ２０（配列番号１３５）を含み；
Ｘ１３はＡまたはＶであり；
Ｘ１４はＳまたはＧであり；
Ｘ１５はＱ、ＥまたはＲであり；
Ｘ１６はＧ、Ｓ、ＤまたはＮであり；
Ｘ１７はＧ、ＳまたはＮであり；
Ｘ１８は、Ｓ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、ＨまたはＶであり；
Ｘ１９はＬまたはＶであり；
Ｘ２０はＧまたはＡであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ２１ＡＸ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６（配列番号１３６）を含み；
Ｘ２１はＳ、Ｄ、ＥまたはＡであり；
Ｘ２２はＳまたはＫであり；
Ｘ２３はＳ、Ｎ、Ｔ、ＲまたはＤであり；
Ｘ２４はＬまたはＶであり；
Ｘ２５はＱ、ＥまたはＨであり；
Ｘ２６はＳ、Ｎ、Ａ、Ｒ、ＰまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＱＱＸ２７Ｘ２８ＳＦＰＸ２９Ｘ３０（配列番号１３７）を含み；
Ｘ２７はＡまたはＧであり；
Ｘ２８はＮ、ＤまたはＹであり；
Ｘ２９はＦまたはＬであり；
Ｘ３０はＡまたはＴである。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号２１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号２２の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号２３の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号９６の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号９７の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号８２の配列を含む。
実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２４を含む重鎖可変領域または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号９８を含む軽鎖可変領域または配列番号９８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号２１、２２および２３を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４５、４６および４７；配列番号６６、６７および６８；配列番号７０、６７および７１；配列番号７３、７４および７５；配列番号７７、７８および４７；配列番号８０、８１および８２；配列番号７７、７８および８４；配列番号７７、８６および４７；配列番号８８、８９および４７；配列番号６６、６７および４７；配列番号８０、９２および７５；配列番号８０、９４および７１；配列番号９９、１００および４７；配列番号１０２、１０３および１０４；配列番号１０６、１０３および４７；配列番号１０８、１０３および４７；配列番号１１０、１１１および７５；配列番号７７、１０３および１１３；配列番号７７、１１１および４７；配列番号１１６、６７および４７；配列番号１１８、１１９および４７；配列番号８０、７８および４７；配列番号１２２、１０３および４７；配列番号１２４、１２５および７５；配列番号１２７、３８および６８；配列番号１２９、１３０および４７；または配列番号１３２、１３３および７５を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２４を含む重鎖可変領域または配列番号２４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４を含む軽鎖可変領域または配列番号４８、６９、７２、７６、７９、８３、８５、９０、９１、９３、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１もしくは１３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含む；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含む；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含む；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列ＲＳＳＸ１ＳＬＬＸ２ＳＮＧＸ３Ｘ４ＹＬＤ（配列番号６２）を含み、
Ｘ１はＱまたはＥであり；
Ｘ２はＨまたはＹであり；
Ｘ３はＹまたはＮであり；
Ｘ４はＴまたはＮであり；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列Ｘ５Ｘ６ＳＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号６３）を含み、
Ｘ５はＬ、ＱまたはＥであり；
Ｘ６はＳ、ＡまたはＶであり；
Ｘ７はＨ、Ｎ、ＴまたはＳであり；
Ｘ８はＲまたはＬであり；
Ｘ９はＧ、ＡまたはＨであり；
Ｘ１０はＳまたはＴであり；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列ＭＱＧＸ１１Ｘ１２ＷＰＹＴ（配列番号６４）を含み、
Ｘ１１はＡ、ＴまたはＳであり；
Ｘ１２はＨまたはＲである。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列番号１７の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列番号１８の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列番号１９の配列を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列番号４１の配列を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列番号４９の配列を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列番号５０の配列を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、以下：
配列番号２０を含む重鎖可変領域または配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列；および
配列番号５１を含む軽鎖可変領域または配列番号５１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一である配列
を含む。
実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲは、以下の配列を含む：
ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２ＨおよびＣＤＲ３Ｈの配列は、それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含み；
ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２ＬおよびＣＤＲ３Ｌの配列は、それぞれ、配列番号４１、４２および４３；配列番号４１、５２および５３；配列番号４１、５５および５６；または配列番号５８、５９および６０を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号４、８、１２、１６、２０および２４からなる群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号２８、３２、３６、４０、４４、４８、５１、５４、５７、６１、６５、６９、７２、７６、７９、８３、８５、８８、９０、９１、９３、９５、９８、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１、１３４および１３８からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号６５の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号４４、５１、５４、５７および６１からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号５１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号５４の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号５７の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号６１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１３８の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２０の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号６９、７２、７６、７９、８３、８５、８７、９０、９１、９３、９５、９８、１０１、１０５、１０７、１０９、１１２、１１４、１１５、１１７、１２０、１２１、１２３、１２６、１２８、１３１、１３４および１３８からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号９８の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号６９の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号７２の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号７６の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号７９の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号８３の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号８５の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号８７の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号９０の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号９１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号９３の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号９５の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１０１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１０５の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１０７の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１０９の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１１２の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１１４の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１１５の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１１７の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２０の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２３の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２６の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１２８の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１３１の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号２４の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１３４の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域の配列は、配列番号１４２の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含み、軽鎖可変領域の配列は、配列番号１４６、１５０、１５３、１５６、１６０、１６４および１６７からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１４３を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１４４を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１４５を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１４７を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１４８を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１４９を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１５１を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１４８を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１５２を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１５４を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１４８を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１５５を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１５７を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１５８を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１５９を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１６１を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１６２を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１６３を含む。
一実施形態では、本開示は、ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ここで：
ＣＤＲ１Ｈの配列は、配列、配列番号１３９を含み；
ＣＤＲ２Ｈの配列は、配列、配列番号１４０を含み；
ＣＤＲ３Ｈの配列は、配列、配列番号１４１を含み；
ＣＤＲ１Ｌの配列は、配列、配列番号１５７を含み；
ＣＤＲ２Ｌの配列は、配列、配列番号１６５を含み；
ＣＤＲ３Ｌの配列は、配列、配列番号１６６を含む。
上記の説明に加えて、図１は、その全体を参照により組み入れる付随する配列表と同様に、本明細書において開示される抗体の重および軽鎖可変領域および関連ＣＤＲを示す。以下の実施例で示されるように、抗ＰＤ－１抗体の軽鎖シャッフリングは、ＰＤ－１結合親和性の実質的な改善を与える抗体バリアントの同定につながった。バリアントの分析によって、アミノ酸が軽鎖シャッフルされた抗体の間で相対的に不変のままであったある特定のＣＤＲ位置、およびＰＤ－１結合を消失させることなく変動を導入できる他のＣＤＲ位置が明らかになった。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片ならびに本明細書において開示される融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入および／または付加を有し得る。一部の実施形態では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片（または抗ＰＤ－１抗体もしくは抗原結合断片を含む融合タンパク質）の１つまたはそれ以上のＣＤＲ残基が、アミノ酸置換、欠失、挿入および／または付加によって変更されている。アミノ酸置換は、保存的置換である場合も、非保存的置換である場合もある。本開示はまた、本明細書において開示されるアミノ酸配列に由来し、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個またはそれ以上のアミノ酸が、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に突然変異している（このような配列変化は、本明細書においてまとめて「生殖系列突然変異」と呼ばれる）、抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片（および抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片を含む融合タンパク質）を含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその結合断片（または抗ＰＤ－１抗体もしくは抗原結合断片を含む融合タンパク質）は、図１に示されるＣＤＲおよび／または可変ドメイン配列に対して少なくとも８５％少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、１つもしくはそれ以上のＣＤＲ、または１つもしくはそれ以上の可変ドメインを含む。
また、表２５に開示される可変重鎖および可変軽鎖およびその対合に対して同様であるが、同一ではない可変重鎖および可変軽鎖配列ならびにその対合が、本明細書において提供される。本明細書において記載されるフレームワークのいずれも、本明細書において記載されるＣＤＲおよびＣＤＲモチーフのいずれかと組み合わせて利用できるということは明らかであろう。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、表２５に記載されるフレームワークを利用する。
また、本明細書において開示される抗ＰＤ１抗体および抗原結合断片の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書において提供される。また、本明細書において開示される抗ＰＤ１抗体および抗原結合断片のうちいずれか１つの６つのＣＤＲを含むＣＡＲも本明細書において提供される。
本明細書において開示される抗ＰＤ１抗体および抗原結合断片の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含むＣＡＲを発現する免疫細胞が開示される。本明細書において開示される抗ＰＤ１抗体および抗原結合断片のいずれか１つの６つのＣＤＲを含むＣＡＲを発現する免疫細胞が、開示される。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。
「同一性」とは、最適アラインメントに必要とされたギャップの数および各ギャップの長さを考慮した後の、最適にアラインされた配列中の２つのアミノ酸または核酸配列によって共有される同一位置の数またはパーセンテージを指す。「実質的に同一な」とは、元の配列から保存的アミノ酸置換のみによって異なり、タンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列を意味する。
また、本明細書において開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％もしくは少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質も、本明細書において開示される。それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３（１９９０）およびＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を含む、配列類似性を決定するための方法およびコンピュータプログラムは、公的に利用可能である。Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、類似性を決定するために使用できる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源から公的に利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ、メリーランド州、ベゼスタ ２０８９４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／でＢＬＡＳＴ ２．０）。配列の比較において、これらの方法は、種々の置換、欠失および他の改変を説明する。
本明細書において記載される態様の一部の実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において記載されるＰＤ－１に結合する融合タンパク質のアミノ酸配列改変が企図される。抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片もしくは融合タンパク質をコードする核酸中に適切なヌクレオチド変更を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような改変には、例えば、抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、結合特異性、生物活性の阻害を有する場合、最終構築物に到達するために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行われる。
