JP7646768B2 - 抗－ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ｐｄ－ｌ１）の抗体及びその用途 - Google Patents

抗－ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ｐｄ－ｌ１）の抗体及びその用途 Download PDF

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Description

［相互参照］
この出願は、２０１９年１１月０８日に中国特許庁へ出願された、出願番号２０１９１１０８８６４３．５、発明の名称「抗－ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）の抗体及びその用途」の中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容を援用により本願に組み込まれる。
本発明は、抗－ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）の抗体又はその抗原結合フラグメント、それをコードする核酸、発現ベクター及び発現細胞、作製方法、医薬組成物、並びにＴ細胞の機能を増強、又はＴ細胞が介した免疫応答をアップレギュレートするためのそれらの使用、及び腫瘍といったＰＤ－Ｌ１の発現異常又はＴ細胞の機能異常に関連する疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
免疫療法は、腫瘍治療において最も急速に発展し、最も見通しのある研究分野の１つであり、そして、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体などの免疫チェックポイント阻害剤の使用は、悪性腫瘍患者の生存期間を大幅に向上させ、腫瘍免疫療法における革新的な治療法となっている。
Ｔ細胞が介した免疫応答は、抗原免疫応答と自己耐性の維持との間に最適なバランスを維持するように、共刺激及び共抑制機構によって厳格に調節される。このバランスには、様々な活性化及び抑制タンパク質が関与する。抑制タンパク質は、免疫チェックポイント様タンパク質とも呼ばれ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）の活性化及びエフェクター機能を調節し、自己耐性を維持する。免疫チェックポイント様抑制タンパク質は、腫瘍の調節経路において重要な役割を果たしている。ＰＤ－１は、重要な免疫チェックポイントタンパク質の１つで、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１に結合すると、免疫抑制シグナルを伝達し、Ｔ細胞の活性を低下させる。その一方、腫瘍細胞は、細胞表面にＰＤ－Ｌ１を発現することによりＴ細胞の活性化及び増殖を抑制し、ＣＴＬの攻撃及び傷害を回避することもできる。そこで、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を用いて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合及び相互作用を防ぐことは、Ｔ細胞の機能を部分的に回復させ、腫瘍細胞を傷害する能力を高めることができる。
２０１１年、最初の免疫チェックポイント阻害剤であるイピリムマブは、抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体として、黒色腫の治療に成功した腫瘍免疫療法となり、これまで治療を受けた多くの患者は、従来の治療法よりも良い５年間の生存期間を取得してきた。その後、ＦＤＡによって順次に承認された３つのＰＤ－１モノクローナル抗体及び３つのＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、黒色腫以外の十数種類の腫瘍の免疫療法にうまく用いられ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び膀胱、又は尿路上皮癌などの多くのがんの一次治療手段となってきた。中国では、これまでに２つの輸入ＰＤ－１抗体及び３つの国産ＰＤ－１抗体の発売が承認されているが、ＰＤ－Ｌ１抗体はまだ承認されていない。また、ＰＤ－Ｌ１抗体とＰＤ－１抗体とが治療メカニズム及び現在の臨床試験における併用薬と適応症の面で相違していることに鑑み、新しいＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体及びＰＤ－Ｌ１に基づいた二重抗体の開発が依然として重大な社会的及び経済的意味を持っている。
本発明は、ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する抗体及び抗原結合フラグメント、これらの抗体及び抗原結合フラグメントをコードする核酸、前記抗体及び抗原結合フラグメントを含む医薬組成物及びキット、並びにＴ細胞の機能を増強、及びＴ細胞が介した免疫応答をアップレギュレートするためのそれらの使用、腫瘍免疫といったＰＤ－Ｌ１の発現異常及びＴ細胞の機能異常に関連する病気を治療するためのそれらの使用を提供する。この抗体は、ヒト及びカニクイザルのＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合するだけでなく、ヒトＰＤ－Ｌ１とヒトＰＤ－１との相互作用を遮断することもできる。
いくつかの実施形態において、ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖ＣＤＲｓの組み合わせと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせとを含み、
（１）前記重鎖ＣＤＲｓの組み合わせは、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨを含み、
Figure 0007646768000001
（２）前記軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせは、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬを含み、
Figure 0007646768000002
ここで、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、ＣＤＲ３－ＶＨ、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬのそれぞれは、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義される。
いくつかの実施形態において、ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する単離されたヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖ＣＤＲｓの組み合わせと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせとを含み、
（１）前記重鎖ＣＤＲｓの組み合わせは、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨを含み、
Figure 0007646768000003
（２）前記軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせは、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬを含み、
Figure 0007646768000004
ここで、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、ＣＤＲ３－ＶＨ、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬのそれぞれは、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義される。
特に、例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＨ１＋ＶＬ１、ＶＨ２＋ＶＬ２、ＶＨ３＋ＶＬ３、ＶＨ４＋ＶＬ４、ＶＨ５＋ＶＬ５、ＶＨ６＋ＶＬ６、ＶＨ７＋ＶＬ７、ＶＨ８＋ＶＬ８、ＶＨ９＋ＶＬ９、ＶＨ１０＋ＶＬ１０、ＶＨ１１＋ＶＬ１１、ＶＨ１２＋ＶＬ１２、ＶＨ１３＋ＶＬ１３、ＶＨ１４＋ＶＬ１４、ＶＨ１５＋ＶＬ１５、ＶＨ１６＋ＶＬ１６、ＶＨ１７＋ＶＬ１７、ＶＨ１８＋ＶＬ１８、ＶＨ１９＋ＶＬ１９、ＶＨ２０＋ＶＬ２０、ＶＨ２１＋ＶＬ２１、ＶＨ２２＋ＶＬ２２、ＶＨ２３＋ＶＬ２３、ＶＨ２４＋ＶＬ２４、ＶＨ２５＋ＶＬ２５、及びＶＨ２６＋ＶＬ２６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとの組み合わせ、前記重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせの配列よりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＣＤＲｓの組み合わせを含む。
別の具体的な実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、
１）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
２）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号３及び配列番号４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
３）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号５及び配列番号６で示される配列又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
４）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号７及び配列番号８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
５）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
６）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
７）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
８）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
９）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１７及び配列番号１８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
１０）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
１１）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、
１２）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３１及び配列番号１３２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するもの、或いは、
１３）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３３及び配列番号１３４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有するものである。
