JP7645353B2

JP7645353B2 - 細胞分析用の自動化された試料調製プラットフォーム

Info

Publication number: JP7645353B2
Application number: JP2023500322A
Authority: JP
Inventors: ガエルブーヴィエ，; アンドレアスベームラー，; ダヴィッドファイユ，; エドゥアルドフローレスフエンテス，; ジーザスアマンダライン，; ダニエルジェイ．フラグラー，
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2025-03-13
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: AU2021306347A1; CA3184627A1; JP2024083566A; MX2023000392A; BR112022026762A2; CN116601479A; WO2022011285A1; KR102915827B1; US20230305003A1; KR20230033740A; IL299645A; EP4179322A1; JP2023533948A

Description

関連出願への相互参照
本出願は、本明細書に完全に記載されているかのように参照によって組み入れられる、２０２０年７月１０日に出願された米国仮出願第６３／０５０，６３７号の恩典を主張する。

背景
フローサイトメータを使用する細胞分析機器は当分野において公知である。例えば、本明細書に完全に記載されているかのように参照によって組み入れられる米国特許出願公開第２００８／００１００１９号を参照されたい。フローサイトメータは、光線によって粒子を励起させることができる感知ゾーンを通して粒子の流れを導く。光線は粒子に蛍光を発するようにさせ、および／または光を散乱させ、放射された光はフィルタによって電磁（ＥＭ）スペクトルの部分に分離される。フィルタリングされたＥＭスペクトルを調べることにより、細胞内容物の分析を行うことができ、ある種の特性および値を報告することができる。

米国特許出願公開第２００８／００１００１９号明細書

要旨
しかしながら、これまでのところ、（ｉ）例えば、最適なインキュベーションおよび体積の詳細が予めプログラムされている、造血幹細胞、前駆細胞またはＴ細胞試料を含む血液試料（例えば、臍帯血試料）の自動化された調製；（ｉｉ）これらの試料が調製される機器と同一の機器における、造血幹細胞、造血前駆細胞、Ｔ細胞、さらには白血球の少なくとも１つの分析および計数を可能にするフローサイトメータは存在しない。さらに、（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、陰性対照ありもしくはなしで単一の試料に対してまたは陰性対照ありもしくはなしで反復試料（例えば、二連試料）に対して分析を行うことを可能にするフローサイトメータは存在しない。本開示は、そのような機器を記載する。本開示はまた、粒子を正しく計数するために、懸濁された固体（例えば、細胞）を有する様々な液体（例えば、検体型）を正確かつ精確に移動させる能力によって、少なくとも部分的に機器の性能が改善される高性能機器を提供する。
ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞の計数は、臨床フローサイトメトリ検査室において最も高度に規制された試験の１つである。この試験の臨界性に寄与する４つの主な要因が存在する。

（１）移植前に、ドナーは、通常、患者の血液形成系を除去する化学療法および／または放射線療法を受け、その結果、患者の回復は、造血を再構成するために十分に多数の幹細胞を移植することに依存する。したがって、ＣＤ３４＋細胞の正確な計数は必須である。

（２）ＣＤ３４＋計数に対する規制の枠組みは地域によって異なるが、ＩＶＤに関して承認された現在利用可能な定量化方法は、これらの違いに対応するために必要な柔軟性を提供せず、検査室は、地元の管理機関の要件を満たすために、乏しい貴重な試料タイプに対して検査室で開発された試験を自己検証することを強いられる。

（３）同種異系（非自己）移植は、幹細胞移植レジメンにおける生命を脅かす可能性がある合併症である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性を有する残存免疫担当ＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する。したがって、これらの試料中のＣＤ３＋Ｔ細胞の数を計数することが必須であるが、現在、試料中のＣＤ３４＋幹細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞の並行的計数を可能にするＩＶＤキットは市場に存在せず、同様に、検査室はユーザが定めた試験での作業を強いられる。

（４）現在利用可能なＣＤ３４＋計数手順は手作業が多く、ヒューマンエラーの余地をもたらし、このため試料再実行の必要性を生じさせ、追加の試料を採取する必要がある場合に結果の報告の遅延または患者／ドナーの不快感をもたらす。さらに、これらの試料は、検査室に緊急（ＳＴＡＴ）試料として届くことが多く、検査室のワークフローを乱し、検査室スタッフは他の試料の分析の優先順位を下げることを余儀なくされる。両方の要因が、ＣＤ３４＋計数のための自動化されたソリューションに対する需要をもたらした。

新たに開発されたＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍおよび本明細書に記載される方法は、これらの重要な側面に対処するＣＤ３４＋計数のための最初のインビトロ診断（ＩＶＤ）ソリューションである。本明細書に記載の自動化されたＡＱＵＩＯＳＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍおよび方法に基づいて、試料での自動化されたＣＤ３４＋計数および必要に応じたＣＤ３＋計数のための完全なソリューションを提供し、人的介入の必要性を最小限に抑えるワークフローをもたらす。試料はオペレータによってシステムに装填され、試料調製およびデータ解析は解析装置によって自動的に実行される。この実際に操作する時間の短縮は、検査室における円滑なワークフローを提供し、手動の、したがって潜在的に誤りを起こしやすい工程の数を最小限に抑える。これはまた、非フローサイトメトリ専門家によってＣＤ３４＋計数が実施されることができ、夜間シフト中または週末などの規制を受けた検査室の操業時間外に、検査室がＣＤ３４＋計数を提供することを可能にすることを意味する。両方の側面が、患者ケアのレベルを高め、このスピードが重視される用途に関して結果が得られるまでの時間を短縮する。

さらに、本明細書に記載されるＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍおよび方法は、二連の実行および陰性対照の使用についての要求が異なる個別の規制要件、例えば、ＣＤ３４＋計数に対するＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＨｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＧｒａｆｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＩＳＨＡＧＥ）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓおよび欧州薬局方に適合した分析オプションを提供する。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍはＩＶＤソリューションの一部として選択するための合計６つの分析オプションを提供するという点で、この柔軟性は、ＣＤ３４＋幹細胞集団および前駆細胞集団と一緒にＣＤ３＋Ｔ細胞を並列計数することも考慮する。これは市場において他に類を見ず、検査室で開発された試験を、時間をかけて自己検証することを不要にする。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍによって提供される自動化のレベルは、最高レベルのデータ追跡可能性を確保しつつ、自動化に適合した予め混合された即時使用可能な試薬の組み合わせを使用することによって達成される。現在利用可能な手動試験キットは、濃縮物から手作業で毎日調製することが必要であり、細胞生存率に悪影響を及ぼすために実際の分析の前に試料を氷上で保存する必要がある溶液を赤血球溶解（試料調製において必須の工程）のために使用する。対照的に、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、そのまま使用可能で、室温で使用することができるより穏やかな赤血球溶解試薬を使用し、これにより、他の自動化されたフローサイトメトリ用途に関して公知であるが、幹細胞計数に関しては公知でない様式でＣＤ３４＋およびＣＤ３＋計数の自動化が可能になる。試験にとって極めて重要なすべての試薬バイアルは、個別の識別子および試薬の種類、試薬ロット、最初の使用日、有効期限などの不可欠な品質管理パラメータがバーコードで付され、試料情報と共に１つのデータベースに保存され、今日の認定機関によって要求されるデータ追跡可能性のレベルを提供する。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、その基礎となった方法であって、臨床用ＣＤ３４＋計数の市場において「ゴールドスタンダード」として認知され、他の製造業者の手動ＣＤ３４＋計数ソリューションに対する基準としても使用されていたＦＣ５００フローサイトメータ用のＳｔｅｍ－Ｋｉｔに対して臨床試験で検証されている。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍにより、臨床検査室から幹細胞計数の負担を軽減する、ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞の計数用の独自の新しいソリューションを提供することによって、「ゴールドスタンダード」が次のレベルに引き上げられる。

本技術のこれらおよびその他の特徴、局面および利点は、以下の図面に関連してさらによく理解されるであろう。

図１Ａは、臨床検査室の要件に対処するＣＤ３４＋造血前駆細胞の同定および定量のためのソリューションの特徴のチェックリストである。

図１Ｂは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための本明細書中に記載される方法のフロー図である。

図２は、診断機器の一つの例の斜視図であり、機器は検体自動装填装置と連結されて示されており、フローサイトメータを含む。

図３は、図２に示される診断機器の一部の拡大斜視図である。

図４は、動作中の機器を示す、図２～図３の診断機器の正面斜視図である。

図５は、単一の検体管を一度にサンプリングすることができる診断機器の部分の拡大図である。

図６は、図２～図５に示される提案された診断機器の外側筐体の正面斜視図である。

図７は、検体自動装填装置が取り外され、前扉を通して検体管が挿入されている、別の例の外側筐体の正面斜視図である。

図８は、本明細書に記載される方法およびシステムにおいて使用することができるソフトウェアコンポーネントシステムの一例である。

図９は、残存Ｔ細胞の分析ありまたはなしでの、ＣＤ３４＋ＨＰＣの臨床的定量のためのパネルオプションを示す表である。

図１０Ａ～１０Ｃは、ＣＤ３４＋絶対数（細胞／μＬ）についての３つのＣＤ３４＋分析オプションであるＳＴＥＭＰａｎｅｌ（二連、陰性対照を加えて試験）、ＳＴＥＭＤｕｐｌｉｃａｔｅ（二連、陰性対照なしで試験）およびＳＴＥＭＳｉｎｇｌｅ（単一の試験）の同等性を示すプロットである。これらの３つの分析オプションは、ＣＤ３を含まない試験に対するものである。

図１１Ａ～１１Ｃは、ＣＤ３４＋絶対数（細胞／μＬ）についての３つのＣＤ３４＋プラスＣＤ３＋分析オプションであるＳＴＥＭＡＬＬＯＰａｎｅｌ（二連、陰性対照を加えて試験）、ＳＴＥＭＡＬＬＯＤｕｐｌｉｃａｔｅ（二連、陰性対照なしで試験）およびＳＴＥＭＡＬＬＯＳｉｎｇｌｅ（単一の試験）の同等性を示すプロットである。これらの３つの分析オプションは、ＣＤ３を含む試験に対するものである。

図１２Ａ～１２Ｃは、ＣＤ３＋絶対数（細胞／μＬ）についての３つのＣＤ３４＋プラスＣＤ３＋分析オプションであるＳＴＥＭＡＬＬＯＰａｎｅｌ（二連、陰性対照を加えて試験）、ＳＴＥＭＡＬＬＯＤｕｐｌｉｃａｔｅ（二連、陰性対照なしで試験）およびＳＴＥＭＡＬＬＯＳｉｎｇｌｅ（単一の試験）の同等性を示すプロットである。これらの３つの分析オプションは、ＣＤ３を含む試験に対するものである。

図１３は、実施例２に記載されている代表的な手動フローサイトメトリワークフローである。

図１４は、実施例２に記載されている代表的なＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙＳｙｓｔｅｍワークフローである。

