JP7649100B2

JP7649100B2 - アンモニアの生産方法

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Publication number: JP7649100B2
Application number: JP2019038967A
Authority: JP
Inventors: 祐輝立道; 丈晴仲原
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2025-03-19
Anticipated expiration: 2039-03-04
Also published as: JP2020141575A

Description

本発明は、広く、アンモニアを生産する方法等に関する。

アンモニアは、農作物の窒素系肥料や食品等の原料として幅広く利用されており、農作物や食品の増産に寄与し、今日の人口増加を支え続けてきた。アンモニアの大半は、ハーバー・ボッシュ法によって工業的に生産されているが、この工程には高温、高圧という条件が必要で大量のエネルギーを要する等、環境負荷の大きさに問題がある。ハーバー・ボッシュ法に頼らないアンモニア製造法も検討されており、例えば、土壌細菌等の窒素固定細菌を用いたアンモニア生産法が提案されている。しかしながら、当該方法には窒素固定細菌によるアンモニアの生産速度や用いられる細菌の安全性の課題があった。

一方で、エネルギー問題や地球環境問題が深刻化している今日、再生可能性やカーボンニュートラルの観点からバイオマスが注目されてきた。

バイオマス中の代表的成分は、糖質、タンパク質等である。デンプン系や木質系等の糖質系バイオマスは、バイオエタノール製造に利用されているものの、食品廃棄物等のタンパク質が豊富なバイオマスは、バイオエタノール製造の原料としては不向きであり、ほとんどが利用されていない。

特開２０１０－０４６０２６号公報特許第４６１５１２６号公報

本発明者は、バイオマスのタンパク質を含有する材料を、ソースとして効率的に利用することが可能であれば有用であるとの考えのもと、研究を行った。

グルタミナーゼは、グルタミンと水を基質に、１分子のグルタミンから、アンモニアとグルタミン酸を１分子ずつ作りだす酵素である。グルタミナーゼにより生成するグルタミン酸はうま味成分であり、食品製造において重要な物質の一つである。

グルタミナーゼを菌体内に発現する場合には、その菌体培養液や破砕液からグルタミナーゼを分離、精製するが、通常、菌体内の他の酵素、例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素も含まれることがあるので、菌体内発現のグルタミナーゼを使ってアンモニアを生産する場合、生成されたアンモニアが菌体内の他の酵素によって速やかに他のアミノ酸へと変換されてしまう。特に、酵母はこのような窒素同化能力が高いため、高濃度のアンモニアを得ることは困難であった。

また、本発明者らによるバイオマスからのアンモニア生産法の研究において、バイオマス中に高濃度に含まれているグルコースが、アンモニア生産反応を阻害していることが明らかとなった。