好適な一実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、キメラ、又はヒト化、又は完全ヒト化ものである。
好適な一実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する解離定数（ＫＤ）が１０ｎＭを超えなく、カニクイザルプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する解離定数（ＫＤ）が１００ｎＭを超えない。
好適な一実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれかの定常領域の配列を含み、好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列、又は変異したヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含む。
好適な一実施形態では、本発明に係る抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、ナノ抗体及び抗体の最小認識単位から選択される１つ又は複数である。
好適な一実施形態では、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、番号３４、５０、９０、１３０、１５６、３７０、３７３、４１３、又は７９４からなる群より選択される抗体と競合的にＰＤ－Ｌ１に結合することができ、かつ、
１）ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合する特性、
２）ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１タンパク質との結合を遮断する特性、
３）ＰＤ－１と細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１との結合を抑制する特性、
４）Ｔ細胞活性を増強する特性、
５）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を媒介する特性、又は／及び
６）腫瘍の成長を抑制する特性、を備える。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る抗体、抗原結合フラグメント、又はそれらの任意の組み合わせをコードする、単離された核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る単離された核酸分子又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
好適な一実施形態では、前記宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞である。より好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞、大腸菌及び／又は枯草菌に由来するものである。さらに好ましくは、前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）から選択される。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る宿主細胞を適切な条件下で培養し、抗体又は抗原結合フラグメントを単離する工程を含む抗体又は抗原結合フラグメントの作製方法、を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る抗体又は抗原結合フラグメント、本発明に係る単離された核酸分子、本発明に係る発現ベクター、本発明に係る宿主細胞、又は本発明に係る方法により作製される製品（例えば、抗体及び抗原結合フラグメント）と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。
好適な一実施形態では、前記医薬組成物は、さらに追加的な抗腫瘍剤を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とする患者に本発明に係る抗体又は抗原結合フラグメント、本発明に係る単離された核酸分子、本発明に係る発現ベクター、本発明に係る宿主細胞、本発明に係る方法により作製される製品（例えば、抗体及び抗原結合フラグメント）、又は本発明に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＰＤ－Ｌ１の発現異常及び／又はＴ細胞の機能異常に関連する疾患を予防及び／又は治療する方法を提供する。前記疾患は、腫瘍であることが好ましい。前記腫瘍は、結腸・直腸癌がであることが好ましい。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１の発現異常に関連する疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の製造における前記の抗体又は抗原結合フラグメント、本発明に係る単離された核酸分子、本発明に係る発現ベクター、本発明に係る宿主細胞、本発明に係る方法により作製される製品（例えば抗体及び抗原結合フラグメント）、又は本発明に記載の医薬組成物の使用を提供する。前記疾患は、腫瘍であることが好ましい。前記腫瘍は、結腸・直腸癌がであることが好ましい。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明に係る抗体又は抗原結合フラグメント、本発明に係る単離された核酸分子、本発明に係る発現ベクター、本発明に係る宿主細胞、又は本発明に係る方法により作製される製品（例えば抗体及び抗原結合フラグメント）と、使用説明書とを含む、キットを提供する。
用語及び定義：
別段の説明がない限り、本明細書で使用される用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するが、ただし、本明細書で明確に定義される用語については、ここで定義された意味を持っている。
本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）という用語とは、目的抗原に特異的に結合するか、又は免疫応答性を有する免疫グロブリン分子を指し、抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子工学によって操作されたもの、及び他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、異種構造共役抗体（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性抗体、二重抗体、三重抗体及び四重抗体）、抗体抱合体）及び抗体の抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ、及びｓｃＦｖフラグメントである。）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、特に断りがない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合できるインタクト抗体分子及び不完全な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントであり、それらはインタクト抗体のＦｃフラグメントを欠いているため（動物の循環からより速く除去される）、Ｆｃが介したエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を欠いている（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６，１９８３を参照のこと。その内容が本明細書に組み込まれる））の意味を包含する。
本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語とは、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する１つ又はそれ以上の抗体フラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより実行することができる。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、二重抗体、三重抗体、親和体（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノ抗体、アプタマー又はドメイン抗体であり得る。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語を含む結合フラグメントの実例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨｌドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ジスルフィド結合によりヒンジ領域で連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨｌドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体片腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（Ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）、（ｖｉｉ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ、（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ｉｘ）合成リンカーにより任意に連結され得る２つ又はそれ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ、が含まれるが、これらに限定されない。なお、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、この２つのドメインは、組換え方法を使用してリンカーにより結合でき、このリンカーは、ＶＬとＶＨの領域が互いに対になって一価分子の単一タンバク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる、例えばＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３，１９８８を参照のこと。）を形成することを可能にする。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得ることができ、これらのフラグメントは、インタクト抗体と同じ方法で使用するためにスクリーニングされる。抗原結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、完全免疫グロブリンの酵素的又は化学的切断により、又は幾つかの実施形態では、当技術分野で知られている化学的ペプチド合成手順により産生することができる。
本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１」という用語とは、重要な免疫抑制分子であるＣＤ２７９（分化クラスター２７９）とも呼ばれるプログラム細胞死リガンド－１を指す。前記ＰＤ－Ｌ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１であることが好ましい。