図１５Ａ～１５Ｂは、Ｓｔｅｍ－ＫｉｔとＦＣ５００（代替方法、白抜きのバー）およびＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ（ＡＱＵＩＯＳ、斜線のバー）上での１つのＣＤ３４＋試料または１０個のＣＤ３４＋試料のバッチについての試料処理所要時間およびオペレータが実際に操作する時間のプロットである。

図１６Ａ～１６Ｂは、作業日（図１６Ａ）および５日間の作業週（図１６Ｂ）当たりの、Ｓｔｅｍ－ＫｉｔとＦＣ５００（代替方法、灰色のバー）およびＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ（ＡＱＵＩＯＳ、赤いバー）上での品質管理（ＱＣ）手順のための工程所要時間およびオペレータが実際に操作する時間のプロットである。

説明
ここで、開示された主題のある特定の態様を詳細に参照する。開示された主題は、列記された特許請求の範囲と共に説明されるが、例示された主題は、特許請求の範囲を開示された主題に限定することを意図しないことが理解されよう。

動員された末梢幹細胞および前駆細胞（ＰＢＳＣ）を移植目的で使用することが増加したことに伴い、研究者らは、高度の正確性および実験室間での再現性を可能にする単純で高感度の方法を提供することを意図して、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＨｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＧｒａｆｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＩＳＨＡＧＥ）と協力して、１９９６年にＣＤ３４＋計数のための一連の基準を記載した。得られた「ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」は、ほどなく、フローサイトメトリによる造血ＣＤ３４＋前駆細胞の計数のためのゴールドスタンダードになった。１９９８年に、ある研究グループが、絶対的な計数のためにビーズを導入し、死細胞を排除するために生死判別色素として７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を添加し、ホルムアルデヒドなどの固定剤を欠く溶解試薬を添加することによって、１９９６年ガイドラインの修正版を公表した。これらの修正は、基本プロトコルを単一プラットフォーム方法に変換し、その結果得られた「生死判別色素を用いた単一プラットフォームＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」は、２０年を超えてもなお、ほとんど手が加えられていない。

ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓの顕著な特徴は、生存白血球からＣＤ３４＋細胞の数を導出する逐次ゲーティング戦略である。このＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、試験の変動性ならびに非特異的な細胞および蛍光色素の結合を是正するために、陰性対照と共に二連で試験を実施することを要求する。

逐次ゲーティングの選択性のために、ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、陰性対照の使用を任意とした。これに対して、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）は、対照の使用を義務付けている。ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓとは対照的に、Ｐｈ．Ｅｕｒ．に記載されているＳｔａｎｄａｒｄｓは、欧州薬局方の詳細に関する欧州評議会条約ならびにＥＵおよび国内の医薬法制に定められているように、法的拘束力を有する。

インビトロ診断（ＩＶＤ）システムの一部である現在利用可能なソフトウェアソリューションは、ＩＶＤ状態を維持しながら、陰性対照ありまたはなしのいずれかでＣＤ３４＋を計数するためのパネルを実行する柔軟性を提供しない。さらに、すべてのＣＤ３４＋計数試薬キットが陰性対照試薬を含有するわけではない。

逐次ＩＳＨＡＧＥゲーティング戦略の開始点は、希少なＣＤ３４＋細胞集団の正確な定量を著しく容易にするが、終点としては、すべての計数されたＣＤ３４＋細胞は自動的に生存であり、すべてのＣＤ３４＋細胞のうちの生存ＣＤ３４＋細胞の割合を直接計算することは困難であり得るという事実につながる。さらに、総合的な検体生存率を評価するために、適用されたゲーティング戦略からＣＤ４５＋白血球の総数を読み出すことは困難であり得る。

臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の場合、最近公開された「ＮｅｔＣｏｒｄ－ＦＡＣＴＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒＣｏｒｄＢｌｏｏｄＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂａｎｋｉｎｇ，ａｎｄＲｅｌｅａｓｅｆｏｒＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ」の第７版は、処理後、凍結保存前に臍帯血試料について総ＣＤ３４＋数と総生存ＣＤ３４＋数の両方を決定すること、および臨床プログラムへの臍帯血ユニットの開放前にＣＤ３４の生存率を評価することを要求する。

ＣＤ３４＋の定量が品質管理の目的で行われる場合、検査室は、二連検査＋陰性対照からなる「完全な」ＩＳＨＡＧＥパネルを実行せず、むしろ、特に分析のためにごくわずかな検体体積が利用可能である場合には、単一の試験を実行できることを求めている。現在の取得ソフトウェアは、パネルをＩＶＤソリューションの一部として適宜適合させる柔軟性を提供しない。ＱＣ目的のために、ＩＶＤシステムは必ずしも必要ではないが、これらの試験を実行するほとんどの検査室は高度に規制されており、したがって、この目的のためだけにユーザが定めた別個の試験を検証することを控える。

血液学的疾患または造血系の非悪性機能不全の場合、ＣＤ３４＋細胞は、非自己（同種異系）ドナーの末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）または臍帯血（ＣＢ）から収集される。ドナーとレシピエントが同一人物である自家状況におけるのと同様に、今日、動員されたＰＢは、同種異系移植スキームにおいてＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞のために最も一般的に使用される供給源である。

同種異系造血前駆細胞（ＨＰＣ）移植の成功は、適切なドナーの利用可能性、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性、移植の移植片対白血病／腫瘍効果を維持しながら患者の免疫応答のバランスを上手く取ることなどの様々な因子に依存する。動員された末梢血からのＣＤ３４＋細胞の使用は、移植後の造血の比較的迅速な回復という利点を有するが、より多数の循環Ｔ細胞に起因する急性移植片対宿主病（ａＧｖＨＤ）のリスクの増加を伴う。急性および慢性ＧｖＨＤは、同種異系移植を受ける患者の約３０～４０％に発症し、ドナーＴ細胞がａＧｖＤＨを媒介する上で中心的な役割を果たすと認識されているので、ＣＤ３４＋細胞と一緒に移植片中のＣＤ３＋Ｔ細胞を計数することが、多くの検査室で標準的な慣行となっている。１つの検査でＣＤ３４とＣＤ３のＩＶＤ分析を可能にする市販のキットは現在存在しないので、検査室は、この場合にも、この用途のためのユーザが定めた試験の検証に頼る必要がある。

ＣＤ３４＋ＨＰＣ計数を行う検査室は、データ追跡可能性の点で高度に規制されており、特に認定を受けている場合、大規模なＱＣシステムを確立する必要がある。これらの管理機構のいくつかの重要な側面としては、（ａ）すべての試料の適切な特定による過程全体を通じた試料の取り違えの回避；（ｂ）試験手順および機器の信頼性、正確性、精度および性能を監視するための適切な規定；（ｃ）機器および試薬の機能チェック；（ｄ）適切な参考資料の使用および進行中の技能試験の文書化；（ｅ）期限切れの試薬および供給品の使用を防止するための手続き；ならびに（ｆ）ロット番号、使用期限、供給品および試薬の製造業者を各検体に結び付けることを可能にする機構が挙げられる

特に、試薬および検体の文書化は、データ取得および分析のために使用されるプラットフォーム上に存在しないなど、しばしば相互に関連付けられておらず、「オフライン」で発生するので、側面（ｅ）および（ｆ）は困難であり得る。

血液腫瘍学検査室では、ＨＰＣ試料はしばしば検査室に緊急（ＳＴＡＴ）試料として届き、早急な対応が必要であり、日常的なワークフローを乱す。これらの試料に伴うすべての問題は二度手間をかけるため、人為的エラーの可能性を増大させる。これらの検査室にとって、ＣＤ３４＋ＨＰＣの分析はスピードが重視されるため、理想的にはサンプリングミスまたはその他の問題のリスクを最小限に抑えるように、ＨＰＣ試料を通常のワークフローに統合することが望ましい。臍帯血施設などのＣＤ３４＋計数に特化した検査室の場合、より高度な自動化は、本明細書に概説されるように高水準の追跡可能性を提供しながら、より多くの数の分析されるべき試料を管理するのに役立つ。

細胞生存率に悪影響を及ぼす赤血球溶解試薬を使用し、そのため、調製された試料を分析前に氷上に保つ必要があることが主な原因で、フローサイトメトリによるＣＤ３４＋計数用の現在のＩＶＤソリューションは自動化することができない。基本的に、塩化アンモニウムが、追加の固定剤を必要とすることなく、および関心対象の細胞集団の散乱特性を変化させることなく、溶解／無洗浄アプローチに適した、当時利用可能な唯一の溶解試薬であったため、ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、塩化アンモニウムの使用を提案した。塩化アンモニウムの使用は、基本的にすべての市販のフローサイトメトリ用ＣＤ３４＋計数キットにおいて十分に確立されているが、細胞生存率に対する影響のため、および作業希釈液を毎日新たに調製する必要があるため、自動化試料調製およびフローサイトメトリプラットフォーム上でＣＤ３４＋試験を実施することを妨げる。

現在、試料調製中に白血球の生存率に顕著な影響を与えることなく赤血球を特異的に溶解し、自動化されたフローサイトメトリシステム上でＣＤ３４＋計数を行うことを可能にする、固定剤を含まない直ちに使用可能な赤血球溶解試薬が利用可能である。

フローサイトメトリ用の理想的なＣＤ３４＋定量キットは、確立された標準およびプロトコルの利点と、試薬およびソフトウェアツールを臨床検査室のニーズに適合させるのに十分な柔軟性とを兼ね備える。これには、ＩＶＤソリューションと並行してユーザが定めた試験を準備する必要がない、異なる試料タイプのための取得および分析パネル、高度に規制された作業環境の要件を満たす品質管理機構、ならびに高度な自動化が含まれる。図１Ａを参照されたい。

造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための本明細書に記載される方法は、いわゆるゴールドスタンダードを「次のレベル」に引き上げることを目指して設計された。本明細書に記載される方法は、とりわけ、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞の自動化された分析のためのモジュール式アプローチを具体化する。一例において、本明細書に記載される方法は、本明細書中の表１および２に記載されているように、ＣＤ３４＋計数のためのソフトウェアおよび試薬キットと；同種異系ドナー由来の試料材料中のＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ３４＋細胞の同時計数のためのソフトウェアおよび試薬キットと；ＣＤ３４対照細胞（２つのレベル）とを含む。
表中、「ＣＤ４５－ＦＩＴＣ」は、ＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈＳＡＳ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＣｏｍｐａｎｙ）、マルセイユ、フランスによって製造され、フローサイトメトリを使用して、ヒト生物学的試料中に存在するＣＤ４５抗原を発現する細胞集団の分析および計数を可能にするフルオレセイン結合抗体を一般的に指し；「ＣＤ３４－ＰＥ」は、ＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈＳＡＳ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＣｏｍｐａｎｙ）、マルセイユ、フランスによって製造され、フローサイトメトリを使用して、ヒト生物学的試料中に存在するＣＤ３４抗原を発現する細胞集団の分析および計数を可能にするフィコエリトリン結合抗体を一般的に指し；「ＣＤ３－ＰＣ７」は、フローサイトメトリを使用して、ヒト生物学的試料中に存在するＣＤ３抗原を発現する細胞集団の分析および計数を可能にするフィコエリトリンシアニン７結合抗体を一般的に指す。本明細書では、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＰＣ７などのフルオロフォアが指定されているが、フルオロフォアが機器の検出能力内で検出され得る限り、ＣＤ４５、ＣＤ３４抗原およびＣＤ３抗原を発現する細胞集団の分析および計数を可能にする任意の適切なフルオロフォア結合抗体を使用することができる。