アミノ酸置換は、一部の場合には、（ａ）置換の領域においてペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するその効果において有意に異ならない置換を選択すること（保存的アミノ酸置換バリアント）によって行うことができる。これらのバリアントは、同様の側鎖特性を有する異なる残基によって置き換えられた、抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化できる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５を参照されたい）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
そのようなものとして、保存的アミノ酸置換の限定されない例は、非極性アミノ酸を別の非極性アミノ酸と置き換えるものである。
あるいは、天然に存在する残基を、共通側鎖特性に基づいてグループにわけることができる：
（１）疎水性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；
（２）中性親水性：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）；
（６）芳香族：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）。
これらのグループ内で行われる置換は、保存的置換と考えることができる。限定されない置換の例として、バリンのアラニンとの、リシンのアルギニンとの、グルタミンのアスパラギンとの、グルタミン酸のアスパラギン酸との、セリンのシステインとの、アスパラギンのグルタミンとの、アスパラギン酸のグルタミン酸との、プロリンのグリシンとの、アルギニンのヒスチジンとの、ロイシンのイソロイシンとの、イソロイシンのロイシンとの、アルギニンのリシンとの、ロイシンのメチオニンとの、ロイシンのフェニルアラニンとの、グリシンのプロリンとの、トレオニンのセリンとの、セリンのトレオニンとの、チロシンのトリプトファンとの、フェニルアラニンのチロシンとの、および／またはロイシンのバリンとの置換が挙げられる。
１残基～１００個またはそれより多い残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含み得るアミノ酸配列挿入がさらに企図される。末端融合物の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体もしくはの抗原結合断片または細胞傷害性ポリペプチドに融合された抗体もしくはその抗原結合断片（またはこのような抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質）が挙げられる。抗体またはその抗原結合断片の末端融合物の他の例として、例えば、ビオチンのような抗体またはその抗原結合断片の血清半減期を増大する酵素またはポリペプチドへの、抗体またはその抗原結合断片のＮ末端またはＣ末端への融合物（またはこのような抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質）が挙げられる。
分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、ＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合断片の適切なコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、例えばセリンまたはアラニンと置換できる。
逆に、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に、その安定性を改善するために（特に、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片がＦｖ断片のような抗体断片である場合に）、システイン結合を加えることができる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片または記載された抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の元のグリコシル化パターンを変更するアミノ酸変更を有する。「元のグリコシル化パターンを変更すること」とは、抗体もしくはその抗原結合断片において見出される１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させること、および／または抗体もしくはその抗原結合断片中に存在しない１つまたはそれ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は通常、Ｎ連結型またはＯ連結型のいずれかである。Ｎ連結型とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ連結型グリコシル化とは、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンも使用できるが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンへの付着を指す。変更はまた、１つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基の、元の抗体またはその抗原結合断片の配列への付加または置換によって行うことができる（Ｏ連結型グリコシル化部位について）。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、それだけには限らないが、既知保護基／ブロッキング基、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによる、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、誘導体化を含む改変を含み得る。化学的改変のプロセスは、当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが含まれる。付加的に、分子は、１個またはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、結合特徴が直接突然変異、親和性成熟、ファージディスプレイまたは鎖シャッフリングによって変更されている抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片を含み得る。親和性および特異性は、ＣＤＲを突然変異することおよび所望の特徴を有するＣＤＲをスクリーニングすることによって変更される。突然変異誘発の方法は、当業者には公知である。
抗体結合
また、抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片、ならびに本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のうちの１つと同一のＰＤ－１上のエピトープに結合する抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において提供される。
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、１つまたはそれ以上のＰＤファミリーメンバーを上回ってＰＤ－１に選択的に結合する。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ－４および／またはＣＤ２８への結合含めて、他のＰＤファミリーメンバーへの有意な結合を示さない。ヒトＰＤ－１遺伝子は、４種の選択的スプライシングされたＰＤ－１ ｍＲＮＡ転写物を生成する。これらのバリアントのうち１つは、ＰＤ－１の可溶性形態を生成する。一態様では、本開示は、ＰＤ－１のすべてのアイソフォームに結合する抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を提供する。一部の実施形態では、提供された抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片は、哺乳動物ＰＤ－１に結合する。
本明細書において使用される場合、抗体またはその抗原結合断片または抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質の、ＰＤ－１、ＰＤ－１上のエピトープ、または以下に記載されるある特定の実施形態では、ＰＤ－１上の特定の残基への「結合」は、抗体またはその抗原結合断片のＰＤ－１との選択的相互作用を含む。したがって、結合は、例えば、水素結合、イオン性相互作用、塩橋ならびに親水性および疎水性相互作用を含む一次的または二次的相互作用を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ－１に、１０－２～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－３～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－４～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－５～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－６～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－７～１０－１０ｍｏｌ／ｌ、１０－８～１０－１０ｍｏｌ／ｌまたは１０－９～１０－１０ｍｏｌ／ｌの解離（ＫＤ）の平衡定数で結合する。他の実施形態では、本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ－１に１０－２～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－３～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－４～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－５～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－６～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－７～１０－９ｍｏｌ／ｌ、１０－８～１０－９ｍｏｌ／ｌまたは１０－９～１０－１０ｍｏｌ／ｌのＫＤで結合する。
本明細書において使用される場合、抗原の抗原結合タンパク質とのＫＤによって表される「親和性」は、抗原決定基と、抗体またはその抗体断片のような抗原結合タンパク質上の抗原結合部位の間の結合強度の尺度である。ＫＤの値は、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度に反比例する。あるいは、親和性はまた、１／ＫＤである会合定数（ＫＡ）として表すことができる。親和性は、当業者によって、目的の特異的抗原に応じてそれ自体公知の様式で決定できる。
「特異性」という用語は、本明細書において、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のような抗体またはその抗原結合断片の、ＰＤ－１内のエピトープを認識し、一方で、ＰＤ－１の他の部分との検出可能な反応性をほとんど有さないまたは全く有さない能力を指す。特異性は、競合アッセイによって、または本明細書において記載されるエピトープ同定／特性決定技術または当技術分野で公知のその均等物によって相対的に決定できる。
「エピトープ」という用語は、本明細書において、抗体が結合する特定の標的を指す。エピトープは、アミノ酸の連続ストレッチ（連続エピトープ）によって、および標的タンパク質が特定のコンホメーションにフォールディングされた場合にのみ存在するアミノ酸残基の３次元配置（非連続的エピトープ）の両方によって形成される。一般に、エピトープは、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個、少なくとも５個または約７～１０個のアミノ酸を含む。
抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２と同一のエピトープに特異的に結合する、抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片ならびに抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において開示される。また、抗ＰＤ－１抗体３１Ｂ１と同一のエピトープに結合する、抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片ならびに抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片を含む融合タンパク質が、本明細書において開示される。
本明細書において使用される場合、「ブロッキング」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の生物活性を阻害または低減するものである。例えば、一部の実施形態では、抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１の活性および／またはＰＤ－１の、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２のような結合パートナーへの結合を阻害する。活性の阻害および結合の阻害は、部分的阻害を含む。ＰＤ－１相互作用をブロッキングするＰＤ－１抗体を同定する方法は、本明細書に記載されており、当業者に公知である。例えば、競合抗体、交差ブロッキング抗体および交差ブロッキングされた（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋｅｄ）抗体は、競合抗体または交差ブロッキング抗体のヒトＰＤ－１への結合が、本明細書において開示される抗体の結合を妨げる、または逆もまた同様である競合ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを含む、当技術分野で公知の任意の適した方法を使用して同定できる。
ある特定の実施形態では、すべてのＣＤＲが抗原への結合に直接的に関与しているわけではない。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の６つのＣＤＲのうち４つが、抗原と接触する。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の６つのＣＤＲのうち５つが、抗原と接触する。一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の６つのＣＤＲのうち６つが抗原と接触する。
「選択的」および「選択性」という用語は、本明細書において、特定の領域、標的またはペプチド；通常、他のＰＤ－１ファミリーメンバーを含む１種またはそれ以上の他の生体分子とは対照的に、ＰＤ－１中の領域またはエピトープに対する、抗体またはその抗原結合断片（すなわち、ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片）の優先的な結合を指す。
一態様では、ＰＤ－１上の結合部位の少なくとも一部に特異的に結合し、それによって、１つまたはそれ以上のＰＤ－１リガンドとのＰＤ－１相互作用をブロッキングする抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片が提供される。これらのＰＤ－１リガンドは、それだけには限らないが、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を含む。
ある特定の実施形態では、本開示に従う抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片は、第１のおよび第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、安定な会合を形成する。実施形態では、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、同一である。代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、同一ではない。実施形態では、Ｆｃドメインの１つのサブユニットは、免疫複合体分子と融合される。実施形態では、抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ３ Ｆｃドメイン、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり得る。さらなる特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
二量体化を促進する開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＦｃドメインにおける改変がさらに企図される。実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のおよび第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。一実施形態では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおいてである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のおよび第２のサブユニットの会合を促進する前記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにおける「ノブ」改変およびＦｃドメインの２つのサブユニットのうちのもう一方における「ホール」改変を含む。
ノブ・イントゥ・ホール改変は、「空洞への突起」戦略であり、ヘテロオリゴマー化のための第１のおよび第２のポリペプチド間の界面を操作するように働く。「突起」（すなわち、ノブ）を、第１のポリペプチドの界面に由来する小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖と置き換えることによって構築する。突起に対して同一またはより小さい大きさの代償的な「空洞」（すなわち、ホール）を、大きなアミノ酸側鎖をより小さいものと置き換えることによって第２のポリペプチドの界面上に場合によりで作出する。特定の実施形態では、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第１のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内にノブが生成され、これは、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン中において１つのアミノ酸残基を、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えることによって生成した、第２のＦｃサブユニットのＣＨ３ドメイン内に存在するホール中に配置することができる。好ましくは、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、リシン（Ｌ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
ノブおよびホールに対応する突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって、またはペプチド合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって行うことができる。
１つの重鎖のみがＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉに連結される融合タンパク質実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＦｃドメインは、ヘテロ二量体形成（すなわち、重鎖融合物と融合を欠く重鎖との会合）を促進する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。実施形態では、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３－１）中のアミノ酸残基は、アミノ酸を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換え、それによって、ＣＨ３ドメイン内に「ノブ」を生成するアミノ酸置換を含み、これは、アミノ酸残基を、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置き換えることによって生成した、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３－２）内に存在する「ホール」中に配置することができる。実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインは、以下；Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｓ３６４Ｈ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖから１つまたはそれ以上の置換を含み得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインは、以下；Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔから１つまたはそれ以上の置換を含み得る。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、
（１）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ；
（２）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ；