本明細書で使用される場合、「抗－プログラム細胞死リガンド－１抗体」、「プログラム細胞死リガンド－１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗－ＰＤ－Ｌ１抗体部分」及び／又は「抗－ＰＤ－Ｌ１抗体フラグメント」という用語などとは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子の少なくとも一部（例えば、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部分、重鎖又は軽鎖の可変領域、重鎖又は軽鎖の定常領域、フレームワーク領域又はその任意の部分が挙げられるが、それらに限られない）を含む任意的なタンバク質又はペプチド含有分子を指す。ＰＤ－Ｌ１抗体には、抗体ＣＤＲと構造及び溶媒接近性に類似するＢＣ、ＤＥ及びＦＧ構造ループを含む、抗体様タンパク質足場（例えば１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３））も含まれる。１０Ｆｎ３ドメインの三次構造はＩｇＧ重鎖の可変領域の三次構造と類似しており、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ及びＦＧループの残基をＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体由来のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２又はＣＤＲ－Ｈ３領域の残基で置換することにより、当業者は、例えばＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のＣＤＲをフィブロネクチン足場にグラフトすることができる。
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」用語とは、少なくとも２つの異なる抗原に対してモノクローナル結合特異性を有する抗体を指し、典型的にヒト又はヒト化抗体である。本発明においては、結合特異性の１つは、ＰＤ－Ｌ１の抗原エピトープに対して検出され、もう１つは、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異性抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスコード化エンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質又は細菌表面タンパク質などの、ＰＤ－Ｌ１の他の抗原エピトープ又は他の任意の抗原に対して検出されることができる。
本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体という用語とは、一種のソース生物（例えばラット又はマウス）に由来する免疫グロブリンの可変配列及び異なる生体（例えばヒト）に由来する免疫グロブリンの定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を製造するための方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７；Ｏｉら，１９８６，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２を参照されたい。これらの文献の記載を引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語とは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインに見られる超可変領域を指す。可変ドメイン中のより高い保存性の部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）を呼ばれる。当技術分野で理解されるように、抗体の超可変領域を表すアミノ酸の位置は、文脈及び当技術分野で知られている様々な定義に従って変化することができる。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ヘテロ接合超可変位置と見なすことができ、それは、これらの位置が１つの群の基準（例えばＩＭＧＴ又はＫＡＢＡＴ）での超可変領域以内にあると見なされ、異なる群の基準（例えばＫＡＢＡＴ又はＩＭＧＴ）での超可変領域以外にあると見なされることができるのためである。これらの位置のうちの１つ又はそれ以上は、拡張される超可変領域にも見られる。本発明では、これらのヘテロ接合超可変の位置に修飾を行った抗体が含まれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、主にシート構造を用いる４つのフレームワーク領域を含み、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）により連結され、これらの３つのＣＤＲはシート構造を連結するループを形成し、場合によってはシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によりＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で緊密に保持され、他の抗体鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７を参照のこと、これは、引用により本明細書に組み込まれる。）。例えば、本明細書では、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨは、それぞれ重鎖の可変領域（ＶＨ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ及び第３のＣＤＲを指し、これらの３つＣＤＲは、重鎖（又はその可変領域）のＣＤＲの組み合わせ（ＶＨＣＤＲの組み合わせ）を構成する。ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬは、それぞれ軽鎖の可変領域（ＶＬ）の第１のＣＤＲ、第２のＣＤＲ及び第３のＣＤＲを指し、これらの３つＣＤＲは、軽鎖（又はその可変領域）のＣＤＲの組み合わせ（ＶＬＣＤＲの組み合わせ）を構成する。
本明細書で使用される場合、「抗体抱合体」という用語とは、抗体分子が直接又はリンカーを介して別の分子に化学的に結合して形成される共役体／抱合体を指す。例えば、抗体－医薬抱合体（ＡＤＣ）では、医薬分子が前記の別の分子である。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語とは、抗体の生成方法に限定されるものではなく、単一のクローン（任意の真核、原核、又はファージクローンを含む。）に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「ＶＨ」という用語とは、抗体の免疫グロブリン重鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はＦａｂの重鎖を含む。）の可変領域を指す。「ＶＬ」という用語とは、免疫グロブリン軽鎖（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂの軽鎖を含む。）の可変領域を指す。
本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセント（％）」という用語とは、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列アライメント及びギャップ導入（必要の場合）（例えば、最適な比較のために、候補及び参照配列の中の１つ又は２つにギャップを導入することができ、また、比較の目的で、非相同配列を無視することができる。）が行われた後、参照配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基に対する候補配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基の同一性のパーセントを指す。配列同一性パーセントを決定する目的で、アラインメントは、当業者によく知られている様々な方式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＩｉ）ソフトウェアのような一般的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、アライメントされる配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定ための適切なパラメータを決定することができる。例えば、候補配列との比較のためにアラインメントされる参照配列は、候補配列の全長又は候補配列から選択される部分の連続アミノ酸（又はヌクレオチド）残基において候補配列が５０％から１００％までの配列同一性を示すこと、を示すことができる。比較の目的でアラインメントされる候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）であり得る。候補配列中の位置が参照配列中の対応する位置で同じアミノ酸（又はヌクレオチド）残基に占められている場合、これらの分子は、その位置で同じである。
本明細書で使用される場合、「特異的に結合」という用語とは、タンバク質及び他の生物分子の１つ異質性集団における抗原の存在状態を決定する結合反応を指し、前記タンバク質及び他の生物分子は、例えば抗体又はその抗原結合フラグメントにより特異的に認識される。抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する。例えば、抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、１００ｎＭ（（例えば１ｐＭ～１００ｎＭ）と高いＫＤで抗原に結合する。特定の抗原又はそのエピトープへの特異的に結合を示さない抗体又はその抗原結合フラグメントは、この特定の抗原又はそのエピトープに対して１００ｎＭ（例えば５００ｎＭ、１μＭ、１００μΜ、５００μΜ又は１ｍＭより大きい）より大きいＫＤを示す。特定のタンパク質又は炭水化物と特異的な免疫応答を起こす抗体は、例えば、慣用されている固相ＥＬＩＳＡのような様々な免疫学的測定法より選択することができる。特異的な免疫応答性を決定するために使用できる免疫学的測定法及び条件について説明されている、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語には、例えば、ＤＮＡベクター（例えばプラスミド）、ＲＮＡベクター、ウイルス又は他の適切なレプリコン（例えばウイルスベクター）のような核酸ベクターが含まれる。外来タンバク質をコードするポリヌクレオチドを原核又は真核細胞に送達するための様々なベクターが開発されている。本発明に係る発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列と、例えばタンバク質を発現及び／又はこれらのポリヌクレオチド配列を哺乳動物の細胞ゲノムにインテグレートするために用いられる追加の配列要素とを含む。本発明に係る抗体及び抗体フラグメントを発現するために使用できるいくつかのベクターには、遺伝子転写を制御する調節配列（例えばプロモーター及びエンハンサー領域）を含むプラスミドが含まれる。抗体及び抗体フラグメントを発現するための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、又は遺伝子転写で産生したｍＲＮＡの安定性又は核外輸送を改善するかのポリヌクレオチド配列を含む。これらの配列要素には、発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写を制御するために、例えば５’及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本発明に係る発現ベクターは、このようなベクターを含む細胞を選択するための標識をコードするポリヌクレオチドを含むこともできる。適切な標識の実例には、抗生物質（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はヌールセオスリシン）の耐性をコードする遺伝子が含まれる。