本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるシステムの一部として、パラメータＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ３を検証するための安定化されたヒト白血球の液体調製物であるＣＤ３４対照細胞を使用することができる。一例では、キットは、約１０個のＣＤ３４＋細胞／μＬ（レベル１）および約３０個のＣＤ３４＋細胞／μＬ（レベル２）で、ＣＤ３４の２つのレベルを含有する。アッセイ値は、対照細胞アッセイシートのバーコードをスキャンすることによってシステムに入力することができる。

本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、一般に、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、および単球（例えば、単球、マクロファージ）などの機能的成熟細胞に分化することを可能にする多能性と、それらの多能性を維持しながら再生する能力（自己再生）との両方を有する細胞を意味する。

本明細書で使用される場合、「造血前駆細胞」または「ＨＰＣ」という用語は、一般に、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、および単球（例えば、単球、マクロファージ）などの機能的成熟細胞に分化する可能性を有する細胞を意味する。

ＨＳＣおよび／またはＨＰＣは、必要に応じて、造血起源の細胞を含有する身体または身体の器官から得られる。そのような供給源には、分画されていない骨髄、臍帯および末梢血が含まれる。上記の精製されていないまたは分画されていない血液製剤はすべて、当業者に公知の方法で造血幹細胞特性を有する細胞を濃縮することができる。

造血中、ＨＳＣは、まず前駆細胞段階に分岐して骨髄系統およびリンパ系統になり、次いで、それぞれ骨髄系幹細胞（混合コロニー形成細胞、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）およびリンパ系幹細胞に分化する。さらに、骨髄系幹細胞は、赤血球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）および赤血球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｅ）を介して赤血球に分化し、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＭＥＧ）を介して血小板に分化し、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ－ＧＭ）を介して単球、好中球および好塩基球に分化し、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｅｏ）を介して好酸球に分化するのに対して、リンパ系幹細胞は、Ｔリンパ球前駆細胞を介してＴ細胞に分化し、Ｂリンパ球前駆細胞を介してＢ細胞に分化する。これらの骨髄系幹細胞およびそれらに由来する様々な造血前駆細胞は、様々なサイトカインの存在下で軟寒天、半固体メチルセルロース培地上などでこれらの細胞が形成するコロニーの特性によって特定される。

表２に示される例では、同種異系起源の試料中の残存ＣＤ３＋Ｔ細胞の分析のために、必要に応じて同種異系ＣＤ３キットを表１に記載されているベースキットと組み合わせることができる。両キットの組み合わせは、本明細書中に記載される３つのパネルオプションの間で選択する能力を有する、１回の実行でＣＤ３４とＣＤ３の一体化された定量を行うための検証されたソリューションを提供する。

このフレームワークを念頭に置いて、本開示は、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための、図１Ｂに示されるものなどの自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
フローサイトメータの試料調製領域に位置する試料プレートの１またはそれを超えるレセプタクル中に、１またはそれを超える血液試料（例えば、同じ患者血液試料からの血液一定分量）の正確な体積を配置することと；
少なくとも１つの第１の組成物を得るために、１またはそれを超えるレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理することであって、少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
少なくとも１つの第２の組成物を与えるために、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬の結合に十分な期間、少なくとも１つの第１の組成物をインキュベートすることと；
少なくとも１つの第３の組成物を与えるために、少なくとも１つの第２の組成物を溶解試薬で処理することと；
１またはそれを超える血液試料中の、生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、少なくとも１つの第３の組成物をフローサイトメトリによって分析することと；
を含む、自動化されたフローサイトメトリ方法に関する。本方法は、計数ビーズの正確な添加を実施することと、次いで、１またはそれを超える血液試料中の、生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、少なくとも１つの第３の組成物をフローサイトメトリによって分析することとをさらに含むことができる。第１の組成物は、少なくとも１つの試薬の例として生死判別色素をさらに含むことができる。本明細書で論じられるように、生死判別色素の一例は７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）である。

本明細書で論じられるように、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される様々な供給源からの二連の血液一定分量を用いて実施することができる。これに代えてまたはこれに加えて、本明細書に記載される方法は、陰性対照を用いて（または用いずに）実施することができる。例えば、表１および表２の試験パネルを参照されたい。陰性対照はＣＤ３４に対するものであり得る。あるいは、陰性対照はＣＤ３に対するものである。また、本明細書中に記載されるように、マーカーは、ＣＤ４５（例えば、造血幹細胞を含むある特定の細胞集団上で発現されるＣＤ４５抗原）、ＣＤ３（例えば、Ｔ細胞を含むある特定の細胞集団上で発現されるＣＤ３抗原）およびＣＤ３４（例えば、造血幹細胞を含むある特定の細胞集団上で発現されるＣＤ３４抗原）のうちの少なくとも１つである。陰性対照は、アイソタイプ対照またはアイソクロニック対照であり得る。アイソクロニック対照では、細胞は過剰の同一の非標識抗体の存在下で染色される。非標識抗体はすべての結合部位を占有し、標識抗体が特異的に結合するのを妨げる。したがって、検出されるすべてのシグナルは、非特異的結合に由来するはずである。

少なくとも１つの画像化試薬は、蛍光レポーターを含む画像化剤を含む、任意の適切な画像化剤であり得る。したがって、例えば、本明細書で企図される画像化剤は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＣ７などを含むがこれらに限定されない蛍光レポーターと結合した抗体であり得る。

本明細書に記載される方法は、生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを提供することができる。

本明細書に記載される方法はまた、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
試料プレートの第１のレセプタクル中に第１の血液試料を配置することと；
第１の組成物ｆ１を得るために、第１のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、第２の組成物ｓ１を与えるために、第１の組成物ｆ１をインキュベートすることであって、少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
第１の組成物ｆ１がインキュベートされている間に、試料プレートの第２のレセプタクル中に第２の血液試料を配置し、第１の組成物ｆ２を得るために、第２のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であり、第２の組成物ｓ２を与えるために第１の組成物ｆ２をインキュベートすることと；
第３の組成物ｔ１およびｔ２を与えるために、第２の組成物ｓ１およびｓ２を溶解試薬で処理することと；
生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、第３の組成物ｔ１およびｔ２をフローサイトメトリによって分析することと；
を含む、自動化されたフローサイトメトリ方法を含む。

いくつかの例では、本明細書に記載されるように、これらの方法は、陰性対照をさらに調製することをさらに含むことができる。陰性対照は、第１の組成物ｆ１の前に調製することができ、陰性対照は、第１の組成物ｆ１の後に調製することができ、または陰性対照は、第１の組成物ｆ２の後に調製することができる。

本明細書に記載されるシステムおよび方法は、様々な利点を有する。例えば、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、自動化された装填、試料調製、試薬管理、ならびにバーコードスキャンおよび患者追跡の他、データ解析および双方向ＬＩＳ接続を１つのプラットフォームに組み込むことによって動作を効率化する。さらに、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、既存のソフトウェアへのＣＤ３４＋計数の追加を可能にし、その結果、本明細書に記載される方法のほとんどの工程を自動化することができる。これは、ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓの基準（例えば、洗浄なし、固定剤の添加なし、標的集団の散乱特性の変化なし）を満たすが、室温で保存し、取り扱うことが可能であり、ストック溶液から作業希釈物を毎日調製することを必要とせず直ちに使用でき、関心対象の集団に対して穏やかな赤血球溶解試薬の使用によって達成される。適切な溶解試薬の例としては、限定されないが、ＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈＳＡＳ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＣｏｍｐａｎｙ）、マルセイユ、フランスによって製造されたＶｅｒｓａＬｙｓｅＬｙｓｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎが挙げられる。例えば、溶解試薬を広く記載し、参照によって本明細書に完全に記載されているかのように組み入れられる米国特許第７，３０，７９７号を参照されたい。

絶対的計数のために使用されるビーズ溶液（表１および表２参照）は、各ピペット操作工程の前に個々の混合を必要としない注意深くバランスのとれた浮力を有する。また、ビーズを含有する瓶には、蒸発を避ける特別な蓋が付いている。

試料は、その後、列内の他の試料よりも優先されるＳＴＡＴ試料用のカセット検体自動装填装置または単一チューブ装填装置のいずれかを使用して装填される。これにより、進行中の過程を中断する必要なしに円滑なワークフローが確保される。試料調製は、９６ウェルの深ウェルプレートまたは任意の適切な試料プレート中で行うことができ、ここで、試料は調製されるだけでなく、試料は、所定の体積の少なくとも１つの試薬を送達するように構成された自動化された分注器によって実行される処理工程において処理もされる。試料調製は、試料調製および分析のための個々のプローブを用いて行うことができ、その結果、両工程は並行して行われ、試料は、試料調製が完了すると直ちに分析される。

本明細書に記載されるシステムおよび方法において使用される試薬は、有効期限、搭載時有効期限、ロットおよび容器番号を追跡するための固有のバーコード識別を含む。試薬消費およびプレート使用は、試料が処理されるときに本明細書に記載されるシステムによって監視される。バーコードリーダは、最初の使用時に試薬またはプレートをスキャンし、「消耗品」情報に誤りがないまたは少なくとも実質的に誤りがないようにする。本明細書に記載されるシステムは、試薬容器またはプレートがシステムによって初めて「見られる」ときに、試薬容器またはプレートが最大容量にあると見なす。本明細書に記載されるシステムは、ＡＱＵＩＯＳＣＬフローサイトメータ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中に存在するＡＱＵＩＯＳＳｍａｒｔＴｒａｃｋ試薬追跡システムなどの試薬追跡システムを備えることができ、適切な日付の試薬が使用されること、および各試料に対して十分な試薬が存在することを確実にするためにリアルタイムな消耗品追跡を提供し、これにより、試薬レベルが不十分であるか試薬が喪失しているために試料を再実行しなければならないリスクが排除される。例えば、本明細書に記載されるシステムは、必要な抗体バイアルを見つけなければ試験を実行しない。

本明細書に記載されるシステムは、さらなる利点を有する。例えば、本明細書に記載されるシステムは、携帯型バーコードスキャナを使用せずに検体バーコードを自動的に読み取ることができるチューブバーコードリーダを有することができる。システムは、チューブ上のバーコードをＬＩＳ要求に合致させる。誤識別を防ぐために、検体吸引の前に検体ＩＤが記録され、検体ＩＤは実行全体を通じて自動的に追跡される。