（３）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ；
（４）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｙ４０７Ｔ；
（５）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｙ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｙ４０７Ｔ；
（６）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｙ４０７Ａ；
（７）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｆ４０５Ａ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３９４Ｗ；
（８）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｆ４０５Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３９４Ｓ；
（９）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６ＹおよびＦ４０５Ａ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔ；
（１０）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３９４Ｓ：および４０７Ａ；
（１１）第１の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｆ４０５ＷおよびＹ４０７Ａ；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓ
（１２）
から選択される。
ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片（またはこのような抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質）が、本明細書において提供され、抗体は、配列番号１６８～１６９、１７１～１７２、１８５、１９１および２０１～２０３からなる群から選択される配列を含む重鎖を含む。
ＰＤ－１に結合する、抗体またはその抗原結合断片（またはこのような抗体もしくはその抗原結合断片を含む融合タンパク質）が、本明細書において提供され、抗体は、配列番号１７０、１７３、１８６、１９２および２０５からなる群から選択される配列を含む軽鎖を含む。
特定の実施形態では、本開示に従うＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低減および／またはエフェクター機能の低減を示す。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減および／またはエフェクター機能の低減を有するように操作される。
リンカー
実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質は、本明細書において開示される融合タンパク質の成分をつなげる１つまたはそれ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、（ｉ）ＩＬ－１５ポリペプチドとｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５Ｒαポリペプチドの間；（ｉｉ）抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖とＩＬ－１５ポリペプチドもしくはｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５Ｒαポリペプチドの間；または（ｉｉｉ）両方に位置し得る。本開示の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドおよびｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５Ｒαポリペプチドは、第１のリンカーアミノ酸配列によってつなげられる、または連結される。実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチド（またはＩＬ１５Ｒαポリペプチド）は、第２のリンカーアミノ酸配列によって本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片に連結される。実施形態では、第２のリンカーは、重鎖可変領域のＮ末端をＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端につなげる。第１のおよび第２のリンカーは、同一または異なるアミノ酸配列を有し得る。
本明細書において記載されるリンカーアミノ酸配列は、融合タンパク質が適切な二次および三次構造を形成することを確実にするのに十分な長さのものであり得る。リンカーアミノの長さは、５～４０個のアミノ酸、好ましくは、１０～４０個のアミノ酸、より好ましくは、１５～４０個のアミノ酸、さらにより好ましくは、２０～４０個のアミノ酸、最も好ましくは、２５～３５個のアミノ酸の間であり得る。
好ましくは、リンカー配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＧｌｎ（Ｑ）を含む群において選択される中性に近いアミノ酸を含み、最も好ましくは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）およびＳｅｒ（Ｓ）を含む群から選択されるアミノ酸においてである。好ましくは、リンカー配列は、グリシンリッチおよびセリンリッチであり、一部の実施形態では、リンカーは、セリンおよびグリシン残基のみを含有する。
一部の実施形態では、リンカーは、それだけには限らないが、配列番号２１５（以下）のリンカー中の太字の配列を含む、ｓｕｓｈｉドメインの外側のＩＬ１５Ｒαポリペプチドの部分を含む。
アミノ酸配列の一部の限定されないリンカー例としてＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号２１５）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）；
ＩＲＤＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１７）、ＩＲＤＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１８）、および
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４４）
が挙げられる。
実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドとＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉとをつなげるリンカーは、ＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号２１５）、ＩＲＤＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１７）、またはＩＲＤＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１８）
を含む。
実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドを抗ＰＤ－１抗体重鎖につなげるリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１６）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４４）
を含む。
実施形態では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重および軽鎖は、ＶＲおよびＶＬドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にする第３のリンカーを使用して、単一ポリペプチド鎖（「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」）に接続される場合もある。リンカーのアミノ酸配列は、同一である場合も異なっている場合もある。
一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドまたはＩＬ－１５誘導体は、リンカーによってＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体に共有結合によって連結される。
一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドまたはＩＬ－１５誘導体は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドのＣ末端またはＩＬ－１５誘導体は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＮ末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドのＮ末端またはＩＬ－１５誘導体は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣ末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドのＮ末端またはＩＬ－１５誘導体は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＨ３領域に共有結合によって連結される。
一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体のＣ末端は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＮ末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体のＮ末端は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣ末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体のＮ末端は、リンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＣＨ３領域に共有結合によって連結される。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドまたはＩＬ－１５誘導体は、第１のリンカーによってＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドまたはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体に共有結合によって連結され、ＩＬ－１５ポリペプチドもしくはＩＬ－１５誘導体またはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉポリペプチドもしくはＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ誘導体のいずれかは、第２のリンカーによって抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片に共有結合によって連結される。一部の実施形態では、第１のおよび第２のリンカーのアミノ酸配列は、同一である。他の実施形態では、第１のおよび第２のリンカーのアミノ酸配列は、異なっている。
コンジュゲート
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の機能的部分をさらに含み得る。有用な機能的部分の例として、それだけには限らないが、ブロッキング部分、検出可能部分、診断部分、標的化および治療部分が挙げられる。
ブロッキング部分は、例えば、抗体またはその抗原結合断片をグリコシル化するスリコシダーゼの能力をブロッキングすることによって、低減されたグリコシル化が生じるように十分な立体的な嵩および／または電荷の部分を含み得る。好ましいブロッキング部分は、システイン、混合ジスルフィド付加物またはジスルフィド結合のようなシステイン付加物ならびにポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）、ポリオキシエチル化グリセロール（「ＰＯＧ」）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール（「ＰＶＡ」）および他のポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコースのようなＰＥＧ部分を含む。ＰＥＧは、いくつかの理由のために生物学的適用において好ましい部分である。ＰＥＧ化は、分子の見かけの分子量を増大することによって分子の薬物動態性能を改善し得る。増大した見かけの分子量は、皮下または全身投与後の身体からのクリアランスの速度を低減する。多くの場合には、ペグ化は、抗原性および免疫原性を低下させ得る。ＰＥＧ化はまた、生物学的に活性な分子の溶解度を増大する。付加的に、ＰＥＧは通常透明、無色、無臭であり、水に可溶性、熱に対して安定、多数の化学薬品に対して不活性であり、加水分解せず、非毒性であり、これによって生物学的適用にとって好ましい選択になる。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体または抗原結合断片または融合物とコンジュゲートされる検出可能な部分の例として、蛍光部分または標識、造影剤、放射性同位体部分、放射不透過性部分など、例えば、ビオチン、フルオロフォア、発色団、スピン共鳴プローブまたは放射標識のような検出可能標識を挙げることができる。フルオロフォアの例として、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）および他の発光分子（例えば、ルミナル）が挙げられる。フルオロフォアは、基質（例えば、ダンシルプローブ）に結合した際に構造的変化を受ける改変タンパク質中の１個またはそれ以上の残基に近接して位置する場合にその蛍光が変化するように環境的に感受性であり得る。例示的放射標識として、１つまたはそれ以上の低感受性核を有する原子（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなど）を含有する小分子が挙げられる。
診断部分は、疾患または障害の存在を明らかにするのに適した検出可能な部分を含む。通常、診断部分によって、疾患または障害と関連している分子、例えば、標的ペプチド、タンパク質（単数または複数）の存在、不在またはレベルを決定することが可能となる。このような診断はまた、疾患または障害およびその進行を予測および／または診断するのに適している。
治療部分の例として、抗炎症剤、抗がん剤、抗神経変性剤、抗感染剤または全般的に、治療薬が挙げられる。機能的部分はまた、上記の機能のうち１つまたはそれ以上を有し得る。例示的治療部分には、抗生物質、第２の抗ＰＤ－１抗体または腫瘍特異的抗原、自己免疫組織抗原、ウイルス感染細胞抗原のような別の抗原に対する抗体、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞共阻害剤または免疫毒素またはがん、自己免疫疾患もしくは慢性ウイルス感染を含む疾患もしくは状態を処置するのに有用な任意の他の治療部分が含まれる。例示的治療部分はまた、細胞毒、放射活性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチドまたは治療剤を、その標的に結合可能である限り分子に沿った任意の位置に含み得る。イムノコンジュゲートの例として、抗体薬物コンジュゲートおよび抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。ある特定の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に特異的な薬剤にコンジュゲートされる。
例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるようなサルベージ受容体結合エピトープを抗体またはその抗原結合断片（特に、抗体断片）に付着して、本明細書において記載される抗体または抗原結合断片の半減期を増大することもできる。「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の増大に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す場合がある（例えば、Ｇｈｅｔｉｅら、１８ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７３９（２０００）。
核酸
また、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質をコードする核酸ならびにベクター、宿主細胞および発現系が、本明細書において提供される。「核酸」という用語は、本明細書において使用される場合、任意の長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマー形態を指し、それだけには限らないが、単鎖、二本鎖もしくは複数鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドまたはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマーまたは他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基が含まれる。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片ならびに融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成的に生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独もしくは組み合わせて含む組換え生成されたキメラ核酸分子であり得る。
「ベクター」という用語は、核酸分子を細胞中へ輸送可能である核酸分子を含む媒体を指す。「ベクター」には、それだけには限らないが、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクターまたは線形もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が含まれ、これは、染色体、非染色体、半合成または合成核酸からなる場合がある。一部の実施形態では、用いられるベクターは、それらが連結される核酸の自己複製（エピソームベクター）および／または発現を可能なもの（発現ベクター）である。いくつかの適したベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
抗体および融合タンパク質調製物および発現系
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、抗原結合断片または融合タンパク質は通常、組換え発現によって産生される。場合により、定常領域に連結された軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸を、同一発現ベクター中に挿入できる。あるいは、場合により、定常領域に連結された軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸は、異なる発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは、それだけには限らないが、プロモーター（例えば、相同または異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列を含む、１つまたはそれ以上の発現制御配列をさらに含み得る。好ましくは、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクター中の真核生物のプロモーター系である。通常、宿主は、ベクターが適切な宿主中に組み込まれた後の、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。
一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含有する。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を発現するために使用される宿主は、原核生物の、または真核生物の宿主であり得る。適した宿主の例として、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕのいずれかの酵母、昆虫、真菌、鳥および哺乳動物細胞、または哺乳動物、昆虫、鳥もしくは酵母起源の宿主細胞を含む細菌または真核生物宿主が挙げられる。哺乳動物細胞または組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコ起源のものであり得るが、任意の他の哺乳動物細胞を使用できる。
本明細書において開示される抗体、抗原結合断片または融合タンパク質を発現させるために使用できる細菌宿主の例は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）のような桿菌ならびにサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）および種々のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種のような他の腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）であり得る。
