JP7655896B2 - 抗ｃｔｌａ４／抗ｐｄ－１二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍の治療及び分子免疫学の分野に関し、特には、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体及びその使用に関する。より特には、本発明は突然変異体抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体に関する。

膜貫通型受容体ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）はＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞において発現される。ＰＤ－１の両方のリガンド、ＰＤＬ１（プログラム細胞死１リガンド１、又はＰＤＬ－１）及びＰＤＬ２（プログラム細胞死１リガンド２、又はＰＤＬ－２）はＢ７スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤＬ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞及び上皮細胞を含めて様々な細胞において発現され、ＰＤＬ２は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞及びマクロファージにおいてのみ発現される。

ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路は、免疫寛容の調節、微小生物感染及び腫瘍免疫回避において重要な役割を果たす。ＰＤ－１は、免疫細胞、例えばＴ細胞において主に発現され、ＰＤ－１のリガンドＰＤＬ１は複数のヒト腫瘍組織において高発現される。ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路の遮断は、阻害されたＴ細胞を活性化させて、そのため該Ｔ細胞ががん細胞を攻撃し得る。ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達の遮断は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍細胞殺傷プロセスを活性化させ、更に局所的な腫瘍成長を阻害することができる（Julie R et al., 2012, N Engl J Med., 366:2455-2465）。追加的に、高いＰＤＬ１発現を有する腫瘍は、検出が困難ながんと関連付けられる（Hamanishi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:3360-5）。有効な方法は、抗ＰＤ－１抗体を投与してＰＤ－１の発現をモジュレートすることである。ＰＤ－１抗体の広い抗腫瘍の有望性及び驚くべき有効性に起因して、ＰＤ－１経路を標的化する抗体は様々な腫瘍、例えば、非小細胞肺がん、腎細胞癌、卵巣がん、黒色腫（Homet M. B., Parisi G., et al., 2015, Semin Oncol., 42(3):466-473）、白血病及び貧血（Held SA, Heine A, et al., 2013, Curr Cancer Drug Targets., 13(7):768-74）の治療においてブレイクスルーをもたらすであろうことが産業において広く認められている。

細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）及びＣＤ２８分子は、遺伝子の構造、染色体上の位置、配列相同性及び遺伝子発現の局面において非常に類似している。両方の分子は共刺激分子Ｂ７の受容体であり、活性化されたＴ細胞の表面上に主に発現される。Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合は、マウス及びヒトＴ細胞の活性化を阻害し、Ｔ細胞活性化において負の調節的役割を果たす。

ＣＴＬＡ４抗体（若しくは抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体）又はＣＴＬＡ４リガンドは、ＣＴＬＡ４がその天然のリガンドに結合することを予防し、それによりＴ細胞へのＣＴＬＡ４による負の調節シグナルの伝達を遮断し、且つ様々な抗原に対するＴ細胞の反応性を増強することができる。これに関して、インビボ及びインビトロの研究は本質的に一貫している。現在、臨床試験中の、又は前立腺がん、膀胱がん、結腸直腸がん、胃腸がん、肝臓がん、悪性黒色腫等を治療するために承認されたＣＴＬＡ４モノクローナル抗体がある（Grosso JF., Jure-Kunkel MN., 2013, Cancer Immun., 13:5）。

インターロイキン２（ＩＬ－２）はＴ細胞により産生される。それは、Ｔ細胞亜群を調節する増殖因子であり、免疫応答の調節において重要な因子である。それは活性化Ｂ細胞の増殖を促進し、抗体応答、造血及び腫瘍サーベイランスに参加する。組換えヒトＩＬ－２は、黒色腫、腎臓がん等を含めて、悪性腫瘍を治療するために米国ＦＤＡにより承認されており、慢性ウイルス感染症を治療するための臨床研究が現在進行中である（Chavez, A.R., et al., 2009, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1182:p.14-27）。ＣＴＬＡ４及びＣＴＬＡ４抗体はＴ細胞機能の重要な影響因子であり、身体中の免疫微環境に干渉する。ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４の免疫抑制を特異的に緩和し、Ｔ細胞を活性化させ、且つＩＬ－２生成を誘導し、疾患、例えば腫瘍及び寄生生物感染症に対する遺伝子療法における広い応用において有望であることをインビトロ及びインビボ研究は実証した。

ＣＴＬＡ４抗体は、疾患に対する特有の治療効果及び顕著な有効性を生じさせることができ、伝統的な薬を補うため及び遺伝子療法の新たな手段を探索するために使用され得る。

二重特異性抗体は二機能性抗体としても公知であり、これは２つの異なる抗原を同時に標的化する特有の薬物であり、免疫磁気分離により製造され得る。代替的に、それらは遺伝子操作により得られ得る。遺伝子操作は、結合部位最適化、合成形態、収率及び同種のものの局面において柔軟性を有し、そのためある特定の利点を有する。現在、４５を上回る形態が実証されている（Dafne Muller, Kontermann R E., 2010, BioDrugs, 24(2):89-98）。多数の開発された二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖの形態、即ち、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマット（Coloma MJ, Morrison SL., 1997, Nat Biotechnol., 15:159-163）であり、これは、天然に存在するＩｇＧ形態に対するその類似性並びに抗体操作、発現及び精製における利点のために二重特異性抗体のための理想的な形態の１つであることが実証されている（Miller BR, Demarest SJ, et al., 2010, Protein Eng Des Sel, 23:549-57; Fitzgerald J, Lugovskoy A., 2011, MAbs, 3:299-309）。

ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）は、ウイルス感染細胞又は腫瘍細胞のエピトープへの抗体のＦａｂ断片の結合及びキラー細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への抗体のＦｃ断片の結合により媒介されるキラー細胞（ＮＫ細胞、マクロファージ等）による標的細胞の殺傷を指す。

ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）は、細胞膜表面上の対応する抗原への抗体の特異的結合により複合体が形成されて補体システムを活性化させ、それが標的細胞の表面上にＭＡＣを更に形成させて、その後の標的細胞溶解を結果としてもたらすことを指す。補体は、様々な細菌及び他の病原性生物の溶解を引き起こすことがあり、病原性生物の感染に対する重要な防御機構である。

Ｆｃ受容体は、特有の免疫細胞の表面上に発現されて抗体Ｆｃ領域を認識し、免疫応答を媒介する、免疫グロブリンファミリーに属する。Ｆａｂ領域が抗原を認識した後に、抗体のＦｃ領域は免疫細胞（例えば、キラー細胞）上のＦｃ受容体に結合して、免疫細胞の応答機能、例えば貪食及びＡＤＣＣを開始させる。

Ｆｃ受容体により認識される抗体の種類及び発現細胞の種類にしたがって、Ｆｃ受容体は主に３つのタイプ、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ及びＦｃεＲに分類される。ＦｃγＲは４つのサブタイプ、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）及びＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に更に分類され得る。これらの中で、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩはＡＤＣＣ効果と密接に関連付けられる。ＦｃγＲＩＩＩは、ＡＤＣＣを媒介する最も優勢な分子であり、異なる細胞種中に２つの高度に相同的なサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂを有する。ＦｃγＲＩＩＩａ集団中に、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の部位により区別される２つのサブタイプ、高い親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８及び低い親和性を有するＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８が存在する。ＦｃγＲＩは、ＩｇＧのＦｃ領域に対してより高い親和性を有し、且つＡＤＣＣプロセスに参加し；ＦｃγＲＩＩは３つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃ（それぞれＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ３２ｃとも称される）を含み、これらの中でＦｃγＲＩＩａはＡＤＣＣ活性を有し；ＦｃγＲＩＩａについて、単一ヌクレオチド突然変異に起因して２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１及びＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１がヒトにおいて存在し；ＦｃγＲＩＩｂは阻害受容体であり、且つ近くのＩＴＡＭ経路を阻害する典型的な阻害性ＦｃγＲである。例えば、ＢＣＲへの免疫複合体の結合後に、Ｆｃ断片は同じ細胞上のＦｃγＲＩＩｂに結合して、Ｂ細胞活性化を負に調節し、抗体及びサイトカインの分泌を減少させる（Hogarth PM, Pietersz GA., 2012, NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, 11(4):311-331）。

ＩｇＧファミリーは４つのメンバー、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含み、これらは重鎖定常領域の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域中のアミノ酸において異なり、ＦｃγＲに対するそれらの異なる親和性を結果としてもたらす。ＩｇＧ１は、ヒトにおいて最も豊富に存在するサブタイプであり、そしてまた、モノクローナル抗体医薬品において使用される最も一般的なサブタイプである。ＩｇＧ１は、様々なＦｃγＲに結合することができ、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を誘導することができる。ＩｇＧ２は、ＦｃγＲに対して最も低い親和性を有するが、依然としてＦｃγＲＩＩａへの結合により単球媒介性ＡＤＣＣを誘導することができる。ＩｇＧ３は、ＦｃγＲへの最も高い結合能力を特徴とし、ＡＤＣＣ及びＩｇＧ１よりも高いＣＤＣ効果を誘導することができる。ＩｇＧ４分子は、ＦｃγＲＩ以外のＦｃγＲに対する弱い結合性を実証し、ＣＤＣ及びＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを引き起こすより低い確率を有する。しかしながら、ＩｇＧ４サブタイプの抗体は、ＦｃγＲＩへの結合を通じてＡＤＣＰ効果を媒介することができ、免疫細胞を標的化する抗体療法において存在するＡＤＣＰ効果は、免疫細胞に対する損傷を引き起こして、薬理学的な有害効果を招き得る。現在、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体が結合する免疫細胞に対する抗体媒介性ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ活性により引き起こされる損傷を低減させ又は排除するため、並びに抗体療法の有効性を向上させるための新規の抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体を開発する必要性が依然として存在する。

化学療法は現在、以下の９つのクラスに主に分類される（He Jie, et al., Clinical Oncology, Beijing, People’s Medical Publishing House, 2016:230-237）。第１のクラスは、ＤＮＡに直接的に結合してＤＮＡ複製を予防する薬物であり、これには、様々なアルキル化剤、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダカルバジン、白金ベースの薬物（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、カンプトテシン、並びにこれらの誘導体が含まれる。第２のクラスは、腫瘍細胞の酵素系に主に影響してＤＮＡ及びＲＮＡの前駆体の合成を遮断し、それによりＤＮＡ又はＲＮＡの形成を阻害する、核酸生合成を予防するための薬物であり、これには、メトトレキサート、フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、ヒドロキシウレア及びシタラビンが含まれ；そのような薬物はＳ期の細胞に主に作用し、代謝拮抗化学療法剤及び細胞周期特異的抗がん薬である。第３のクラスは、薬物がＤＮＡ二重らせんに挿入されてＤＮＡ二重らせんと非共有結合を形成して、ＤＮＡ依存性ｍＲＮＡへのＤＮＡ上の遺伝情報の転写に干渉し、損なわれた鋳型機能及び邪魔された転写を引き起こす薬理学的機構を通じて、転写に影響する化学療法剤である。第４のクラスは、チューブリン及び有糸分裂に影響するものであり、これには、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン及びタキサンが含まれる。第５のクラスは、リボソームの機能に影響してタンパク質合成を遮断する薬物であり；そのような薬物の代表はハリングトニンであり、これはタンパク質合成の開始を阻害し、リボソームを分解し且つ新たなペプチド鎖を放出させるが、リボソームへのｍＲＮＡ及びｔＲＮＡの結合を遮断せず；そのような薬物は、核内ＤＮＡ及び細胞質ＲＮＡの還元並びにポリソームの解重合を引き起こし、有糸分裂を阻害する。第６のクラスは、腫瘍細胞の膜に影響する薬物、例えばコンカナバリン（Ｃｏｎ－Ａ）及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）であり；それらは、細胞膜上の糖タンパク質受容体に結合し、それにより、腫瘍細胞中でのＤＮＡ合成に影響して腫瘍細胞が分裂することを予防することができる。第７のクラスは、アポトーシスを誘導する薬物、例えば三酸化ヒ素である。第８のクラスは、内分泌系を調節することにより腫瘍を治療するホルモンであり、これには、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲストゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン、コルチコステロイド、並びに抗コルチコステロイド（ジクロロジフェニルジクロロエタン及びアミノグルテチミドを含む）が含まれる。第９のクラスは抗がん標的化療法であり、これには、モノクローナル抗体、上皮増殖因子シグナル伝達阻害剤（例えば、受容体チロシンキナーゼ経路に対する標的化薬物）、ユビキチン－プロテアソーム阻害剤、及び血管新生阻害剤が含まれる。