本明細書に記載される方法を実行することができるシステムの例は、診断機器１０の形態で図２～７に示されるシステムを含む。図示された例では、多数の検体カセット１４がその上に装填された自動装填装置部分１２を見ることができる。このような例では、カセット１４は、複数の同一の検体管もしくはバイアル１６（以下、「管」と称される）、様々な検体管１６、または単一の検体管１６のみを装填することができる。次いで、カセットは、自動装填装置部分１２の上部に装填され、受け取られた順序で処理される。あるいは、例えば、より迅速な単一試料処理が望まれる場合、図４に示されるように、別の検体入口、例えばドア１８（図５で見ることができる）中に試料管を直接挿入し、すべての待機中のカセット１４に先立って処理することができる。これは、直ちに試験を実行する能力と共に、臨床医による試験への即時のアクセスを与え、それによって、臨床医により所望されるときに他の検体管の試験を中断する（が、悪影響を与えない）。さらに、損なわれたバーコードを有するまたはバーコードを有さない（後述する）検体管を手動で挿入することができる。

本明細書で詳細に説明されるように、診断機器１０は、例示的に、検体管１６（または検体管カセット１４）が受容されると、以下の工程を実行する。このような工程は、臨床医による介入なしに機器１０によって実行され、これらの工程は、実行されるべき特定の試験に応じて変更、追加、または削除することができることが想定される。本開示を通じて血液管が論述されているが、他のタイプの体液および試料が本開示の範囲内であり、提案された機器１０において分析することができることが想定されることを理解すべきである。例えば、骨髄、血清、尿、滑膜、脊髄、腹膜、胸膜（ｐｌｕｒａｌ）および他の種類の流体または試料を、実質的に以下に記載されるように試験および分析することができる。

機器１０によって実行することができる工程には、検体管１６内にある間に（例えば、自動装填装置中にある間に）試料を混合する（例えば、揺動する）工程；検体管１６の蓋を貫き、必要な量の検体をサンプリングする工程；試料／患者ＩＤを確認するために、および／または管のタイプ／サイズを確認するためにバーコード（または任意の他の形態のマーキング／識別）を読み取る工程；ＩＤ、実行すべき試験および必要とされる試薬を合わせ、コンピュータによる追跡のためのシリアル番号を割り当てる工程；さらなる処理のために、（例えば、図２～４においてマイクロタイタープレートとして示されている）格納領域２０内の選択された空の管またはウェル中に検体／試料を配置する工程；添加された時点での試薬の混合、および実施すべき試験のための試料を適切に調製するためのタイミングを含む、適切な順序で適切な試薬を添加する工程；所定のインキュベーション時間（試薬に基づいて変動し得る）にわたって試料を試薬と反応させる工程；（所望であれば、または試験によって必要とされれば）格納領域２０内の複数の管／ウェル中に試料を分割する工程；バーコードまたは他の種類の追跡装置（例えば、ＲＦＩＤ）を介してすべての試料、カセット、試薬および関連する位置を追跡する工程；調製された試料／試薬の組み合わせを格納領域から適時に吸引し、（その後の試料を調製しながら）フローサイトメータを介して、調製された試料／試薬の組み合わせを分析する工程；臨床医が主導した決定規則に応じて、結果を自動検証するか、または検討のために結果を保留する工程が含まれる。

機器１０は、とりわけ、自動化および一体化された検体サンプリングを提供し、上記の各工程は（特定の試験によって必要とされれば）、追加の診断機器を使用することなく、機器１０内でおよび機器１０によって実行され得ることを意味する。さらに、臨床医が所望すれば、このような工程は、臨床医からの一切の相互作用なしに行うことができる。しかしながら、機器１０は、障害または他の問題が発生した場合に臨床医に警告を与えるように構成することができることを理解されたい。

図示された例では、機器１０は、プローブキャリア２２が単軸トラック２４に沿って移動している間に様々な機能を実行することを可能にする単軸プローブキャリア２２を使用する。例えば、プローブキャリア２２（および、したがって、プローブ２６）は、プローブキャリア２２が位置Ａにあるときに管１６から試料を採取するように配置することができ、位置Ｂにおいて格納領域２０に試料を置くことができ、位置Ｃにおいて試薬をサンプリングすることができる。（例えば、試料の即時の処理のために）試料が旋回可能なトレイ３６中に任意の点で配置されると、機器１０は試料の存在を感知し、自動装填装置１２中で処理を待っている任意の試料に先立って試料を挿入することができる。次いで、プローブ２６が旋回可能なトレイ３６中に配置された管から試料採取することができるように、プローブキャリア２２は位置Ｄに移動することができる。試薬は、実行すべき特定の試験によって必要とされるとおりに、試料との反応のために試料が堆積される前または後のいずれか（または前および後の両方）に格納領域２０に置かれ、本明細書で論述されているようにそれ自体を追跡することができる。

各工程は、以下の順序で行うことができる。しかしながら、ある特定の試験は、１もしくはそれを超える工程をスキップし得、または所望される血液試験に対して最良の試験結果を達成するために工程を修正し得ることが企図される。

まず、検体管１６は、使用すべき特定の検体管１６に適した予め構成されたカセット１４中に装填することができる。例えば、検体管１６は、一般的に見られる１３ｍｍ×７５ｍｍの検体管のサイズとすることができ、この場合には、図２および図４に示す５管カセット１４を使用することができる。しかしながら、様々なサイズおよび種類の検体管１６を使用することができ、それに応じてカセット１４を設計することができることを理解されたい。カセット１４は、様々な検体管１６を保持するように構成することさえできる。本明細書で述べるように、様々なサイズの検体管１６も、図６に示すドア１８を通して個別に挿入され得る。

検体管１６が蓋３２を有する場合、血液が管の内部で撹拌され、（より正確なサンプリングのために）より均質になるように、（カセット１４によって保持された）検体管を揺動させることができる。このような揺動は、ステーションＡにおいて起こることができ、図４では、カセット１４は、その揺動された位置において見ることができる。

カセット１４の揺動中に、ステーションＣに移動し、実施すべき試験のために試薬３４の適切な一部のサンプリングを開始するようにプローブキャリア２２に指示することができる。しかしながら、試験が、血液試料の前に試薬３４が格納領域２０上に配置されることを想定していなければ、プローブキャリア２２は、管１６から血液をサンプリングした後にこのような工程を実行し得る。

位置Ｃにおいて見ることができるように、試薬３４（例えば、表１および２に記載される試薬）はバイアル中に保持することができる。しかしながら、試薬は、これに代えてまたはこれに加えて、（図２および３に示される）プレートベース３０上または例えばプローブ２６に直接配管することができる他の領域（見えない）中などのその他の場所に配置されたリザーバ中に保持することができる。

本明細書に記載されるように、診断機器１０はまた、臨床医が外側ドア１８を介して検体管１６を挿入することができることを企図している。これに対応するために、図示された機器１０には管レシーバ３８が設けられており、そのような管レシーバは、図３～５に見られるように、小児用管を含む様々なタイプの検体管１６を収容することができる。図示された例では、検体管１６は、検体管１６の容易なアクセスおよび回収を可能にする旋回可能なトレイ３６によって保持されることができる。あるいは、図４に示すように、検体管１６は、回転可能なカセット４０によって保持されることができる。

検体および／または試薬３４のサンプリングの間および後に、プローブキャリア２２は、プローブ２６を洗浄することができるようにプローブ洗浄ステーション２８に移動することができる。プローブ２６を洗浄することにより、交差汚染が防止され、したがって不正確な試験結果が防止される。

（例えば、ステーションＡにおいて）管内の検体の十分な混合が為された後、検体はプローブ２６によってサンプリングされ、格納領域２０内の所定のウェルまたは管中に置かれる。本明細書に記載される方法を使用する造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞のうちの少なくとも１つの分析および計数など、実施すべき試験に応じて、２つ以上のウェルまたはチューブ中に検体試料を配置することができ、対応する量の検体（血液など）を予め吸引することができる。次いで、本明細書に記載されているように、プローブ２６を洗浄ステーション２８において洗浄する。

格納領域２０に検体試料を置いた後に検体試料に試薬を添加するか否かに応じて、プローブキャリア２２は、適切な試薬３４のサンプリングのためにステーションＣに移動させることができる。この場合にも、１を超える試薬が必要であれば、プローブ２６は、各試薬３４サンプリングの間および最終の試薬３４サンプリング後に、洗浄ステーション２８において洗浄することができる。

格納領域２０の各ウェルまたは管内に検体試料および試薬を置くために、プレートベース３０の回転の点に応じて各ウェルまたは管がプローブ２６に提示され得るように、プレートベース３０は回転軸上に配置され得る。プレートベース３０のこのような構成および回転運動は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，８３２，２９２号に開示されている。

多軸プローブキャリアもこれらの最終目的を達成することができるが、単軸装置には特定の利点が存在する。例えば、単軸装置は、より少ない部品およびより少ないプログラミングを必要とし、より小さな機器１０の設置面積をもたらし、位置を揃えることがより容易であり、より信頼性が高く、より安定であり、最終的にステーション間の移動がより速い。

ウェルまたは管内への配置後、検体試料を（試薬および実施すべき試験に応じて）特定の時間試薬と反応させ、次いで、分析のためにフローサイトメータを通して処理する。細胞のサイズ選別および区別のために電子ボリュームを使用する装置、または吸光度を使用するヘモグロビン測定など、他の試験装置も組み込むことができると考えられる。

好都合には、格納領域２０は、試料調製と分析の間の共通のインターフェースとして機能する。さらに、格納領域２０は、固定式のまたは取り外し可能な、および／または使い捨てもしくは再使用可能な構成要素を含むことができ、臨床医が使用後にインターフェース全体（例えば、マイクロタイタープレート）を捨てることを選択することを可能にする。調製アームと分析アーム間の共通のインターフェースとして機能することにより、格納領域２０は、誤りおよび外部または環境影響への曝露がより少ないシステムを提供する。

プロセッサおよびプロセッサ上で動作するように構成されたソフトウェアスケジューラ（図示せず）も、開示されたシステムに組み込まれる。ソフトウェアスケジューラは、例えば、固定反応速度論のための利用可能なウィンドウを再計算する（再現可能な反応速度論を維持しながら処理量を最適化する）（例えば、抗体インキュベーション、ＲＢＣ溶解時間、反応クエンチ時間など）ようにプログラムすることができる。本明細書に記載される方法およびシステムにおいて使用することができるソフトウェアコンポーネントシステムの一例が図８に示されている。

また、本明細書で論じられているように、多数の項目をバーコード化し、動作中に追跡することができる。このようなバーコード化および追跡は、ソフトウェアスケジューラによって登録することができる。例えば、バーコードは、試薬バイアル３４、検体管１６（異なる患者および／またはサイズに対して異なるバーコードを有する）、シース液、共通のインターフェース（例えば、格納領域２０）、調製試薬、ビーズ試薬、カセット１４などに割り当てることができる。これらの様々な項目をバーコード化することにより、試薬の使用／消費、各試薬瓶の残りの試験数、開放した容器の有効期限、閉鎖された容器の有効期限、アッセイ値などの様々な重要な情報を追跡することができる。