上記事情に鑑みて、本発明は、環境負荷が低い、新規なアンモニア生産法を提供することを目的とする。

本発明者らは、タンパク質が豊富なバイオマス等のタンパク質含有材料の原料に対し、アンモニアの生産に関連する遺伝子を改変した微生物を加えることにより、上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］アンモニアを生産する方法であって、
タンパク質含有材料と、遺伝子組換え微生物とを接触させる工程を含む、方法。
［２］前記タンパク質含有材料は、バイオマスである、［１］に記載の方法。
［３］前記バイオマスは、食品又はその廃棄物を含む、［２］に記載の方法。
［４］前記食品又はその廃棄物は、大豆、その加工物又は残渣を含む、［３］に記載の方法。
［５］前記加工物又は残渣は、分解物を含む、［４］に記載の方法。
［６］前記分解物は、しょうゆ麹を含む、［５］に記載の方法。
［７］前記分解物は、大豆タンパク質又はそのペプチドを含む、［５］に記載の方法。
［８］前記遺伝子組換え微生物は、その細胞表層にグルタミナーゼを提示するよう遺伝子組換えがされている、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記微生物は、酵母、大腸菌又は乳酸菌を含む、［８］に記載の方法。
［１０］前記酵母の細胞表層に提示しているグルタミナーゼは、酸耐性である、［９］に記載の方法。
［１１］前記グルタミナーゼは、麹菌、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来する、［８］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ジゴサッカロマイセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）又はカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を含む、［９］から［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］グルタミン酸が更に生産される、［１］から［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記遺伝子組換え微生物は、ｇｌｎＡ及び／又はｐｔｓＧ遺伝子の破壊株である、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［１６］前記微生物は、ＤｇｓＡ及び／又はｋｉｖＤ遺伝子を発現する、［１５］に記載の方法。
［１７］前記微生物は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）を含む、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］前記接触工程は、５ｍＭ以上の濃度のグルコースの存在下で実施される、［１５］から［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］アンモニアを原料とする製品を製造する方法であって、［１］～［１８］のいずれかに記載の方法を用いてアンモニアを生産する工程を含む、方法。
［２０］前記製品は、酵母エキス原料又は農産物の肥料である、［１９］に記載の製品。
［２１］グルタミン酸を生産する方法であって、
タンパク質含有材料と、細胞表層にグルタミナーゼを提示するように遺伝子が組換えられた微生物とを接触させて、グルタミン酸を生成する工程を含む、方法。
［２２］グルタミン酸は、食品の製造に使用される、［２１］に記載の方法。
［２３］前記食品は、しょうゆである、［２２］に記載の方法。
［２４］食品におけるグルタミン酸を増強する方法であって、
タンパク質含有材料と、細胞表層にグルタミナーゼを提示するように遺伝子が組換えられた微生物とを接触させて、グルタミン酸を生成する工程を含む、方法。
［２５］前記食品は、しょうゆである、［２４］に記載の方法。
［２６］前記タンパク質含有材料は、バイオマスである、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］前記バイオマスは、大豆又はその加工物を含む、［２６］に記載の方法。
［２８］前記加工物は、しょうゆ麹を含む、［２７］に記載の方法。
［２９］前記加工物は、大豆タンパク質又はそのペプチドを含む、［２７］に記載の方法。
［３０］前記グルタミナーゼは、麹菌に由来する、［２４］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）である、［３０］に記載の方法。
［３２］前記微生物は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ジゴサッカロマイセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）及びカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）から選択された酵母である、［２４］から［３１］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、タンパク質の豊富なバイオマス等のタンパク質含有材料を原料とするため、環境に優しいアンモニア生産法を提供することができる。

また、本発明によれば、細胞表層にグルタミナーゼを提示する表層提示菌体を生体触媒として用いることで、生産されたアンモニアの窒素同化を防ぐことができ、ひいては効率的にアンモニアを生産することが可能になる。グルタミナーゼは、細胞表層に配置されることで、酸耐性が向上するという利点もある。

グルタミナーゼを提示する表層提示菌体の使用により、アンモニアの生産のみならず、グルタミン酸を同時に生産することもできる。

さらに、本発明によれば、グルコーストランスポーターやグルタミン合成酵素破壊菌株を用いることで、バイオマス中にグルコースが含まれていても、効率的にアンモニアを生産することができる。

図１－１～図１－４は、ｐＵＬＤ１の塩基配列を示す。図１－１～図１－４は、ｐＵＬＤ１の塩基配列を示す。図１－１～図１－４は、ｐＵＬＤ１の塩基配列を示す。図１－１～図１－４は、ｐＵＬＤ１の塩基配列を示す。図２は、実施例１におけるｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株のアンモニア生産性の評価を示す。図３は、実施例２におけるｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株のアンモニア生産性の評価を示す。図４は、実施例３におけるＤＨ１０Ｂ株、ΔｇｌｎＡ株、ΔｐｔｓＧ株、及びΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株のアンモニア生産性の評価を示す。図５は、実施例４におけるＤＨ１０Ｂ株、ΔｇｌｎＡ株、ΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株のアンモニア生産性の評価を示す。図６は、実施例５におけるｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株のグルタミン酸生産性の評価を示す。図７は、実施例６におけるｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株のアンモニアとグルタミン酸生産性の評価を示す。

（タンパク質含有材料）
本明細書で使用する場合、「タンパク質含有材料」とは、タンパク質を含有する材料を意味し、肉類、魚介類、卵類等の動物由来のタンパク質を含有する材料や、穀物類、野菜類等の植物由来のタンパク質を含有する材料のみならず、微生物由来のタンパク質を含有する材料を含む、あらゆる生物由来のタンパク質を含有する材料を意味する。限定することを意図するものではないが、そのような材料の例として、バイオマス、例えば、食品を製造する際、特に加工時に生成する廃棄物等が挙げられる。バイオマスは、タンパク質に加え、デンプン等の糖質系の成分を含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「タンパク質」は上述のような生物由来のタンパク質を意味するが、その分解産物であるオリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸を含んでもよい。