酵母もまた、本明細書において開示される抗体、抗原結合断片または融合タンパク質を発現するための宿主として使用できる。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）は、例示的酵母宿主であり、適したベクターは、必要に応じて、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する。通常のプロモーターは、３－ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。誘導酵母プロモーターには、中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターが含まれる。
培養中の哺乳動物細胞はまた、本明細書において開示される抗体、抗原結合断片または融合タンパク質を発現する宿主細胞として使用できる。当技術分野で周知の異種タンパク質（例えば、無傷の免疫グロブリン）を分泌可能な、適した宿主細胞株の例として、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターには、複製起点、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位および／または転写ターミネーター配列のような必要なプロセシング情報部位が含まれる。発現制御配列の例として、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどが挙げられる。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、単一発現構築物もしくはベクターまたは複数の発現構築物もしくはベクター（例えば、２つまたは３つの発現構築物）を使用して発現させることができる。抗体重および軽鎖が別々の発現ベクター上でクローニングされる場合には、無傷の免疫グロブリンの発現およびアセンブリーを得るためにベクターが同時トランスフェクトされる。ひとたび発現されると、本明細書において開示される全抗体、その二量体、個々の軽および重鎖または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む、技術分野の標準手順に従って精製できる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９８２）を参照されたい）。医薬使用のためには、少なくとも約９０～９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８～９９％またはそれより高い均一性がもっとも好ましい。
開示される抗ＰＤ－１抗体、抗原結合断片および融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製できる。ヒトまたはマウス抗体または融合分子を生成するための一般的な技術は、当技術分野で公知である。
ＰＤ－１活性をモジュレートする方法
一態様では、本開示は、ＰＤ－１と、それだけには限らないが、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を含むＰＤ－リガンドとの間の相互作用を減少させるために本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質は、ＰＤ－１単量体間の相互作用を撹乱する。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、免疫抑制、例えば、Ｔ細胞耐性を低減するために有用である。「低減すること」とは、処置されていない対照と比較して、約２０％もしくはそれより多い、３０％もしくはそれより多い、４０％もしくはそれより多い、４５％もしくはそれより多い、５０％もしくはそれより多い、５５％もしくはそれより多い、６０％もしくはそれより多い、６５％もしくはそれより多い、７０％もしくはそれより多い、または７５％もしくはそれより多い、８０％もしくはそれより多い、８５％もしくはそれより多い、９０％もしくはそれより多い、または９５％もしくはそれより多い全体的な減少を引き起こす能力を意味する。免疫抑制は、免疫細胞の表面上に発現される免疫阻害性受容体およびそのリガンドとのその相互作用によって媒介される。Ｔ細胞活性を測定する方法は、当技術分野で公知である。非限定な例として、Ｔ細胞耐性は、Ｔ細胞を共刺激および／またはイオノマイシンの不在下でリコール抗原、抗ＣＤ３と接触させることによって誘導できる。例えば、ＩＬ－２７、ＬＤＨ－Ａ、ＲＡＢ１０、および／またはＺＡＰ７０（細胞内または分泌型の両方）のレベルをモニタリングして、例えば、Ｔ細胞寛容形成の程度を決定できる（Ｔ細胞耐性の増大と相関するＩＬ－２、インターフェロン－γおよびＴＮＦのレベルを用いて）。
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、Ｔ細胞拡大増殖、活性化および増殖を増強するためにさらに有用である。
処置の方法
ＰＤ－１は、自己免疫、腫瘍免疫および感染免疫の調節において免疫系において重要な役割を果たす。ＰＤ－１媒介性Ｔ細胞阻害は、自己免疫を防ぐ重要な機序である。さらに、がんおよび慢性感染性疾患は、この調節機序を侵害して、免疫抑制を駆動する可能性がある。モノクローナル抗体を含むアンタゴニストを用いてＰＤ－１をブロッキングすることは、がんおよび慢性ウイルス性感染症の処置において研究されてきた。ＰＤ－１の、Ｔ細胞活性化を阻害する能力は、免疫応答を逃れるために慢性ウイルス性感染症および腫瘍によって利用されている。慢性ウイルス性感染症では、ウイルス特異的Ｔ細胞上でＰＤ－１が高度に発現されており、これらのＴ細胞は、「消耗した」ようになり、エフェクター機能および増殖能を失う。
ＰＤ－１欠損動物モデルは、自己免疫性心筋症、関節リウマチおよび移植片対宿主病を含む種々の自己免疫表現型を発症する。具体的には、それらは、高レベルのＩｇＧ２ｂおよびＩｇＡを有し、軽度ループス様自己免疫および拡張型心筋症を発症する。免疫応答をモジュレートするＰＤ－１の役割を考慮すると、ＰＤ－１媒介性免疫抑制が関与する疾患を処置するために、ＰＤ－１シグナル伝達をアンタゴナイズする本明細書において開示される治療剤を投与できる。
免疫調節は、種々の疾患および障害を処置するための有用な治療アプローチである。免疫調節のための１つのアプローチは、免疫ホメオスタシスの維持および自己免疫の防止において重要な役割を果たす免疫活性化のレギュレーターによって１つまたはそれ以上の免疫チェックポイントで介入することである。疾患または障害に応じて、免疫応答を上方制御または下方制御することが望ましい場合がある。非自己抗原を提示する腫瘍細胞は、免疫チェックポイントを活性化するサイトカインまたはリガンドを分泌することによって免疫攻撃を回避することができる。したがって、がん療法では、一般に、腫瘍細胞に対する免疫応答を上方制御することが望ましい。対照的に、自己免疫疾患の処置では、一般に、ある特定の組織において免疫応答を下方制御することが望ましい。
一態様では、本開示は、それを必要とする対象の処置に有用である抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を提供する。
本明細書において記載される方法では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の治療有効量が、それを必要とする哺乳動物投与される。「哺乳動物」という用語は、本明細書において使用される場合、それだけには限らないが、ヒト、実験動物、飼育ペットおよび家畜を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本明細書において記載される「治療有効量」とは、哺乳動物に投与された場合に、所望の治療効果をもたらすのに有効である、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の量を指す。
「対象」とは、それだけには限らないが、ヒトまたはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジもしくはネコなどのような非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物を意味する。個体および患者も、本明細書における対象である。
「処置する」、「処置された」、「処置すること」または「処置」という用語は、本明細書で使用される場合、目的が、望ましくない生理学的状態、障害もしくは疾患を減速すること（減らすこと）である、または有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである治療的処置を指す。本開示の目的上、有益なまたは所望の臨床結果には、それだけには限らないが、症状の軽減；状態、障害または疾患の程度の減少；状態、障害または疾患の状況の安定化（すなわち、悪化しないこと）；状態、障害または疾患の進行の発生の遅延または減速；状態、障害または疾患状況の１つまたはそれ以上の症状の改善；および緩解（部分的であろうと、完全であろうと）が含まれる。処置には、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に重要な応答を引き出すことが含まれる。処置にはまた、処置を受けていない場合に予測される生存と比較して生存を延長することが含まれる。「防止する」、「防止」などの用語は、疾患もしくは障害が発症することを防止するために、または疾患もしくは障害の程度を最小にするために、または発症の過程を減速するために、明白な疾患または障害発生の前に行動することを指す。
一態様では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用して、それだけには限らないが、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性筋疾患、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性じんま疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬の関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎およびウェジナー肉芽腫症を含む自己免疫疾患を患っている対象を処置できる。ある特定の実施形態では、本明細書において開示される活性化抗体を使用して、自己免疫疾患を患っている対象を処置できる。
一態様では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用して、慢性ウイルス性感染症を患っている対象を処置できる。特定の実施形態では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用して、それを必要とする対象において、消耗したＴ細胞をレスキューできる、および／またはウイルス力価を減少できる。ある特定の実施形態では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用して、治療有効用量をそれを必要とする対象に投与することによって慢性ウイルス性感染症を処置できる。一部の実施形態では、対象は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはＢ／Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ／ＨＣＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）によって引き起こされるウイルス性感染症を患っている。
別の態様では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を使用して、それだけには限らないが、腎細胞癌、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、脳がん（例えば、多形性神経膠芽腫）、頭頸部の扁平上皮癌、胃がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫および黒色腫を含む原発性または再発性がんを患っている対象を処置できる。
ある特定の実施形態では、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を、がんまたはウイルス性感染症を患っている対象に治療有効量で投与できる。
疾患または障害の症状または状態のうち１つまたはそれ以上の重症度を緩和または防止または減少させるために、本明細書において開示される１種またはそれ以上の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を投与できる。ある特定の実施形態では、慢性ウイルス性感染症または自己免疫疾患を発症するリスクを低減ために、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を、それを必要とする対象に予防的に投与できる。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質を、がん、自己免疫疾患またはウイルス性感染症を処置するのに有用な当業者に公知の任意の他の薬剤または任意の他の療法との補助療法として使用できる。
併用療法
本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、有利には、追加の治療剤と組み合わせることができる。このような追加の薬剤には、それだけには限らないが、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、増殖阻害剤、抗炎症剤、抗がん剤、抗神経変性剤、免疫抑制剤および抗感染剤が含まれる。抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質と、追加の治療剤の投与は、同時、逐次または断続的であり得る。抗ＰＤ－１抗体もしくはその抗原結合断片または融合タンパク質と、追加の治療剤との投与は、別々である場合も、混合物としての場合もある。さらに、本明細書において提供される処置の方法は、それだけには限らないが、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群を含む１つまたはそれ以上の療法と組み合わせた処置に関連する場合がある。
本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片および融合タンパク質は、それだけには限らないが、腎細胞癌、結腸直腸腸がん、多形性神経膠芽腫、頭頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺がん、結腸がん、卵巣がん、腺癌、前立腺がん、神経膠腫および黒色腫を含む、がんを処置するために使用される１つまたはそれ以上の抗がん薬または療法と相乗的に組み合わせることができる。このような薬剤の例には、それだけには限らないが、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体とともに、ＰＤ－１に対する第２の抗体（例えば、ニボルマブ）、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ １、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトのような「ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ」またはＵＳ７，０８７，４１１に示されるような他のＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブまたはラニビズマブ）またはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ））、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ３）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激受容体に対するアゴニスト（例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質に対するアゴニスト）、腫瘍特異的抗原（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ウイルス薬（例えば、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリンおよび副腎皮質ステロイド）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１およびＣＡ１９－９）に対する抗体、ワクチン（例えば、カルメット・ゲラン菌、がんワクチン）、抗原提示を増大するためのアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体、ＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体）、がんワクチン（例えば、ＭＡＧＥ３、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲｖ３、ＡＬＶＡＣ－ＣＥＡ）、細胞毒、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセルおよびビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線療法、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５のようなサイトカイン、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９－ＤＭ４ ＡＤＣおよび抗ＤＳ６－ＤＭ４ ＡＤＣ）、抗炎症性薬物（例えば、副腎皮質ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬）、抗酸化物質のような栄養補助食品またはがんを処置するための任意の緩和ケア、放射線療法、および／または自己免疫疾患の処置のための免疫細胞上のＦｃ受容体に対する抗体が含まれる。
投与方法
本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質のいずれかを含む治療組成物を、それだけには限らないが、注射、輸注、留置または移植によってを含む任意の好都合な様式で、それを必要とする対象に投与できる。本明細書において記載される組成物は、それを必要とする対象に皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、頭蓋内に、静脈内もしくはリンパ内注射によって、または腹膜内に投与できる。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質は、哺乳動物に、静脈内注入、すなわち、ある特定の期間にわたる抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の哺乳動物の静脈中への導入によって投与される。ある特定の実施形態では、期間は、約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間または約８時間である。
投与レジメン
本開示のこの態様に従う方法は、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の複数用量を対象に逐次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次投与すること」とは、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の各用量が、対象に異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間または数ヶ月）によって隔てられた異なる日に投与されることを意味する。本開示は、患者に本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の単一の初回用量、続いて、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の１つまたはそれ以上の第２の用量、および場合により、続いて、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の１つまたはそれ以上の第３の用量を逐次投与することを含む方法を含む。本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与できる。
ある特定の実施形態では、化合物または組成物の用量が、対象に毎日、隔日で、数日毎に、３日目毎に、週に１回、週に２回、１週間に３回、２週間毎に１回または１ヶ月に１回投与される。他の実施形態では、化合物または組成物の２、３または４用量が、対象に毎日、数日毎に、３日目毎に、週に１回、２週間毎に１回または１ヶ月に１回投与される。一部の実施形態では、化合物または組成物の用量が２日、３日、５日、７日、１４日、２１日または２８日間投与される。ある特定の実施形態では、化合物または組成物の用量が、１ヶ月、１．５ヶ月、２ヶ月、２．５ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月間またはそれ以上投与される。
医薬組成物
別の態様では、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤と一緒に製剤化された、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質の治療有効量を含む薬学的に許容される組成物が提供される。
活性剤の投与量は、使用上の理由、個々の対象および投与様式に応じて変わり得る。投与量は、対象の体重、年齢および対象の健康ならびに化合物または組成物に対する耐性に基づいて調整できる。
活性剤および賦形剤は、当技術分野で公知の方法に従って組成物および剤形に製剤化できる。本明細書において提供される医薬組成物は、例えば、皮下、腫瘍内、筋肉内または静脈内注射による非経口投与に適応させたものを含む固体または液体形態、例えば、滅菌溶液または懸濁液に特別に製剤化できる。
抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片またはその融合タンパク質を含む治療組成物は、１種またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化でき、これは、液体または固体充填剤、希釈剤、担体、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸）、対象への投与のための治療用化合物の運搬または輸送に関与する溶媒またはカプセル化材料、嵩高剤、塩、界面活性剤および／または保存料のような薬学的に許容される材料、組成物または媒体であり得る。薬学的に許容される賦形剤として働くことができる材料の一部の例として以下が挙げられる：ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；ゼラチン；タルク；ワックス；ピーナッツオイル、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油のようなオイル；エチレングリコールおよびプロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；緩衝剤；水；等張性生理食塩水；ｐＨ緩衝溶液；および医薬製剤において用いられる他の非毒性適合性物質。
本明細書において言及されるような嵩高剤は、医薬組成物の質量を増大するために、また凍結乾燥形態で製剤の物理的構造に寄与するために添加される化合物として記載される。嵩高剤の例には、それだけには限らないが、適したマンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。
治療組成物は、場合により、界面活性剤を含み得る。界面活性剤の使用は、再構成されたタンパク質の凝集を低減し得る、および／または再構成された製剤の粒子の形成を低減し得る。本開示に従って使用してもよい、適した界面活性剤の例として、それだけには限らないが、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－またはステアリル－スルホベタイン；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－、またはステアリル－サルコシン；リノレイル－、ミリスチル－、またはセチル－ベタイン；ラウロアミドプロピル－、コカミドプロピル－、リノレアミドプロピル－、ミリストアミドプロピル－、パルミドプロピル－、またはイソステアラミドプロピル－ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピル－、パルミドプロピル－、またはイソステアラミドプロピル－ジメチルアミン；タウ酸メチルココイルナトリウム、またはタウ酸メチルオレイル二ナトリウム；およびポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコールならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニック、ＰＦ６８など）が挙げられる。
本明細書において記載される治療組成物において、保存料を場合により使用してもよい。本明細書において提供される製剤において使用するための適した保存料として、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である、アルキルベンジル－塩化ジメチルアンモニウムの混合物）および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の種類の保存料として、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールのような芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールが挙げられる。
本明細書において記載される治療組成物は、変動濃度の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を有し得る。例えば、組成物は、１０ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ～１３０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ～１２５ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ～１１０ｍｇ／ｍｌまたは８０ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を含み得る。組成物はまた、約１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、治療組成物は、凍結乾燥し、投与の前に再構成するための組成物で提供できる。
診断的使用
本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質を使用して、例えば、診断目的のために試料中のＰＤ－１を検出および／または測定できる。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質をアッセイにおいて使用して、がん、自己免疫疾患または慢性ウイルス性感染症のような疾患または障害を検出できる。ＰＤ－１の例示的診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本開示の抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質と接触させることを含む場合があり、抗ＰＤ－１抗体、その抗原結合断片または融合タンパク質は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＰＤ－１を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用されるか、または代替的に、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて使用される。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは２５ｌのような同位元素；フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンのような蛍光または化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼのような酵素であり得る。試料中のＰＤ－１を検出または測定するために使用できる特定の例示的アッセイとして、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本開示のキットは、本明細書において提供される薬剤、組成物、成分、試薬、投与デバイスまたは機序または他の実体の任意の組合せを含み得る。例えば、本開示のキットは、本明細書において開示される、１つもしくはそれ以上の抗ＰＤ－１抗体もしくは
その抗原結合断片または融合タンパク質と、担体組成物、投与デバイスおよび併用療法剤とのうち１つまたはそれ以上を含み得る。キットは、注射のためのシリンジのような送達を容易にするデバイスまたはそれを必要とする対象への治療組成物の送達を容易にするツールをさらに含み得る。本明細書において提供されるキットのいずれも、投与のための使用説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中に含めることができる。
すべての他の言及された特許および出願は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。さらに、本明細書に参照により組み入れる参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書において提供される用語の定義と不一致であるか、それに反している場合には、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、参照文献中のその用語の定義は適用されない。
本開示は、記載された特定の分子、組成物、方法論またはプロトコールに限定されず、これはこれらが変わる可能性があるからであるということは理解されるべきである。本明細書において記載されるものと同様または同等である任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実行または試験において使用できる。さらに、本明細書における本開示は、このような特定の構成のすべての可能性ある組合せを含むということは理解されるべきである。例えば、特定の構成が、本明細書における本開示または特定の請求項の特定の態様または実施形態の文脈において開示される場合には、本開示の他の特定の態様および実施形態と組み合わせて、および／または本開示の他の特定の態様および実施形態の文脈において、ならびに全般的に本開示において、その構成も可能な限り使用できる。
２つまたはそれより多い定義された工程を含む方法が本明細書において言及される場合には、定義される工程は、列挙されるとおりの順序で、または任意の順序で、または同時に（文脈がその可能性を排除する場合を除いて）実施でき、方法は、定義される工程のいずれかの前に、定義される工程の２つの間に、または定義される工程すべての後に実施される、１つまたはそれ以上の他の工程を含み得る（文脈がそれらの可能性を排除する場合を除いて）。
本開示のより良好な理解を容易にするために、特定の実施形態の以下の実施例を示す。以下の実施例は、本開示の全範囲を制限または規定すると読まれるべきではない。
Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｂｉｏ ＳｕｐｅｒＨｕｍａｎ ２．０ Ｉｎｃ．ライブラリーからの抗ＰＤ－１抗体の同定
ｈＰＤ－１－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＮ末端に融合されたヒトＩｇＶドメイン；溶液中で二量体として存在する）またはｈＰＤ－１－ｈｉｓ（６個のヒスチジンペプチドのＮ末端に接続されたＰＤ－１のヒトＩｇＶドメイン；溶液中で単量体として存在する）を、抗ｈｉｓ抗体または抗ｈＦｃ抗体でコーティングされたイムノチューブ上に固定化した。ビオチン標識ｈＰＤ－１－ｈｉｓをストレプトアビジンがコンジュゲートされた磁性ビーズによって捕捉した。ファージライブラリーを３％ ＰＢＳミルクでブロッキングし、抗原でコーティングされたチューブに添加するか、または抗原でコーティングされたビーズと混合し、室温で０．５～１時間インキュベートして、ファージが固定化抗原に結合することを可能にした。結合していないファージを洗浄除去し、一方で結合しているファージをトリエチルアミン（ｐＨ＞１１）を用いて溶出した。中和されたファージを使用して、対数期の大腸菌に感染させ、これを３０℃で一晩増殖させた。回収した細菌を使用して、次のラウンドのパニングのためにファージを増幅させた。
ファージライブラリーから単離された選択されたｓｃＦｖ抗体の重および軽鎖可変ドメインを、ＰＣＲによって増幅させ、エフェクター機能が除去されている改変ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含有する哺乳動物発現ベクター中に挿入した。ＨＥＫ２９３細胞において全長ＩｇＧ抗体を発現させ、プロテインＡによって精製した。精製された抗１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１（配列番号１～４８、表２５を参照されたい）を、結合（可溶性および細胞によって発現されたＰＤ－１）およびブロッキングアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ動態解析およびＳＥＢによって刺激されたヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌によって特性決定した。
より高親和性の抗体を同定するために、それぞれ、リード抗体２３Ｈ９または２４Ｈ９の重鎖を、Ｒ１パニングからの軽鎖混合物と組み合わせることによって、２つの軽鎖シャッフリングライブラリーを構築した。より制限された条件でのパニングによってより高親和性のおよび／またはより安定なバリアントを同定した。これらの成熟抗体をＩｇＧに変換し、発現させ、精製し、再度特性決定した。ＣＨＯ細胞においてより高親和性のクローンを発現させ、さらなる研究を実行するために、プロテインＡおよびＳＥ－ＨＰＬＣによって精製して、より高い品質を得た。２３Ｈ９の重鎖を使用する軽鎖シャッフリングによって抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３３Ｇ８、３４Ｃ１（配列番号４９～６５、表２５を参照されたい）を得た。２４Ｈ９の重鎖を使用する軽鎖シャッフリングによって抗体３２Ａ１１、３２Ｄ１１、３２Ｄ２、３２Ｇ６、３８Ａ１０、３８Ａ１１、３８Ａ４、３８Ａ６、３８Ａ８、３８Ｂ１、３８Ｂ１０、３８Ｂ２、３８Ｃ１１、３８Ｃ６、３８Ｇ１１、３８Ｇ９、３８Ｈ３、３９Ａ３、３９Ｂ１１、３９Ｂ３、３９Ｂ６、３９Ｆ１１、３９Ｇ５、３９Ｇ８、３９Ｈ１１、３９Ｈ２および３９Ｈ７（配列番号６６～１３８、表２５を参照）を得た。
図１は、本明細書において生成された例示的抗体の配列アラインメントを表す。表２５は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ定義に従う選択された抗ＰＤ－１抗体の重および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。この実施例の方法に従って生成された例示的抗体の生物学的特性は、以下に示される実施例において詳細に説明される。
ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体は、ｈＰＤ－１に結合する
抗ｈＰＤ１抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９、２３Ａ１１（ＨＥＫ２９３細胞から単離された）の、ｈＰＤ１に結合する能力を、一次抗体として示された抗体を使用する用量反応結合ＥＬＩＳＡを使用して評価した。このために、高結合（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ）プレートを、ヒトＰＤ－１－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１０８６－ＰＤ－０５０）を用いて直接的にコーティングした。ビオチン標識されたｈＰＤ－１－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）を、１日前にプレート上にコーティングされたストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ０１６－０００－１１４）または抗ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ０５０－１００）によって捕捉した。抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１の段階希釈を、抗原がコーティングされたプレートに添加し、室温で１～２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％）を用いてプレートを３回洗浄した後、１／５０００～１／１０，０００希釈した抗ｈＦａｂ－ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９－０３６－０９７）をプレートに添加し、これを室温で１時間インキュベートした。ＴＭＢ製の基質ＡとＢと（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号５１２０－００５０）の１：１希釈物を添加すること、続いて、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて中和することによって色を発色させた。ＴＥＣＡＮプレートリーダーを使用してＯＤ４５０を読み取った（表１）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して、ＯＤ４５０読取りの平均±Ｓ．Ｄ．を対数抗体濃度に対してプロットした。対数（アゴニスト）対反応（３パラメーター）または対数（アゴニスト）対反応－変化のある傾斜（４パラメーター）（図２）をプロットすることによってＥＣ５０値を算出した。図２中のデータ点は、２連の定量の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ヒトＰＤ－１－Ｆｃに結合された場合には、６種の抗体すべてが、同様のＥＣ５０およびＯＤ４５０（１０ｎＭ）値を示したが、ＰＤ－１－ｈｉｓに結合された場合には、異なるＥＣ５０およびＯＤ４５０（１０ｎＭ）値を示した（表１）。抗体２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９は、他の抗体と比較して、ｈＰＤ－１－ｈｉｓに優れた結合を示した（図２）。ＰＤ－１－ｈｉｓへのそれらの結合に基づいて３種のリード抗体－２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９を選択した（表１および図２）。
Figure 0007644151000001
ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体は、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする。抗ｈＰＤ１抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９、２３Ａ１１（ＨＥＫ２９３細胞から単離された）の、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする能力を調べるために、高結合（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ）プレートを、それぞれヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１５６－Ｂ７－１００）またはＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１２２４＿ＰＬ）を用いてコーティングし、３％ ＰＢＳミルクを用いてブロッキングした。抗体１９Ｂ６、１９Ｂ１０、２３Ａ８、２３Ｈ９、２４Ｈ９および２３Ａ１１の段階希釈を、０．５μｇ／ｍｌ（最終濃度）のビオチン標識されたｈＰＤ－１－Ｆｃと混合し、室温で１時間インキュベートした。混合物をＰＤ－Ｌ１－ＦｃまたはＰＤ－Ｌ２－Ｆｃでコーティングされたプレートに移し、室温でさらに１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％）を用いて３回洗浄した後、プレートに１／５０００～１／１０，０００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号２１１４０）を添加し、これを室温で約１時間インキュベートした。ＴＭＢ製の基質ＡとＢとの１：１希釈物を添加すること、続いて、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて中和することによって色を発色させた。ＴＥＣＡＮプレートリーダーを使用してＯＤ４５０を読み取った（表２）。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して、ＯＤ読取りの平均±Ｓ．Ｄ．を対数抗体濃度に対してプロットした。対数（アゴニスト）対反応（３パラメーター）または対数（アゴニスト）対－反応変化のある傾斜（４パラメーター）を分析することによってＥＣ５０値を算出した。２連の定量のデータ点は、平均±Ｓ．Ｄ．である（図３）。６種の抗体はすべて、ヒトＰＤ－Ｌ１へのｈＰＤ－１－Ｆｃ結合をブロッキングし、異なるＩＣ５０値を有するとわかった（表２および図３）。６種の抗体はすべて、ｈＰＤ－Ｆｃに対して極めて類似した親和性を有する。しかし、抗体２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９は、他の抗体と比較して、ｈＰＤ－１－ｈｉｓに対して優れたブロッキング活性を示した（表２および図３）。３種のリードクローン２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９は、それぞれ３０および３．３ｎＭの抗体の存在下で＞９３％の阻害および≧７０％の阻害を示した（表２および図３）。
Figure 0007644151000002
ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体は、ヒトＰＤ－１を発現する細胞に結合する
抗ＰＤ－１抗体の、ヒトＰＤ－１を過剰発現するＨＥＫ２９３およびＪｕｒｋａｔ細胞への結合：細胞を、１０％熱不活性ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給した、グルタミンを含むＩＭＤＭ培地で培養した。細胞をまず、示された抗ＰＤ－１抗体とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｒ－フィコエリトリンがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９－１１６－０９８）とともにインキュベートした。フローサイトメトリーＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ（商標）ＨＴサンプリングフローサイトメーター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ｈＰＤ－１に結合する抗体を決定した。図４中のデータ点は、２連の定量の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。抗体２３Ａ８、２３Ｈ９および１９Ｂ１０は、 ＨＥＫ２９３細胞に対して最強の結合を示し、抗体２３Ａ８、２４Ｈ９および１９Ｂ１０は、最高平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した（表４および図４）。