ソフトウェアスケジューラは、図８に記載される工程および／または以下の工程を実行するように構成することができる：この時点で新しい試料を追加してよいか否かを決定し、別の活動を優先させる必要があれば、ドアまたはマルチローダ（ランダムなアクセス）を待機させる；存在すれば非速度論的反応、またはより広い許容され得るウィンドウを有する速度論的反応を調整することによって、試料ドア１８が利用できない影響を最小限に抑える；衝突効果を最小化し、各速度論的反応に対して許容され得るウィンドウを定義することによって処理量を最適化する；分析が所定量の時間を要するようにさせる（スケジュール通りに停止／一定体積の試料）；すべての活動を適切にスケジュールできるように、各サイクル（血液の取得、混合を含む試薬の添加、分析）に対して所定の時間を使用する；スケジュールに新しい試料を追加することが許容され得るかどうかを判定する際にすべてのスケジュールされた試料時間ウィンドウを考慮に入れ、そのすべての活動が所定の時間に行われるようにこのような新しい試料のスケジュールを決める；スケジュールが達成され得るかどうかを判定する際に、ハードウェアリソースおよび物理的なハードウェアの衝突を考慮に入れる。

本明細書に開示されるソフトウェアスケジューラと組み合わせて機器１０を使用すると、最初の結果までの時間（ＴＦＲ）は一時間未満であり得、その後の結果は約３０分またはそれ未満ごとに報告される。処理量は、１日当たり５試料超、１０試料超、２０試料超、３０試料超、４０試料超、５０試料超、６０試料超、７０試料超、８０試料超、９０試料超または１００試料超とすることができ、はるかに素早く早い段階で結果を報告することができるので、検査室の能力を大幅に増加させることができる。

図示されている例では、報告可能な結果を得るためのデータの分析は自動化されている（例えば、ゲート、領域およびカーソルの設定ならびに疑わしい結果の警告または通知）。警告／通知態様は、システムにおける自動検証機能と称することができる。

すべての試料の調製および分析が１つの機器１０に完全に統合されているため、臨床医は、試料が収集され、十分な数が収集された段階で処理が開始される、すなわち、試料の群全体で血液処理の各工程を進める遅くてつまらない「バッチ処理」を実行する必要はない。対照的に、機器１０は、格納領域２０内で患者試料を自動的に調製するように構成されているので、標識して追跡するための娘管は存在せず、必要な血液および試薬は著しく少ない。試料はいつでもシステムに装填することができ、一例では、それぞれが自動的に処理され、３０分未満、２０分未満、または１５分未満など、１時間未満でシステムパイプラインを出る。その後の試料は、約３０分またはそれ未満の間隔でシステムパイプラインを出ることができるが、正確な時間は、実施すべき試験および必要な試料調製時間に応じて変化する。

重要な利点は、検査室のコスト削減である。より多くの試料を１日で処理することができるだけでなく、１つのシステムを使用することにより、システムコストがより低くなり、試薬コストがより低くなり、手作業が少なくなる。したがって、機器１０を所有し、動作させるための全体的なコストは、著しく低くなる。

さらに、従来技術の方法およびシステムは、複数のモジュールおよびコンピュータスクリーンを備え、１０～１３フィートの貴重な実験台スペースを占める。対照的に、診断機器１０はコンパクトであり、自動装填装置部分１２を含めて幅がわずか３１インチである。自動装填装置部分がない図６に示されている例では、必要な設置面積はさらに小さくなる。タッチスクリーンコンピュータ／スクリーン（図示せず）をシステムの上部に都合よく配置することも可能であり、設置面積が小さく保たれ、検査室の貴重なスペースが確保される。

提案されたシステムは、委託研究、医薬品開発、ならびに大学の医療センターおよび参照試験所での研究のために１またはそれを超える固定された免疫監視パネルを実行する臨床研究者のためにも使用できることが企図される。幹細胞およびＴ細胞を分析および計数するための記載された試験に加えて、免疫不全（ＨＩＶ－ＡＩＤＳ）、自己免疫疾患、臓器移植応答、感染性疾患、腫瘍学などをモニタリングするために、既存の標準化された免疫モニタリングパネルを使用することができることがさらに企図される。両用途は、本システム上で並行して実行することができる。

一般に、分解能（同じ量の蛍光を有する２つの粒子を測定し、それらに同じ値を割り当てる能力）および感度（薄暗い粒子とわずかにより明るい粒子とを区別する能力）という２つの特性が性能に寄与する。これらの特性を測定するために、本明細書では「ミクロスフェア」または「ビーズ」を使用することができる。これらのミクロスフェアは、例えば、既知の蛍光値を有するフルオロフォア標識された材料から作製することができる。このようなミクロスフェアがフローサイトメータに通される場合、フローサイトメータによって測定されている分解能および感度値を反映するある種の試験が行われてきた。

使用される試薬が適切に機能していることを確認するために、ビーズ試験の後に別の試験を行うことができる。フローサイトメータの分野で訓練を受けたユーザは、主として経験または自分自身の（変化し得る）洞察に基づいて、必要とされる診断試験をその日に実行できるようにフローサイトメータが十分に「最適化」されたかどうかについての判定を行う。

フローサイトメータによって実施される診断試験は、業界で主流のビーズおよび試薬試験とは異なる最小の分解能および感度ニーズを有することができる。ビーズおよび試薬試験は、フローサイトメータが最適化されていないことを臨床医に示すが、実際には、フローサイトメータは必要とされる診断試験を実行するのに十分に動作しており、単に仮想のビーズおよび試薬試験に合格しなかったに過ぎない場合があり得る。

したがって、分解能または感度の不足を試薬および機器の性能に絞り込むことができるように、既知の患者試料、例えば血液処理対照を利用することが望ましい場合があり得る。既知の患者試料、例えば血液対照が使用される場合、試薬および機器の性能のみが試験の分解能および感度の結果に影響を及ぼし得る。

いくつかの例では、既知の患者試料を対照試料／初期試験試料として使用することができる。既知の患者試料は、その機器によって診断されるべき集団と類似または同一である識別可能な集団、例えば少なくとも２種類の細胞を有することを特徴とする。図２～７に示されるものなどの標準化された免疫モニタリングパネルを実行している診断装置の例では、既知の試料は、機器１０によって分析される細胞の種類（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞）を含む細胞内容物を有する。

この例によれば、既知の患者試料が評価を受けている機器１０を通過したときに、結果は、機器１０が複数の細胞集団を検出することができたかどうかを示すはずである。装置の分解能および感度が最適化されていれば、別個の細胞集団が結果に示されるはずである。本明細書に記載されているようにオフ光散乱、ＥＣＶおよび／または蛍光データを計算するために、ソフトウェアを使用することができる。

開示された例は、特定の試験で特定のパラメータについて機器１０の分解能および感度を測定し、試験を実行するための充足性に関してそれを定量化するための統計量を導出するために使用することもできる。次いで、そのような統計量は、試験において使用される材料が適切であるかどうかを判定するために使用され得る。例えば、サイトメータ／試薬パッケージから最小の分解能および感度ニーズを定義し、次いで、サイトメータ／試薬パッケージが任意の患者に対して試験を実行するのに適切に機能しているかどうかを分析するために、統計量を使用することができる。統計量は、以前の患者試料からのデータが正確なものとして受容されるべきかどうかを判定するためにも使用され得る。最終結果はまた、試験の性能を認定する数的手段であり得る。

実施例
実施例１本明細書中に記載されるシステムによるＣＤ３４＋造血前駆細胞および残存ＣＤ３＋Ｔ細胞の計数：試験プロトコルの同等性の検証
背景
動員された末梢幹細胞および前駆細胞（ＰＢＳＣ）を移植目的で使用することが増加したことに伴い、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄらは、高度の正確性および実験室間での再現性を可能にする単純で高感度の方法を提供することを意図して、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＨｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＧｒａｆｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＩＳＨＡＧＥ）と協力して、１９９６年にＣＤ３４＋計数のための一連の基準を記載した。得られた「ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」は、ほどなく、フローサイトメトリによる造血ＣＤ３４＋前駆細胞の計数のためのゴールドスタンダードになった。

ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓの顕著な特徴は、生存白血球からＣＤ３４＋細胞の数を導出する逐次ゲーティング戦略である。このＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓは、試験の変動性ならびに非特異的な細胞および蛍光色素の結合を是正するために、陰性対照と共に二連で試験を実施することを要求する。逐次ゲーティングの選択性のために、陰性対照の使用は、その後の数年、ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓの作成者によって任意とされたが、欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）は陰性対照の使用を義務付けている。ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓとは対照的に、Ｐｈ．Ｅｕｒ．に記載されているＳｔａｎｄａｒｄｓは、欧州薬局方の詳細に関する欧州評議会条約ならびにＥＵおよび国内の医薬法制に定められているように、法的拘束力を有する。

ＩＶＤシステムの一部である現在利用可能なソフトウェアソリューションは、ＩＶＤ状態を維持しながら、陰性対照ありまたはなしのいずれかでＣＤ３４＋を計数するためのパネルを実行する柔軟性を提供しない。さらに、すべてのＣＤ３４＋計数試薬キットが陰性対照試薬を含有するわけではない。したがって、検査室は、ユーザが定めた独自の試験を検証する必要がある。

幹細胞および前駆細胞が同種異系（非自己）設定で移植される場合には、潜在的な移植片対宿主病を予測し管理するために、ＣＤ３４＋前駆細胞の数だけでなく、移植片中の免疫担当ＣＤ３＋残存Ｔ細胞の数も定量することが推奨される。今日のところ、ＣＤ３４＋前駆細胞およびＣＤ３＋残存Ｔ細胞の同時分析を可能にする市販のＩＶＤキットは利用できず、そのため、検査室は、この場合にも、この用途のためのユーザが定めた試験の検証に頼る必要がある。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ
本明細書に記載されるシステムは、とりわけ、臨床的ＣＤ３４＋計数のために合計６つの異なる取得パネルを提供することによって（図９）、これらの制限を克服することを意図している。すべてのプロトコルは、ＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓの逐次ゲーティング戦略に従い、パネルは、ＩＳＨＡＧＥによって推奨され、Ｐｈ．Ｅｕｒ．によって義務付けられている３つの試験（二連＋陰性対照）の「完全」パネル、陰性対照を使用しないオプションのＩＳＨＡＧＥパネル、または稀な検体タイプのためにＱＣ目的で使用することができる単一の試験のいずれかを実行するための選択肢を与える。すべてのパネルの組み合わせは、ユーザが定めた試験を作製する必要がないＩＶＤソリューションの一部である。

同種異系起源の試料中の残存ＣＤ３＋Ｔ細胞の分析のために、オプションのＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡｌｌｏ－ＣＤ３ＫｉｔをベースのＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＫｉｔと組み合わせることができる。両キットの組み合わせは、図９で本明細書中に記載される３つのパネルオプションの間で選択する能力を同じく有する、１回の実行でＣＤ３４とＣＤ３の一体化された定量を行うための検証されたソリューションを提供する。