アンロチニブはキノリン誘導体チロシンキナーゼ阻害剤である。多標的チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）として、それは腫瘍血管新生及び増殖シグナル伝達に影響する。主要な標的としては、受容体チロシンキナーゼ血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）１～３、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１～４、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）α及びβ、並びに幹細胞因子受容体（ＳＣＦＲ）７、８及び９が挙げられる。フェーズ２試験は、アンロチニブは全生存のための潜在的な利益と共に無増悪生存期間を向上させることを示した（Han B, et al., Br J Cancer, 2018; 118(5):654-661）。多施設二重盲検無作為化フェーズ３臨床試験は、アンロチニブは中国人患者において延長された且つ無増悪性の生存を結果としてもたらすことを示した。該発見は、アンロチニブは忍容性良好であり、進行したＮＳＣＬＣを有する患者のための潜在的なサードライン又は更なる治療であることを示唆した（Han B, et al., JAMA Oncol., 2018 Nov.; 4(11):1569-1575）。

特許文献国際公開第２００８１１２４０７号パンフレットの実施例２４は、キノリン由来チロシンキナーゼ阻害剤１－［［［４－（４－フルオロ－２－メチル－１Ｈ－インドール－５－イル）オキシ－６－メトキシキノリン－７－イル］オキシ］メチル］シクロプロピルアミン及びその調製方法を開示する。キノリン由来チロシンキナーゼ阻害剤の構造式は式Ｉに示される。塩酸アンロチニブは式Ｉの化合物の塩酸塩である。

エーザイ（日本）により開発された経口用の複数のチロシンキナーゼ阻害剤であるレンバチニブは、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）及びＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４）のキナーゼ活性を阻害する多標的受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。通常の細胞機能に加えて、レンバチニブはまた、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４、「ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ」（ＲＥＴ）受容体、ＫＩＴ並びに血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）を含めて、病原性血管新生、腫瘍成長及びがんの進行に関与する他の受容体チロシンキナーゼを阻害する。レンバチニブはまた肝細胞癌細胞系において抗増殖活性を呈し、これはＦＧＦＲシグナル伝達の活性化及びＦＧＦ受容体基質２α（ＦＲＳ２α）のリン酸化の同時の阻害に依存する。

レンバチニブ、４－（３－クロロ－４（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドの構造は米国特許第７，６１２，２０８号明細書の実施例３６８に開示されている。米国特許第７，２５３，２８６号明細書は、４－［３－クロロ－４－（シクロプロピルウレイド）フェノキシ］－７－メトキシキノリン－６－カルボキサミドメシル酸塩と命名される、レンバチニブのメシル酸塩形態（即ち、レンバチニブメシル酸塩）を開示し、その化学構造は以下（式ＩＩ）に提供される：

しかしながら、様々な腫瘍について、疾患は依然として化学療法後に長期にわたり制御可能ではなく、５年生存率は依然として非常に低い。したがって、より低い毒性及びより高い有効性を有する医薬品又は併用療法の開発は大きな意味を持つ。

集中的な研究及び創造的な努力により、本発明者は、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１抗体構造のＦｃ断片を対応的に改変して、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合能力を低減させ、それにより、免疫細胞に対するＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ効果を低減させ且つ抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１抗体の有効性を増加させた。

本発明は以下において詳述される。

本発明の１つの態様は、二重特異性抗体であって、
ＰＤ－１を標的化する第１のタンパク質機能性領域、及び
ＣＴＬＡ４を標的化する第２のタンパク質機能性領域を含み；
第１のタンパク質機能性領域が免疫グロブリンであり、且つ第２のタンパク質機能性領域が単鎖抗体であり；又は、第１のタンパク質機能性領域が単鎖抗体であり、且つ第２のタンパク質機能性領域が免疫グロブリンであり；
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２７～２９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３０～３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；単鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３３～３５にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３６～３８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
又は、
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３３～３５にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３６～３８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；単鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２７～２９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３０～３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプの免疫グロブリンであり；
ＥＵナンバリングシステムにしたがって、免疫グロブリンの重鎖定常領域が、位置２３４、２３５及び２３７のいずれか２つ又は３つにおいて突然変異を有し、且つＦｃγＲＩＩＩａ及び／又はＣ１ｑに対する二重特異性抗体の親和性定数が、突然変異前のものと比較して突然変異後に低減されており；好ましくは、親和性定数がＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定される、
二重特異性抗体に関する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、上記の突然変異後に、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８及び／又はＦｃγＲＩＩｂに対する二重特異性抗体の親和性定数は、突然変異前のものと比較して低減されており；好ましくは、親和性定数はＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定される。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、ＥＵナンバリングシステムにしたがって、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、位置２３４、２３５及び／又は２３７において以下の突然変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；
又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ
を有する。

本発明において、他に指定されなければ、位置番号の前の文字は突然変異前のアミノ酸を表し、且つ位置番号の後の文字は突然変異後のアミノ酸を表す。

本発明は更に、二重特異性抗体であって、
ＰＤ－１を標的化する第１のタンパク質機能性領域、及び
ＣＴＬＡ４を標的化する第２のタンパク質機能性領域を含み；
第１のタンパク質機能性領域が免疫グロブリンであり、且つ第２のタンパク質機能性領域が単鎖抗体であり；又は、第１のタンパク質機能性領域が単鎖抗体であり、且つ第２のタンパク質機能性領域が免疫グロブリンであり；
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号２７～２９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３０～３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；単鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号３３～３５にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３６～３８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
又は、
免疫グロブリンについて、重鎖可変領域が、配列番号３３～３５にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３６～３８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；単鎖抗体について、重鎖可変領域が、配列番号２７～２９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖可変領域が、配列番号３０～３２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列のＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み；
免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１サブタイプの免疫グロブリンであり；
ＥＵナンバリングシステムにしたがって、免疫グロブリンの重鎖定常領域が、位置２３４、２３５及び／又は２３７において以下の突然変異：
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
Ｌ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ；
Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ；又は
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａ
を有する、
二重特異性抗体に関する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、ＥＵナンバリングシステムにしたがって、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、
Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｐ２３８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｅ２３３Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｔ３９４Ｄ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ａ、Ｌ３２８Ｒ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ３１８Ａ及びＫ３２０Ａ
から選択される１つ又は複数の突然変異を有する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖの形態、即ち、Ｍｏｒｒｉｓｏｎフォーマットである。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４及び配列番号１８から選択され；免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１６及び配列番号２０から選択され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号４１及び配列番号４３から選択され；単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号４２及び配列番号４４から選択され；
又は、
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号４１及び配列番号４３から選択され；免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号４２及び配列番号４４から選択され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１４及び配列番号１８から選択され；単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１６及び配列番号２０から選択される。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体は、以下の（１）～（２０）：
（１）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に記載される；
（２）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載される；
（３）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に記載される；
（４）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に記載される；
（５）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載される；
（６）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に記載される；
（７）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される；
（８）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される；
（９）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される；
（１０）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される；
（１１）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される；
（１２）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される；
（１３）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４２に記載される；
（１４）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４３に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４４に記載される；
（１５）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４２に記載される；
（１６）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４３に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４４に記載される；
（１７）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４２に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される；
（１８）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４３に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４４に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される；
（１９）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４２に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される；
及び、
（２０）
免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４３に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４４に記載され；単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される
のうちのいずれか１つから選択される。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、
免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は配列番号４０に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４に記載される。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片は、約１０^-7Ｍより高い、例えば、約１０^-6Ｍ、１０^-5Ｍ、１０^-4Ｍ、若しくは１０^-3Ｍより高い又はより高い親和性定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８及び／又はＦｃγＲＩＩｂに結合し；好ましくは、親和性定数はＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定され；
好ましくは、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片は、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８及び／又はＦｃγＲＩＩｂに対して結合シグナルを有しないか、又は０．１ｎｍより低い結合シグナルを有し；好ましくは、結合シグナルは、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定される応答を指す。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片は、約１０^-9Ｍより高い、例えば、約１０^-8Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-6Ｍ、若しくは１０^-5Ｍより高い又はより高い親和性定数でＣ１ｑに結合し；好ましくは、親和性定数はＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定され;
好ましくは、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片は、Ｃ１ｑに対して結合シグナルを有しないか、又は０．１ｎｍより低い結合シグナルを有し；好ましくは、結合シグナルは、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定される応答を指す。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、第１のタンパク質機能性領域は、直接的に若しくはリンカー断片を介して第２のタンパク質機能性領域に連結されており；且つ／又は単鎖抗体の重鎖可変領域は、直接的に若しくはリンカー断片を介して単鎖抗体の軽鎖可変領域に連結されている。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、リンカー断片は（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは正の整数であり；好ましくは、ｎは、１、２、３、４、５又は６である。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、第１のタンパク質機能性領域及び第２のタンパク質機能性領域の数は、それぞれ独立して、１つ、２つ又はそれより多い。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、第１のタンパク質機能性領域の数は１つであり、且つ第２のタンパク質機能性領域の数は２つである。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体について、単鎖抗体は免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている。免疫グロブリンは２つの重鎖を有するので、２つの単鎖抗体分子は１つの免疫グロブリン分子に連結されている。好ましくは、２つの単鎖抗体分子は同一である。好ましくは、単鎖抗体は、上述のリンカー断片を介してアミド結合を形成することにより免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、免疫グロブリンの定常領域はヒト化されている。例えば、重鎖定常領域はＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域、アクセッション：Ｐ０１８５７であり、且つ軽鎖定常領域はＩｇカッパ鎖Ｃ領域、アクセッション：Ｐ０１８３４である。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体は、約１０^-5Ｍより低い、例えば、約１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ若しくは１０^-10Ｍより低い又はより低いＫ_DでＣＴＬＡ４タンパク質及び／又はＰＤ－１タンパク質に結合する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体はモノクローナル抗体である。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体はヒト化抗体である。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、二重特異性抗体は、
ＰＤ－１を標的化する第１のタンパク質機能性領域、及び
ＣＴＬＡ４を標的化する第２のタンパク質機能性領域
を含み；
第１のタンパク質機能性領域の数は１つであり、且つ第２のタンパク質機能性領域の数は２つであり；
第１のタンパク質機能性領域は免疫グロブリンであり、且つ第２のタンパク質機能性領域は単鎖抗体であり；
免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列は配列番号４０に記載され、且つ免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２４に記載され；
単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４３に記載され、且つ単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４４に記載され；
単鎖抗体は免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されており；
第１のタンパク質機能性領域は第１のリンカー断片を介して第２のタンパク質機能性領域に連結されており；且つ単鎖抗体の重鎖可変領域は第２のリンカー断片を介して単鎖抗体の軽鎖可変領域に連結されており；第１のリンカー断片及び第２のリンカー断片は同一又は異なるものであり；
好ましくは、第１のリンカー断片及び第２のリンカー断片のアミノ酸配列は配列番号２５及び配列番号２６から独立して選択され；
好ましくは、第１のリンカー断片及び第２のリンカー断片のアミノ酸配列は配列番号２６に記載される。

本発明の別の態様は、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子に関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む、ベクターに関する。