（バイオマス）
本明細書で使用する場合、「バイオマス」とは、広く、再生可能な、生物由来の有機性資源で、化石資源を除いたものを意味する。このような有機性資源の中でも、タンパク質、アミノ酸、尿素、尿酸等の含窒素化合物を含有する材料は分解を経てアンモニアを生成するため好ましい。窒素含有化合物を含むバイオマスとして、飲食品又はその廃棄物等が挙げられる。バイオマスの種類に応じて飲食品と廃棄物の範囲は互いに変動し得る。生物が大豆である場合を例に説明すると、大豆そのものや、豆乳のような加工物は飲食品に含まれると考えられるが、その残渣である大豆粕は廃棄されて飼料等にされる場合もあれば、おからとして食用にされる場合もあり、食品と廃棄物は明確に区別できない。そのため、本明細書で使用する場合のバイオマスには廃棄物のみならず飲食品も含まれ得る。

食品やその廃棄物には、微生物により発酵した状態のものや加水分解等で分解された状態のものも含まれる。大豆を例に説明すると、発酵物の例としてしょうゆ麹があり、分解物として、大豆タンパク質やそのペプチド等がある。

（遺伝子組換え微生物）
本明細書で使用する場合、「遺伝子組換え微生物」とは、菌体外でアンモニアを生産できるよう形質転換されている微生物、好ましくは、細胞表層にグルタミナーゼを提示するよう形質転換されている微生物（以下、「グルタミナーゼ表層提示」微生物ともいう）や、アンモニアの生産に悪影響を及ぼす遺伝子が破壊されている微生物を意味する。このような微生物として酵母、大腸菌、乳酸菌が挙げられる。アンモニアを生産できる限り、微生物は同じか異なる種のもののうち、１又は複数の株を同時に使用することもできる。

微生物の種類は、アンモニアの生産効率や、アンモニアの最終目的物の用途に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、最終製品が医薬、食品、化粧品のように人体に適用され得るものである場合、微生物は人体に有害ではないものが好ましい。

限定することを意図するものではないが、飲食品に使用可能な酵母の例として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ジゴサッカロマイセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。これらの酵母は、細胞表層にグルタミナーゼを提示するよう形質転換する場合にも好適に使用することができる。

グルタミナーゼは、過酷な条件下でもアンモニアの生産効率が高い特性を有するものが好ましい。そのようなグルタミナーゼとして、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）やアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）等の麹菌、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来するグルタミナーゼが挙げられる。アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のグルタミナーゼをコードする遺伝子（配列番号８－１０）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来のグルタミナーゼをコードする遺伝子（配列番号１１）を以下の表１に記載する。

アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）は表１の遺伝子のオルソログを有する。

グルタミナーゼ遺伝子を用いた遺伝子組換えは常法により行うことができる。例えば、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターにグルタミナーゼ遺伝子を組み込むことで、各々のベクターに対応する宿主細胞がその細胞表層にグルタミナーゼを提示するよう形質転換される。細胞表層に提示されたグルタミナーゼにより、アンモニアは菌体外で生産されるため、菌体内に取り込まれない限り窒素同化されず、効率的な生産が可能になる。

限定することを意図するものではないが、飲食品に使用可能なその他の微生物の例として、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等が挙げられる。これらの微生物は、アンモニアの生産に悪影響を及ぼす遺伝子、例えばグルタミン合成酵素をコードする遺伝子やホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）を構成するタンパク質をコードする遺伝子を破壊した株を作成する場合にも好適に使用することができる。グルタミン合成酵素をコードする遺伝子としてｇｌｎＡがある。また、ＰＴＳを構成するタンパク質をコードする遺伝子として、ｅｎｚｙｍｅＩＩ（ＥＩＩ）のドメインＡ、Ｂ、ＣをコードするｐｔｓＧ遺伝子がある。これらの遺伝子を破壊することで、バイオマスにグルコースが含まれていても、効率的にアンモニアを生産することが可能になる。