本明細書で使用される場合、「被検者」、「対象」及び「患者」という用語とは、本明細書に記載された特定の疾患又は病気（例えばがんや伝染性疾患）への治療を受ける生体を指す。対象及び患者の実例には、疾患又は病気（例えばがんや伝染性疾患のような細胞増殖性病気）の治療を受ける、ヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ科のメンバー（例えば家牛、バイソン、バッファロー、エルク及びヤクなど）、ウシ、ヒツジ、馬及びバイソンといった哺乳動物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語とは、治療対象における望ましくない生理的変化又は病変、例えば、細胞増殖性病気（例えばがんや伝染性疾患）の進行を予防、緩和（低減）することを目的とする外科手術又は医薬処理（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指す。有益な又は望ましい臨床結果には、検出可能又は検出不可能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（即ち、悪化していない）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分寛解又は客観寛解にかかわらない）が含まれるが、これらに限定されない。治療を必要とする対象には、すでに病気又は疾患をかかっている対象、病気又は疾患をかかりやすい対象、病気又は疾患を予防しようとする対象が含まれる。緩和、軽減、減少、緩和、寛解などの用語に言及する場合、それらの意味は、除去、消失、発生しないなどの場合も含まれる。
以下、本発明の詳細な説明及び図面を通じて、本発明の前に述べた態様及び他の態様を明確に説明する。本明細書における図面は、本発明のいくつかの好適な実施形態を例示して説明するためのものであるが、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されないことが理解されたい。
図１は、最後の免疫後に測定されたヒトＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ（Ａ）及びＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（Ｂ）組換えタンパク質へのマウス血清の結合力価を示すグラフである。 図２は、ＰＤ－Ｌ１特異性Ｂ細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及びゲーティング戦略を示す図である。 図３は、競合ＥＬＩＳＡ法により測定した、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質との結合を遮断する結果を示すグラフである。 図４は、ＦＡＣＳにより測定した、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が細胞表面のＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合するＥＣ５０を示すグラフである。 図５は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１－ＮＦＡＴシステムでのレポーター遺伝子の発現及び活性を増加させることを示すグラフである。 図６は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が混合リンパ球反応でのＩＦＮ－γの分泌を促進することを示すグラフである。 図７は、Ａ４３１細胞に対する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すグラフである。 図８は、マウス由来抗ＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウス体内のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸がん腫瘍の成長を抑制することを示すグラフである。 図９は、ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体がヒトＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウス体内のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸がん腫瘍の成長を抑制することを示すグラフである。
以下、本発明を実施例及び図面を参照して詳細に説明する。本明細書における図面は、本発明のいくつかの好適な実施形態を例示して説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと見なされるへきではない。また、本発明が開示されている特定の実施形態に限定されないことが理解されたい。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、従来の条件又はメーカーが提案した条件に従って行う。使用される試薬又は機器にメーカーが明記されていないものは、いずれも市販により購入できる従来製品である。
実施例１ マウス免疫によるＰＤ－Ｌ１抗体の産生
６～８週齢の雌性ＳＪＬマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）又はＢａｌｂ／ｃマウス（上海斯莱克実験動物有限公司から購入）に対して、マウスＦｃを融合したヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ，Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．ＣＭ０６，又はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．１００８４－Ｈ０５Ｈ）又はヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．Ｃ３１５又はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ：．１００８４－Ｈ０８Ｈ）、及びフロイント完全アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｆ５８８１）を用いて初回免疫を行った。上記のＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ又はヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ、フロイント不完全アジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＩＦＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｆ５５０６）及び非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ１８２６、上海生工生物より合成した）を用いて後の三回免疫を行った。ここで、免疫時に乳化操作により形成された均一で安定したエマルジョンを５０μｇ／匹／回注射した。特に、高力価、高親和力、及び高特異性の抗血清と特異的な免疫細胞を得るには、初回と２回目の免疫では、後ろ足パッド及び背中に注射し、３回目と４回目の免疫では、尾部皮下と背中に注射した。最後の免疫（４回目の免疫）から５～７日目にマウスを安楽死させ、脾臓を無菌的に摘出し、マウスの脾臓リンパ球を無菌的に分離抽出し、凍結保存チューブに分装し、液体窒素中に凍結保存した。２回目の免疫、３回目の免疫から１０日目及びマウスを安楽死させた当日にそれぞれにマウスの採血操作を行い、血清を分離し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）法を用いて血清中の抗ＰＤ－Ｌ１特異性抗体の力価を測定した。
実験の結果は、図１に示すように、４回の免疫後、免疫されたマウスの血清がヒトＰＤ－Ｌ１－ｍＦｃ及びＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓと結合する力価が高かったことを示している。この方法を用いてマウスの免疫を行い、マウスに高力価の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を産生させることができたことが認められた。
実施例２ ＰＤ－Ｌ１特異的単一Ｂ細胞の蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ，ＦＡＣＳ）
ＰＤ－Ｌ１タンパク質で免疫したマウスの脾臓細胞は、抗原ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．Ｃ３１５又はＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．１００８４－Ｈ０８Ｈ）及び間接標識抗体ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．ＩＣ０５０Ａ）及びマウスＢ細胞表面に特有的な標識に対する抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ｂ２２０－Ｐａｃｆｉｃ Ｂｌｕｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．５５３０８９；ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＤ－ＰＥ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．５５８５９７；ａｎｔｉ－ ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ－ＰＥ Ｃｙ７，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．５５２８６７）により染色され、また、分取前に死細胞と生細胞を区別するための染料７－ＡＡＤ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．５１－６８９８１Ｅ）を添加し、ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ社）フローサイトメトリーでＰＤ－Ｌ１特異的な単一Ｂ細胞（７ＡＡＤ－Ｂ２２０＋ＩｇＤ－ＩｇＭ－ＰＤＬ１－Ｈｉｓ＋）を細胞溶解液、ＲＮＡ酵素阻害剤を含んだＰＣＲウェルに分取し、各ウェルに１つの細胞を収集した。その結果（図２）より示されるように、ブランク対照の免疫されていないマウス脾臓（Ａ）、又はＨｉｓを有する非関連タンパク質ＣＲＥＧ－Ｈｉｓ染色を用いたＰＤ－Ｌ１免疫のマウス脾臓（Ｂ）には、いずれも明らかなＰＤ－Ｌ１＋抗原特異的なＢ細胞サブグループが検出されず、ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ染色を用いたＰＤ－Ｌ１免疫のマウス脾臓（Ｃ）には、ＰＤ－Ｌ１＋Ｂ細胞の集団が検出され、１０６脾臓細胞あたり約１１４個のＰＤ－Ｌ１＋Ｂ細胞を有した。
実施例３ モノクローナル抗体の増幅及びハイスループット発現
特許「ネストされた増幅のための組み合わせたプライマー及びその適用」特許出願番号：２０１８１１６１８１３４．４に記載された実施例１の方法を使用して、単一細胞のｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。次に、ｃＤＮＡをテンプレートとしてネストされたＰＣＲを行い、それぞれ抗体の重鎖及び軽鎖の増幅を行った。増幅により得られた抗体の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を、それぞれ相同組換え法により重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターにクローンした。重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターの定常領域は、いずれもヒトＩｇＧ１に由来したものであった。完全な重鎖発現配列は、シグナルペプチド－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３であり、完全な軽鎖発現配列は、シグナルペプチド－Ｖκ－Ｃκであった。上述した単一Ｂ細胞抗体のクローン及び発現は、いずれも９６ウェルプレートでハイスループットの方式で抗体の迅速な同定及び発見を実現した。３２４ペアのクローン発現した抗体の重鎖及び軽鎖を一連の物理化学的及び機能的スクリーニングした後に、市販のＰＤ－Ｌ１抗体であるアベルマブ又はアテゾリズマブと同等又はそれ以上の物理化学的及び機能的活性を有する候補マウス抗体分子、合計９つを得た。それらの配列のＣＤＲｓは、それぞれＩＭＧＴ及びＫＡＢＡＴソフトウェアで分析され、対応する配列情報は、以下の表１～２に示す。表１はマウス抗体分子のＶＨ及びＶＬ配列、表２はマウス抗体分子のＩＭＧＴ及びＫＡＢＡＴの分析結果を示した。