本発明はまた、本発明の単離された核酸分子又は本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。

本発明の別の態様は、抗体又はその抗原結合性断片、及びコンジュゲート化された部分を含む、コンジュゲートであって、免疫グロブリンが本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体であり、且つコンジュゲート化された部分が、検出可能な標識であり；好ましくは、コンジュゲート化された部分が、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、又は酵素である、コンジュゲートに関する。

本発明の別の態様は、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体を含む又は本発明のコンジュゲートを含む、キットであって；
好ましくは、キットが、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片を特異的に認識することができる第２の抗体を更に含み；任意選択的に、第２の抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、又は酵素を更に含む、
キットに関する。

本発明の別の態様は、試料中のＰＤ－１及び／又はＣＴＬＡ４の存在又はレベルを検出するためのキットの調製における、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体又はコンジュゲートの使用に関する。

本発明の別の態様は、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体又はコンジュゲートを含む、医薬組成物であって；任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を更に含む、医薬組成物に関する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、医薬組成物は、１つ又は複数の抗腫瘍化学療法剤を更に含み；
好ましくは、抗腫瘍化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤であり；より好ましくは、抗腫瘍化学療法剤は、アンロチニブ若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）、又はレンバチニブ若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、メシル酸塩）である。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、医薬組成物の単位用量は、二重特異性抗体の質量に基づいて、１００～１０００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、４００～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである。

本発明の別の態様は、別々のパッケージ中に第１の製品及び第２の製品を含む、組合せ製品であって、
第１の製品が、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体、コンジュゲート又は医薬組成物を含み；
第２の製品が１つ又は複数の抗腫瘍化学療法剤を含み；好ましくは、抗腫瘍化学療法剤がチロシンキナーゼ阻害剤であり；より好ましくは、抗腫瘍化学療法剤が、アンロチニブ若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）、又はレンバチニブ若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、メシル酸塩）であり；
好ましくは、第１の製品及び第２の製品が、独立して、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤を更に含み；
好ましくは、組合せ製品がパッケージ挿入物を更に含む、
組合せ製品に関する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、組合せ製品について、第１の製品の単位用量は、二重特異性抗体の質量に基づいて、１００～１０００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、４００～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、組合せ製品について、第２の製品の単位用量は、活性成分の質量に基づいて、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．５～１０ｍｇ、１～１０ｍｇ、２～８ｍｇ、又は１～５ｍｇである。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、組合せ製品について、第２の製品の単位用量は、活性成分の質量に基づいて、１～２０ｍｇ、２～１５ｍｇ、４～１２ｍｇ、又は８～１２ｍｇである。

本発明の別の態様は、腫瘍若しくは貧血を治療及び／若しくは予防するための医薬の調製、又は腫瘍若しくは貧血を診断するための医薬の調製における、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体、コンジュゲート、医薬組成物又は組合せ製品の使用であって；好ましくは、腫瘍が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、白血病、乳がん、中皮腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、リンパ腫及び鼻咽頭がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、腫瘍がＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の固形腫瘍であり；好ましくは、腫瘍が、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃がん、中皮腫、肉腫、副腎皮質癌、悪性黒色腫又は卵巣生殖細胞新生物であり；
好ましくは、肺がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん及び扁平細胞肺がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、胃がんが胃腺癌又は胃食道接合部腺癌である、
使用に関する。

ＭＳＩはマイクロサテライト不安定性を指す。マイクロサテライトは、１つ、２つ又はそれより多くのヌクレオチドの１０～５０個のリピートを含めて、ヒトゲノムの全体を通じた短いタンデムリピートである。ある特定の異常な細胞、例えば腫瘍中のマイクロサテライトは、正常細胞と比較してリピート単位の挿入又は欠失により長さにおいて変更されている。そのような変更はＭＳＩと称される。不安定性及び程度に基づいて、ＭＳＩは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）、低頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｌ）及びマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）として分類され得る。ＭＳＩの主要な原因はＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）である。ヒトミスマッチ修復遺伝子（ＭＭＲ遺伝子）は、転写及び翻訳を通じて対応するミスマッチ修復タンパク質を発現することができる。いかなるＭＭＲタンパク質も存在しないことはミスマッチ修復不全に繋がることがあり、塩基対ミスマッチがそのような不全に起因してＤＮＡ複製のプロセス中に蓄積し、最終的にＭＳＩを結果としてもたらす。結腸直腸がんの約１５％はＭＳＩ経路に起因する。これは結腸直腸がんにおいて最初に報告され、胃がん、子宮内膜がん、副腎皮質癌及び同種のものにおいても起こり得る（Baretti M et al., Pharmacol Ther., 2018; 189:45-62）。ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲの特徴は、その後の研究において中皮腫、肉腫、副腎皮質癌、悪性黒色腫及び卵巣生殖細胞新生物においても見出された。

ＭＳＩ－Ｈ及びｄＭＭＲは、２つの異なるアッセイの結果を表し、生物学的に一貫しており、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ又は高頻度ＭＳＩ／ｄＭＭＲと呼ばれるが、ＭＳＩ－Ｌ及びＭＳＳはプロフィシェントＭＭＲ（ｐＭＭＲ）の表現型である。ｄＭＭＲの検出は、腫瘍検体（手術検体及び吸引検体を含む）に基づいてＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６及びＰＭＳ２の４つのミスマッチ遺伝子についてタンパク質発現の免疫組織化学を実行することである。４つのタンパク質のいずれかの非存在はｄＭＭＲを裏付け；４つ全てのタンパク質の陽性の結果はｐＭＭＲ、即ち、完全なミスマッチ修復機能を指し示す。ＭＳＩの検出は、腫瘍細胞及び体細胞中の繰返しのＤＮＡ配列（マイクロサテライト配列）の長さをマッチさせること、並びに長さを比較することである。Ａｍｅｒｉｃａｎ ＮＣＩ ｓｔａｎｄａｒｄに基づいてＰＣＲを使用して５つの標準的な座位が検出された場合、２つ又はそれより多くの座位における非一貫性は、ＭＳＩ－Ｈとして定義される不安定性を指し示し、１つの非一貫的な座位はＭＳＩ－Ｌを指し示し、５つの一貫的な座位はＭＳＳを指し示す。ハイスループットシークエンシング（次世代シークエンシング、又はＮＧＳとも称される）もまた、マイクロサテライト不安定性を検出するための方法として使用され得る。より多くのマイクロサテライト座位、例えば５つより多くの座位又は他のマイクロサテライト座位が選択される場合、ＰＣＲアッセイについて、≧３０％の座位における非一貫性はＭＳＩ－Ｈとして定義され、全ての座位における一貫性はＭＳＳとして定義され、０～３０％の非一貫性はＭＳＩ－Ｌとして定義される。

本発明の別の態様は、
ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を遮断するための医薬、
ＰＤ－１の活性若しくはレベルを下方調節するための医薬、
生物においてＰＤ－１の免疫抑制を緩和するための医薬、若しくは
Ｔリンパ球においてＩＦＮ－γ及び／若しくはＩＬ－２の発現を上昇させるための医薬；
並びに／又は
Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を遮断するための医薬、
ＣＴＬＡ４の活性若しくはレベルを下方調節するための医薬、
生物においてＣＴＬＡ４の免疫抑制を緩和するための医薬、若しくは
Ｔリンパ球においてＩＬ－２の発現を上昇させるための医薬
の調製における、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体又はコンジュゲートの使用に関する。

本発明の別の態様は、腫瘍の予防及び／若しくは治療並びに／又はアジュバント治療及び／若しくは診断の方法であって、必要とする対象に有効量の本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体、コンジュゲート、医薬組成物又は組合せ製品を投与することを含み；好ましくは、腫瘍が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、白血病、乳がん、中皮腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、リンパ腫及び鼻咽頭がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、肺がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん及び扁平細胞肺がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、胃がんが胃腺癌又は胃食道接合部腺癌であり；
好ましくは、腫瘍がＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の固形腫瘍であり；好ましくは、腫瘍が、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の以下の腫瘍：
結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃がん、中皮腫、肉腫、副腎皮質癌、悪性黒色腫及び卵巣生殖細胞新生物
のうちの１つ又は複数から選択される、
方法に関する。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、方法のために、投与は、外科治療の前若しくは後及び／又は放射線療法の前若しくは後に行われる。

本発明の１つ又は複数の実施形態において、方法において、
抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の単位用量は、体重１ｋｇ当たり０．１～１００ｍｇ、好ましくは１～１０ｍｇ（例えば、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ又は１０ｍｇ）であり；代替的に、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の単位用量は、各対象において１０～１０００ｍｇ（例えば、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ又は約１０００ｍｇ）、好ましくは５０～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１５０～３００ｍｇ、１５０～２５０ｍｇ又は２００ｍｇであり；
好ましくは、用量は、３日、４日、５日、６日、１０日、１週、２週又は３週毎に１回与えられ；
好ましくは、投与の経路は静脈点滴又は静脈注射である。

一部の実施形態において、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体の投与は、２週（１４日）又は３週（２１日）のサイクルで行われ、且つ好ましくは、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は、各サイクルの１日目（Ｄ１）に静脈内に投与される。例えば、抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二重特異性抗体は２週（ｑ２ｗ）又は３週（ｑ３ｗ）毎に１回投与される。

腫瘍の予防及び／若しくは治療並びに／又はアジュバント治療及び／若しくは診断における使用のための、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体、コンジュゲート、医薬組成物又は組合せ製品であって；好ましくは、腫瘍が、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、白血病、乳がん、中皮腫、子宮頸がん、子宮内膜がん、リンパ腫及び鼻咽頭がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、肺がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん及び扁平細胞肺がんのうちの１つ又は複数から選択され；
好ましくは、胃がんが胃腺癌又は胃食道接合部腺癌であり；
好ましくは、腫瘍がＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の固形腫瘍であり；好ましくは、腫瘍が、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の以下の腫瘍：
結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、胃がん、中皮腫、肉腫、副腎皮質癌、悪性黒色腫及び卵巣生殖細胞新生物
のうちの１つ又は複数から選択される、
前記使用のための、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体、コンジュゲート、医薬組成物又は組合せ製品もまた提供される。

ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を遮断すること、
ＰＤ－１の活性若しくはレベルを下方調節すること、
生物においてＰＤ－１の免疫抑制を緩和すること、若しくは
Ｔリンパ球においてＩＦＮ－γの発現を上昇させること；
及び／又は
Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を遮断すること、
ＣＴＬＡ４の活性若しくはレベルを下方調節すること、
生物においてＣＴＬＡ４の免疫抑制を緩和すること、若しくは
Ｔリンパ球においてＩＬ－２の発現を上昇させること
における使用のための、本発明の任意の実施形態による二重特異性抗体又はコンジュゲートが提供される。

抗体薬物、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、様々な疾患の治療において良好な有効性を達成してきた。これらの治療用抗体を獲得するための伝統的な実験方法は、抗原を用いて動物を免疫化し、免疫化された動物において抗原を標的化する抗体を獲得すること、又は親和性成熟により抗原に対するより低い親和性を有するそれらの抗体を向上させることである。

軽鎖及び重鎖の可変領域は抗原の結合を決定し；各鎖の可変領域は３つの超可変領域、即ち、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、且つ軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み；これらはKabat et al.により定義される；Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991), Volumes 1-3, NIH Publication 91-3242, Bethesda Mdを参照）。

以下の（１）～（１３）におけるモノクローナル抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、当業者に周知の技術的手段により、例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースにより、分析され、結果は以下の通りである：

（１）１４Ｃ１２
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に記載され、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に記載される。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２７）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号２８）
ＨＣＤＲ３：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号２９）
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号３０）
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮ（配列番号３１）
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３２）

（２）１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載され、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２０に記載される。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は１４Ｃ１２と同じである。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は１４Ｃ１２と同じである。