上記遺伝子の破壊は、対象の遺伝子の一部又は全部を破壊すること、例えばｇｌｎＡ遺伝子の一部又は全部を欠失させたり、ｇｌｎＡ遺伝子の途中に薬剤耐性遺伝子等、別の遺伝子を挿入する等して正常に機能しないように遺伝子を修飾すること等を意味する。

微生物は更に、アンモニアの生産効率増大に関与する遺伝子が発現するよう、別の遺伝子で更に形質転換されていてもよいし、その生産効率低下に関与する遺伝子が破壊するような変異が導入されていてもよい。アンモニアの生産効率増大に関与する遺伝子として、グルコースカタボライト抑制に関与する転写因子であるＤｇｓＡや、アミノ酸脱炭酸酵素であるｋｉｖｄ等がある。

（アンモニア生産方法）
タンパク質含有材料と遺伝子組換え微生物との接触工程は、遺伝子組換え微生物がアンモニアを生産するのに必要な条件のもと行われる。その条件は使用する微生物の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。

バイオマス中にグルコースが含まれている場合、その濃度が増大するにつれてアンモニアの生産が阻害されてしまうが、ｐｔｓＧ遺伝子とｇｌｎＡ遺伝子を破壊することで生産効率の低下を防ぐことができる。そのため、上記接触工程は、高濃度、例えば５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上のグルコースの存在下でも実施可能である。

（アンモニアの用途）
生産されたアンモニアは種々の用途、例えば、酵母エキス等の飲食品、硝酸等の基礎化学品、硫安等の窒素肥料等の原料に好適に使用される。

（グルタミン酸の生産）
グルタミナーゼ表層提示微生物を使用した場合、菌体外において更にグルタミン酸を生産することができる。

（グルタミン酸の用途）
グルタミン酸は、しょうゆ、うま味調味料の原料として好適に使用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例で使用したプライマーの配列情報について表２に記載する。

（グルタミナーゼ表層提示酵母の作製）

［グルタミナーゼ発現用プラスミドの作製］
細胞表層提示型グルタミナーゼの発現には、国際公開第２０１０／１０１１５８号に開示の方法に従って作製したプラスミドｐＵＬＤ１を使用し、選択マーカーとしてＵＲＡ３マーカーを使用した。ｐＵＬＤ１の塩基配列（配列番号７）は図１－１～１－４に示す。

まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α株（タカラバイオ社）のＤＮＡを鋳型に、一対のプライマーｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ＿Ｆｗ（配列番号１）及びｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ＿Ｒｖ（配列番号２）を用いたＰＣＲにより、グルタミナーゼ遺伝子（ＹｂａＳ）のＤＮＡ断片（配列番号１１）を増幅した。得られたＤＮＡ断片とｐＵＬＤ１は、制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ社）で処理し、それらを連結することでプラスミドｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅを作成した。

［形質転換］
Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ（登録商標）キット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を使用して、プラスミドｐＵＬＤ１－ＧｌｕｔａｍｉｎａｓｅとプラスミドｐＵＬＤ１を出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３－１ａ株（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅＰｒｏｊｅｃｔ (ＮＢＲＰ)）に導入して形質転換を行った。形質転換により得られたコロニーをＳＣ（ウラシル未添加（以下、「－Ｕｒａｃｉｌ」ともいう））培地プレートで選択し、ｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株を得た。

［グルタミナーゼ表層提示酵母の評価］
本実施例では、グルタミンからアンモニアを得るために必要な表層提示グルタミナーゼの能力を評価した。

２００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、１２０ｍＭ又は１７９ｍＭグルタミンが含まれている反応液に、ＳＣ（－Ｕｒａｃｉｌ）で一晩培養したｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株を培地のＯＤ６００が１となるように加えた。これらを振とう培養機（ＴＡＩＴＥＣ社製ＢＲ－２３。以下同様）で２４０ｒｐｍ、３７℃で反応させ、反応後０時間、４時間、８時間、２４時間にサンプリングした。