試験方法
ＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒは、本明細書に記載される方法を実施するために使用することができる１つのシステムであり、「無洗浄」試料調製過程でＳＴＥＭ診断アプリケーションを実行する定量的自動分析器である。このシステムは、検体導入から結果報告までの試料の自動処理を伴う自動化された分析装置であることを意図しているので、「Ｌｏａｄ＆Ｇｏ」フローサイトメータと呼ばれる。ＡＱＵＩＯＳＳｙｓｔｅｍＳｏｆｔｗａｒｅおよびＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＴｅｓｔｓおよびＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌＲｅａｇｅｎｔｓは、光散乱および蛍光強度の標準化のユーザ検証または色補正設定の検証を必要としない。

自動運転は、リクエストを作成し、自動装填装置中の複数の検体管またはＳｉｎｇｌｅ－ｔｕｂｅＬｏａｄｅｒ中の１つの検体管を含有するカセットを搭載することによって開始される。試料は、これらのリクエストに従って自動的に処理される。試料を染色およびインキュベートし、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＬｙｓｉｎｇ溶液を用いて赤血球を溶解する。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＴｅｓｔｓを用いてＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙシステムで白血球を分析する。ＳＴＥＭ試料調製は、円錐形状の深いウェルを有するバーコード化された９６ディープウェルプレートを使用して動作するように最適化される。各ウェルは６００μＬまで保持する。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭシステムは、最大２つのキット：ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭキットを単独で、またはＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡＬＬＯ－ＣＤ３キットと組み合わせて利用することができる。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ－Ｋｉｔ試薬は、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ／ＣＤ３４－ＰＥマウスモノクローナル抗体試薬、対応する陰性対照（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ／ＣＤ３４－ＣＴＲＬ）、絶対数試薬（ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ－ＣｏｕｎｔＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、細胞生死判別試薬（７－ＡＡＤ）および即時使用可能な溶解試薬からなる。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡｌｌｏ－ＣＤ３Ｋｉｔは、同種異系ドナー由来の試料材料中のＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ３４＋細胞を同時に計数するためのオプションの試薬キットである。キットは、ＣＤ３－ＰＣ７および適切な陰性対照を含有する。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＴｅｓｔｓは、ＣＤ３４＋ＨＰＣの生存絶対数／μＬ、ＣＤ４５＋の生存絶対数／μＬ、および生存ＣＤ３４＋ＨＰＣのパーセンテージの同時同定および計数のために、モノクローナル抗体を含有するＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＫｉｔ試薬を使用している。ステムパネル：二連＋陰性対照で試験を実行する（３ウェル）；ステム二連：二連で試験を実行する（陰性対照なし；２ウェル）；ステム単一：単一の試験（１ウェル）という３つのＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ試験がＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭメニューの一部として利用可能である（図９）。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡＬＬＯＴｅｓｔｓは、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡＬＬＯ－ＣＤ３Ｋｉｔ試薬と組み合わせてＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＫｉｔ試薬を使用している。２つのキットの組み合わせはモノクローナル抗体を含有し、ＣＤ３４＋ＨＰＣの生存絶対数／μＬ、ＣＤ４５＋の生存絶対数／μＬ、生存ＣＤ３＋の生存絶対数／μＬおよび生存ＣＤ３４＋ＨＰＣのパーセンテージの同時同定および計数を可能にする。ＳＴＥＭＡＬＬＯパネル：二連＋陰性対照で試験を実行する（３ウェル）；ＳＴＥＭＡＬＬＯ二連：二連で試験を実行する（陰性対照なし；２ウェル）；ＳＴＥＭＡＬＬＯ単一：単一の試験（１ウェル）という３つのＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＡＬＬＯ試験が利用可能である（図９）。

すべての試験は、１３μＬの各試薬（モノクローナル抗体および生死判別色素）で染色された４３μＬの試料を使用する。１５分間のインキュベーション後、４３０μＬのＬｙｓｉｎｇＲｅａｇｅｎｔを用いて試料を溶解し、次いで約１５分の溶解インキュベーション後にＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ－Ｃｏｕｎｔを加える。次いで、試料を混合し、分析のために吸引する。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ／ＳＴＥＭＡＬＬＯＤｕｐｌｉｃａｔｅまたはＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭ／ＳＴＥＭＡＬＬＯＰａｎｅｌの場合、それぞれ、２つまたは３つのウェルが使用される。

研究の目的および範囲
製品の特徴決定の一環として、本研究は、図９に要約された分析オプションにわたって生存ＣＤ３４＋絶対数およびＣＤ３＋Ｔ細胞絶対数の同等の性能を比較するために行われた。

４０個の新鮮なアフェレーシス試料を収集し、分析した。ＣＤ３４＋計数のための試験オプション間の同等性を評価するために、２つの追加の分析オプション「ＳＴＥＭＤｕｐｌｉｃａｔｅ」（二連のＣＤ３４、陰性対照なし）および「ＳＴＥＭＳｉｎｇｌｅ」（単一の試験）に対する基準として、分析オプション「ＳＴＥＭＰａｎｅｌ」（二連のＣＤ３４＋陰性対照）を使用した。

２つの追加の分析オプション「ＳＴＥＭＡＬＬＯＤｕｐｌｉｃａｔｅ」（二連のＣＤ３４およびＣＤ３、陰性対照なし）および「ＳＴＥＭＡＬＬＯＳｉｎｇｌｅ」（ＣＤ３４およびＣＤ３に対する単一試験）の基準として分析プロトコル「ＳＴＥＭＡＬＬＯＰａｎｅｌ」（二連のＣＤ３４およびＣＤ３＋陰性対照）を使用することにより、追加のマーカーとしてＣＤ３を含むことができる分析オプションで、ＣＤ３４＋およびＣＤ３＋計数について同じ試験スキームを実行した。

研究は、ＣＬＳＩＥＰ０９ｃ：ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔＰｒｏｃｅｄｕｒｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎａｎｄＢｉａｓＥｓｔｉｍａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＰａｔｉｅｎｔＳａｍｐｌｅｓ；ＡｐｐｒｏｖｅｄＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ－ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎに従って行った。試料は、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｏｆｔｗａｒｅおよびＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ試薬を備えたＡＱＵＩＯＳＣＬフローサイトメータを使用して分析した。

試験設計
本研究で使用したＡＱＵＩＯＳＣＬ機器の毎日の起動および停止は、製造業者の使用説明書に従って実施した。保守管理作業は保守管理Ｌｏｇに記録した。

機器の調整を確認するために、および割り当てられたアッセイ値内での動作を確保するために、Ｆｌｏｗ－ＣｈｅｃｋＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓおよびＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＣＤ３４ＣｏｎｔｒｏｌＣｅｌｌｓを用いて、毎日の品質管理（ＱＣ）および工程対照の実行を行った。

抗凝固剤としてＡＣＤ－Ａを用いて、本研究に使用したアフェレーシス試料を収集し、使用するまで２～８℃で保存した。試料は、白血球数が３万細胞／μＬ未満であった場合には希釈せずに使用され、そうでなければＰＢＳ／６％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に３万細胞／μＬを超えない白血球濃度に希釈した。各アフェレーシス試料の個々の一定分量を、図１に要約した試験オプションに従う合計１２回の実行のために使用した。溶血した検体および目に見える血餅を含有する検体は除外した。

データ解析は、重み付きデミング回帰を使用することによって、ＣＬＳＩＥＰ０９ｃに従って行った。バイアスの標準誤差に基づいてバイアス推定値の９５％信頼限界の上限および下限を計算し、製造業者の合格限界（仕様）と比較した。

結果
ＣＤ３４＋絶対数に対するＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ試験オプションの同等性
造血前駆細胞移植の結果は、レシピエントにおける造血を再構成するために十分な数の生きたＣＤ３４＋細胞を首尾よく注入することに依存し、そのため、フローサイトメトリによるＣＤ３４＋細胞の正確な決定は、移植手順の中で鍵となる要素である。

ＣＤ３４＋計数のための他のソリューションとは対照的に、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、ＣＤ３＋Ｔ細胞の必要に応じた分析ありまたはなしのいずれかで、ＣＤ３４＋計数のための合計６つの異なるプロトコルを提供する（図９）。これらの異なる試験オプション間の同等性を実証するために、同じ試料からの一定分量を異なるオプションで実行し、相関性について分析した。

第１の一連の実験では、以下の３つのオプション（図１０Ａ～図１０Ｃ）間でのＣＤ３４計数の同等性を実証するために、ＣＤ３を含まない３つの分析プロトコルオプション（ＳＴＥＭＰａｎｅｌ、ＳＴＥＭＤｕｐｌｉｃａｔｅ、ＳＴＥＭＳｉｎｇｌｅ）を用いてアフェレーシス試料を実行することによってＣＤ３４＋細胞の絶対数／μＬを評価した。試験が二連で行われる分析オプションの比較（ＳＴＥＭＰａｎｅｌ対ＳＴＥＭＤｕｐｌｉｃａｔｅ、図１０Ａ）については、双方の実行の平均を分析のために使用した。二連の実行を含む試験オプションを単一実行の試験オプションに対して比較する場合には（ＳＴＥＭＰａｎｅｌ対ＳＴＥＭＳｉｎｇｌｅ（図１０Ｂ）およびＳＴＥＭＤｕｐｌｉｃａｔｅ対ＳＴＥＭＳｉｎｇｌｅ（図１０Ｃ））、最初の実行の結果を基準として使用した。分析されたすべての回帰ペアについて、分析オプションにわたる生存ＣＤ３４＋細胞絶対数の等価な成績は、定められた許容基準内にあることが実証された。

第２の一連の実験では、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３＋細胞の並行した計数を意図した３つの分析プロトコルを使用することによって、ＣＤ３４＋細胞の数を分析し、すべてのその他の基準は同一に保った（図１１Ａ～１１Ｃ）。この場合にも、分析されたすべての回帰ペアについて、分析オプションにわたる生存ＣＤ３４＋細胞絶対数の等価な成績は、ＣＤ３を用いた分析プロトコルに対する基準でもある定められた許容基準内にあることが実証された。

要約すると、ＣＤ３ありまたはなしのいずれかでの、ＣＤ３４＋計数のための６つの分析オプションはすべて、分析された相関ペアに対して同等の結果を与えた。

残存ＣＤ３＋Ｔ細胞の計数に対するＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍ試験オプション同等性
血液学的疾患または造血系の非悪性機能不全の場合、ＣＤ３４＋細胞は、非自己（同種異系）ドナーの末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）または臍帯血（ＣＢ）から収集される。ドナーとレシピエントが同一人物である自家状況におけるのと同様に、今日、動員されたＰＢは、同種異系移植スキームにおいてＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞のために最も一般的に使用される供給源である。

動員された末梢血からのＣＤ３４＋細胞の使用は、移植後の造血の比較的迅速な回復という利点を有するが、より多数の循環Ｔ細胞に起因する急性移植片対宿主病（ａＧｖＨＤ）のリスクの増加を伴う。急性および慢性ＧｖＨＤは、同種異系移植を受ける患者の約３０～４０％に発症し、ドナーＴ細胞がａＧｖＤＨを媒介する上で中心的な役割を果たすと認識されているので、ＣＤ３４＋細胞と一緒に移植片中のＣＤ３＋Ｔ細胞を計数することが、多くの検査室で標準的な慣行となっている。