（３）４Ｇ１０
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に記載される。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号３３）
ＨＣＤＲ２：ＩＮＰＹＮＮＩＴ（配列番号３４）
ＨＣＤＲ３：ＡＲＬＤＹＲＳＹ（配列番号３５）
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＴＧＡＶＴＴＳＮＦ（配列番号３６）
ＬＣＤＲ２：ＧＴＮ（配列番号３７）
ＬＣＤＲ３：ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号３８）

（４）４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に記載され、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載され；
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は４Ｇ１０と同じである。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は４Ｇ１０と同じである。

（５）４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３
重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０に記載され、且つ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２に記載される。
重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は４Ｇ１０と同じである。
軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は４Ｇ１０と同じである。

（６）ＢｉＡｂ００１（Ｍ）
重鎖可変領域と関連付けられる９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（配列番号２７）
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（配列番号２８）
ＨＣＤＲ３：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（配列番号２９）
ＨＣＤＲ４：ＧＹＳＦＴＧＹＴ（配列番号３３）
ＨＣＤＲ５：ＩＮＰＹＮＮＩＴ（配列番号３４）
ＨＣＤＲ６：ＡＲＬＤＹＲＳＹ（配列番号３５）
ＨＣＤＲ７：ＴＧＡＶＴＴＳＮＦ（配列番号３６）
ＨＣＤＲ８：ＧＴＮ（配列番号３７）
ＨＣＤＲ９：ＡＬＷＹＳＮＨＷＶ（配列番号３８）
軽鎖可変領域と関連付けられる３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＮＴＹ（配列番号３０）
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮ（配列番号３１）
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（配列番号３２）

（７）ＢｉＡｂ００２（Ｍ）
重鎖可変領域と関連付けられる９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。
軽鎖可変領域と関連付けられる３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。

（８）ＢｉＡｂ００３（Ｍ）
重鎖可変領域と関連付けられる９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。
軽鎖可変領域と関連付けられる３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。

（９）ＢｉＡｂ００４（Ｍ）
重鎖可変領域と関連付けられる９つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。
軽鎖可変領域と関連付けられる３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列はＢｉＡｂ００１（Ｍ）と同じである。

本発明の抗体ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、アミノ酸突然変異はＢｉＡｂ００４（Ｍ）の非可変領域に導入される。ＥＵナンバリングシステムにしたがって、アミノ酸突然変異は、位置２３４、２３５及び２３７において導入される：

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、重鎖のヒンジ領域中で位置２３４においてロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５においてロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３５Ａ）、及び位置２３７においてグリシンからアラニンへの点突然変異（Ｇ２３７Ａ）を導入することにより得られる。

本発明において、他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。追加的に、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験操作は、対応する分野において広く使用されるルーチンの手順である。本発明をより良好に理解するために、関連する用語の定義及び説明が以下において提供される。

本明細書において使用される場合、ＣＴＬＡ４タンパク質（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）のアミノ酸配列を参照する場合、それは、ＣＴＬＡ４タンパク質の全長、又はＣＴＬＡ４の細胞外断片ＣＴＬＡ４ＥＣＤ又はＣＴＬＡ４ＥＣＤを含む断片を含み；ＣＴＬＡ４ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウス又はヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃ又はｈＦｃ）に融合した断片もまた含まれる。しかしながら、ＣＴＬＡ４タンパク質のアミノ酸配列において、その生物学的機能に影響することなく突然変異又はバリエーション（置換、欠失及び／又は付加が挙げられるがこれらに限定されない）が天然に生成され又は人工的に導入され得ることを当業者は理解する。したがって、本発明において、「ＣＴＬＡ４タンパク質」という用語は、それらの天然の又は人工的なバリアントを含めて、全てのそのような配列を含むべきである。追加的に、ＣＴＬＡ４タンパク質の配列断片を記載する場合、それはまた、その天然の又は人工的なバリアント中の対応する配列断片を含む。

本明細書において使用される場合、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００５０１８）を参照する場合、それは、ＰＤ－１タンパク質の全長、又はＰＤ－１の細胞外断片ＰＤ－１ＥＣＤ又はＰＤ－１ＥＣＤを含む断片を含み；ＰＤ－１ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウス又はヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃ又はｈＦｃ）に融合した断片もまた含まれる。しかしながら、ＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列において、その生物学的機能に影響することなく突然変異又はバリエーション（置換、欠失及び／又は付加が挙げられるがこれらに限定されない）が天然に生成され又は人工的に導入され得ることを当業者は理解する。したがって、本発明において、「ＰＤ－１タンパク質」という用語は、それらの天然の又は人工的なバリアントを含めて、全てのそのような配列を含むべきである。追加的に、ＰＤ－１タンパク質の配列断片を記載する場合、それはまた、その天然の又は人工的なバリアント中の対応する配列断片を含む。

本明細書において使用される場合、他に指定されなければ、Ｂ７はＢ７－１及び／又はＢ７－２であり；その特有の配列は先行技術において公知のものであり、既存の文献又はＧｅｎＢａｎｋにおいて開示される配列に対して参照が為され得る。例えば、Ｂ７－１（ＣＤ８０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４１）；Ｂ７－２（ＣＤ８６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４２）。

本明細書において使用される場合、ＥＣ₅₀という用語は、最大の効果の５０％のための濃度、即ち、最大の効果の５０％を引き起こすことができる濃度を指す。

本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、一般にポリペプチド鎖の２つのペア（各ペアは１つの「軽」（Ｌ）鎖及び１つの「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子を指す。一般的意味において、重鎖は、抗体中のより大きい分子量を有するポリペプチド鎖として解釈され得るものであり、軽鎖は、抗体中のより小さい分子量を有するポリペプチド鎖を指す。軽鎖はκ及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、一般に、μ、δ、γ、α、又はεとして分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約１２個又はそれより多くのアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖はまた、約３個又はそれより多くのアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は重鎖可変領域（Ｖ_H）及び重鎖定常領域（Ｃ_H）からなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（Ｃ_H1、Ｃ_H2、及びＣ_H3）からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（Ｖ_L）及び軽鎖定常領域（Ｃ_L）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣ_Lからなる。抗体の定常領域は、古典的補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）の結合を含めて、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。Ｖ_H及びＶ_L領域は、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存的な領域が分布した高度に可変な領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に更に分けられ得る。各Ｖ_H及びＶ_Lは、アミノ末端からカルボキシル末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で編成された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（Ｖ_H及びＶ_L）は抗体結合性部位をそれぞれ形成する。各領域又はドメインへのアミノ酸の割当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1987 and 1991））、Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917、又はChothia et al. (1989) Nature, 342:878-883の定義に従う。特に、重鎖はまた、３つより多く、例えば６、９、又は１２個のＣＤＲを含んでもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体において、重鎖は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端が別の抗体に連結されたｓｃＦｖであってもよく、この場合、重鎖は９つのＣＤＲを含む。「抗体」という用語は、抗体を製造するためのいかなる特有の方法によっても限定されない。例えば、抗体としては、特に、組換え抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体が挙げられる。抗体は異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えば、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭであることができる。

抗体の抗原結合性断片（例えば、上記の抗体断片）は、当業者に公知の従来技術（例えば、ＤＮＡ組換え、又は酵素的若しくは化学的切断）を使用することにより所与の抗体から得ることができ、抗体の抗原結合性断片は、インタクトな抗体と同じやり方で特異性についてスクリーニングされる。

本明細書において使用される場合、文脈において他に明確に定義されなければ、「抗体」という用語を言及する場合、それはインタクトな抗体だけでなく、抗体の抗原結合性断片もまた含む。

本明細書において使用される場合、「ｍＡｂ」及び「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同的な抗体の群に由来する、即ち、自然発生的に起こり得る天然の突然変異を除いて、同一の抗体分子の群に由来する、抗体又はその断片を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対して高度に特異的である。モノクローナル抗体に対して、ポリクローナル抗体は、抗原上の異なるエピトープを一般に同定する少なくとも２つ又はそれより多くの異なる抗体を一般に含む。モノクローナル抗体は、Kohler et al. （Kohler et al., Nature, 256:495, 1975）により最初に報告されたハイブリドーマ技術を使用して一般に得ることができるが、ＤＮＡ組換えを使用して得ることもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。

本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）のＣＤＲ領域の全体又は部分が非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域により置き換えられた場合に得られる抗体又は抗体断片を指し、ドナー抗体は、期待される特異性、親和性又は反応性を有する非ヒト（例えば、マウス、ラット又はウサギ）抗体であってもよい。追加的に、レセプター抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）中の一部のアミノ酸残基はまた、抗体の性能を更に向上させ又は最適化するために、対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基により又は他の抗体のアミノ酸残基により置き換えられ得る。ヒト化抗体に関するより詳細について、例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)；及びClark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000)を参照。

本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」はまた、当該分野において「抗原決定基」と呼ばれる。エピトープ又は抗原決定基は、一般に、分子の化学的に活性の表面基、例えばアミノ酸、炭水化物又は糖側鎖からなり、通常、特有の三次元構造的特徴及び特有の電荷的特徴を有する。例えば、エピトープは、一般に、「リニア」又は「コンホメーショナル」であり得る独特の空間的配座において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の連続的又は非連続的なアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照。リニアエピトープにおいて、タンパク質及び相互作用分子（例えば、抗体）の間の全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に位置する。コンホメーショナルエピトープにおいて、相互作用部位は、互いに分離したタンパク質のアミノ酸残基にわたり位置する。

本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、天然の状態から人工的な手段により得られたことを指す。ある特定の「単離された」物質又は成分が天然に見られる場合、それは、変化がその天然の環境において起こること、若しくはそれが天然の環境から単離されること、又は両方が該当し得る。例えば、ある特定の単離されたものではないポリヌクレオチド又はポリペプチドがある特定の生きた動物中に天然に存在し、またそのような天然の状態から単離された高い純度を有する同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、物質の活性に影響しない人工的な若しくは合成の物質又は他の不純物の存在を除外しない。

本明細書において使用される場合、「大腸菌発現系」という用語は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（株）及びベクターからなる発現系を指し、大腸菌（株）は、商業的に入手可能な株、以下に限定されないが例えば、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）に由来する。

本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸媒体を指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能とする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターにより運ばれる遺伝物質要素が宿主細胞中で発現され得るように形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入され得る。ベクターは当業者に周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばラムダファージ又はＭ１３ファージ；及び動物ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターとして使用され得る動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、発現を制御する様々なエレメントを含んでもよく、これには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。追加的に、ベクターは複製開始部位を更に含んでもよい。

本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターが導入され得る細胞を指し、これには、原核細胞、例えば大腸菌若しくは枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真菌細胞、例えば酵母細胞若しくはアスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、昆虫細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞若しくはＳｆ９、又は動物細胞、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、若しくはヒト細胞が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、２つの分子の間のランダムでない結合反応、例えば抗体及びそれが標的化する抗原の間の反応を指す。一部の実施形態において、抗原（又は抗原に特異的な抗体）に特異的に結合する抗体は、抗体が、約１０^-5Ｍより低い、例えば約１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ若しくは１０^-10Ｍより低い又はより低い親和性（Ｋ_D）で抗原に結合することを指す。本発明の一部の実施形態において、「標的化する」という用語は特異的結合を指す。

本明細書において使用される場合、「Ｋ_D」という用語は、特異的な抗体－抗原相互作用についての解離平衡定数を指し、これは抗体及び抗原の間の結合親和性を記載するために使用される。平衡解離定数が小さくなればなる程、抗体－抗原結合はより堅固なものとなり、抗体及び抗原の間の親和性はより高くなる。一般に、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）機器又はＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムにより測定された場合に、抗体は、約１０^-5Ｍより低い、例えば約１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ若しくは１０^-10Ｍより低い又はより低い解離平衡定数（Ｋ_D）で抗原に結合する。