反応液はブロックインキュベーター（アステック社製ＢＩ５１６。以下同様）で８０℃、１５分加熱処理した。アンモニア濃度はＦ－キットアンモニア（ＪＫインターナショナル社製）で測定した。

図２に示すように、対照株であるｐＵＬＤ１組換え株では、反応時間中にアンモニアの生産はほとんど見られなかった。一方で、ｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株では、顕著なアンモニア濃度増加が観察された。特に１２０ｍＭグルタミン含有反応液を２４時間反応させたとき、反応効率は約１０９％であった。これは表層提示したグルタミナーゼが効率的にグルタミンからアンモニアを生産したことを示している。上記反応効率は、アンモニア分析値／アンモニア理論上最大値（１２０ｍＭアンモニア）に基づき算出した。

なお、上述のように反応効率が約１０９％のように１００％を超えた理由としては、酵母菌体内のグルタミン酸が溶出した可能性が考えられる。

（グルタミナーゼ表層提示酵母を用いたバイオマスからのアンモニア生産）

本実施例では、バイオマスとしておから粕を使用した、グルタミナーゼ表層提示酵母によるアンモニア生産の検討を行った。

まず、１０ｇのおからをミキサー（Ｉｗａｔａｎｉ社製ＩＦＭ－７００Ｇ）で粉砕し、これに７０ｇの５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を加えた。さらに、プロチンＳＤ－ＡＹ１０（アマノエンザイム社製）とプロテアックス（アマノエンザイム社製）を１．５ｇ加え、振とう培養機で５５℃、２００ｒｐｍ、４８時間反応させた。このおからの分解液を定性ろ紙Ｎｏ．２（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製。以下同様）を用いてろ過した。このろ液に対し、ＳＣ（－Ｕｒａｃｉｌ）培地で一晩培養したｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株を培地のＯＤ６００が１となるように加えた。これらを振とう培養機で２４０ｒｐｍ、３７℃で１０分間反応させ、ブロックインキュベーターで８０℃、１５分加熱した後、アンモニア濃度を測定した。

図３に示すように、対照株では、反応前後でアンモニア濃度に大きな変化は見られなかった。一方で、ｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株では、１０分の反応でアンモニア濃度が２倍以上となった。このことからも、グルタミナーゼ表層提示酵母を用いることで、バイオマスからの効率的なアンモニア生産が可能であることが示された。

（ｇｌｎＡ、ｐｔｓＧ破壊大腸菌を用いたバイオマスからのアンモニア生産）

本実施例において、バイオマスにグルコースが含まれていても効率的にアンモニアを生産する細菌細胞の樹立を検討した。

［ΔｇｌｎＡ株とΔｐｔｓＧ株の作製］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ株（タカラバイオ社）の遺伝子破壊法は、ワンステップ不活性化方法（Ｏｎｅ－ｓｔｅｐｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）という手法によって行った。なお、この手法や使用したプラスミドの詳細は当業者に公知である（例えば、山田雅巳，Ｅｎｖｉｒｏｎ．ＭｕｔａｇｅｎＲｅｓ．，２５：８７－９２（２００３）；ＫｉｒｉｌｌＡ．ＤａｔｓｅｎｋｏａｎｄＢａｒｒｙＬ．Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７（１２）：６６４０－６６４５（２０００））を参照のこと）。

まず、ヒートショック法によってプラスミドｐＫＤ４６を形質転換させたＤＨ１０Ｂ株をＬＢ培地で３７℃一晩培養し、５０ｍＬのＬＢ培地（＋１０ｍＭアラビノース）に２ｍＬ植菌した。ＯＤ６００が０．５になったところで培地を氷冷した。遠心後のペレットを冷水と冷１０％グリセロール水溶液で洗浄した後、コンピテントセルとして－８０℃で保管した。

ｇｌｎＡとｐｔｓＧ遺伝子を欠損させるために、プラスミドｐＫＤ１３を鋳型に、プライマーΔｇｌｎＡ＿Ｆｗ（配列番号３）とΔｇｌｎＡ＿Ｒｖ（配列番号４）の組み合わせ、プライマーΔｐｔｓＧ＿Ｆｗ（配列番号５）とΔｐｔｓＧ＿Ｒｖ（配列番号６）の組み合わせでＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物はＧｅｎｅＰｌｕｓｅｒＩＩ（登録商標）エレクトロポーレーター（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、６００Ω、１．３５ｋＶ、１０μＦの条件で、上記コンピテントセルに形質転換させた。