ＣＤ３４＋計数のための標準的な試験プロトコルに加えて、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＣＤ３４＋細胞と共に１回の実行で分析するオプションを提供する。ＣＤ３４＋分析だけでなくＣＤ３＋計数についても試験オプションの同等性を保証するために、本明細書に記載される３つの分析オプション（図１２Ａ～１２Ｃ）についてＣＤ３＋計数の結果を比較する第３の一連の実験を行った。ＣＤ３４＋に関して、分析オプションにわたる生存ＣＤ３＋細胞絶対数の等価な成績は、分析されたすべての回帰ペアに対する定められた許容基準内にあることが実証された。

結論
ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、ＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ上でのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞の自動化された分析のためのモジュール式アプローチであり、パネルおよびアッセイの柔軟性に関する現在利用可能なソリューションの限界を克服することを意図している。

本研究は、一方のオプションを他方のオプションよりも選択することによる潜在的なバイアスを排除するために、システムによって提供される試験オプションがＣＤ３４＋およびＣＤ３＋絶対数について同等のデータをどの程度もたらすかという問題に対処した。

要約すると、分析されたすべての回帰ペアについてデータの同等性を実証することが可能であり、分析オプションにわたる生存ＣＤ３４＋細胞絶対数および生存ＣＤ３＋絶対数の等価な成績は、定められた許容基準内にあることが実証された。

実施例２ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍとその基礎となった方法であるＦＣ５００Ｓｔｅｍ－Ｋｉｔのワークフロー比較
背景
今日、５万を超える造血幹細胞および前駆細胞（ＨＰＣ）移植が、いくつかの血液悪性腫瘍の処置の他、非血液学的適応症のために世界中で毎年行われている。

臨床検査室は、時間とリソースを消費するユーザが定めた試験の検証を回避するために、ＣＤ３４＋ＨＰＣ計数のための市販のＩＶＤソリューションに依存している。ほとんどの試薬キットおよびソフトウェアパッケージは、１９９６年および１９９８年のＩＳＨＡＧＥＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓに応じて開発されたが、それ以降、特に自動化能力に関して、診断検査室の進化する要求を満たすように更新されなかった。血液腫瘍学検査室では、ＨＰＣ試料はしばしば検査室に緊急（ＳＴＡＴ）試料として届き、早急な対応が必要であり、日常的なワークフローを乱す。これらの試料に伴うすべての問題は二度手間をかけるため、人為的エラーの可能性を増大させる。これらの検査室にとって、ＣＤ３４＋ＨＰＣの分析はスピードが重視されるため、理想的にはサンプリングミスまたはその他の問題のリスクを最小限に抑えるように、ＨＰＣ試料を通常のワークフローに統合することが望ましい。

本実施例は、所要時間およびオペレータが実際に操作する時間に関して、自動化されたＣＤ３４＋計数のための新たに開発されたＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍのワークフローを、その基礎となった方法であるＦＣ５００フローサイトメータ用のＳｔｅｍ－Ｋｉｔ（いずれもＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に対して比較する。

従来のフローサイトメトリワークフローの概要
ＦＣ５００用のＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＳｔｅｍ－ＫｉｔなどのＣＤ３４＋計数のための多くの従来のフローサイトメトリソリューションは、試料の手作業での調製、ワークリストの手作業での作成、手作業でのデータ検討および数値データの手作業での集計を必要とする。このワークフローは、より長い実行時間、より長い実際に操作する時間をもたらし得、より多くの経験豊富なオペレータを必要とする。

基礎となった方法（ＦＣ５００でのＳｔｅｍ－Ｋｉｔ）を用いてＣＤ３４＋計数試験を実施するために、オペレータは、機器の調整を手作業でチェックし、蛍光色素の漏れ込みを検証および調整する（補正）ための対照を調製し、工程対照を調製および実行し、最終的に実際の患者／ドナー試料を調製および実行する必要がある。得られたデータを検証し、検査室情報システム（ＬＩＳ）に手作業で転送する必要がある。試薬および品質管理（ＱＣ）日誌は、通例、手作業で保管される。代表的な手動のフローサイトメトリワークフローについては図１３を参照されたい。

ＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒのワークフローの概要
ＡＱＵＩＯＳＣＬは、試験結果もたらす準備工程の大半を実行する自動化されたシステムであり、その結果、ほとんどの手作業の準備工程が取り除かれる。

ＡＱＵＩＯＳ上でのＣＤ３４＋計数のためのＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍでは、オペレータは、システムに試薬を一回装填し、機器を起動し、ＱＣ試料を実行する必要があり、その後、残りの作業日を通じて患者試料を装填および分析する準備ができる（図１４）。

比較プロトコル
本事例研究の目的は、とりわけ、ＣＤ３４＋計数に関してＡＱＵＩＯＳＣＬＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒデザインを評価すること、およびＦＣ５００でのＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＳｔｅｍ－Ｋｉｔ（基礎となった法）と比較することを通じて、結果として生じるそのワークフローをモデル化することであった。この事例研究は、以下のワークフローパラメータを推定する。

所要時間－代替のシステムでは、期間は最初の試料調製工程で始まり、完了した試験結果で終わる。ＡＱＵＩＯＳＣＬシステムでは、期間は、自動装填装置に配置された試料から始まり、表示されている最後の試料についての完了した試験結果で終わる。いずれのシステムについても、時間はＱＣを含まない。

オペレータが実際に操作する時間－製造業者の使用説明書に従って、提供された試験手順に列挙された工程を物理的に実行するためにユーザが必要とする時間。

試料調製および分析過程をビデオ録画することによって時点を取得し、社内のワークフロー分析ソフトウェアを使用してモデル化した。
結果

試料処理所要時間およびオペレータが実際に操作する時間この試験事例は、二連＋陰性対照で調製された、動員された末梢血の１つの試料または１０個の試料のバッチのいずれかを用いるシナリオからなった。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍを、その基礎となった方法であるＦＣ５００でのＳｔｅｍ－Ｋｉｔと直接比較した。二連の実行＋陰性対照からなる試験についてのデータを示す。

プロセス工程は主に抗体および赤血球溶解試薬とのインキュベーション時間によって決定されるので、１検体試料については、試料調製から結果生成までの結果に至る時間は大きな差を示さなかった（基礎となった方法については５６：１９分、ＡＱＵＩＯＳについては５３：５４分；図１５Ａ）。

しかしながら、オペレータが実際に操作する時間は、基礎となった方法の６：２３分から、ＡＱＵＩＯＳでの０：２０分へと９５％短縮することができた（図１５Ａ）。

１０検体試料のバッチ（中型の幹細胞移植センターにおける平均１日作業量）では、これらの差はより顕著になる。検体調製から結果生成までの結果に至る時間は、基礎となった方法の２：４０：２９時間からＡＱＵＩＯＳの２：０３：５４時間に短縮され（図１５Ｂ）、オペレータが実際に操作する時間は、基礎となった方法の１：０１：１３時間からＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍの３：２０分に短縮された（図１５Ｂ）。

手作業での過程に対しても、ある工程は並行して実行することができ（第１の試料のインキュベーション時間中に次の試料をピペット操作することなど）、１０個の試料に対する総時間は、１つの試料の１０倍の合計よりも短い。

１年の期間にわたって１作業日当たり１０個の試料を想定すると、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍによって、検査室は毎年何百時間もの貴重な技術時間を節約する。さらに、１日当たり１０試料という平均的な作業量を実行した場合に結果が得られるまでの時間がより迅速になることは、ＣＤ３４＋計数などのスピードが重視されるアッセイにとって後押しとなる。

品質管理（ＱＣ）手順のための工程所要時間およびオペレータが実際に操作する時間
規制された環境では、システム性能は、機器設定および実行されるべき試験の両方に関して、適切な品質管理および工程対照により管理される必要がある。ＦＣ５００でのＳｔｅｍ－ＫｉｔおよびＡＱＵＩＯＳのいずれについても、フルオロスフェア（蛍光性ミクロスフェア）のアッセイされた懸濁液であるＦｌｏｗ－ＣｈｅｃｋＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓを用いてフローサイトメータの光学的調整および流体システムの毎日の検証が行われる。関心対象の分析パラメータを検証するための工程対照として、基礎となった方法は、正常な血液試料に添加される凍結乾燥されたＣＤ３４＋細胞（Ｓｔｅｍ－ＴｒｏｌＣｅｌｌｓ）を使用するのに対して、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、ヒト全血検体において見られる特性を代表する溶解、光散乱、抗原発現および抗体染色特性を有する安定化されたヒト白血球（リンパ球、単球および顆粒球）および赤血球の液体調製物（ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＣＤ３４ＣｏｎｔｒｏｌＣｅｌｌｓ）を使用する。

ＣＤ３４＋計数に関連するＱＣ手順のために必要とされる総時間は、基礎となった方法の２：０２：２２時間からＡＱＵＩＯＳの１：０９：４４時間に短縮された。注目すべきことに、ＱＣは患者／ドナー試料を実行することができるより前に完了する必要があり、これは１日当たり５２：３８分の時間節約につながる（図１６Ａ）。１週間に５日作業する場合、これは合計すると、ＱＣ手順のみで約４．５時間になる（図１６Ｂ）。

オペレータがＱＣ手順のために実際に操作する時間は、１日当たり１２：２２分（基礎となった方法）から１：５１分（ＡＱＵＩＯＳ）に短縮され（図１６Ａ）、その結果、ＱＣ工程のために実際に操作される総時間は週に５２分節約される（図１６Ｂ）。

結論
すべての試験事例シナリオにおいて、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、基礎となった方法より、大幅に短い実際に操作する時間を要した。１日あたり１０個の検体試料を用いる典型的な週５日間の作業では、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、手作業での作業量を約６時間削減し、検査室がより効率的にリソースを割り当てることを可能にする。さらに、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭは、試料調製から患者結果までの全体的な所要時間を短縮し、これはＣＤ３４＋計数などのスピードが重視される試験には不可欠である。

ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、「無洗浄」試料調製工程でＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞の計数を行う定量的な自動化されたソリューションである。このシステムは、検体導入から結果報告までの試料の自動処理を伴う自動化された分析装置であることを意図しているので、Ｌｏａｄ＆Ｇｏフローサイトメータと呼ばれる。これらの自動化機能によって、ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍは、多くのプロセス工程を手作業で実行する必要がある代替方法（その基礎となった方法、すなわちＳｔｅｍ－Ｋｉｔを用いるＦＣ５００を含む）と区別される。ＡＱＵＩＯＳＳＴＥＭＳｙｓｔｅｍのオールインワンアプローチは、時間の節約に役立ち、現代の検査室のワークフロー効率を増大させるのに役立つことを目的としている。