本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用することができ；「ポリクローナル抗体」及び「ｐＡｂ」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用することができ；「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用することができる。また、本明細書において、アミノ酸は、一般に、当該技術分野において公知の１文字及び３文字での略記により表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａにより表され得る。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」という用語は、対象及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合性の担体及び／又は賦形剤を指し、これは当該技術分野において周知であり（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, edited by Gennaro AR, 19th ed., Pennsylvania, Mack Publishing Company, 1995を参照）、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ｐＨ調節剤としてはリン酸緩衝液が挙げられるがこれに限定されず；界面活性剤としては、陽イオン性、陰イオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０が挙げられるがこれらに限定されず；イオン強度増強剤としては塩化ナトリウムが挙げられるがこれに限定されない。

本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原と共に生物に送達された場合又は事前に生物に送達された場合に抗原に対する生物の免疫応答を増強し又は免疫応答の種類を変化させることができる、非特異的な免疫増強剤を指す。様々なアジュバントがあり、これには、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカイン等が含まれるがこれらに限定されない。フロイントアジュバントは、動物実験において最も一般的に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより使用される。

本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を得る又は少なくとも部分的に得るために充分な量を指す。例えば、（例えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合又はＣＴＬＡ４過剰活性と関連付けられる疾患、例えば腫瘍のための）予防有効量は、疾患（例えば、Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合又はＣＴＬＡ４過剰活性と関連付けられる疾患、例えば腫瘍）の開始を予防し、停止させ、又は遅延させるために充分な量であり；治療有効量は、疾患を患う患者において疾患及びその合併症を治癒し又は少なくとも部分的に停止させるために充分な量である。そのような有効量を決定することは、疑いなく当業者の能力の範囲内である。例えば、治療目的のために有効な量は、治療されるべき疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的条件、例えば年齢、体重及び性別、投与の経路、並びに並行して与えられる他の治療等に依存する。

「再発性」がんは、以前の治療（例えば、手術）に対する応答の後に元々の部位又は遠位の部位において再生するがんである。「局所再発性」がんは、以前に治療されたがんと同じ部位において治療後に起こるがんである。

「転移性」がんは、身体の１つの部分（例えば、肺）から別の部分へと広がるがんを指す。

本明細書において使用される場合、「完全に排除された」という用語は、既存の計測手段（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステム）により検出された場合の結合シグナルの非存在又は極めて弱い結合シグナルを指す。本発明の１つの実施形態において、結合シグナルの非存在又は極めて弱い結合シグナルは、０．１ｎｍより低い結合シグナル（即ち、応答）を指す。

本発明において、「第１」（例えば、第１のタンパク質機能性領域、第１のリンカー断片又は第１の製品）及び「第２」（例えば、第２のタンパク質機能性領域、第２のリンカー断片又は第２の製品）という用語は、他に指定されなければ、区別するため又は表現における明確性のために使用され、典型的な順次的な意味を持たない。

本発明において、「約」又は「おおよそ」は、定義される値又は物理的量が、他に指定されなければ、１０％、２０％又は３０％の範囲内で増減することを指す。例えば、約１００分又はおおよそ１００分は、９０分～１１０分、８０分～１２０分又は７０分～１３０分であり得る。

本発明の利点：
本発明は、以下の技術的な効果（１）～（３）のうちの１つ又は複数を達成する：
（１）本発明者による本発明の抗体のＦｃ断片の改変は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８及び／又はＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性を完全に排除し、それによりＡＤＣＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性を排除する。
（２）本発明者による本発明の抗体のＦｃ断片の改変は、補体Ｃ１ｑに対する結合活性を完全に排除し、それによりＣＤＣ活性を排除する。
（３）本発明の抗体は、腫瘍を予防及び治療するための医薬の調製における使用のための潜在能力を有する。

ＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１２ｎＭである。 ＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１２ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ及び３１．２５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ及び３１．２５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ及び３１．２５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ及び３１．２５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 ＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ及び１２．５ｎＭである。 Ｃ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗体濃度は、それぞれ２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ及び１．２５ｎＭである。 Ｃ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗原濃度は、それぞれ２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ及び１．２５ｎＭである。 Ｃ１ｑに対する５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２－ＩｇＧ１ｍｔの親和性定数アッセイ。上から下への曲線ペアについての抗原濃度は、それぞれ２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ及び１．２５ｎＭである。 ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＣ活性アッセイ。 レンバチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）による皮下ヒト肺がんＨＣＣ８２７細胞腫瘍異種移植片の阻害。 Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３マウスにおけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）による皮下結腸がんＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３腫瘍移植片の阻害。 ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の抗体媒介性貪食活性。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト胃がんKATO III細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト子宮頸がんＨｅｌａ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト鼻咽頭がんＣＮＥ－２Ｚ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト中皮腫ＮＣＩ－Ｈ２４５２細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト非小細胞肺がん（ヒト肺腺癌）Ａ５４９細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト小細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ４４６細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト扁平細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ２２６細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がんＳＷ４８細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。 ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）による非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がんＳＷ８３７細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答。

詳細な説明
本発明の実施形態が、実施例を参照して以下において詳細に記載される。以下の実施例は、本発明の実例を示すためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことを当業者は理解する。技術又は条件が指定されない場合、実施例は、当該技術分野における文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, authored by J. Sambrook et al., and translated by Huang Peitang et al., Third Edition, Science Pressを参照）に記載の技術若しくは条件にしたがって又は製品マニュアルにしたがって実行された。使用された試薬又は機器は、その製造者が指定されない場合、商業的に入手可能な従来の製品である。

本発明の以下の実施例において：
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Guangdong Medical Laboratory Animal Centerから購入した。
ヒト末梢血単核細胞は、ドナーのインフォームドコンセントと共に、Akeso Biopharma, Inc．において単離及び調製した。
Raji-PDL1は、Akeso BiopharmaによりヒトＢ細胞Ｒａｊｉに基づいてトランスフェクションを介して構築されたヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞である。
Ficoll-Paque^TM PLUS（又はFicoll-Paque PLUS）はGE Healthcareから購入した。
Human IL-2 ELISA kitはDakewe Biotech Co., Ltdから購入した。
ＲＰＭＩ １６４０培地、ＤＭＥＭ培地、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）フェノールレッド及びBlastidinはいずれもGibcoから購入した。
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）はDianotechから購入した。
ＦＢＳはExcell bioから購入した。
ミトマイシンＣ（ＭＭＣ）はStressmarqから購入した。
アイソタイプ対照、ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ抗体、又はｈＩｇＧと略記されるヒトＩｇＧ）の配列は、「Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies」というタイトルでAcierno et al.により報告された研究（Acierno et al., J Mol Biol., 2007; 374(1):130-146）におけるＦａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列に由来する。
実施例において使用されたアンロチニブは、商標名Fukewei（登録商標）及び一般名塩酸アンロチニブ（ａｎｌｏｄｉｎｉｂ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の下でのアンロチニブの塩酸塩であり、CTTQ Pharmaから購入した。
実施例において使用されたレンバチニブは、商標名Lenvima（登録商標）の下でのレンバチニブメシル酸塩であり、Eisai（中国）から購入した。

調製例１：抗ＣＴＬＡ４抗体の配列設計
抗ＣＴＬＡ４抗体４Ｇ１０並びにそのヒト化抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１及び４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びコーディングヌクレオチド配列は、中国特許公開公報第１０６９６７１７２（Ａ）号におけるそれぞれ４Ｇ１０、４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１及び４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３のものと同一である。

（１）４Ｇ１０の重鎖及び軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３７２ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴ（配列番号１）
コードされるアミノ酸配列：（１２４ａａ）
ＱＶＫＬＱＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＦＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＲＬＴＳＥＤＳＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹ（配列番号２）
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３７８ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣ（配列番号３）
コードされるアミノ酸配列：（１２６ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＳＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＱＧＱＦＣ（配列番号４）

（２）ヒト化モノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ１Ｌ１の重鎖及び軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域のヌクレオチド配列（４Ｇ１０Ｈ１Ｖ）：（３４５ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＡＧＣＧＧＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴ（配列番号５）
コードされるアミノ酸配列：（１１５ａａ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＦＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＳＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号６）
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（４Ｇ１０Ｌ１Ｖ）：（３２７ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号７）
コードされるアミノ酸配列：（１０９ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＳＬＩＧＧＴＮＮＲＡＳＷＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号８）

（３）ヒト化モノクローナル抗体４Ｇ１０Ｈ３Ｌ３の重鎖及び軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域のヌクレオチド配列（４Ｇ１０Ｈ３Ｖ）：（３４５ｂｐ）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＴＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡ（配列番号９）
コードされるアミノ酸配列（４Ｇ１０Ｈ３Ｖ）：（１１５ａａ）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１０）
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（４Ｇ１０Ｌ３Ｖ）：（３２７ｂｐ）
ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号１１）
コードされるアミノ酸配列（４Ｇ１０Ｌ３Ｖ）：（１０９ａａ）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＳＬＩＧＧＴＮＮＫＡＳＷＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１２）

調製例２：抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２及びそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の配列設計
抗ＰＤ－１抗体１４Ｃ１２及びそのヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列及びコーディングヌクレオチド配列は、中国特許公開公報第ＣＮ１０６９６７１７２（Ａ）号におけるそれぞれ１４Ｃ１２及び１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のものと同一である。

（１）１４Ｃ１２の重鎖及び軽鎖可変領域配列
重鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
ＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣ（配列番号１３）
コードされるアミノ酸配列：（１１８ａａ）
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号１４）
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１５）
コードされるアミノ酸配列：（１０７ａａ）
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＦＴＣＫＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号１６）

（２）ヒト化モノクローナル抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖及び軽鎖可変領域並びに重鎖及び軽鎖配列
重鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３５４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（配列番号１７）
コードされるアミノ酸配列：（１１８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１８）
軽鎖可変領域のヌクレオチド配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号１９）
コードされるアミノ酸配列：（１０７ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２０）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１重鎖のＤＮＡ配列（１４Ｃ１２Ｈ１）：（１３４４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号２１）
コードされるアミノ酸配列：（４４８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２２）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１軽鎖のＤＮＡ配列（１４Ｃ１２Ｌ１）：（６４２ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＧＧＣＧＡＡＴＧＴ（配列番号２３）
コードされるアミノ酸配列：（２１４ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２４）

調製例３：二機能性抗体ＢｉＡｂ００１（Ｍ）、ＢｉＡｂ００２（Ｍ）、ＢｉＡｂ００３（Ｍ）及びＢｉＡｂ００４（Ｍ）の配列設計
二機能性抗体ＢｉＡｂ００１（Ｍ）、ＢｉＡｂ００２（Ｍ）、ＢｉＡｂ００３（Ｍ）及びＢｉＡｂ００４（Ｍ）の構造パターンはＭｏｒｒｉｓｏｎフォーマット（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）であり、即ち、１つのＩｇＧ抗体の２つの重鎖のＣ末端は、リンカー断片を介して別の抗体のｓｃＦｖ断片に別々に連結されている。重鎖及び軽鎖の設計のための構成要素が以下の表Ａに示される。

上記の表Ａにおいて：
リンカー１のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）₃（配列番号２５）であり、且つ
リンカー２のアミノ酸配列は（ＧＧＧＧＳ）₄（配列番号２６）である。

上記の表Ａにおいて、ＢｉＡｂ００１（Ｍ）、ＢｉＡｂ００２（Ｍ）、ＢｉＡｂ００３（Ｍ）及びＢｉＡｂ００４（Ｍ）抗体のｓｃＦｖ断片４Ｇ１０Ｈ１Ｖ（Ｍ）、４Ｇ１０Ｌ１Ｖ（Ｍ）、４Ｇ１０Ｈ３Ｖ（Ｍ）及び４Ｇ１０Ｌ３Ｖ（Ｍ）は、それぞれ４Ｇ１０Ｈ１Ｖ、４Ｇ１０Ｌ１Ｖ、４Ｇ１０Ｈ３Ｖ及び４Ｇ１０Ｌ３Ｖに基づくフレームワーク領域の個々のアミノ酸における突然変異を含んでおり、これは、抗体の構造を有効に最適化し、それらの有効性を向上させた。