その後形質転換した株をＳＯＣ培地で一晩静置培養し、さらに翌日ＬＢ培地（＋カナマイシン）で培養を行うことで、相同組換えが生じてカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたΔｇｌｎＡ株とΔｐｔｓＧ株がそれぞれ得られた。得られた株はさらに３７℃で培養しｐＫＤ４６を欠落させた。

［ΔｐｔｓＧΔｇｌｎＡ株の作製］
作製したΔｐｔｓＧ株をＬＢ培地（＋カナマイシン）で３７℃一晩前培養し、５０ｍＬのＬＢ培地（＋カナマイシン）に２ｍＬ植菌した。ＯＤ６００が０．５になったところで培地を氷冷した。遠心後のペレットを冷水と冷１０％グリセロール水溶液で洗浄した後、コンピテントセルとして－８０℃で保管した。

このコンピテントセルにプラスミドｐＣＰ２０を形質転換させるために、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩエレクトロポーレーターを用いて、６００Ω、１．３５ｋＶ、１０μＦの条件で形質転換させた。得られたコロニーは３０℃で一晩培養し、さらに３７℃で継代培養し、ｐＣＰ２０を欠落させた。

このΔｐｔｓＧ株について、ΔｇｌｎＡ株を作製する方法と同じ手順で行い、ΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株を作製した。

［遺伝子破壊株のアンモニア生産性の評価］
実施例２で作製したおからの分解ろ液に、ＤＨ１０Ｂ株、ΔｇｌｎＡ株、ΔｐｔｓＧ株、及びΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株を、それぞれ培地のＯＤ６００が０．５となるように加え、振とう培養機で３７℃、２００ｒｐｍで２６時間反応させた。

反応液は遠心分離した。上清をブロックインキュベーターで８０℃、１５分加熱した後、アンモニア濃度を測定した。おから分解液中には約７０ｍＭのグルコースが含まれていた。

図４に示すように、ＤＨ１０Ｂ株では効率的にアンモニア生産ができなかった。しかし、グルタミン合成酵素をコードするｇｌｎＡと、グルコースホスホトランスフェラーゼシステムの主要輸送体をコードするｐｔｓＧを同時に破壊することで、グルコースを高濃度に含んだバイオマスから高効率でアンモニアを生産することが可能であることが示された。

（遺伝子破壊株のアンモニア生産性の評価）

本実施例において、異なる濃度のグルコースの存在下で、実施例３で作製したΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株によるアンモニア生産性を検討した。

６ｇ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム（ナカライテスク社）、３ｇ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム（ナカライテスク社）、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ナカライテスク社）、７．２５ｇ／Ｌイースト抽出物（日本ＢＤ社）、０．１ｍＭ塩化カルシウム（ナカライテスク社）、１ｍＭ硫酸マグネシウム（ナカライテスク社）を混合し、滅菌処理した。このようにして得られた培地にグルコース（ナカライテスク社）を１０ｍＭ又は５０ｍＭ加え、培地のＯＤ６００が０．５となるように、ＤＨ１０Ｂ株、ΔｇｌｎＡ株又はΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株を加え、振とう培養機で３７℃、２００ｒｐｍで２６時間反応させた。反応液は遠心分離し、上清をブロックインキュベーターで８０℃、１５分加熱した後、アンモニア濃度を測定した。

図５に示すように、対照株であるＤＨ１０Ｂ株では効率的にアンモニア生産ができなかった。しかし、ΔｇｌｎＡΔｐｔｓＧ株では高濃度のグルコースを加えても効率よくアンモニアを生産することが可能であることが示された。

（表層提示グルタミナーゼを使用したグルタミン酸生産）

本実施例において、実施例１で作製したグルタミナーゼ表層提示酵母によるグルタミン酸生産の検討を行い、食品製造にも応用可能かを検討した。

［しょうゆ麹の作製］
加熱変性した大豆と小麦を等量含む固体培地に、キッコーマン株式会社が保有する麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）の株の胞子を添加して、２５～４０℃で７２時間製麹することによりしょうゆ麹を得た。