Figure 0007646768000005
それぞれＫＡＢＡＴ及びＩＭＧＴソフトウェアを使用して各抗体のＣＤＲｓを分析した。具体的な配列情報を以下の表２に示した。
Figure 0007646768000006
Figure 0007646768000007
実施例４ 抗体ヒト化
まず、古典的な「ＣＤＲｓ移植」法を用いて抗体ヒト化を行い、即ち、配列により相同性が最も高いヒト型抗体を抗体フレームワーク領域（ＦＲｓ）として選択して、目的抗体のＫａｂａｔ命名法による抗原結合フラグメント相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をＦＲｓに移植してヒト化抗体を形成した。次に、抗体の活性及び親和力をより良く維持するために、抗体構造モデリング分析（ＭＯＥソフトウェア）に基づいて、以下のように行った：１）．抗体フレームワーク領域がＶＨ－ＶＬ界面に位置するか、ＣＤＲｓに近接するか、又はＣＤＲｓと直接相互作用するなどのアミノ酸残基を選択して回復変異を行うこと（このようなアミノ酸残基は、ＣＤＲｓ領域の立体配座を維持するのに重要である）、２）．免疫原性を考慮する場合、できるだけタンパク質内部に埋め込まれたアミノ酸を選択して回復変異を行うこと、３）．抗体の安定性及び発現レベルを考慮する場合、分子エネルギーの低下変異を優先的に考慮すること、４）．ヒト化過程で、ＣＤＲｓ領域のアミノ酸定点変異によりヒト化抗体の親和力をさらに向上させてみたこと。異なる変異を含むヒト化抗体とヒトＰＤ－Ｌ１との親和力、及びそれと表面にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞との結合を測定することにより、マウスＰＤ－Ｌ１抗体との親和力、抗体特徴付け、及び活性機能に同等又はそれ以上のヒト化抗体をスクリーニングした。
その中で、ＰＤＬ１－１５６抗体がヒト化された後の好適な候補抗体分子の配列のＣＤＲｓは、以下の通りである。ＩＭＧＴ及びＫＡＢＡＴソフトウェアで分析した配列情報は、それぞれ表３及び表４に示す。表３にはヒト化抗体分子のＶＨ及びＶＬ配列、表４にはヒト化抗体分子のＩＭＧＴ及びＫＡＢＡＴ分析結果が示される。
Figure 0007646768000008
それぞれＫＡＢＡＴ及びＩＭＧＴソフトウェアを使用して各ヒト化抗体のＣＤＲｓを分析した。具体的な配列情報は、以下の通りである。
Figure 0007646768000009
実施例５ サイズ排除クロマトグラフィーによる抗体純度の測定
ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬクロマトカラム（ＴＯＳＯＨ，０００８５４１）、プレカラムＴｓｋｇｅｌ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ，Ｃａｔ．０００８５４３）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによる抗体純度の測定を行った。移動相としては、８．８８ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３３．３３ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを計量して調製したリン酸塩緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４）を使用した。１ｍＬ／ｍｉｎの流速で移動相でクロマトカラムをバランスさせた。ベースラインが安定した後にサンプリングを注入し、サンプリング体積を１０μＬとし、紫外検出波長を２８０ｎｍとし、バンド幅を１６ｎｍとし、参照波長をオフにした。測定結果を表５に示した。
Figure 0007646768000010
実施例６ ヒト及びカニクイザルのＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に結合する抗体のＫＤ測定
ヒト及びカニクイザルのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質に対するＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。２５℃でＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．ＢＲ－１００５－３０）にａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｇｅｎｗａｙ，Ｃａｔ．ＧＷＢ－２０Ａ７０５）を固定した。ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ（Ｇｅｎｗａｙ，Ｃａｔ．ＧＷＢ－２０Ａ７０５）をＡｃｅｔａｔｅ ｐＨ５．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＢＲ－１００３－５１）で２０μｇ／ｍＬに希釈した。固定化方法（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）のＡｍｉｎｅ法を用いて固定を行った。又は、市販Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．２９１２７５５６）チップを用いて検出した。２５℃でマルチサイクル速度論的法により抗体と抗原の親和力を測定した。各サイクルで、まず被検抗体を固定されたＣＭ５チップに捕捉し、次に組換えヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃａｔ．３１５）及びカニクイザルＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．９０２５１－Ｃ０８Ｈ）を注入し、最後にＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５で再生した。移動相としては、ＨＢＳ－ＥＰ＋ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃａｔ．ＢＲ－１００６－６９）を使用し、流速を３０μＬ／ｍｉｎとし、結合時間を３００秒間とした。再生流速を３０μＬ／ｍｉｎとし、時間を３０秒間とした。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０）を使用して、１：１結合モデルで試験データを分析し、抗体抗原の解離定数ＫＤを適合させ、結合速度定数ｋａ及び解離速度定数ｋｄを決定した。
結果から、ヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質に対する被検ＰＤ－Ｌ１抗体の結合がｎＭ又はそれ以上の親和力を示し、また、カニクイザルのＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質との親和力が６２．５ｎＭ～０．３７５ｎＭの範囲内にあったことが分かった。その結果を下表６に示す。
Figure 0007646768000011
表７から、マウス抗体ＰＤＬ１－１５６に由来するヒト化抗体１５６－１Ｈ、１５６－７Ｈ、１５６－１０Ｈ及び１５６－１１ＨのヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合がＰＤＬ１－１５６と同等の親和力を示した、ことが分かった。
Figure 0007646768000012
実施例７ ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用を遮断する抗体のＩＣ５０測定
競合ＥＬＩＳＡ法により、ＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－１タンパク質の結合を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＩＣ５０を決定した。
炭酸塩緩衝液で希釈したヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．１００８４－Ｈ０５Ｈ）を９６ウェル酵素プレートに添加し、最終濃度を１μｇ／ｍｌとした。３％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロックし、段階希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（６０００ｎｇ／ｍｌ～２ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＰＤ－１－Ｈｉｓ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．１０３７７－Ｈ０８Ｈ）を加えて共インキュベートした後、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（ＭＢＬ，Ｃａｔ．Ｄ２９１－７）を添加し、ＴＭＢで発色させ、１Ｍ硫酸で終了した後にＯＤ値（二重波長４５０ｎｍ－６３０ｎｍ）を読み取った。抗体濃度をＯＤ値に対応させて、受試抗体の競合結合曲線を描き、ＩＣ５０値を計算した。図３は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体とヒトＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質との競合結合曲線を示している。その結果、図面に示されるように、被検された９つのマウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ａ）及び４つのヒト化抗体（Ｂ）は、何かの遮断作用もない抗体同型陰性対照ａｎｔｉ－Ｈｅｌ（百英生物製）と比較して、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とヒトＰＤ－１タンパク質との相互作用を効果的に遮断することができ、ヒト化抗体は、ヒト化前のマウスＰＤＬ１－１５６の阻害活性と同等となり（Ｂ）、ＩＣ５０がそれぞれ１９７．０ｎｇ／ｍＬ（１５６－１Ｈ）、２３０．５ｎｇ／ｍＬ（１５６－７Ｈ）、２５０．１ｎｇ／ｍＬ（１５６－１０Ｈ）、２０７．２ｎｇ／ｍＬ（１５６－１１Ｈ）であった。マウスＰＤ－Ｌ１－１５６のＩＣ５０は２２１．３ｎｇ／ｍｌ、陽性対照アテゾリズマブ（百英生物製）は４４６．４ｎｇ／ｍｌ、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ，ｌｏｔ ＡＵ０２０３２２）は１９０．３ｎｇ／ｍｌであった。
実施例８ ＦＡＣＳによる細胞表面ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－Ｌ１抗体結合のＥＣ５０測定