範囲の形式で表された値は、範囲の限界として明示的に記された数値を含むだけでなく、あたかも各数値および部分範囲が明示的に記されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値または部分範囲も含むように柔軟に解釈されるべきである。例えば、「約０．１％～約５％」または「約０．１％～５％」という範囲は、約０．１％～約５％だけでなく、示された範囲内の個々の値（例えば、１％、２％、３および４％）および部分範囲（例えば、０．１％～０．５％、１．１％～２．２％、３．３％～４．４％）も含むと解釈されるべきである。「約Ｘ～Ｙ」という記述は、特に断らない限り、「約Ｘ～約Ｙ」と同義である。同様に、「約Ｘ、Ｙ、または約Ｚ」という記述は、特に断らない限り「約Ｘ、約Ｙ、または約Ｚ」と同義である。

本明細書では、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明確に反対の指示がない限り、１つまたは１つを超えることを含むために使用される。「または」という用語は、別段の指示がなければ、非排他的な「または」を表すために使用される。さらに、本明細書で使用され、別段の定義が為されていない表現または用語は、説明のみを目的としており、限定を目的としていないことを理解すべきである。すべてのセクション見出しの使用は、本明細書の読解を補助することを意図しており、限定として解釈されるべきではない。さらに、セクション見出しに関連する情報は、その特定のセクションの中または外に存在し得る。さらに、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許文献は、あたかも参照によって個別に組み入れられるのと同様に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本文書と参照によってこのように組み入れられた文書との間で用法が矛盾する場合、組み入れられた参考文献における用法は、本文書の用法の補足と考えられるべきであり、相容れない不一致については、本文書での用法が優越する。

本明細書に記載される方法においては、時間的または動作的順序が明示的に記載されている場合を除いて、本開示の原理から逸脱することなく、工程を任意の順序で実行することができる。さらに、明示的な請求項の文言が、指定された工程が別々に実行されることを記載していない限り、指定された工程は同時に実行することができる。例えば、Ｘを実施するという請求項の工程およびＹを実施するという請求項の工程は、単一の操作内で同時に行うことができ、得られた方法は特許請求された方法の文言上の範囲内に属する。

本明細書で使用される「約」という用語は、値または範囲のある程度の変動、例えば、記載された値または記載された範囲の限界の１０％以内、５％以内または１％以内を許容することができる。

本明細書で使用される「実質的に」という用語は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または少なくとも約９９．９９９％もしくはそれを超えるにおけるように、過半数または大部分を指す。

本明細書で使用される「実質的にない」という用語は、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．００１％未満、または約０．０００５％未満もしくはそれ未満、または約０％もしくは０％を指す。

当業者であれば、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される態様に対する多くの修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本記述は、与えられた実施例に限定されることを意図しておらず、そのように解釈されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって付与される保護の全範囲が与えられるべきである。さらに、他の特徴の対応する使用なしに、本開示の特徴のいくつかを使用することが可能である。したがって、前述の説明または例示的な態様は、本開示の原理を例示する目的で提供されており、本開示を限定するものではなく、本開示に対する修正および本開示の変更を含むことができる。
特定の態様では例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
フローサイトメータの試料調製領域に位置する試料プレートの１またはそれを超えるレセプタクル中に、１またはそれを超える血液試料を配置することと；
少なくとも１つの第１の組成物を得るために、前記１またはそれを超えるレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理することであって、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、前記造血幹細胞、前記造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
少なくとも１つの第２の組成物を与えるために、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の前記少なくとも１つ上の前記マーカーに対して特異的な認識要素を含む前記少なくとも１つの画像化試薬の結合に十分な期間、前記少なくとも１つの第１の組成物をインキュベートすることと；
少なくとも１つの第３の組成物を与えるために、前記少なくとも１つの第２の組成物を溶解試薬で処理することと；
前記１またはそれを超える血液試料中の、生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、少なくとも１つの第３の組成物をフローサイトメトリによって分析することと；
を含む、自動化されたフローサイトメトリ方法。
（項目２）
前記方法が、二連の血液試料を用いて実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記方法が、陰性対照を用いて実施される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記陰性対照がＣＤ３４に対するものである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記陰性対照がＣＤ３に対するものである、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ３４の少なくとも１つである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記少なくとも１つの画像化試薬が蛍光レポーターを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記少なくとも１つの画像化試薬が、ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰＣ７蛍光レポーターを含む、項目１～７に記載の方法。
（項目９）
前記第１の組成物が生死判別色素をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記生死判別色素が７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数ならびに生存および総Ｔ細胞数が得られる、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記試料プレートが９６ウェルマイクロタイタープレートである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
少なくとも１つの第１の組成物を得るために前記１またはそれを超えるレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理することが、前記少なくとも１つの試薬に関して所定の体積を送達するように構成される自動化された分注器によって実行される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記インキュベートすることが、少なくとも１つの第２の組成物を与えるために、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の前記少なくとも１つに対して特異的な認識要素を含む前記少なくとも１つの画像化試薬の結合に十分な所定の期間、前記少なくとも１つの第１の組成物をインキュベートするように自動化される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
試料プレートの第１のレセプタクル中に第１の血液試料を配置することと；
第１の組成物ｆ ^１を得るために、前記第１のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、第２の組成物ｓ ^１を与えるために、第１の組成物ｆ ^１をインキュベートすることであって、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
第１の組成物ｆ ^１がインキュベートされている間に、前記試料プレートの第２のレセプタクル中に第２の血液試料を配置し、第１の組成物ｆ ^２を得るために、前記第２のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であり、第２の組成物ｓ ^２を与えるために第１の組成物ｆ ^２をインキュベートすることと；
第３の組成物ｔ ^１およびｔ ^２を与えるために、第２の組成物ｓ ^１およびｓ ^２を溶解試薬で処理することと；
生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、第３の組成物ｔ ^１およびｔ ^２をフローサイトメトリによって分析することと；
を含む、自動化されたフローサイトメトリ方法。
（項目１６）
陰性対照を調製することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記陰性対照が前記第１の組成物ｆ ^１の前に調製される、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記陰性対照が前記第１の組成物ｆ ^１の後に調製される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記陰性対照が、前記第１の組成物ｆ ^２の後に調製される、項目１５に記載の方法。

Claims

造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
フローサイトメータの試料調製領域に位置する試料プレートの１またはそれを超えるレセプタクル中に、１またはそれを超える血液試料を配置することと；
少なくとも１つの第１の組成物を得るために、前記１またはそれを超えるレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理することであって、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、前記造血幹細胞、前記造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
少なくとも１つの第２の組成物を与えるために、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の前記少なくとも１つ上の前記マーカーに対して特異的な認識要素を含む前記少なくとも１つの画像化試薬の結合に十分な期間、前記少なくとも１つの第１の組成物をインキュベートすることと；
少なくとも１つの第３の組成物を与えるために、前記少なくとも１つの第２の組成物を溶解試薬で処理することと；
前記１またはそれを超える血液試料中の、生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、前記少なくとも１つの第３の組成物をフローサイトメトリによって分析することと；
を含み、
前記マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ３４の少なくとも１つであり；
前記第１の組成物が生死判別色素をさらに含み；かつ
前記方法が、第１の濃度のＣＤ３４＋細胞を有するヒト白血球および赤血球の第１の液体調製物、ならびに、第２の濃度のＣＤ３４＋細胞を有するヒト白血球および赤血球の第２の液体調製物である対照を使用し、
前記第１の濃度と前記第２の濃度が異なり、
前記第１の液体調製物と前記第２の液体調製物の両方が、ヒト全血生検において見られる特性を代表する溶解、光散乱、抗原発現、および抗体染色特性を有し、
前記第１の液体調製物および第２の液体調製物が、使用前の正常な血液試料で希釈されない、自動化されたフローサイトメトリ方法。
前記方法が、二連の血液試料を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
前記方法が、陰性対照を用いて実施される、請求項２に記載の方法。
前記陰性対照がＣＤ３４に対するものである、請求項３に記載の方法。
前記陰性対照がＣＤ３に対するものである、請求項３に記載の方法。
前記少なくとも１つの画像化試薬が蛍光レポーターを含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも１つの画像化試薬が、ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰＣ７蛍光レポーターを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記生死判別色素が７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数ならびに生存および総Ｔ細胞数が得られる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記試料プレートが９６ウェルマイクロタイタープレートである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも１つの第１の組成物を得るために前記１またはそれを超えるレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理することが、前記少なくとも１つの試薬に関して所定の体積を送達するように構成される自動化された分注器によって実行される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記インキュベートすることが、少なくとも１つの第２の組成物を与えるために、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の前記少なくとも１つに対して特異的な認識要素を含む前記少なくとも１つの画像化試薬の結合に十分な所定の期間、前記少なくとも１つの第１の組成物をインキュベートするように自動化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つの分析および計数のための自動化されたフローサイトメトリ方法であって、
試料プレートの第１のレセプタクル中に第１の血液試料を配置することと；
第１の組成物ｆ^１を得るために、前記第１のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、第２の組成物ｓ^１を与えるために、第１の組成物ｆ^１をインキュベートすることであって、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、前記造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であることと；
第１の組成物ｆ^１がインキュベートされている間に、前記試料プレートの第２のレセプタクル中に第２の血液試料を配置し、第１の組成物ｆ^２を得るために、前記第２のレセプタクルを少なくとも１つの試薬で処理し、前記少なくとも１つの試薬の少なくとも１つは、造血幹細胞、造血前駆細胞およびＴ細胞の少なくとも１つ上のマーカーに対して特異的な認識要素を含む少なくとも１つの画像化試薬であり、第２の組成物ｓ^２を与えるために第１の組成物ｆ^２をインキュベートすることと；
第３の組成物ｔ^１およびｔ^２を与えるために、第２の組成物ｓ^１およびｓ^２を溶解試薬で処理することと；
生存および総造血幹細胞数、生存および総前駆細胞数、ならびに生存および総Ｔ細胞数の少なくとも１つを得るために、第３の組成物ｔ^１およびｔ^２をフローサイトメトリによって分析することと；
を含み、
前記マーカーが、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＣＤ３４の少なくとも１つであり；
前記第１の組成物が生死判別色素をさらに含み；かつ
前記方法が、第１の濃度のＣＤ３４＋細胞を有するヒト白血球および赤血球の第１の液体調製物、ならびに、第２の濃度のＣＤ３４＋細胞を有するヒト白血球および赤血球の第２の液体調製物である対照を使用し、
前記第１の濃度と前記第２の濃度が異なり、
前記第１の液体調製物と前記第２の液体調製物の両方が、ヒト全血生検において見られる特性を代表する溶解、光散乱、抗原発現、および抗体染色特性を有し、
前記第１の液体調製物および第２の液体調製物が、使用前の正常な血液試料で希釈されない、自動化されたフローサイトメトリ方法。
陰性対照を調製することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
前記陰性対照が前記第１の組成物ｆ^１の前に調製される、請求項１４に記載の方法。
前記陰性対照が前記第１の組成物ｆ^１の後に調製される、請求項１４に記載の方法。
前記陰性対照が、前記第１の組成物ｆ^２の後に調製される、請求項１４に記載の方法。