［グルタミン酸生産性の評価］
得られたしょうゆ麹６０ｇに、乳酸０．６ｍＬ、水７６ｍＬを加え、さらにＳＣ（－Ｕｒａｃｉｌ）培地で一晩培養したｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株とｐＵＬＤ１組換え株を培地のＯＤ６００が１となるように加えた。また比較用に、グルタミナーゼＳＤ－Ｃ１００Ｓ（アマノエンザイム社）を５０ｍｇ加えた。これらを振とう培養機で２４０ｒｐｍ、２５℃で２４時間反応させ、定性ろ紙Ｎｏ．２でろ過した。ろ液はバイオセンサ（王子計測機器社製ＢＦ－５Ｄ）でグルタミン酸濃度を求めた。

しょうゆ麹中には麹菌由来のグルタミナーゼが豊富に含まれているが、それらは塩や酸によって失活したり、麹菌由来のプロテアーゼによって分解を受ける。図６に示すように、グルタミナーゼ酵素剤を加えた場合でも、グルタミン酸濃度は上昇しなかった。一方でｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株を添加した条件では、グルタミン酸濃度が２０％近く上昇した。これは表層提示されたグルタミナーゼが塩酸、各種酵素に対して安定であり、酸耐性に優れることを示し、食品製造におけるグルタミン酸増強にも有用であることを示している。

（大豆タンパク質分解物からのアンモニアとグルタミン酸生産）

本実施例において、実施例１で作製したグルタミナーゼ表層提示酵母を用いて、大豆タンパク質分解物からのアンモニアとグルタミン酸生産を検討した。

大豆ペプチドハイニュートＳ（アマノエンザイム社製）３ｇに乳酸６０μＬと水１０ｍＬを加え、ＳＣ（－Ｕｒａｃｉｌ）培地で一晩培養したｐＵＬＤ１－Ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ組換え株を培地のＯＤ６００が１となるように加えた。これらを振とう培養機で２４０ｒｐｍ、３７℃で２４時間反応させ、ブロックインキュベーターで８０℃、１５分加熱した後、グルタミン酸濃度とアンモニア濃度を測定した。

図７に示すように、グルタミナーゼ表層提示酵母は、大豆分解物中のグルタミンと反応し、アンモニアとグルタミン酸を同時に生産していることが示された。

Claims

アンモニアを生産する方法であって、
タンパク質含有材料と、遺伝子組換え微生物とを接触させる工程を含み、
前記遺伝子組換え微生物は、その細胞表層にグルタミナーゼを提示するよう遺伝子組換えがされており、
前記グルタミナーゼは、麹菌、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に由来する、方法。
前記タンパク質含有材料は、バイオマスである、請求項１に記載の方法。
前記バイオマスは、食品又はその廃棄物を含む、請求項２に記載の方法。
前記食品又はその廃棄物は、大豆、その加工物又は残渣を含む、請求項３に記載の方法。
前記加工物又は残渣は、分解物を含む、請求項４に記載の方法。
前記分解物は、しょうゆ麹を含む、請求項５に記載の方法。
前記分解物は、大豆タンパク質又はそのペプチドを含む、請求項５に記載の方法。
前記微生物は、酵母、大腸菌又は乳酸菌を含む、請求項１に記載の方法。
前記酵母の細胞表層に提示しているグルタミナーゼは、酸耐性である、請求項８に記載の方法。
前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ジゴサッカロマイセス・ロキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）又はカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を含む、請求項８または９のいずれか一項に記載の方法。
グルタミン酸が更に生産される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
アンモニアを生産する方法であって、
タンパク質含有材料と、遺伝子組換え微生物とを接触させる工程を含み、
前記遺伝子組換え微生物は、ｇｌｎＡ及びｐｔｓＧ遺伝子の破壊株である、方法。
前記微生物は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）を含む、請求項１３に記載の方法。
前記微生物は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であり、前記接触工程は、５ｍＭ以上の濃度のグルコースの存在下で実施される、請求項１３に記載の方法。
アンモニアを原料とする製品を製造する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を用いてアンモニアを生産する工程を含む、方法。
前記製品は、酵母エキス原料又は農産物の肥料である、請求項１６に記載の方法。