勾配濃度を有する被検抗体（抗体の最終濃度：１００００ｎｇ／ｍｌ～０．１ｎｇ／ｍｌ、１０倍段階希釈）と細胞表面にＰＤ－Ｌ１を高発現したＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（南京勇山生物科技有限公司、１０５個／ウェル）を４℃で３０分間共にインキュベートした。インキュベート終了後、１：２５０に希釈したａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＰＥ蛍光抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．１２－４９９８－８）を添加し、４℃で３０ｍｉｎ共にインキュベートした。蛍光抗体が被検抗体のＦｃセグメントに特異的に結合し、ＦＡＣＳによりＰＥ蛍光強度の高低を検出して細胞表面に高発現しているＰＤ－Ｌ１タンパク質への被検抗体の結合能力を分析した。図４の結果から、被検対象のマウスＰＤ－Ｌ１抗体のＥＣ５０は、本実験の陽性対照のアベルマブ（ＥＣ５０が５８．２ｎｇ／ｍｌであった）及びアテゾリズマブ（～９９．７３ｎｇ／ｍｌ）に近く、ＰＤＬ１－１５６及びＰＤＬ１－３７０のＥＣ５０は最も低く、検出されたヒト化抗体１５６－１Ｈ、１５６－７Ｈ、１５６－１０Ｈ及び１５６－１１ＨのＥＣ５０はそれぞれ４９．４２ｎｇ／ｍｌ、７８．３７ｎｇ／ｍｌ、６３．５ｎｇ／ｍｌ及び４９．９７ｎｇ／ｍｌであり、本実験の陽性対照アベルマブ（ＥＣ５０が５６．８８ｎｇ／ｍｌであった）に近かったことが分かった。このアッセイから、各被検ＰＤ－Ｌ１抗体が細胞表面でのＰＤ－Ｌ１標的用量に依存的に結合する能力が定量的に確信された。ＭＦＩ ｆｏｌｄ＝実験群ＭＦＩ値／薬剤を添加していない対照群ＭＦＩ値。
実施例９ ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１の結合及びシグナル伝達への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の阻害に関するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１－ＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイ
ＰＤ－１を安定的にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃａｔ．００６１２）とＰＤ－Ｌ１を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃａｔ．Ｍ００６１３）を使用して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１タンパク質相互作用及びそのシグナル経路に対するＰＤ－Ｌ１抗体の拮抗作用を比較した。シグナル経路阻害が抑制されると、ＮＦＡＴに制御された発光レポーター遺伝子の発現が増強し、発光シグナル値が増加する。ＰＤ－Ｌ１に対する抗体の遮断作用の強弱は、読み取った発光値の強弱（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ，ＲＬＵ）に反映される。
ＰＤ－Ｌ１を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株を９６ウェルの白底プレートに、１ウェルあたり４００００個の細胞、１００μｌ／ウェルで接種し、一晩中インキュベーターした。翌日、ウェルプレートを取り出し、培地を吸引して除去し、ＰＤ－１を安定的にトランスフェクトした細胞株、及び被検出ＰＤ－Ｌ１抗体を添加して共インキュベートした。ここで、１ウェルあたりＰＤ－１細胞の添加量は１６０００個／ウェルとし、抗体は段階希釈され、各用量に対しては３つの複製ウェルが設置され、インキュベート体積は１００μｌ／ウェルとし、インキュベート時間は６時間とした。インキュベート完了後、ウェルプレートを取り出し、等体積（１００μｌ）で発光検出試薬を加え、発光値を読み取った。検出値に基づき、Ｇｒａｐｈｐａｄで４パラメータ解析を行い、回帰曲線を作成し、各抗体のＥＣ５０値を得た。その結果、図５Ａに示すように、被検マウスＰＤ－Ｌ１抗体のＥＣ５０値は、陽性対照抗体であるアベルマブ及びアテゾリズマブのＥＣ５０値（２２２．９ｎｇ／ｍｌ，３２１．６ｎｇ／ｍｌ）に近く、また、図５Ｂ及び５Ｃに示すように、４つのヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体である１５６－１Ｈ、１５６－７Ｈ及び１５６－１０Ｈ、１５６－１１ＨのＥＣ５０は、それぞれ３４２ｎｇ／ｍｌ、３１３．７ｎｇ／ｍｌ、３５７．１ｎｇ／ｍｌ及び２８２．２ｎｇ／ｍｌであり、陽性対照アベルマブのＥＣ５０に近かった。このアッセイから、マウス及びヒト化の抗ＰＤ－Ｌ１抗体が細胞表面ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１の相互作用によるＴ細胞活性の抑制に対して用量依存性の阻害能力を示すことが定量的に確信され、それによってＪｕｒｋａｔ細胞内のレポーター遺伝子の活性を用量依存的に増強した。
実施例１０ ＥＬＩＳＡによる混合リンパ球反応においてＴ細胞により分泌されたＩＦＮ－γの検出
混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＭＬＲ）により、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体がＴ細胞の活性を増強するのを測定した。健常なトナー１の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）からＣＤ１４＋単球を分離し、組換えヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．３００－０３）及び組換えヒトインターロイキン４（ｒｈＩＬ－４， Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．２００－０４）を用いてインビトロで樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ，ＤＣ）へ誘導分化させ、インキュベートの６日目にＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ：Ｌ４５１６）を添加して成熟ＤＣを刺激した。７日目にトナー１のＤＣ細胞を健常なトナー２のＰＢＭＣから濃化したＣＤ４＋Ｔ細胞と混合して共培養し（ＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ細胞数の比例を１：１０とした）、被検抗体又は陽性対照抗体のアベルマブ又はアテゾリズマブ（抗体濃度を１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌとした）を加え、４日間共インキュベートした。４日後に細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ法で上清でのＩＦＮ－γの含有量を検出した。図６に示すように、試験されたマウス抗体及び陽性対照抗体であるアベルマブ、アテゾリズマブは、ａｎｔｉ－ＨＥＬモノクローナル抗体及び処理なし（即ち、投与なし）陰性対照群と比較して、ＭＬＲ実験におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌能力を有意に増強することができ、ＰＤ－Ｌ１抗体医薬品濃度が低下すると、ＩＦＮ－γの分泌を増加させる活性も低下した。この結果は、ＰＤ－Ｌ１抗体がＴ細胞の機能を増強でき、用量依存性を有することを示した。Ｔ－ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１．
実施例１１ 抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔ，ＡＤＣＣ）活性アッセイ
ヒトＰＤ－Ｌ１を高発現するＡ４３１細胞に対する単離及び精製された健常なヒトＰＢＭＣ中のナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）細胞の傷害実験により、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体が介した抗体依存性細胞傷害活性を測定した。
エフェクター細胞の作製：凍結保存されたヒトＰＢＭＣ細胞（Ｓｔｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社）を蘇生させた後、１００ＩＵ／ｍｌ組換えヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ－２，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．２００－０２）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン 、Ｃａｔ．１１８３５０３０）で一晩インキュベートした。その後、細胞を収集した後に生細胞をカウントした。次に、ＮＫ細胞磁気ビーズ分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，Ｃａｔ．１７９５５）を用いて、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製し、ＮＫ細胞を１０％失活させたウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（インビトロジェン ，Ｃａｔ．１１９６５０８４）で再懸濁した後にカウントし、エフェクター細胞として使用した。
標的細胞の作製：標的細胞Ａ４３１を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ 培地で培養し、ＡＤＣＣ実験の前日に、最終濃度５００ＩＵのインターフェロンＩＦＮ－γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．３００－０２）を添加し、一晩刺激培養しておいた。
１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で抗ＰＤ－Ｌ１抗体を希釈し、希釈された抗体を白壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｔ．３６１０）に２５μｌ／ウェルで分注し、そして、標的細胞をウェル中（２５μｌ／ウェル、１００００細胞／ウェル）に添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間インキュベートした。続いて、エフェクター細胞をウェル（２５μｌ／ウェル、４００００細胞／ウェル、即ち、効果細胞－標的細胞比のＮＫ：Ａ４３１を４：１とした）に総体積が１００μｌとなるように添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間インキュベートした。
培地バックグラウンド対照ウェル（即ち、ウェルに１００μｌ培地を加えた）、標的細胞の自然死放出ウェル（即ち、標的細胞のみがウェルにある）、エフェクター細胞自然死放出ウェル（即ち、ＮＫ細胞のみがウェルにある）、標的細胞最大死放出ウェル（即ち、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｇ９２９１）で提供されるｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ及び標的細胞を加えた）を同時に設定する必要があり、すべての対照ウェルの体積を最後に培地で１００μｌまで補充した。４時間培養した後、プレートを取り出し、ウェルあたりに５０μｌ ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを加え、シェーカーで均一に混合した後、室温で１５分間放置した後に化学発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＲＬＵ）を読み取った。
ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は、以下のステップに従って算出した。まず、すべてのウェルの読み取り値から培地バックグラウンド対照ウェルの平均読み取り値を差し引き、次に、切断率％＝（実験ウェルの読み取り値－標的細胞自然死放出ウェルの読み取り値－エフェクター細胞自然死放出ウェルの読み取り値）／（標的細胞最大死放出ウェルの読み取り値－標的細胞自然死放出ウェルの読み取り値）×１００として算出した。