抗ＰＤ－１抗体の、ＳＥＢ活性化ヒトＰＢＭＣへの結合：製造業者の使用説明書を使用してＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＬｅｕｋｏＰａｋ（単球、リンパ球、血小板、血漿および赤血球を含む高濃度の血液細胞を含有する濃縮白血球アフェレーシス）からＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、１０％ ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｙＣｌｏｎｅ）を補給したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１２ウェルプレート中で２×１０６個／ｍＬで培養し、１μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）、Ｓｉｇｍａ）によって３～４日間活性化した。活性化されたＰＢＭＣをまず、示された抗ＰＤ－１抗体とともにインキュベートし、続いて、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｒ－フィコエリトリンがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈカタログ番号１０９－１１６－０９８）と、抗ヒトＣＤ４－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ４カタログ番号１７－００４９－４２）または抗ヒトＣＤ８－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ８カタログ番号１７－００８８－４２）のいずれかの組合せとともにインキュベートした。細胞上に発現されたＰＤ－１に結合する抗体を、Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ（商標）ＨＴサンプリングフローサイトメーター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して評価した。データ点は２連の定量の平均±Ｓ．Ｄ．を算出することによって生成した（表３および図４）。抗体１９Ｂ６、２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９は、試験した抗体の間ＰＢＭＣへの結合について最高ＭＦＩおよび最低ＥＣ５０を示し、さらなる特性決定のために選択した（表３および図４）。
Figure 0007644151000003
ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体は、細胞間ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を撹乱する
選択された抗ＰＤ－１抗体の、ＰＤ－１を発現する細胞のＰＤ－Ｌ１を発現する細胞への結合を撹乱する能力を評価するために、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを使用した。このアッセイは、２種の遺伝子操作された細胞株、ＰＤ－１エフェクター細胞およびＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞からなる。同時培養すると、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用がＴＣＲ媒介性発光を阻害する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用が撹乱されると、ＴＣＲ活性化が発光を誘導し（ＮＦＡＴ経路の活性化によって）、これをＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬の添加およびルミノメーターを用いる定量化によって検出できる。
実験は、製造業者の使用説明書に従って実施した。手短には、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞をプレーティングし、１６～２０時間インキュベートし、その後、漸増濃度の抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－１エフェクター細胞を添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、ＴＥＣＡＮプレートリーダーを使用して発光（相対光単位、ＲＬＵとして記録される）を測定した。誘導倍数を、ＲＬＵ（誘導されたもの－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）によって算出した。データ点は、２連の定量の平均±Ｓ．Ｄ．として表されている（図５）。抗体１９Ｂ６、２３Ａ８、２３Ｈ９および２４Ｈ９は、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングし、異なるＥＣ５０および誘導倍数を有していた（表４および図５）。
Figure 0007644151000004
軽鎖シャッフリングのために抗体２３Ｈ９および２４Ｈ９を選択し、２３Ｈ９または２４Ｈ９の重鎖をそれぞれ、軽鎖のライブラリーと対形成した。抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３３Ｇ８、３４Ｃ１（配列番号４９～６５、表２５を参照されたい）が、２３Ｈ９の重鎖を使用する軽鎖シャッフリングによって得られた。抗体３２Ａ１１、３２Ｄ１１、３２Ｄ２、３２Ｇ６、３８Ａ１０、３８Ａ１１、３８Ａ４、３８Ａ６、３８Ａ８、３８Ｂ１、３８Ｂ１０、３８Ｂ２、３８Ｃ１１、３８Ｃ６、３８Ｇ１１、３８Ｇ９、３８Ｈ３、３９Ａ３、３９Ｂ１１、３９Ｂ３、３９Ｂ６、３９Ｆ１１、３９Ｇ５、３９Ｇ８、３９Ｈ１１、３９Ｈ２および３９Ｈ７（配列番号６６～１３８、表２５を参照されたい）が、２４Ｈ９の重鎖を使用する軽鎖シャッフリングによって得られた。
抗ｈＰＤ－１抗体２３Ｈ９およびその誘導体は、ｈＰＤ－１に結合し、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする
抗ｈＰＤ１抗体２３Ｈ９およびその誘導体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３３Ｇ８および３４Ｃ１の、ｈＰＤ１に結合し、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする能力を、実施例２および３にそれぞれ記載されたプロトコールを使用して決定した。親抗体２３Ｈ９およびその誘導体は、ｈＰＤ－１－Ｆｃおよびストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン－ｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合において有意差を示さなかった（表５および図６Ａ）。しかし、すべての誘導体は、抗ｈｉｓによって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合において、およびｈＰＤ－１－Ｆ／ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの相互作用のブロッキングにおいて、その親２３Ｈ９よりも強力であった（表５および図６Ｂ）。２つのクローン（３１Ｂ１および３３Ｃ４）をさらなる特性決定のために選択した（表５）。
Figure 0007644151000005
抗ｈＰＤ－１抗体２４Ｈ９およびその誘導体は、ｈＰＤ－１に結合し、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする
抗ｈＰＤ１抗体２４Ｈ９およびその誘導体３２Ａ１１、３２Ｄ２、３２Ｄ１１、３８Ａ６、３８Ａ１０、３８Ａ１１、３８Ｂ２、３８Ｃ１１、３９Ｂ３、３９Ｂ１１、３９Ｇ８および３８Ｈ１１の、ｈＰＤ１に結合し、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする能力を、実施例２および３にそれぞれ記載されたプロトコールを使用して決定した。親抗体２４Ｈ９およびその誘導体は、ストレプトアビジンによって捕捉されたｈＰＤ－１－ＦｃおよびｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合において有意差を示さなかった（図７）。しかし、すべての誘導体は、抗ｈｉｓによって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合およびｈＰＤ－１－Ｆｃ－ｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃの相互作用のブロッキングにおいて親２４Ｈ９よりも強力であるとわかった（図７）。
２つのクローン（３８Ａ６および３８Ｂ２）をさらなる特性決定のために選んだ（表６）。
Figure 0007644151000006
２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体の結合プロファイルは、これらの抗体が異なる結合エピトープに結合することを示す
２３Ｈ９、３１Ｂ１、３３Ｃ４、２４Ｈ９、３８Ａ６および３８Ｂ２を使用する用量反応結合アッセイを、実施例４に開示されるプロトコールに従って実施した。結果は、図８に示されている。２３Ｈ９誘導体および２４Ｈ９誘導体は、その親抗体よりもＰＤ－１発現細胞への結合においてより強力であるとわかった（表７）。さらに、２３Ｈ９誘導体および２４Ｈ９誘導体は、異なる結合プロファイルを示し、それらが異なる結合エピトープに結合することを示した（図８）。
Figure 0007644151000007
抗体２３Ｈ９、２４Ｈ９およびその誘導体は、細胞間ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を撹乱する
ＰＤ－１遮断バイオアッセイを、抗体２３Ｈ９、３１Ｂ１、３３Ｃ４、２４Ｈ９、３８Ａ６および３８Ｂ２を使用し、実施例５に概説されたプロトコールに従って実施した。すべての誘導体が、ｈＰＤ－１－ｈＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングにおいて、その親抗体２３Ｈ９および２４Ｈ９よりも強力であるとわかった（図９）。３８Ｂ２および３１Ｂ１は、試験した６種の抗体の間で最低ＥＣ５０および最大誘導倍数を示すとわかった（表８および図９）。
Figure 0007644151000008
ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生に対する抗ＰＤ－１抗体の効果
ドナーＦＡ由来のＳＥＢ活性化ＰＢＭＣにおける３８Ａ６、３８Ｂ２、３１Ｂ１および３３Ｃ４を使用するサイトカイン産生に対する抗ＰＤ－１抗体の効果を、培養培地においてＰＢＭＣによって放出されたサイトカインの量を測定することによって評価した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の使用説明書によって使用して、ＬｅｕｋｏＰａｋ（単球、リンパ球、血小板、血漿および赤血球を含む高濃度の血液細胞を含有する濃縮白血球アフェレーシス）からＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、１０％ ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｙＣｌｏｎｅ）を補給したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する９６ウェルプレート中のウェルあたり１×１０５個で培養した。細胞を０．０１μｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｓｉｇｍａ）によって２日間活性化した。Ｄｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の使用説明書によって使用するＩＬ－２の測定のために上清を収集した（図１０Ａ）。
実験を反復して、ドナーＥＡ由来のＰＢＭＣを使用して抗体２３Ｈ９、３１Ｂ１、２４Ｈ９および３８Ｂ２のＥＣ５０値を得た（図１０Ｂ）。
ＩＬ－２濃度は、すべての抗体の存在下で用量依存的に増大した（図１０Ａ、１０Ｂ）。ＩＬ－２濃度は、２３Ｈ９誘導体３１Ｂ１および２４Ｈ９誘導体３８Ｂ２の存在下で増大し、これは、その親抗体２３Ｈ９および２４Ｈ９それぞれよりも強力であるとわかった（表９および図１０Ｂ）。
Figure 0007644151000009
選択された２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体のＢｉａｃｏｒｅ解析
抗体のｈＰＤ－１－ＦｃまたはｈＰＤ－１－ｈｉｓのいずれかに対する結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ヒトＰＤ－１－ＦｃまたはＰＤ－１－ｈｉｓタンパク質を、標準アミンカップリング化学を使用してｐＨ５でＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。抗体２３Ｈ９および２３Ｈ９誘導体３１Ｂ１、３３Ｃ４ならびに２４Ｈ９および２４Ｈ９誘導体３８Ａ６、３８Ｂ２、３２Ｄ１１、３９Ｇ８、３８Ａ１０および３８Ａ１１を、ランニングバッファーとして１Ｘ ＨＢＳＥＰを使用して固定化表面上に１．５～１００ｎＭの範囲の濃度で３０μｌ／分で注入した。接触時間（会合相）は３分とした。解離時間は６～１０分とした。３０秒間３０μｌ／分の流速で２０ｍＭ ＨＣｌの注入を用いて、各結合サイクル後に再生を実施した。各濃度でセンサーグラムを得、導かれた曲線をＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした。誘導体３１Ｂ１および３３Ｃ４は、ｈＰＤ－１－Ｆｃとのその結合において親２３Ｈ９より強力であるとわかった（表１０）。２４Ｈ９のすべての誘導体は、ｈＰＤ－１－ｈｉｓおよびｈＰＤ－１－Ｆｃへのその結合において親抗体２４Ｈ９よりも強力であるとわかった。
Figure 0007644151000010
示差走査熱量計（ＤＳＣ）による選択された２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体の熱安定性測定
ＷｕＸｉ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓによってＷｕＸｉの哺乳動物発現ベクターおよびＣＨＯノックアウト細胞株を使用することによって、選択された２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体、３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６および３８Ｂ２をクローニングし、発現させた。すべての抗体を、プロテインＡおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣを使用して精製した。プロテインＡおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣ精製後に２０ｍｌの培養物から２．５ｍｇより多い精製抗体が得られた。すべての抗体の単量体パーセンテージは、１．０ＥＵ／ｍｇより低いエンドトキシンレベルを用いて９６％を上回っていた。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、４つの抗体の安定性を決定した。Ｍａｌｖｅｎ ＤＳＣシステムを使用してＤＳＣ分析を実施した。タンパク質試料をまず、分析の前に製剤化バッファーを用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈した。４００μｌのそれぞれの製剤化バッファーを、参照として９６ウェルプレートに添加し、４００μＬのタンパク質試料を添加した。試料を、キャピラリーＤＳＣシステムにおいて９０℃／時間の加熱速度で１０℃から１００℃に加熱した。供給業者のソフトウェアを使用してＤＳＣ結果（Ｔｍ開始およびＴｍ値）を分析した。３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６および３８Ｂ２の最低熱転移中間点（Ｔｍ１）は、それぞれ７０．５、７４．０、７１．０および７１．９℃であった（図１１Ａ）。すべての抗体の単量体パーセンテージは、１．０ＥＵ／ｍｇよりも低いエンドトキシンレベルを用いて９６％を上回っていた（表１１）。３３Ｃ４および３８Ｂ２は、試験されたすべての抗体のうち最も熱安定性であるとわかった（表１１）。
Figure 0007644151000011
選択された２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体は、ｈＰＤ－１に結合し、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１およびｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ２相互作用をブロッキングする
それぞれ実施例２および３において概説されたプロトコールを使用して、一過性ＣＨＯｋ細胞から単離された抗体３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６、３８Ｂ２を使用して、結合およびブロッキングＥＬＩＳＡを実施した。結合ＥＬＩＳＡを使用する抗体の比較によって、ｈＰＤ－１－Ｆｃ、ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン標識ｈＰＤ－１ｈｉｓおよびプレートに直接的に結合された抗ｈｉｓ 抗体によって捕捉されたｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合において誘導体間で有意差は示されなかった（図１２Ａ～Ｃ）。しかし、３８Ｂ２および３８Ａ６（両方とも２４Ｈ９誘導体）のＥＣ５０は、３１Ｂ２および３３Ｃ４（両方とも２３Ｈ９誘導体）よりも低く、両対照よりも優れていた（表１２および図１２Ａ～Ｃ）。
ブロッキングＥＬＩＳＡを使用する抗体の比較によって、ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－１およびｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ２相互作用のブロッキングにおいて誘導体間に有意差は示されなかった（図１２Ｄ～Ｅ）。しかし、結合ＥＬＩＳＡと同様に、抗体３８Ａ６および３８Ｂ２（両方とも２４Ｈ９誘導体）は、特に、ｈＰＤ－１へのｈＰＤ－Ｌ２結合の阻害について３１Ｂ２および３３Ｃ４（両方とも２３Ｈ９誘導体）よりも強力であるとわかった（表１３および図１２Ｄ～Ｅ）。
Figure 0007644151000012
Figure 0007644151000013
３３Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６および３８Ｂ２を使用する用量反応結合アッセイ
実施例４において概説されたプロトコールを使用し、抗体３３Ｂ１、３３Ｃ４（両方とも２３Ｈ９誘導体）、３８Ａ６および３８Ｂ２（両方とも２４Ｈ９誘導体）を使用して、用量反応結合アッセイを実施した。
用量反応結合アッセイは、抗体の、ｈＰＤ－１がトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３およびＪｕｒｋａｔ細胞ならびにＳＥＢ活性化ＰＢＭＣへの結合において、同一の親抗体に由来する２種の誘導体間で差を示さなかった（表１４および図１３）。しかし、異なる親抗体に由来する誘導体は、異なる細胞株への結合の差を示し、２３Ｈ９誘導体および２４Ｈ９誘導体が異なる結合エピトープを有することを示唆する（表１４および図１３）。
Figure 0007644151000014
選択された２３Ｈ９および２４Ｈ９誘導体は、高親和性でｈＰＤ－１に結合する
選択された抗体の、ｈＰＤ－１ ｈｉｓおよびｈＰＤ－１Ｆｃへの結合を、ＳＰＲによって決定した。３１Ｂ１、３３Ｃ４、３８Ａ６および３８Ｂ２のＢｉａｃｏｒｅ解析を、実施例１１に記載されたプロトコールを使用して実施した。４種の抗体すべてが、ｈＰＤ－１－ＦｃおよびｈＰＤ－１－ｈｉｓの両方に対して高親和性を有するとわかった（表１５および図１４）。しかし、２３Ｈ９の２種の誘導体の間で、３１Ｂ１は、ＰＤ－１－ＦｃおよびＰＤ－１－ｈｉｓへの両結合において３３Ｃ４よりも強力であるとわかった（表１５）。２４Ｈ９の２種の間で、３８Ｂ２は、ｈＰＤ－１－Ｆｃへの結合において３８Ａ６よりもわずかにより強力であるとわかり、ｈＰＤ－１－ｈｉｓへの結合において有意差を示さなかった。３１Ｂ１および３８Ｂ２の両方とも、２種の対照よりも優れているとわかった（表１５）。
Figure 0007644151000015
抗体３１Ｂ１および３８Ｂ２は、細胞間ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用３１Ｂ１および３８Ｂ２を撹乱する
３１Ｂ１および３８Ｂ２の、ＰＤ－１を発現する細胞のＰＤ－Ｌ１を発現する細胞への結合を撹乱する能力を評価するために、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイを、実施例５において記載されたプロトコールを使用して実施した。３１Ｂ１および３８Ｂ２の間でＥＣ５０および誘導倍数において有意差は観察されなかった（図１５）。３１Ｂ１および３８Ｂ２の両方とも、対照Ｂ（商品名オプジーボで販売される、ニボルマブ）に対して優れており、対照Ｍ（商品名キイトルーダで販売される、ペムブロリズマブ）に対して同様であるとわかった（表１６）。
Figure 0007644151000016
ＳＥＢ活性化されたＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生に対する３１Ｂ１および３８Ｂ２の効果
ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生に対する３１Ｂ１および３８Ｂ２の効果を、実施例４において概説されたプロトコールを使用して決定した。３８Ｂ２は、３１Ｂ１および試験した２種の対照抗体よりも強力であるとわかった（表１７および図１６）。
Figure 0007644151000017
Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｂｉｏ ＳｕｐｅｒＨｕｍａｎ ２．０ Ｉｎｃ．ライブラリーからのヒトおよびマウスと交差反応する抗体の単離
マウスおよびヒトＰＤ－１の両方に結合するＰＤ－１抗体を、実施例１において概説されたプロトコールを使用し、ｍＰＤ－１－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１ＦｃのＮ末端に融合するマウスＩｇＶドメイン；溶液中で二量体として存在する）またはｍＰＤ－１－ｈｉｓ（６個のヒスチジンのＮ末端に接続されたＰＤ－１のマウスＩｇＶドメイン；溶液中で単量体として存在する）を使用して単離した。