（１）４Ｇ１０Ｈ１Ｖ（Ｍ）：（１１５ａａ、４Ｇ１０Ｈ１Ｖに基づくアミノ酸配列中で突然変異の位置に下線を引いている）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＣＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＮＱＫＦＭＧＫＡＴＦＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＳＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４１）
（２）４Ｇ１０Ｌ１Ｖ（Ｍ）：（１１０ａａ、４Ｇ１０Ｌ１Ｖに基づくアミノ酸配列中で突然変異の位置に下線を引いている）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＳＬＩＧＧＴＮＮＲＡＳＷＶＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＦＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＣＧＴＫＬＴＶＬＲ（配列番号４２）
（３）４Ｇ１０Ｈ３Ｖ（Ｍ）：（１１５ａａ、４Ｇ１０Ｈ３Ｖに基づくアミノ酸配列中で突然変異の位置に下線を引いている）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＣＬＥＷＩＧＬＩＮＰＹＮＮＩＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＦＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＧＶＹＦＣＡＲＬＤＹＲＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４３）
（４）４Ｇ１０Ｌ３Ｖ（Ｍ）：（１１０ａａ、４Ｇ１０Ｌ３Ｖに基づくアミノ酸配列中で突然変異の位置に下線を引いている）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＦＰＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＳＬＩＧＧＴＮＮＫＡＳＷＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＩＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＣＧＴＫＬＴＶＬＲ（配列番号４４）

突然変異させた抗体からの区別のために、以後、ＢｉＡｂ００４（Ｍ）はこの実施例においてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）とも称する。上記のＢｉＡｂ００４（Ｍ）は、重鎖定常領域としてＩｇガンマ－１鎖Ｃ領域（アクセッション：Ｐ０１８５７）及び軽鎖定常領域としてＩｇカッパ鎖Ｃ領域（アクセッション：Ｐ０１８３４）を含む、「野生型」である。

調製例４：ヒト化二機能性抗体ＢｉＡｂ００４に基づく非可変領域アミノ酸突然変異設計
調製例３において得られたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）に基づいて、重鎖中の位置２３４におけるロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５におけるロイシンからアラニンへの点突然変異（Ｌ２３５Ａ）、及び位置２３７におけるグリシンからアラニンへの点突然変異（Ｇ２３７Ａ）を導入することによりＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）を得た。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）中の免疫グロブリン部分の重鎖のＤＮＡ配列：（１３４４ｂｐ、突然変異の位置に下線を引いている）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号３９）

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）中の免疫グロブリン部分の重鎖のアミノ酸配列：（４４８ａａ、突然変異の位置に下線を引いている）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４０）

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は、軽鎖の同じＤＮＡ配列及び同じコードされるアミノ酸配列を共有する。特有の配列を調製例３に示す。

実験例１：受容体ＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性アッセイ
ＣＤ６４としても公知のＦｃ受容体ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合することができ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与する。Ｆｃ受容体に対する治療用モノクローナル抗体の結合能力は抗体の安全性及び有効性に影響を及ぼす。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体の潜在的なＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＦｃγＲＩに対する抗体の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩ溶液（Ｓｉｎｏｂｉｏ）をＨＩＳ１Ｋセンサーに加えて、センサー表面上にＦｃγＲＩを５０ｓ間固定化した。３．１２～５０ｎＭ（段階２倍希釈）の抗体濃度を用いて緩衝液中でＦｃγＲＩに対する抗体の会合定数及び解離定数の両方を決定した。抗原が固定化されたセンサーを緩衝液中で６０ｓ間平衡化し、次に抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩの結合を１２０ｓ間決定し；抗体からのＦｃγＲＩの解離を１２０ｓで決定した。温度は３０℃、周波数は０．３Ｈｚであった。データをフィッティングさせ、１：１モデルを用いて分析して抗体についてのＦｃγＲＩに対する親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表１並びに図１及び図２に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は、５．９２Ｅ－０９Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩに結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、ＦｃγＲＩに対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、ＦｃγＲＩに対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。

ＦｃγＲＩに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性はＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例２：ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｖ１５８としても公知）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する抗体の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８をＨＩＳ１Ｋセンサー上に１２０ｓ間固定化した。センサーを緩衝液中で６０ｓ間平衡化させ、３１．２５～５００ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８の結合を６０ｓ間決定した。抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）中で４回、各５ｓ間再生させた。温度は３０℃、周波数は０．３Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表２並びに図３及び図４に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は１．７７Ｅ－０７Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｖ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例３：ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８（ＣＤ１６ａ＿Ｆ１５８としても公知）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８をＨＩＳ１Ｋセンサー上に１２０ｓ間固定化した。センサーを緩衝液中で６０ｓ間平衡化させ、３１．２５～５００ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８の結合を６０ｓ間決定した。抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ １．５）中で４回、各５ｓ間再生させた。温度は３０℃、周波数は０．３Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表３並びに図５及び図６に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は２．２１Ｅ－０７Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。

ＦｃγＲＩＩＩａ＿Ｆ１５８に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例４：ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｈ１３１としても公知）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：固定化希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であり、アナライト希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１を約１．０ｎｍの固定化高さにおいてＮＴＡセンサー上に固定化した。センサーをＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の緩衝液中、３００ｓのブロッキングで平衡化させ、１２．５～２００ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１の結合を６０ｓ間決定した。抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ １．７）及び１０ｎＭの硫酸ニッケル中で再生させた。温度は３０℃、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表４並びに図７及び図８に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は２．２２Ｅ－０８Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｈ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例５：ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１（ＣＤ３２ａ＿Ｒ１３１としても公知）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＡＤＣＣ効果を媒介することができる。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：固定化希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であり、アナライト希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１を約１．０ｎｍの固定化高さにおいてＮＴＡセンサー上に固定化した。センサーをＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の緩衝液中、３００ｓのブロッキングで平衡化させ、１２．５～２００ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１の結合を６０ｓ間決定した。抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ １．７）及び１０ｎＭの硫酸ニッケル中で再生させた。温度は３０℃、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表５並びに図９及び図１０に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の両方はそれぞれ１．４３Ｅ－０８Ｍ及び４．２０Ｅ－０８Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に結合することを結果は示した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の両方はＦｃγＲＩＩａ＿Ｒ１３１に対する結合活性を有することを結果は示唆する。しかしながら、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）よりも強い結合シグナル及びそのためより高い親和性を有することを図９及び図１０における結果は示した。

実験例６：ＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数アッセイ
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂとしても公知）は、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、免疫細胞の機能を下方調節し、免疫細胞の活性化及び増殖を阻害し、且つサイトカインの分泌を阻害することができる。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、Ｆｃ受容体に対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合能力を評価した。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：固定化希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であり、アナライト希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩｂを約１．０ｎｍの固定化高さにおいてＮＴＡセンサー上に固定化した。センサーをＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０２％のカゼイン及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の緩衝液中、３００ｓのブロッキングで平衡化させ、１２．５～２００ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗体に対するセンサー上の固定化されたＦｃγＲＩＩｂの結合を６０ｓ間決定した。抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ １．７）及び１０ｎＭの硫酸ニッケル中で再生させた。温度は３０℃、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。

ＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）の親和性定数アッセイの結果を以下の表６並びに図１１及び図１２に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は５．６１Ｅ－０８Ｍの親和性定数でＦｃγＲＩＩｂに結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。
ＦｃγＲＩＩｂに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例７：Ｃ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性アッセイ
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片に結合し、ＣＤＣ効果を媒介することができる。Ｃ１ｑに対する治療用モノクローナル抗体の結合は、抗体の安全性及び有効性に影響を及ぼす。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用してＣ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の親和性定数をこの実験において測定して、抗体のＣＤＣ活性を評価した。この実験例において、抗ＰＤＬ１抗体５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２－ＩｇＧ１ｍｔを対照として使用し、その調製はＰＣＴ国際公開第２０１７１４８４２４（Ａ１）号パンフレットに記載される。

Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＯｃｔｅｔシステムによりＣ１ｑに対する抗体の親和性定数を決定する方法は簡単には以下のように記載される：試料希釈緩衝液は、ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０及び０．１％のＢＳＡ、ｐＨ ７．４の溶液であった。５０μｇ／ｍＬの抗体を約２．０ｎｍの固定化高さにおいてＦＡＢ２Ｇセンサー上に固定化した。センサーを緩衝液中でブロッキングのために６０ｓ間平衡化させ、１．２５～２０ｎＭ（段階２倍希釈）の濃度において抗原Ｃ１ｑに対するセンサー上の固定化された抗体の結合を６０ｓ間決定した。抗原及び抗体を緩衝液中で６０ｓ間解離させた。センサーを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ １．７）中で４回、各５ｓ間再生させた。試料プレートの振盪速度は１０００ｒｐｍ、温度は３０℃、周波数は０．６Ｈｚであった。データを１：１モデルへのフィッティングにより分析して親和性定数を得た。データ取得ソフトウェアはFortebio Data Acquisition 7.0であり、データ解析ソフトウェアはFortebio Data Analysis 7.0であった。

Ｃ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及び５Ｃ１０Ｈ２Ｌ２－ＩｇＧ１ｍｔの親和性定数アッセイの結果を以下の表７並びに図１３、図１４及び図１５に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）は２．５３Ｅ－０９Ｍの親和性定数でＣ１ｑに結合したが；ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）について、対応するデータは得られず、Ｃ１ｑに対する結合シグナルは検出されなかったか、又は極めて弱いシグナルが検出され、Ｃ１ｑに対する結合がないことを指し示すことを結果は示した。

Ｃ１ｑに対するＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の結合活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有効に排除されることを結果は示唆する。

実験例８：ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞におけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＣ活性アッセイ
ＡＤＣＣ効果は、殺傷活性を有するエフェクター免疫細胞が、それらの表面上に発現されたＦｃ受容体（ＦｃＲ）を通じて標的細胞の抗原に結合した抗体のＦｃ断片を認識し、標的細胞を直接的に殺傷することを指す。抗ＣＴＬＡ４／抗ＰＤ－１二機能性抗体ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＣ効果を試験するために、本発明者らは、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ４抗原を発現する２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞及び初代ＰＢＭＣの共培養システムを構築して、抗体のＡＤＣＣ活性を試験した。

ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞におけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＣ活性アッセイの方法は以下の通りである：
Ｆｉｃｏｌｌ末梢血単核細胞単離の使用説明書にしたがって正常なヒトＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣをＲＰＭＩ－１６４０完全培地に再懸濁し、ＡＯ／ＰＩを用いて染色し、カウントし、凍結した。実験の１日前に、ＰＢＭＣを解凍し、カウントし、生存を決定した。５％のＣＯ₂及び３７℃において二酸化炭素インキュベーター中で細胞を終夜インキュベートした。実験の日に、２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞及びＰＢＭＣを収集し、８００ｒｐｍ又は１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＲＰＭＩ－１６４０（１％のＦＢＳを含有する；以下、培地と称する）に再懸濁し、２回洗浄した。細胞をカウントし、生存を決定した。培地を使用して細胞密度を適切な範囲に調整した。実験の設計にしたがって１００μＬの２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞を３．０Ｅ＋０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに加えた。５０μＬの抗体を加え、細胞を室温で１ｈプレインキュベートし；１ｈ後に、５０μＬのＰＢＭＣを９．０Ｅ＋０５細胞／ウェルで加え、混合物をよく混合し、５％のＣＯ₂において二酸化炭素インキュベーター中３７℃で４ｈインキュベートした。細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離した。１００μＬの上清を新たな９６ウェル平底マイクロプレートに移した（細胞沈殿物をピペッティングしない）。Cytotoxicity Detection Kitの使用説明書にしたがって１００μＬの新たに調製された反応溶液を各ウェルに加えた。細胞を暗所中室温で３０分間インキュベートした。４９０ｎｍ及び６５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。式ＡＤＣＣ（％）＝（処理群 － 陰性対照群）／（標的細胞における最大ＬＤＨ放出 － 標的細胞における自発的ＬＤＨ放出）×１００％にしたがってＡＤＣＣパーセンテージを各群について算出した。

ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１抗原を発現する２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞におけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＣ活性をＡＤＣＣパーセンテージとして表し、結果を図１６に示す。

ＰＢＭＣ及び２９３Ｔ－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１の混合培養系において、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）により誘導されるＡＤＣＣパーセンテージは、同じレベルのＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）により誘導されるものよりも有意に低いことを結果は示した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はＡＤＣＣ活性を有しないことを結果は示唆する。

実験例９：レンバチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるマウスにおける結腸直腸がんＭＣ３８細胞移植片の成長阻害
マウスＭＣ３８細胞系はマウス結腸直腸がん細胞系である。ＭＣ３８細胞系は、ヒトＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ腫瘍を研究するための有用なモデルであることが実証されている（Efremova M et al., Nat Commun., 2018; 9(1):32）。

ＭＣ－３８細胞（Shanghai Ruilu Biotech Co., Ltd.から購入）を収集し、５００万細胞／ｍＬの密度に調整し、ＰＤ－１トランスジェニックマウス（Shanghai Model Organisms Center, Inc.から購入）の右脇腹の皮下に２００μＬ／マウスの体積で移植した。１２匹のマウスに移植を行い、それぞれは１×１０⁶個の細胞を保有した。腫瘍体積が約６０～１５０ｍｍ³に達した時に、マウスを腫瘍体積（約９４ｍｍ³の類似した平均体積を有する）により、６匹のマウスをそれぞれ含有する２つの群、モデル群及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）／レンバチニブ処置群に分けた。グループ分けの日をＤ０と設定した。６用量の抗体をそれぞれＤ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１３及びＤ１７に腹腔内に投与し；レンバチニブを経口胃管栄養法により１日毎に２０日間投与した。腫瘍体積をノギスにより測定した。グループ分け後にノギスを使用して腫瘍寸法を週毎に２回測定し、式ＴＶ＝０．５×ａｂ²（ａは腫瘍の最長の直径であり、ｂは腫瘍の最短の直径であり、ＴＶは腫瘍の体積である）にしたがって腫瘍体積を算出した。特有のプロトコールを表８に示す。

この実験におけるアイソタイプ対照、ヒト抗鶏卵リゾチームＩｇＧ（抗ＨＥＬ抗体、又はｈＩｇＧと略記されるヒトＩｇＧ）の配列は、「Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies」というタイトルでAcierno et al.により報告された研究（Acierno et al., J Mol Biol., 2007; 374(1):130-46）におけるＦａｂ Ｆ１０．６．６配列の可変領域配列に由来する。

実験結果を図１７に示す。

レンバチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はＭＣ３８腫瘍の成長を有意に阻害し；レンバチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の直腸及び／又は結腸がんに対して有意に有効性を実証したことを結果は示した。

実験例１０：Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３マウス結腸がんＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３皮下移植片腫瘍モデルにおけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の薬力学的評価
雌Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３マウス（Nanjing GemPharmatech Co., Ltd.から購入）を８つの群に分け、右前肢の皮下に結腸がんＭＣ３８－ｈＰＤＬ１／ｈＣＤ７３細胞（Nanjing GemPharmatech Co., Ltd.から購入）（２×１０⁶細胞／１００μＬ／マウス）を移植した。移植の日をＤ０と定義した。投薬体積は体重にしたがって調整し、マウスの体重１ｇ当たり１０μＬとした。アイソタイプ対照抗体（調製及び供給元は実験例９のものと同じである）又はＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）を腹腔内に週毎に２回で３週間、計６用量で投与した。腫瘍を実験中に連続的に測定し、以下の式：腫瘍体積（ｍｍ³）＝（腫瘍長さ×（腫瘍幅）²）／２として体積を算出した。

結果を図１８及び以下の表９に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）群における腫瘍体積の増加はアイソタイプ対照抗体群と比べて阻害されたことを結果は示し、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はマウスＭＣ３８細胞の増殖を有意に阻害し、結腸がん及び／又は直腸がんを有効に治療できることを指し示した。

実験例１１：ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１におけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の抗体媒介性貪食活性の研究
Zhang et al. （Zhang T et al, Cancer Immunol Immunother., 2018; 67(7):1079-1090.)及びDahan et al. (Dahan R et al., Cancer cell, 2015, 28(3):285-95.）は、Ｆｃ受容体に対する、免疫チェックポイント、例えばＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的化する抗体のＦｃ断片の結合は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）が免疫細胞損傷に繋がる重要な機序であるＦｃ依存性エフェクター機能誘導性免疫細胞損傷に可能性としては起因して、抗体媒介性抗がん活性に負に影響することを報告した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）のＡＤＣＰ活性を試験するために、マウスマクロファージをエフェクター細胞として使用し、対応する抗原を過剰発現する細胞系を標的細胞として使用した。細胞により媒介されるＡＤＣＰ効果を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Guangdong Medical Laboratory Animal Centerから購入）の大腿骨髄を最初に無菌的に収集し、赤血球溶解緩衝液により氷上で５分間溶解させた。ＤＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳを含有する）を用いて溶解を終了させ、溶解液を１０００ｒｐｍで遠心分離し、２回洗浄した。細胞ペレットを１０ｍＬのＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を１００ｎｇ／ｍＬの作用濃度で加えた。誘導のために細胞培養チャンバー中３７℃及び５％のＣＯ₂で細胞を７日間培養した。３及び５日目に培地の半分を交換し、Ｍ－ＣＳＦを加えた。細胞の誘導を７日目に完了した。０．２５％のトリプシンを用いて細胞を消化させた。マクロファージを収集し、１７０×ｇで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＤＭＥＭ完全培地に懸濁し、カウントした。細胞を適切な密度に調整し、更なる使用のために無菌ＥＰチューブに充填した。

対数期のＣＨＯ－Ｋ１－ＣＴＬＡ４－ＰＤ１細胞（Akeso Biopharma, Inc.により構築された、ヒトＣＴＬＡ４及びＰＤ１抗原の両方を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に基づく細胞系）を収集し、１７０×ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳを用いて洗浄し、再懸濁し、カウントし、生存を決定した。ＰＢＳを用いてカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を２．５μＭに希釈し、細胞を再懸濁した（染色密度：１０００万細胞／ｍＬ）。細胞を細胞インキュベーター中で２０分間インキュベートした。６ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を加えて染色を停止させた。細胞を１７０×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。１ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を再懸濁のために加えた。細胞をインキュベーター中で１０分間インキュベートし、実験密度に調整した。細胞をＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＣＴＬＡ４－ＣＦＳＥとしてコード化した。試験抗体をＤＭＥＭ完全培地中に希釈した。アイソタイプ対照抗体抗ＨＥＬ抗体及び培地をアイソタイプ対照群及びブランク対照群として使用した。研究設計にしたがって、希釈された抗体及びＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＣＴＬＡ４－ＣＦＳＥ細胞を、マクロファージを含有する１．５ｍＬ ＥＰチューブに加えた（最終体積は１００μＬであり、エフェクター対標的比は５０，０００：１５０，０００であり、抗体の作用濃度は５０、５及び０．５ｎＭであった）。混合物を再懸濁し、均一に混合し、インキュベーター中３７℃で２ｈインキュベートした。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する８００μＬのＰＢＳを室温で各チューブに加えた。混合物を１２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。８００μＬの１％のＰＢＳＡを用いて細胞を１回洗浄した。ＡＰＣ抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号：１０１２１２）を１％のＰＢＳＡを用いて４００倍に希釈し、対応する試料に１００μＬ／試料で加えた。混合物をよく混合し、氷上で３０分間インキュベートし、８００μＬの１％のＰＢＳＡを用いて１回洗浄し、１２００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。２００μＬの１％のＰＢＳＡを各チューブに加えて細胞を再懸濁した。細胞をローディングチューブに移し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析した。系中のマクロファージはＡＰＣ⁺陽性であり、貪食に関与するマクロファージはＡＰＣ及びＣＦＳＥ二重陽性であった。ＡＰＣ陽性細胞の数に対する二重陽性細胞の数の比として貪食率を決定し、抗体媒介性ＡＤＣＰ活性を評価した。

Ｐ％として表される各群のＡＤＣＰ活性を以下のように算出した：

結果を図１９に示す。

貪食活性の媒介についての抗体検証システムにおいて、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）により媒介されるマクロファージによるＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ１－ＣＴＬＡ４細胞の貪食活性は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較してアイソタイプ対照抗体抗ＨＥＬ抗体のものと有意な差異を有しないことを結果は示し、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はＡＤＣＰ活性を有しないことを指し示した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）により導入されたアミノ酸突然変異はＡＤＣＰ効果を有効に排除することができ、驚くべき技術的効果が得られることを結果は示唆する。

実験例１２：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト胃がんKATO III細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びKATO III細胞（Chinese Academy of Sciences Shanghai Cell Bankから購入）をDMEM + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのミトマイシンＣ（ＭＭＣ）を用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のKATO III細胞を収集し、９６ウェルプレート上に５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２０に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト胃がん細胞KATO IIIに対する免疫細胞の免疫応答をより有意に増強し、そのためＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は胃がんを治療するために有望であることを結果は示した。

実験例１３：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト子宮頸がんＨｅｌａ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＨｅｌａ細胞（Chinese Academy of Sciences Cell Bankから購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＨｅｌａ細胞を収集し、９６ウェルプレート上に５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２１に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト子宮頸がんＨｅｌａ細胞に対する免疫細胞の免疫応答をより有意に増強し、そのためＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は子宮頸がんを治療するために有望であることを結果は示した。

実験例１４：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞（Chinese Academy of Sciences Cell Bankから購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２２に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ（即ち、ＡＤＣＰ）を排除しながら、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒトＴ細胞リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する免疫細胞の免疫応答を有意に増強し；抗体はＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して１．３４ｎＭ及び２０ｎＭの用量で同等の又はより高い薬理活性を有し、子宮頸がんを治療するために有望である。

実験例１５：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト鼻咽頭がんＣＮＥ－２Ｚ細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＣＮＥ－２Ｚ細胞（GuangZhou Jennio Biotech Co., Ltd.から購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＣＮＥ－２Ｚ細胞を収集し、９６ウェルプレート上に３×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２３に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト鼻咽頭がん細胞ＣＮＥ－２Ｚに対する免疫細胞の免疫応答を同等且つ／又はより有意に増強したこと、及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は２０ｎＭにおいて有意な優位性を特に有したことを結果は示した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ効果の有効な排除に基づいてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比べてより良好な又は同等の薬理活性を有し、ヒト鼻咽頭がんを治療するための潜在能力を指し示すことを上記の結果は示した。

実験例１６：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（GuangZhou Jennio Biotech Co., Ltd.から購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を収集し、９６ウェルプレート上に３×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２４に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する免疫細胞の免疫応答を同等又はより有意に増強した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ効果の有効な排除に基づいてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比べてより良好な又は同等の薬理活性を有し、ヒト乳がんを治療するための潜在能力を指し示すことを上記の結果は示した。