結果を図７に示す。実験結果から、被検された３つのマウスＰＤ－Ｌ１抗体及びＦＤＡで市販が承認された陽性対照抗ＰＤ－Ｌ１薬であるアベルマブは、標的細胞Ａ４３１細胞に対する抗体濃度依存性の溶解傷害活性及び近いＥＣ５０値を示し、陰性同型対照抗体ｈＩｇＧ１，Ｋ（Ａｂｄｓｅｒｏｔｅｃ，ＰＨＰ０１０）は、最高濃度でもＡＤＣＣ活性を示さなかったこと、が示された。
実施例１２ マウスＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤＬ１－１５６のマウス体内の薬効アッセイ
Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウス（バイオサイトジェン(北京)製薬株式会社）を用いて、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸がん動物モデルを構築してＰＤ－Ｌ１抗体の有効性実験を行った。マウスの右側に５×１０５ ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１結腸がん細胞を皮下接種した。腫瘍体積が～１１０ｍｍ３に達した時、固体腫瘍体積の適当なマウスを群に選択し、動物を腫瘍体積に応じてランダムに群分けするソフトウェアを用いて３つの実験群：ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｈＩｇＧ同型対照群、抗ＰＤＬ１－１５６抗体群、陽性薬アベルマブ群（Ｐｆｉｚｅｒ，ｌｏｔ ＡＵ０２０３２２）に、各群に８匹ずつに分配し、群分けの当日に投与を開始した（研究０日目と定義した）。各群に１０ｍｇ／ｋｇ用量で、週に２回、合計７回腹腔注射により投与した。腫瘍体積及びマウス体重を週に２回測定し、測定値を記録し、腫瘍体積（長径×短径２／２）及び成長阻害率（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ％，ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％、ここで、Ｔｉは、治療群の投与ｉ日目の腫瘍体積平均値、Ｔ０は、治療群の投与０日目の腫瘍体積平均値、Ｖｉは、溶媒対照群の投与ｉ日目の腫瘍体積平均値、Ｖ０は、溶媒対照群の投与０日目の腫瘍体積平均値を示す）を算出した。また、腫瘍体積を統計学的な手法で分析した。Ｐ＜０．０５は有意差があると見なされた。
図８Ａ、Ｂ、Ｃ、表８に示すように、群分けして投与後の２１日目に、対照群と比べて、陽性薬アベルマブ群及びＰＤＬ１－１５６マウス抗ＰＤ－Ｌ１抗体群は、腫瘍体積で有意かつ近い抑制効果を示し、統計的に有意差（Ｐ＜０．０５）が見られた。
Figure 0007646768000013
また、実験では、ｈＩｇＧ対照群で１匹のマウスが早期に異常死したのを除いて、残りの実験動物は投与期間に活動及び食事状態が良好で、体重がある程度に上昇した。この結果は、図８Ｄ、表９に示し、この抗体の安全性が高かったことを示した。
Figure 0007646768000014
実施例１３ ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体のマウス体内薬効検出
ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を雌性６～８週齢のＢ－ｈＰＤ－Ｌ１トランスジェニックマウス（百奥采図江蘇基因生物技術有限公司）の右側皮下に５×１０５個／０．１ｍＬ濃度で接種し、腫瘍が約１０８ｍｍ３まで成長した時に、腫瘍体積に基づき２４匹を選択し、ランダムに各群８匹ずつに合計３群：生理食塩水、アベルマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、１５６－１０Ｈ（５ｍｇ／ｋｇ）に群分けした。各群の投与経路を腹腔注射とし、週に２回、連続６回投与し、最後の投与から５日後に実験を終了した。投与及び観測期間中、マウス体重及び腫瘍体積を週に３回測定し、測定値を記録し、腫瘍体積（長径×短径２／２）及び成長阻害率（ＴＧＩＴＶ（％））を算出した。群分け投与の２１日目に、生理食塩水対照群と比べて、陽性薬アベルマブ群及びＰＤ－Ｌ１抗体１５６－１０Ｈ群は、図９Ａ、Ｂ、Ｃ、表１０に示すように、腫瘍体積で有意かつ近い抑制効果を有し、統計学的有意差（Ｐ＜０．０５）が見られた。
Figure 0007646768000015
実験動物は、図９Ｄ、表１１に示すように、投与期間中に活動及び食事状態が良好で、体重はある程度に上昇した。
Figure 0007646768000016
以上結果は、ヒト化のＰＤ－Ｌ１抗体１５６－１０Ｈが、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍皮下移植瘤の成長に対して有意な抑制作用を有し、より高い安全性を示すことを示した。陽性対照抗体であるアベルマブと比べて、両者のＴＧＩレベルが同等であるが、１５６－１０Ｈの方がより均一な抗腫瘍効果を示した。
以上、本発明で提供される抗－ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）の抗体及びその用途について詳述した。本明細書では、本発明の原理及び実施形態について具体例を用いて説明したが、上記の実施例の説明は、本発明の方法及びその要旨を理解するために用いられるもので過ぎない。なお、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明に幾つかの改善及び修飾を行うこともでき、これらも本発明の特許請求の範囲に含まれる。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
重鎖ＣＤＲｓの組み合わせと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせとを含む抗体又は抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖ＣＤＲｓの組み合わせが、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨを含み、
Figure 0007646768000017
（２）前記軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせが、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬを含み、
Figure 0007646768000018
ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、ＣＤＲ３－ＶＨ、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬのそれぞれは、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義される、
ことを特徴とするヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
＜２＞
重鎖ＣＤＲｓの組み合わせと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせとを含む抗体又は抗原結合フラグメントであって、
（１）前記重鎖ＣＤＲｓの組み合わせが、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨを含み、
Figure 0007646768000019
（２）前記軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせが、以下から選択される任意の配列の組み合わせ、或いは前記配列の組み合わせよりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の組み合わせを有するＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬを含み、
Figure 0007646768000020
ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ、ＣＤＲ３－ＶＨ、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬのそれぞれは、ＫＡＢＡＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義される、
ことを特徴とするヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する単離されたヒト化抗体又は抗原結合フラグメント。
＜３＞
ＶＨ１＋ＶＬ１、ＶＨ２＋ＶＬ２、ＶＨ３＋ＶＬ３、ＶＨ４＋ＶＬ４、ＶＨ５＋ＶＬ５、ＶＨ６＋ＶＬ６、ＶＨ７＋ＶＬ７、ＶＨ８＋ＶＬ８、ＶＨ９＋ＶＬ９、ＶＨ１０＋ＶＬ１０、ＶＨ１１＋ＶＬ１１、ＶＨ１２＋ＶＬ１２、ＶＨ１３＋ＶＬ１３、ＶＨ１４＋ＶＬ１４、ＶＨ１５＋ＶＬ１５、ＶＨ１６＋ＶＬ１６、ＶＨ１７＋ＶＬ１７、ＶＨ１８＋ＶＬ１８、ＶＨ１９＋ＶＬ１９、ＶＨ２０＋ＶＬ２０、ＶＨ２１＋ＶＬ２１、ＶＨ２２＋ＶＬ２２、ＶＨ２３＋ＶＬ２３、ＶＨ２４＋ＶＬ２４、ＶＨ２５＋ＶＬ２５、及びＶＨ２６＋ＶＬ２６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとの組み合わせ、又は前記重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓの組み合わせの配列よりも１、２、３又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を有するＣＤＲｓの組み合わせを含む、ことを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜４＞
１）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１及び配列番号２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
２）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号３及び配列番号４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
３）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号５及び配列番号６で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
４）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号７及び配列番号８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
５）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号９及び配列番号１０で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
６）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
７）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
８）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１５及び配列番号１６で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
９）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１７及び配列番号１８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