Ｒ３Ａ９のＶＨ鎖を使用する軽対シャッフリングによる抗ｍＰＤ－１抗体Ｒ３Ａ９（配列番号１３９～１４６）の誘導体。Ｒ３Ａ９およびその誘導体（例えば、配列番号１４７～１６７を参照されたい）を選択して、さらに開発した。ＷｕＸｉ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓによってＷｕｘｉの哺乳動物発現ベクターおよびＣＨＯノックアウト細胞株を使用して、抗体をクローニングし、発現させた。抗体をプロテインＡおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣによって精製した。プロテインＡ精製後に２０ｍｌの培養物から２．５ｍｇより多い精製抗体が得られた。抗体をＳＥＣ－ＨＰＬＣによってさらに精製した。
この実施例の方法に従って生成された選択された抗体の生物学的特性は、以下に示される実施例において詳述される。図１および表２５は、選択された抗ｍＰＤ－１抗体の重および軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列を提供する（Ｋａｂａｔ番号付け）。
抗ｍＰＤ－１抗体Ｒ３Ａ９およびその誘導体は、ｍＰＤ－１に結合し、ｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１相互作用をブロッキングする
実施例２および３において概説されたようなプロトコールを使用し、Ｒ３Ａ９およびその誘導体を使用して、用量反応結合およびブロッキングＥＬＩＳＡを実施した。抗体の、ｍＰＤ－１を発現する細胞への結合は、実施例４に記載されるように実施した。細胞間ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断は、実施例５において記載されたＰｒｏｍｅｇａバイオアッセイを使用して調べた。結果は、図１７に示されている。
Ｒ３Ａ９誘導体ｍ３Ａ７は、可溶性の細胞によって発現されたｍＰＤ－１への結合およびｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１相互作用のブロッキングの両方において親Ｒ３Ａ９抗体よりも強力であるとわかった（表１８）。
Figure 0007644151000018
Ｒ３Ａ９誘導体ｍ２Ｃ１、ｍ２Ａ１、ｍ４Ｄ１およびｍ３Ａ７は、ヒトおよびマウスＰＤ－１に結合する
それぞれ実施例２および３において概説されたプロトコールを使用して、抗体について用量反応結合およびブロッキングＥＬＩＳＡを実施した。実験は、すべてのＲ３Ａ９誘導体がｈＰＤ－１およびｍＰＤ－１の両方に強力に結合し（図１８Ａ～Ｃ）、ｈＰＤ－Ｌ１－ｈＰＤ－１およびｍＰＤ－Ｌ１／ｍＰＤ－１相互作用をブロッキングする（図１８Ｄ～Ｅ）と示した。表１９は、試験した抗体のＥＣ５０／ＩＣ５０データを提供する。
Figure 0007644151000019
Ｒ３Ａ９は、ヒトまたはマウスＰＤ－１を発現する細胞に結合する
Ｒ３Ａ９およびそのＲ３Ａ９誘導体ｍ２Ａ１、ｍ２Ｃ１、ｍ４Ｄ１、ｍ３Ａ７の、ＰＢＭＣ細胞への結合を、実施例４において概説されたプロトコールを使用して試験した。さらに、実施例１１において提供されたプロトコールを使用して、この実施例において開示されたすべての抗体でＢｉａｃｏｒｅ解析を実施した。
３種の誘導体ｍ４ｄ１、ｍ２Ａ１およびｍ３Ｃ１のみが、細胞で発現されたヒトおよびマウスＰＤ－１の両方に結合するとわかった（表２１および図１９）。細胞結合（表２０）およびＢｉａｃｏｒｅ解析（表２０）に基づいて、ｍ４Ｄ１は、試験した他の２種の抗体（表２０および図１９）と比較して結合特性の改善を示すとわかった。
Figure 0007644151000020
Figure 0007644151000021
ｍ４Ｄ１を、３８Ｂ２およびｍ３Ａ７と比較するＰｒｏｍｅｇａ（ｈ／ｍ）ＰＤ－１／（ｈ／ｍ）ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイ
実施例４において概説されたプロトコールを使用して、Ｐｒｏｍｅｇａ遮断バイオアッセイを実施して、ｍ４Ｄ１、ｍ３Ａ７および３８Ｂ２の、細胞間ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を撹乱する効力を比較した。結果は、図２０に表されている。
ｍ４Ｄ１は、ｈＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１相互作用の両方をブロッキングするとわかった。さらに、ｍ４Ｄ１は、ｍＰＤ－１／ｍＰＤ－Ｌ１遮断アッセイにおいてｍ３Ａ７と同程度に強力であり、効力が３８Ｂ２の３分の１であるとわかった（図２０）。
抗ｍＰＤ１－または抗ｈＰＤ－１抗体、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインを含む融合タンパク質
抗体ｍ３Ａ７（ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５と呼ばれる）を含む抗ｍＰＤ－１融合抗体を、ＩＬ－１５Ｒαのｓｕｓｈｉ－ドメインおよびＩＬ－１５ポリペプチドを、抗体のＣ末端またはＮ末端のいずれかに付加することによって操作した。ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインの、ヒンジ領域の部分、リンカー１およびＩＬ－１５とともの融合物は、「ＳＤ１５」と呼ばれる。ＳＤ１５ドメインの一例については、表２５中の配列番号１７４、太字で強調されたＳＤ１５ドメインを参照されたい。
融合タンパク質の第１のバージョンでは、ＳＤ１５ドメインを、１つのみのＩｇＧ１ ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合した（「１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５」と表される）。
第２のバージョンでは、ＳＤ１５ドメインを、両方のＩｇＧ１ ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合した（「２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５」と表される）。
融合タンパク質の第３のバージョンでは、ＳＤ１５ドメインを、第２のリンカーを介して１つのみのＶＨドメインのＮ末端に連結した（「１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５」と表される）。
融合タンパク質の第４のバージョンでは、ＳＤ１５ドメインを、第２のリンカーを介して両方のＶＨドメインのＮ末端に連結した（「２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５」と表される）。
上記の第４の構築物では、軽鎖は、従来の抗体のものであった。補体結合および固定ならびにＦｃ－γ依存性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を排除するために、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）を両方のＣＨ２ドメインに導入した。
さらに、ヘテロ二量体融合物については、突然変異を重鎖の定常領域中に導入し、アミノ酸置換は、以下の群：（１）ＣＨ３－１：Ｔ３６６Ｙ（「ノブ」）；ＣＨ３－２：Ｙ４０７Ｔ（「ホール」）、（２）ＣＨ３－１：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ（「ノブ」）；ＣＨ３－２：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ（「ホール」）および（３）ＣＨ３－１：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ（「ノブ」）；ＣＨ３－２：Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ（「ホール」）のうち１つから選択した。
融合抗体は、ＣＨＯｋ１細胞において一過性に発現させた。プロテインＡおよびＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いる精製後に少なくとも９５％の純度の単量体が得られた。抗体３８Ｂ２を含む抗ｈＰＤ－１／ＩＬ－１５融合抗体（本明細書において３８Ｂ２－ｈＳＤ１５または３８Ｂ２／ＩＬ－１５として記載される）の４つの対応するバージョン－１Ｃ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、２Ｃ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、１Ｎ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、２Ｎ＿－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５－を、同一手順に従って作出した。ＩＬ－１５配列の６５位にアミノ酸置換を有する１Ｎ＿３８Ｂ２－ＳＤ１５の３つの対応するバージョン、６５Ａ＿１Ｎ＿３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、６５Ｄ＿１Ｎ＿３８Ｂ２－ｈＳｄ１５および６５Ｓ＿１Ｎ＿３８Ｂ２－ｈＳＤ１５を同一手順を使用して作出した。
対照融合抗体（ＤＰ４７／ＩＬ－１５）の４つの対応するバージョン、１Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５を、同一手順に従って作出した。ＤＰ４７を非標的化対照抗体として使用した。抗体配向を示す模式図が図２１に示されている。
ｍＰＤ－１／ＩＬ－１５融合分子は、マウスＰＤ－１に結合し、ｍＰＤ－１とｍＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロッキングする
融合タンパク質１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５の、ｍＰＤ－１に結合し、ｍＰＤ－１とｍＰＤ－Ｌ１との間の相互作用をブロッキングする能力を、それぞれ実施例２および３において記載されたプロトコールに従って評価した。
４つの異なる分子の間で、結合およびブロッキング能に有意差は観察されなかった（表２２および図２２）。
Figure 0007644151000022
マウスリンパ球ＣＴＬＬ２およびＣ５７ＢＬ６脾臓細胞のＩＬ－２依存性細胞増殖刺激に対するｍＰＤ－１／ＩＬ－１５融合分子の効果
ＣＴＬＬ２培養および増殖アッセイ：マウスＴリンパ球細胞株ＣＴＬＬ２を、１０％熱不活化ＦＢＳおよび１０％ＩＬ－２サプリメント（ＣｏｎＡを含むＴ細胞培養サプリメント、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補給したＩＭＤＭ培地で培養した。この実施例では以下の融合タンパク質を試験した：１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５。１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５およびｍ３Ａ７を対照として使用した。
抗体または融合タンパク質の段階希釈を９６ウェルプレートに添加し、次いで、細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補給したＩＭＤＭ培地においてウェルあたり２．５×１０４個で播種した。細胞を３７℃で３～５日間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存力アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞増殖を検出した。
マウス脾臓細胞単離および増殖アッセイ：Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓を、７０μｍのセルストレーナーによってＩＭＤＭ培地中でホモジナイズした。１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を脾臓細胞に添加し、時折振盪しながら３分間静置し、次いで、５倍体積のＰＢＳバッファーで希釈した。ＰＢＳバッファーで洗浄した後、直ちに増殖アッセイのために、１０％熱不活化ＦＢＳを補給した完全ＩＭＤＭ培地で脾細胞細胞懸濁液を調製した。この実施例では以下の融合タンパク質を試験した：１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５。１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、２Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５、１Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５および２Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５を対照として使用した。
融合タンパク質および対照の段階希釈を９６ウェルプレートに添加し、次いで、細胞を、ウェルあたり１×１０５個で播種した。細胞を３７℃で５～７日間培養し、フローサイトメトリー分析のために収集した。細胞を洗浄し、固定可能生存性色素Ｆｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｆｏｘｐ３転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて透過処理し、続いて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）－ＰＥ、ＣＤ４（ＲＭ４－５）－ＡＰＣ、ＣＤ８α－（５３－６．７）－ＰＥＣｙ７およびＫｉ６７（ＳｏｌＡ１５）－ＦＩＴＣを用いて染色した。増殖性ＣＤ４（ＣＤ４＋Ｋｉ６７＋）またはＣＤ８（ＣＤ８＋Ｋｉ６７＋）Ｔ細胞集団を分析し、ＧｕａｖａフローサイトメトリーＥａｓｙＣｙｔｅシステムを使用して規定した。
すべてのｍＰＤ－１／ＩＬ－１５融合構築物が、ＩＬ－２依存性マウスリンパ球ＣＴＬＬ２（図２３Ａ）およびＣ５７ＢＬ６脾臓細胞増殖（図２３Ｂ）の両方を刺激した。Ｔ細胞集団の分析によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団のパーセンテージのみが増大し、一方ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団パーセンテージは、影響を受けないままであったことが示された（図２３Ｃ）。試験した４種の構築物のうち、１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５が、ＩＬ－２依存性マウスリンパ球および脾臓細胞増殖およびＴ細胞増殖に対して最小の刺激効果を示し、２Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５は、細胞増殖およびＴ細胞増殖に対して最も刺激効果を示した。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ルイス肺がんモデルにおけるｍＰＤ－１／ＩＬ－１５融合分子の有効性研究
融合タンパク質中のＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインの配向または数が、融合分子の、腫瘍成長を低減する能力に対して何らかの効果を有するか否かを決定するために、ＬＬ／２マウス肺がん同系モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を、ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ融合タンパク質を使用してＣｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（太倉）によって実施した。この実施例では、構築物１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５および１Ｃ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５を試験し、１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５および１Ｃ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５を対照として使用した。
Ｃ５７ＢＬ／６株のマウス、８～１０週齢および１６．５～２０．７ｇの体重を、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ（中国、上海）から購入した。ＬＬ／２腫瘍細胞を、１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ培地を用い、５％ ＣＯ２の存在下、３７℃でｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。細胞を対数増殖期で回収し、カウントし、その後、腫瘍接種した。この実施例において使用した融合タンパク質は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって産生され、少なくとも９５％の純度を示し、９５％より多い単量体を含有していた。
各マウスの右後側腹部領域に、腫瘍発生のために０．１ｍｌのＰＢＳ中のＬＬ／２腫瘍細胞（３×１０５個）を皮下接種した。無作為化の日付および第１の投薬日を０日目と示した。平均腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に到達したときに、無作為化プロセスを開始した。マウスを異なる研究群に無作為に割り当てた。無作為化は、マルチタスク法（ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア、バージョン３．１．３９９．１９）無作為化ブロックデザインを使用し、「マッチした分布（ｍａｔｃｈｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）」法に基づいて実施した。
融合タンパク質を示された用量に従って希釈し、１０μｌ／ｋｇの融合タンパク質を、毎週１回、３週間マウスに静脈内注射した。無作為化後、マウスを週に２回秤量した。腫瘍体積をノギスを使用して２つの寸法で週に２回測定し、体積は式：“Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは、腫瘍体積を表し、Ｌは、腫瘍の長さ（最長腫瘍寸法）を表し、Ｗは、腫瘍の幅（Ｌに対して垂直な最長腫瘍寸法）を表す）を使用してｍｍ３で表した。投薬ならびに腫瘍および体重測定は、Ｌａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔ中で実施した。体重および腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用することによって測定した。
融合タンパク質の抗腫瘍活性を決定するために、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）パーセンテージは、以下の式ＴＧＩ（％）＝１００×（１－Ｔ／Ｃ）（式中、ＴおよびＣは、融合タンパク質および対照各々のそれぞれ処置群および対照群の平均腫瘍体積（または体重）を表す）を使用して毎日測定し、記録した。
試験した融合タンパク質のうち、１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５は、腫瘍成長に対して最も阻害効果を示した（表２３および図２４）。
まとめると、実施例２５および２６から得られたデータは、末梢Ｔ細胞のより低い刺激のために、Ｃ末端融合抗体と比較して、Ｎ末端融合抗体は、毒性をさらに低減することを示唆する。データは、Ｎ末端融合分子が、ｃｉｓ提示のために、末梢Ｔ細胞に対してと比較して腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の刺激において特に有効であることをさらに示す；Ｎ末端融合分子におけるＩＬ－２Ｒβγ結合の低減によって、ＰＤ－１／ＩＬ－１５が、ＴＩＬに選択的に結合し、したがって、その毒性を低減することが可能となる。最後に、データは、１Ｎ－融合分子が２Ｎ－融合分子よりも優れていることを示す。
Figure 0007644151000023
ｈＰＤ－１／ＩＬ－１５融合タンパク質は、そのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害機能を保持していた
Ｐｒｏｍｅｇａ遮断バイオアッセイを、融合タンパク質１Ｃ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、２Ｃ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、１Ｎ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、２Ｎ－３８Ｂ２－ｈＳＤ１５、１Ｎ－６５Ｄ－ｈＳＤ１５－３８Ｂ２および１Ｎ－６５Ｓ－ｈＳＤ１５－３８Ｂ２を使用して実施例５に記載されたように実施した。すべての融合分子は、３８Ｂ２と比較してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害機能を保持した（図２６）。１Ｎ－融合物は、最もＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害機能を提供した。
ｈＰＤ－１／ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＩＬ－１５活性を刺激する
ＥｘａＭ０７ｅ培養および増殖アッセイ：融合タンパク質の、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ－１５を刺激する能力を決定するために、ヒト急性巨核芽球白血病Ｍ０７ｅ細胞株を、１５％熱不活化ＦＢＳおよび２０％の細胞株５６３７の条件付け培地を補給したＩＭＤＭ培地で培養した。
抗体または融合タンパク質の段階希釈を、９６ウェルプレートに添加し、次いで、細胞を１０％熱不活化ＦＢＳを補給したＩＭＤＭ培地でウェルあたり２．５×１０４個で播種した。細胞を３７℃で３～５日間インキュベートし、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存力アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して検出した。
すべての試験した融合タンパク質構築物がＩＬ－１５活性を刺激したが、１Ｎ融合物は、１Ｃ、２Ｃまたは２Ｎ構築物と比較して、刺激する能力の低下を示した（図２７）。