実験例１７：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト中皮腫ＮＣＩ－Ｈ２４５２細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＮＣＩ－Ｈ２４５２細胞（Chinese Academy of Sciences Shanghai Cell Bankから購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＮＣＩ－Ｈ２４５２細胞を収集し、９６ウェルプレート上に３×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２５に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト中皮腫細胞ＮＣＩ－Ｈ２４５２に対する免疫細胞の免疫応答をより有意に増強し、そのためＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は中皮腫を治療するために有望であることを結果は示した。

実験例１８：アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト非小細胞肺がん（ヒト肺腺癌）Ａ５４９細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1細胞をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養し、Ａ５４９細胞をDMEM + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＡ５４９細胞（Chinese Academy of Sciences Cell Bankから購入）を収集し、９６ウェルプレート上に５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

図２６に示されるように、塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）単剤療法、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）単剤療法及び塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト非小細胞肺がん（ヒト肺腺癌）Ａ５４９細胞に対する免疫細胞の免疫応答をより有意に増強し、そのため塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はヒト非小細胞肺がん又はヒト肺腺癌を治療するために有望である。

実験例１９：アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト小細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ４４６細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＮＣＩ－Ｈ４４６細胞（Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciencesから購入)をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＮＣＩ－Ｈ４４６細胞（Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciencesから購入）を収集し、９６ウェルプレート上に８×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体及びアンロチニブを研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２７に示す。

塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＭＴ）単剤療法、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）単剤療法及び塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト小細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ４４６細胞に対する免疫細胞の免疫応答を有意に増強し、そのため塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）はヒト小細胞肺がんを治療するために有望である。

実験例２０：アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるヒト扁平細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ２２６細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1及びＮＣＩ－Ｈ２２６細胞（Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciencesから購入）をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＮＣＩ－Ｈ２２６細胞を収集し、９６ウェルプレート上に５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体及びアンロチニブを研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２８に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）単剤療法は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）単剤療法と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにヒト扁平細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ２２６細胞に対する免疫細胞の免疫応答をより有効且つ有意に増強した。

塩酸アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）単剤療法及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）単剤療法と比較してヒト扁平細胞肺がんＮＣＩ－Ｈ２２６細胞に対する免疫細胞の免疫応答をより有意に増強し、アンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と同等の薬理活性を実証した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ効果の有効な排除に基づいてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）単剤療法又はアンロチニブと組み合わせたＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比べてより良好な又は同等の薬理活性を示し、ヒト扁平細胞肺がんを治療するためのより良好な有効性を指し示すことを上記の結果は示した。

実験例２１：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がんＳＷ４８細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
ＳＷ４８はヒト結腸直腸がん細胞系であり、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型と共に同定される（Branch P et al., (1995), Cancer Res, 55(11): 2304-2309.）。ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の腫瘍に対する増強された免疫細胞応答を検出するためにそれを使用した。

実験において、Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1細胞をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養し、ＳＷ４８細胞（GuangZhou Jennio Biotech Co., Ltd.から購入）をDMEM + 10% FBS完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＳＷ４８細胞を収集し、９６ウェルプレート上に２×１０⁵細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図２９に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の両方は、抗ＨＥＬ抗体と比較して有意に増加したＩＬ－２の分泌レベルにより特徴付けられるようにＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がん細胞ＳＷ４８細胞に対する免疫細胞の免疫応答を有意に増強した。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ効果の有効な排除に基づいてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比べてより良好な又は同等の薬理活性を有し、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の固形腫瘍、特にはＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の結腸がん及び／又は直腸がんを治療するための潜在能力を指し示すことを上記の結果は示した。

実験例２２：ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）によるＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がんＳＷ８３７細胞に対する免疫細胞の有意に増強された免疫応答
ＳＷ８３７は非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ（即ち、ＭＳＳ）表現型のヒト結腸直腸がん細胞系（Guo J et al., Cancer Res., 2011;71(8):2978-2987.）であり、この実施例においてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）による非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の腫瘍に対する増強した免疫細胞応答を検出するためにそれを使用した。

Ficoll-Paque^TM Plus試薬の使用説明書にしたがってＰＢＭＣを健常なヒト末梢血から単離し、単離されたＰＢＭＣをカウントし、凍結した。Raji-PDL1細胞をRPMI 1640 + 10% FBS完全培地中で培養し、ＳＷ８３７細胞（Shanghai Honsun Biological Technology Co., Ltdから購入）を10% FBS + LeibovitzのL-15（Gibcoから購入）完全培地中で培養した。ＰＢＭＣを解凍し、０．５μｇ／ｍＬのＳＥＢを用いて２日間活性化させた。実験の日に、２μｇ／ｍＬのＭＭＣを用いてRaji-PDL1細胞を１ｈ処理した。ＳＥＢ活性化ＰＢＭＣ及びＭＭＣ処理Raji-PDL1細胞を収集し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、RPMI 1640 + 10% FBS完全培地中に再懸濁し、カウントした。Raji-PDL1及びＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上に１×１０⁵細胞／ウェルで播種した。対数増殖期のＳＷ８３７細胞を収集し、９６ウェルプレート上に５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。希釈された抗体を研究設計にしたがって加えた。混合物を均一に混合し、５％のＣＯ２インキュベーター中３７℃で３日間インキュベートした。３日後に、細胞培養上清を収集し、ELISA KITの使用説明書にしたがってＩＬ－２について試験した。

この実験における培地は全て、10% FBS + RPMI 1640であった。

結果を図３０に示す。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）及びＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の両方は、抗ＨＥＬ抗体と比較して非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型のヒト結腸直腸がん細胞ＳＷ８３７細胞に対する免疫細胞の免疫応答を有意に増強した。高用量群におけるＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）の薬理活性は、ＩＬ－２の有意に増加した分泌レベルにより特徴付けられるように、ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）のそれよりも優位であった。

ＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＴＭ）は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又はＡＤＣＰ効果の有効な排除に基づいてＢｉＡｂ００４（ｈＧ１ＷＴ）と比べてより良好な又は同等の薬理活性を有し、非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の固形腫瘍、特には非ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ表現型の結腸がん及び／又は直腸がんを治療するための潜在能力を指し示すことを上記の結果は示した。

本発明の特有の実施形態を詳細に記載したが、開示された全ての教示にしたがってそれらの詳細に対して様々な改変及び置換が為され得ること、並びにこれらの変更は全て本発明の保護範囲内であることを当業者は理解する。本発明の全範囲は、添付の請求項及びそのあらゆる均等により与えられる。

Claims (23)

1. ＰＤ－１を標的化する第１のタンパク質機能性領域、及び
   ＣＴＬＡ４を標的化する第２のタンパク質機能性領域を含む二重特異性抗体であって、
   前記第１のタンパク質機能性領域が免疫グロブリンであり、且つ前記第２のタンパク質機能性領域が単鎖抗体であり；
   前記免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸配列が配列番号４０に記載され、且つ前記免疫グロブリンの軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２４に記載され；
   前記単鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４３に記載され、且つ前記単鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４４に記載され；
   前記第１のタンパク質機能性領域が、第１のリンカー断片を介して前記第２のタンパク質機能性領域に連結されており、且つ前記単鎖抗体の前記重鎖可変領域が、第２のリンカー断片を介して前記単鎖抗体の前記軽鎖可変領域に連結されており、ここで前記第１のリンカー断片及び前記第２のリンカー断片は同一又は異なるものであり；且つ、
   前記単鎖抗体が前記免疫グロブリンの重鎖のＣ末端に連結されている、二重特異性抗体。
2. 前記第１のリンカー断片及び前記第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号２５及び配列番号２６から独立して選択される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記第１のリンカー断片及び前記第２のリンカー断片のアミノ酸配列が配列番号２６に記載される、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
4. 請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。
5. 請求項４に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
6. 請求項４に記載の単離された核酸分子又は請求項５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
7. 請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体及びコンジュゲート化された部分を含む、コンジュゲートであって、前記コンジュゲート化された部分が、検出可能な標識である、コンジュゲート。
8. 請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体又は請求項７に記載のコンジュゲートを含む、キットであって、
   前記キットが、前記二重特異性抗体又はその抗原結合性断片を特異的に認識することができる第２の抗体を更に含み；かつ前記第２の抗体が、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色物質、又は酵素を更に含む、
   キット。
9. 試料中のＰＤ－１及び／又はＣＴＬＡ４の存在又はレベルを検出するためのキットの調製における、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体又は請求項７に記載のコンジュゲートの使用。
10. 請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体又は請求項７に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物であって、任意選択的に、前記医薬組成物が、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を更に含む、医薬組成物。
11. １つ又は複数の抗腫瘍化学療法剤を更に含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記１つ又は複数の抗腫瘍化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記チロシンキナーゼ阻害剤は、アンロチニブ若しくはその薬学的に許容される塩、又はレンバチニブ若しくはその薬学的に許容される塩である、請求項１３に記載の医薬組成物。
14. 前記医薬組成物の単位用量が、前記二重特異性抗体の質量に基づいて、１００～１０００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、４００～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、請求項１０～１３のいずれかに記載の医薬組成物。
15. 別々のパッケージ中に第１の製品及び第２の製品を含む、組合せ製品であって、
    前記第１の製品が、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項８に記載のコンジュゲート、又は請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物を含み；
    前記第２の製品が１つ又は複数の抗腫瘍化学療法剤を含む、
    組合せ製品。
16. 前記第１の製品の単位用量が、前記二重特異性抗体の質量に基づいて、１００～１０００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、４００～５００ｍｇ、又は４５０ｍｇである、請求項１５に記載の組合せ製品。
17. 前記第２の製品の単位用量が、活性成分の質量に基づいて、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、１～２０ｍｇ、２～１５ｍｇ、４～１２ｍｇ、又は８～１２ｍｇである、請求項１５又は１６に記載の組合せ製品。
18. 腫瘍若しくは貧血を治療及び／若しくは予防するための医薬の調製、又は腫瘍若しくは貧血を診断するための医薬の調製における、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項７に記載のコンジュゲート、請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物、又は請求項１５～１７のいずれかに記載の組合せ製品の使用。
19. ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１の結合を遮断するための医薬；
    ＰＤ－１の活性若しくはレベルを下方調節するための医薬；
    生物においてＰＤ－１の免疫抑制を緩和するための医薬；若しくは
    Ｔリンパ球においてＩＦＮ－γ及び／若しくはＩＬ－２の発現を上昇させるための医薬；
    並びに／又は
    Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合を遮断するための医薬；
    ＣＴＬＡ４の活性若しくはレベルを下方調節するための医薬；
    生物においてＣＴＬＡ４の免疫抑制を緩和するための医薬；若しくは
    Ｔリンパ球においてＩＬ－２の発現を上昇させるための医薬；
    の調製における、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項７に記載のコンジュゲート、請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物、又は請求項１５～１７のいずれかに記載の組合せ製品の使用。
20. 腫瘍若しくは貧血の治療及び／若しくは予防における使用のため、又は腫瘍若しくは貧血の診断における使用のための、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項７に記載のコンジュゲート、請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物又は請求項１５～１７のいずれかに記載の組合せ製品。
21. 前記二重特異性抗体、前記コンジュゲート、前記医薬組成物又は前記組合せ製品は、外科治療の前若しくは後及び／又は放射線療法の前若しくは後の投与のためのものである、請求項２０に記載の使用のための、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項７に記載のコンジュゲート、請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物又は請求項１５～１７のいずれかに記載の組合せ製品。
22. 前記二重特異性抗体の単位用量が、体重１ｋｇ当たり０．１～１００ｍｇである、
    請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記二重特異性抗体、前記コンジュゲート、前記医薬組成物又は前記組合せ製品は、２又は３週のサイクルで行われる投与のためのものである、請求項２０に記載の使用のための、請求項１～３のいずれかに記載の二重特異性抗体、請求項７に記載のコンジュゲート、請求項１０～１４のいずれかに記載の医薬組成物又は請求項１５～１７のいずれかに記載の組合せ製品。