１０）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１２７及び配列番号１２８で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
１１）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１２９及び配列番号１３０で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、
１２）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３１及び配列番号１３２で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、或いは、
１３）重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１３３及び配列番号１３４で示される配列、又は該配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を有すること、を特徴とする＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜５＞
ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する解離定数（ＫＤ）が１０ｎＭを超えなく、カニクイザルプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に結合する解離定数（ＫＤ）が１００ｎＭを超えない、ことを特徴とする＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜６＞
前記抗体又は抗原結合フラグメントが、
（１）キメラ抗体又はそのフラグメント、
（２）ヒト化抗体又はそのフラグメント、又は
（３）全ヒト抗体又はそのフラグメントである、ことを特徴とする＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜７＞
前記抗体が、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれかの定常領域の配列を含み、
好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含む、ことを特徴とする＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜８＞
前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、ナノ抗体、及び抗体の最小認識単位から選択される１つ又は複数である、ことを特徴とする＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
＜９＞
＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメントと競合的にＰＤ－Ｌ１又はその抗原エピトープに結合し、かつ、
１）ＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質及びＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に特異的に結合する特性、
２）ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１タンパク質との結合を遮断する特性、
３）ＰＤ－１と細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１との結合を抑制する特性、
４）Ｔ細胞活性を増強する特性、
５）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を媒介する特性、又は／及び
６）腫瘍の成長を抑制する特性を備える、
ことを特徴とする抗体又は抗原結合フラグメント。
＜１０＞
＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の抗体、抗原結合フラグメント、又はそれらの任意の組み合わせをコードする、ことを特徴とする単離された核酸分子。
＜１１＞
＜１０＞に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
＜１２＞
＜１０＞に記載の単離された核酸分子、又は＜１１＞に記載の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、
好ましく、真核細胞又は原核細胞であり、
より好ましく、哺乳動物の細胞、酵母細胞、昆虫細胞、大腸菌及び／又は枯草菌に由来するものであり、
さらに好ましく、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）から選択されるものである、宿主細胞。
＜１３＞
＜１２＞に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、抗体又は抗原結合フラグメントを単離する工程を含む、ことを特徴とする抗体又は抗原結合フラグメントの作製方法。
＜１４＞
＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント、＜１０＞に記載の単離された核酸分子、＜１１＞に記載の発現ベクター、＜１２＞に記載の宿主細胞、又は＜１３＞に記載の方法により作製された製品と、薬学的に許容されるキャリアとを含み、
好ましくは、追加的な抗腫瘍剤をさらに含む、ことを特徴とする医薬組成物。
＜１５＞
ＰＤ－Ｌ１の発現異常に関連する疾患（該疾患は、腫瘍であることが好ましい）を予防及び／又は治療するための医薬品の製造における、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント、＜１０＞に記載の単離された核酸分子、＜１１＞に記載の発現ベクター、＜１２＞に記載の宿主細胞、＜１３＞に記載の方法により作製された製品、又は＜１４＞に記載の医薬組成物、の使用。
＜１６＞
それを必要とする患者に、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の抗体又は抗原結合フラグメント、＜１０＞に記載の単離された核酸分子、＜１１＞に記載の発現ベクター、＜１２＞に記載の宿主細胞、＜１３＞に記載の方法により作製された製品、又は＜１４＞に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、ＰＤ－Ｌ１の発現異常及び／又はＴ細胞の機能異常に関連する疾患（該疾患は、腫瘍がであることが好ましく、該腫瘍は、結腸・直腸癌がであることが好ましい）を予防及び／又は治療する方法。
＜１７＞
＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、＜１０＞に記載の単離された核酸分子、＜１１＞に記載の発現ベクター、＜１２＞に記載の宿主細胞、又は＜１３＞に記載の方法により作製された製品と、使用説明書とを含む、キット。

Claims (14)

  1. ヒトプログラム細胞死リガンド－１（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合フラグメントは重鎖ＣＤＲの組み合わせと軽鎖ＣＤＲの組み合わせとを含み、
    前記重鎖ＣＤＲの組み合わせが、ＣＤＲ１－ＶＨ、ＣＤＲ２－ＶＨ及びＣＤＲ３－ＶＨを含み、前記軽鎖ＣＤＲの組み合わせが、ＣＤＲ１－ＶＬ、ＣＤＲ２－ＶＬ及びＣＤＲ３－ＶＬを含み、
    ＫＡＢＡＴの通用分析方法に従って定義されるＣＤＲ１－ＶＨが配列番号６７の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＨが配列番号６８の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＨが配列番号６９の配列を含み、
    ＫＡＢＡＴの通用分析方法に従って定義されるＣＤＲ１－ＶＬが配列番号７０の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＬが配列番号７１の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＬが配列番号７２の配列を含む；若しくは
    ＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義されるＣＤＲ１－ＶＨが配列番号１２１の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＨが配列番号１２２の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＨが配列番号１２３の配列を含み、
    ＩＭＧＴの通用分析方法に従って定義されるＣＤＲ１－ＶＬが配列番号１２４の配列を含み、ＣＤＲ２－ＶＬが配列番号１２５の配列を含み、ＣＤＲ３－ＶＬが配列番号１２６の配列を含む
    ことを特徴とする前記単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
  2. 重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域が、それぞれ配列番号１７及び配列番号１８で示される配列を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  3. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、
    （１）キメラ抗体又はそのフラグメント、
    （２）ヒト化抗体又はそのフラグメント、又は
    （３）完全ヒト抗体又はそのフラグメントである、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体が、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれかの定常領域の配列を含み、
    好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び二重特異抗体から選択される１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合フラグメント、又はそれらの任意の組み合わせをコードする、ことを特徴とする単離された核酸分子。
  7. 請求項６に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
  8. 請求項６に記載の単離された核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
  9. 請求項８に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、抗体又は抗原結合フラグメントを単離する工程を含む、ことを特徴とする抗体又は抗原結合フラグメントの作製方法。
  10. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含むことを特徴とする組成物。
  11. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む、ＰＤ－Ｌ１の発現異常及び／又はＴ細胞の機能異常に関連する疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、前記疾患は腫瘍である、医薬組成物。
  12. 前記腫瘍は結腸・直腸癌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 追加的な抗腫瘍剤をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、使用説明書とを含む、キット。
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