ＣＴ２６同質遺伝子モデルにおけるｈＰＤ－Ｌ１／ＳＤ１５融合分子の有効性研究
ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインの配向または数が、融合分子の、腫瘍成長を阻害する能力に対して何らかの効果を有するか否かを決定するために、１Ｎ－ＳＤ１５－Ｄ７Ａ８、２Ｎ－ＳＤ１５－Ｄ７Ａ８、１Ｃ－ＳＤ１５－Ｄ７Ａ８および２Ｃ－ＳＤ１５－Ｄ７Ａ８を使用してＣＴ２６同質遺伝子モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を実施した。ＣＴ２６同質遺伝子モデルマウスを、融合タンパク質を用いて処置し、腫瘍発生／低減について観察した。ＣＴ２６は、マウス結腸癌腫株である。
腫瘍体積をノギスを使用して２つの寸法で週に２回測定し、体積は式：“Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは、腫瘍体積を表し、Ｌは、腫瘍の長さ（最長腫瘍寸法）を表し、Ｗは、腫瘍の幅（Ｌに対して垂直な最長腫瘍寸法）を表す）を使用して体積をｍｍ３で表した。投薬ならびに腫瘍および体重測定は、Ｌａｍｉｎａｒ Ｆｌｏｗ Ｃａｂｉｎｅｔ中で実施した。体重および腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（バージョン３．１．３９９．１９）を使用することによって測定した。
ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５分子を用いる有効性研究の結果は、図２８に示されている。
１Ｎ－融合タンパク質中のＩＬ－１５アミノ酸置換の存在は、融合タンパク質のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害機能に影響を及ぼさなかった
Ｐｒｏｍｅｇａ遮断バイオアッセイ（図２６Ｃ、図２９Ｅおよび図２９Ｆ）およびＥＬＩＳＡ競合アッセイ（図２９Ｂおよび２９Ｃ）は、ＩＬ－１５を含む１Ｎ－融合タンパク質中のＮ６５ＳまたはＮ６５Ｄアミノ酸置換が、融合タンパク質の、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２相互作用を効果的に撹乱する能力に影響を及ぼさなかったことを示した。
同様に、可溶性ＰＤ－１またはＰＤ－１を発現する細胞への、それぞれ野生型ＩＬ－１５またはＩＬ－１５ Ｎ６５Ｓを含む１Ｎ－融合タンパク質の強力な結合において有意差は観察されなかった（図２９Ａおよび２９Ｄ）。
ＩＬ－１５アミノ酸置換を含む１Ｎ－融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで弱いＩＬ－１５刺激を示した
１Ｎ－融合タンパク質の、ヒトおよびマウス細胞においてＩＬ－１５活性を刺激する能力を調べた。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＩＬ－１５／３８Ｂ２の存在下で、ヒト急性巨核芽球白血病細胞（Ｍ０７ｅ、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃ）、ｈＰＢＭＣ（図３０Ｄ）、ＩＬ－２／ＩＬ－１５依存性マウスリンパ球細胞株（ＣＴＬＬ２、図３１Ａ）、マウス脾臓細胞（図３１Ｂ）は、野生型１Ｎ－ＩＬ－１５／３８Ｂ２の存在下よりも遅く増殖した。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－／３８Ｂ２の、ｈＩＬ－２ＲβがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３への結合は、減少した（図３０Ｅ）。
さらに、１Ｎ－ＩＬ－１５／３８Ｂ２およびｍｕｔ－１Ｎ－ＩＬ－１５／３８Ｂ２の両方とも、マウス脾臓（図３１Ｃ）およびｈＰＢＭＣ（図３１Ｄ）の両方におけるＣＤ４＋Ｔ細胞よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖において、より良好な用量反応を誘導した。
ＩＬ－１５アミノ酸置換を含む１Ｎ－融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体耐性マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示した
それぞれ野生型ＩＬ－１５、ＩＬ－１５ Ｎ６５ＳまたはＩＬ－１５ Ｎ６５Ｄを含む１Ｎ－融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、キイトルーダ（抗ＰＤ－１抗体）耐性ｈＰＤ－Ｌ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に到達したときに、融合抗体（週に１回）および対照（週に２回）を注射（腹腔内）した。
１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５およびＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５の両方とも、強力な抗腫瘍活性を示した（図３２Ａ）。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５の抗腫瘍効力は、用量依存性であった（図３２Ｂ）。１２ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ×３週間のＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５は、腫瘍退縮を実証した（図３２Ｂおよび３２Ｃ）。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５を用い１２ｍｇ／ｋｇで投薬された場合に、体重減少または死亡は観察されなかったが、１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５を用い≧１ｍｇ／ｋｇで投薬された場合に有意な体重減少および死亡が観察された（図３２Ｅおよび図３２Ｅ）。非標的化１Ｎ－ＩＬ－１５融合物は、抗腫瘍効力を全く示さなかった。非標的化１Ｎ－ＩＬ－１５融合物について≧１ｍｇ／ｋｇが投薬された場合に有意な体重減少（図３２Ｄ）および死亡が観察された（データは示されていない）。
ＩＬ－１５ Ｎ６５Ｓを含む１Ｎ－融合タンパク質は、ＩＬ－１５ Ｎ６５Ｄを含む１Ｎ－融合タンパク質と比較して有効性の改善を示した（図３２Ｉおよび３２Ｋ）。
要するに、突然変異ＩＬ－１５を含む融合タンパク質は、ＩＬ－１５が関連する効力および刺激を低下させ、その結果、毒性が低下し、治療的処置ウィンドウが増大した。
ＩＬ－１５アミノ酸置換を含む１Ｎ－融合タンパク質は、腫瘍細胞を再負荷されたマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示した
ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウスにおいて、それぞれＩＬ－１５ Ｎ６５ＳまたはＩＬ－１５ Ｎ６５Ｄを含む１Ｎ－融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。
０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６をマウスの右下側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に到達したときに、マウスに１２ｍｇ／ｋｇのＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５またはＮ６５Ｄ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５をそれぞれ毎週１回および毎週２回、３週間腹膜内注射した。５匹のマウス（６匹のうち）において、Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５処置について約２５日で、およびＮ６５Ｄ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５処置について４０日で腫瘍が完全に消失した。
８８日目に、０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６細胞および０．１×１０６個のＣＴ２６細胞を、それぞれ左下側腹部および左上側腹部に皮下接種した。両細胞株について最大１３５日目まで腫瘍成長は観察されず、融合タンパク質がマウスを腫瘍細胞を用いた再負荷から保護することを示した（図３３）。
ＩＬ－１５アミノ酸置換を含む１Ｎ－融合タンパク質は、非標的化融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との組合せと比較して、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ１／ＰＤＬ１マウスにおいて抗腫瘍活性の改善を示した
０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６細胞を、マウスの右下側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に到達したときに、マウスにそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの３８Ｂ２、１２ｍｇ／ｋｇのＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５および１０ｍｇ／ｋｇの３８Ｂ２と１２ｍｇ／ｋｇのＮ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５の組合せを毎週１回、３週間腹膜内注射した。組合せ処置については、２つの試験物質を１時間間隔で逐次注射した。
以下の構築物について腫瘍成長を抑制する能力を比較した：（１）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質；（２）非標的化融合Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５；（３）抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２と非標的化融合（すなわち、Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５）との組合せ；および（４）抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２のみ。
腫瘍は、組合せ群と比較してＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５群において有意により遅く成長した（図３４Ａ）。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合物群では、８３％（５／６）のマウスが腫瘍を有していなかったが、一方、組合せ群では腫瘍を有さないマウスは観察されず、抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２のみの群では１匹の腫瘍を有さないマウスが観察された（図３４Ｂ）。６５Ｓ－１Ｎ－ＩＬ１５／３８Ｂ２融合物群については体重減少は観察されず、非標的化融合物６５Ｓ－１Ｎ－ＩＬ１５／ＤＰ４７群については約－５％の体重減少が観察された（図３４Ｃ）。
このデータは、Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質の頑強な抗腫瘍活性を示し、その二機能性ならびにＴＩＬ上に同時発現されるＰＤ１およびＩＬ２Ｒβγ両方に結合するその能力を強調する。
抗ＰＤ－１抗体の追加の投与は、１Ｎ－融合タンパク質の抗腫瘍活性のさらなる増大につながらない
０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６細胞を、マウスの右下側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に到達したときに、マウスに１０ｍｇ／ｋｇの３８Ｂ２、１２ｍｇ／ｋｇのＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５および１０ｍｇ／ｋｇの３８Ｂ２と１２ｍｇ／ｋｇのＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５の組合せを、それぞれ毎週１回、３週間腹膜内注射した。組合せ処置については、２つの試験物質をまず混合し、次いでマウスに注射した。
以下の構築物について、腫瘍成長を抑制する能力を比較した：（１）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質；（２）抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質との組合せ；および（３）抗ＰＤ－１抗体３８Ｂ２のみ。
腫瘍は、組合せ群と比較してＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５群において有意により遅く成長した（図３５Ａ）。Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５群では８３％（５／６）のマウスが腫瘍を有していなかったが、組合せ群では腫瘍を有さないマウスは観察されず、抗体のみでは１匹の腫瘍を有さないマウスが観察された（図３５Ｂ）。体重は、図３５Ｃに示されている。
このデータは、１Ｎ－融合タンパク質と抗ＰＤ－１抗体との組合せよりも、腫瘍成長の低減において１Ｎ－融合タンパク質がより有効であることを示す。
Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５融合タンパク質は、ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤ１／ＰＤＬ１トランスジェニックマウスにおいて長い血清半減期を示した
ｈＰＤ１／ＰＤＬ１トランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスに、０．１ｍＬのＰＢＳ中のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６腫瘍細胞（０．５×１０６個）を右下側腹部に皮下接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積がおよそ８３ｍｍ３に到達したときに処置を開始した。５．１ｍｇ／ｋｇ（０．３５μｍｏｌ／ｋｇ）の３８Ｂ２または１もしくは６ｍｇ／ｋｇ（０．０６または３５μｍｏｌ／ｋｇ）のＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５をマウスに腹膜内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）投与した。投薬後、注射後０．２時間、５時間、２時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間および１６８時間で血液を採取し、精製血清を使用して、ヒトＰＤ１を捕捉されたタンパク質として使用し、ビオチン－ＩＬ１５および抗ヒトＦａｂを別々に使用してＫＤ０５０および３８Ｂ２結合を検出する伝統的なＥＬＩＳＡによって、抗体濃度を測定した。
Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５は、ＩＶ（図３６Ａ）およびＩＰ（図３６Ｂ）注射の両方において、抗体３８Ｂ２と同様の血清半減期プロファイルを示し、処置後最大１２０時間まで用量反応を示した。
ｈＰＤＬ１－ＣＴ２６腫瘍を有するｈＰＤＬ１／ＰＤ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスにおける作用機序研究
０．５×１０６個のｈＰＤＬ１／ＣＴ２６細胞を、ｈＰＤ１／ＰＤＬ１トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスの右下側腹部に皮下接種した。腫瘍サイズが約１７５ｍｍ３に到達したときに、（１）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１、（２）Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５（非標的化対照）、（３）抗体３８Ｂ２および（４）抗体３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せの各０．０６または０．３５μｍｏｌ／ｋｇ用いてマウスに静脈内注射した。腫瘍サイズを、週に２回測定し、投薬後７日目にマウスを終了させた（図３７Ａ）。すべての群から血液および流入領域リンパ節（ＤＬＮ）を採取して、フローサイトメトリーを実施した。腫瘍を採取して、ＴＩＬ分析を実施した（図３７Ｂ）。統計分析には一元ＡＮＯＶＡを使用した。有意なＦ－統計量（誤差分散に対する処置分散の比率）が得られた場合には、異なる群間の比較を、ゲームス・ハウエル（等分散を仮定しない）またはチューキー（等分散を仮定する）検定を用いて実施した。媒体と他の群との間の比較、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、平均の標準誤差を表した（ＳＥＭ）。
Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５が、ＰＤ１およびＩＬ２Ｒβγを発現するＴＩＬに結合し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を異なって増殖させることが示された。具体的には、腫瘍、血液および流入領域リンパ節（抗体（１）３８Ｂ２、（２）ＰＤ１標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５、（３）非標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５または（４）３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せを用いて処置された）におけるＣＤ８／ＣＤ４比率を分析すると、腫瘍ではＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５がＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進するが、血液および流入領域リンパ節では促進しないことがわかった。ＣＤ８／ＣＤ４比率は、他の処置（（１）３８Ｂ２、（２）非標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５または（３）３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せ））の結果として変化しなかった（図３７Ｃ）。
次いで、腫瘍（抗体（１）３８Ｂ２、（２）ＰＤ１標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５、（３）非標的化融合タンパク質Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－ＤＰ４７／ＩＬ－１５または（４）３８Ｂ２とＮ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５との組合せを用いて処置した）におけるＣＤ８およびＣＤ４サブタイプを分析した。腫瘍においてエフェクター記憶ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｎ６５Ｓ－１Ｎ－３８Ｂ２／ＩＬ－１５処置サンプルについて有意に増大し、３８Ｂ２処置サンプルについてはわずかに増大したことがわかった（図３７Ｄ）。異なる処置群において他のＴ細胞サブタイプの間では差は観察されなかった。
複数のマウス同系腫瘍モデルにおけるＮ６５Ｓ－１Ｎ－ｍ３Ａ７／ＩＬ－１５（代替物）有効性研究
０．１ｍＬのＰＢＳ中の示された量の腫瘍細胞（表２４）を、マウスの右側腹部に皮下接種した。動物を無作為化し、平均腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３（７５～１２５ｍｍ３の間）に到達したときに処置を開始した。腫瘍体積をノギスを使用して２つの寸法で週に２回測定し、体積は、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２（式中、Ｖは、腫瘍体積であり、Ｌは、腫瘍の長さ（最長腫瘍寸法）であり、Ｗは、腫瘍の幅（Ｌに対して垂直な最長腫瘍寸法）である）を使用してｍｍ３で表した。
単一用量処置で１２モデルすべてにおいて有意な抗腫瘍効力が観察された（ＴＧＩ＞５０％）（表２４）。ＣＴ２６、ＥＭＴ６、ＭＣ３８、Ｈ２２、Ａ２０およびＰａｎ０２について完全奏功（腫瘍がない）が見られた（表２４）。例示として示されるＥＭＴ６のデータ（図３８）。
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Claims (6)

  1. 融合タンパク質であって、
    抗ＰＤ－１抗体；
    ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチド；および
    ＩＬ－１５ポリペプチドを含み、
    前記融合タンパク質は配列番号２１９の軽鎖配列、配列番号２４０の第１の重鎖配列および配列番号２４１の第２の重鎖配列を含む、前記融合タンパク質。
  2. 前記融合タンパク質は、１つ以下のＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインポリペプチドおよび１つ以下のＩＬ－１５ポリペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. ２つの軽鎖および２つの重鎖を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む、１以上の発現ベクター。
  5. 請求項４に記載の発現ベクターを含む、細胞。
  6. （ｉ）請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、
    （ｉｉ）薬学的に許容される担体と
    を含む、医薬組成物。
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